DE69434637T2

DE69434637T2 - Hepatoblasten und verfahren zu ihrer isolierung

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Publication number: DE69434637T2
Application number: DE69434637T
Authority: DE
Inventors: M. Lola Chapel Hill REID; Samuel H. New York Sigal; Shlomo Brill; A. Patricia Ossining HOLST
Original assignee: Albert Einstein College of Medicine
Current assignee: Albert Einstein College of Medicine
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1994-11-16
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2014-11-17
Also published as: CA2177043A1; IL111693A0; JP2004339227A; ATE318075T1; DE69434637D1; CA2177043C; EP1688037A2; IL111693A; AU1256395A; EP0729297A4; EP0729297B1; JPH09505206A; ZA949180B; ES2260759T3; WO1995013697A1; EP0729297A1; EP1688037A3

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung hepatischer Vorläuferzellen und die isolierten Hepatoblasten. Die isolierten Hepatoblasten der Erfindung umfassen Leberstammzellen (pluripotente Vorstufen) und festgelegte Vorläuferzellen (Vorstufen mit nur einer Entwicklungsrichtung) für entweder Hepatocyten oder Gallengangzellen. Die isolierten hepatischen Vorläuferzellen der Erfindung können verwendet werden, um eine Leberfehlfunktion zu behandeln und für künstliche Lebern, die Gentherapie, Medikamententests und die Impfstoffherstellung. Zusätzlich können die isolierten Hepatoblasten der Erfindung für Forschungs-, therapeutische und kommerzielle Zwecke verwendet werden, die die Verwendung von Populationen aus funktionellen Leberzellen voraussetzen.
Im Gegensatz zu ausgereiften Leberzellen generieren die Hepatoblasten der Erfindung Tochterzellen, die zu Leberzelllinien reifen können und das gesamte Spektrum an Leberfunktionen bieten, von denen viele abstammungspositionspezifisch sind. Zudem haben die Hepatoblasten der Erfindung eine höhere Kapazität zur Proliferation und langfristigen Überlebensfähigkeit als dies ausgereifte Leberzellen haben. Als ein Ergebnis davon sind die Hepatoblasten der Erfindung besser für Forschungs-, therapeutische und kommerzielle Anwendungen als ausgereifte Leberzellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Von Stammzellen und frühen Vorläuferzellen war seit langem bekannt, dass sie in schnell proliferierenden, ausgewachsenen Geweben wie Knochenmark, Darm und der Epidermis existieren, aber erst seit kurzem wird davon angenommen, dass sie in ruhenden Geweben wie der Leber von Erwachsenen existieren, ein Organ, das durch eine lange zelluläre Lebensspanne gekennzeichnet ist. Die Fähigkeit von Stammzellen, sich selbst zu replizieren, und zur Herstellung von Tochterzellen mit mehreren Schicksalen, unterscheidet diese von festgelegten Vorläuferzellen. Im Gegensatz dazu produzieren festgelegte Vorläuferzellen Tochterzellen mit nur einem Schicksal in Bezug auf den Zelltyp und diese Zellen durchlaufen einen graduellen Reifungsprozess, bei dem differenzierte Funktionen in einem abstammungspositiosabhängigen Prozess erscheinen.
In erwachsenen Organismen produzieren Stammzellen in somatischen Geweben eine Stammlinie von Tochterzellen, die einen unidirektionalen, terminalen Differenzierungs prozess durchlaufen. In allen gut charakterisierten Abstammungssystemen wie der Hemopoese, dem Darm und der Epidermis wurden Stammzellen durch empirische Assays identifiziert, in denen von den Stammzellen gezeigt wurde, dass sie in der Lage waren, das volle Spektrum von Abkömmlingen zu produzieren. Bis heute sind keine molekularen Marker bekannt, die eindeutig Stammzellen als eine allgemeine Klasse von Zellen identifizieren, und es sind keine molekularen Mechanismen bekannt, die in der Umwandlung von Zellen von der Selbstreplikation und Pluripotenz hin zu einer Festlegung der Differenzierung und einem Einzelschicksal resultieren.
Die strukturelle und funktionelle Einheit des Leberparenchyms ist die der Acinus (Drüsenbeere), der wie ein Rad um zwei ausgeprägte vaskuläre Betten organisiert ist. Sechs Sätze von portalen Triaden, jeder mit einer portalen Venole, einer hepatischen Arteriole und einem Gallengang, bilden die Peripherie und die zentrale Vene bildet die Nabe. Das Parenchym, das die „Speichen" des Rades umfasst, besteht aus Platten von Zellen, die auf beiden Seiten durch das fenestrierte sinusoidale Endothel aufgereiht sind. Blut fließt von den portalen Venolen und den hepatischen Arteriolen an den portalen Triaden durch Sinusoide, die Platten aus Parenchym umranden, hin zu den terminalen hepatischen Venolen, der zentralen Vene. Hepatocyten zeigen eine deutliche morphologische, biochemische und funktionelle Heterogenität basierend auf deren Lokalisation im Acinus (siehe Gebhardt, Pharmac. Ther., Bd. 53, S. 275–354 (1990)).
Im Vergleich dazu sind periportale Parenchymzellen klein an Größe, Zellen in der Mitte des Acinus sind von mittlerer Größe und perizentrale Zellen sind am größten. Es gibt von der Acinusposition her abhängige Variationen in der Morphologie der Mitochondrien, des endoplasmatischen Reticulums und der Glycogenkörnchen. Von kritischer Bedeutung ist, dass die diploiden Parenchymzellen und solche mit dem größten Wachstumspotential periportal lokalisiert sind. Parallel dazu ist die gewebespezifische Genexpression von der Position im Acinus abhängig, was zu der Hypothese führt, dass die Expression von Genen von der Reife abhängig ist (siehe Sigal et al., Amer. J. Physiol., Bd. 263, S. G139–G148 (1993)).
Es wird derzeit angenommen, dass die Leber ein Stammzell- und Abstammungsliniensystem ist, das verschiedene Parallelen mit dem Darm, der Haut und den hemopoetischen Systemen aufweist (siehe Sigal et al., Amer. J. Physiol., Bd. 263, S. G139–G148 (1993); Sigal et al., In Extracellular Matrix, Zern und Reed, Eds., Marcel Dekker, NY., S. 507–537 (1993)); und Brill et al., Liver Biology and Pathobiology, Arias et al., 3d. Eds., Raven Press, NY (1994, im Druck)). Als solches wird erwartet, dass es Vorläuferzellpopulationen in den Lebern von allen oder den meisten Altersstufen von Tieren gibt. Ein Abstammungsmodell der Leber würde klarstellen, warum Forscher bisher nicht in der Lage waren, adulte ausgereifte Leberzellen in Kultur für mehr als ein paar Runden der Zellteilung wachsen zu fassen, warum nur ein paar Teilungen von reifen adulten Leberzellen beobachtet wurden, wenn sie in vivo in die Leber oder in ectopische Positionen injiziert wurden, und warum sie nur beschränkten Erfolg beim Etablieren künstlicher Lebern mit adulten Leberzellen hatten. Diese Sackgassen sind bei der Verwendung von isolierten Leberzellen zur Lebertransplantation, für künstliche Lebern, die Gentherapie und andere therapeutische oder kommerzielle Anwendungen von besonderer Bedeutung.
Der Erfolg der oben aufgelisteten Prozeduren setzt die Verwendung von hepatischen Vorläuferzellen (Hepatoblasten) voraus, die in einem großen Anteil von Leberzellen in frühen embryonischen Lebern zu finden sind und in kleinen Anzahlen periportal in den Lebern von Erwachsenen lokalisiert sind. Weil es wünschenswert ist, solche Hepatoblasten zu isolieren, gibt es einen Bedarf an der Entwicklung eines Verfahrens zur erfolgreichen Isolierung besagter Hepatoblasten. Die Erfinder haben Marker identifiziert und ein Verfahren zur Isolierung von Hepatoblasten aus den Lebern von Tieren in jeglicher Altersstufe entwickelt. Die Verfahren der Erfindung wurden unter Verwendung embryonaler und neonataler Lebern aus Ratten entwickelt, das Verfahren der Erfindung bietet jedoch einen systematischen Ansatz zur Isolierung von Hepatoblasten aus jeglicher Altersstufe und jeglicher Spezies.
Die Verfahren der Erfindung wurden mit embryonischen Lebern entwickelt, in denen es eine signifikante Anzahl von pluripotenten Leberzellen (Leberstammzellen) und festgelegten Vorläuferzellen (Zellen mit einem einzigen Schicksal, dass sie entweder Hepatocyten oder Gallengangzellen werden) gibt. Der Beginn der Differenzierung von Parenchymzellen der Leber von Ratten kommt am zehnten Tag der Gestation zustande. In diesem Stadium sind Parenchymzellen (epitheliale oder epitheloide Zellen) morphologisch homogen und bestehen aus kleinen Zellen mit kaum Zytoplasma und somit hohen Verhältnissen von Nukleus zu Zytoplasma, mit undifferenzierten, bleichen Nuklei und einigen interzellulären Anhaftungen. Von den meisten Leberparenchymzellen in diesem Stadium wird angenommen, dass sie bipotent für Gallengangzellen und Hepatocyten sind. Obwohl sie üblicher Weise einige leberspezifische Funktionen schwach exprimieren, von denen bekannt ist, dass sie sehr früh in der Entwicklung aktiviert werden, wie Albumin und α-Fetoprotein (AFP), exprimieren sie keine für Erwachsene spezifische Marker wie Glycogen-, Harnstoffzyklusenzyme oder das Hauptharnprotein (major urinary protein, MUP). Nur einige Inseln aus fötalen Zellen sind für BDS₇, einen Gallengang-zellspezifischen Marker positiv, und keine sind positiv für HES₆, einen hepatocytenspezifischen Marker (siehe Germain et al., Cancer Research, Bd. 48, S. 4909–4918 (1988)). Die Hepatoblasten mit kaum Zytoplasma und oft eiförmig geformten Nuklei umfassen verschiedene Zellpopulationen einschließlich pluripotente Leberstammzellen und festgelegte Vorläuferzellen, die jeweils nur ein Schicksal für entweder Gallengangzellen oder Hepatocyten aufweisen.
Am fünfzehnten Tag der Gestation bestehen Hepatoblasten stärker aus den festgelegten Vorläuferzellen, die sich entweder in die Gallengang- oder die Hepatocytenabstammungslinie differenzieren. Deren Reifung wird durch Änderungen in der Morphologie angezeigt (zunehmende Größe, zunehmende Anzahl von zytoplasmatischen Organellen und Vakuolen, heterogene nukleare Morphologien und eine Erhöhung der pigmentierten Körnchen), die leicht durch flusszytometrische Parameter unterschieden werden können. Die „Vorwärtsstreuung" misst die Zellgröße. Die „Seitenstreuung" misst die zelluläre Komplexizität oder Körnigkeit, die durch die Anzahl der zellulären Organellen bestimmt wird. Die Autofluoreszenz hängt von Lipofuscinen und anderen Pigmenten ab, die sich mit der Reifung vermehren.
Begleitet werden die morphologischen Änderungen von schrittweisen oder aufeinander folgenden Änderungen der Expression von Arten von Zytokeratinen, verschiedenen Oberflächenantigenen und gewebespezifischen Genen. Während die frühen Hepatoblasten, die Leberstammzellen umfassen, intensiv AFP und schwach Albumin exprimieren, bilden festgelegte Vorläuferzellen, deren Schicksl es ist, Hepatocyten zu werden, Schnüre aus Zellen, die deren AFP- Expression verlieren, verstärkt große Mengen an Albumin exprimieren und langsam hepatocytenspezifische Marker wie Glykogen- und Harnstoffzyklusenzyme annehmen. Zellen, die dazu vorgesehen sind, intrahepatische Gallengangzellen zu werden, entstehen aus scheinbar identischen Hepatoblasten und behalten die Expression von AFP bei, verlieren die Albuminexpression und bilden Cytokeratin 19 (CK 19). Anfänglich ist eine Aneinanderreihung von perlenartigen Zellen um die großen vaskulären Verzweigungen in der Nähe des Leberhiliums vorhanden. In den darauf folgenden Tagen erscheinen ähnliche Strukturen in der gesamten Leber. Auf BDS₇ positive Zellen werden schnell größer und werden zahlreicher mit höherem Entwicklungsalter. Langsam bilden sich Lumen innerhalb der Strukturen und am achtzehnten Tag der Gestation sind Gallengangstrukturen morphologisch identifizierbar.
Um die Leberentwicklung und die aufeinander folgenden Änderungen in der Expression von leberspezifischen Genen mit der Reifung zu verstehen, ist es notwendig, die Hepatoblasten direkt zu untersuchen. Jedoch wird die Untersuchung von Hepatoblasten durch die Schwierigkeit der Isolierung dieser behindert, da sie immer nur einen kleinen Teil ausmachen, weniger als 10% der Zellarten innerhalb der Leber im embryonalen, neonatalen und erwachsenen Stadium. In dem Embryo ist die Leber der Ort sowohl für die Hepatopoese (Bildung von Leberzellen) wie auch der Hemopoese (Bildung von Blutzellen). Hemopoetische Zellen wandern während des zwölften Tages der Gestation vom Dottersack in die Leber. Anschließend wird die Hemopoese, insbesondere die Erythropoese, schnell eine der am stärksten dominierenden Funktionen der fötalen Leber, wobei hemopoetische Zellen 50% oder mehr der Lebermasse umfassen. In neonatalen Organismen ist der Grossteil der Leberzellen entweder hemopoetische Zellen oder reife Leberzellen (Hepatocyten oder Gallengangzellen). Als ein Ergebnis davon sind sequenzielle Änderungen in den Parenchymfunktionen in intakter Leber schwer zu interpretieren, da die Daten durch die wechselnden hemopoetischen Beiträge verwirren. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass eine transiente Verringerung der parenchymalen Funktionen am Tag achtzehn der Gestation nicht durch eine Verringerung hepatischer Zellen oder deren Expression dieser Gene bedingt ist, sondern zustande kommt, weil es der Höhepunkt der Erythropoese ist, wenn der größte Teil der Leber aus erythroiden Zellen besteht. Die Hemopoese in der Leber verringert sich schnell nach der Geburt, wenn sie zum Knochenmark hin übertragen wird, dem Ort der Hemopoese im Erwachsenen. Nichtsdestotrotz bleibt die Isolierung von Hepatoblasten aus der Leber von Erwachsenen problematisch, da diese einen sehr kleinen Prozentanteil an hepatischen Zellen umfassen.
Weil Hepatoblasten alle Entwicklungsstadien der Leberzellen generieren können und daher das gesamte Spektrum der leberspezifischen Funktionen bieten, die durch Gene kodiert werden, die in frühen bis späten Stadien der Differenzierung aktiviert und exprimiert werden, sie viel mehr Wachstumspotential als ausgereifte Leberzellen aufweisen, ein stärkeres proliferatives Potential haben und Zellen mit stärkerer Fähigkeit zur Transfektion mit geeigneten Genen bieten (d. h., eine größere Kapazität zur Gentherapie), ist es wünschenswert, hepatische Vorläuferzellen (im Gegensatz zu ausgereiften Leberzellen) zu isolieren.
Die derzeit verfügbaren Verfahren zur Isolierung von Hepatoblasten setzen die Verwendung von Fraktionierungsverfahren nach Zellgröße oder Zelldichte voraus, die für die Abtrennung von hemopoetischen von hepatopoetischen Vorläuferzellen ungeeignet sind, sie setzen die Verwendung von Zellen voraus, die spezifische Enzymbehandlungen wie einen Pronaseverdau überleben (von dem nachgewiesen wurde, dass er auch Hepatoblastenunterpopulationen tötet) oder benötigen die Verwendung von Selektionsprotokollen in Kultur, bei denen die Anreicherung von Zellen von Interesse von der unterschiedlichen Anhaftung an das Substrat oder dem differenziellen Wachstum in spezifischen Kulturmedien abhängt. Daher haben sich die derzeit verfügbaren Isolierungsverfahren als ineffizient erwiesen. Zudem hängt die Identifizierung der parenchymalen Vorläuferzellen von Assays auf parenchymspezifische Funktionen ab. Zudem differenzieren Hepatoblasten unter den meisten Kulturbedingungen erneut und werden dadurch nicht mehr nachweisbar, oder es gibt einen so hohen Anteil an nicht relevanten Zellen (z. B. mesenchymale Zellen), dass die Funktionen von Interesse durch solche der verunreinigenden Zellpopulationen ausgeschwemmt werden. Zusätzlich bilden dissoziierte Leberzellen leicht große Aggregate über einen kalzium- und temperaturabhängigen Glykoprotein-vermittelten Prozess. Um die Leberzellen zu disaggregieren, ist es notwendig, mechanische Verfahren zu verwenden, die heftiges Pepetieren und Ansaugen durch eine Spritze umfassen, Verfahren, die üblicher Weise unzureichend sind, um Einzelzellsuspensionen zu erreichen, und die in einer dramatisch verringerten Überlebensfähigkeit der Zellen resultieren können. Daher ist es wünschenswert, ein Verfahren zur Isolierung fötaler Hepatoblasten zu entwickeln, bei dem das Verfahren die Hepatoblasten als eine Einzelzellsuspension aufrecht hält, das nicht in Zellaggregation resultiert und auf alle Altersstufen anwendbar ist.
Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, Verfahren zur Isolierung hepatischer Vorläuferzellen bereit zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, isolierte hepatische Vorläuferzellen bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Nutzung isolierter Hepatoblasten zur Behandlung einer Leberfehlfunktion bereit zu stellen.
Hoang et al. (Blood, Bd. 61, S. 580–588 (1983)) beschrieben die Abtrennung von hemopoetischen Zellen aus dem Mark erwachsener Mäuse unter Verwendung monoklonaler Antikörper.
Hixon et al. (Pathobiology, Bd. 58, S. 65–74 (1990)) offenbarten die Analyse von hepatischen Zellpopulationen unter Verwendung monoklonaler Antikörper.
Germain et al. (Cancer Research, Bd. 48, S. 4909–4918 (1988)) diskutierten Gallengangepithel- und hepatische Zellabstammungsverhältnisse in embryonischer Rattenleber, die durch die differenzielle Expression von Cytokeratinen, α-Fetoprotein, Albumin und zelloberflächenexponierten Komponenten bestimmt wurden.
Robinson et al. (Immunology, Bd. 57, S. 231–237 (1986)) beschrieben die Reaktion des OX-43 monoklonalen Antikörpers mit vaskulärem Endothel.
Sigal et al. (Amer. J. Physiol., Bd. 263, S. G139–G148 (1992)) diskutierten die Transplantation von Leberzellen zur Behandlung von Lebermangelerscheinungen.
Li et al. (In Vitro Cell. Dev. Biol., Bd. 29A, S. 249–254 (1993)) beschrieben die Kultivierung von primären Hepatocyten in einem Bioreaktor mit gepacktem Bett als Basis für die Entwicklung einer künstlichen Leber.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft isolierte Hepatoblasten und Verfahren zur Isolierung von Hepatoblasten unter Verwendung von Selektions- (Schwenk-; „panning")-techniken und der Flusszytometrie (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, „fluorescence-activated cell sorting", FACS) von Zellsuspensionen aus Leberzellen. Dissoziierte Leberzellen werden selektiert („panned") und fluoreszenzaktiviert nach Zellen unter Verwendung von Antikörpern sortiert, um so stark die Anzahl von verunreinigenden Zelltypen wie hemopoetische Zellen in embryonischer Leber oder ausgereiften Leberzellen in Erwachsenen zu verringern. Die Zellen, die nicht an den Selektionsplatten haften, werden negativ unter Verwendung mehrerer Antikörper gegen die verunreinigenden Zelltypen aussortiert, was zu einer Zellpopulation führt, die auf unreife hepatocytische Zelltypen stark angereichert ist, und die dann in verschiedene Unterkategorien von unreifen hepatischen Zelltypen durch die multiparametrische, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aufgetrennt werden. Diese Erfindung ist zudem auf die Verwendung von isolierten Hepatoblasten für die Behandlung einer Leberfehlfunktion und für die Herstellung von künstlichen Lebern gerichtet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben genannte kurze Beschreibung sowie weitere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden besser durch die Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der derzeit bevorzugten, obgleich illustrativen, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen gesehen werden, worin:
1 Zellen aus Lebern am Tag 14 der Gestation zeigt, die mit den monoklonalen Antikörpern 374.3 und OX-43 gefolgt durch FITC- und PE-markierte zweite Antikörper gefärbt sind. Bild A ist eine zweifarbige Dichtegrafik, die 5 Populationen in einer nicht beschränkten Probe zeigt, die mit R1–5 bezeichnet werden. R1 und R2 sind Zellpopulationen, die für OX-43 positiv sind, wohingegen R3–5 für diesen Marker negativ sind. Bild B ist eine biparametrische Punktgrafik von FL2 gegen SSC, die die Sperrparameter zeigt, die verwendet wurden, um OX-43⁺- von OX-43^–-Zellen zu trennen. Der Einschub zeigt die negative Kontrolle. Bild C ist eine 3D-Grafik von FL1 gegen FL2 von OX-43^–-Zellen, die drei eigenständige Zellpopulationen, R3–5, zeigt;
2, Bild A ist ein Westernblot des Gesamtproteins von sortierten Zellen, der das Vorhandensein von albuminhaltigen Zellen ausschließlich in der OX-43^–-Population zeigt. Die Bilder B und C zeigen die indirekte Immunfluoreszenz für AFP auf OX-43^–(B)- und OX-43⁺ (C)-Zellen;
3 zeigt Zellen aus R3–5, die nach dem Aussperren aller OX-43⁺-Zellen sortiert wurden und die Gesamt-RNA, die durch das Guanidiniumisothiocyanatverfahren hergestellt wird. Der Nothernblot zeigt die Expression von Albumin in R4, während Serglycin durch R3-Zellen exprimiert wird;
4 zeigt Zellen, die ausgesperrt wurden, um Populationen zu trennen, die für OX-43 positiv und negativ sind, und die dann weiter in 5 Populationen basierend auf deren Fluoreszenz in biparametrischen Dichtegrafiken von FL1 gegen FL2 abgetrennt wurden. Frisch sortierte und zytogeschleuderte Zellen wurden für die Morphologie durch den Diff-Quik Färbekit gefärbt. Ursprüngliche Vergrößerung – 100 ×;
5 zeigt eine Population, die an fötalen Leberparenchymzellen hoch angereichert ist, die durch FACS (R4-Zellen nach dem Ausschluss von alten OX-43^–) und 5 × 10⁴ Zellen/cm² auf Typ 1 kollagenbeschichteten Platten in einem serumfreien, hormonell definierten Medium plattiert erhalten wurde. Bild A ist eine Phasenmikrografik, die eine typische Epithelkolonie und sehr wenige mesenchymale Zellen nach 4 Tagen in Kultur zeigt (ursprüngliche Vergrößerung – 50 ×). Bild B ist eine indirekte in situ Immunfluoreszenz, die die Aufnahme von BrdU in die Nuklei von ungefähr 25% der kultivierten Parenchymzellen nach 24 Stunden in Kultur zeigt (ursprüngliche Vergrößerung – 50 ×). Bild C ist eine Phasenmikrografik von Bild B;
6 zeigt ein Fliessdiagramm der Anreicherung von Hepatoblasten unter Verwendung eines Verfahrens der Erfindung;
7, Bild A zeigt eine Phasenkontrastmikroskopie und Bild B zeigt die Immunfluoreszenz für AFP auf Hepatoblasten an Tag 15 der Gestation. AFP- positive Zellen lagen bei der Morphologie im Bereich von kleinen Zellen mit ovalen Nuklei und kaum Zytoplasma, die nur leicht größer als die hemopoetischen Zellen waren, bis zu Zellen mit größeren Mengen an vakuolisiertem Zytoplasma. Negative Kontrollen bestanden aus Zellen, die mit Kaninchen- IgG als primärem Antikörper gefärbt wurden;
8 zeigt die Northernblotanalyse der Gesamt-RNA (5 μg/Bahn) von frisch isolierten fötalen Leberzellen vor und nach dem Selektieren (Schwenken, „paning") und diese hybridisierte mit cDNAs, die α-Fötoprotein und Albumin kodieren. Bahn 1 zeigt frist isolierte fötale Leberzellen. Bahn 2 zeigt eine Zellpräparation nach dem Selektieren (2 ×) mit Anti-Ratte-RBC-Antikörper. Es werden auch Blots für 18 S gezeigt, die als eine interne Kontrolle für die Gesamt-RNA-Beladung verwendet werden;
9 zeigt die biparametrische Analyse von fötalen Rattenleberzellen, die als Seitenstreuung (SSC, „side scatter"), ein Maß der zytoplasmatischen Komplexität, gegen den Logarithmus der Fluoreszenz für OX-43 und OX-44 dargestellt wird. Bild A zeigt ungefärbte Zellen; Bild B zeigt die Zellen direkt nach der Isolierung (ursprüngliche Suspension); und Bild C zeigt die Zellen nach dem letzten Selektieren. Der größte Teil der Zellen direkt nach der Isolierung war nicht granulär und positiv für die Marker (R1-Zellpopulation). Mit der Anreicherung erhöhte sich die Population der granulären Zellen (SSC > 50 A.U.), die für die OX-43-/OX-44-Marker negativ waren (R3-Zellpopulation). Die Sortierung auf diese Population zeigte, dass 75% davon für AFP positiv waren. Die Trennung zwischen Positiven und Negativen ist bedingt durch die größere Autofluoreszenz der granulären Zellen höher für die granulären als für die agranulären Populationen;
10 zeigt Zellen am Tag 15 der Gestation, die auf Hepatoblasten durch das Ausselektieren von roten Blutzellen, die für 5 Tage auf Typ IV Kollagen in serumfreiem, hormonell definierten Medium kultiviert wurden, angereichert wurden. Die Zeilen zeigten eine typische epitheliale Morphologie einschließlich der Bildung von Gallengang-Canaliculi. Die umgebenden Epithelzellen sind fibroblastenartige Zellen.
Balken = 25 μ; und
11 zeigt kleine epitheliale Inseln mit positiver Färbung für Albumin durch in situ Immunfluoreszenz nach 16 Tagen in Kultur. Die fibroblastenartigen Zellen, die diese umgeben, sind negativ auf die Gegenwart von Albumin. Balken = 100 μ.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft isolierte Hepatoblasten und Verfahren zur Isolierung von Hepatoblasten aus dissoziierten Leberzellen unter Verwendung von Trennungstechniken und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Die isolierten Hepatoblasten der Erfindung können verwendet werden, um eine Leberfehlfunktion zu behandeln, um künstliche Lebern herzustellen, zur Untersuchung von Leberfunktionen, in der Gentherapie, in Medikamententests und bei der Impfstoffherstellung.
Die Lebern werden durch enzymatischen Verdau unter Vermeidung von Enzymen wie Pronase dissoziiert, die Hepatoblasten negativ beeinträchtigen, und werden dann in Lösungen aufbewahrt, die gekühlt werden und die Chelatisierungsmittel wie EGTA enthalten, was in Zellen resultiert, die als Einzelzellen gehalten werden können. Die dissoziierten Leberzellen werden dann mit Antikörpern selektiert, um die Anzahl der verunreinigenden Zelltypen (hemopoetische Zellen einschließlich rote Blutzellen, Endothelzellen und andere mesenchymale Zellen in embryonischer und neonataler Leber und ausgereifte Leberzellen, Hepatocyten, Gallengangzellen, Endothelzellen und andere mesenchymale Zellen in der Leber von Erwachsenen) zu verringern. Das Selektieren allein, obwohl es schnell, ist ineffizient und ergibt keine sehr reinen Zellpopulationen. Jedoch wird es verwendet, um schnell die Anzahl der Nicht-Hepatoblastenzellen zu verringern. Die Zellen, die nicht an den Trennplatten anhaften, werden dann durch die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aufgetrennt, eine Technologie mit sehr hoher Genauigkeit und Effizienz. Die Kombination der schnellen Trenntechnologie mit der Genauigkeit der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung ergibt stark aufgereinigte Zellpopulationen mit guter Überlebensfähigkeit.
In embryonischen und neonatalen Lebern sind die verunreinigenden Zelltypen, die durch die Selektionsprotokolle verringert werden, erythroide, myeloide und andere hemopoetische Zelltypen und Endothelzelltypen (mesenchymale Zelltypen). Die Selektionsschritte führen zu einer Zellpopulation, die auf unreife hepatische Zelltypen hin angereichert ist. In den Lebern von Erwachsenen sind die verunreinigenden Zelltypen reife Hepatocyten, Gallengangzellen, Endothelzellen und einige hemopoetische Zellpopulationen.
Die durch Selektieren („panning") abgetrennten Zellen werden auch auf mehrere Marker hin sortiert, die unterschiedliche Unterkategorien von hepatischen Vorstufenzellpopulationen unterscheiden. Die identifizierten Marker sind (a) das Ausmaß der Granularität, wie sie durch Seitenstreuung bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung gemessen wird, wobei weniger reife Zellpopulationen stärker agranular sind und eine erhöhte Granularität mit stärkerer Reifung korreliert; (b) das Ausmaß der Autofluoreszenz, wobei eine verstärkte Autofluoreszenz mit verstärkter Reifung korreliert; und/oder (c) die Expression eines hepatischen Zellmarkers (wie der ovale Zellmarker OC.3, der durch den monoklonalen Antikörper 374.3 nachgewiesen wird).
Leberzellen, die keine hemopoetischen oder endothelialen Zellantigene exprimieren, die durch die monoklonalen Antikörper OX-43 und/oder OX-44 erkannt werden (die myeloide Zellen und Endothelialzellen erkennen), und die keine Antigene exprimieren, die durch einen monoklonalen Antikörper gegen ein erythroides Antigen erkannt werden, umfassen die Hepatoblasten der Erfindung. Die hepatischen Vorläuferzellen der Erfindung umfassen drei Kategorien von unreifen Leberzellen:

(1) Stärker granuläre Zellen, die OC.3⁺ sind, sind festgelegte Gallengangvorläuferzellen. Diese Zellen sind auch AFP⁺, Albumin⁺ und CK 19⁺.
(2) Stärker granuläre Zellen, die OC.3^– sind, sind festgelegte Hepatocytenvorläuferzellen. Diese Zellen sind auch AFP⁺, Albumin⁺⁺⁺ und CK 19^–.
(3) Agranuläre Zellen, die OC.3⁺ sind, sind sehr unreife hepatische Vorläuferzellen. Diese Zellen sind auch AFP⁺⁺⁺, Albumin⁺ und CK 19^–.

Diese Erfindung ist zudem auf die Verwendung von Hepatoblasten gerichtet, die durch das Verfahren der Erfindung isoliert werden. Die isolierten Hepatoblasten der Erfindung können zur Behandlung einer Leberfehlfunktion verwendet werden. Zum Beispiel können Hepatoblasten in den Körper wie in die Leber oder an einen ectopischen Ort injiziert werden. Eine Transplantation der Gesamtleber, die eine teure und gefährliche große Operation voraussetzt, kann durch eine kleinere chirurgische Prozedur ersetzt werden, die Hepatoblasten in vivo entweder in die Leber über die Portalvene oder an einen ectopischen Ort wie die Milz einführt. Zusätzlich können Hepatoblasten in Bioreaktoren oder in einer Kulturvorrichtung verwendet werden, um künstliche Lebern zu erzeugen. Zudem können Hepatoblasten in der Gentherapie, Medikamententests, der Impfstoffherstellung und für jeglichen Forschungs-, kommerziellen oder therapeutischen Zweck verwendet werden, der Leberzellen mit unterschiedlichen Ausmaßen an Reifung voraussetzt.
Beispiel I
Fischer 344 Ratten mit bekannter Dauer der Trächtigkeit wurden von Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) erworben und im Tierhaus des Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, auf Standard-Rattenfutter mit zwölfstündigen Lichtzyklen gehalten. Durch Konvention ist der erste Tag der Gestation als Tag 0 definiert. Die Verwendung der Tiere entsprach der Richtlinie des NIH zur Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde vom Komitee zur Tierpflege und Verwendung des Albert Einstein College of Medicine bewilligt.
Um fötale Leberzellen zu isolieren, wurden trächtige Ratten am vierzehnten Tag der Gestation mit Ether euthanasiert und die Embryonen wurden intakt entfernt und in eiskalte Ca⁺²-freie Hank's Balanced Salt-Lösung, enthaltend 0,04% DNAse, 0,8 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH 7,3 (HBSS) platziert. Die Lebern wurden dann aus den Föten präpariert und in frische eiskalte HBSS platziert. Nachdem alle Gewebe gesammelt wurden und Nicht-Lebergewebe entfernt worden war, wurde HBSS – 5 mM EGTA bis zu einer endgültigen Konzentration an EGTA von 1 mM hinzu gegeben. Die Lebern wurden mit einer Pipette auf ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen überführt, vorsichtig 6 bis 8 Mal trituriert, um das Gewebe teilweise zu disaggregieren, und dann bei 400 g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Alle anschließenden Zentrifugationsschritte wurden in der gleicher Weise durchgeführt. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet der Zellen und des Gewebes wurde in 50 ml 0,6% Kollagenase D (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in HBSS, enthaltend 1 mM CaCl₂, resuspendiert, vorsichtig trituriert und dann bei 37°C für 15 Minuten in einem Erlenmeyer-Gefäß gerührt. Die dispergierten Zellen wurden zusammengeführt, in HBSS, enthaltend 1 mM EGTA, suspendiert, und durch einen 46 μm Gewebesammler (Ballco Glass, Inc., Vineland, NY) filtriert. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in HBSS resuspendiert, das mit MEM-Aminosäuren, MEM-Vitaminen, MEM-nichtessentiellen Aminosäuren, Insulin (10 μg/ml), mit Eisen gesättigtem Transferrin (10 μg/ml), freien Fettsäuren (7,6 mEq/l, wie es in Chessebeuf et al., 1984, Nu-Chek-Prep, Elysian, MN beschrieben wird), Spurenelementen, Albumin (0,1%, Fraktion V, fettsäurefrei, Miles Inc., Kankakee, IL), Myoinositol (0,5 mM) und Gentamicin (10 μg/ml, Gibco BRL, Grand Island, NY) supplementiert worden war (HBSS-MEM). Die Zellzahl und Lebensfähigkeit wurden durch Hemacytometer und Trypan-Bau-Ausschluss bestimmt.
Um erythroide Zellen zu entfernen, wurden Trennplatten gemäß dem Verfahren von Wysocki und Sato (1978) unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-Ratte-RBC IgGs hergestellt (Rockland Inc., Gilbertsville, PA). Antikörper (0,5 mg/Platte), die in 9 ml 0,05 M Tris pH 9,5 verdünnt worden waren, wurden in 100 mm² bakteriologische Polystyrolpetrischalen gegossen (Falcon, Lincoln Park, NJ). Die Platten wurden geschwenkt, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten und bei Raumtemperatur für 40 Minuten inkubiert. Die beschichteten Platten wurden vor der Verwendung vier Mal mit PBS und ein Mal mit HBSS, das 0,1% BSA enthielt, gewaschen.
Drei Milliliter der Zellsuspension, die bis zu 3 × 10⁷ Zellen enthält, wurden bei 4°C für 10 Minuten in den Schalen inkubiert, die mit dem Kaninchen-Anti-Ratte RBC IgG beschichtet worden waren. Die nicht anhaftenden Zellen wurden durch Absaugen entfernt und die Platten wurden drei Mal mit HBSS – 0,1% BSA – 0,2 mM EGTA gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in HBSS-MEM erneut suspendiert und das RBC-Selektieren wurde wiederholt. Nach dem zweiten RBC-Selektieren wurde die Zellzahl und Überlebensfähigkeit erneut bestimmt.
Die nach dem RBC-Selektieren zurück gewonnenen Zellen wurden dann in Suspension durch das gleichzeitige Inkubieren mit Maus-monoklonalem Antikörper OX-43 (1/200 = 15 μg/ml, MCA 276, Bioproducts for Science, Indianapolis, IN) und dem monoklonalen Antikörper 374.3 (1/500–1/750, ein Geschenk von R. Faris und D. Hixon, Brown University, Providence, RI) bei 4°C für 40 Minuten markiert. OX-43 erkennt ein Antigen auf Endothelzellen, eine Unterpopulation von Makrophagen und erythroiden Zellen (siehe Barclay, Immunology, Bd. 42, S. 593–600 (1981) und Robinson et al., Immunology, Bd. 57, S. 231–237 (1986)) und 374.3 erkennt ovale Zellen, Gallengangzellen und hemopoetische Zellen (siehe Hixon et al., Pathology: Liver Carcinogenesis, S. 65–77 (1990)). Die sekundären Antikörper waren PE-konjugierte Anti-Maus IgGs, die für die schwere Kette spezfisch sind (Southern Biotechnology Inc., AL), sowie FITC-konjugierte Anti-Maus IgMs, die für die schwere Kette spezifisch sind (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Negative Kontrollen umfassten Zellen ohne Markierung und Zellen, die mit Maus-Isotypkontrollen markiert worden waren.
Zellen vor und nach der Sortierung wurden bei 4°C und in HBSS-MEM aufbewahrt. Nach der Vervollständigung der Antikörpermarkierung wurde Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 10 μg/ml zu jedem der Probenröhrchen hinzu gegeben. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS wurde mit einem Becton Dickinson FACSTAR^plus (San Jose, CA) unter Verwendung eines 4 W Argon-Lasers mit 60 mW Leistung und einer 100 μm Düse durchgeführt. Die Fluoreszenzemission bei 488 nm Anregung wurde nach dem Durchführen durch einen 530/30 nm Banddurchlassfilter für FITC und 585/42 nm für PE gesammelt. Die Fluoreszenzmessungen wurden unter Verwendung einer logarithmischen Verstärkung auf biparametrischen Grafiken von FL1 (FITC) gegen FL2 (PE) gesammelt. Die Zellen wurden als positiv angesehen, wenn die Fluoreszenz mehr als 95% der negativen Kontrolzellen betrug.
Zur Messung der physikalischen Eigenschaften der Zellen waren die FACSTAR^plus-Parameter FSC Gain 8 und SSC Gain 8. Diese Einstellungen ermöglichten es allen Zellen, in der Skala visualisiert zu werden. HBSS wurde als Hüllflüssigkeit verwendet. Zur Analyse wurde ein Minimum von 10.000 Vorgängen gemessen. Die Daten wurden gesammelt und mit der LysisII Software analysiert. Tote Zellen wurden unter Verwendung der Propidiumiodidfluoreszenzhistogramme von nicht markierten Zellen ausgeschlossen.
Zur Bestimmung des positiven Ergebnisses für einen einzelnen Antikörper, wurden Punktgrafiken der Fluoreszenz gegen die Seitenstreuung verwendet. Dichtegrafiken von FL1 gegen FL2 wurden verwendet, um Populationen in Bezug auf die Expression von beiden Antigenen zu selektieren. Ein Sortierungsverstärkermodul wurde für nicht rechteckige Sperren verwendet und die Verwendung multiparametrischer Sperren zur Auswahl der Populationen von Interesse.
Sortierte Zellen vom Tag vierzehn der Gestation aus allen Populationen wurden in einem serumfreien, hormonell definierten Medium mit αMEM als Basismedium plattiert, zu dem die folgenden Komponenten hinzugefügt wurden: Insulin (10 μg/ml); EGF (0,01 μg/ml, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY); Wachstumshormon (10 μU/ml); Prolaktin (20 mU/ml); Triiodthyronin (10^–7 M); Dexamethason (10^–7 M); mit Eisen gesättigtes Transferrin (10 μg/ml); Folsäure (10^–8 M, Gibco BRL, Grand Island, NY), eine Mischung mit freien Fettsäuren (7,6 mEq/l, wie sie von Chessebeuf et al., 1984 beschrieben wird, Nu-Chek-Prep, Elysian, MN); Putrescin (0,02 μg/ml); Hypoxanthin (0,24 μg/ml); Thymidin (0,07 μg/ml); Rinderalbumin (0,1%, Fraktion V, frei von Fettsäuren, Miles Inc. Kankakee, IL); Spurenelemente; CuSo₄·5H₂O (0,0000025 mg/l), FeSO₄·7H₂O (0,8 mg/l), MnSO₄·7H₂O (0,0000024 mg/l), (NH₄)₆Mo₇O₂₄·H₂O (0,0012 mg/l), NiCl₂·6H₂O (0,000012 mg/l), NH₄VO₃ (0,000058 mg/l), H₂SeO₃ (0,00039 mg/l; HEPES (31 mM) und Gentamicin (10 μg/ml, Gibco BRL, Grand Island, NY). Die Reagenzien wurden von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, zur Verfügung gestellt, es sei denn, dieses wird anders spezifiziert. Die Spurenelementmischung war ein Geschenk von Dr. I. Lemishka, Princeton University, NJ.
Kulturplatten sowie Zytospins von verschiedenen Zellsuspensionen wurden mit eiskaltem Ethanol oder Aceton fixiert. Nach dem Blockieren mit PBS, das 1% BSA enthält, für 30 Minuten bei Raumtemperatur, wurden die fixierten Zellen durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung der folgenden primären Antikörper untersucht: polyklonaler Kaninchen-Anti-Ratte-Albumin – Antikörper (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), Kaninchen-Anti-Maus-AFP – Antiserum (ICN Biomedical, IN., Costa Mesa, CA), monoklonaler Maus-Anti-Mensch-Zytokeratin 19 – Antikörper (Amersham Life Science Arlington Heights, IL), polyklonaler Kaninchen-Anti-Mensch-IGFII Rezeptor – Antikörper (ein Geschenk von Dr. Michael Czech, University of Worchester, MA), monoklonaler Maus-Anti-Ratte-Thy-1– Antikörper (OX-7, Bioproducts for Science, Indianapolis, IN), monoklonaler Maus-Anti-Desmin – Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 258.26, ein monoklonaler Maus-Anti-Ratte – Antikörper, der postnatale Hepatocyten sowie einige fötale Leberparenchymzellen identifiziert (ein Geschenk der Dres. R. Faris und D. Hixon, Brown University, RI). Die sekundären Antikörper umfassten speziesspezifische Rhodamin-konjugierte Antikörper, die mit den primären Antikörpern korrespondierten. Negative Kontrollen bestanden aus Zellen, die mit Maus- oder Kaninchen- IgG oder für Maus isotypischen Kontrollen gefärbt wurden. Frisch isolierte adulte Hepatocyten wurden als positive Kontrollen zur Albuminfärbung verwendet. Gamma-glutamyltranspeptidase (GGT) wurde durch Immunhistochemie auf mit Ethanol fixierten Zellen unter Verwendung des von Rutenberg et al., J. Hist. Cyt., Bd. 17, S. 517–526 (1969) beschriebenen Verfahrens untersucht.
Um eine Northern Blot-Analyse auf die Gegenwart spezifischer mRNA durchzuführen, wurde Gesamt-RNA aus sortierten Zellen unter Verwendung des Guanidiniumisothiocyanatverfahrens extrahiert, wie es von Chomcznyski et al., Anal. Biochem., Bd. 162, S. 156–159 (1987)) beschrieben wird. Die RNA-Proben wurden durch Elektrophorese durch 1% Agaroseformaldehydgele in 3-(N-morpholino)propansulfonsäurepuffer (siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 191–193 (1982)) aufgelöst. Die RNA wurde dann auf Gene Screen (New England Nuclear, Boston, MA) übertragen und die Filter wurden vorhybridisiert und mit den entsprechenden Sonden hybridisiert. Die cDNA-Klone, die komplementär zu den spezifischen mRNAs sind, wurden radioaktiv durch Primer-Verlängerung mit ³²P dCTP markiert, wie es von Feinberg et al., Anal. Biochem., Bd. 137, S. 266–267 (1984) beschrieben wird. Die in der Hybridisierung verwendeten cDNAs waren Rattenalbumin (ein Geschenk von Dr. Zern, Jefferson University, Philadelphia, PA) und α-Fetoprotein aus der Maus (Dr. Tighlman, Princeton, NJ), GGT (erhalten von Dr. M. Manson, MRC Medical Research Council, Surrey, UK) und PG19. Die Autoradiogramme wurden mit einem Quantimat-Densitometer (Modell 920; Hersteller ist Cambridge Instrument) abgetastet. Die Daten für jedes der Gene wurden für das des gemeinsamen Gens 19S (J. Darnell, Rockefeller University, New York, NY) normalisiert.
Um eine Western Blot-Analyse durchzuführen, wurden Gesamtproteinproben aus verschieden sortierten Zellen auf ein 10% Polyacrylamid-Minigel geladen. Die Beladung wurde auf gleiche Zellzahlen normalisiert, 100.000 Zellen pro Tasche. Es wurde eine Elektrophorese gefolgt durch Elektroblotten auf Nitrozellulosemembranen (Schleicher and Schuell, Keene, NH) durchgeführt. Die Blots wurden über Nacht in 2% trockener Milchlösung bei 4°C blockiert und auf Albumin unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Rattenalbumin-Antiserums, das 1 : 800 verdünnt war, in der Blockierungslösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur, gefolgt durch 1 Stunde Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase- konjugiertem anti-Kaninchen-IgG (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL), 1 : 50 in Blockierungslösung verdünnt, untersucht. Der Nachweis wurde durch die Inkubation der Blots mit Reagenzien des ECL-Chemiluminescenz-Kits (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) für 1 Minute und anschließender Autoradiografie erreicht.
Platten mit 48 Wells wurden mit Typ 1 Kollagen beschichtet, das aus der Schwanzsehne von Ratten, wie es durch Reid, Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Bd. 5, S. 237–276 (1990) beschrieben wurde, extrahiert wurde. Sortierte Zellen bei Dichten zwischen 50.000 bis 100.000 Zellen/cm² wurden pro Well ausplattiert. Nach einem Anhaftungszeitraum über Nacht wurde das Medium mit den nicht haftenden Zellen vorsichtig entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Ein vollständiger Mediumwechsel wurde alle 24 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C in einer vollständig befeuchteten Atmosphäre kultiviert, die 5% CO₂ enthielt, und wurden täglich observiert. Nach 4 Tagen in Kultur wurden die Zellen mit eiskaltem Ethanol fixiert und in situ durch Immunfluoreszenz auf Albumin, AFP, CK 19 und IGF II-Rezeptor und durch Immunchemie auf GGT, wie es unten beschrieben wird, gefärbt.
Leber aus Embryonen am vierzehnten Tag der Gestation, die durch EGTA-Kollagenaseverdau isoliert worden waren, ergaben Einzelzellsuspensionen und eine vernachlässigbare Anzahl von Zellaggregaten. Die Zellüberlebensfähigkeit betrug mehr als 95%, wie es durch den Ausschluss von Trypan-Blau bestimmt wurde. Die Zellausbeute betrug 2,62 ± 0,31 × 10⁶ Zellen pro Leber. Die ursprüngliche Zellsuspension wurde zwei Schritten der Immunhaftung („Trennung") unter Verwendung von Kaninchen-anti-Ratten-RBC IgG-beschichteten Polystyrolplatten ausgesetzt. Die zelluläre Ausbeute nach Beendigung der zwei Trennungsschritte betrug 51% (± 8%), variierte jedoch etwas mit unterschiedlichen Chargen von Antikörpern.
Die nach dem RBC-Abtrennen gewonnenen Zellen wurden in Suspension mit einer Mischung aus zwei Antikörpern gefärbt: einem Antikörper, der gegen „ovale Zellen" gezüchtet wurde (monoklonaler Antikörper 374.3) und einem kommerziell verfügbaren Antikörper, von dem bekannt ist, dass er endotheliale sowie auch einige erythroide und myeloide Zellen in der Ratte erkennt (monoklonaler Antikörper OX-43). Nach der Inkubation mit den geeigneten FITC- und PE-markierten sekundären Antikörpern wurden die Zellen auf deren Fluoreszenzmuster hin analysiert. Wie in 1, Bild A, gezeigt wird, wurden, wenn Fluoreszenzintensitäten für beide Antikörper gegen einander aufgetragen wurden, fünf verschiedene Populationen beobachtet, die als R1–R5 bezeichnet werden. Mit kleineren Variationen in dem Prozentanteil jeder Population war die Verteilung der Zellen bei der Ausbildung der fünf Populationen extrem reproduzierbar. Die kleinen Unterschiede können durch Variationen in der Ausbeute der Zellen nach dem RBC-Abtrennen erklärt werden.
Die anfängliche Analyse der sortierten Zellen durch Immunfluoreszenz zeigte die Anwesenheit von Albumin- und AFP-positiven Zellen in einer der OX-43-positiven Zellpopulationen (R2). Diese größeren und komplexeren Zellen umfassten ungefähr 5–10 der Zellen in dieser Auswahl. Jedoch schienen diese größeren Zellen negativ für OX-43 (keine PE-Markierung), wenn frisch sortierte R2-Zellen unter dem Epi-Fluoreszenzmikroskop angesehen wurden. Die Parenchymzellen in der Leber haben einen signifikanten Grad an Autofluoreszenz, der sich mit der Reifung der Leber parallel zu der Erhöhung in zellulärer Komplexizität erhöht, wie es durch die Seitenstreuungsparameter auf dem FACS gemessen wird. Es wurde daher postuliert, dass dies durch das Phänomen bedingt ist, dass einige Parenchymzellen in der Region der OX-43-positiven Zellen erscheinen, obwohl sie das Antigen nicht exprimieren. Um dieser Hypothese nachzugehen, wurde ein positives Ergebnis auf OX-43 genau durch Seitenstreuung (zelluläre Granularität) gegen die PE-Fluoreszenz, wie es auf der FL2-Skala gemessen wird (1, Bild B), bestimmt, und OX-43-positive und negative Zellen wurden sortiert und charakterisiert. Um die Genauigkeit der Sortierungen zu bestimmen, wurden nach der Sortierung weitere Selektionen der sortierten Zellen unter Verwendung der gleichen instrumentellen Einstellungen durchgeführt. Die typische Reinheit nach der Sortierung (d. h., der Prozentanteil der Zellen aus einer sortierten Population, die in der gleichen Region erschien, wenn sie nach der Sortierung erneut analysiert wurde) betrug > 90%.
Die sortierten Zellen aus sowohl der OX-43-positiven wie auch der negativen Auswahl wurden auf die Expression von leberspezifischen Genen durch Western Blot-Analyse und durch indirekte Immunfluoreszenz untersucht. Wie in 2, Bild A, gezeigt wird, gab es im Vergleich mit den OX-43-negativen Zellen eine minimale Menge an Albumin in der OX-43-positiven Zellfraktion, die durch Western Blotten nachgewiesen wurde. Es konnten keine AFP-positiven Zellen durch indirekte Immunfluoreszenz mit Cytospins von sortierten OX-43-positiven Zellen im Gegensatz zu 30% der OX-43-negativen Zellen, die den fötalen Lebermarker exprimieren (siehe 2, Bilder B und C), gezeigt werden. Es wurde daraus geschlossen, dass am Tag vierzehn der Gestation alle fötalen Leberparenchymzellen OX-43-negativ sind. Daher wurden, um „sauberere" Auswahlen zu treffen, OX-43-positive und negative Zellen auf einer SSC gegen FL2-Grafik getrennt und getrennt untersucht.
Wenn OX-43-positive Zellen elektronisch aussortiert wurden und die verbleibenden Zellen auf einer FL1 gegen FL2-Grafik angesehen wurden, wurden leicht drei verschiedene Populationen nachgewiesen (siehe 1, Bild C), die mit R3–5 in der nicht sortierten Zellsuspension korrespondieren. Alle der Zellen in R3 waren 374.3-positiv, wohingegen 30% der Zellen in R4 positiv für diesen Marker waren. R5-Zellen exprimierten kein OC.3. Die Expression verschiedener leberspezifischer und anderer Gene wurde mit sortierten Zellen aus R3–5 untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 unten zusammengefasst.
TABELLE 1 Charakterisierung von sortierten Zellen durch Immunfluoreszenz und durch Histochemie
Ungefähr 2–3% der R3-Zellen (weniger als 0,2% der gesamten nicht ausgewählten Zellsuspension) wurden intensiv auf Albumin und AFP gefärbt. Sie exprimierten auch GGT und CK 19, die Marker der Gallengangabstammung sind. Jedoch schien der Hauptteil der Zellen kleine, blastozytenartige Zellen zu sein und exprimierte keine leberspezifischen Gene, sondern exprimierte klassische hemopoetische Marker wie Thy-1 und Serglycin (siehe Tabelle 1 und die 3 und 4). Die meisten der Leberparenchymzellen wurden in der R4-Auswahl gefunden (siehe Tabelle 1 und 3). Der allergrößte Teil der Zellen exprimierte Albumin, AFP und GGT, die alle Marker des fötalen Leberparenchyms sind. Es wurden keine hemopoetischen oder fettspeichernden Zellmarker in dieser Auswahl nachgewiesen. Die Zellpopulation, die als R5 bezeichnet wird, ist eine heterogene (siehe 4), die hauptsächlich zwei Zelltypen umfasst: (1) Zellen, die morphologisch scheinbar Normoblasten sind; und (2) einfache kleine Zellen, die keine Leberparenchymgene exprimieren. Das Verhältnis dieser zwei Zelltypen variierte etwas und war von der Effizienz der RBC-Trennung abhängig.
Wenn alle OX-43-negativen Zeilen aussortiert wurden, wurden zwei verschiedene Populationen auf einem FL1/FL2-Plot beobachtet. Wie es erwartet wurde, wurden keine Parenchymlebermarker in diesen Zellen nachgewiesen. Einige der R2-Zellen färbten intensiv mit dem Antikörper gegen Desmin, einem intermediären Filament, das üblicher Weise in fettlagernden Zellen exprimiert wird. Morphologisch schienen die meisten der R2-Zellen frühe erythroide Vorläuferzellen zu sein (siehe 4), während 10% von diesen Thy-1 exprimierten. In der R1-Auswahl waren zwei morphologisch unterschiedliche Zelltypen (siehe 4). Der Hauptanteil waren kleine, blastocytenartige Zellen und diese exprimierten keine der getesteten Marker. Die anderen, ungefähr 20% der Zellen in dieser Auswahl, waren größere Zellen mit einem blassen Zytoplasma und exprimierten den Rezeptor für IGF-II. Sehr wenige Zellen aus R1 färbten für Thy-1.
Die sortierten Zellen aus allen 5 Populationen wurden für 4 Tage kultiviert, um deren in vitro-Schicksale zu bestimmten. Wenn sie mit hoher Dichte unter den beschriebenen Bedingungen ausplattiert wurden, ergaben R4-Zellen Anhäufungen von epithelialen Zellen, die durch sehr wenige verstreute Stromazellen umgeben waren (siehe 5A und Tabelle 2 unten).
TABELLE 2 Charakterisierung der R4-Zellen nach 4 Tagen in Kultur
Die Zellteilung war eindeutig erkennbar sowohl in den epithelialen wie auch in den Stromakomponenten der Kultur. An dem 2. Tag der Kultur zeigten 25 ± 5% der Epithelzellen die Aufnahme von Brom-Deoxyuridin (BrdU) nach einer Stunde der Inkubation mit einem Medium, das BrdU enthält (siehe 5A und B). Wenn RBC-getrennte, aber nicht sortierte Zellen vom Tag 14 der Gestation unter ähnlichen Bedingungen plattiert wurden, überlebten sie für wenigstens 10 Tage (die Daten werden nicht gezeigt). Jedoch verschlechterten sich die Kulturen der sortierten R4-Zellen schnell. Die Epithelzellen verloren deren klassische polygonale Form und verlängerten sich in ähnlicher Weise, wie es in Primärkulturen von adulten Hepatocyten in der Gegenwart von Serum zu beobachten ist. Zudem zeigten kultivierte R4-Zellen, wenn sie in situ auf Albumin, AFP und GGT gefärbt wurden, eine langsame Verringerung in diesen leberspezifischen Genen, wohingegen RBC-getrennte Zellen am Tag 14 der Gestation deren Genexpression unter ähnlichen Bedingungen (Daten werden nicht gezeigt) beibehielten. Der IGF-II-Rezeptor blieb in dem Golgi-Apparat der kultivierten Epithelzellen wie auch der Stromazellen eindeutig nachweisbar. Ungefähr 30% der kultivierten R4-Zellen zeigt eine Färbung auf CK 19, ein Cytokeratin, das in Gallengangzellen und nicht in adulten Hepatocyten vorhanden ist.
Wenn Zellen aus allen anderen vier Populationen unter den gleichen Bedingungen plattiert wurden, wurden nur einige verstreute fibroblastenartige Zellen (aber keine Epithelkolonien) beobachtet. Trotz der Leberparenchymeigenschaften von einigen R3-Zellen konnten keine Epithelkolonien aus diesen Zellen unter ähnlichen Plattierungsbedingungen erhalten werden. Dieses kann durch die niedrige Dichte der Epithelzellen in dieser Auswahl bedingt gewesen sein. Diese Zellen aggregierten in Suspension, überlebten ungefähr für 48 Stunden und starben dann. Die Beschichtung der Platten mit Typ I- oder Typ IV-Kollagen, Fibronectin oder Laminin allein oder in Kombination verbesserten weder die Anhaftung noch die Überlebensfähigkeit dieser Zellen (Daten werden nicht gezeigt).
Beispiel II
Fisher 344-Ratten mit bekannter Dauer der Trächtigkeit wurden von Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) erworben und in dem Tierhaus des Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, bei einer Standard-Rattendiät mit 12-stündigen Lichtzyklen gehalten. Nach der Konvention ist der erste Tag der Gestation als der Tag Null definiert. Die Verwendung der Tiere entsprach der NIH-Richtlinie zur Pflege und Nutzung von Labortieren und wurde vom Komitee zur Tierpflege und Nutzung des Albert Einstein College of Medicine bewilligt.
Trächtige Ratten am fünfzehnten Tag der Gestation wurden mit Ether euthanasiert und die Embryonen wurden entfernt. Die Lebern wurden dann aus den Föten ausgeschnitten, gewogen, in eiskalte Ca⁺-freie Hank's Balanced Salzlösung platziert, die 0,8 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH 7,3 (HBSS) enthielt und leicht bei Raumtemperatur für 1 Minute gerührt. Nach dem Entfernen nicht hepatischen Gewebes, wurden die Lebern vorsichtig trituriert und dann bei 37°C für 10 bis 15 Minuten in einem Erlenmeyer-Gefäß mit 0,6% Typ IV Kollagenase (Sigma Chemical Co., Charge 11H6830, St. Louis, MO) in HBSS gerührt, die 1 mM CaCl₂ und 0,06 % DNAse I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) enthielt. In Intervallen von 5 Minuten wurden Gewebefragmente bei 1 g sedimentieren gelassen. Der Überstand wurde zurückgewonnen und frische Kollagenaselösung hinzu gegeben. Die dispergierten Zellen wurden zusammengeführt, in HBSS suspendiert, die 5 mM EGTA enthielt, und durch einen 46 μm Gewebesammler (Bellco Glass, Inc., Vineland, NY) bei 1 g filtriert. Die resultierende Zellsuspension wurde bei 4°C für 5 Minuten bei 450 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in HBSS erneut suspendiert, die 0,2 mM EGTA und 0,5% BSA enthielt (HBSS – EGTA – 0,5% BSA), und die Zellzahl wurde mit einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL) abgeschätzt. Die Überlebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Ausschluss von 0,04% Trypan-Blau bestimmt und eine Probe der Suspension wurde in einem austarierten Mikrofugenröhrchen bei 450 g für 5 Minuten zentrifugiert.
Um hemopoetische und endotheliale Zellen auf mit Antikörper beschichteten Polystyrolplatten einer Immunhaftung auszusetzen, wurden Trennplatten gemäß dem Verfahren von Wysocki und Sato hergestellt. Die eingesetzten Antikörper umfassten Kaninchen- anti-Ratten-RBC-IgG (Inter-cell Technologies, Inc., Hopewell, NJ) und Ziegen-IgG, das gegen Maus-Gesamt-IgG-Molekül gerichtetet ist (M-3014, Sigma, St. Louis, MO). In 10 ml 0,05 M Tris, pH 9,5, verdünnte Antikörper (0,5 mg/Platte) wurden auf 100 mm² bakteriologische Polystyrolpetriplatten (Falcon, Lincoln Park, NJ) gegossen, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten und bei Raumtemperatur für 40 Minuten inkubiert. Die beschichteten Platten wurden vier Mal mit PBS gewaschen und ein Mal vor der Verwendung mit HBSS, die 0,1% BSA enthält.
Drei Milliliter der Zellsuspension, die bis zu 3 × 10⁷ Zellen enthielt, wurden bei 4°C für 10 Minuten in den Platten inkubiert, die mit dem Kaninchen-anti-Ratte-RBC-IgG beschichtet worden waren. Der Überstand, der nicht haftende Zellen enthielt, wurde durch vorsichtiges Absaugen unter Neigen und Schwenken entfernt, kombiniert mit drei Waschgängen mit 7 ml HBSS – EGTA – 0,1% BSA, und bei 4°C für 5 Minuten bei 450 g zentrifugiert. Die Zellen aus zwei Platten wurden zusammengeführt und erneut mit einer frischen Platte getrennt, die mit Kaninchen-anti-Ratte-RBC-IgG beschichtet war. Die nicht haftenden Zellen wurden dann wie oben entfernt und erneut mit HBSS – EGTA – 0,5% BSA auf eine Konzentration von 1 × 10⁷/ml suspendiert. Die angereicherten Hepatoblasten wurden dann gleichzeitig bei 4°C für 40 Minuten mit dem monoklonalen Mausantikörper OX-43 (15 μg/ml, MCA276, Serotec, Indianapolis, IN) und dem monoklonalen Antikörper OX-44 (18 μg/ml, MCA371, Serotec, Indianapolis, IN) inkubiert. OX-43 erkennt ein Antigen auf Makrophagen, Endothelzellen und roten Blutzellen und OX-44 erkennt das Membranglycoprotein CD53, das auf allen Rattenmyeloidzellen sowie auf peripheren Lymphzellen vorhanden ist, und ist mit dem menschlichen Leukozytenantigen CD37 verwandt. Nach dem Waschen zur Entfernung eines Überschusses an Antikörper wurden die Zellen bei 4°C für 10 Minuten in einer Platte getrennt, die mit Ziege-anti-Maus-Gesamt-IgG-Antikörper beschichtet war und nicht haftende Zellen wurden wie oben beschrieben entfernt.
Danach wurden Cytospins der verschiedenen Zellsuspensionen mit entweder eiskaltem Ethanol oder Alkohol, Aceton und Carbowax 1540 (Fix-Rite, Richard-Allan Medical Industries, Richland, MI) fixiert. Nach dem Blockieren wurden die fixierten Zellen durch indirekte Immunfluoreszenz oder das Biotin/Streptavidin-Verfahren unter Verwendung von β-Galactosidase (BioGenex, San Ramon, CA) mit Kaninchen-anti-Ratten-Albumin-IgG (USB Corp., Cleveland, OH) oder Kaninchen-anti-Maus-AFP-Antiserum (ICN ImmunoBiologicals, Liste, IL) als primäre Antikörper immungefärbt. Negative Kontrollen bestanden aus Zellen, die ohne die primären Antikörper gefärbt worden waren. Positive Kontrollen für Albuminfärbung wurden mit frisch isolierten adulten Hepatocyten durchgeführt.
Um eine Northern Blot-Analyse durchzuführen, wurde Gesamt-RNA aus den Zellen vor und nach dem Abtrennen und aus den Zellen, die an den Trennplatten hafteten, unter Verwendung des Guanidiniumisothiocyanat-Verfahrens, extrahiert. RNA-Proben wurden durch Elektrophorese mit 1% Agaroseformaldehydgelen im 3-(N-morpholino)-propansulfonsäurepuffer aufgelöst, dann auf Gene Screen übertragen (New England Nuclear, Boston, MA), die vorhybridisiert waren, und dann mit den geeigneten Sonden hybridisiert. Die cDNA-Klone, die komplementär zu den spezifischen mRNAs waren, wurden radioaktiv durch Primerverlängerung mit ³²P dCTP markiert. Die verwendeten cDNAs waren Rattenalbumin, Maus-AFP und Maus-18S (J. Darnell, Rockefeller University, NY). Die Autoradiogramme wurden mit einem Quantimat-Densitometer (Modell 920; Hersteller Cambridge Instrument) abgetastet. Die Daten für jedes der Gene wurden auf die des gemeinsamen Gens 18S normalisiert.
Um eine FACS-Analyse und Sortierung auf hemopoetische und endotheliale Zellmarker am Tag 15 der Gestation durchzuführen, wurden Zellsuspensionen zu verschiedenen Stadien der Anreicherung durch Flusszytometrie in der FACS-Vorrichtung des Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, durchgeführt. Die Zellen wurden auf 1 × 10⁷ Zellen/ml erneut suspendiert und bei 4°C für 40 Minuten mit OX-43 mit und ohne OX-44 inkubiert, gefolgt durch FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG (spezifisch für die schwere Kette, Southern Biotech, Birmingham, AL) bei 4°C für 40 Minuten. Die Zellen färbten nur mit dem FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG, der als negative Kontrolle diente.
Die flusszytometrische Analyse wurde auf einem Becton Dickinson FACScan (San Jose, CA) mit einem 15 mW luftgekühlten Argonlaser durchgeführt. Die Zellsortierung wurde mit einem Becton Dickinson FACSTAR^plus (San Jose, CA) unter Verwendung eines 4 W Argonlasers mit 60 mW Leistung und einer 100 μm Düse durchgeführt. In beiden Fällen wurde die Fluoreszenzemission bei 488 nm Anregung nach dem Durchführen durch einen 530/30 nm Banddurchlassfilter für FITC gesammelt. Die Fluoreszenzmessungen wurden unter Verwendung einer logarithmischen Verstärkung durchgeführt. Die Zellen wurden als positiv angesehen, wenn die Fluoreszenz mehr als 95% der negativen Kontrollzellen betrug. Zur Messung der physikalischen Eigenschaften der Zellen lag der Nachweiswert bei E-1 für die Vorwärtsstreuung (FSC, „forward scatter") mit einer Verstärkung im mittleren Bereich. Für die Seitenstreuung (SSC, „side scatter") lag der Nachweiswert im mittleren Bereich mit einer Verstärkung von 1. Äquivalente FACSTAR^plus-Parameter waren ein FSC-Gain von 4 und ein SSC-Gain von 8. Diese Einstellungen ermöglichten es allen Zellen, auf der Skala visualisiert zu werden. Die FSC- und SSC-Auswahl wurde unter Verwendung einer linearen Verstärkung durchgeführt, wobei beide Parameter in 256 arbiträre Einheiten (A. E.) aufgeteilt wurden. Zur Analyse wurden wenigstens 10.000 Vorgänge gemessen. Die aufgelisteten Modusdaten wurden genommen und unter Verwendung der LysisII-Software analysiert. Zellen vor und nach der Sortierung wurden bei 4°C und in HBSS gehalten, die mit Insulin, Transferrin, freien Fettsäuren, Spurenelementen, Albumin und Gentamicin ergänzt war, wie es im Detail für die Ergänzungsmittel beschrieben wurde, die zu dem HDM hinzu gegeben werden.
Als nächstes wurde eine multiparametrische flusszytometrische Analyse der hemopoetischen und endothelialen Marker in Bezug auf das ovale Zellantigen OC.3 durchgeführt. Die isolierten Zellen wurden mit einer Kombination aus OX-43 und OX-44 (Maus IgGs) und dem monoklonalen Antikörper 374.3 (Maus IgM, Hixson und Faris, Brown University, Providence, RI) markiert, gefolgt durch FITC-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG (spezifisch für die schwere Kette, So Biotech, Birmingham, AL) und PE-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgM (spezifisch für die schwere Kette, So Biotech, Birmingham, AL). Die Zellen färbten nur mit dem FITC-konjugierten anti-Maus IgG und das PE-konjugierte anti-Maus-IgM diente als negative Kontrolle. Die Zellen wurden sowohl auf das Ausmaß der Fluoreszenz für eine der Sonden wie auch durch Seitenstreuung bewertet, ein Maß der zellulären Komplexizität (Menge der cytoplasmatischen Organellen).
Leberzellen vom 15. Tag der Gestation wurden gegen einen Rattenantikörper gegen rote Blutzellen selektiert und die epithelangereicherte Zellsuspension wurde in ein serumfreies, hormonell definiertes Medium mit αMEM als Basismedium plattiert, zu dem die folgenden Komponenten hinzu gegeben wurden: Insulin (10 μg/ml); EGF (0,01 μg/ml, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY); Wachstumshormon (10 μU/ml); Prolactin (20 mU/ml); Glucagon (10 μg/ml); Triiodthyronin (10^–7 M); Dexamethason (10^–7 M); mit Eisen gesättigtes Transferrin (10 μg/ml); Folsäure (10^–8 M, Gibco BRL, Grand Island, NY), eine Mischung aus freien Fettsäuren (0,76 mEq/l, eine Modifikation des von Chessebeuf, Nu Check-Prep, Elysian, MN, beschriebenen Verfahrens); Putrescin (0,02 μg/ml); Hypoxanthin (0,24 μg/ml); Thymidin (0,07 μg/ml); Rinderalbumin (0,1%, Fraktion V, fettsäurefrei, Miles Inc., Kankakee, IL); Spurenelemente: CuSo₄·5H₂O (0,0000025 mg/l), FeSO₄·7H₂O (0,8 mg/l), MnSO₄·7H₂O (0,0000024 mg/l), (NH₄)₆Mo₇O₂₄·H₂O (0,0012 mg/l), NiCl₂·6H₂O (0,000012 mg/l), NH₄VO₃ (0,000058 mg/l), H₂SeO₃ (0,00039 mg/l); Hepes (31 mM) und Gentamicin (10 μg/ml, Gibco BRL, Grand Island, NY). Die Reagenzien wurden von der Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bereit gestellt, es sei denn, dieses wird anderweitig spezifiziert. Die Spurenelementmischung war ein Geschenk von Dr. I. Lemishka, Princeton University, NJ.
Platten mit 24 Wells wurden mit Typ IV-Kollagen beschichtet, das aus EHS-Tumoren extrahiert worden war. Die getrennten Zellen mit Dichten zwischen 12.500 und 25.000 Zellen pro cm² wurden pro Well plattiert und für vier bis fünf Stunden anhaften gelassen, wonach das Medium mit den nicht haftenden Zellen vorsichtig entfernt und mit frischem Medium ersetzt wurde. Die Zellen wurden bei 37°C in einer vollständig befeuchteten Atmosphäre kultiviert, die 5% CO₂ enthielt, und wurden täglich für 5 bis 16 Tage observiert. Ein vollständiger Mediumwechsel wurde alle 48 Stunden durchgeführt.
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Beginn der Kultur wurden Zellen mit eiskaltem Ethanol fixiert und in situ durch Immunchemie oder durch Immunfluoreszenz auf Albumin und AFP gefärbt.
Das Gewicht der Lebern an dem 15. Tage der Gestation betrug 9,1 ± 1, 3 mg. Die Kollagenasebehandlung verdaute die Leber vollständig und es wurde nur sehr wenig partikelförmige Materie durch das Gewebesieb ausgeschlossen. Die Zahl der Zellen, die in diesem Schritt erhalten wurden, betrugen 1,07 × 10⁷/Leber und das Gewicht der dissoziierten Zellen betrug 8,6 ± 1,1 mg/Leber, 95% des gesamten Gewichts des Organs. Die Suspension bestand fast vollständig aus isolierten einzelnen Zellen mit gelegentlichen kleinen Aggregaten, die sich in der Größe und der Anzahl in der Abwesenheit von EGTA und einer Temperatur von mehr als 4°C erhöhte. Die Überlebensfähigkeit durch Trypan-Blau-Ausschluss betrug mehr als 90%.
Nach jedem Trennungschritt zeigte die Phasenkontrastmikroskopie, dass die anhaftenden Zellen eine erythroide Morphologie zeigten. Nur seltene Zellen waren für Albumin durch Immunchemie positiv. Nach dem Abtrennen mit den durch Kaninchen-anti-Ratte-Rote-Blutzellen-Antikörper beschichteten Platten zur Entfernung roter Blutzellen und dann mit den mit Ziege-anti-Maus-Gesamtmolekül-IgG-Antikörper beschichteten Platten zur Verringerung der Anzahl der OX43/OX44⁺-Zellen machten die nicht anhaftenden Zellen jeweils 29 ± 5% und 16 ± 4% der Zellzahl der frisch dispergierten fötalen Leber (ursprüngliche Suspension) aus. Die Trennung erwies sich als erfolgreich für Lebergewebe aus allen fötalen und frühen neonatalen Altersstufen, obwohl die Variation der hemopoetischen Konstituenten mit dem Entwicklungsalter in unterschiedlichen Ausmaßen der Anreicherung resultierte (die Daten werden nicht gezeigt). Auch variierte die Effizienz der RBC-Abtrennungsprozedur mit der Antikörpercharge. Bei Antikörpern mit schlechter Effizienz für das direkte Abtrennen war jedoch die indirekte Immunhaftung für die Zellen erfolgreich, die in der Suspension markiert worden waren, gefolgt durch die Trennung mit anti-Kaninchen-IgG-beschichteten Petrischalen.
In der Phasenkontrastmikroskopie nach der Leberdispersion war der dominante Zelltyp eine kleine rote Zelle, die in der Morphologie mit der einer frühen erythroiden Zelle konsistent ist. Es waren auch größere vakuolisierte Zellen vorhanden. Die Immunzytochemie zeigte, dass der größte Teil der vakuolisierten Zellen sowie gelegentliche kleinere, oval geformte Zellen stark positiv für Albumin und AFP waren (siehe 7). Die Anteile der Albumin- und AFP-positiven Zellen in verschiedenen Stadien der Anreicherung werden in (siehe Tabelle 3 unten und 6) gezeigt. TABELLE 3 Charakterisierung der E15 zellulären Lebersuspension in verschiedenen Stadien der Anreicherung

ND = nicht durchgeführt
¹Immunzytochemie mit dem Biotin/Streptavidin-Verfahren unter Verwendung von β-Galactosidase (BioGenex, San Ramon, CA) mit dem Weglassen des primären Antikörpers als negative Kontrolle.
²Die Zellen wurden als positiv angesehen, wenn die Fluoreszenz mehr als 95% der negativen Kontrollzellen durch FACS-Analyse ergab.

Die Northern Blot-Analyse für leberspezifische Gene (Albumin und AFP) wurde mit Zellen vor und nach der Trennung durchgeführt und wird in 8 gezeigt. Die Zellen nach der Trennung waren bis zu 5-fach auf AFP mRNA und 2-fach für Albumin mRNA angereichert, ein Ergebnis, das sowohl den Erfolg der Trennprozeduren wie auch die hohen Konzentrationen der Hepatoblasten (im Gegensatz zu reifen Hepatocyten) zeigt. Vernachlässigbare Mengen an Albumin- und keinerlei AFP mRNA waren in den Zellen erkennbar, die an den Trennplatten hafteten.
Zur Bestimmung der Effizienz, mit der hemopoetische und endotheliale Zellen entfernt wurden, wurden Zellen aus verschiedenen Stadien der Anreicherung durch Flusszytometrie auf die Gegenwart von OX-43 hin analysiert, das Makrophagen, endotheliale Zellen und rote Blutzellen erkennt, und auf die Gegenwart von OX-44 hin analysiert, das myeloide und periphere lymphoide Zellen erkennt. Die Ergebnisse werden in 6 und in Tabelle 3 gezeigt. Der Prozentanteil der Zellen, die für OX-43/OX-44 in der ursprünglichen Zellsuspension positiv waren, betrug 87,9 ± 2,5%. Die Kombination der Trennprozeduren mit anti-Ratte-RBC-IgG- und anti-Maus-Gesamt-IgG-Antikörpern entfernte 84% der Zellen. Obwohl 69 ± 10,0% der nicht anhaftenden Zellen immer noch positiv für die OX-43/44-Marker waren, wurde der Prozentanteil der Hepatoblasten dramatisch angereichert (5-fach). Obwohl zusätzliches Trennen die OX-43/44⁺-Zellpopulation noch weiter hätte verringern können, wurde herausgefunden, dass die Zellzahlen ausreichend durch die Trennung verringert worden waren, um eine FAC-Sortierung zu ermöglichen, um den Prozess der Eliminierung der OX-43/44⁺-Zellen zu vervollständigen.
Wenn sie durch Flusszytometrie untersucht wurden, bestanden fötale Leberzellen aus einer heterogenen Population in Bezug auf FSC, ein Maß der Zellgröße, und SSC, ein Maß der cytoplasmatischen Komplexizität. Cytologisch gab es einen breiten Bereich an Zellgrößen (5 bis 15 μ, durch Coulter-Zähler, die Daten werden nicht gezeigt), aber die Zellgröße hat sich nicht als nützlich bei der Trennung von hemopoetischen von Parenchymvorläufern herausgestellt. Stattdessen wurden die Populationen am besten unter Verwendung von SSC aufgetrennt. Die Definition von granulären gegenüber agranulären Zellen wurde basierend auf einer linearen Skale für die Seitenstreuung unter Verwendung biparametrischer Grafiken der Fluoreszenz gegen die Seitenstreuung gemacht. Basierend auf den Populationsprofilen unterschied 50 A. E. üblicher Weise die agranulären von den granulären Zellen.
Unter Verwendung von SSC gegen die Fluoreszenz könnten die fötalen Leberzellen in drei Populationen isoliert werden: agranuläre Zellen (die R1-Population), die positiv für die endothelialen und/oder myeloiden Marker (OX43/OX44) waren, und agranuläre (R2) und granuläre (R3) Zellen, die negativ für die OX43/OX44-Marker waren (siehe 9). Die Trennung zwischen positiv und negativ war bedingt durch die größere Autofluoreszenz der granulären Zellen höher für die granulären als für die agranulären Populationen. Die Analyse der sortierten FACS-Populationen zeigte, dass jeweils weniger als 1% und 3,0 ± 0,7% der Zellen in den R1- und R2-Populationen positiv für AFP waren. Jedoch waren 75,1 ± 4,7% der granulären Zellen, die für die Marker negativ waren (R3), für AFP durch Immuncytochemie (siehe Tabelle 4 unten) positiv. TABELLE 4 Charakteristiken der Zellfraktionen auf dem FACS

¹Die Zellen wurden als positiv angesehen, wenn die Fluoreszenz größer als 95% der negativen Kontrollzellen durch FACS-Analyse war.
²50 A. E. unterschieden die agranulären von den granulären Zellen unter Verwendung der FACS-Parameter mit einem FSC-Gain von 4 und einem SSC-Gain von 8.
³Immunzytochemie mit dem Biotin/Streptavidin-Verfahren unter Verwendung von β-Galactosidase (BioGenex, San Ramon, CA), wobei der primäre Antikörper als negative Kontrolle ausgelassen wurde.

Die Doppelbildanalyse der R1-Zellpopulation, der einzigen, die mit OX-43/OX-44⁺-Zellen analysiert wurde, zeigte eine intensive Überlappung von OX-43/44-positiven und OC.3-positiven Zellen. Das FACS-Muster für OX-43/OX-44 war für alle Altersstufen der Gestation außer einer kleinen Erhöhung in der R1 Gruppe (und gleichzeitig einer Verringerung in der R3 Population) mit zunehmendem Gestationsalter bedingt durch eine sich erhöhende hepatische Erythropoese ähnlich (die Daten werden nicht gezeigt). Die Analyse der sortierten Zellpopulation, die für OX-43/44 positiv war, zeigte unabhängig von der Expression von O.C.3 oder der Granularität, dass die meisten morphologisch hemopoetische Vorläuferzellen waren und für AFP negativ waren. Von den granulären OX-43/44^–- Zellen (der Zellpopulation R3), von denen die meisten AFP⁺ waren, waren ungefähr 30% OC.3⁺. Eine kleine Population von Zellen (R2 in Tabelle 4), die OX43/44^–, agranulär und AFP⁺ waren, wurde nicht auf OC.3-Expression hin untersucht.
Die Zellzubereitungen vom Tag 15 der Gestation, die durch Selektion auf Hepatoblasten hin angereichert worden waren, wurden auf mit Typ IV Kollagen beschichteten Platten und in einem serumfreien, hormonell definierten Medium, wie es oben beschrieben wird, ausplattiert. Innerhalb eines Tages nach der Plattierung aggregierten die epithelialen Zellen erneut und hafteten an dere Matrix als kleine Zellanhäufungen. Plattierungseffizienzen von bis zu 60% wurden erhalten (Die Daten werden nicht gezeigt). Die Zellen waren in Inseln aus typischen Parenchymzellen organisiert, die enge Zell-Zell-Kontakte bildeten, und Gallengangcanaliculi, die durch nicht epitheliale, fibroblastenartige Zellen umgeben waren (siehe 10). Nach 4–5 Tagen in Kultur waren die Parenchymzellkomponenten langsam durch nicht Parenchymzellen überwachsen. Jedoch blieben verbleibende Anhäufungen von Hepatoblasten für bis zu 16 Tagen in Kultur positiv auf Albumin und AFP, wie es durch in situ Immunchemie oder Immunfluoreszenz untersucht wurde (siehe 11). In einigen Experimenten, in denen Glucagon aus dem Kulturmedium weggelassen wurde, wurde kein morphologischer Unterschied beobachtet, und die Zellen exprimierten Albumin und AFP, wenn sie in situ durch Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie (die Daten werden nicht gezeigt) gefärbt wurden. Diese Beobachtung wird einer relativen Glucagonresistenz der fötalen Hepatoblasten zugesprochen.
Die Erfinder haben Verfahren entwickelt, die Trenntechnologien sowie die multiparametrische FAC (fluroeszenzaktivierte)- Sortierung umfassen, die Zellpopulationen auf Leberparenchymzellvorstufen hin stark anreichern. Von den Verfahren dieser Erfindung wurde durch die Erfinder herausgefunden, dass sie auf die Isolierung von hepatischen Vorläuferzellen aus Leber am Tag 13 des Gestationsalters bis hin zur frühen neonatalen Periode geeignet sind. Die beschriebene Leberdispersionsprozedur ergibt eine Population von hauptsächlich einzelnen Zellen mit mehr als 90% Überlebensfähigkeit, und am Gestationstag 15 werden 95% des gesamten Organgewichts zurückgewonnen. Die Selektionsprozeduren entfernen bis zu 84% der gesamten Zellzahl und reichern gleichzeitig die hepatoblastische Population um das 5-fache an. Die Erhöhung in der Parenchym-spezifischen Genexpression von Albumin und AFP wurde durch Northern Blot-Analyse der Zellen vor und nach der Trennung illustriert, und die Spezifität der Prozedur wurde durch die Analyse der Zellen, die an die Trennplatten haften, gezeigt. In ähnlicher Weise wurde die Anreicherung durch in vitro Daten bestätigt, in denen es nach dem Selektieren im Vergleich zu der ursprünglichen Suspension zu einer dramatischen Erhöhung in der Zahl der Zellkolonien kommt, die Albumin und AFP exprimieren. Zudem war die Plattierungseffizienz im Vergleich zu den zuvor berichteten Werten von 6 bis 10 % signifikant erhöht (bis zu 60%). Obwohl die Hepatoblasten immer noch eine kleinere Population nach den Trennprozeduren darstellen, ist es wichtig, zu berücksichtigen, dass die üblichen in situ Hepatocyten-Perfusionsprotokolle eine Population ergeben, die im Durchschnitt 37,7% Hepatocyten enthält.
Der Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu den bisherigen Verfahren, die die Anhaftung von dispergierten Leberzellen an Kulturplatten, die differentielle Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit und die Kultur in Arginin-deffizitärem Medium involvieren, ist mehrfach. Isolierte Hepatocyten verlieren in vitro schnell die gewebespezifische Genregulation. Als ein Ergebnis davon kann in Prozeduren, die die Zellanhaftung an eine Matrix voraussetzen, die Messung der Parenchym-spezifischen Funktion, wie der Protein- oder mRNA-Gehalt, die in vivo-Mengen vielleicht nicht reflektieren. Dissoziierte fötale Hepatoblasten bilden auch leicht große Aggregate über einen Kalzium- und Temperatur-abhängigen Glycoprotein-vermittelten Prozess. Bereits am Tag 14 der Gestation waren große Mengen von einem Zellmembranprotein vorhanden, von dem angenommen wird, dass es Uvomorulin (E-cadherin) ist, auf Hepatoblasten vorhanden. Diese Tendenz zur Aggregation erklärt die Fähigkeit zur differentiellen Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur Anreicherung auf relativ große (E19) Hepatoblasten, insbesondere in der Gegenwart von Ca²⁺ und bei einer Temperatur von mehr als 4°C. Zum Dissaggregieren der Hepatoblasten wurden mechanische Verfahren einschließlich intensives Pipettieren und Ansaugen durch eine Spritze eingesetzt, aber es wurde herausgefunden, dass diese unzureichend sind, was zu den Schwierigkeiten mit weiteren Analysen führt, die eine Einzelzellsuspension voraussetzen, wie die FACS.
Die Tendenz der Zellen zur Aggregation wird durch die Aufbewahrung der Zellen bei 4°C und durch das Entfernen von Kalzium mit EGTA, das mit der CAM-vermittelten Aggregation interferiert, verhindert. Der Vorteil der Aufbewahrung der Zellen als eine Einzelzellsuspension ist zweifach. Als erstes kann die Messung der Parenchym-spezifischen Funktionen auf zellulärer Ebene bestimmt werden, was die physiologisch irrerelevanten Änderungen in der hemopoetischen Zellpopulation übergeht. Zweitens können Prozeduren wie FACS, die eine Einzelzellsuspension benötigen, leicht durchgeführt werden.
Obwohl Hepatoblasten an Gestationstag 15 größer als Nicht-Parenchymzellen erscheinen, erwies sich die Seitenstreuung anstatt die Vorwärtsstreuung auf dem FACS als ein besseres Unterscheidungskriterium bei der Trennung der verschiedenen Populationen, wahrscheinlich weil sogar Hepatoblasten am Gestationstag 12, die Vakuolen, Mitochondrien und viel endoplasmatisches Reticulum enthalten, relativ komplex sind. Zusätzlich erwies sich die Seitenstreuung als ein sinnvolles Maß der zellulären Reife. Im Allgemeinen waren Hepatoblasten mit stärkerer Granulärität morphologisch und biochemisch reifer (die Daten werden nicht gezeigt).
Somit wurde die FACS- (fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs-) Analyse eingesetzt, um die Expression des ovalen Zellmarkers OC.3 zu untersuchen, von dem nachgesagt wurde, dass er Leberstammzellen identifiziert. Mit der multiparametrischen FACS-Analyse auf die OC.3 oder OX-43/44-Expression hin in Kombination mit der Auswahl von Zellen mit einem bestimmten Mass an Granularität waren die Erfinder in der Lage, die Populationen in Nicht- Parenchymzellen (homeopoetische, endotheliale und stromale Zellen) gegen Parenchymzellvorläufern aufzuteilen, die AFP⁺ waren. Zudem waren die Erfinder in der Lage, die Expression des OC.3-Antigens in verschiedenen Subpopulationen zu bewerten. Am Gestationstag 15 erwiesen sich die meisten agranulären OX-43/44⁺- Zellen als hemopoetische Zellen, größtenteils erythroide Zellpopulationen. Von der granulären OX-43/44^–- Zellpopulation, die hauptsächlich AFP⁺-positiv war, waren ungefähr 30% der Zellen OC.3⁺ und stellten wahrscheinlich Gallengangzellvorläufer dar, wohingegen OC.3^–- Zellen wahrscheinlich Hepatocytenvorläuferzellen waren. Jedoch war ein kleiner Prozentsatz der agranulären OX-43/44^–-Zellen AFP⁺.
Im Vergleich zu dem hemopoetischen Gebiet ist das Gebiet der Leberstammzellen noch in seinen Anfängen. Jedoch wird die Fähigkeit zur Isolierung spezifischer Populationen durch FACS-Sortierung unter Verwendung dieser Parameter mit anschließender Untersuchung des in vitro und in vivo Schicksals die Identifizierung der Leberstammzelle stark unterstützen. Zudem ist diese Technologie auf das Studium aller Aspekte der Biologie der Leberstammzelle anwendbar, einschließlich des Gallengangepithels, der Karzinogenese, der Regeneration, der Alterung und der gewebespezifischen Genexpression.

Claims

Ein Verfahren zur Isolierung hepatischer Vorläuferzellen aus der Leber von Erwachsenen, umfassend: (a) die Herstellung einer Einzelzellsuspension aus Leberzellen von Erwachsenen; (b) das Schwenken der Suspension unter Verwendung von Antikörpern, die für ausgereifte Hepatocyten, ausgereifte Gallengangzellen, endotheliale Zellen, mesenchymale Zellen und hemopoetische Zellen spezifisch sind, um ausgereifte Hepaytocyten, ausgereifte Gallenganzellen, endotheliale Zellen, mesenchymale Zellen und hemopoetische Zellen aus der Suspension zu entfernen; (c) das Durchführen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unter Verwendung dieser Antikörper, um verbleibende ausgereifte Hepatocyten, ausgereifte Gallengangzellen, endotheliale Zellen, mesenchymale Zellen und hemopoetische Zellen aus der Suspension zu entfernen; und (d) das Durchführen einer multiparametrischen fluoreszenzaktivierten Zellsortierung mit der Suspension unter Verwendung einer Antikörper gegen einen hepatischen Zellmarker- Seitenstreuungs-, Vorwärtsstreuungs- und/oder Autofluoreszenz zur Isolierung der hepatischen Vorläuferzellen.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin der Antikörper gegen einen hepatischen Zellmarker der monoklonale Antikörper 374.3 ist
Das Verfahren von entweder Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der hepatische Zellmarker OC.3 ist
Das Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Einzelzellsuspension ein Mittel umfasst, das in der Lage ist, Kalzium aus der Oberfläche von Leberzellen zu entfernen.
Das Verfahren von Anspruch 4, worin die Einzelzellsuspension EGTA umfasst.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Einzelzellsuspension ein Enzym umfasst, das in der Lage ist, Leberzellen zu dissoziieren.
Das Verfahren von Anspruch 6, worin die Einzelzellsuspension Collagenase enthält.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Einzelzellsuspension gekühlt wird.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin die Einzelzellsuspension bei einer Temperatur zwischen ungefähr 2 und 20°C vorliegt.
Ein Verfahren zur Isolierung hepatischer Vorläuferzellen aus embryonaler oder neonataler Leber, umfassend: (a) die Herstellung einer Einzelzellsuspension aus embryonischen oder neonatalen Leberzellen; (b) das Schwenken der Suspension unter Verwendung von Antikörpern, die für hemopoetische Zellen, mesenchymale Zellen oder Kombinationen davon spezifisch sind, um die hemopoetischen Zellen und mesenchymalen Zellen aus der Suspension zu entfernen; (c) das Durchführen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unter Verwendung der Antikörper, um hemopoetische Zellen und mesenchymale Zellen aus der Suspension zu entfernen; und (d) das Durchführen einer multiparametrischen fluoreszenzaktivierten Zellsortierung mit der Suspension unter Verwendung wenigstens einer Antikörper gegen einen hepatischen Zellmarker- Seitenstreuungs-, Vorwärtsstreuungs- und/oder Autofluoreszenz oder Kombinationen davon, so dass die Zellen, die in der Suspension verbleiben, angereicherte hepatische Vorläuferzellen sind.
Das Verfahren von Anspruch 10, worin der Antikörper, der für hemopoetische Zellen spezifisch ist, ein monoklonaler Antikörper ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, worin der monoklonale Antikörper wenigstens einer von OX-43 und OX-44 ist.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 12, worin der Antikörper gegen einen hepatischen Zellmarker der monoklonale Antikörper 374.3 ist.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 13, worin der hepatische Zellmarker OC.3 ist.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 14, worin die Einzelzellsuspension ein Mittel umfasst, das in der Lage ist, Kalzium aus der Oberfläche von Leberzellen zu entfernen.
Das Verfahren von Anspruch 15, worin die Einzelzellsuspension EGTA umfasst.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 16, worin die Einzelzellsuspension ein Enzym umfasst, das in der Lage ist, Leberzellen zu dissoziieren.
Das Verfahren von Anspruch 17, worin die Einzelzellsuspension Collagenase enthält.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 18, worin die Einzelzellsuspension gekühlt wird.
Das Verfahren von Anspruch 19, worin die Einzelzellsuspension bei einer Temperatur zwischen ungefähr 2 und 20°C vorliegt.