DE60221987T2

DE60221987T2 - Le-zellen (liver engrafting cells), assays und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60221987T2
Application number: DE60221987T
Authority: DE
Inventors: Eric Portola Valley LAGASSE; Timothy Morgan Hill AUSTIN
Original assignee: StemCells Inc
Current assignee: Microbot Medical Inc
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2022-06-22
Also published as: DK1406998T3; EP2388330A1; US20030032184A1; CA2451637A1; AU2002315392A2; WO2003000848A2; US20110256625A1; EP1406998B1; CN101974480A; EP1406998A2; US8283164B2; JP2009183299A; US7211404B2; JP4455876B2; CN1665920A; ES2292772T3; EP1956078A2; EP1956078A3; ATE371018T1; AU2002315392B2

Description

Der Körper ist darauf angewiesen, dass die Leber zahlreiche lebenswichtige Funktionen ausführt, die die Regulation, die Synthese und die Sekretion mehrerer zur Aufrechterhaltung des Normalzustands des Körpers wichtiger Substanzen, das Speichern wichtiger Nährstoffe, wie etwa Glykogen (Glukose), Vitamine und Mineralien, und die Reinigung, Umwandlung und Beseitigung von Abfallprodukten, Arzneimitteln und Giftstoffen einschließen. Allerdings machen sie ihre unverwechselbaren Eigenschaften und Aktivitäten anfällig für Schädigungen mit vielerlei Ursprung und solche Schädigungen können erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit eines Menschen haben.
Die zahlreichsten und metabolisch aktivsten Zellen in der Leber sind die Hepatozyten. Die Leberläppchen weisen eine hexagonale Form auf, mit sechs Periportalfeldern an der Peripherie, die jeweils einen Ast der Pfortader, einen Ast der Leberarterie und einen Gallengang enthalten, die durch eine Lage von Hepatozyten eng zusammen gehalten werden. Hepatozyten teilen sich selten, aber sie haben die einzigartige Fähigkeit, sich in Erwiderung auf einen geeigneten Stimulus, wie etwa die Entfernung eines Teils der Leber, zu reproduzieren. Dieser Prozess ist mit der kontrollierten Hyperplasie verbunden, die die Leber üblicherweise innerhalb 5 bis 10 % ihres ursprünglichen Gewichts wiederherstellt.
Die Leber besitzt die einzigartige Fähigkeit, sich nach einer Verletzung zu regenerieren. Der Prozess beginnt mit der Proliferation „reifer" Hepatozyten; andere Ziellinien, die Gallenepithelzellen (BEC) und Sinusiodalzellen einschließen, proliferieren etwas später. Die Leberregenerierung spielt eine wichtige Rolle nach partieller Hepatektomie und nach Schädigungen, die Teile der Leber zerstören, wie etwa virale, toxische oder ischämische Schädigung. Allerdings kann eine übermäßige Schädigung einen „Punkt ohne Rückkehr" erreichen und normales Gewebe wird dann durch Narbengewebe ersetzt. Die Fähigkeit der Leber, sich zu regenerieren, wird auch durch eine vorbestehende oder wiederholte Leberschädigung oder -erkrankung gefährdet.
Man hat herausgefunden, dass zahlreiche Oberflächendeterminanten unter aus Knochenmark abgeleiteten Stammzellen und Zellen, die zu Hepatozyten führen, gemeinsam sind, einschließlich c-kit, CD34 und Thy-1 in Nagetieren und c-kit und CD34 in Menschen (siehe Omori et al. (1997) Hepatology 26: 720–727; Lemmer et al. (1998) J. Hepatol. 29: 450–454; Peterson et al. (1998) Hepatology 27: 433–445; ibid. (1999) Science 284: 1168–1170; Baumann et al. (1999) Hepatology 30: 112–117; Lagasse et al. (2000) Nature Med. 11: 1129–1234). Diese Erkenntnisse können wichtige klinische Implikationen für die Gentherapie und die Hepatozyten-Transplantation besitzen, zwei innovative Ansätze zur Behandlung hepatischem Versagens und metabolischer Störungen der Leber.
Einige Hinweise deuten daraufhin, dass einige unreife Leberzelllinien sowohl in BEC als auch in Hepatozyten differenzieren können. Beispielsweise berichten Fiorino et al. (1998) In Vitro Cell Dev Biol Anim 34(3): 247–58 von der Isolierung einer bedingt transformierten Leberprogenitorzelllinie. Coleman und Presnell (1996) Hepatology 24(6): 1542–6 erörtern phänotypische Umwandlungen in proliferierenden Hepatozytenkulturen, die eine bipotente Differenzierungsfähigkeit reifer Hepatozyten nahe legen. Von den Ovalzellvorläufern wird vermutet, dass sie entweder in den Heringkanälen oder nahe den Gallengängen lokalisiert sind. Zur Ovalzellprofilation sind Gallengangzellen erforderlich, was darauf hinweist, dass sie entweder die Quelle für die Vorläufer sind oder dass sie eine unterstützende oder induktive Rolle spielen. Kubota et al., Internationales Patent WO 02/28997 , offenbaren eine ICAM-1 exprimierende Progenitorzellpopulation.
Intermediärfilamentproteine, insbesondere gallengangspezifisches Cytokeratin 19 (CK19) und hepatozytenspezifisches HepPar1-Antigen können helfen, die Entwicklungsstufen der hepatischen Progenitorzellen während der Lebermorphogenese zu definieren. Duktulare Hepatozyten proliferieren und haben mit Hepatozyten und BEC phänotypische Charakteristika gemeinsam. Sowie die Hepatozytendifferenzierung fortschreitet, nimmt die Expression von HepPar1-Antigen zu und die Expression von CK14 und CK19 sinkt ab. Im Gegensatz dazu steigt die CK19-Expression in ausdifferenzierten Gallengängen, während CK14 und HepPar1-Antigene verschwinden, sowie sich Progenitorzellen in duktale Plattenzellen umwandeln. Hepatische Progenitorzellen können daher in Schritten ausdifferenzieren, die durch die Entstehung oder das Verschwinden spezifischer phänotypischer Charakteristika markiert werden. Die Festlegung der Progenitorzellen entweder als Hepatozyten- oder als Gallengangepithelzelllinie führt zu zunehmender Expression eines Markers und dem Verschwinden des anderen Markers. Frühere Berichte, die auf die In-vivo-Gegenwart solcher bipotenter Progenitorzellen hinweisen, können bei Douarin (1975) Med. Biol. 53: 427–455; Shiojiri et al. (1991) Cancer Res. 51: 2611–2620, Haruna et al. (1996) Hepatology 23(3): 476–81, Tateno und Yoshizato (1996) Am J Pathol 149(5): 1593–605 und Haque et al. (1996) Lab Invest 75(5): 699–705 gefunden werden. Die Expression von Albumin und Alpha-Fetoprotein sind ebenso geeignete Marker für Hepatozyten.
Eine Diskussion über hepatische Progenitorzellen kann bei Susick et al. (2001) Ann. N. Y. Acad. Sci. 944: 398–419, im US-Patent No. 5,576,207 and in der US-Patentanmeldung Nr. 20020016000 gefunden werden.
Um eine weitere Charakterisierung der hepatischen Progenitorzellen und der davon abstammenden Zellen zu erreichen, ist es entscheidend, über wohldefinierte Modellsysteme zu verfingen, die das komplexe Zusammenspiel zwischen „Umweltfaktoren" und intrinsischen zellulären Faktoren entschlüsseln können, das die Zellerneuerung reguliert, sowie die phänotypische Definition der spezifischen Zellen, die in der Lage sind, zu reifen hepatischen Zellen zu führen. Die Identifikation und Charakterisierung von Faktoren, die die Spezifikation und Differenzierung von Zelllinien in der sich entwickelnden und adulten Leber und im Gallenwegsystem regulieren, sind von großem Interesse. Die weitere Charakterisierung von Leber-Transplantationszellen ist von großem wissenschaftlichem und klinischem Interesse.
Kurzfassung der Erfindung
Es werden Verfahren zur Abrennung und Charakterisierung von Leber-Transplantationszellen (LEC) bereitgestellt, welche Progenitorzellen sind, die die Fähigkeit besitzen, sich in die Leber einzufügen und zu ausdifferenzierten hepatischen Zellen zu führen. Die Zellen können auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung und Autofluoreszenz und/oder durch die Expression spezifischer Zelloberflächenmarker separiert werden. Die Zellen sind bei der Transplantation, beispielsweise zur experimentellen Evaluation, und als eine Quelle für abstammungslinien- und zellspezifische Produkte, einschließlich mRNA-Spezies, die bei der Identifizierung von Genen dienlich sind, die spezifisch in diesen Zellen exprimiert werden, und als Ziele für die Entdeckung von Faktoren oder Molekülen geeignet, auf die sie einwirken können.
Es werden In-vitro- und In-vivo-Systeme zur Züchtung und Analyse, einschließlich klonale Analyse, von Leber-Transplantationszellen bereitgestellt. Klonogenitätstests können in der Gegenwart einer Nährschicht aus Bindegewebszellen in vitro ausgeführt werden. Die Zellen können auch bei Abwesenheit von Nährschichten in vitro entwickelt werden. Diese Kultursysteme sind zum Züchten und Charakterisieren von Leber-Transplantationszellen geeignet. In vivo fügen sich die Zellen in die Leber ein und das Anwachsen kann experimentell durch Repopulation der Leberzellen in FAH-defizienten Tieren getestet werden.
Die Leber-Transplantationszellen finden Verwendung bei der Evaluierung von Therapien betreffend leberspezifische Viren, beispielsweise Hepatitisviren A, B, C, D, E etc., insbesondere humane Hepatitisviren. Die Zellen finden zudem Verwendung bei Toxizitätstests für die Herstellung von Hepatozyten in Kultur und als ein Mittel zum Bereitstellen von Nebenprodukten des Leberstoffwechsels, beispielsweise die Produkte der Arzneimitteltransformation durch Leberzellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt das Anfärben menschlicher fötaler Leberzellen für die Vorwärtsstreuung, Autofluoreszenz und Vitalität (Propidiumiodid) und die Separation in eine R1- und R2-Population auf der Grundlage dieser Charakteristika. 1B zeigt die Expression der 5E12- und HLA-Klasse-I-Epitope auf Subpopulationen von Zellen in der R2-Population.
Die 2A und 2B zeigen, dass die R2-Population heterogen für die Expression von Albumin und CK19 ist, vor dem Sortieren für die 5E12-Expression.
Die 3A bis 3D zeigen die Phänotypanalyse von menschlichen fötalen Leberzellen.
4 zeigt das Anfärben von Zellen aus der R2-Population mit 5E12, EpCAM, CD49f, E-Cadherin und HLA. Die 4A, 4D und 4G zeigen eine Färbung 5E12 gegen HLA Klasse I. Die polygonalen Bereiche stellen die Schleusen dar, die verwendet wurden, um nach 5E12⁺, HLA^low LEC zu selektieren. Die 4B, 4E und 4H zeigen entsprechende graphische Darstellungen, die E-Cadherin, EpCam bzw. CD49f als x-Achse verwenden. Die 4C, 4F und 4I zeigen die Analyse der Populationen, die in den 4B, 4E und 4H ausgeschleust wurden, auf die Expression von 5E12. Die Daten demonstrieren die Äquivalenz der Färbung zwischen 5E12, EpCAM, E-Cadherin und CD49f.
Die 5A bis 5F zeigen das Anfärben für Albumin (alb), Alpha-Fötoprotein (afp) und CK19 an Kolonien, die aus menschlichen fötalen Leber-LEC stammen, nach zwei Wochen in Kultur in vitro.
Die 6A und 6B zeigen die Pegel von zirkulierendem menschlichen Alpha-1-Antitrypsin (AAT)(9A) und Albumin (ALB)(9B) Protein aus Serum von NOD-SCID-Mäusen 6 Wochen nach der Transplantation von Gesamtleberzellen, sortierten Gesamtleberzellen oder sortierten R2-5E12⁺-HLA^low-Zellen. Die Daten demonstrieren das Anwachsen und die Erzeugung von funktionellen Hepatozyten aus LEC.
Die 7A bis 7F zeigen die Detektion von menschlichem ALB- oder CK19-Protein in transplantierten menschlichen fötalen Leberzellen in der Leber einer NOD-SCID-Maus 6 Wochen nach der Transplantation. Die 10A bis 10F sind Reihenschnitte aus einer einzelnen Leber. Diese Daten demonstrieren die Fähigkeit von LEC, Hepatozyten zu erzeugen. Die Bereiche, in denen menschliches Albumin exprimiert wird, sind auch positiv für CK19.
8A zeigt die Färbung von menschlichen adulten Leberzellen für die R1- und R2-Populationen und die Färbung der Färbung der R2-Population für 5E12, HLA. 8B zeigt die Expression von Albumin und Alpha-1-Antitrypsin nach Kultur in vitro.
Die 9A bis 9H zeigen Analysen von menschlichem adultem Lebergewebe wie es für die fötalen Zellen in 3 beschrieben wurde.
Die 10A bis 10H zeigen das Anfärben von LEC in fötaler und adulter Leber.
11 zeigt die Morphologie der Leber-Transplantationszellen nach zwei Wochen in Kultur, in der sie als typische Epithelzell-Monoschicht wachsen.
Tabelle 2 zeigt die Grenzwertverdünnung von Leber-Transplantationszellen.
Tabelle 3 zeigt das Screening nach LEC durch Immunfärbung.
Beschreibung der speziellen Ausführungsbeispiele
Leber-Transplantationszellen (LEC) werden isoliert und charakterisiert und es wird demonstriert, dass sie Progenitorzellen sind, die in der Lage sind, sich in Hepatozyten zu entwickeln, wenn sie in vivo transplantiert werden. Die Zellpopulationen, die mit auf der Leber anwachsenden Zellen angereichert sind, sind zur Transplantation geeignet, um einem Empfänger die Wiederherstellung der Leberfunktion zu bieten, ferner zum Arzneimittel-Screening, als In-vitro- und In-vivo-Modelle der hepatischen Entwicklung, für In-vitro- und In-vivo-Screeningtests, um die Wachstums- und Differenzierungsfaktoren zu definieren, und um Gene zu charakterisieren, die bei der Leberentwicklung und -regulation beteiligt sind und dergleichen. Für diese Zwecke können die nativen Zellen verwendet werden oder sie können genetisch modifiziert werden, um geänderte Fähigkeiten zu bieten.
Die Fähigkeit, sich in regenerierende Hepatozyten zu entwickeln, kann in vivo beurteilt werden, beispielsweise in autofluoreszenten Tieren, beispielsweise RAG, SCID, nackt etc., in FAH⁺-Tieren oder in immundefizienten FAH-Knockout-Tieren mit allogenischen, syngenischen oder xenogenischen Donorzellen, durch die Fähigkeit dieser Donorzellen, in diesen Systemen Funktionalität bereitzustellen. Die FAH-Expression ist ein Defekt der menschlichen genetischen Störung Tyrosinämie Typ 1. Die FAH-Funktion wird von den angewachsenen Hepatozyten bereitgestellt. Alternativ können für die Beurteilung der biologischen Funktion In-vitro-Verfahren verwendet werden, durch die Kultivierung von Zellen mit geeigneten Wachstumsfaktoren und/oder Zytokinen unter Hepatozyten generierenden Bedingungen. Wenn sie in Kultur gezüchtet werden, wachsen die beanspruchten Zellen als Monoschicht mit einer typischen Epithelzellmorphologie.
Die Leber-Transplantationszellen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der Vitalität, der Vorwärtsstreuung, Autofluoreszenz und Expression von Zelloberflächenmarkern angereichert werden. Beispielsweise färben sich tote Zellen nach Anfärben mit Propidiumiodid hell an, weil sie nicht in der Lage sind, den Farbstoff auszuschließen. Wohingegen vitale Zellen negativ oder gering mit Propidiumiodid angefärbt werden. Die Zellen von Interesse werden in der PI^low-Subpopulation gefunden, zwischen der sehr hellen und der negativen, wie es in 1 gezeigt ist. Zudem kann Vorwärtsstreuung verwendet werden, um die Zellen von Interesse auszulesen, die eine hohe Vorwärtsstreuung aufweisen, wie es in 1 gezeigt ist.
Innerhalb der Population mit hoher Vorwärtsstreuung, PI^low-Zellen, werden die Leber-Transplantationszellen positiv und/oder negativ nach der Expression von spezifischen Markern selektiert. Durch Durchflusszytometrieanalyse und Sortieren nach Zelloberflächenmarkern, wie etwa jenen, die im Folgenden beschrieben werden, können vitale Zellen aussortiert werden. Ein solcher Marker von Interesse zur positiven Selektion ist das 5E12-Epitop. Andere Marker, die austauschbar mit 5E12 zur positiven Selektion verwendet werden können, schließen Ep-Cam, E-Cadherin und CD49f ein. Vorzugsweise werde die Zellen auch nach geringer Expression von HLA-Klasse-I-Antigenen selektiert, d. h. HLA-A, HLA-B und HLA-C. Andere Marker, die austauschbar mit HLA-Klasse-I-Antigenen verwendet werden können, schließen CD38 und CD54 ein. Zudem können die Zellen auch negativ selektiert oder als negativ charakterisiert werden für die Expression von CD117 und/oder CD14. Obwohl es üblicherweise nicht für die Selektion verwendet wird, ist die Expression der beiden zytoplasmatischen Proteine Albumin und CK19 für LEC charakteristisch.
Definitionen
Bei den im Folgenden angegeben Definitionen von Marker und Zellen wird der Begriff typischerweise bezüglich menschliche Proteine, Zellen und dergleichen definiert, wobei menschliche Zellen ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung sind. Es versteht sich für den Fachmann von selbst, dass andere Säugetiere ebenfalls als Quelle für Zellen dienen können und dass die Selektion von Zellen aus solchen nichtmenschlichen Spezies die Gegenstücke homolog und funktionell verwandte Marker für diese Spezies nutzen wird.
Leber-Transplantation. Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck „Leber-Transplantationszellen" auf eine Progenitorzellpopulation, die, wenn sie in ein Tier transplantiert wird, zu reifen Hepatozyten führt. Das Entwicklungspotential von Leber-Progenitorzellen kann durch funktionelle und phänotypische Kriterien beurteilt werden. Funktionell sind Hepatozyten durch ihre Fähigkeit, FAH-Mangel auszugleichen, und durch die Expression von leberspezifischen Proteinen gekennzeichnet, einschließlich Albumin, Alpha-1-Antitrypsin, Alpha-Fötoprotein etc. Hepatozyten sind zudem funktionell durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, mit Hepatitisviren infiziert zu werden, beispielsweise Hepatitis A (HAV), Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV), Hepatitis D (HDV), Hepatitis E (HEV) etc. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind auch in der Lage, zu BEC zu führen, die funktionell durch die Expression von Zytokeratin 19, durch multizellulare Duktalbildung und die Bildung von Gallenkanälchen zwischen einzelnen Monoschichtzellen gekennzeichnet sind.
Positives und negatives Anfärben. Die beanspruchten Leber-Transplantationszellen sind durch ihre Expression von Zelloberflächenmarkern gekennzeichnet. Während es im Fachgebiet üblich ist, Zellen als „positiv" oder „negativ" für einen bestimmten Marker zu bezeichnen, sind die tatsächlichen Expressionspegel ein quantitatives Merkmal. Die Zahl der Moleküle auf der Zelloberfläche kann um mehrere Logarithmen variieren, wenngleich sie immer noch als „positiv" charakterisiert werden. Es versteht sich für den Fachmann auch von selbst, dass eine Zelle, die negativ für das Anfärben ist, d. h. bei der der Pegel der Bindung eines markerspezifischen Reagens nicht nachweisbar unterschiedlich von einer Kontrolle ist, beispielsweise einer isotopenmarkierten Kontrolle, minimale Mengen des Markers exprimieren kann. Die Charakterisierung des Anfärbungspegels erlaubt eine feine Unterscheidung zwischen Zellpopulationen.
Die Färbungsintensität der Zellen kann durch Durchflusszytometrie überwacht werden, wobei Laser die quantitativen Pegel an Fluorochrom erfassen (die proportional zur Menge der Zelloberflächenmarker sind, die durch spezifische Reagenzien, beispielsweise Antikörper, gebunden werden). Zudem kann Durchflusszytometrie oder FACS verwendet werden, um Zellpopulationen auf der Grundlage der Intensität der Bindung an ein spezifisches Reagens sowie anderer Parameter, wie etwa der Zellgröße und der Lichtstreuung, zu separieren. Obwohl die absoluten Färbungspegel mit einem bestimmten Fluorochrom und einer bestimmten Reagenszubereitung differieren können, können die Daten auf eine Kontrolle normalisiert werden.
Um die Verteilung auf eine Kontrolle zu normalisieren, wird jede Zelle als ein Datenpunkt aufgenommen, der eine bestimmte Färbungsintensität aufweist. Diese Datenpunkte können gemäß einer Logarithmusskala dargestellt werden, wobei die Maßeinheit eine beliebige Färbungsintensität ist. Bei einem Beispiel können die am hellsten angefärbten Zellen in einer Probe um 4 Logarithmen intensiver sein als nicht angefärbte Zellen. Wenn sie auf diese Art und Weise dargestellt werden, ist es klar, dass die Zellen, die in den höchsten Logarithmus der Färbungsintensität fallen, hell sind, während jene in der niedrigsten Intensität negativ sind. Die „gering" positiv angefärbten Zellen weisen einen Färbungspegel über der Helligkeit einer isotyp abgestimmten Kontrolle auf, sind aber nicht so intensiv wie die am hellsten eingefärbten Zellen, die normalerweise in der Population gefunden werden. Gering positive Zellen können einzigartige Eigenschaften aufweisen, die sich von denen der negativ und hell angefärbten positiven Zellen der Probe unterscheiden. Eine alternative Kontrolle kann ein Substrat nutzen, das eine definierte Markerdichte auf seiner Oberfläche aufweist, beispielsweise eine angefertigte Bead- oder Zelllinie, die die positive Intensitätskontrolle bereitstellt.
Quellen für Progenitorzellen. Ex-vivo- und In-vitro-Zellpopulationen, die als Quelle für Zellen sinnvoll sind, können frische oder gefrorene Leberzellpopulationen, Gallengangzellpopulationen oder pankreatische Zellpopulationen etc. sein, die aus embryonalem, fötalem, pädiatrischem oder adultem Gewebe erhalten werden. Die Verfahren können darüber hinaus die Anreicherungs- oder Reinigungsprozeduren oder -schritte zur Zellisolation durch positive Selektion nach anderen zellspezifischen Markern umfassen. Die Progenitorzellen können aus irgendeiner Säugetierart erhalten werden, beispielsweise Menschen, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Nagern, beispielsweise Mausen, Ratten, Hamster, Primaten etc.
R2-Population. Populationen von Zellen, die Leber-Transplantationsprogenitorzellen umfassen, wie oben beschrieben, können auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung, Autofluoreszenz und Vitalität in der Gegenwart eines Vitalitätsfarbstoffs (wie etwa Propidiumiodid, 7-AAD etc. separiert werden. Die R2-Population, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Population von lebenden, autofluoreszenten Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung, wie sie in 1 gezeigt sind. Nach Anfärben mit dem Vitalfarbstoff Propidiumiodid (PI) färben sich die Zellen von Interesse nicht hell, d. h. sie sind PI^low. Diese Population von Zellen ist mit Leber-Transplantationsprogenitorzellen angereichert und enthält zudem einige kontaminierende Zellen, die Fibroblasten, Endothelzellen und dergleichen sein können.
5E12. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind positiv für die Expression von 5E12-Antigen. Der monoklonale 5E12-Antikörper wurde ursprünglich gegen neurale Zellen gezüchtet. Der Antikörper erkennt ein Protein von ungefähr 125 kDa. Die Hybridoma-Zelllinie, die den monoklonalen 5E12-Antikörper erzeugt, ist bei der American Type Culture Collection, Zugriffsnummer (siehe die Parallelanmeldung 60/119725 ), hinterlegt worden.
Ep-Cam. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind positiv für die Expression von Ep-Cam. Dieses Antigen ist auch bekannt als epitheliales Oberflächenantigen (ESA) und epitheliales Glykoprotein 2 (EGP-2). Ep-Cam vermittelt Ca² ⁺-unabhängige homotypische Zell-Zell-Adhäsionen. Die In-vivo-Expression von Ep-Cam hängt mit einer gesteigerten epithelialen Proliferation zusammen und korreliert negativ mit der Zelldifferenzierung. Eine regulatorische Funktion von Ep-Cam bei der Morphogenese von Epithelgewebe ist für eine Anzahl von Geweben demonstriert worden. Die Sequenz wird von Szala et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 3542–3546 offenbart. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 347197.
E-Cadherin. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind positiv für die Expression von E-Cadherin. E-Cadherin ist ein 120 kDa Transmembran-Glykoprotein, das in den Adherens junctions von Epithelzellen lokalisiert ist. Es verleiht über fünf extrazellulare, Calcium bindende Wiederholungseinheiten die calciumabhängige Zell-Zell-Adhäsion. Die Expression auf der Zelloberfläche führt zur Zellsortierung, wobei die Spezifität der homophilen Wechselwirkung durch die spezifischen extrazellulären Bereiche verliehen wird. Die intrazellulären Bereiche verknüpft es mit den zytoplasmatischen Partnern β-Catenin oder Plakoglobin (PG) und folglich mit α-Catenin und dem Actin-Netzwerk. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 610181.
CD49f. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind positiv für die Expression von CD49f. Integrin alpha 6 (CD49f) ist ein 150 kDa Transmembran-Protein, welches ein Teil eines Integrin-Heterodimers ist, das überwiegend von Epithelzellen exprimiert wird. Alpha 6 verbindet sich mit der Integrin-β1-Kette, so dass sich VLA-6 bildet, und mit der Integrin-β4-Kette, so dass sich die Laminin- und Kalinin-Rezeptoren bilden. CD48f wird hauptsächlich auf T-Zellen, Monozyten, Blutplättchen, Epithel- und Endothelzellen, Perineuralzellen und Trophoblasten der Plazenta exprimiert. Seine Sequenz kann bei Tamura et al. (1990) J. Cell Biol. 111: 1593–1604 gefunden werden. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 557511.
HLA Klasse I. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind negativ bis gering für die Klasse-I-HLA-Expression. Beispiele für die Klasse-I-Stellen sind HLA-A, -B und -C. Die Klasse-I-MHC-Antigene sind polymorphe zweikettige Zelloberflächen-Glykoproteine. Die schwere Kette besitzt ein Molekulargewicht von 44.000 und wird von 3 N-terminalen extrazellularen Domänen von jeweils 90 Aminosäuren, einem kleinen hydrophoben membranüberspannenden Segment und einer kleinen intrazellulären C-terminalen Domäne gebildet, siehe Malissen et al. (1982) Proc. Nat-Acad. Sci 79: 893–897. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 557349, welche mit der menschlichen Form eines monomorphen Epitops von Histokompatibilitäts-Klasse-I-Hauptantigenen reagieren.
CD54. Die aus adultem Lebergewebe isolierten Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind negativ für die Expression von CD54. Aus fötalem Lebergewebe isolierte Zellen können negativ oder positiv für die Expression von CD54 sein, sind aber im Allgemeinen weniger hell als CD54-positive Zellen, beispielsweise Zellen, die in der 5E12-Population gefunden werden. CD54 ist auch als interzellulares Adhäsionsmolekül (ICAM-1), 90 kDa, bekannt. Das CD54-Antigen ist ein Ligand für das mit der Leukozytenfunktion assoziierte Antigen-1 (CD11a/CD18) und beeinflusst sowohl die LFA-1-abhängige Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen als auch den Immunfunktionen verursachenden Zell-Zell-Kontakt. Das CD54-Antigen kann an Fibroblasten, Epithelzellen und Endothelzellen induzierbar sein. Bei normalem Gewebe ist die CD54-Antigendichte am höchsten in Endothel und wird durch Faktoren, wie etwa dem Aussetzen von Cytokinen, Entzündungen und neoplastischer Transformation gesteigert. Die Nukleotidsequenz von ICAM-1 wird von Simmons et al. (1988) Nature 331: 624–627 offenbart. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 347977.
CD117. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind negativ für die Expression von CD117. CD117 erkennt die Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit. Dieser Rezeptor ist insbesondere mit Stammzellen, einschließlich hämatopoietischen Stammzellen, in Verbindung gebracht worden. Als Ergebnis alternativer mRNA-Spleißung, proteolytischer Spaltung und der Verwendung von kryptischen internen Promotoren in bestimmten Zelltypen existieren mehrere Isoformen von c-Kit. Strukturell enthält c-Kit fünf immunglobulinartige Domänen extrazellular und eine katalytische Domäne intrazellular, die durch eine Einfügung von 77 Aminosäuren in zwei Bereiche unterteilt ist; die Sequenz kann bei Yarden et al. (1987) EMBO J. 6 (11): 3341–3351 gefunden werden. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 340529.
CD14. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung sind negativ für die Expression von CD14. CD14 ist ein Einzelstückgen, das 2 Proteinformen kodiert: ein über Glykosylphosphatidylinositol verankertes Membranprotein (mCD14) mit 50 bis 55 kD und ein aus Monozyten oder aus der Leber stammendes lösliches Serumprotein (sCD14), dem ein Anker fehlt. Beide Moleküle sind für die von Lipopolysaccharid (LPS) abhängige Signaltransduktion kritisch und sCD14 vermittelt Zellen, denen mCD14 fehlt, LPS-Sensitivität. Die Sequenz kann bei Govert et al. (1988) Sciences 239: 497–500 gefunden werden. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA.
CD34. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung können negativ oder positiv für die Expression von CD34 sein. CD34 ist ein monomeres Zelloberflächenantigen mit einer Molekülmasse von ungefähr 110 kD, das selektiv auf menschlichen hämatopoietischen Progenitorzellen exprimiert wird. Das Gen wird zusätzlich zu hämatopoietischen Progenitorzellen durch kleine Gefäß-Endothelzellen exprimiert und ist ein einkettiges, stark O-glykosiliertes Transmembran-Glykoprotein mit 105 bis 120 kDa. Die Sequenz wird von Simmons et al. (1992) J. Immun. 148: 267–271 offenbart. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 550760.
CD38. Die Leber-Transplantationszellen der Erfindung können negativ oder positiv für die Expression von CD38 sein, sind aber im Allgemeinen weniger hell als CD38-positive Zellen, beispielsweise solche Zellen, die in der 5E12-population gefunden werden. CD38 ist ein 30 Aminosäuren umfassendes Typ-II-Transmembranprotein mit einem kurzen N-terminalen zytoplasmatischen Schwanz und 4 C-terminalen extrazellularen N-Glykosilierungsstellen. Die Sequenz wird von Jackson et al. (1990) J. Immun. 144: 2811–2815 offenbart. Antikörper sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von BD-Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, Katalognummer 347680.
Isolation von Leber-Transplantationszellen
Die beanspruchten Leber-Transplantationszellen werden aus einer komplexen Mischung von Zellen durch Techniken abgetrennt, die für Zellen anreichern, die die beschriebenen Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise kann zur Expression von einem oder mehrerer aus 4E12, E-Cadherin, Ep-Cam und CD49f eine Population von Zellen aus der R2-Population selektiert werden. Die Zellen werden wahlweise nach geringer oder negativer Expression von HLA-Klasse-I-Antigenen (im Folgenden als HLA^low bezeichnet) selektiert. CD54 und CD38 können wechselweise mit HLA verwendet werden.
Zur Isolation von Zellen aus Gewebe kann eine geeignete Lösung zur Dispersion oder Suspension verwendet werden. Solch eine Lösung wird im Allgemeinen eine abgestimmte Salzlösung sein, beispielsweise normale Kochsalzlösung, PBS, Hanks abgestimmte Salzlösung etc., die zweckmäßigerweise mit fötalem Rinderserum oder anderen natürlich auftretenden Faktoren, in Verbindung mit einem verträglichen Puffer bei geringer Konzentration, im Allgemeinen von 5 bis 25 mM, versetzt wird. Geeignete Puffer schließen HEPES, Phosphatpuffer, Laktatpuffer etc. ein.
Die beanspruchten Zellen sind große Blastzellen, deshalb kann eine anfängliche Separation durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Methoden nach großen Zellen selektieren, einschließlich Elutration, Ficoll-Hipaque oder Durchflusszytometrie unter Verwendung der Parameter der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung zum Ausschleusen von Blastzellen.
Die Separation der beanspruchten Zellpopulation wird dann die Affinitätsseparation nutzen, um eine im Wesentlichen reine Population bereitzustellen. Die Techniken zur Affinitätsseparation können magnetische Separation unter Verwendung von mit Antikörpern beschichteten Kügelchen, Affinitätschromatographie, mit einem monoklonalen Antikörper verknüpften oder in Verbindung mit einem monoklonalen Antikörper verwendeten zytotoxischen Wirkstoff, beispielsweise Komplement und Zytotoxine, und „Überziehen" mit einem auf einer festen Matrix, beispielsweise eine Platte, angebrachten Antikörper oder eine andere zweckmäßige Technik einschließen. Die Techniken, die eine akkurate Separation liefern, schließen fluoreszenzaktivierte Zellsortierer ein, die verschiedene Grade an Raffinesse aufweisen können, wie etwa Mehrfarbenkanäle, Vorwärts- und Seitwärtsstreuungs-Detektionskanäle, Impedanzkanäle etc. Die Zellen können durch Einsetzen von Farbstoffen, die mit toten Zellen assoziiert sind (Propidiumiodid, 7-AAD), gegen tote Zellen selektiert werden. Es kann jede Technik eingesetzt werden, die nicht übermäßig nachteilig für die Vitalität der selektierten Zellen ist.
Die Affinitätsreagenzien können spezifische Rezeptoren oder Liganden für die oben angegebenen Zelloberflächenmoleküle sein. Die Details der Herstellung von Antikörpern und ihre Eignung zur Verwendung als spezifische Bindungselemente sind dem Fachmann wohlbekannt.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Antikörpern als Affinitätsreagenzien. Zweckmäßigerweise sind diese Antikörper mit einer Markierung zur Verwendung bei der Separation konjugiert. Markierungen schließen magnetische Kügelchen, die eine direkte Abtrennung erlauben, Biotin, das mit Avidin oder Streptavidin entfernt werden kann, das an einen Träger gebunden ist, Fluorochrome, die mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer verwendet werden können, oder dergleichen ein, um eine leichte Separation des einzelnen Zelltyps zu ermöglichen. Fluorochrome, die Verwendung finden, schließen Phycobiliproteine, beispielsweise Phycoerythrin und Allophycozyanine, Fluorescein und Texas-Rot ein. Häufig wird jeder Antikörper mit einem unterschiedlichen Fluorochrom markiert, um eine unabhängige Sortierung für jeden Marker zu ermöglichen.
Die Antikörper werden zu einer Suspension von Zellen gegeben und eine Zeitdauer lang inkubiert, die ausreicht, die verfügbaren Zelloberflächenantigene zu binden. Die Inkubation wird üblicherweise wenigstens etwa 5 Minuten und üblicherweise weniger als etwa 30 Minuten betragen. Es ist wünschenswert, dass die Konzentration an Antikörpern in der Reaktionsmischung derart ausreichend ist, dass die Effizienz der Separation nicht durch ein Fehlen von Antikörpern eingeschränkt ist. Die geeignete Konzentration wird durch Titration bestimmt. Das Medium, in dem die Zellen separiert werden, wird jedes Medium sein, das die Vitalität der Zellen aufrechterhält. Ein bevorzugtes Medium ist phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 0,1 bis 0,5 % BSA enthält. Es sind verschiedene Medien kommerziell erhältlich und können gemäß der Natur der Zellen verwendet werden, einschließlich Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), Hanks Basissalzlösung (HBSS), Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), RPMI, Iscoves Medium, PBS mit 5 mM EDTA etc., häufig ergänzt mit fötalem Rinderserum, BSA, HSA etc.
Die markierten Zellen werden dann wie der oben beschriebene Phänotyp isoliert. Die separierten Zellen können in jedem geeigneten Medium gesammelt werden, das die Vitalität der Zellen aufrechterhält, wobei üblicherweise am Boden des Sammelröhrchens ein Polster aus Serum vorhanden ist. Es sind verschiedene Medien kommerziell erhältlich und können gemäß der der Natur der Zellen verwendet werden, einschließlich DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, Iscoves Medium, häufig ergänzt mit fötalem Rinderserum.
Auf diese Art und Weise werden Zusammensetzungen erhalten, die stark auf Leber-Transplantationsaktivität angereichert sind. Die beanspruchte Population wird etwa 50 % oder mehr der Zellpopulation und üblicherweise 90 % oder mehr der Zellzusammensetzung betragen und kann soviel wie 95 % oder mehr der lebenden Zellpopulation ausmachen. Die angereicherte Zellpopulation kann unmittelbar verwendet werden oder kann bei Temperaturen des flüssigen Stickstoffs eingefroren und für lange Zeitdauern gelagert werden, wobei sie aufgetaut werden und in der Lage sind, wieder verwendet zu werden. Die Zellen werden üblicherweise in 10 % DMSO, 50 % FCS, 40 % RPMI 1640 Medium gelagert. Einmal aufgetaut können die Zellen unter Verwendung von Wachstumsfaktoren und/oder Bindegewebszellen zur Proliferation und Ausdifferenzierung vermehrt werden.
Die vorliegenden Verfahren sind bei der Entwicklung eines In-vitro- oder In-vivo-Modells für Hepatozytenfunktionen und sind auch bei Experimenten zur Gentherapie und zur künstlichen Organkonstruktion verwendbar. Die sich entwickelnden Hepatozyten dienen als wertvolle Quelle für neuartige Wachstumsfaktoren und Pharmazeutika und für die Produktion von Viren oder Impfstoffen (beispielsweise Hepatitisviren) sowie zum Studium von Leberparasiten oder Parasiten, die eine Entwicklungsstufe in der Leber aufweisen (beispielsweise Malariaorganismen), für In-vitro-Toxizitäts- und -metabolismustests von Arzneimitteln und industriellen Verbindungen, zu Gentherapieexperimenten (da die Leber das größte vaskuläre Organ des Körpers ist), zur Konstruktion von künstlichen Transplantationslebern und für Lebermutagenese- und -karzinogenesetests.
Funktionstest
Ein Test von Interesse zum Bestimmen der In-vitro-Fähigkeit von hepatischen Progenitorzellen ist ein Tiermodell mit erblicher Tyrosinämie Typ 1, einer schweren autosomal rezessiven Stoffwechselkrankheit, die die Leber und die Nieren beeinträchtigt und die durch einen Mangel an dem Enzym Fumarylacetoacetathydrolase (FAH). Die Behandlung von Mäusen, die homozygot für die FAH-Genstörung (FAH^-/-) sind, mit 2-(2-Nitro-4-trifluormethylbenzoyl)-1,3-cyclohexandion (NTBC) beseitigt die neonatale Sterblichkeit und korrigiert die Leber- und Nierenfunktionen. Das Tiermodel wird beispielsweise von Grompe et al. (1995) Nature Genetics 10: 4530–460, Oventurf et al. (1996) Nat. Genet. 12(3): 266–73 etc. beschrieben.
Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine FAH-Maus mit Leber-Transplantationszellen rekonstituiert, die menschliche Progenitorzellen oder Mauszellen sein können, die einen detektierbaren Marker umfassen. Beispielsweise können die Zellen in die Maus eingebracht werden, die eine bestrahlte Maus sein kann, und es kann zuerst ermöglicht werden, dass sich die Leber wiederherstellt, dann wird das NTBC abgesetzt, um zur hepatischen Rekonstitution zu selektieren. Alternativ kann NTBC unmittelbar nach dem Einbringen der Leber-Transplantationszellen abgesetzt werden. Die rekonstituierten Tiere sind zum Screening von Impfstoffen und viralen Wirkstoffen gegen hepatische Viren, beispielsweise Hepatitis A, B, C, D, E, für metabolische und Toxizitätstests von biologisch aktiven Wirkstoffen und dergleichen verwendbar.
In-vitro-Zellkultur
Die angereicherte Zellpopulation kann unter verschiedenen Kulturbedingungen in vitro gezüchtet werden. Wenn sie in Kultur gezüchtet wird, wachsen die beanspruchten Zellen als eine Monoschicht mit einer typischen Epithelzellmorphologie. Das Kulturzellmedium kann flüssig oder halbfest sein, beispielsweise Agar, Methylcellulose etc. enthalten. Die Zellpopulation kann zweckmäßigerweise in einem geeigneten Nährmedium suspendiert werden, wie etwa Iscoves modifiziertem DMEM oder RPMI-1640, normalerweise ergänzt mit fötalem Rinderserum (etwa 5 bis 10 %), L-Glutamin, einem Thiol, insbesondere 2-Mercaptoethanol, und Antibiotika, beispielsweise Penicillin und Streptomycin.
Die beanspruchten Zellen können in einer Kokultur mit Nährschichtzellen gezüchtet werden. Bindegewebszellen, die für die Verwendung als Nährschicht geeignet sind, schließen Knochenmark-Bindegewebszellen, beispielsweise die SYS-1-Zelllinie, FFS-1-Fibroblastzelllinie etc. ein. Andere Zellen, die als eine Nährschicht verwendet werden können, schließen Fibroblasten ein, die aus menschlichen oder anderen tierischen Quellen stammen, fötale Fibroblasten, die aus der Primärkultur aus der gleichen Spezies wie der Leber stammen, die STO-Fibroblastzelllinie etc. Diese Zellschichten stellen dem Medium nicht definierte Komponenten bereit und können die Ausdifferenzierung der pluripotenten Zellen hemmen. Die Kultur in der Gegenwart von Nährschichten ist zur klonalen Kultur verwendbar, d. h. bei der eine einzelne Progenitorzelle zu einer Population vermehrt wird.
Funktionstests können unter Verwendung von in vitro kultivierten Zellen, insbesondere klonogenen Kulturen von Zellen, ausgeführt werden. Beispielsweise können kultivierte Zellen auf ihre Fähigkeit getestet werden, leberspezifische Proteine zu exprimieren, einschließlich Albumin und Alpha-1-Antitrypsin. Die Expression kann irgendein zweckmäßiges Format nutzen, einschließlich RT-PCR, ELISA für die Gegenwart des Proteins in Kulturüberständen etc. Die kultivierten Zellen können auch auf ihre Fähigkeit getestet werden, Gallengangproteine zu exprimieren, beispielsweise CK19.
Die Kultur kann Wachstumsfaktoren enthalten, auf die die Zellen ansprechen. Wachstumsfaktoren, wie sie hierin definiert sind, sind Moleküle, die in der Lage sind, das Überleben, das Wachstum und/oder die Ausdifferenzierung der Zellen entweder in Kultur oder im intakten Gewebe über spezifische Effekte auf einen Transmembranrezeptor zu fördern. Wachstumsfaktoren schließen Polypeptide und Nicht-Polypeptidfaktoren ein. Spezielle Wachstumsfaktoren, die beim Kultivieren der beanspruchten Zellen verwendet werden können, schließen Hepatozyten-Wachstumsfaktor/Streufaktor (HGF), EGF, TGFα, sauren FGF ein (siehe Block et al. (1996) J. Biol Chem 132: 1133–1149), sind aber nicht darauf beschränkt. Die speziellen Kulturbedingungen werden so gewählt, dass ein bestimmter Zweck erreicht wird, d. h. Aufrechterhaltung der Progenitorzellaktivität etc. Zusätzlich zu den Wachstumsfaktoren oder anstelle dessen können die beanspruchten Zellen in einer Kokultur mit Bindegewebs- oder Nährschichtzellen gezüchtet werden. Zur Verwendung bei der Züchtung von Progenitorzellen geeignete Nährschichtzellen sind im Fachgebiet bekannt.
Die beanspruchten kokultivierten Zellen können auf vielerlei Weise verwendet werden. Beispielsweise kann das Nährmedium, das ein konditioniertes Medium ist, auf verschiedenen Stufen isoliert werden und die Komponenten können analysiert werden.
Die Separation kann mit HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Dialyse oder andere nichtdegenerative Techniken erreicht werden, die eine Sparation nach Molekulargewicht, Molekularvolumen, Ladung, Kombinationen davon oder dergleichen ermöglichen. Eine oder mehrere dieser Techniken können kombiniert werden, um weiter nach spezifischen Fraktionen anzureichern, die die Progenitorzellaktivität fördern.
Die beanspruchten Zellen können in Kultur in einem bindegewebszellfreien Medium vermehrt werden, wie es beispielsweise von Suzuki et al. (2000) Hepatology 32: 1230–1239 beschrieben wird. Solche Kulturen werden bevorzugt auf einem Substrat gezüchtet, das eine Schicht von extrazellularen Matrixkomponenten bietet, beispielsweise Laminin, Typ-IV-Kollagen, Typ-I-Kollagen, Fibronectin etc. Das Medium umfasst im Wesentlichen Wachstumsfaktoren, beispielsweise HGF, EGF etc.
Die Leber-Transplantationszellen können in Verbindung mit einem Kultursystem bei der Isolierung und Evaluation von Faktoren verwendet werden, die mit der Ausdifferenzierung und Reifung von Hepatozyten und BEC assoziiert sind. Somit können die Zellen in Tests verwendet werden, um die Aktivität von Medien zu bestimmen, wie etwa konditionierte Medien, um die Flüssigkeiten auf Wachstumsfaktoraktivität, Mitwirkung bei der Bildung spezieller Strukturen oder dergleichen zu beurteilen. Die Kulturen können auch als ein Mittel zur Verarbeitung von Arzneimitteln und anderer Komponenten verwendet werden, um die Wirkung des Leberstoffwechsels auf einen Wirkstoff von Interesse zu bestimmen. Beispielsweise kann das Produkt des Leberstoffwechsels isoliert und auf Toxizität und Wirksamkeit getestet werden.
Transplantation
Hepatisches Versagen geht mit systemischen Komplikationen einher, die mit schwerer Leberschädigung und -dysfunktion verbunden sind. Es kann bei einem Patienten ohne vorbestehende Leberkrankheit vorkommen oder einer chronischen Leberschädigung überlagert sein. Die Diagnose akuten Leberversagens erfordert das Vorhandensein von Symptomen, einschließlich Ikterus und Enzephalopathie. Fulminantes hepatisches Versagen beeinträchtigt alle Leberfunktionen, was verringerten Bilirubinstoffwechsel, verminderte Beseitigung von Ammoniak und aus dem Darm stammende Proteine und eine verminderte Produktion von Blutgerinnungsfaktoren verursacht. Es kann auch Nierenversagen, Schock und Sepsis verursachen. Ohne ein Lebertransplantat werden mehr als 50 % der Patienten sterben, üblicherweise aus einer Kombination der obigen Zustände. Die Mortalität beträgt auch unter den besten Umständen mehr als 50 %. Die Behandlung umfasst allgemeine unterstützende Maßnahmen, bis sich die Leber regenerieren und ihre Funktion wieder aufnehmen kann.
Die beanspruchten Zellen können zur Wiederherstellung der Leberfunktion in einem Empfänger verwendet werden. Allogen Zellen können zur Progenitorzellisolierung und anschließenden Transplantation verwendet werden. Die meisten der klinischen Manifestationen von Leberdysfunktion sind auf Zellschädigung und Schmälerung der normalen Leberkapazität zurückzuführen. Beispielsweise verursacht eine Virushepatitis die Schädigung und den Tod von Hepatozyten. In diesem Fall können Manifestationen gesteigerte Blutung, Ikterus und gesteigerte Pegel von zirkulierenden Hepatozytenenzymen umfassen. Wenn die Leberdysfunktion von Zuständen wie etwa Tumoren herrührt, können die beanspruchten Zellen aus dem autologen Lebergewebe isoliert und verwendet werden, um die Leberfunktion nach der Behandlung wiederherzustellen.
Lebererkrankung hat zahlreiche Ursachen, die von mikrobiellen Infektionen und Neoplasmen (Tumoren) bis zu Stoffwechsel- und Kreislaufproblemen reichen. Hepatitis geht mit Entzündung und Schädigung der Hepatozyten einher. Dieser Typ von Insult kann sich aus Infektionserregern, Toxinen oder Immunangriff ergeben. Allerdings ist der am häufigsten vorkommende Fall von Hepatitis die Virusinfektion. In den USA verursachen drei bedeutende Viren Hepatitis: die Hepatitisviren A, B und C. Zusammen infizieren sie jedes Jahr nahezu 500000 Menschen in den USA. Zudem können Bakterien, Pilze und Protozoen die Leber infizieren und die Leber ist zum Teil fast unvermeidlich bei allen durch Blut übertragenen Infektionen beeinträchtigt.
Zahlreiche Medikationen können die Leber schädigen, die von milder, asymtomatischer Änderung in der Leberchemie bis zu hepatischem Versagen und Tod reichen. Die Lebertoxizität kann dosisabhängig sein oder nicht. Tylenol (Acetominophen) ist ein hepatotoxisches Arzneimittel, Dilantin (ein krampflösendes Mittel) und Isoniazid (ein Antituberkulosemittel) sind Beispiele für Arzneimittel, die eine „virusartige" Hepatitis verursachen können. Sowohl Umwelt- als auch industrielle Toxine können eine große Vielfalt von Änderung in der Leber verursachen. Die hepatische Schädigung ist nicht notwendigerweise dosisabhängig und kann von milder, asymtomatischer Entzündung bis zu fulminantem Versagen oder progressiver Fibrose und Zirrhose reichen.
Probleme mit Stoffwechselprozessen in der Leber können entweder erblich bedingt oder erworben sein. Einige dieser Störungen, wie etwa Wilsonsche Krankheit und Hämochromatose, können sich als Hepatitis oder Zirrhose zeigen. Die Wilsonsche Krankheit ist eine seltene Erbkrankheit, die durch eine Unfähigkeit gekennzeichnet ist, Kupfer in die Galle auszuscheiden, was zur toxischen Ansammlung von Kupfer in der Leber und im Nervensystem führt. Hämochromatose ist ein Eisen-Überlastungssyndrom, das Eisenabscheidungen und folglich eine Schädigung verschiedener Organe verursacht, einschließlich der Leber, des Herzens, der Bauchspeicheldrüse und der Hirnanhangdrüse. Die Krankheit kann aufgrund einer ererbten Steigerung der Darmabsorption von Eisen oder mehrfacher Bluttransfusionen bestehen, da Eisen normalerweise in zirkulierenden roten Blutzellen gefunden wird.
Die Leber kann durch zahlreiche Erkrankungen beeinträchtigt werden, insbesondere Autoimmunstörungen, bei denen das Immunsystem das körpereigene normale Gewebe angreift. Einige Beispiele schließen rheumatische Erkrankungen, wie etwa systemischer Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis, und entzündliche Darmerkrankungen, wie etwa Colitis ulcerosa und Crohnsche Krankheit.
In die Zellen können vor der Kultur oder Transplantation zu unterschiedlichen Zwecken Gene eingebracht werden, beispielsweise um die Anfälligkeit für Infektionen zu verhindern oder zu vermindern, Gene zu ersetzen, die Funktionsausfallmutationen aufweisen etc. Alternativ werden Vektoren eingebracht, die Antisense-mRNA oder Ribozyme exprimieren, wodurch die Expression eines unerwünschten Gens blockiert wird. Andere Verfahren der Gentherapie sind die Einbringung arzneimittelresistenter Gene, um zu ermöglichen, dass normale Progenitorzellen einen Vorteil aufweisen und einem Selektionsdruck ausgesetzt werden, beispielsweise das Vielfach-Arzneimittelresistenzgen (MDR), oder Antiapoptosegene, wie etwa bci-2. Um die Zielzellen zu transfizieren, können verschiedene im Fachgebiet bekannte Techniken verwendet werden, beispielsweise Elektroporation, calciumgefällte DNA, Fusion, Transfektion, Lipofektion und dergleichen. Die besondere Art und Weise, auf die die DNA eingebracht wird, ist nicht kritisch, um die Erfindung zu nutzen.
Es sind viele Vektoren erhältlich, die zum Übertragen exogener Gene in Säugetierzellen verwendbar sind. Die Vektoren können episomal sein, beispielsweise Plasmide, aus Viren stammende Vektoren, wie etwa das Cytomegalievirus, das Adenvirus etc., oder können über homologe Rekombination oder zufällige Integration in das Zielzellgenom integriert werden, beispielsweise von Retroviren angeleitete Vektoren, wie etwa. MMLV, HIV-1, ALV etc. Für Beispiele für die Progenitor- und Stammzellgenänderung siehe Svendersen et al. (1999) Trends Neurosci 22(8): 357–64, Krawetz et al. (1999) Gene 234(1): 1–9, Pellegrini et al. Med Biol Eng Comput 36(6): 778–90 und Alison (1998) Curr Opin Cell Biol 10(6): 710–5.
Alternativ können die Leberprogenitoren immortalisiert-deimmortalisiert sein, siehe beispielsweise Kobayashi et al. (2000) Science 287: 1258–1262. Bei einer solchen Prozedur wird in die Zelle eine immortalisierende Gensequenz auf solche Art und Weise eingebracht, dass sie leicht entfernt werden kann, beispielsweise mit einer ortspezifischen Rekombinase, wie etwa dem Cre-lox-System.
Um zu überprüfen, dass jemand genetisch modifizierte Progenitorzellen aufweist, können verschiedene Techniken verwendet werden. Das Genom der Zellen kann mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen und mit oder ohne DNA-Amplifikation verwendet werden. Es können die Polymerase-Kettenreaktion, Gelelektrophorese, Restriktionsanalyse, Southern-, Northern- und Westernblot, Sequenzierung oder dergleichen sämtlich eingesetzt werden. Die Zellen können unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen in der Lage sind, auszudifferenzieren, während die Fähigkeit aufrechterhalten wird, die eingebrachte DNA zu exprimieren. Es können verschiedene Tests in vitro und in vivo eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass die pluripotente Fähigkeit der Zellen aufrechterhalten worden ist.
Die Zellen können in jedem physiologisch verträglichen Medium normalerweise intravaskulär, einschließlich intravenös, beispielsweise über die Leberpfortader, intralienal etc., verabreicht werden, obwohl sie auch in andere geeignete Stellen eingebracht werden können, an denen die Zellen eine geeignete Stelle zur Regeneration und Ausdifferenzierung finden können. Üblicherweise werden wenigstens 1 × 10³ Zellen/kg verabreicht, besser 1 × 10⁴ Zellen/kg, vorzugsweise 1 × 10⁶ Zellen/kg. Die Zellen können durch Injektion, Katheter oder dergleichen eingebracht werden.
Die beanspruchten Zellen finden Verwendung als kultivierte Zellen und für die Erzeugung von Hepatozyten für bioartifizielle Leber-Bioreaktoren, in denen die Hepatozyten durch eine Membran oder eine andere physikalische Barriere vom Perfusatstrom abgetrennt werden. Vier Geräte (Circe Biomedical HepatAssist^®, Vitagen ELADTM, Gerlach GELS und Excorp Medical BLSS), die Hepatozyten nutzen, die in Hohlfasermembranen kultiviert werden, befinden sich derzeit in der klinischen Erprobung. Während die Entwicklung von bioartifiziellen Leber-Unterstützungsgeräten (BLADs) für die Behandlung von akutem Leberversagen, entweder fulminante oder akute Dekompensation an chronischem Leberversagen, von großem Interesse ist, ist es bisher schwierig gewesen, sie auszuführen, teilweise weil Hepatozyten äußerst schwer in Kultur zu halten sind. Durch Kultivieren der beanspruchten Leber-Transplantationszellen wird solchen Geräten ein konstanter Zustrom bereitgestellt.
Bioartifizielle Leber-Bioreaktoren stellen eine oder mehrere der folgenden Funktionen bereit: oxidative Entgiftung (hauptsächlich über das Cytochrom P450 Enzymsystem), Biotransformation (beispielsweise Harnstoffsynthese, Glucuronidierung und Sulfatierung), Ausscheidung (über das Gallensystem), Protein- und Makromolekülsynthese, Intermediatmetabolismus (Gluconeogenese, Fettsäure und Aminosäure) und Modulation des Immun- und Hormonsystems.
Derzeitige BLADs in der klinischen Erprobung basieren auf der Verwendung von Hohlfaserpatronen, die Hepatozyten beherbergen, die im extraluminalen Raum der Hohlfasern kultiviert werden. Durch den luminalen Raum der Hohlfaserpatrone wird das gesamte Blut oder ein Plasmastrom perfundiert. Vor den Bioreaktoren kann ein Oxygenator, um die verfügbaren Sauerstoffpegel im Perfusionsstrom zu steigern, und Säulen oder Filter angeordnet werden, die verwendet werden, um Toxine vor dem Erreichen der Hepatozyten zu vermindern.
Andere Geräte können Plasma in einem axialen Fluss über und/oder durch ein Polyestervlies perfundieren, durch Kanäle, die in einer hochporösen Polyurethanschaumstruktur eingebettet sind, die mit Hepatozyten geimpft ist, über mikroporöse Polysulfon-Hohlfasermembranen, ein mikroporöses Polyvinylformal-Harzmaterial und dergleichen. Die Progenitorzellen und/oder abkömmliche Hepatozyten können verkapselt sein.
Expressionstest
Von besonderem Interesse ist die Untersuchung der Genexpression in Leber-Transplantationszellen. Der exprimierte Satz an Genen kann mit einer Vielfalt von Zellen von Interesse verglichen werden, beispielsweise mit adulten hepatischen Progenitorzellen, Stammzellen, hämatopoietischen Zellen etc., wie es im Fachgebiet bekannt ist. Beispielsweise kann man Experimente ausführen, um die Gene zu bestimmen, die während der Entwicklung reguliert werden.
Zum Detektieren spezifischer mRNA kann jedes geeignete qualitative oder quantitative Verfahren verwendet werden. mRNA kann beispielsweise durch Hybridisierung auf einem Mikroarray, In-situ-Hybridisierung in Gewebeschnitten, durch PCR mit Reverser Transkriptase oder in Northern Blots, die Poly-A⁺-mRNA enthalten, detektiert werden. Ein Fachmann kann diese Verfahren leicht nutzen, um Unterschiede in der Größe oder in der Menge von mRNA-Iranskripten zwischen zwei Proben zu bestimmen. Beispielsweise wird der Pegel einzelner mRNAs in Progenitorzellen mit der Expression der mRNAs in einer Referenzprobe, beispielsweise Hepatozyten oder anderen ausdifferenzierten Zellen, verglichen.
In Verbindung mit den Verfahren der Erfindung kann jedes geeignete Verfahren zum Erfassen und Vergleichen von mRNA-Expressionspegeln in einer Probe verwendet werden. Beispielsweise können mRNA-Expressionspegel in einer Probe durch Erzeugen einer Bibliothek von exprimierten Sequenztags (ESTs) aus einer Probe bestimmt werden. Die Aufzählung der relativen Repräsentation von ESTs innerhalb der Bibliothek kann verwendet werden, um die relative Repräsentation eines Gentranskripts innerhalb der Ausgangsprobe abzuschätzen. Die Ergebnisse der EST-Analyse einer Testprobe können dann mit einer EST-Analyse einer Referenzprobe verglichen werden, um den relativen Expressionspegel eines ausgewählten Polynukleotids zu bestimmen, insbesondere eines Polynukleotids, das einem oder mehreren exprimierten Genen entspricht, die hierin beschrieben werden.
Alternativ kann die Genexpression in einer Testprobe unter Verwendung des Verfahrens der seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) ausgeführt werden (Velculescu et al. (1995) Science 270: 484). SAGE umfasst die Isolierung kurzer einmaliger Sequenztags von einer spezifischen Stelle innerhalb eines jeden Iranskripts. Die Sequenztags werden verknüpft, geklont und sequenziert. Die Häufigkeit einzelner Transkripte innerhalb der Ausgangsprobe wird dadurch reflektiert, wie häufig das assoziierte Sequenztag mit der Sequenzpopulation anzutreffen ist.
Die Genexpression kann auch unter Verwendung des Differential-Display-Verfahrens (DD-Verfahren) analysiert werden. Bei DD werden Fragmente, die durch spezifische Polynukleotidsequenzen (oder Restrektionsenzymstellen) definiert sind, gekoppelt mit Information über die Fragmentlänge oder Fragmentstelle innerhalb des exprimierten Gens als einmalige Identifikatoren von Genen verwendet. Die relative Repräsentation eines exprimierten Gens innerhalb einer Probe kann dann auf der Grundlage der relativen Repräsentation des mit dem Gen assoziierten Fragments innerhalb des Pools aller möglichen Fragmente abgeschätzt. Die Verfahren und Anordnungen zum Ausführen von DD sind im Fachgebiet wohlbekannt, siehe beispielsweise US 5,776,683 und US 5,807,680 .
Alternativ kann die Genexpression in einer Probe unter Verwendung einer Hybridisierungsanalyse analysiert werden, die auf der Spezifität von Nukleotidinteraktionen beruht. Oligonukleotide oder cDNA kann verwendet werden, um selektiv DNA oder RNA mit spezifischer Sequenzaufbau und die Menge an RNA oder cDNA, hybridisiert an eine bekannte Fängersequenz, die qualitativ oder quantitativ bestimmt ist, zu identifizieren oder zu fassen, um Information über die relative Repräsentation einer einzelnen Botschaft innerhalb des Pools zellularer Botschaften in einer Probe bereitzustellen. Die Hybridisierungsanalyse kann so entworfen sein, dass sie ein gleichzeitiges Screening der relativen Expression von Hunderten bis Tausenden von Genen erlaubt, beispielsweise durch Verwendung arraybasierter Technologien, die Formate mit hoher Dichte aufweisen, einschließlich Filter, Mikroskop-Objektträger oder Mikrochips, oder lösungsbasierte Technologien, die eine spektroskopische Analyse (beispielsweise Massenspektroskopie) verwenden. Eine exemplarische Verwendung von Arrays bei den diagnostischen Verfahren wird im Folgenden detaillierter beschrieben.
Die Hybridisierung auf Arrays kann ausgeführt werden, wobei die Arrays gemäß jedem im Fachgebiet bekannten geeigneten Verfahren hergestellt werden können. Beispielsweise werden in US 5,134,854 und US 5,445,934 Verfahren zur Herstellung großer Arrays von Oligonukleotiden unter Verwendung lichtgesteuerter Synthesetechniken. Unter Verwendung eines computergesteuerten Systems wird ein heterogenes Array von Monomeren durch simultanes Kuppeln an zahlreichen Reaktionsstellen in ein heterogenes Array von Polymeren umgewandelt. Alternativ werden Mikroarrays durch Abscheidung von vorsynthetisierten Oligonukleotiden auf einem festen Substrat erzeugt, beispielsweise wie es in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 95/35505 beschrieben ist.
Verfahren zur Sammlung von Daten aus der Hybridisierung von Proben mit einem Array sind im Fachgebiet ebenso wohlbekannt. Beispielsweise können die Polynukleotide der Zellproben unter Verwendung einer detektierbaren Fluoreszenzmarkierung und Hybridisierung der Polynukleotide in den Proben, die durch Rastern der Mikroarrays nach der Anwesenheit der detektierbaren Markierung erfasst werden, erzeugt werden. Die Verfahren und Vorrichtungen zum Detektieren fluoreszenzmarkierter Ziele auf Anordnungen sind im Fachgebiet bekannt. Im Allgemeinen umfassen solche Detektionsvorrichtungen ein Mikroskop und eine Lichtquelle zum Ausrichten von Licht auf ein Substrat. Ein Photonenzähler erfasst die Fluoreszenz vom Substrat, während eine x-y-Translationsbühne die Stelle des Substrats variiert. Ein Konfokaldetektionsgerät, das bei den betreffenden Verfahren verwendet werden kann, wird im US-Patent Nr. 5,631,734 beschrieben. Ein Rasterlasermikroskop wird von Shalon et al. (1996) Genome Res 6: 639 beschrieben. Unter Verwendung einer geeigneten Anregungslinie wird für jeden verwendeten Fluorophor eine Abtastung ausgeführt. Die aus der Abtastung erzeugten Digitalbilder werden dann zur anschließenden Analyse kombiniert. Für jedes einzelne Arrayelement wird das Verhältnis des Fluoreszenzsignals einer Probe mit dem Fluoreszenzsignal einer anderen Probe verglichen und die relative Signalintensität bestimmt.
Verfahren zum Analysieren der aus der Hybridisierung an Arrays gesammelten Daten sind im Fachgebiet wohlbekannt. Wenn die Detektion mit einer Fluoreszenzmarkierung einhergeht, kann die Datenanalyse beispielsweise die Schritte des Erfassen der Fluoreszenzintensität als eine Funktion der Substratposition von den gesammelten Daten, Entfernen von Ausreißern, d. h. Daten, die von einer festgelegten statistischen Verteilung abweichen, und Berechnen der relativen Bindungsaffinität der Ziele aus den verbleibenden Daten. Die sich ergebenden Daten können als ein Bild dargestellt werden, bei dem die Intensität in jedem Bereich gemäß der Bindungsaffinität zwischen Zielen und Sonden variiert.
Ein Musterabgleich kann manuell ausgeführt werden oder kann unter Verwendung eines Computerprogramms ausgeführt werden. Verfahren zur Herstellung von Substratmatrizen (beispielsweise Arrays), Entwurf von Oligonukleotiden zur Verwendung mit solchen Matrizen, Markieren von Sonden, Hybridisierungsbedingungen, Rastern von hybridisierten Matrizen und Analyse von erzeugten Muster, umfassend Vergleichsanalyse, sind beispielsweise in US 5,800,992 beschrieben.
Bei einem anderen Screeningverfahren wird die Testprobe auf dem Proteinniveau getestet. Die Diagnose kann unter Verwendung irgendeines aus einer Vielzahl von Verfahren bewerkstelligt werden, um die Abwesenheit oder Anwesenheit oder geänderte Mengen eines differentiell exprimierten Polypeptids in der Testprobe zu bestimmen. Beispielsweise kann die Detektion das Anfärben von Zellen oder histologischen Schnitten (beispielsweise aus einer Biopsieprobe) mit markierten Antikörpern, ausgeführt gemäß herkömmlichen Verfahren. Die Zellen können permeabilisiert werden, um zytoplasmatische Moleküle anzufärben. Im Allgemeinen werden einer Probe Antikörper hinzugefügt, die spezifisch an differenziell exprimierte Polypeptide der Erfindung binden, und eine Zeitdauer lang inkubiert, die ausreicht, an das Epitop zu binden, üblicherweise wenigstens etwa 10 Minuten. Der Antikörper kann zur gerichteten Detektion detektierbar markiert werden (beispielsweise unter Verwendung von Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffen, Chemilumineszenzfarbstoffen und dergleichen) oder kann in Verbindung mit einem Antikörper zweiter Stufe oder Reagenz verwendet werden, um die Bindung zu detektieren (beispielsweise Biotin, das mit Meerrettich-Peroxidase mit Avidin konjugiert ist, einem sekundären Antikörper, der an eine Fluoreszenzverbindung konjugiert ist, beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot etc.). Die Abwesenheit oder Anwesenheit von Antikörperbindung kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, einschließlich Durchflusszytometrie von dissoziierten Zellen, Mikroskopie, Radiographie, Szintillationszählung etc. Jedes geeignete alternative Verfahren zur qualitativen und quantitativen Erfassung von Pegeln oder Mengen von differentiell exprimierten Polypeptiden kann verwendet werden, beispielsweise ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation, Radioimmunassay etc.
Screeningtests
Die beanspruchten Zellen sind für In-vitro-Tests und zum In-vitro-Screening verwendbar, um Wirkstoffe zu detektieren, die die Leber-Transplantationszellen und die aus den Leber-Transplantationszellen erzeugten Hepatozyten beeinträchtigen. Zu diesem Zweck kann eine große Vielfalt von Tests verwendet werden, einschließlich toxikologischer Tests, Immunassays für die Proteinbindung, Bestimmung des Zellwachstums, der Ausdifferenzierung und funktionellen Aktivität, Produktion von Hormonen und dergleichen.
Bei Screeningtests für biologisch aktive Wirkstoffe, Viren etc. werden die beanspruchten Zellen, üblicherweise eine Kultur, die die beanspruchte Zellen umfasst, mit dem Wirkstoff von Interesse in Kontakt gebracht und die Wirkung des Wirkstoffs durch Beobachtung von Ausgangsparametern, wie etwa Expression von Markern, Zellvitalität und dergleichen, abgeschätzt. Die Zellen können wie oben beschrieben frisch isoliert werden, kultiviert, genetisch verändert oder dergleichen. Die Zellen können umweltbedingt erzeugte Varianten klonaler Kulturen sein, beispielsweise in unabhängige Kulturen geteilt und unter bestimmten Bedingungen gezüchtet werden, beispielsweise mit oder ohne Viren, in der Gegenwart oder in Abwesenheit anderer Cytokine oder Kombinationen davon. Die Art und Weise, auf die die Zellen auf einen Wirkstoff reagieren, insbesondere auf einen pharmakologischen Wirkstoff, einschließlich des Reaktionszeitverhaltens, ist eine wichtige Spiegelung des physiologischen Zustands der Zelle.
Die Parameter sind quantifizierbare Komponenten der Zelle, insbesondere Komponenten, die genau gemessen werden können, vorzugsweise in einem Hochdurchsatzsystem. Parameter kann jede Zellkomponente oder jedes Zellprodukt sein, einschließlich Zelloberflächendeterminanten, Rezeptoren, Proteine oder konformative oder posttranslationale Modifikationen davon, Lipide, Kohlenhydrate, organische oder anorganische Moleküle, Nukleinsäuren, beispielsweise mRNA, DNA etc., oder ein aus einer solchen Zellkomponente stammender Teil oder Kombinationen davon. Während die meisten Parameter ein quantitatives Auslesen erlauben, wird in einigen Fällen ein halbquantitatives oder Qualitatives Ergebnis akzeptabel sein. Ablesungen können einen einzelnen bestimmten Wert umfassen oder können Mittelwerte, Medianwerte oder die Varianz etc. umfassen. Charakteristischerweise wird für jeden Parameter aus einer Vielzahl von gleichen Tests ein Bereich von Parameterauslesewerten erhalten werden. Variabilität ist zu erwarten und es wird für jeden der Sätze von Testparametern unter Verwendung von statistischen Standardverfahren mit einem gebräuchlichen statistischen Verfahren, das verwendet wird, um einzelne Werte bereitzustellen, ein Bereich von Werten erhalten werden.
Wirkstoffe von Interesse zum Screening schließen bekannte und unbekannte Verbindungen ein, die zahlreichen chemischen Klassen angehören, vorrangig organische Moleküle, die metallorganische Moleküle einschließen können, anorganische Moleküle, genetische Sequenzen etc. Ein wichtiger Gesichtspunkt der Erfindung ist es, Arzneimittelkandidaten zu beurteilen, einschließlich Toxizitätstests, um die Wirkung von hepatischen Viren zu testen, beispielsweise Hepatitisviren A, B, C, D, E, antivirale Wirkstoffe und dergleichen.
Zusätzlich zu komplexen biologischen Wirkstoffen, wie etwa Viren, schließen Wirkstoffkandidaten organische Moleküle ein, die funktionelle Gruppen umfassen, die für strukturelle Wechselwirkungen notwendig sind, insbesondere Wasserstoffbrückenbindung, und schließen typischerweise wenigstens eine Amino-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe ein, häufig wenigstens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Wirkstoffkandidaten umfassen häufig carbozyklische oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Wirkstoffkandidaten werden auch unter Biomolekülen gefunden, einschließlich Peptiden, Polynukleotiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, strukturellen Analoga oder Kombinationen davon.
Eingeschlossen sind pharmakologisch aktive Arzneimittel, genetisch aktive Moleküle etc. Verbindungen von Interesse schließen chemotherapeutische Wirkstoffe, Hormone oder Hormonantagonisten etc. ein. Beispiele von pharmazeutischen Wirkstoffen, die für diese Erfindung geeignet sind, sind jene, die in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman und Gilman, McGraw-Rill, New York, N. Y., (1996), neunte Auflage, unter den folgenden Abschnitten beschrieben werden: Wasser, Salz und Ionen; die Nierenfunktion und den Elektrolytstoffwechsel beeinflussende Arzneimittel, die Gastrointestinalfunktion beeinflussende Arzneimittel; Chemotherapie von mikrobiellen Krankheiten; Chemotherapie von neoplastischen Krankheiten; an blutbildenden Organen wirkende Arzneimittel; Hormone und Hormonantagonisten; Vitamine; Dermatologie und Toxikologie, die alle hierin durch Inbezugnahme übernommen werden. Ebenso eingeschlossen sind Toxine und biologische und chemische Kampfstoffe, siehe beispielsweise Somani, S. M. (Hrsg.), "Chemical Warfare Agents", Academic Press, New York, 1992.
Testverbindungen schließen alle der oben beschriebenen Klassen von Molekülen ein und können darüber hinaus Proben von unbekanntem Inhalt umfassen. Von Interesse sind komplexe Mischungen von natürlich auftretenden Verbindungen, die aus natürlichen Quellen, wie etwa Pflanzen, stammen. Während viele Proben Verbindungen in Lösung umfassen werden, können auch feste Proben getestet werden, die in einem geeigneten Lösemittel gelöst werden können, beispielsweise Grundwasser, Seewasser, Mienenabfall etc., biologische Proben, beispielsweise aus Kulturpflanzen hergestellte Lysate, Gewebeproben etc., Produktionsproben, beispielsweise zeitlicher Verlauf während der Herstellung von Pharmazeutika, sowie Bibliotheken von zur Analyse hergestellten Verbindungen und dergleichen. Proben von Interesse schließen Verbindungen ein, die auf ihren potentiellen therapeutischen Wert getestet werden, d. h. Arzneimittelkandidaten.
Der Ausdruck Proben schließt zudem die oben beschriebenen Flüssigkeiten ein, denen zusätzliche Komponenten hinzugefügt worden sind, beispielsweise Komponenten, die die Innenstärke, den pH, die Gesamtproteinkonzentration etc. beeinflussen. Zusätzlich können die Proben behandelt werden, um wenigstens eine Teilfraktion oder -konzentration zu erzielen. Biologische Proben können gelagert werden, wenn darauf Acht gegeben wird, dass die Zersetzung der Verbindung vermindert wird, beispielsweise unter Stickstoff, gefroren oder einer Kombination davon. Das verwendete Probenvolumen reicht aus, um eine messbare Detektion zu ermöglichen, üblicherweise sind etwa 0,1 μl bis 1 ml an biologischer Probe ausreichend.
Die Verbindungen, einschließlich Wirkstoffkandidaten, werden aus einer Vielfalt von Quellen erhalten, einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Beispielsweise sind zahlreiche Mittel für die zufällige und gerichtete Synthese einer breiten Vielfalt von organischen Verbindungen zugänglich, einschließlich Biomoleküle, die die Expression von zufälligen Oligonukleotiden und Oligopeptiden einschließen. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in der Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten zugänglich oder leicht herzustellen. Zudem werden natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht über herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel und können verwendet werden, um kombinatorische Bibliotheken herzustellen. Bekannte pharmakologische Wirkstoffe können gerichteten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterworfen werden, wie etwa Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung etc., um strukturelle Analoga herzustellen.
Die Wirkstoffe werden durch Zufügen des Wirkstoffs zu wenigstens einer und üblicherweise einer Vielzahl von Zellproben, üblicherweise in Verbindung mit Zellen, denen der Wirkstoff fehlt, auf biologische Aktivität überprüft. Die Änderung der Parameter in Reaktion auf den Wirkstoff wird gemessen und das Ergebnis durch Vergleich zu Referenzkulturen beurteilt, beispielsweise in der Gegenwart oder in Abwesenheit des Wirkstoffs, erhalten mit anderen Wirkstoffen etc.
Die Wirkstoffe werden zweckmäßigerweise in Lösung oder in leicht löslicher Form dem Medium der Zellkultur zugefügt. Die Wirkstoffe können in einem Durchflusssystem als Strom, intermittierend oder kontinuierlich, oder alternativ durch Zugeben eines Bolus einer Verbindung, einzeln oder schrittweise, zu einer sonst statischen Lösung zugegeben werden. In einem Durchflusssystem werden zwei Flüssigkeiten verwendet, wobei eine davon eine physiologisch neutrale Lösung ist und die andere die gleiche Lösung mit der zugefügten Testsubstanz ist. Die erste Flüssigkeit wird über die Zellen laufen gelassen, gefolgt von der zweiten. Bei einem Einzellösungsverfahren wird ein Bolus der Testverbindung zu dem Volumen des die Zellen umgebenden Mediums gegeben. Die Gesamtkonzentrationen der Verbindungen des Kulturmediums sollten sich bei der Zugabe des Bolus oder zwischen den zwei Lösungen bei einem Durchflussverfahren nicht signifikant ändern.
Bevorzugte Wirkstoffformulierungen enthalten keine zusätzlichen Komponenten, wie etwa Konservierungsmittel, die eine signifikante Wirkung auf die Gesamtformulierung aufweisen können. Derartige bevorzugte Formulierungen bestehen im Wesentlichen aus einer biologisch aktiven Verbindung und einem physiologisch verträglichen Träger, beispielsweise Wasser, Ethanol, DMSO etc. Wenn allerdings eine Verbindung ohne Lösungsmittel flüssig ist, kann die Formulierung im Wesentlichen aus der Verbindung selbst bestehen.
Eine Vielfalt von Tests kann parallel mit verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen ausgeführt werden, um eine unterschiedliche Reaktion auf die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Wie es im Fachgebiet bekannt ist wird beim Bestimmen der wirksamen Konzentration eines Wirkstoffs typischerweise ein Bereich von Konzentrationen genutzt, die sich aus 1:10 oder anderen logarithmischen Verdünnungen ergeben. Die Konzentrationen können, wenn nötig, mit einer zweiten Verdünnungsreihe weiter verfeinert werden. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als eine negative Kontrolle, d. h. mit der Konzentration null oder unter dem Detektionspegel des Wirkstoffs oder mit der Konzentration des Wirkstoffs, die keine detektierbare Änderung im Phänotyp ergibt oder darunter.
Zum Quantifizieren des Vorhandenseins der ausgewählten Marker können verschiedene Verfahren genutzt werden. Zum Messen der Menge eines Moleküls, das vorhanden ist, ist ein zweckmäßiges Verfahren, ein Molekül mit einem detektierbaren Rest zu markieren, der fluoreszent, lumineszent, radioaktiv, enzymatisch aktiv etc. ist, insbesondere ein Molekül, spezifisch zur Bindung an den Parameter mit hoher Affinität. Fluoreszente Reste zum Markieren nahezu jeden Biomoleküls, jeder Struktur oder jedes Zelltyps sind leicht erhältlich. Immunfluoreszente Reste können darauf gerichtet sein, nicht nur an spezielle Proteine zu binden, sondern auch an spezielle Konformationen, Spaltprodukte oder Stellenmodifikationen, wie Phosphorylierung. Einzelne Peptide und Proteine können so gestaltet werden, dass sie autofluoreszent sind, beispielsweise durch deren Expression als grüne fluoreszente Proteinchimären innerhalb der Zellen (für einen Übersichtsartikel siehe Jones et al. (1999) Trends Biotechnol. 17(12): 477–81. Auf diese Weise können Antikörper genetisch modifiziert werden, um einen Fluoreszenzfarbstoff als Teil des Substrats bereitzustellen. In Abhängigkeit von der gewählten Markierung können Parameter unter Verwendung anderer Markierungen als Fluoreszenzmarkierungen gemessen werden, unter Verwendung solcher Immunassaytechniken, wie Radioimmunassay (RIA) oder enzymgekoppeltem Immunabsorptionstest (ELISA), homogenen Enzymimmunassays und verwandten nichtenzymatischen Techniken. Die Quantifizierung von Nukleinsäuren, speziell Messenger-RNAs, ist ebenso als ein Parameter von Interesse. Diese kann durch Hybridisierungstechniken gemessen werden, die von der Sequenz von Nukleinsäure-Nukleotiden abhängen. Die Techniken schließen Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion sowie Genarray-Techniken ein. Siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2000; Freeman et al. (1999) Biotechniques 26(1): 112–225; Kawamoto et al. (1999) Genome Res 9(12): 1305–12, und Chen et al. (1998) Genomics 51(3): 313–24.
Experimentelles
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um den Fachmann mit einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung zu versorgen, wie die beanspruchte Erfindung anzufertigen und zu nutzen ist, und sind nicht dazu gedacht, den Umfang dessen zu beschränken, was als die Erfindung angesehen wird. Es wurden Anstrengungen unternommen, Genauigkeit bezüglich der verwendeten Zahlen (beispielsweise Mengen, Temperaturen, Konzentrationen etc.) sicherzustellen, aber einige experimentellen Fehler und Abweichungen sollten dabei erlaubt sein. Soweit es nicht anders angegeben ist, sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist das mittlere Molekulargewicht, die Temperatur wird in Grad Celsius angegeben und der Druck ist oder ist nahezu Atmosphärendruck.
Alle in dieser Beschreibung zitierten Publikationen und Patentanmeldungen werden hierin durch Inbezugnahme übernommen, so als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung speziell und einzeln als durch Inbezugnahme übernommen indiziert wäre. Die Zitierung irgendeiner Publikation dient der Offenbarung vor dem Anmeldedatum und sollte nicht als Anerkennung ausgelegt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht dazu berechtigt ist, solch eine Publikation durch eine frühere Erfindung vorwegzunehmen.
Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung nicht auf die einzelnen beschriebenen Verfahren, Protokolle, Zelllinien, Tierspezies oder -gattungen und Reagenzien beschränkt sind, soweit sie variieren können. Es versteht sich von selbst, dass die hierin verwendete Terminologie nur bezweckt, einzelne Ausführungsbeispiele zu beschreiben, und nicht dazu gedacht ist, den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken, die nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt werden wird.
Wie sie hierin verwendet werden, schließen die Singularformen „ein(e)" und „der/die/das" Pluralreferenten ein, soweit der Kontext nicht klar anderes vorgibt. Somit schließt beispielsweise die Bezugnahme auf „eine Zelle" eine Vielzahl von solchen Zellen ein und eine Bezugnahme auf „das Protein" schließt die Bezugnahme auf ein oder mehrere Proteine und Äquivalente davon ein, die dem Fachmann bekannt sind, usw. Alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe besitzen die gleiche Bedeutung wie sie allgemein von einem auf dem Fachgebiet, dem diese Erfindung angehört, Bewanderten verstanden wird, soweit es nicht klar anders angegeben ist.
Beispiel 1: Durchflusszytometrie-Sortierung von menschlichen Leberzellen
Die Zweifach-Laser-Durchflusszytometrieanalyse und -sortierung von menschlichen Leberzellen aus fötalem und adultem Gewebe wurde an einem Becton Dickinson FACSVantage SE ausgeführt. Ein Argon-Innenlaser und ein Helium-Neon-Laser wurden als primäre und sekundäre Anregungsquellen verwendet, die 150 mW bei der Wellenlänge 488 nm bzw. 30 mW bei der Wellenlänge 633 nm emittiert. Licht, das mit gestreckten und rechten Winkeln gestreut wird, wurde linear verstärkt und über 48 nm Bandpassfilter gemessen, wobei ein 0,6 OD Neutraldichtefilter vor dem Vorwärtsstreuungsdetektor eingesetzt wird, um die hochpegeligen Vorwärtsstreuungssignale abzuschwächen, die sich aus den Populationen mit größeren Zellen ergeben. Bei diesem Aufbau ist an der Vorwärtsstreuungsachse ein ausreichender Dynamikbereich vorhanden, um die Vorwärtsstreuungssignale einzufangen und zu skalieren, die sich aus dem unterschiedlichen Bereich der Zellgrößen ergibt, der bei Lebergewebe innerhalb einer einzelnen linearen Dekade gefunden wird. Typische Vorwärtsstreuungs-Verstärkungseinstellungen rangieren von 8 bis 16. FITC-, PE- und PI-Fluorochrome wurden alle bei 488 nm angeregt und Fluoreszenzemissionen wurden jeweils unter Verwendung von 530/30, 585/42, 610/20 nm Bandpassfiltern gemessen. APC- und APC-Cy7-Fluorochrome wurden bei 633 nm angeregt und Fluoreszenzemissionen wurden jeweils unter Verwendung von 660/20-Bandpass- und 750-Langpassfiltern gemessen. Alle Immunfluoreszenzmessungen wurden logarithmisch verstärkt.
Die Spannungseinstellungen für jeden Fluoreszenzkanal wurden unter Verwendung der Spherotech RFP 30-5 Referenzteilchen kalibriert. Nach der Kalibrierung wurden unter Verwendung von einzelnen Farbkontrollen empirisch Ausgleichseinstellungen erhalten.
Die Konfiguration Strömungseinstellungen am Durchflusszytometer wird für die besondere Größenverteilung und die Eigenschaften der Zellen optimiert, die in dem aus Leber stammenden Gewebe gefunden werden. Es wurden eine speziell angefertigte Düsenspitze mit einem Lochdurchmesser von 130 μm und eine Hülsendruckeinstellung von 10 psi verwendet. Die Temperatur des Hülsenreservoirs, der Probenhalterung und des Aufnahmerohrs wurden durch einen Gefrierzirkulator alle bei 4°C gehalten.
Zusammenhängende Subpopulationen von aus Leber stammenden Zellen können durch Zugabe von PI zur Zellsuspension, Unterwerfen der Zellen der Durchflusszytometrie und Analysieren der Daten als eine graphische Darstellung der Vorwärtsstreuung gegen die PI-Fluoreszenz identifiziert werden. Drei eindeutige Populationen können gemäß den folgenden Attributen aufgelöst werden: ein kleiner Zellverband, der geringe Vorwärtsstreuung und geringe Fluoreszenz (R1) zeigt, ein großer Zellverband, der hohe Vorwärtsstreuung und mittlere Fluoreszenz (R2) zeigt, und tote Zellen, die den dritten eindeutigen Verband mit einem Kontinuum von geringen bis mittleren Vorwärtsstreuungssignalen und sehr hoher Fluoreszenz umfassen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die R2-Subpopulation zeigt sich durch Ausführen der oben beschriebenen Analyse in Abwesenheit von Pi als autofluoreszent. Zwei eindeutige Populationen können gemäß den folgenden Attributen aufgelöst werden: ein kleiner Zellverband, der geringe Vorwärtsstreuung und geringe Fluoreszenz zeigt und ein großer Zellverband, der hohe Vorwärtsstreuung und mittlere Fluoreszenz zeigt.
Aggregate werden unter Verwendung von Impulsverarbeitung durch Auftragen der Vorwärtsstreuungsspitzenhöhe gegen die Breite, die die Basis des dritten Bereichs bildet, diskriminiert. Ein Sortiergatter wird als Schnitt dieser drei Bereiche definiert. Die primäre Anreicherung der Zielpopulation wird in der ersten Sortierungsrunde erhalten. Das angereicherte Produkt kann dann auf relative Reinheit rücksortiert werden. Die Produktreinheit wird immer durch Rückanalyse verifiziert.
Beispiel 2: Isolierung einer Leber-Progenitorzelle
Leberzellen, die zuvor eingefroren wurden, oder frisch isolierte Leberzellen wurden mit 5E12 angefärbt. Die Zellen wurden durch eine MACS-Säule unter Verwendung von 5E12 Ab nach 5E12 angereichert, dann wurden 5E12⁺-Zellen sortiert. Alternativ wurden 5E12⁺-Zellen direkt nach dem Anfärben sortiert. Für das Sortieren wurden die Zellen zwischen R1 und R2 aufgetrennt. R2/5E12⁺-Zellen repräsentieren die Mehrheit der Leber-Transplantationszellen in einem In-vitro- und In-vivo-Test. Die Zellen wurden durch die Expression von ck19 und Albumin in der gleichen Zelle charakterisiert (gezeigt in 2A und 2B). Zusätzlich zu 5E12 wurde zur Anreicherung für die Leber-Transplantation unter Verwendung eines Antikörpers, der auf menschliches HLA Klasse I A, B, C reagiert (W6-32-Antikörper), nach geringeren Pegeln der Expression von HLA Klasse I selektiert. Beim Ausschleusen der R2-Zellen können durch Analyse der 5E12-Fluoreszenz gegen die HLA-Klasse-I-Fluoreszenz als zweidimensionale Dichte oder Konturdiagramm (1) drei eindeutige zusammenhängende Subpopulationen von Zellen aufgelöst werden. Eine Subpopulation zeigt negatives Anfärben sowohl für 5E12 als auch HLA Klasse I (5E12^– HLA^–), eine zweite Subpopulation zeigt einen geringeren relativen Pegel der 5E12-Fluoreszenz und höhere Pegel der HLA-Klasse-I-Fluoreszenz (5E12^– HLA⁺) und eine dritte Subpopulation zeigt höhere Pegel der 5E12-Fluoreszenz und geringere Pegel der HLA-Klasse-I-Fluoreszenz (5E12⁺ HLA^low).
Während die Analyse einer einzelnen Färbung, d. h. einer Farbe, nicht notwendigerweise eine klare Populationsentscheidung liefert, ist es aus den Figuren klar, dass in einem Zweifarbendiagramm die Zellen in eindeutige Subpopulationen fallen.
Ergebnisse:
Es wird ein Verfahren zum Anreichern nach Leber-Progenitorkolonien durch Sortieren nach der Expression von Zelloberflächen-Antigenen bereitgestellt. Aus den Ergebnissen eines Klonierungstests sortierter menschlicher fötaler Leberzellen wurden Zellen durch Vitalität (PI), Größe (VS) und Autofluoreszenz sortiert und wurden dann durch Oberflächenantikörper weiter separiert und auf FFS oder BMS-6 plattiert. Die proliferative Kapazität der hepatischen Kolonien, die nach dem Sortieren (ck19/Albumin oder nur ck19) erzeugt wurden, wurden alle 2 Wochen in Kultur verglichen. Nur R2-geschleuste Zellen (VS⁺ PI^low) erzeugten Kolonien.
Der 5E12-Antikörper reichert auf menschliche fötale und adulte Leber-Progenitorzellen an. 1 stellt das Anfärben von menschlichen fötalen Leberzellen (16 g. w.) mit monoklonalen 5E12-Antikörpern dar. Die Zellen in der R2-Schleuse wurden mit 5E12 oder isotyp angepasstem monoklonalen Kontroll-Antikörper angefärbt.
Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen die Ergebnisse einer Grenzwertverdünnungsanalyse von sortierten 5E12-Leberzellen. Menschliche fatale Leberzellen wurden unter Verwendung von MACS-Säulen nach 5E12-positive Zellen angereichert. L R2, 5E12-positive Zellen wurden in 96 Wellplatten auf BMS-6 Stroma von 1 bis 500 Zellen pro Well sortiert. Die Expression von menschlichem Albumin wurde durch ELISA beobachtet, um Kolonien von Progenitorzellen in den Kulturwells zu detektieren.
Tabelle 1: Grenzwertverdünnungsanalyse von sortierten 5E12-Leberzellen
Die Analyse wurde unter Verwendung von ACDU-sortierten 5E12⁺-Leberzellen und 8 Verdünnungspunkten (1, 5, 10, 25, 50, 125, 150, 500 Zellen) vorgenommen. Albuminpositive Wells wurden durch ELISA am Tag 7, am Tag 14, am Tag 21 und am Tag 28 detektiert.

Tag R2/5E12

7 1/39

14 1/50

21 1/79

28 1/147
Beispiel 3: Charakterisierung eines Leber-Transplantationszell-Phänotyps
Menschliche fötale Leberzellen und menschliche adulte Leberzellen wurden bei 4°C erhalten. Um eine Zellsuspension herzustellen, wurde das Gewebe zerhackt, in Cafreier gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und 30 min lang bei 37°C mit Kollagenase in der Gegenwart von Hyaluronidase aufgeschlossen. Wahlweise wurden die Suspensionen zusätzlich 20 min lang bei 37°C mit Trypsin/EDTA aufgeschlossen. Die Zellsuspension wurde durch ein 70 μm Nylonfilter filtriert und in IMDM, das 2 % FBS und 2 mM EDTA enthielt, resuspendiert. Zu einem Aliquot von Zellen wurde eine Kombination von zwei oder mehreren Antikörpern zugegeben, vorzugsweise titriert, wie es in den 3 und 4 gezeigt ist. Zum Anfärben wurden isotyp abgestimmte Kontrollen verwendet. Die Zellen wurden durch Durchflusszytometrie analysiert, wie es in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurde.
Die Daten (3A) zeigen, dass CD14 nicht die LEC-Zellen anfärbt (R2, 5E12⁺ HLA^low). CD54, CD38 und Cd34 färben LEC positiv an (3B bis 3D). Die 4A, 4D, 4G zeigen das typische Färbungsmuster für LEC. Die 4b, 4E und 4H zeigen, dass E-Cadherin, EpCam und CD49f ein Färbungsprofil ähnlich dem von 5E12 auf die R2-Population aufweist. Die 4C, 4F und 4I zeigen, dass die LEC-Populationen, seliektiert nach E-Cadherin, EpCam oder CD49f, gleichmäßig 5E12-positiv sind. Diese Daten demonstrieren, dass 5E12, E-Cadherin, EpCam und CD49f austauschbar bei der Selektion von LEC verwendet werden können. Ähnliche Daten wurden mit adultem Lebergewebe erhalten (gezeigt in 9). 10 fasst diese Daten zusammen.
Beispiel 4: In-vitro-Test für menschliche Leberzellen
Es zeigt sich, dass Leberzellen, die Leber-Progenitorzellen einschließen, überleben und auf als Nährboden verwendeten Bindegewebszellen proliferieren. Die In-vitro-Kultur dieser Zellen erlaubt die Isolierung und Charakterisierung von Progenitorzellen aus der Leber. Zwei unterschiedliche Nähr-Bindegewebszelllinien wurden als Nährboden verwendet, BMS-6, eine Knochenmarks-Bindegewebslinie, und FFS-1, ein fötaler Fibroblast. Dieser Test basiert auf einem nährzellenabhängigen Kokultursystem und der Natur einer Leber-Progenitorzelle, die eine hochprofilerative Zelle mit der Fähigkeit, auf der Leber aufzuwachsen, sein sollte.
Materialien und Methoden:
Herstellung der Nährschicht und Kulturbedingungen: FFS-1 Mausfibroblastzellen (aus STO stammend) wurden 5 Stunden lang mit Mitomycin behandelt (10 μg/ml, Sigma, St Louis, MO) und mit 5 × 10⁴ Zellen/cm² ausplattiert. Die Nährschichten wurden in einer 1:1-Mischung von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium und Medium 199 mit 10 % FCS kultiviert.
Isolierung von angereicherten Leberzellfaktionen unter Verwendung der Durchflusszytometrie: Leberzellpräparate wurden durch typische Prozeduren zum Gewebeaufschluss und Einzelzellsuspensionen hergestellt und durch Multiparameter-Durchflusszytometrie analysiert. Die Isolierung spezieller Leberzellsubpopulationen wurde unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS^TM), hergestellt von Becton Dickinson Immunocytometry Systems, bewerkstelligt. Um genau zu sein, das FACSVantage SE ist aus Argon-, Krypton- und Helium-Neon-Ionenlasern aufgebaut, die drei räumlich getrennte Anregungsquellen bieten. Dieser Aufbau ermöglicht es, eine breite Vielfalt von kommerziell erhältlichen Fluoreszenzsonden für die Analyse von diskreten zellularen Merkmalen einzusetzen. In diesem Instrument aufgebaute spezielle Subsysteme ermöglichen die indizierte Abscheidung von einzelnen Zellen direkt in einzelnen Wells von Gewebekulturplatten, die zuvor mit Nährschichtzellen kultiviert wurden. Computerunterstützte Hochgeschwindigkeits-Datenerfassungssysteme ermöglichen die Sammlung von bis zu neun unabhängigen Datenparametern von jeder Zelle. Die Fähigkeit, Listmodedaten-Dateien zu sammeln, die aus mehr als einer Millionen Ereignissen bestehen, erleichtert die Diskriminierung von Subpopulationen mit sehr geringer Häufigkeit. Die Datenparameter wurden in der Listmodedaten-Datei gesammelt und wurden durch das Softwareprogramm Fiowjo (www.treestar.com) analysiert. Reine Populationen von Leberzellen wurden direkt in einzelnen Wells von 96-Wellplatten oder 24-Wellplatten sortiert, die zuvor mit Nährschichtzellen kultiviert wurden.
Protokoll zum Einfrieren von Zellen: Resuspendierte Leberzellen in IMDM + 10 % FCS mit 40 % FCS 5 min lang auf Eis, dann Mischung 1:1 mit IMDM + 10 % FCS mit 15 % DMSO. Die Zellen werden bei 80°C, dann in flüssigem Stickstoff gefroren.
Protokoll für die Hepatitisinfektion: Die Leberzellen werden eine Stunde lang mit menschlichem Serum, das Hepatitis enthält, auf Eis inkubiert, dann werden die Zellen auf Stroma ausplattiert und die Zellen werden 2 Wochen lang kultiviert.
Ergebnisse:
Die Leberzellpopulationen wurden durch MACS oder Sortieren oder beides in R2/5E12⁺ gegen R2/5E12^– separiert. Die Zellen wurden dann 2 Wochen lang kultiviert und dann durch die Expression von Albumin und ck19 in den sich bildenden Kolonien das CFC-LBC (colony forming cell-liver bipotent colony) beurteilt, siehe 8. Die Häufigkeit hepatischer Kolonien wurde durch Grenzwertverdünnung unter Verwendung 3 unterschiedlicher Zellkonzentrationen berechnet. Die Daten sind in Tabelle 3 und in 8 (menschliche adulte Zellen) gezeigt.
Die Grenzwertverdünnungstests können eine Kombination von Zellsortierung und ELISA nutzen, um Grenzwertverdünnungen zu bestimmen. Beispielsweise wurden Zellen gemäß R2-Schleusen, Expression von 5E12 und Expression von HLA-Antigenen sortiert. Die sortierten Zellen wurden wie oben beschrieben in 96 Wellplatten verdünnt und 14 Tage lang in vitro kultiviert, dann durch ELISA auf die Expression von Alpha-Fötoprotein, Albumin und Alpha-1-Antitrypsin analysiert.
Beispiel 5: In-vitro-Modell einer Hepatitisinfektion
Es wird ein Verfahren für die In-vitro-Infektion von hepatischen Kolonien durch Hepatitisviren bereitgestellt. Fötale Leberzellen (16 g. w.), enthaltend Leber-Transplantationsprogenitorzellen, wurden isoliert und mit Hepatitisvirus D (HDV) infiziert und 2 Wochen lang kultiviert. Die Zellen wurden 2 Wochen lang kultiviert, fixiert und für Albumin (APC-Blau), Cytokin 19 (FITC-Grün) und HDV (PE-Rot) angefärbt, um mit dem Hepatitis-D-Virus infizierte hepatische Progenitoren zu identifizieren. Die Zellkerne wurden mit Hoechst kontrastgefärbt.
Fötale Leberzellen wurden mit Serum aus mit dem Hepatitis-D-Virus infizierten Patienten inkubiert. Eine Stunde später wurde die Probe auf einer Stromaschicht gegeben und 2 Woche darauf belassen. Die Kultur wurde fixiert und mit hepatischen und Anti-HDV-Markern angefärbt. Diese Kulturverfahren unterstützen das Wachstum von Zellen, die mit Hepatitisviren infizierbar sind.
Beispiel 6: Ex-vivo-Expansion von Populationen menschlicher Leber-Transplantationszellen
Menschliche Leber-Transplantationszellen, die auf hepatische Progenitoren angereichert worden sind, die den HLA^low 5E12⁺ Phänotyp tragen, wurden auf oder in einer extrazellularen Matrix plattiert, der für zellulare Haftung, Adhäsion und Proliferation sorgt. Die Zellen wurden in einem geeigneten Basalmedium in Kombination mit der Matrixkomponente Laminin in der Gegenwart von Leber-Transplantationszell-Medium (LEC-Medium). Die Zellmorphologie ist in 11 gezeigt.
Leber-Transplantationszell-Medium (LEC-Medium): DMEM/F12 (50:50) mit L-Glutamin, 10 % fötalem Rinderserum, Dexamethason (10 – 7 M), Nicotinamid (10 mM), Betamercaptoethanol (0,05 mM), Penicillin/Streptomycin (1 X), rekombinanter menschlicher Hepatozytenwachstumsfaktor (40 ng/mL), rekombinanter menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor (20 ng/mL).
Während des Ablaufs der Ex-vivo-Expansion wurde das klonogene Potential von vermehrten Zellen in einem Bindegewebskokulturtest wie oben für unkultivierte Zellen beschrieben beurteilt. Die sezernierten hepatischen Proteine Albumin, Alpha-1-Antitrypsin und Alpha-Fötoprotein wurden durch ELISA-Tests von Kulturüberständen von proliferierenden Zellen auf ECM plus LEC-Medium oder in Bindegewebskokultur überwacht.
Das Transplantationspotential von durch Kultur auf ECM plus LEC-Medium vermehrten Zellen können durch Transplantation in verschiedene geeignete Tiermodelle, einschließlich die NOD-SCID-Maus oder die NOD-SCID/FAH-Maus überprüft werden. Ein zusätzlicher Ansatz ist es, die Differenzierung von vermehrten Zellen als ein Mittel zu induzieren, verbessertes Leberanwachsen oder verbesserte Langzeit-Hepatozytenfunktion zu fördern. Zellen, die durch Kultur auf ECM plus LEC-Medium vermehrt wurden, können durch zusätzliche Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Differenzierungsmittel vermehrt werden, um eine Differenzierungsstufe einer reifen Hepatozyte zu fördern. Die Auswirkung solcher Behandlungen auf das Transplantationspotential der vermehrten und ausdifferenzierten Zellen kann wie oben beschrieben durch Transplantation in Tiermodelle beurteilt werden.
Beispiel 7: Transplantation von Populationen menschlicher Leber-Transplantationszellen
Das Transplantation- und Hepatozytendifferenzierungspotential von menschlichen Leberzellen wurde durch Transplantation in die NOD-SCID-Maus bewertet. Kurz, menschliche Leberzellen wurden in einem Injektionspuffer (50 % Matrigel BD Biosciences Nr. 356234, 50 % DMEM) resuspendiert und bis zur Injektion auf Eis gelagert. Bis zu 20 Mikroliter an Zellen in Injektionspuffer wurden in die Lebern von 0 bis 48 Stunden alten neugeborenen NOD-SCID-Mäusen injiziert. Serum aus den injizierten Mausen wurden 5 bis 6 Wochen nach Transplantation durch ELISA auf die Anwesenheit von leberspezifischen Proteinen (Albumin, Alpha-1-Antitrypsin oder Alpha-Fötoprotein) analysiert. In 6 wurde 6 Wochen nach der Transplantation von Gesamtleberzellen, sortierten Leberzellen oder R2-5E12⁺-HLA^low-Zellen zirkulierendes menschliches Alpha-1-Antitrypsin (AAT) und Albumin (ALB) Protein aus dem Serum von NOD-SCID-Mäusen erfasst. Die Pegel von AAT oder ALB in Mausen, die mit 10000 sortierten R2-5E12⁺-HLA^low-Zellen transplantiert wurden, waren größer oder gleich denen in Mausen, die mit 75000 unsortierten Gesamtleberzellen oder 10000 oder 40000 sortierten Gesamtleberzellen transplantiert wurden. Das menschliche AAT oder ALB sind bis zu 5 Monate wiederholbar detektierbar in Mausen, die mit sortierten R2-5E12⁺-HLA^low-Zellen transplantiert wurden, was ein dauerhaftes Aufwachsen und eine nachhaltige hepatische Differenzierung indiziert. 7 zeigt die Detektion von menschlichem ALB- oder CK19-Protein in transplantierten menschlichen fötalen Leberzellen in der Leber einer repräsentativen NOD-SCID-Maus 6 Wochen nach der Transplantation. Die Serumpegel von menschlichem AAT und ALB, die zum Zeitpunkt der Tötung durch ELISA-Analyse erfasst wurden, sind in den unteren Feldern gezeigt.

Claims

Zusammensetzung von aus Lebergewebe isolierten Säugetierleber-Transplantationszellen, wobei wenigstens 80 % der Zellen in der Zusammensetzung als lebende autofluoreszente Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung und positiv für einen Marker, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5E12, Ep-Cam, CD49f und E-Cadherin besteht, und HLA^low gekennzeichnet sind, wobei die Zusammensetzung Zellen umfasst, die imstande sind, zu ausgereiften Hepatozyten zu führen.
Zusammensetzung von Leber-Transplantationszellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen negativ für DC117 und CD14 sind.
Zusammensetzung von Leber-Transplantationszellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.
Zusammensetzung von Leber-Transplantationszellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen genetisch so modifiziert sind, dass sie einen exogenen DNA-Vektor umfassen.
Anreicherungsverfahren für eine Zusammensetzung von Säugetierleber-Transplantationszellen, wobei wenigstens 80 % der Zellen in der Zusammensetzung als lebende autofluoreszente Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung und positiv für einen Marker, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5E12, Ep-Cam, CD49f und E-Cadherin besteht, und HLA^low gekennzeichnet sind, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Vereinigen von Reagenzien, die spezifisch einen Marker erkennen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5E12, Ep-Cam, CD49f und E-Cadherin besteht, und mit einem Reagenz, das spezifisch HLA Klasse I Antigene erkennt, mit einer Probe der Leberzellen; Selektieren nach der lebenden autofluoreszenten Zellpopulation mit hoher Vorwärtsstreuung; Selektieren nach jenen Zellen, die positiv für einen Marker sind, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5E12, Ep-Cam, CD49f und E-Cadherin besteht; Selektieren nach jenen Zellen, die schwach oder negativ für HLA Klasse I Antigene sind; um eine angereicherte Population an Zellen bereitzustellen, die Lebertransplantationsaktivität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 5, das darüber hinaus den Schritt des Selektierens nach Zellen umfasst, die negativ für CD117 und CD14 sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.
Zusammensetzung von Säugetierleber-Transplantationszellen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Verwendung bei einem Verfahren der Transplantation in ein Wirtstier.
Verwendung einer Zellpopulation nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Einbringung in ein Wirtstier, um dem Wirtstier funktionelle Hepatozyten und/oder Gallenzellen bereitzustellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 9, wobei die funktionellen Hepatozyten Albumin oder Alpha-1-Antitrypsin sezernieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 9, wobei die funktionellen Hepatozyten Alpha-1-Antitrypsin sezernieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 9, wobei die funktionellen Hepatozyten Albumin sezernieren.
Zusammensetzung von Leber-Transplantationszellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen genetisch so modifiziert sind, dass sie einen exogenen DNA-Vektor umfassen.
In-vitro-Zellkultur, umfassend Säugetierleber-Transplantationszellen, wobei wenigstens 80 % der Zellen in der Zusammensetzung als lebende autofluoreszente Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung und positiv für einen Marker, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5E12, Ep-Cam, CD49f und E-Cadherin besteht, und HLA^low gekennzeichnet sind, mit oder ohne Nährzellenschicht.
In-vitro-Zellkultur nach Anspruch 15, wobei die Säugetierleber-Transplantationszellen menschliche Zellen sind.
Chimäre immundefiziente Maus, FAH^-/--Maus oder FAH^-/--immundefiziente Maus, umfassend: funktionelles Regenerieren von Hepatozyten und/oder Gallenzellen, die aus einer im Wesentlichen reinen Zusammensetzung von aus Lebergewebe isolierten Säugetierleber-Transplantationszellen erzeugt werden, wobei wenigstens 80 % der Zellen in der Zusammensetzung als lebende autofluoreszente Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung und positiv für einen Marker, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5E12, Ep-Cam, CD49f und E-Cadherin besteht, und HLA^low gekennzeichnet sind.
Chimäre Maus nach Anspruch 17, wobei die Säugetierleber-Transplantationszellen menschliche Zellen sind.
Verfahren zum Screening auf genetische Sequenzen, die spezifisch in Säugetierleber-Transplantationszellen exprimiert werden, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Isolieren von RNA aus einer Zellpopulation nach Anspruch 1, einer In-vitro-Zellkultur nach Anspruch 15 oder einer chimären Maus nach Anspruch 17, Erzeugen einer Sonde aus der RNA, Screening einer Population von Nukleinsäuren zur Hybridisierung der Sonde.
Verfahren nach Anspruch 19, das darüber hinaus einen Vergleich der erhaltenen Hybridisierung zwischen den Leber-Transplantationszellen und einer zweiten eindeutigen Zellpopulation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Population von Nukleinsäuren in einem Array repräsentiert wird.
Verfahren zum Screening auf Wirkstoffe, die die Lebensfäbigkeit, das Wachstum, die Stoffwechselfunktion oder die Differenzierung von Säugetierleber-Transplantationszellen bewirken, wobei das Verfahren folgendes umfasst: in Kontakt bringen einer Zellpopulation nach Anspruch 1, einer In-vitro-Zellkultur nach Anspruch 15 oder einer chimären Maus nach Anspruch 17 und Bestimmen der Wirkung des Wirkstoffs auf die Lebensfähigkeit, das Wachstum, die Stoffwechselfunktion oder die Differenzierung der Leber-Transplantationszellen.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff ein Arzneimittel ist, das im Verdacht steht, auf menschliche Hepatozyten toxisch zu wirken.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff ein menschliches Hepatitisvirus ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff ein Impfstoff gegen menschliches Hepatitisvirus ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff ein antiviraler Wirkstoff ist.