KR100873690B1 - 인간 간 전구세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 간장에서 전구세포를 분리하고 동결 보존하는 방법에 관한 것으로 전구세포 및 인간 간에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 세포 계통의 비전구세포를 함유하는 실질적으로 단일세포 현탁액을 제공하는 인간 간 조직을 프로세싱하는 단계; 현탁액에서 비전구세포를 제거하기 위해 현탁액을 데벌킹 처리하면 이 데벨킹된 현탁액은 하나 또는 그 이상의 세포 계통과 연관된 하나 이상의 마커를 나타내는 전구세포가 농축되는 단계; 데벌킹된 현탁액에서 선택된 세포 자체, 이들의 자손세포, 더욱 성숙된 형태가 하나 이상의 세포 계통과 연관된 하나 이상의 마커를 표현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 중 마커는 CD14, CD34, CD38, CD45 및 ICAM이다. 간 전구세포는 6∼15 u 직경으로서 이배체, 글리코포린 A^-, CD45^-, AFP⁺⁺⁺, ALB⁺, ICAM⁺이고, CD14⁺, CD34⁺⁺, CD38⁺⁺, CD117⁺를 발현하는 아집단을 갖는다. 이 전구세포 아집단은 간장 세포에 특히 유용하며 유전자 치료 및 생체 인공 기관을 만드는 데 유용하다.

Description

인간 간 전구세포{HUMAN LIVER PROGENITORS}

본 발명은 인간 간세포 및 담즙관 세포를 생성하는 다분화능 세포인 인간 간 줄기세포 및 조혈세포, 간엽세포 또는 간세포 계보를 포함하는 1개 또는 복수의 간장 세포 계보로 증식 및 분화하는 능력을 갖는 그의 다른 간장 전구세포 아집단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 간장 전구세포를 동정하는데 사용되는 마커 및 특성, 그의 정제 및 동결보존 방법, 간세포 아집단을 조혈 세포 아집단으로부터 구별할 수 있도록 하는 새로운 접근 및 간 전구세포가 태아에서 성인 간장까지에 존재하는 것을 입증하기 위한 증거에 관한 것이다. 본 발명은 세포요법 및 유전자 치료 및 생물 인공 장기의 확립의 기반으로 된다.

성숙 간장의 주된 구조 및 기능적 단위는 소엽(acinus)이고, 횡단면에서는 주변부에 3∼7세트의 문맥 3분지(각각 문맥 세정맥, 간 세정맥 및 답즙관을 갖는다)가 있으며, 중심부에는 중심정맥이 있다고 하는 2종류의 다른 혈관상의 주위에 바퀴와 유사한 구성으로 된다. 간장 세포는 문맥 및 중심 혈관 구조와 인접한 일련의 시누소이드(sinusoid)를 규정하는 구멍이 있는 내피가 양측에 연결된 세포판으로 구성되어 있다. 최근 데이터는 문맥 3분지의 각각의 주위에 위치하는 가는 관인 헤링관(Canals of Hering)에서 작은 도관이 형성되어 간장 판 내에 구역 1(zone 1)의 전체에 걸쳐 확장 및 접속하여 보틀 부러쉬(bottle brush)와 비슷한 패턴을 형성하고 있는 것이 나타나 있다(Theise, N. 1999 Hepatology, 30:1425-1433).

간세포는 시누소이드의 전체에 따라 디스(Disse) 강이라는 좁은 공간에 의해 내피와 분리되어 있다. 이 구성의 결과로서, 간세포는 각각 시누소이드로 나누어진 2개의 기저 도메인 및 인접한 간세포 사이에 접촉 영역에 의해 규정된 1개의 정상 부위(apical) 도메인을 갖는다. 기저 도메인은 혈액과 접촉하여 혈장 성분의 흡수, 분비에 관여하나, 정상 도메인은 답즙산염의 분비로 특화된 모세 담즙관을 형성하고, 담즙관과 상호 접속 네트워크를 통해 연락하고 있다. 혈액은 문맥 세정맥 및 간장 동맥으로부터 시누소이드를 통해 말단의 간장 정맥 및 중심 정맥으로 흐른다.

소엽은 이 미소 순환 패턴에 의하여 문맥주위 영역인 구역 1, 소엽 중앙 영역인 구역 2 및 중심주위 영역 3의 3개의 구역으로 나누어진다. 증식능, 형태학적 기준, 배수성(倍數性) 및 대부분의 간 특이적 유전자는 구역 위치와 상관하고 있다(Gebhardt, R., et al. 1988. FEBS Lett. 241: 89-93; Gumucio, J. J. 1989, Vol. 19. Springer International, Madrid; Traber, P, et al. 1988. Gastroenterology. 95:1130-43). 소엽의 폭방향 및 문맥 삼분지로부터 중심 정맥으로의 혈류 방향에 따라서 생기는 산소를 함유하는 혈액 성분의 농도 구배가 이 구역 구조의 일부, 예를 들면 당분해 및 당신생(글루코나제니시스)의 상호 구획화의 원인으로 되어 있다. 그러나, 2개만을 예로 들면, 갭 결합 단백질 코넥신 26의 문맥 주위 구역 분포 및 글루타민 신세타제의 중심 부위 구역 분포는 이와 같은 농도구배에 영향을 받지 않고, 대부분의 조직 특이적 유전자를 대표하는 것이며, 세포에 고유의, 또는 순환의 혈류 이외의 변수에 고유의 요인에 의해 결정되는 것으로 생각된다.

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간세포, 담즙 관 상피세포(담즙관 세포) 및 내피세포에 더하여, 문맥영역과 중심로 사이의 영역에는 이토(Ito) 세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포 등의 다른 종류의 세포도 포함한다. 이들은 간장의 병적 상태, 특히, 염증, 선유화(線維化)에는 큰 역할을 하지만, 정상 장기의 주된 항상성 기능에 직접적인 기여는 매우 작다고 생각된다.

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간장은 앞창자 꼬리부 및 횡중격으로부터 형성된 간 측실의 집단의 결과로서 발생한다. 간장 세포의 형성은 내배엽 상피가 심장 형성성 중배엽과, 아마 섬유아세포 증식인자를 통해 상호작용 후에 개시할 것이다. 그런 다음, 특화된 간장 세포는 패션과 같은 코드로 횡중격의 간엽으로 증식하여 파고들어 간 원기를 형성한다. 간장의 이들 초기 발생단계에는 상피-간엽의 직접적인 상호작용이 극히 중요한 것이며, 이들에 의해 어느 세포가 각각 간세포 또는 담관 세포 및 구멍이 있는 내피가 되는가가 지령된다. 간엽 특이적 유전자인 hlx 및 jumonji의 변이에 의해 간장 발생이 저지됨으로, 이 조직으로부터 기여의 중요성을 나타내고 있다. 발생 초기의 간장은 기저 멤브레인이 없는 연속되는 내피를 경계로 하는 원시 간세포 덩어리 및 많은 조혈 세포 집단으로 이루어져 있다. 내피가 변형하여 불연속적인 구멍이 있는 내피로 되는 것에 수반하여 맥관구조, 특히 문맥 맥관구조가 기저 멤브레인의 형성을 수반하여 발달한다. 간문맥 간질은 담즙관의 발생에 대한 유인으로 된다고 생각되며, 이것이 간문맥 정맥, 간장 소동맥, 담즙관을 둘러싸서 문맥 삼분지를 형성한다. 미성숙 간세포는 빨리 증식하여 실질 플레이트가 형성되나, 이것은 아마 조혈 세포의 대부분(모두는 아니지만)의 골수로 이동함과 동시에 일으키는 C-CAM 105, Agp 110, E-cadherin 및 코넥신 등의 조직 형성성 분자의 양 및 분포의 변화에 따르는 것이라고 생각된다. 최근 연구는 조혈 전구세포(progenitor)의 일부가 정지 상태의 성체 설치류 간장에 존속하고 있을 가능성이 시사되고 있으며, 성인 인간과 마우스의 성체 간장 어느 것으로부터도 조혈세포가 분리될 수 있다(Crosbie, O. M, et al, 1999, Hepatoligy, 29:1193-8). 성숙형의 신체적 조직화는 설치류에서는 생후 수 주간 이내에 일어나며, 인간의 경우에는, 약 생후 수년 이내에 일어난다. 대사 구역 분포는 각종 효소에 대해 다른 스케줄에 따라 확립되지만 출생 후의 시기에는 확실해진다.
[줄기세포 및 분화능이 구속된 전구세포]
줄기세포는 자기 복제성이며, 다능성(즉, 복수의 운명을 갖는 딸세포를 생산하는)이며, 활발히 증식하고, 1개 또는 복수의 조직을 재구성할 수 있는 원시(primitive) 세포로 정의되어 왔다. 줄기세포에 대한 대부분의 문헌은 배아 또는 조혈조직, 상피조식 또는 창자 조직에 관한 문헌의 어느 1개에서 유래하는 것이다.
보다 최근의 정의는 특정 클래스의 줄기세포를 함유하도록 수정되었다. 생식세포를 함유하는 모든 세포종의 발생에 관여하는 가능성을 갖는 줄기 세포는 전능성 줄기세포라 불리며, 이것에는 접합자 및 8세포기(상실기)까지의 정상 배세포를 함유한다. 배체 간장 세포는 "ES"라 불리며, 포배기의 전능성 정상세포에 유래하는 영구 세포 집단으로 되며, 1980년대 초기에 처음으로 보고되었다. ES 세포계는 전능성을 유지한 채, 인 비트로 배양이 가능하다. ES 세포는 면역부전 숙주의 자궁내 이외의 어느 부위에 도입된 경우에는 종양원성이며, 기형암을 형성한다. 그러나 이들을 정상의 포배기에 다시 주입하여 되돌리면, 배아 발생을 재개할 수 있고, 정상이지만 키메라성 마우스 형성에 관여한다. ES 세포주는 여러 종(마우스, 랫트, 피그 등등)으로부터 수립되어 있으나, 배양물로부터의 변형 ES 세포를 포배기와 융합시킨 후에 포배기를 가상 임신숙주로 이식함으로서 새로운 표현형을 가진 동물(녹아웃체, 트랜스제닉체)을 만들기 위하여 루틴하게 이용되고 있는 것은 오직 마우스계만이다. ES 세포의 많은 특성을 나타내는 배종(EG) 세포계는 원시 생식 세포 집단으로부터 인 비트로에서 직접 분리될 수 있다. ES 세포와 함께, EG 세포를 면역 부전 마우스에 주입하면 기형암을 형성하고, 포배기에 주입하면 생식세포를 함유하는 키메라가 생긴다.
운명이 결정된 줄기세포(Determined stem cells)란 한정된 수의 세포 종에 유전적 가능성이 제한된, 왕성한 증식능을 갖는 다능성 세포이다. 텔로메라제 분야 등에서 증가하고 있는 발견으로부터는 운명이 결정된 줄기 세포는 자기복제를 행하지 않고, 그의 자손(progeny)은 부모 세포보다 증식능이 낮은 가능성이 있는 것이 시사된다. 운명이 결정된 줄기세포로부터는 유전적 가능성이 단일의 운명, 예를 들면 줄기 세포에 한정되는 것에 의해 다능성을 잃은 딸세포가 생기고, 이들은 분화능이 구속된 전구세포(committed progenitors)라 부른다. 간장 세포 계통에는 분화능이 구속된 간세포 전구세포 및 분화능이 구속된 담즙관 전구세포가 있다.
최근 공개된 실험으로 인간 ES 세포 배양액을 사람 배아로부터 수립할 수 있는 것이 보고되었다. 이들의 인간 ES 세포를 조직에 주입함으로서 손상된 장기 및 조직을 재구성시킬 수 없을까가 제창되고 있다. ES 및 EG 세포를 자궁 이외의 부위에 주입하면 종양을 형성한다는 발견으로부터 인간 ES 세포를 환자에게 접종하려는 계획은 현실적이지 않고, 그 환자에게 종양을 발생시키는 중대한 우려가 있다. 이런 난제를 극복하기 위해 몇몇 단체는 환자에게 규정의 미소 환경 조건하에서 ES 세포를 분화시켜 환자에게 안전하게 접종할 수 있는 운명이 결정된 줄기 세포로 하는 계획을 추진 중이다. 예를 들면, 조혈 전구세포를 만드는 것에 대해서는 일정한 성과가 얻어져 있다. 그러나, 배양물을 환자에게 접종한 경우, 배양물 중에 남은 ES 세포로 인해 종양 발생의 위험이 남아 있다. 이상의 것으로부터 고려하면, 배아 발생시의 세포의 운명을 규정하는 무수한 제어과정이 발생 생물학의 연구에 의해 밝혀지지 않는 한, ES 세포는 세포 요법 또는 유전자 요법에 임상 프로그램에 연결되는 희망이 없는 실험적 도구로 남게 될 것이다. 세포 요법 또는 유전자 요법의 임상 프로그램에 연결되는 유일한 현실적인 선택은 한정된 수의 세포종에 유전적 가능성이 제한된 운명이 결정된 줄기세포를 사용하는 것이다. 이에 대하여, 공지의 조건하에서 ES 세포에 의해 생산되는 종류의 조직(예를 들어 조혈 세포)에 대해서는 ES 세포에는 생물 인공 장기로 연결될 가능성이 큰 것으로 생각된다.
[간장 줄기세포에 대한 논쟁]
줄기세포가 성인 정상 간에 존재하는가는 간장 세포 생물학 분야에서 커다란 논쟁 주제로 되어 있다. 이 분야에서 주류로 되어 있는, 경합하는 몇 개의 모델의 개요를 아래에 정리했다. 이탤릭체 부분은 각 모델의 중심적인 개념을 나타낸다.
이 분야의 일부 전문가는 간 줄기세포는 오직 배아 조직에만 존재하고, 성인 간에는 줄기세포가 존재하지 않고, 모든 성숙 간세포는 간장의 재생 과정에 동일하게 관여한다고 고려한다(Farber, E. 1992. In The Role of Cell Types in Hepatocarcinogensis. S. A. E, editor. Academic Press, New York). 파버(Farber) 모델에서는 모든 성숙 실질 세포는 표형형의 점에서 서로 동등하며, 간장에서의 증식능 및 유전자 발현의 공지의 불균일성은 미소 환경에만 기인한다고 생각한다. 파버는 발암 조건하에서는 성체 실질 세포는 역분화하여 종양세포가 된다고 제창하고 있다. 이 모델은 간암 발생 분야에서 수십년에 걸쳐 유력하며, 현재도 간 재생 연구에 강한 영향을 주고 있다.
모든 간장 세포가 줄기세포라고 생각하는 전문가도 있다(Kennedy, S. et al. 1995, Hepatology. 22:160-8;Michalopoulos, G. K. et al. 1997, Science. 276:60-6). 이들 연구자들은 모든 실질 세포는 서로 동등하고, 가소성이 높고, 유전자 발현이 미소환경에 의해 지령된다고 생각한다. 적당한 발암 조건에서는 성숙 실질 세포는 줄기세포로 되며, 이어서 종양 세포로 변환될 수 있는 것으로 가정하고 있다.
정지 줄기세포 모델 은 Wilson 및 Leduc(Wilson, J. W. et al, 1968. J. Pathol. Bacteriol 76:441-449)의 연구에 기초가 된다. 조혈 분야와 같이, 이 개념은 간 발암 형성에 관한 폭 넓은 연구에 의해 가장 신뢰를 얻었다(Marceau, N. 1994. Gut. 35:294-6). 이 연구자들은 2분화능(bipotential) 전구세포를 함유하는 전구세포가 성인 조직에 존재할 수 있다고 생각하나, 이들은 배아 발생으로부터 세포 집단의 드문 잔존물 또는 잔유물이라고 제창하고 있다. 이들은 전구세포는 오직 질병상태에서만 역할을 하고, 정상 또는 재생 간기능에서는 어떠한 역할도 하지 않는다고 가정한다(Overturf K, et al. 1999. American Journal of Pathology. 155:2135-2143). 즉, 그들은 근육내의 위성 세포와 비슷한 "정지상태"인 것으로 가정하고 있다. 이들 세포핵의 특징적인 형상으로부터 "달걀 세포"라고 기재되어 있다. 이들은 소형(∼9㎛)이며, 세포 표면에 특징적인 항원 프로필을 발현한다. 모든 성숙 간세포는 증식 및 유전자 발현에 관여하여 서로 동등하며, 유전자 발현의 불균일성의 모든 양상은 세포 미소환경에 의해 지령되는 것으로 보았다. 정지 줄기세포 모델의 지지자들은 실질 세포가 문맥 주위에서 중심 주위 영역으로 이동한다는 생각을 강하게 부정한다. 줄기 세포와 다른 간 전주세포의 중요성은 오직 질병 상태에만, 특히 발암에 관련된 것으로 간주한다. 이 때문에, 이 연구자들은 각종 발암성 상해에 의한 처리를 받은 동물의 전구세포의 후보에 대해 초점을 맞추고 노력을 가하였다. 이 연구는 "달걀 세포"는 재생 조건 또는 가볍거나 중등도의 손상 조겅하에서는 급속히 증식하는 세포를 인식할 수 있는 집단을 형성하지 않음을 보여준다. 의미 있는 수의 증식성 달걀 세포 집단은 극히 고도의 간 손상 후에만 관찰된다(Grisham J. W. et al. 1997. In Stem Cells. C. S. Potter, editor Academic Press, London 233-282).
간세포의 유동 에 기초로 한 모델(Arber, N. et al. 1988. Liver. 8:80-7; Zajick, G. et al. 1991. Liver. 11:347-51)은 날카로운 비판을 받아왔고 무시되어왔다. (Jirtle, R. L. 1995 . Liver Regeneration and Carcinogenesis: Molecular and Cellular Mechanism, Academic Press, New York). 이 가설은 줄기 세포 구획이 문맥 삼분지의 각각에서 중심 정맥으로 "흐르는" 성체 실질 세포를 생성한다고 가정하고 있다. 유동 과정에 의해 딸세포는 다른 미소 환경과 접촉하여 세포의 표현형이 변화한다. 더욱이, 미소 환경은 표현형의 매우 중요한 결정인자이다. 많은 연구자들은 표지된 도우너 세포가 이동하여 간장에 다시 도입되는 것은 아닌 것을 나타내는 연구와 모순되므로 이 모델에 반대하고 있다(Kennedy, S. et al. 1995, Hepatology, 22: 160-8). 그러나 유동 모델에 비판적인 가장 결정적인 증거를 제공하는 연구에서 조차도 미소 환경 또는 세포 계통상의 위치가 도우너 세포에 사용되는 마커의 발현에 영향을 미치는지 아닌지는 불명하다. 더욱이 간장 유동 가설은 간장 전구세포에 관계가 있다고 오랫동안 생각되어온 헤링관(Canals of Herring)에서 소도관이 생성되며, 간 플레이트내의 적어도 구역 1(zone 1)의 전체에 걸쳐 확장하는 것이라는 티이스(Thiese) 등의 최근 소견으로 볼 때, 재검토를 요하는 것으로 생각된다(Theise, N, 1999, Hepatoligy, 30;1425-1433).
Reid 등은 간장이 줄기 세포 및 성숙 계통의 계 라고 제창하였다(Sigal, S. H. et al. 1992. Am J Physiol. 263:G139-48). 그들은 조직은 줄기 세포 또는 초기 전구세포 집단에 의해 샘과 같이 영양분을 받은 성숙계통으로 조직되어 있다고 가정하고 있다(Brill, S. et al. 1993. Proceedings of the Society for Experimental Biology ＆ Medicine. 204:261-9). 조직은 "어린, 중년에서 노령 세포"로 진행되는 것으로 정의된다. 성숙 과정은 세포 크기, 형태, 항원 프로필, 증식능 및 유전자 발현 중 계통 위치 의존적인 변화에 의해 생긴다. 이들 변화는 자율적인 세포 변화의 조합에 의한 것으로 가정된다: 미소 환경에는 영양소, 가스 교환(산소, CO₂), pH, 호르몬, 세포간 상호작용 및 세포 외기질의 화학적 성질이 포함된다.
표 1

증식성은 줄기세포 및 초기 전구세포에서 최대이고, 계통을 통하여 진행함에 따라 저하된다고 가정한다. 이 모델은 성인 간 조직 중 대부분의 세포가 배수체, 특히 4배체, 8배체, 1/3 이하가 2배체인 것을 고려하였다. 최근 데이터로부터, 조직에서 재생 능력의 대부분이 2배체 세포 집단으로부터 유래하고, 오래된 세포는 배수성에 수반하여 비대성 응답을 통해 세포 량을 증가시킴으로서 재생에 기여한다는 개념이 지지된다(Sigal, S. H, et al. 1999. American Journal of Physiology. 276:G1260-72). 따라서 이 연구자들은 세포 증식을 위해 가장 유망한 것은 세포요법 또는 유전자 요법 또는 인공 장기의 어느 것이라도 조직의 2배체 세포 집단인 것으로 제창하고 있다.
줄기 세포 및 성숙 계통 모델은 간 악성 종양이 발암성 상해의 직접적이기 보다는 간접적인 결과일 가능성이 높다는 것을 시사하는 점에서 다른 간 세포발생 모델과 으로 종양 유전자 활성화에 의한 것이라는 제안하는 기타 간세포 발달 모델과 일치하지 않는다. 발암성 장해는 간장 대부분의 세포, 특히 계보의 성숙 세포를 사멸시켜 재생 응답을 강하게 유도한다고 주창한다. 그 결과 생성되는 전구세포의 증식에 의해 급속히 증식하는 세포인 전구세포의 2차적 변이 이벤트의 위험이 높아지고, 그것이 악성 종양을 초래할 우려가 있다. 따라서, 암의 분화가 차단되거나, 암이 줄기 세포를 표적으로 하는 발암성 상해에 기인한다는 오래된 가설을 맞는다고 받아드려지지만 상기에 제시한 수정을 필요로 한다.
현재, 성숙 계통 모델이 널리 받아드려지고 있는 배경에는 간장에 아팝토틱(apoptotic) 과정 또는 말단 분화과정을 나타내는 특징이 풍부하게 보이며(Sigal, S. H. 1995. Differentiation. 59:35-42), 또한 성인 간에 존재하는 간세포의 특정 아집단만이 왕성하게 세포 분열을 행한다는 데이터가 있다(Overturf K, et al. 1999, American Journal of Pathology. 155:2135-2143; Tateno, C et al. 2000. Hepatology. 31:65-74). 이 모델에서 전구세포 및 성체 세포의 부분 아집단(2배체 아집단으로 추정된다)은 생체내에(in vivo) 재주입되었을 때, 간 조직을 재구성할 수 있으며, 클론 증식을 포함하는 왕성한 증식을 행하는 것이 가능하다.
Naughton의 U.S. 특허 제5,559,022호에는 간으로부터 세포의 분리 및 농도구배 원심분리 사용에 의한 정제를 개시하고 있다. 그러나, 분리된 세포 아집단은 "호산성 실질 세포 집단"이며, 이것은 청구하는 본 발명의 간 전구세포가 아니다.
[간 전구세포의 전임상적 및 임상적 적용성]
간에서 미성숙 전구세포를 분리 및 동정하는 것은 이런 종류의 세포 아집단이 간질환의 치료에 영향을 주기 때문에, 임상적 및 상업적 관심이 있다. 미국에서 매년 약 250,000명이 간질환으로 입원한다. 간 이식은 어떤 간부전의 몇 개의 변형에 대한 치료법이고, 미국에서 1년에 약 4100건의 이식 수술이 행해지고 있다. 간이식시 제한 요인의 1개는 기관 이식을 위한 공여체 간은 뇌사를 겪고 있는 환자의 것이여야 한다는 것이다. 사후 1시간 이내의 간의 사용에 대한 가능성에 대해 많은 연구가 있지만, 시체 공여체의 간으로는 성공할 수 없었다.
간으로의 세포이식은 대부분의 간질환에 대해 매력적인 대체 요법이다. 세포 이식을 위한 외과적 처치는 전체 장기 이식에 비하여 규모가 작기 때문에, 고령 또는 허약과 같은 각종 수술 위험이 있는 환자에게도 사용될 수 있다. 다른 포유류로부터 유래된 간세포보다 인간 간세포를 이용하는 것이 유리하며, 이는 병원체가 가령 존재하고 있어도 인간 유래의 것이며, 환자에 의해 더욱 내성이 생길 수도 있고 사용 전의 스크리닝도 용이한 것으로 생각되기 때문이다.
간장 세포 이식에 대한 시도는 분획되지 않은 성숙 간세포가 사용되며, 일정의 유효성이 보인다(Fox, I. J. et al. 1998. New England Journal of Medicine. 338:1422-1426). 그러나, 세포는 생체내에서 증식하지 않기 때문에, 성공을 위해서는 많은 수의 세포(100∼200억)의 주입이 필요하다. 또한, 많은 수의 큰 성숙 간세포(평균 세포 지름 30∼50㎛)의 주입에는, 주입후에 큰 응집물이 형성되어 치명적인 색전을 일으키는 경향아 있는 것이 장해로 된다. 또한, 이러한 세포는 현저한 면역 거부 반응을 유발하기 때문에 환자는 인생의 남은 기간을 통하여 면역 억제제에 의해 유지하여야 된다. 마지막으로, 성숙 간세포는 동결 보존은 성공적으로 될 수 없으며 적합한 간조직의 입수, 세포 현탁액의 제조 및 임상 치료를 위한 세포의 즉시 배달에 관한 연계를 위하여는 복잡한 물류 시스템이 필요하다.
[간 전구세포 분리의 진보]
간으로부터 간장 전구세포의 분리는 간세포의 양성 선택을 위한 마커가 부족하기 때문에 극히 곤란한 작업이라고 알려져 있다. 간 전구세포의 후보에 대하여 사용할 수 있는 유일한 항체는 발암성 상해로 폭로하여 증식되도록 유도된 간 전구세포의 부분 아집단(난형 세포)에 대하여 조제된 모노클로날 항체이다. 그러나 이러한 항체는 조혈 세포 내에 존재하는 항체와 교차 반응한다.
간의 세포 요법 및 유전자 요법을 위하여 가장 용도가 넓은 집단으로 추정되는 간 전구세포 아집단을 입수하여 위하여 지금까지 수많은 시도가 되어왔다. 리등등의 미국 특허 제 5,576, 207호; 동 제5,789,246호에서는 간장 내의 규정 아집단을 제공하기 위하여 세포 표면 마커 및 측방 산란 플로우 사이토메트리를 이용하고 있다. 세포 계통으로 분화능이 구속된(lineage committed) 세포를 제거한 후, 세포 마커에 관하여 OC.3-양성(난형 세포 항원 마커), AFP-양성, 알부민 양성 및 CK19-음성(사이토케라틴 19)의 무과립 세포로서 검출된 미성숙 간 전구체를 선택함으로서 랫트 간세포의 아집단이 분리된다. 랫트 간 아집단은 설치류 간장으로부터 농축 간 전구세포를 분리 및 동정에 중요한 특징을 나타내고 있다.
본 명세서에서 개시하는 성인 인간 간장으로부터 간 전구세포 분리는 신규하고, 예상외의 것이나, 이것은 일부에서는 성인의 간 전구세포는 존재 자체에 관하여 논쟁이 있으며, 인간 간 전구세포는 존재하지 않던가, 또는 배 형성시부터 정지상태로서 존속하고 있는 것으로 추정되었기 때문이다. 따라서, 병적 상태를 제외하고는 이것을 분리 또는 연구하려는 시도가 없었다.
이에 대하여 발생 중의 간장의 혈장 단백질, 알파-페토프로테인(AFP) 및 알부민의 존재는 전구세포의 강력한 양성 지표로서 인식되고 있다. 간발생의 가장 초기에는 이들 세포는 답즙 세포 계통 및 간세포 계통의 양쪽으로 들어가는 자손 세포를 생산할 수 있다. 이들 딸세포가 담즙관 세포계통로 분화로 구속되면 알파-페토프로테인 발현은 소실한다. 그러나, 간세포 계통에서는 알파-페토프로테인 발현이 주산기까지 지속하며, 그 시점에서 억제되어 알부민 발현이 성인 간세포의 주된 특징의 하나로서 남는다.
그러나, 알파-페토프로테인이 세포 내 단백직이며, 세포의 고정 및 투과화 처리 후를 행하지 않으며 가시화되지 않기 때문에, 생성된 간 전구세포를 동정하기 위한 마커로서 적당하지 않다.

본 발명은 인간의 간 전구세포의 농축 집단을 함유하는 혼합물로, 인간 간 조직에서 유래하는 세포의 혼합물을 함유하는 조성물을 제공하는 방법에 있어서, 미성숙 세포 및 성숙 세포를 함유하는 각종 크기의 세포 혼합물을 함유하는 인간 간조직의 실질적으로 단일세포 현탁액을 제공하고; 인간 간 전구세포 자체, 그의 자손 세포, 또는 그보다 성숙된 형태인 알파-페토프로테인, 알부민 또는 양자의 발현을 지시하는 1개 또는 그 이상의 마커를 나타내도록 인간 간 전구세포의 농축 집단을 함유하는 세포 혼합물이 제공될 수 있도록 성숙 세포 및 비교적 큰 세포의 제거를 허용하고, 동시에 미성숙 세포 및 상대적으로 작은 세포를 유지하는 조건하에서 현탁액을 데벌킹(debulking)하는 것을 함유하는 방법에 관한 것이다. 알파-페토프로테인 및 알부민은 전장(full-length) 또는 변이형이어도 좋다. 데벌킹 공정은 세포 크기, 부유 밀도 또는 양쪽 모두에 의한 분리를 포함한다. 또한 데벌킹은 침강 속도, 유체 반경 및 침강과 평균 밀도와의 대비에 의한 것일 수 있다. 또는 분리를 표면 마커의 항체 또는 렉틴 등의 결합 성분의 상대적인 접착성에 의해 행할 수 있다. 분리된 전구세포는 이배체이고 직경이 약 15미크론 미만이다. 게다가, 전구세포 또는 그의 자손세포는 알파-페토프로테인 및 알부민을 비제한적으로 포함하는, 전구세포에 특징적인 고분자를 합성할 수 있다. 바람직하기로는 알파-페토프로테인은 엑손l(aFP)에 의해 코드된 펩티드 서열을 포함한다. 따라서 알파-페토프로테인은 2 Kb를 상회하는 mRNA인 전장 aFP mRNA로부터 전사된다. 마찬가지로 알부민은 바람직하기로는 exon1(ALB)에 의해 코드된 펩티드 서열을 포함한다. 따라서 알부민은 전장의 mRNA로부터 전사된다.

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또 다른 실시예에서, 본 발명은 인간 간 유래의 전구세포의 분리, 동결보존 및 사용 방법에 있어서, 인간 간장에서 발견되는 1개 또는 그 이상의 세포 계통의 전구세포 및 비전구세포를 함유하는 실질적으로 단일 세포현탁액을 제공하기 위해 인간 간 조직을 처리하는 단계; 적어도 1개의 세포 계통과 관여된 1개 또는 그 이상의 마커를 발현하는 전구세포가 농축된 데벌킹된 현탁액을 제공하기 위하여 현탁액을 현탁액의 비전구세포의 수를 실질적으로 감소시키는 데벌킹 단계에 거는 단계; 선택적으로는 데벌킹된 현탁액으로부터 세포 그 자체, 그의 자손세포, 또는 그보다 성숙된 형태가 적어도 1개의 간세포 계통과 관련된 적어도 1개의 마커를 발현하도록 세포를 선택하는 단계; 선택적으로는 동결보존에 최적 조건하에서 세포를 현탁하는 단계; 및 선택적으로 증식 인자의 생산 및 환자의 치료법을 위한 이용하는 단계를 함유하는 방법에 관한다. 바람직하기로는 알파-페토프로테인 등의 혈장 단백질을 발현하는 간 전구세포를 선택한다. 본 발명의 처리 또는 데벌킹 단계는 바람직하기로는 세포를 부유 밀도 및/또는 크기가 1개 또는 복수의 구배 분획에 관련하여 세포를 그의 부유밀도 및/또는 크기에 따라 분리하기 위한 간장 세포 현탁액의 밀도 구배 원심 또는 원심분리 또는 원심 현탁분리를 포함한다. 이 밀도 구배법은 구역 원심분리(zonal centrifugation) 및 연속 유동 원심분리를 포함할 수 있다.

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본 발명의 하나의 실시예는 코넥신 등의 성숙 간세포와 관련된 마커, 글리코포린 A 및 CD45 등의 조혈 세포와 관련된 마커 및/또는 레티노이드, 폰 윌레브란트 팩터(von Willebrand Factor)등의 성숙 간엽 세포와 관련된 마커를 사용하여 성숙 간세포, 조혈 및 간엽 세포를 포함한 비전구세포의 음성 선택이다.

본 발명자는 간 전구세포의 사용에 의해 성숙 간장 세포의 사용이 수반하는 결점의 다수를 극복할 수 있으며, 이들이 세포 요법 및 유전자 요법에서의 사용 및 인공 장기로의 사용에 이상적인 세포임을 발견하였다. 본 세포는 소형이기 때문에 (7∼15㎛), 큰 색전의 형성을 최소화한다. 또한, 상기 세포는 높은 증식능을 가지며, 이는 환자의 간 조직의 재구성에 필요한 세포가 작아 좋음을 의미한다. 더욱이, 전구세포는 면역 거부를 유발할 우려가 있는 항원성 마커를 극히 조금만 가지고 있을 뿐만 아니라, 필요한 면역억제제가 거의 필요 없거나 또는 아예 필요 없는 것으로 생각된다. 간장 세포에 의한 치료법에는 체외 치료나 간장 세포의 이식을 포함한다. 세포, 바람직하기로는 전구세포를 함유하는 것은 비경구적 또는 복강내를 포함한 각종 방법 중 임의의 것에 의해 공급된다. 세포의 유효량은 바람직하기로는 10³~10¹⁰세포가 필요하다. 더욱 바람직하기로는 10⁵∼10⁸세포가, 최적으로는 약 10⁶ 세포를 이식한다.

본 발명의 다른 실시예에서 간장 전구세포는 증식 인자 및 다른 단백질 생산에 매우 유용하다. 이들 인자는 그들 자신의 증식 또는 간장의 다른 전구세포(예를 들면 조혈 또는 간엽 전구세포)의 증식과 관련이 있고, 간 전구세포의 특정 계통로의 특화의 초기 단계와 관련이 있다. 이들 신규 증식 인자는 간질환을 치료하고, 간 전구세포의 형질전환체인 암을 억제하는데 이용될 수 있다. 또한, 간 전구세포는 삽입된 유전적으로 형질전환을 일으킨, 또는 정상의 간 전구세포가 이와 같은 전구세포가 이식된 개체의 건강을 증진시키도록 유전자 요법을 위한 주요 표적이다.

본 발명의 다른 관점은 세포내에 알파-페토프로테인의 발현과 상관있는 세포 표면의 특유 항원 프로파일의 결정이다. 알파-페토프로테인을 함유하는 세포의 특징은 이와 같이 하여 명백히 함으로서, 그 후에 간장 전체 또는 간엽으로 조제된 살아있는 단일의 세포 현탁액으로부터 플로우 사이토메트리법(flow cytometric methodology)으로 생성된 간 전구세포를 농축하는 것이 가능하다. 더욱이 상술한 바와 같이 인간 간 전구세포의 분리 및 동정은 본 발명자가 본 발명의 특유의 세포 집단을 얻기 위해 처음으로 사용한 특유의 방법, 마커 및 파라미터의 조합의 적용을 통해 이루어졌다.

본 발명의 또 다른 관점은 간장, 조혈 세포 또는 간엽 유래의 간세포 전구세포를 제공한다. 이들 세포 계통, 그들의 자손세포 또는 그들의 더욱 성숙된 형태는 CD14, CD34, CD38, CD45, CDl17, ICAM, 글리코포린 A로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 마커 및/또는 알파-페토프로테인 유사 면역반응, 알부민 유사 면역반응 또는 양쪽 등의 혈장 마커에 의해 선택된다. 알파-페토프로테인은 총 전장의 mRNA(2 Kb를 넘으며, 이 형은 간 전구세포에서 통상 발현된다) 또는 변이형(2 Kb 미만, 즉, 약 0.5, 0.8, 1, 1.5 또는 2 Kb이며, 이 형은 조혈 전구세포에서 통상 발현된다)으로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 간장 전구세포는 태아, 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인의 간장으로부터 분리될 수가 있다.

본 발명의 또 다른 관점에 따라 분리된 사람 간장 전구세포는 실질적으로 순수한 형태로 고도로 농축되어 분리된다. 이러한 간장 전구세포에는 간 전구세포, 조혈세포 및 간엽 전구세포가 포함된다. 간 전구세포는 간세포, 담즙관 세포 또는 이들의 조합으로 발달하는 능력을 가지고 있으며, 조혈 전구세포는 마크로파아지, 호중구, 과립구, 림프구, 혈소판, 호산구, 호염기구 또는 이들의 조합으로 발달하는 능력을 가지고 있다. 간엽 전구세포는 내피 세포, 스트로마 세포, 간장 성상 세포(Ito 세포), 연골 세포, 골세포 또는 이들의 조합으로 발달하는 능력을 가졌다. 본 발명의 방법은 알파-페토프로테인 유사 면역반응, CD45, 알부민 유사 면역반응, CD34, 오스테오폰틴, 뼈 시알로단백질, 콜라겐(타입 Ⅰ형, Ⅱ형, Ⅲ형 또는 Ⅳ형) 또는 이들의 조합을 발현하는 간엽 전구세포를 선택하는 데 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 관점은 외인성 핵산을 함유하는 간 전구세포를 제공한다. 이러한 외인성 핵산은 적어도 1개의 대상으로 되는 폴리펩티드를 코드하거나 적어도 1개의 대상으로 되는 폴리펩티드의 발현을 촉진할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에 따라, 분리된 장 전구세포의 유효량을 부정적 결과로 고생하는 개체에 투여함으로써 1개 또는 그 이상의 인간 장해 또는 기능부전의 부정적 결과를 경감시키는 방법을 제공한다. 전구세포는 복강내에 또는 혈관을 통해 비경구적으로 투여할 수 있으며, 또한 간장 내에 직접 투여할 수도 있다. 직접 투여는 문맥, 장간막정맥, 간동맥, 간 담즙관 또는 이들의 조합을 통해 외과적으로 행하여도 좋다. 또한, 간 전구세포는 비장 또는 복막과 같은 개체의 이소성(異所性) 부위에 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 경감될 수 있는 인간의 장해 또는 기능부전에는 간담관염, 간연화증, 간거대증, 간경변, 섬유증, 간염, 급성 간부전, 만성 간부전 또는 선천성 대사이상 및 간세포암(hepatocarcinoma) 또는 간아세포종(hepatoblastoma) 등의 간장암이 포함된다. 이러한 간장의 암은 암의 원발부위에서도 좋고, 간장에 전이한 것이어도 좋다. 전이성 종양은 장, 전립선, 유방, 신장, 췌장, 피부, 뇌, 폐 또는 그의 조합을 포함한 임의의 수의 원발부위에 유래하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점에 따라, 인간 간장으로부터 분리된 전구세포, 그의 자손세포, 그의 성숙성 또는 분화된 자손 또는 그의 조합을 포함하는 생체 물질을 포함하는 바이오리액터; 및 기초 배양액 등의 배양액; 생체 물질을 수용하는 1개 또는 그 이상의 구획 또는 생체 물질을 함유하는 구획; 및 선택적으로 1개 또는 복수의 접속 포트(port)가 제공된다. 또한 바이오리액터는 선택적으로 세포외 기질, 호르몬, 증식인자, 영양소, 이들의 조합; 및 혈청, 혈장 또는 림프액 등의 체액을 포함할 수 있다.

바이오리액터는 상기 전구세포를 살아있는 기능적 상태로 유지하기 위해 적합화되고, 간 전구세포를 1주일에서 약 55주까지의 범위의 기간에 걸쳐 유지할 수 있다. 특히, 본 바이오리액터는 생산물의 제조, 독성 시험, 또는 시토크롬 P450의 활성 또는 기타 종류의 약물 대사활성에 관한 시험을 포함한 대사 시험을 목적으로 하는 인공 간장으로서의 사용을 위해 적합화된다.

본 발명의 또 다른 관점에 따라, 분리된 인간 간장 전구세포의 조성물 또는 인간 간장으로부터 얻어진 전구세포가 농축된 현탁액이 제공된다. 세포 현탁액은 의학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에 어떤 형태로 제공되며, 치료를 필요로 하는 피험자에게 투여된다. 본 발명의 조성물은 인간 간장에서 발견되는 1개 또는 복수의 세포 계통의 적어도 1개에 관련한 1개 또는 복수개의 마커를 나타내는 간 장 전구세포를 포함하며, 성숙 세포를 실질적으로 포함하지 않는다. 보다 상세히는, 분리된 간장 전구세포는 CD14, CD34, CD38, CD90 또는 CD117, CD45, 글리코포린 A 등의 적어도 1개 또는 복수의 항원 마커 및 알파-페토프로테인형 면역 반응성, 알부민형 면역 반응성 또는 양쪽 모두의 혈장의 마커를 발현하는 간세포, 조혈세포 또는 간엽 세포 계통 및 그 자체, 그 자손세포 또는 그의 전구세포의 더욱 성숙된 형을 포함하는 1개 또는 복수의 간장 세포 계통에서 유래한다. 또 다른 실시예에서, 미성숙 세포, 그의 자손세포 또는 더욱 성숙된 형은 오스테오폰틴, 골 시알로단백질, 콜라겐Ⅰ, 콜라겐Ⅲ, 콜라겐Ⅳ 또는 이들의 조합을 발현한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 인간 간에서 분리된 전구세포, 그의 자손세포, 그의 성숙 형태 또는 분화 자손, 또는 그의 조합을 포함하는 간 전구세포의 세포 배양시스템을 제공한다.

세포 배양 시스템은 부가적으로 1개 또는 복수의 콜라겐, 1개 또는 복수의 접착 단백질(라미닌, 피브로넥틴) 및 기타 성분 프로테오글리칸(예를 들면, 헤파란 황산프로테오글리칸)을 함유하는 세포외 기질(matrix); 또는 각각의 기질 성분을 포함한다. 이 기질 성분은 기질 성분 단편, 세포외 기질 클래스 중 1개의 클래스로부터의 1개 또는 복구의 인자로 코팅된 합성성 및 생물분해성 재료(즉, 마이크로스페어)로 될 수 있는 기질 모방물(matrix mimetics)이 포함된다. 세포 배양 시스템은 기본 배양액 또는 강화 배지 및 기타 영양소, 호르몬, 증식 인자를 함유할 수 있고, 선택적으로 혈청, 혈장, 림프액 등의 체액를 포함할 수 있다. 또한 세포 배양 시스템은 배양 접시, 플레이트, 플라스크, 롤러 바틀, 트랜스 웰 또는 기타 이러한 용기와 같은 생체 물질을 수용하는 1개 또는 복수의 구획을 가질 수 있다.

본 발명의 배양 또는 바이오리액터는 제 Ⅰ상 또는 제 Ⅱ상 생체내 변화 효소 시스템의 활성에 관한 시험을 포함하는 1개 또는 복수의 대사 시험, 간 시누소이드(sinusoidal) 및 모세 담즙관(canalicular) 수송 시스템의 발현, 조절 및 활성, 약물 대사의 양상 및 시토크롬 P450의 활성에 관한 연구를 포함하는 1개 또는 복수의 수송시험에 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 부착 세포의 동결 보존의 방법이 제공된다. 부착 세포의 동결본존 방법은 (a) 부착 세포 및 기질 또는 점도 증강제를 제공하는 것; (b) 배양액, 빙정 방지제, 당질 조절 인자, 철 공여체, 리포단백질 및 리피드를 함유하는 동결보존 혼합액중에 세포를 현탁하는 단계; 및 (c) 현탁액을 세포의 응고점 이하로 냉각하는 단계를 포함한다. 여기서 응고점이란 세포가 과냉된 액체 또는 유리, 미세 결정 또는 거대 결정괴 등의 고형괴로 되는 온도를 의미한다. 또한, 배양액, 빙정 방지제, 당질 조절 인자, 철 공여체, 리포단백질 및 리피드를 함유하는 동결보존 혼합액도 개시한다. 동결보존 혼합액에 아스코르브산, 글리세롤(10％ v/v) 또는 디메틸술폭시드(DMSO, 10％ v/v)(후자의 2개의 약제는 빙정 형성의 방지제로 작용한다) 등의 항산화제를 포함할 수 있다. 당질 조절인자는 인슐린 또는 인슐린형 증식인자 일 수 있다. 철 공여체, 리포단백질 및 리피드는 각각 트랜스페린, 고밀도 리포단백질 및 유리 지방산일 수 있다. 유리지방산은 선택적으로 알부민과 복합체를 형성한다. 동결보존 혼합액은 콜라겐, 콜라겐형 물질, 아가로즈, 메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴을 함유할 수 있으며, 콜라겐은 콜라겐Ⅰ, 콜라겐Ⅲ 또는 콜라겐Ⅵ일 것이다. 동결보존 혼합액의 성분은 Viapan 또는 위스콘신 대학의 동결보존 용액으로 조제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는 동결 보존된 복수의 간 전구세포 및/또는 그의 자손세포를 가지고 있는 수집물, 세포 뱅크, 카탈로그 또는 생물 표본 저장소에 있다. 상기 전구세포는 상술한 방법에 의해 분리되며, 전장 알파-페토프로테인, 알부민 또는 양자를 발현하는 간 전구세포를 제공하는 어떠한 허용되는 방법에 의해 분리된 간 전구세포일 수 있다. 동일하게, 상기 전구세포는 전장 알파-페토프로테인, 알부민 또는 양자의 발현을 지시하는 마커를 발현할 수 있다. 상기 저장소는 세포 마커의 지표 부착의 시스템을 포함할 수 있다. 해동함으로서 저장소의 세포를 세포 배양의 개시를 위해 바이오리액터에 접종하는 것 또는 환자의 치료를 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는 하기에서 정의하는 엑손1을 결실한 유전자 또는 mRNA의 유전자 산물인 알파-페토프로테인 변이형을 포함한다. 본 발명에 개시한 바와 같이, 변이형 알파-페토프로테인은 종종 조혈 전구세포 및 그의 자손세포에 수반하여 보여지며, 간 전구세포에는 부수하지 않는다. 본 발명의 또 다른 실시예는 알파-페토프로테인 엑손1에 의해 코드되는 배열로부터 얻어진 3∼10 아미노산 펩티드를 포함한다.

본 발명의 다른 실시예는 알파-페토프로테인 엑손1에 의해 코드된 배열에 유래하는 3∼10 아미노산을 포함하고, 항원으로서의 사용에 적합한 펩티드와의 결합물을 포함한다. 고분자는 알부민, 헤모시아닌, 카세인, 난백 알부민, 폴리리신(예를 들면 폴리-L-리신 또는 폴리-D-리신) 및 당해 기술분야에 알려진 임의의 다른 적절한 고분자일 수 있다. 항원은 그의 발현이 간 전구세포의 지표이며, 조혈 전구세포나 그들의 자손세포는 지표는 아닌 알파-페토프로테인에 대하여 특이적인 항체를 생성하는 데 이용된다. 항체는 어쥬번트의 부재 또는 존재하에서 동물에게 항원을 접종함으로써 또는 당해 분야에 알려진 바와 같이, 비장 세포를 항원에 폭로한 후에, 비장세포의 융합에 의해 하이브리도마를 형성시킴으로서 생산될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서 인간 간장에서 전구세포를 분리하는 방법이 개시되며, 사람 간장에서 발견되는 1개 또는 복수의 세포 계통의 전구세포 및 비전구세포를 함유하는 실질적으로 단일세포 현탁액을 제공하기 위해 인간 간장 조직을 처리하는 것; 세포 계통의 적어도 1개에 관련된 1개 또는 복수의 마커를 발현하는 전구세포의 농축된 데벌킹된 현탁액을 제공하기 위하여 현탁액을 현탁액 중의 비전구세포의 수를 실질적으로 감소시키는 데벌킹 단계에 거는 것; 및 데벌킹이 끝난 현탁액으로부터 세포 자체, 그들의 자손세포, 또는 그들의 보다 성숙된 형이 적어도 1개의 세포 계통에 관련된 1개 이상의 마커를 발현하는 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법이 개시된다.

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도 1은 알파-페토프로테인 mRNA의 PCR 분석을 나타낸 것이다.

도 2는 알부민 mRNA의 PCR 분석을 나타낸 것이다.

도 3은 태아 간세포의 생존성에 대한 동결 보존의 영향을 나타낸 것이다.

도 4의 좌측 패널은 FACS에 의한 알파-페토프로테인 면역형광의 히스토그램을 나타내고, 우측 패널은 FACS에 의한 알부민 면역형광의 히스토그램을 나타낸 것이다.

도 5는 미분획 간세포 현탁액에서의 표면 마커 CD14, CD34, CD38, CD45 및 글리코포린 A(GA)를 발현하는 세포의 비율을 나타낸 것이다.

도 6은 태아 간세포에 의한 세포 표면 마커 및 알파-페토프로테인의 공동발현을 나타낸다.

도 7의 위 왼쪽은 알파-페토프로테인 양성 세포의 비율을 나타내고, 위 오른쪽은 알부민 양성 세포의 비율을 나타내고, 아래는 알파-페토프로테인 및 알부민의 공동발현에 대한 퍼콜(Percoll) 분획을 나타낸 것이다.

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도 8은 CD14, CD38 및 알파-페토프로테인의 공동발현에 관한 태아 간세포 현탁액의 FACS 분석을 나타낸 것이다.

도 9는 CD14 및/또는 CD38에 의한 선택을 이용한 알파-페토프로테인-양성 세포의 수율을 나타낸 것이다.

도 10은 알파-페토프로테인에 관하여 염색된 태아 간 전구세포의 대표적인 면역 형광 사진을 나타낸다.

도 11은 CD14용 선택 효과(우); 미분 간섭 콘트라스트(상) 및 면역형광 사진(하)을 나타낸 것이다.

도 12A는 위상차 현미경에 의한 간세포의 클라스터(cluster)를 나타낸 것이다.

도 12B는 알파-페토프로테인 항체를 이용한 면역형광법에 의한 간세포의 클라스터이다.

도 12C는 A 및 B를 중첩한 것이다.

도 13A는 칼세인(Calcein)으로 염색한 간세포이다.

도 13B는 패널 A와 동일한 것으로, 알파-페토프로테인으로 염색한 간세포이다.

[바람직한 실시예를 위한 상세한 설명]

I. 정의

후술에서 수많은 용어가 본 발명을 설명하기 위하여 널리 사용될 것이다. 이와 같은 용어에 대해 부여되는 범위를 포함하는 명세서 및 청구범위를 명백하고, 일관성 있게 이해할 수 있도록 다음에 용어의 정의를 설명한다.

알파-페토프로테인형 면역반응(alpha-fetoprotein-like immunoactivity): 알파-페토프로테인에 의해 기인하는 면역반응. 알파-페토프로테인은 알파-페토프로테인의 이성체 및 스플라이스 변이체를 포함한 전장 또는 절단형으로 될 수 있다.

단분화 전구세포(Committed progenitors): 간세포 단분화 전구세포(간세포를 생기게 한다), 또는 담즙관 단분화 전구세포(담즙관을 생기게 한다)와 같은 단일의 운명(single fate)을 갖는 미성숙 세포. 단분화 과정은 분자 레벨로는 이해되지 않는다. 오히려, 이것은 세포의 운명이 선조의 세포의 운명으로부터 좁아진 경우에 한하여 경험적으로 일어나는 것으로 인식되고 있다.

간세포(Hepatic cells): 간세포와 담즙관 세포를 포함하는 간장 세포의 아집단(subpopulation)

간장 세포(Liver cells): 여기서 사용되는 "간장 세포"란 그의 기원 또는 운명에 관계없이, 정상인 간장에 존재하는 세포의 모든 종류를 말한다.

줄기 세포(Stem cells): 여기서 사용되는 "줄기 세포"란 하나 이상의 운명을 갖는 딸세포(daughter cell)를 생기게 하는 미성숙 세포를 의미하며, 이들은 다능성(pluripotent)을 갖는다. 배아 줄기 세포(ES cells) 또는 포유동물 배아의 8세포기까지의 배아 세포와 같은 전능성(totipotent) 줄기 세포는 줄기 세포가 그 자체와 동일한 딸세포를 생산하는 자기 재생(self-renewal) [자기 유지(self-maintaining)]능을 갖는다. 이에 반해, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 피부 줄기세포 또는 간장 줄기 세포와 같은 규정된 줄기세포는 다능성을 가지며, 충분한 증식능을 가지나, 자기 재생능을 의심스럽다. 전능 줄기 세포의 경우에, 몇 개의 딸세포는 부모와 동일하고, 그 중에는 부모보다 낮은 유전능으로 되도록 유전능을 제한하는 특정의 운명(복수)으로 되도록 "분화하는" 것도 있다. 규정된 줄기 세포의 경우 어떤 딸세포는 다능성을 유지하고, 어떤 것은 잃어 단일, 특정 운명으로 결정된 세포도 있다.

간 전구세포(Hepatic progenitors): 이들 세포는 줄기세포 및 담즙관 세포를 생성시킨다. 이 간 전구세포는 3개의 아집단, 즉, "간 줄기 세포", "단분화 줄기세포 전구세포" 및 "단분화 담즙관 전구세포"이며, 마지막 2개는 간 줄기 세포의 후손이며, 단일 운명을 갖는, 즉, 간세포 또는 담즙관 세포의 어느 하나로 되거나, 양쪽으로 되지 않는 미성숙 세포이다.

간 줄기 세포(Hepatic stem cells): 간 전구세포의 아집단.

간장 전구세포(Liver progenitors): 간 전구세포, 조혈 전구세포 및 간엽(mesenchymal) 전구세포를 포함하는 간장의 세포 집단.

조혈(Hemopoiesis): 임프구(B 및 T), 혈소판, 마크로파아지, 호중구(neutrophils) 및 과립구로 되는 세포 운명을 갖는 혈구를 생성하는 것.

간엽 형성(Mesengenesis): 내피세포, 지방 세포, 스트로마 세포(stromal cell), 연골세포, 및 뼈로 되는 세포 운명을 갖는 간엽 유래 세포를 생성하는 것 (마지막 2개는 간장에서 질병 상태에서 일어난다)

세포 치료(Cell Therapy): 여기서 사용되는 "세포 치료"란 조직 중에 자가 또는 유전적으로 다른 동종간의 물질로서 사용되는 한정된 세포 집단의 인비보 또는 엑스 비보 이행을 말하며, 환자의 특이적 표적 세포에 이식 또는 그의 주변에 이식한다. 세포는 적당한 배지, 담체, 희석제, 또는 미소 담체, 비드, 마이크로좀, 마이크로스피어, 소수포(vesicles) 등을 포함한 약제 수송 시스템의 어느 타입으로 이식될 수 있다.

유전자 치료(Gene Therapy): 여기서 사용되는 "유전자 치료"란 일정 유전자 물질을 환자의 특이적 표적 세포에 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo) 비보 이행시킴으로서, 유전자형(genotype)을 변형시키고, 또한, 대부분의 경우, 특정 질환상태의 예방 및 변형시키는 궁극적인 목적을 위하여 이들 표적 세포의 표현형을 변형시키는 것을 의미한다. 이것은 표적 세포를 생체외(ex vivo)에서 개변하여 환자에게 이 세포를 도입하는 것을 포함한다. 또는 외인성 유전자 재료를 수송하여 전구세포를 트랜스펙션하기 위하여 벡터를 생체외에서 간장의 전구세포에 타겟팅한다. 더욱이, 유전자 개변한 전구세포는 환자의 치료로서 또는 생물 생산원으로서 바이오리엑터 중에서 사용될 수 있다. 정의하는 바와 같이, 기초로 되는 전제는 이들 치료적 유전자 기법은 명백한 또는 불명한 병적 상태를 최종적으로 예방, 치료 또는 변화시키도록 디자인되는 것이다. 거의 모든 상황에 있어서, 유전자 치료 기법의 최종적인 목적은 특이적 표적 세포 집단의 표현형을 변형시키는 것이다.

CD: 여기서 사용되는 "분화 클라스터(cluster of differentiation)" 또는 "공동 결정인자(common determinant)"는 모노클로날 항체에 의해 인식되는 세포 표면 분자를 의미한다. 어떤 CDs의 발현은 특정의 세포계통 또는 성숙 경로의 세포에 특이적이나, 그 이외의 발현은 동일 세포의 활성화 상태, 위치 또는 분화 상태에 따라 변화한다.

발명의 상세한 설명중, "1개(one)", "하나(a)", 또는 "하나(an)"가 사용될 때, 이들은 특히 명기하지 않는 한, "적어도 하나", 또는 "1개 또는 그 이상"을 나타낸다.

II. 간 혈통용 진단 마커로서 알파-페토프로테인 및 알부민

어느 것도 세포질 단백질인 알파-페토프로테인(AFP) 및 알부민은 간세포 계통의 특히 신뢰할 수 있는 마커이다. 이들 단백질의 발현은 간장의 다른 세포 타입으로부터 간장 아집단을 동정하기 위한 기초이다.

인간 백혈병 세포주(cell line) 및 인 비트로 자극 후의 정상 T 림프구도 AFP를 발현할 수 있다. 그러나, 이 데이터는 백혈병 세포주 및 활성화된 T 림프구의 AFP mRNA가 간 세포중의 AFP mRNA와 동일 형태인지를 말하는 것은 아니다. RT-PCR은 특정 RNA 템플레이트를 동정하는 경우의 공지의 가장 감도가 좋은 방법이기 때문에, AFP 또는 알부민 mRNA's의 발현이 면역형광, 웨스턴 블롯 등과 같은 통상의 단백 분석에 의해 측정할 수 있는지의 여부를 결정해야 한다.

여기에 기재된 연구 전에, 인간 조혈세포의 AFP 또는 알부민 mRNA's의 형을 상세히 조사한 연구자는 없었다. 본 발명은 조혈세포의 AFP 및 알부민의 변이형의 발현을 증명하였다.

도 1은 알파-페토프로테인 mRNA의 몇 개의 exon에 대한 프라이머를 사용한 폴리메라제 연쇄반응(PCR)에 의한 간장 및 비장 이외의 세포의 분석을 나타낸다. PCR 분석에 의해, 조혈세포에 절단형 AFP가 존재하는 것이 판명된다. hAFP1, hAFP2, hAFP3 및 hAFP4의 프라이머 조합을 사용하는 RT-PCT를 수행하였다. M=분자량 마커, 레인 1-3=Hep3B; 레인 10-12=STO 섬유아세포; 레인 13-15=no RNA. 레인 2, 4 및 8에는 분리밴드, 절단형 AFP 이소폼(isoform)이 존재한다. 레인 1 및 4에서 관찰되는 간장의 세포에 독자의 변종 AFP 이소폼이 있다. 레인 3 및 6에서는 완전 AFP종이 관찰된다. 본 발명자는 실시예 1에서 예시된 바와 같이, hAFP mRNA의 변이형의 특징을 조사하기 위하여 9개의 PCR 프라이머를 디자인하였다. AFP의 코드 배열은 엑손 1에서 엑손 14까지 신장된다. AFP mRNA의 엑손 1에 대한 프라이머 이외의 프라이머 조합은 모두 인간 적백혈병 세포주 K562의 AFP mRNA 부분을 증폭시키나, 모든 조합은 인간 간세포주 HepG2 및 Hep3B중 AFP mRNA를 검출한다. 이는 AFP mRNA의 변이형이 K562중 발현되는 바와 같이, 엑손 2에서 엑손 14까지 포함하나, AFP의 모든 코드 배열을 커버하는 것은 아닌 것을 증명하고 있다. 이 결과는 간세포를 동정하는데 유일의 유용한 프라이머는 그의 발현이 증명 가능하게 조직 특이적으로 제한되는 AFP의 엑손 1의 부위를 검출하는 프라이머인 것을 시사하고 있다. 엑손 1은 간 전구세포 아집단에 독자적 이라는 사실에 의해 이것은 조혈 전구세포 타입에 대하여 간 전구세포를 동정하기 위한 프로우브로서 사용될 수 있다.

삭제

AFP 절단형은 조혈세포의 몇 개가의 아집단 중에서 발견되기 때문에, 간세포 및 조혈세포 쌍방에서 알부민도 분석한다. 알부민에 대한 프라이머를 (전술한) AFP용 프라이머에 유사하도록 맏늘어 이를 이용하여 간세포주 대 조혈세포주에서의 알부민 발현을 평가한다. AFP에 관하여, 절단형은 조혈세포주인 K562로 관찰되며, 전사물은 엑손 12∼14에 대한 프라이머에 의해 검출된다.

본 발명은 간세포 집단 대 조혈세포 집단에서의 AFP와 알부민 mRNA의 변이형의 발현 패턴을 결정하기 위하여 RT-PCR의 특이적 프라이머의 디자인 및 조제를 개시한다. 본 명세서에서 개시된 본 발명은 AFP 및 알부민 mRNA 쌍방의 변이형을 조혈 전구세포중에서 발견될 수 있음을 증명하고 있다. 이는 그와 같은 감도가 좋은 앗세이가 이용하는 경우, 조혈세포 집단으로부터 간장세포 집단을 정의하기 위하여는 AFP에 대한 엑손 1 프로우브를 이용하는 것과 같은 추가 기준을 사용하지 않으면 아니되는 것을 의미한다.

도 2는 알부민의 몇 개의 엑손에 대한 PCR에 의한 간장 및 간장 이외의 세포의 분석을 나타낸다. AFP mRNA의 절단형은 조혈세포의 몇 개의 아집단으로 관찰되는 것이므로, 알부민도 간세포 및 조혈 세포의 쌍방에서 분석된다. 알부민에 대한 프라이머는 AFP에 대한 프라이머(상기 참조)에 유사하도록 만들고, 이를 이용하여 간세포주 대 조혈세포주의 알부민 발현을 평가한다. AFP에 관하여 절단형은 조혈세포주인 K562로 관찰되며, 전사물은 엑손 12∼14에 대한 프라이머에 의해 검출된다.

간장의 발달 연구로부터 태아 간장은 자궁내 발육 시에 간장 및 조혈 장기의 양자인 것이 증명되어 있다. 간장 발달의 각 단계에 있어서, 태아 간장은 다량의 조혈세포, 특히 적혈구 세포계통을 포함한다. 더욱이, 간장 형성 및 조혈 시스템은 밀접하게 상호 관련되어 있고, 이런 상관관계는 AFP와 알부민 또는 이런 단백질의 이소 타입의 합동 발현이 포함될 가능성이 있다는 것은 점점 인식되고 있다. AFP의 엑손 1이 간 전구세포 아집단에 대해 독자인 사실로부터 본 발명의 간장 전구세포의 특이적 아집단을 동정할 수 있게 한다.

PCR 분석에 의해 조혈 전구세포는 AFP 및 알부민 mRNA종의 쌍방을 발현될 수 있는 것이 판명되나, mRNA 발현 수준은 매우 낮다. 실제로, AFP와 알부민을 플로우 사이토메트리 분석(flow cytometric analysis)에 의해 측정하면, 검출 가능한 AFP 또는 알부민은 K562에서 검출되지 않는다. AFP 및 알부민의 어는 것도 간세포의 동정에서의 중요한 가이드이나, AFP는 그것이 간 전구세포에서 강하게 발현되기 때문에 플로우 사이토메트리에 의한 정제 후에 간 전구세포를 특히 진단한다. 또한, AFP는 여하한 종류의 분획방법을 행한 후에도, 간 전구세포의 순도를 추정하는데에도 이용될 수 있다.

III. 인간 간 전구세포의 프로세싱

본 발명자들은 태아 또는 성인 간장으로부터 해리한 인간 간장 전구세포를 최적으로 생성하는 방법을 확립했다. 성숙 간세포의 분리는 통상, 조직을 단세포 현탁액으로 효소적 및 기계적으로 해리한 후에 밀도 구배 원심분리, 원심 현탁분리, 시차 효소 소화 프로토콜(differential enzymatic digestion protocols, 즉, 간성 세포) 및/또는 세포 배양을 이용한 선택에 의한 분획을 포함한다(reviewed in Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique" 1983, Alan R Liss, Inc. NY). 밀도 구배 원심분리는 모든 분획을 버리고, 최종적으로 침강물만을 유지함으로서 세포 파편 및 사멸세포로 생각되는 것을 제거하기 위하여 대부분의 연구자에 의해 일반적으로 이용하고 있다.

한편, 모든 다른 연구자들은 밀도 구배 분획의 최종적인 침강물을 이용하나, 본 명세서에 개시된 프로토콜은 밀도구배의 상층 분획을 이용하여 침강물을 제외하는 것에 있어서 독자이다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 밀도구배 원심분리의 신규 변법은 침강물을 버리고, 보다 낮은 밀도를 갖는 세포(예, 구배의 상부 또는 상부 부근에서 채취하는 세포)를 보유하는 점이다. 본 발명자는 보다 어린(즉, 2배체) 동결보존에 더 견디는 세포는 침강물보다 오히려 퍼콜(Percoll) 밀도 구배의 상부 또는 구배 내에 존재하는 것을 발견하였다.

IV 데벌킹 (debulking)

데벌킹은 간장 전구세포의 농축 프로세스이다. 전구세포는 간, 조혈 및 간엽세포 계통을 포함하는 몇 개의 세포 계통의 어느 것이어도 좋다. 간장은 4배체 또는 다배체일 수 있는 다양한 성숙 세포를 갖기 때문에, 전구세포의 농축된 집단을 조제하기 위하는 이중 일부 또는 전부의 성숙 세포를 제거하는 것이 유용하다. 데벌킹은 4℃에서 수행하는 것이 유리하지만 필수적인 것은 아니다.

간장 세포의 단일세포 현탁액을 조제한 후, 세포 크기, 부유밀도 또는 이들 양자의 조합에 따라 세포를 다수의 분획으로 분리한다. 본 발명에 의하면, 간장의 전구세포는 직경이 15 마이크론 미만이다. 배양배지에서의 침강속도(기초배지 또는 영향이 풍부한 배지), 특히, 구배 침강, 보다 큰 구멍 사이즈의 분리 비드를 사용하는 크로마토그래피를 포함하고, 그와 같은 작은 세포를 보다 큰 세포로부터, 그리하여 세포 파편으로부터 분리하는 분리방법도 적합하다. 구배재료는 폴리비닐피롤리돈-피복 실리카(Percoll), 크로스 링크된 자당(Ficoll), 덱스트란 또는 당업자에 공지된 여하한 재료도 될 수 있고, 세포용해를 방지하기 위하여 등장으로 되도록, 예를 들면, 인산염 완충 생리식염액 또는 이글스 기본 배지(BME)로 조제된다. 해리된 세포의 현탁액은 전형적으로 구배재료 층의 상부에 적용되며, 4℃에서 유지하면서, 원심분리한다. 또는, 세포 현탁액을 혈액성분의 분리에 이용되도록 한, 즉, 플라스마페레시스(plasmapheresis)와 같은 아페레시스 유닛(apheresis unit)에 적용시켜도 좋다. 성숙 실질세포(parenchymal cell) 및 4배체 세포를 함유하는 거대세포는 작은 전구세포 및 2배체 세포보다 빨리 침강하여 제거된다. 원심 프로토콜의 디자인은 낮은 산소 압에 대한 세포의 감수성을 고려하여 세포농축에 요하는 시간을 최소한으로 한다. 세포 현탁액은 이들 방법에 의해 간 전구세포를 농축할 수 있다. 더욱이, 데벌킹 단계는 윈심 현탁분리, 세포표면 접착 단백질에 기초한 패닝(panning), 친화 크로마토그래피 또는 뱃치 프로세스, 형광 표지에 의한 접착, 존(zone) 원심분리, 연속 유동 원심, 마그네틱 비드 등의 인큐베이트한 후 마그네트 소팅(sorting), 예를 들면 항체와 복합체를 형성한 마그네틱 비드, 또는 이들 방법의 조합을 포함한다. 밀도구배 원심분리는 불연속 구배 또는 연속 구배일 수 있다. 퍼콜(Percoll) 분획은 즉시 사용하는 경우, 동결보존, 배양의 확립 또는 다시 농축하는데 적합하다. 더욱이 농축은 선별, 친화성 선택, FACS 소팅 또는 당분야에 공지된 상기의 여하한 기술에 의해 행할 수 있다. 음성 선택은 CD45, 글리코포린 A에 관한 마커, 또는 후술하는 바와 같은 다른 마커를 발현하는 세포를 제거함으로서 행한다. 양성 선택은 CD14, CD34, CD38, ICAM 또는 전장 알파-페토프로테인, 알부민 또는 쌍방의 발현을 나타내는 마커를 발현하는 세포를 선택함으로서 행할 수 있다.

데벌킹의 다른 구체예로서, 비-전구세포는 선택적 용해에 의해 선택적으로 제거될 수 있다. 적혈구는 세포현탁액을 염화암모늄의 등장액에 짧게 폭로시킨 후, 배양배지로 희석하고, 적혈구 "고스트(GHOSTS)" 및 유리 헤모글로빈을 제거하기 위하여 원심분리하여 용해시킨다. 동일하게, 비-전구세포는 후술하는 동결 보존 혼합액을 사용하여 동결함으로써 선택적으로, 그리고 가수분해적으로 용해된다. 데벌킹의 여러 방법은 다배체 세포, 성숙 조혈세포와 관련된 마커를 발현시키는 세포, 성숙 간세포와 관련된 마커를 발현시키는 세포, 성숙 간엽세포와 관련된 마커를 발현시키는 세포 및 이들 세포의 조합을 제거한다.

V. 인간 간 전구세포 및 그의 자손(progeny)의 동결보존

본 발명의 동결 보존 방법론은 선행 기술에서 사용되고 있는 방법과는 전혀 상이하다. 가장 큰 차이는 상이한 완충액을 사용하는 것, 밀도가 낮아 구배원심에서 부유성인 간 전구세포 집단의 동결 보존을 사용하는 것이다. 간 전구세포는 사이즈가 작고 이배체다.

성숙 인간 간장세포의 동결보존의 성공이 심히 요망되어 왔으나, 당해 기술분야에서 지금까지 이루어지지 못하였다. 일반적으로 동결보존의 성공은 세포를 액체 질소온도(-160∼-180℃)에서 동결하고, 이들을 해동하는 경우에 75％ 이상 생존이 관찰되는 것, 그리하여 배양 디쉬에 접착능을 갖는 것으로 정의된다. 옛날 법을 사용하여 설치류나 인간 유래의 성숙 간세포를 동일한 조건에서 동결 후의 생존율은 30∼40％이며, 접착능을 갖지 않는다(예, Toledo-Pdreya, et al., 미국특허제 4,242,883호; Fahy et al, 미국특허제 5,217,860호; Mullon et al., 미국특허제 5,795,711호; Fahy et al., 미국특허제 5,472,876호 참조). 이들 특허의 개시에서는 세포의 생존율이 매우 나쁘고(＜50％), 주로 세포배양을 다루고(세포 현탁액중 각각의 세포가 아님), 동결 전에 완충액에 세포를 지속적으로 폭로시킬 필요가 있다.

도 3은 본 발명 방법에 따라 저온 보존한 간장세포의 우수한 생존율을 나타낸다. 데이터는 처리시간 대 해동시간에서 측정된 생존율의 변화를 백분율로 나타낸 것이다. 이들 데이터는 동결 보존이 세포의 생존율에 유의한 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 이들 데이터는 550일 저장에서 생존율에 유의한 변화는 없었다. 본 발명의 특수한 동결 보존 방법은 신규 완충액, 신규 세포집단, 및 선택적으로 세포를 세포외 매트릭스 형의 세포의 임베딩의 사용을 포함한다. 이 방법론에 의해 최초로 세포 분산 직후에 동결 전에 측정된 생존율과 다르지 않은 융해시 생존율이 비로소 달성한다. 실제 생존율은 도착시의 조직의 상태 및 효소 및 기계적 해리를 이용한 세포 현탁액 조제의 영향에 따라 변화하며, 본 연구에서는 태아 간장 세포의 생존율은 평균 77％이었다. 이 동결보존 방법에 의해, 동결 프로세스에 의한 생존율의 유의한 상실은 일어나지 않고, 융해후의 생체 밖(ex vivo)에서 접착 및 증식할 수 있는 세포의 유의한 상실은 일어나지 않았다.

VI 인간 간 전구세포의 면역선택(Immunoselection)

본 발명은 인간 간장 조직의 실질적인 단일 세포 현탁액을 제공하는 단계, 이 현탁액에 양성 또는 음성 면역선택을 하는 단계를 포함하는 인간 간장으로부터 전구세포를 분리하는 방법을 제공한다. 면역선택 방법은 그 자체, 그들의 자손세포 또는 더욱 성숙된 형이 세포 계통의 적어도 하나에 관련한 적어도 하나의 마커를 발현하는 그 들의 세포를 현탁액으로부터 선택하는 단계를 포함한다. 이들 세포 계통은 조혈세포, 간엽세포, 간세포 또는 이들 세포 계통의 몇 갠가의 조합일 수 있다. 세포 선택단계는 글리코포린 A, CD45, 성인 간장 세포 특이적 마커, 코넥신 32(connexin 32), 또는 이들의 조합을 발현하는 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 더욱이, 선택방법은 다배체 세포, 성숙 조혈세포에 관련한 마커를 발현하는 세포, 성숙 간세포에 관련된 마커를 발현하는 세포, 성숙 간엽세포에 관련된 마커를 발현하는 세포 또는 이들의 조합을 제거하는 단계를 포함한다. 세포의 선택은 CD14, CD34, CD38, ICAM 또는 이들 조합을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 더욱이, 이 방법은 글리코포린 A, CD45, 또는 이들의 조합을 발현하는 성숙 조혈세포를 동정하여 선택할 수 있다. 더욱이, 이 선택방법은 레티노이드류, 폰 윌브란트 인자(von Willebrand Factor), 제 Ⅷ 인자, 또는 그의 조합을 발현하는 성숙 간엽 세포를 선택할 수 있다.

면역선택방법은 세포 사이즈, 부유 밀도 또는 이들의 조합에 의해 데벌킹과 조합하여 수행할 수 있다. 이 선택방법은 조혈세포, 간세포 또는 간엽세포일 수 있는 적어도 하나의 세포 계통과 관련한 적어도 하나의 마커를 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 세포의 선택, 그들의 자손 또는 더 성숙된 형의 선택은 적어도 하나의 세포 계통과 관련한 적어도 하나의 마커를 발현할 수 있다. 이 계통은 실질세포(parenchymal cell) 또는 간세포 또는 담즙관 세포일 수 있다. 이와 같이, 세포에 의해 발현된 마커는 CD14, CD34, CD38, CD117, ICAM 또는 그의 조합일 수 있다.

VI. 세포 마커 및 플로우 사이토메트리

알파-페토프로테인을 발현하는 알부민의 발현을 수반하는 또는 수반하지 않는 미성숙 세포 집단으로서 각각의 현재의 간 전구세포의 정의를 사용하여, 우리는 면역선택방법을 사용하여 이들 세포에 관한 특이성을 선택하는 마커를 평가하였다. 놀라운 발견은 조혈 전구세포용 고전적인 마커인 마커(즉, CD34)의 많은 것이 간 전구세포 아집단을 동일하게 동정하는 것이다. 이와 같이, CD34의 단색 소팅에 의하여, AFP를 발현하는 세포의 유의한 농축(적어도 9배)이 얻어진다. 그러나, 이들 AFP-양성 세포의 모두가 반듯이 간 전구세포인 것으로 확인되는 것은 아니다. 알부민 양성인 비율에 기초로 하여 세포의 80∼90％가 간 전구세포일 것, 나머지는 너무 미성숙하여 알부민을 발현할 수 없는 간 전구세포이거나, 또는 알파-페토프로테인을 발현하는 조혈 아집단의 어느 하나인 것을 추정된다.

본 발명은 독자의 플로우 사이토메트리 소팅방법을 사용한다. 간 전구세포에 관하여 독자적으로 2개의 특징으로서 AFP와 알부민 발현의 조합을 이용하여, 우리는 간 전구세포를 정의하는 항원성 마커와 다른 플로우 사이토메트리 파라미터를 동정하였다. 현재까지의 소팅 방법은 대한 소팅전략은 2배체인(Hoechst dye 33342로 형광하여 사용), 측방 산란에 의해 무과립인 특정의 조혈세포 항원에 관하여 음성인(즉, 글리코포린 A, 적혈구 세포 항원 및 CD45) 작은 세포(전방 산란 측청에 의해 ＜15μ)의 소팅을 행한 후, 간세포 아집단 및 조혈세포 아집단 사이에 공유된 양성 마커(즉, CD14 및/또는 CD38)에 관한 소팅을 포함한다.

여기서 기술된 실험에서, 본 발명자는 알파-페토프로테인을 강하게 발현하고, 알부민을 약하게 발현하며, CD14, CD34, CD38 CD117 또는 이들의 조합을 발현하는 세포를 소팅하여 간 전구세포를 동정한다. 또한, 조혈세포도 마찬가지로, 절단형임에도 불구하고, AFP를 발현하는 증거를 본 명세서에 기재한다. 본 발명의 특정의 세포 집단의 분리, 동정 및 배양의 성공은 진화된 분리방법, 친화성 데벌킹, 고속 형광-활성화 세포 소팅, 보다 빠른 속도와 정확성 및 개변된 동결보존 및 배양기술에 의해 부분적으로 달성된다.

출원인은 신선하게 분리된 세포 현탁액 및/또는 융해된 동결보존 간장세포로부터 간 전구세포를 정제하기 위한 플로우 사이토메트리 소팅 전략 및 방법을 나타낸다. 이 방법은 1) 세포를 특이적 세포표면 마커에 대한 몇 개의 형광프로우브 표지 항체에 의해 염색하고, 2) 멀티파라메타 플로우 사이토메트리 기술에 있어서, 양성 및 음성 소팅 방법의 조합을 이용하는 것을 포함한다. 인간 간세포 집단으로부터 특정 계통기의 정제법은 마커가 세포계통의 위치 특이적인 것으로 생각되기 때문에 어떤 연령 도너(donor)로부터의 간장에 대해서도 사용할 수 있다.

세포를 표지하는 개선된 방법과, 과거에 이용된 플로우 사이토메터(1초에 2000∼6000개를 소팅하고, 2∼4색의 소팅을 행하는 Becton Dickenson's FACSTAR PLUS)와 비교하여 극적으로 개선된 플로우 사이토메터(1초에 40,000개의 비율로 세포를 소팅하고, 8색의 소팅을 행하는 사이토메이션사의 "a MoFlo" 플로우 사이토메터)는, 이 신규 세포 집단의 분리 및 동정의 성공에 역할을 하였다.

도 4는 1가(유니베라이언트) FACS 소팅을 나타낸다. 세포 현탁액을 적색염료, Cy5에 결합된 항체를 사용하는 알파-페토프로테인(AFP) 및 청색 염료(AMCA)에 결합된 항체를 사용하는 알부민의 면역형광분석을 위해 조제하였다. 세포 30,000개를 적색(AFP) 및 청색(알부민) 형광에 관하여 스크리닝했다. 그 결과는 각각의 단백질에 대한 양성 세포의 명백한 군을 나타낸다. 더욱이 분석에 의해 각각의 단백질에 대한 양성집단의 약 80％가 동일 세포(즉, 2종 단백의 동시 발현)임을 나타낸다. AFP 및 알부민형 면역 반응성의 발현은 세포 현탁액에 있어서, 잘 정의되며, 명확한 군의 세포가 백그라운드의 시그널과 명확한 차이를 나타낸다. 알파-페토프로테인은 미분획 세포 현탁액중 세포의 6.9±0.86％로 발현되고, 알부민은 7.7±1.1％로 존재한다. AFP 양성 세포중, 75.6±4.9％는 알부민과 함께 발현되고, 또한 알부민 양성 세포의 80±5.5％가 AFP를 발현시킨다. 이와 같이, 알파-페토프로테인을 발현하는 세포의 약 25％가 알부민을 발현하지 않고, 알부민을 발현하는 세포의 약 20％가 알파-페토프로테인을 발현하지 않는다.

본 연구에 있어서, 사용된 주된 표면 마커를 가진 세포의 비율은 표 2중 완전한 세포 현탁액(예, 적혈구 포함)에 대해 나타낸다(GA=글리코포린 A, 적혈세포상 표면 마커).

표 2: 당초 간장 세포 현탁액중의 CD 양성 세포의 비율과 AFP에 양성인 이들의 비율

도 5는 미분획 간장 세포 현탁액중 표면 마커들 CD14, CD34, CD38, CD45 및 글리코포린 A(GA)을 발현하는 세포의 비율을 나타낸다. GA 데이터는 우측 축에 동일 스케일로 플롯트하였다. 도 6은 알파-페토프로테인 및 다른 항원성 마커를 발현하는 당초 세포 현탁액 중 세포의 비율을 나타낸다. 알파-페토프로테인(AFP) 및 특정 세포 표면 마커(CE14, 34, 38, 및 글리코포린 A)에 양성인 세포의 비율에 대한 평균치±SEM. 글리코포린 A(GA) 양성 세포(즉, 적혈구)는 세포 덩어리의 주 성분을 나타내나, AFP-양성 세포에서는 유의하지 않은 분획을 나타낸다.

도 7(상부)은 알파-페토프로테인 및 알부민의 동시 발현을 나타낸다. 퍼콜 분획을 이용하여 적혈구의 선택적 고갈을 행한, 또는 행하지 않은 태아 간장 세포의 현탁액중, 알파-페토프로테인(좌측 패널) 및 알부민(우측 패널)의 발현. 알부민을 동시 발현하는 AFP 양성 세포의 비율도 80.5±8.2％로 증가하고, 또한 AFP를 동시에 발현하는 알부민-양성 세포의 비율은 89±3.1％로 증가하였으나, 어느 변화도 통계학적으로 유의하지 않았다.

도 7(하부)은 알파-페토프로테인과 알부민 동시 발현에 미치는 퍼콜 분획에 의한 데벌킹 효과를 나타낸다. 알파-페토프로테인 및 알부민 쌍방을 발현하는 세포의 비율은 AFP 또는 알부민 양성 세포의 비율로 나타낸다. 적혈구 고갈한 세포 및 고갈하지 않은 세포에 관한 데이터를 퍼콜 분획을 사용하여 나타냈다. 이와 같이 세포 현탁액이 퍼콜 분획에 의해 적혈구를 고갈하면, AFP를 발현하는 세포의 비율은 12.9±1.9로 유의하게 증가하였고, 알부민을 발현하는 세포의 비율을 12.1±2.3％로 증가한다.

표면 마커를 가진 세포의 비율에 관한 이 기법의 결과를, AFP 양성 염색을 나타내는 각각의 서브그룹의 비율과 함께 표 3에 나타낸다.

표 3: 적혈구의 고갈 후의 간장 세포 현탁액중의 CD 양성 세포의 비율과 AFP에 양성인 이들의 비율

도 8은 CD14, CD38 및 AFP를 동시에 발현하는 태아 간장 세포 현탁액의 FACS 분석을 나타낸다. 2변수 스캐터그램(bivariate scattergram)은 CD14에 관한 TriColor 염색(세로좌표) 대 CD38에 대한 FITC 염색(가로좌표)의 분포를 나타낸다. CD14 및 CD38의 시그널에 따라 특이적 세포 그룹을 선택하기 위하여 게이트를 만들었다. 다음에 이들을 이용하여 이들 서브 그룹의 각각의 AFP 염색의 강도를 나타낸다. AFP 결과는 CD38 또는 CD14의 어느 하나에 관한 양성 세포를 선택함으로서 AFP가 높은 수준의 농축이 얻어짐을 나타낸다. 세포 현탁액 전체(세포 30,000개)로부터 생성된 AFP 시그널을 좌하측에 나타낸다. 대부분의 경우, 세포 표면 마커에 의해 선택된 서브그룹중의 AFP의 존재는 연속적으로 분포하여 있으며, 명백하게 많은 세포가 양성 범위에서 염색 강도를 나타내고 있다. 그러나, AFP의 동시 발현에 대한 CD38 양성 세포의 분포는 특유하다. CD38-양성 세포에서, AFP 동시 발현의 2상성(bimodal) 분포가 명백하며, 여기서 세포의 2개의 명확한 군이 명백히 존재하며, 하나의 군은 AFP에 양성이고, 다른 하나는 음성이다.

이 결과는 알파-페토프로테인(AFP)이 태아 간장 조직(즉, 당초 세포 현탁액)의 단세포 현탁액 중 세포의 7％로 존재하고 있음을 나타낸다. 글리코포린 A에 대한 항체(적혈구상의 항원)에 대한 항체는 AFP를 발현하지 않는 세포의 아집단을 동정하는 것이 판명된다. 이와 같이, 이 항원(즉, 적혈구)을 발현하는 세포는 간 전구세포를 특징을 부여할 의도로 세포로부터 제거된다. CD38 항원은 AFP 양성 세포의 비율의 유의한 증강을 나타내는 세포의 집단을 동정한다(즉, 미분획 샘플 비율의 약 7배보다 크다). 어느 항원도, 스플라이싱 변종에 의해 코드되는 분자의 부분이 존재 여부에 따라 수많은 이소폼을 나타낸다. 각종 이소폼을 동정하는 데 항체를 이용할 수 있다.

조혈 전구세포에 관한 고전적 마커인 CD34는 AFP를 동일하게 발현하는 많은 세포에 존재하는 것이 판명된다. CD34에 양성 세포를 소팅한 결과, AFP 양성세포는 당초 세포 현탁액에서 발견되는 것보다 약 9배 농축된다(CD34-양성세포에서 67％ 대 당초 세포 현탁액에서 7％). 그러나, AFP 양성 세포의 농축에 관한 가장 유효한 단일 항체는 CD14이며, 이는 당초 집단에 비해 이들 세포의 비율을 11배 증가시킨다(81％ 대 7％).

AFP 양성 세포의 수율은 표면 마커의 조합을 이용함으로서 개선할 수 있다 고 생각된다. 이와 같이, 표면 마커의 선택이 증가할 수 있는 정도를 확립하도록 결정된다. 데이터는 표면 마커를 발현하는 AFP 양성 세포의 비율로서(AFP 양성 세포의 "수율"이라 부른다), 그리고 표면 마커에 의해 정의된 집단에서 출현하는 모든 AFP 양성 세포의 비율(AFP 양성 세포에 관하여 "농축"인자라 부른다)로 표기한다. CD14, CD34 및 CD38의 조합에 관한 결과를, 비교를 위하여 각각의 마커로부터 얻은 결과와 함께 표 4에 나타낸다.

표 4:

농축. AFP 양성인 표면 마커의 어느 하나 또는 양자를 발현하는 세포의 비율

수율. 표면 마커 조합의 하나 또는 양자를 발현하는 AFP 양성 세포의 비율

도 9는 CD14 및 CD38에 관한 선택이 어떻게 하여 AFP 양성 세포를 농축하는지를 나타낸다. 태아 간장으로부터 조제된 세포 현택액중의 AFP-양성 세포의 비율은 마커 CD38 및 CD14를 표지하는 양성 표면 표지를 갖는 세포를 선택함으로서 급격히 증가한다. 2개의 마커를 조합하면 어느 하나의 마커 단독의 경우에 얻어진 세포보다 AFP-함유 세포의 보다 유의하게 농축을 일으킨다.

도 10은 인간 간 전구세포의 형광 현미경을 나타낸다. 태아 간장으로부터 대표적인 간 전구세포를 AFP 함량에 관하여 염색했다. 세포 크기는 초기 전구세포와 보다 진행된 간 전구세포의 쌍방이 존재함을 나타내고 있다. AFP에 관하여 양성 염색 세포의 형태는 다양하며, 태아 간으로부터의 세포 현탁액에서는 모든 범위의 세포의 크기 및 형상을 포함하나, 성인 간장에서는 그렇지 않다. AFP-양성 세포의 가장 큰 것은 약 12-15μ이며, 이것은 성숙 간세포보다 훨씬 작다(20-50μ의 범위).

도 11은 AFP의 발현에 의해 선택되는 대표적 세포를 나타낸다. CD14 염색 양성 세포(우측)는 간아구(hepatoblast)의 특징이다. 표면 마커의 염색 음성의 세포는 보다 작고, 초기 간 전구세포의 크기 및 형태와 일치한다. 모든 경우, AFP 양성 세포의 특정 비율은 본 연구에서 사용된 어느 표면항체에 발현도 나타내지 않는다. 이것은 AFP-양성 "null" 세포의 출현을 도 11에 나타내며, 이들은 동일 현탁액에서 소팅한 CD14양성/AFP 양성 세포의 출현과 비교될 수 있다. 쌍방의 세포 타입이 AFP에 양성인 것, 표면항원 염색 음성의 세포는 CD14양성세포보다 일관되게 작고 복잡하지 않은 것이 명백하다.

그리하여 간 전구세포를 소팅하기 위해 고려되는 마커는 글리코포린 A^-, CD45^-, ICAM⁺ 및 1 또는 그 이상의 CD14⁺, CD34, CD38⁺, CD117, 2배체, 무과립(측방 산란에 의함), 15μ이하(전방 산란에 의함)이다. 이들 소팅 세포의 표현형은 세포질이 작고(높은 핵/세포질 비), 알부민⁺ 및/또는 AFP⁺⁺⁺인 작은 세포(＜15μ)이다.

VII. 태아 및 성인 인간 간장에서 알파-페토프로테인을 발현하는 세포의 공초점에 의한 특징부여

알파-페토프로테인을 발현하는 인간 태아 및 성인 세포로부터 이미지(image)를 얻기 위하여 공초점 현미경을 사용하였다. 이 방법에 의해, 이들 세포의 형태 및 크기를 관찰할 수 있고, AFP 및 ALB와 같은 세포내 단백의 위치 및 CD34 및 CD38과 같은 막 표면 마커의 위치를 직접 나타낼 수 있다.

도 12는 알파-페토프로테인을 발현하는 세포 즉, 성인 간장중의 간 전구세포의 공초점 현미경 사진을 나타낸다. 도는 하나의 시야의 3개의 상을 나타내고, 이 시야에는 AFP-양성 세포 2개가 있음을 나타낸다. 패널(A)와 패널(B)의 중첩한 것을 패널(C)에 나타내고, 이것은 간장 세포의 군의 AFP 양성 세포(오리지널 핑크색)의 형태를 나타낸다.

도 13은 모든 세포 타입을 나타내는 칼세인(A)으로 표지된 세포를 나타낸다. 도 13(B)는 AFP를 동시에 발현하는 동일 세포로 이루어져 있으며, AFP-양성인 것은 2개 세포에 불과하다. 세포사이즈는 AFP 양성의 요인은 아니다.

AFP-발현 세포는 태아 및 성인 간장의 쌍방에서 관찰된다. 예상하는 바와 같이, 태아 간장은 최고의 비율(6∼7％)을 갖는 반면, 성인 간장은 낮은 비율(＜1％)을 가지며, 이 수치는 공여자의 연령에 따라 감소한다. 성인 간장에서 발견되는 몇 개의 간 전구세포는 퍼콜 분획 프로세스에 의해 성인 간장으로부터 퍼콜 분획 1 및 2에서 세포의 2％까지 생기도록 유의하게 농축할 수 있다(표 5). AFP-발현 세포는 71세 이상의 공여자의 간장으로부터 관찰되지 않는다.

표 5는 성인 간장의 퍼콜 분리 분획으로 세포 사이즈와 생존율을 나타낸다. 더 작은 세포(분획 1∼3)는 동일한 동결보존 조건에서 동결 보존한 후, 보다 큰 세포(분획 4)보다 생존율이 높다.

이들 결과는 장기 이식 뿐만 아니라, 간장 세포 치료에 유용한 공여자 장기가 젊은 공여자(연령 약 45세까지)로부터의 세포로 구성된 것을 시사한다. 더욱이 노인 환자(연령＞65세)로부터의 간장은, 그것이 간 전구세포부터의 재생능이 부적절하고, 또한 성숙 세포로부터 얻어지는 것으로 알려지고 있는 중간 또는 최소 재생능에 지나지 않으므로, 세포 치료에 부적당하며, 거의 장기 전체의 이식에서도, 특히 어린이에 대해서는 부적당한 공여자일 것이다.

VIII. 성숙 세포 계통(Maturational Lineage)

그러므로 성인 간장은 정상 및 질환 상태의 쌍방에 있어서 간세포 및 담즙관 세포로 분화 및 증식할 수 있는 간 전구세포 집단을 포함한다. 본 발명은 간장 계통중의 모든 위치가 명확한 성숙 단계인 것, 그리고 간장에 다수의 줄기 세포 집단이 존재한다는 입장을 취한다.

놀랍게도 본 발명의 배아 간장은 3개의 독립된 성숙 계통에 관하여 전구세포를 생성한다: 세포의 운명이 간세포 및 담즙관 세포인 간 형성; 임프구(B 및 T), 혈소판, 마크로파아지, 호중구 및 과립구인 조혈; 및 세포의 운명이 내피 세포, 지방 세포, 스트로마 세포, 연골 및 뼈인(최후의 2개는 질환 상태에 한하여 간장에서 일어남) 간엽 형성.

일반적으로 줄기 세포는 하나 보다 많은 운명의 딸세포를 일으키는 미성숙 세포이다. 줄기 세포는 딸세포를 생산하고, 그의 몇 개는 부모와 동일하고, 어떤 것은 특정의 운명으로 "분화하는" 세포도 있다. 단분화 프로세스는 분자 레벨에서는 이해될 수 없다. 오히려, 세포의 운명이 선조의 운명보다 좁을 때에 한하여 경험적으로 일어난다. "단분화 전구세포"는 간세포 분화 전구세포(간세포 발생) 또는 담즙관 분화 전구세포(담즙관 생성)와 같은 단일 운명을 갖는 미성숙 세포로 정의된다.

줄기 세포로부터 성인 세포로의 이행은 세포 크기, 형태, 증식능 및 유전자 발현이 세포 계통에 구속되는 단계적 프로세스로 일어난다. 노화의 은유는 이 프로세스의 정의에 있어서 유용하다. "젊은" 세포는 초기 세포 발현을 가지며, 최대의 증식능을 가지며; 세포 계통중 후기의 세포는 "후기" 유전자 발현을 가지며, 통상 이들의 증식은 한정되거나 전혀 증식하지 않는다. 후기 세포는 "노화하고 있는"으로 보여질 수 있으며, 또는 생물학적 용어로 "아팝토틱(apoptotic)"이며, 최종적으로 탈락한다. 성숙 세포 계통 프로세스에 의해 조직의 자연의 대사회전이 일어나고, 손상후의 재생이 가능하다. 조직은 성숙 프로세스의 속도론이 상이하다. 소화관의 성숙 세포 계통은 전 사이클이 1주일 미만에 일어나며, 매우 빠르나, 간장의 미성숙 세포 계통은 천천히 일어나며, 랫트 간장에서는 약 1년이 걸린다.

랫트 간장은 약 10일째의 배아 생명으로 형성되며, 이것을 "10일 배아" 또는 E10으로 불리고, 배아의 중장 영역에 존재하는 내배엽에 의한 심장 간엽의 함입이 일어난다(Zaret, K. 1998, Current Opinion in Genetics ＆ Development. 8:526-31). 태아에 있어서, 간장 세포가 가장 초기에 인식되는 것은 알파-페토프로테인(AFP)을 코드하는 mRNA용 관한 인 시투 하이브리다이제이션 시험을 이용하여 행하여진다(Zaret, K. 1998, Current Opinion in Genetics ＆ Development. 8:526-31; Zaret, K. 1999, Developmental Biology(Orlando). 209:1-10). AFP-발현 세포는 측정된 모든 랫트 및 마우스 간장에서 9∼10일째에 심장이 생성되는 간엽근처에서 배아의 중장영역에서 관찰된다. 이 간장은 E12까지 육안으로 볼 수 있도록 되며, E13일까지에 직경 약 1 mm로 된다.

이와 평행하여 조혈은 E15∼E16(설치류) 및 3개월∼4개월(인간)까지에 최초의 동정 가능한 조혈 세포가 출현하여 일어나고, 적혈구 형성(적혈구의 형성)의 피크는 E18(설치류), 5개월∼6개월(인간)에서 나타난다. 적혈구 생성 피크에서 이들 적혈구의 수는 간장에서 다수를 점하고, 간장에서 세포의 수의 70％이상으로 맣이 점한다. 임신 기간의 종료는 설치류에서는 21일이고, 인간은 9개월이다. 출산후 수시간 이내에 조혈 세포의 수는 급격히 감소하여 생후 2일(설치류), 1, 2주 이내(인간)에 조혈 세포의 대다수가 골수로 이동하여 소실된다. 조혈 세포의 이동의 원인은 모른다. 그러나, 가장 유력한 2개의 추측이 있다.

첫째, 조혈 전구세포는 비교적 혐기성 조건을 선호하여 폐의 활성화에 의해 간장에서의 산소 레벨이 상승하면 골수(비교적 혐기성이다)로 도망간다; 둘째는 임신 호르몬의 손실이 이동의 원인이다. 생후, 조혈 전구세포의 간장에서의 손실은 간 전구세포의 수를 급격히 감소시키는 것과 관련하고, 이것에 평행하여 간세포 및 담즙관 세포의 수 및 성숙도가 증가한다. 간장의 완전한 성숙은 생후 2∼3주간(설치류) 및 수개월(인간) 이내에 종료한다. 그에 의해 남아있는 간 전구세포는 각각 간장 소엽의 말초에서의 문맥 3분지(portal triad)의 영역으로 이동한다.

그런 다음, 간장 소엽의 고전적 구조가 확립되며, 간장 소염은 문맥 3분지의 6개의 주위로 경계가 정하여지고, 각각이 담즙관, 간동맥 및 간장 정맥을 가지며, 중심부에 대정맥에 연결된 중심정맥을 갖는다. 간세포의 플레이트는 차바퀴의 스포크와 같이 주변부로부터 중심으로 연장된다. 관례에 의해 이 플레이튼 3개의 존으로 나뉘고, 존 1은 문맥 3분지 근방이고; 존 2는 미드아시날(midacinal)이고; 존 3은 중심 정맥 근방이다. 간장의 2배체 세포는 존 1에 존재하고; 4배체 세포는 존 2에 존재하고; 4배체, 8배체 및 다핵 세포는 존 3에 있다. 이 패턴은 아팝토틱 프로세스에서 끝나는 성숙 계통을 시사한다(Sigal, S. H., S. et al. 1995. Differentiation. 59:35-42).

IX. 간장 생물학의 전임상 및 임상시험에서의 세포 계통 개념의 의미

본 발명의 세포 집단의 in vivo 및 in vitro 증식 및 분화 특징은 간장에서 세포계통 위치, 세포계통 모델의 개념 및 의미와 일치한다. 예를 들면, in vitro 실질배양에서 실질 세포의 분열능 및 세포 분열수는 엄밀히 세포 계통-위치 의존적인 것으로 예상된다. 그러므로 문맥주변(peripotal)의 실질 세포는 중심주변의 세포보다 큰 분열능을 가져야 한다. 이것은 생체중 가장 유명한 재생 조직인 간장의 초대 배양이 배양에서 그와 같이 한정된 세포 분열을 나타내는 이유에 관한 장기간의 미스터리를 설명하는 것이다.

줄기 세포 및 그의 형질 전환한 세포인 간암은 알파-페토프로테인 및 인슐린류 증식 인자 Ⅱ와 같은 초기 유전자를 발현하나, 세포 계통의 후기에 발현하는 유전자를 발현하지 않는 것으로 예상된다. 성숙 계통 모델에서, 세포 계통이 완전히 진행하기 위하여는 분화, 증식 및 세포 주기의 조절이 방해받지 않는 것이 필요하기 때문에, 간암을 후기 유전자를 발현하지 않아야 한다. 이것은 실제로 본 발명의 세포 집단에서 관찰되었다. 태아 대 성인 조직에서 간장-특이적 유전자 발현을 비교하는 분자 생물학적 연구에 의하여 몇 개의 클래스의 유전자가 정의된다: 구획(줄기 세포, 증폭, 분화)을 진단하는 유전자; 띠상으로 구획 경계를 넘어 발현되는 유전자; 및 세포 계통의 초기, 중기, 또는 후기에 발현되나, 세포에 의해 각각 발현되는 유전자.

원발성 간 종양의 각종 형태학적 및 유전자 발현 패턴은 본 발명의 세포 집단을 연구함으로서 이해될 가능성이 있다. 만일 종양이 분화능이 다른 형질전환 줄기 세포의 증식을 나타내는 경우, 간암에서의 알파-페토프로테인의 일반적 발현은 유도 종양 마커는 아니고, 통상 알파-페토프로테인을 발현하는 증식된 미성숙 세포 집단의 지표이다.

본 발명의 분리된 세포 집단은 간장 지향 세포 및/또는 유전자 치료의 성공에 큰 영향을 미친다. 본 발명은 실시예에 기술한 바와 같이, 사람 이외의 영장류 및 인간 간 전구세포가 성공적으로 동결 보존되는 중요한 조건을 동정한다.

in vitro에서의 유의한 증식능을 위해 본 발명의 세포 집단은 조혈 계통의 세포와 동일하게 ex vivo 증식을 위해 세포의 종자를 제공하는 "펀치 생검 재료(punch biopsy material)"로서 사용될 수 있다. 이에 의해 환자의 간장의 주된 침습성 외과적 절제술의 필요성이 없게 될 것이다.

인간 간 전구세포가 배양에서 확립된 후, 유전자 이입을 행한다. 이것은 수많은 상이한 유전자 수송 벡터 시스템에 의해 행하여 질 수 있다. 이 점에서 중요한 검토는 성공적인 유전자 이입의 성공은 신속하게 증식하는 배지를 필요로 하는 점이며, 본 발명의 인간 간 전구세포가 통상의 생리적 조건에서 유의하게 분열하기 때문에 간장에 유전자 이입의 이상적인 후보인 점이다. 동일하게, 본 발명의 세포 집단의 증식 특징에 의해 유효한 유전자 삽입 및 발현을 위한 세포 증식을 필요로 하는 특정의 유전자 수송 벡터(즉, retroviral vector)를 사용하는 ex vivo 유전자 이입에서의 사용이 가능하게 된다.

유전자 치료의 또 다른 접근은 전구세포를 특이적으로 표적으로 하는 벡터를 디자인하고, 이것을 관계하는 유전자와 조합하여 벡터에 주입하고, 환자에게 직접 주입하는 것이다. 이 벡터는 내인성 전구 세포 집단을 표적으로 하여 이를 개변한다.

본 발명의 전구세포 집단은 자가 이식 또는 유전적으로 다른 동종간 간장 지향 세포 또는 유전자 치료에 이용될 수 있다. 자가 이식 간 전구세포를 이용함으로써 이식 세포의 거부에 관한 중요한 고민을 제거할 수 있다. 본 발명의 세포 집단은 항원성 프로파일로부터 면역 거부 현상을 최소인 것을 시사하므로 유전적으로 다른 동종간 세포 이식에 특히 매력적이다. 더욱이, 면역원성이 높은 것으로 알려진 혈구, 내피 세포, 쿠퍼 세포(Kupffer cells)와 같은 다른 세포 엘레멘트가 정제 프로세스시에 실질적으로 제거될 수 있다.

자가 이식 또는 다른 동종간 이식 간 전구세포가 분리, 정제 및 배양한 후, 이들은 유전적으로 개변되거나, 또는 손상없이 그대로 유지될 수 있고, in vitro에서 증식되어 그의 숙주에 이식할 수 있다. 유전적 개변이 요구되면, 유전적 개변후 이식전에, 우위를 점하는 선택 마커의 조합 및 발현에 기초로 하여 유전자 개변 세포를 장식 및/또는 선택하여도 좋다. 이식은 간장의 구획, 또는 이소(ectopic) 또는 이소성(heterotopic) 부위로 돌아갈 수 있다. 간장 부위에 이식하기 위해서는 문맥 주입 또는 비장내 주입을 이용할 수 있다. 비장내 주입은 비장내 주사에 의해 이식된 간 전구세포가 간장의 구획에 이동하기 때문에 선택되는 투여경로인지도 모른다.

추가적 의학적 기법은 이식된 간 전구세포의 간 정착 효율에 역할을 할 가능성이 있다. 동물 모델은 부분적 간장 절제에서 혈관 신생인자 및 다른 증식 인자의 투여는 이식된 간세포의 정착 및 생존을 촉진하는 것을 증명하였다. 다른 접근법은 유전자 개변된 간세포를 이소 부위에 이식하는 것이다.

현재, 간장에 대한 세포 치료 접근은 거의 유효성이 없다. 이것은 이용된 공여자의 세포가 주로 성인 간장 세포이고, 분리 및 재주입후에 단명인 사실에 의한 가능성이 있다. 또한 성인 세포를 사용하면 강한 면역학적 거부를 일으킨다. 본 발명의 간 전구세포는 이들이 면역학적 거부 현상의 유발능이 한정되는 것, 그리고, 충분한 재생능을 갖기 때문에 큰 유효성을 제공한다.

유전자 치료에 관해 현재의 노력은 개발중의 가장 일반적인 임상 치료 경로인 "목표 주입 가능한 벡터"를 이용하는 것이다. 이들 접근은 면역학적 문제와 벡터의 일과성 발현의 쌍방 때문에 유효성이 제한된다. 잇점이 있는 것으로 증명된 유전자 치료의 경로는 ex vivo 유전자 치료이며, 조혈 전구 세포에 한하여 행하여지고 있다. 우리는 전구세포의 정제된 아집단에 벡터를 ex vivo로 도입할 수 있고, 개변된 세포를 in vivo에서 선택하여 재도입될 수 있기 때문에 전구세포에 의한 ex vivo 유전자 치료(또는 이들 전구세포 집단에 표적된 주사 가능한 벡터의 사용)는 보다 유효한 것으로 증명되는 것으로 예상된다. 전구세포의 잇점은 그의 광대한 증식능, 면역 응답의 유도는 있어도 최소인 것, 그리고 완전한 성숙 세포 계통을 생성할 수 있도록 분화할 수 있는 것이다.

X. 공통 또는 상호 의존하는 세포계통

개선된 방법론에 의해 본 발명자는 보다 엄밀하게 간 전구세포를 조사하여 특징을 조사할 수 있다. 이 시험에 의해 간 전구세포와 조혈 전구세포 사이의 밀접한 관계가 명백하게 되고, 이들 2개의 세포계통의 밀접한 관계를 시사하고 있다. 실제로 이들 시험은 간세포 및 조혈세포 계통의 전구세포가 다수의 항원 마커(CD14, CD34, CD38, CD117 또는 ckit, 달걀 세포 항원) 및 생화학 성질(즉, 트랜스페린, 글루타치온-S-트랜스페라제 및 알파-페토프로테인의 절단 이소폼)을 공유하고 ex vivo 증식을 위한 배양 요건(세포외 메트릭스형 및 특이적 호르몬 요건)이 널리 중첩되고 있음을 보여준다. 쌍방의 세포계통의 전구세포는 간 소엽 안에 같은 부위에 존재한다. 최후로 췌장 시그널 전달은 2개의 성숙 세포 계통의 세포 전체에 존재한다. 즉, 세포계통의 각각에 의해 생성된 시그널은 다른 계통의 세포를 조절한다. 실제로 간세포 및 조혈 세포 사이에 공통하는 세포계통 또는 적어도 상호 의존하는 계통이 존재할 가능성이 있다고 결론하여도 좋다.

본 명세서에 기재된 세포 집단은 세포가 분리 및 배양되는 조건에 따라 골수 조혈 세포 또는 간 유도체의 어느 하나를 생성할 수 있도록 정제되고 이용된다. 따라서 간 전구세포 및 조혈 전구세포의 쌍방을 정의하는 일련의 항원(예, CD38⁺, ckit⁺, CD45⁺)에 관하여 소팅한 세포 집단을 접종한 바이오리액터 시스템은 다수의 운명을 가지는 세포 집단으로 될 수 있다. 그 운명은 세포가 in vivo에서 어떻게 재도입되는가, 또는 어떠한 배양조건에 세포가 놓여지는가에 의존한다.
본 발명의 세포 집단의 중요한 다른 관점은 이들이 특이적 조혈 줄기세포 표면항원 CD34를 나타내는 점이다. 골수의 CD34 양성 세포는 조혈 줄기 세포에 관한 간편한 양성 선택 마커로 이용되어 왔다. 그러나 조혈 줄기 세포에 대한 CD34 항원 마커의 특이성에 의심하는 수많은 보고가 있었다(Nakauchi H. Nature Medicine 4: 1009-1010(1998)). 실험적 증거에 의해, 사람 골수 및 제대혈의 CD34 음성 집단에 있어서, 면역 결핍 마우스의 골수를 재정착할 수 있는 세포가 존재하는 것이 증명되어 있다.

본 발명은 조혈 세포와 간세포의 밀접한 관련을 이용하여, 후에 임상 및 전임상 프로그램에서 사용되는 조혈 전구세포와 간 전구세포 집단의 쌍방을 정제하는 방법을 개시한다.

인간 간 전구세포의 이용은 많고, 다양하다. 그것에는: 1) 사람 세포에 관한 연구; 2) 백신 또는 항바이러스제의 생산; 3) 독성 연구; 4) 약제의 개발; 5) 단백질의 제조(다양한 사람의 특이적 인자를 생산하기 위한 숙주로서 세포를 이용); 6) 간장의 세포 치료; 7) 간장의 유전자 치료; 8) 연구, 독성시험 및 항균시험, 단백질 제조 또는 간장 보조 시스템으로 임상적으로 이용되는 생체 인공 간장을 포함한다. 조혈 및 간장 형성사이에 공통하는 세포계통의 가능성을 검토하면, 그것이 놓여지는 현미 환경에 따라 간세포 또는 조혈 세포 운명의 쌍방에 동일한 세포를 이용할 수 있다.
고도로 정제된 인간 간 전구세포를 이용할 수 있음으로 인하여, 사람 세포에 관하여 충분한 많은 연구를 행할 수 있고, 성공한 간장의 세포치료 및 유전자 치료 형태의 개발이 촉진되고, 연구에서 및 임상 보조 장치로서 이용되는 사람 생체 인공 간장의 개발이 가능하게 할 것이다. 현재, 건강한 사람 조직의 공급에는 한계가 있으므로, 간장의 세포 치료 및 사람 생체 인공 간의 임상적 프로그램을 행할 수 없다. 전구세포 집단은 이러한 한정된 공급을 극복할 수 있는 정도, 또는 적어도 크게 개선할 수 있는 정도의 충분한 증식능을 가지고 있다.

실시예를 들어 구체적으로 설명하나 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

간세포 타입 대 기타 세포 타입에서 발현되는 AFP와 알부민의 변종형의 분석.

세포주(cell line): 2개의 인간 간암, Hep3B 와 HepG2는 1 mM 피루브산 나트륨, 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 수용액, 5 ㎍/ml 인슐린 그리고 10％ FBS를 보충한 Eagle's MEM 내에서 유지되었다. 인간 적백혈병 세포주인 K562 및 마우스의 배아 섬유아세포의 세포주, STO는 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 5×10^-5M 2-ME 그리고 10％ FBS를 가한 DMEM/F12 배지에서 유지되었다.

RT-PCR: Chomcznski 와 Sacchi N. Anal.Biochem 162, 165-159(1987)의 방법으로 모든 RNA를 Hep3B, HepG2 및 STO로부터 추출하였다. cDNA를 올리고 -dT 프라이머에 의해 합성하여 본 발명자가 디자인하여 사람 AFP 또는 알부민에 관하여 조제한 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. 이 프라이머(primer) 배열은 아래와 같다.
AFP에 관하여:

배열번호: 1 hAFP1: 5'-ACCATGAAGTGGGTGGAATC-3',

배열번호: 2 hAFP2: 5'-CCTGAAGACTGTTCATCTCC-3',

배열번호: 3 hAFP3: 5'-TAAACCCTGGTGTTGGCCAG-3',

배열번호: 4 hAFP4: 5'-ATTTAAACTCCCAAAGCAGCAC-3',

배열번호: 5 hAFPexon2: 5'-CTTCCATATTGGATTCTTACCAATG-3',

배열번호: 6 hAFPexon3: 5'-GGCTACCATATTTTTTGCCCAG',

배열번호: 7 hAFPexon4: 5'-CTACCTGCCTTTCTGGAAGAAC-3',

배열번호: 8 hAFPexon5: 5'-GAGATAGCAAGAAGGCATCCC-3',

배열번호: 9 hAFPexon6: 5'-AAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTG-3',
알부민에 관하여:

배열번호: 10 hALB1: 5'-GGCACAATGAAGTGGGTAACC-3',

배열번호: 11 hALB2: 5'-CCATAGGTTTCACGAAGCGTTG-3',

배열번호: 12 hALB3: 5'-GCCAGTAAGTGACAGAGTCAC-3',

배열번호: 13 hALB4: 5'-TTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3',

프라이머의 조합은 다음과 같다.

AFP에 관하여: hAFP1 및 hAFP2,

hAFP3 및 hAFP4,

hAFP1 및 hAFP4,

hAFPexon2 및 hAFP4,

hAFPexon3 및 hAFP4,

hAFPexon4 및 hAFP4,

hAFPexon5 및 hAFP4, 그리고

hAFPexon6 및 hAFP4

알부민에 관하여: hALB1 및 hALB2

hALB3 및 hALB4,

hALB1 및 hALB4,

PCR은 각 프라이머 1 μM, 각 dNTP 200 μM, 50 mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화마그네슘, 10 mM 트리스HCl, pH 8.3, 및 1.25 U Amplitaq plymerase (Cetus Corp.)으로 이루어진 전량 50 μl에서 실시한다. 샘플을 94℃에서 3분간 가열한 후, 94℃ 2분, 62℃에서 2분, 그리고 72℃에서 3분을 30사이클 반복했다. 마지막 사이클 후, 최종 신장 단계를 72℃에서 7분간 실시하였다. 그 다음에 각각의 PCR 반응액 5 μl를 브롬화 에티듐의 트리스 염산 EDTA 완충액을 함유하는 2％ 아가로즈 겔에 놓아 행하였다.

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AFP에 관한 RT-PCR: 인간 AFP 유전자는 15개의 엑손들로 구성된다.(Gibbs et al., Biochemistry, 26: 1332-1343). 절단형 전사물을 기능적으로 완전한 AFP mRNA와 구별하기 위하여, AFP cDNA 배열의 다른 2개의 부분을 RT-PCR의 표적 분자로 선택한다. hAFP1 및 hAFP2의 프라이머 조합을 이용하여 개시 MET를 함유하는 엑손 1부터 엑손 3을 증폭하나, hAFP3 및 hAFP4의 조합은 엑손 12에서 정지 코돈을 포함하는 엑손 14를 증폭시킨다. 이 PCR의 결과는 도 1에 나타낸다. 상기 프라이머 조합의 결과, Hep3B 및 HepG2로부터의 RNA에 있어서 증폭 밴드가 강하게 검출된다(lane 1, 2, 4 및 5). 대조적으로 K562로부터의 RNA에서는 프라이머 셋트 hAFP3 및 hAFP4에 의해 C-말단 부분의 특이적 밴드만이 검출된다(lane 7 및 8). 이 결과는 적백혈병 세포주인 K562는 N-말단을 갖지 않는 AFP의 절단형만을 발현한다는 것을 시사한다. 이 가설을 지지하여 hAFP1 및 hAFP4 프라이머를 이용한 AFP의 전 코딩 영역에 관한 PCR을 실시한다. 예상되는 바와 같이, Hep3B 및 HepG2 cDNA의 PCR은 1.8Kb의 단일의 현저한 밴드를 나타내나(lane 3 및 6), K562에서는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다(lane 9). 대조군(control)은 RNA를 함유하지 않는 샘플 및 마우스 배아 섬유아세포의 세포주(STO)에 유래한 샘플이다. 양쪽 샘플 모두 어떠한 밴드도 나타내지 않았다.

다음, hAFP mRNA의 진정 및 변종형의 차이를 알아보기 위해 엑손 2에서 엑손 6까지의 일련의 5' 프라이머를 구축했다. 도 1에서, 그 결과는 엑손 1을 제외한 모든 코딩 양역이 K562의 hAFP의 변종형이 공유되어 있음을 보여준다(lane 1, 3, 5, 7, 9 및 11).

알부민에 관한 RT-PCR: 인간 알부민 유전자는 동일하게 15개의 엑손(Minghetti et al., J. Biol. Chem, 261:6747-6757)으로 구성된다. AFP에 관해서는 hALB1과 hALB2의 프라이머 조합을 개시 MET을 포함하고 있는 엑손 1부터 엑손 4까지 증폭에 이용되는 것에 반해, hALB3와 hALB4의 프리아머 조합은 엑손 12부터 정지 코돈을 포함하고 있는 엑손 14을 증폭시킨다. 이 PCR의 결과를 도 17에 나타낸다. 이들 2개 프라이머 조합에 의해 Hep3B 및 HepG2로부터의 RNA에서의 증폭 밴드를 강하게 검출된다. 대조적으로 K562로부터의 RNA에서는 hALB3 및 hALB4의 프라이머 세트에 의해 C-말단부의 특이적 밴드만이 검출된다(lanes 7과 8). hALB1 및 hALB4 프라이머를 사용한 알부민의 전체 코딩 영역의 PCR은 K562에서 어떠한 밴드도 나타내지 않는다(lane 9). 대조군은 RNA를 가지고 있지 않은 샘플과 마우스의 배아 섬유아세포의 세포주(STO)에 유래한 샘플이다. 양쪽 샘플 모두 어떠한 밴드도 나타내지 않는다.

시약 구입처:

Sigma Chemical Company(St. Louis, Mo)

Gibco BRL Products(Gaithersburg, MD)

Worthington Biochemical Corporation(Frehold, New Jersey)

Dupont Pharmaceuticals(Wilmington, Delaware)

Falcon-a subsidiary of Becton Dickinson Labware(Franklin Lakes, New Jersey)

조직 구입처:

Anatomical Gift Foundation(Atlanta, Georgia)

Advanced Biosciences Research, ABR(San Francisco, Cal)

Local transplant surgeons at UNC Hospital

실시예 2

인간 간장의 프로세싱

태아 간장: 태아 간장은 Advanced Biosciences Research, ABR과 제휴한 모든 캘리포니아주에 있는 다수의 병원과 남부(조지아, 버지니아주) 북동부(펜실바니아주), 또는 중서부(캔자스, 콜로라도)의 병원과 Anatomical Gift Foundation으로부터 기증받았다. 태아들은 병원들로부터 수집되었다. 조직은 태아들로부터 절개되었고, 인슐린(시그마, 5㎍/ml), 트랜스페린(시그마, 5㎍/ml), 셀레늄(10^-9M, 그리고 5％ 소 태아의 혈청)을 첨가한 RPMI 1640(깁코)에 넣었다. 이들 샘플들은 얼음위에 놓고, 수송기로 우리 연구실에 운반되었고, 수송시간은 10-16시간이었다. 이와 같이, 우리는 이 샘플을 외과수술 후 대략 24시간 후에 받았다. 이 샘플들은 연대순으로 접두사 REN을 붙인 수자를 부여하고(REN 1, 2 ,3, 등) 여기서 REN은 르네상스의 약어이다.

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성인 간장: 성인 간장은 Anatomical Gift Foundation 또는 지역 외과의 (UNC)로부터 기증 받았고, 이들은 거부된 간장 조직, 즉 이식 수용자로부터의 외식체 또는 장기 이식을 위해 제공되었으나, 병원체 이외의 이유로 거부된 간장들이다. 외식조직 또는 거부된 기증 조직을 제공하는 환자들은 일련의 질환에 관하여 스크리닝하여 이들 시험에 의해 안전함이 확인된 후에 조직만을 세포 처리하여 이용한다. 환자들로부터 채취한 간장을 위스콘신 대학 용액(solution)(Viaspan이라 불린다)에 넣고, 얼음위에 넣어져 연구실로 수송되었다. 장기를 뇌사환자로부터 적출한 시간("고정된 시간(Clamp time)")과 연구실에 도착할 때까지 시간은 매우 다양하다. 이 표본들은 그 시점에서 간장을 기증자로부터 적출한 "고정된 시간(Clamp time)"의 24시간 내에 도착하였다.

사체 간장: 사후 최소 30시간 내에 얻어진 간장들은 지역 장기 조달 협회(캘리포니아 장기 조달협회, 즉 COPA)을 통해서 얻어졌다. 이 간장들은 성인 간장과 동일하게 처리를 하였다.

피험자의 안전을 위해 검사된 항목 리스트는 HIV Ⅰ 및 Ⅱ, HTLV Ⅰ 및 Ⅱ, B형 몇 C형 간염, 그리고 결핵이다. 임상적 사용의 리스트는 위해 HIV Ⅰ 및 Ⅱ, HTLV Ⅰ 및 Ⅱ, A형 B형 C형 그리고 G형 간염, EBV, CMV, 결핵, 매독, 마이코플라즈마 등의 요소를 검사하였다.

태아와 성인 간장들은 효소 소화 및 기계적 해리의 조합을 사용하여 처리하고, 태아 간은 기계적 해리에 의해 조제하나, 성인 간은 효소적 소화에 의해 조제한다. 각각의 상세는 다음에 나타낸다. 태아간 및 성인 간은 효소 용액중에서 다양한 길이의 시간 소화하고, 이것은 조직에서 세포에 함께 결합하고 있는 세포외 매트릭스(extracellular matrix)를 해리시켜주는 역할을 한다. 간장 세포의 분리에 사용되는 콜라게나아제 효소 혼합물은 뵈링거-만하임사가 제조한 고순도의 "리베라제(Liberase)" 효소 조제액이고, 정제 콜라게나아제와 엘라스타제(elastase)의 혼합액으로 이루어져 있다. 이 효소 혼합액은 매우 낮은 농도에서 사용될 수 있으며, 유해한 "부작용"은 적다.

효소 용액: 콜라게나아제 용액: 60∼70 mg/완충제 100mL(시그마의 IV타입 콜라게나아제, 카탈로그 #C5138 또는 워싱턴(Worthington)의 B타입, 카탈로그 #LS005273; 2 가지 모두 콜라게나아제를 농축한 세균 조제물이나, 않은 불순물을 포함하고 있다), 또는 P2 완충제(하기 참조)로 조제하여 0.23 mg/mL로 사용되는 리베라제(Liberase): (뵈링거-만하임사에 의한 정제 콜라게나아제/엘라스타제 조제물, 카탈로그 번호 1814184).

세포 세정액: 인슐린(5 ㎍/mL), 트랜스페린(5 ㎍/mL), 1:1 몰비로 정제된 소 또는 사람 혈청 알부민과 결합된 유리 지방산 혼합물(하기 참조)을 첨가한 RPMI 1640(깁코)

유리 지방산 혼합물: 미성숙 세포 집단 및 손상된 늙은 간장 세포는 그들의 세포막을 유지하고 합성하기 위해 지질을 필요로 한다. 완전히 성숙한 간세포는 하나의 지방산원(source)(리놀렌산)으로부터 막을 합성할 수 있으나, 보다 젊은 실질 세포는 합성할 수 없으므로, 그의 지질 요건을 만족시키기 위하여는 여러 가지 다른 지방산의 혼합물을 필요로 한다. 우리는 고도로 정제된 알부민과 1:1 몰비로 결합하는 복합체 혼합물을 제공한다. 이 지방산 조제물을 조제하는 방법에 대한 상세한 설명을 하기에 나타낸다.

보존액을 아래와 같이 조제하고, 합하여 전체 100 mM 유리 지방산으로 한다:

팔미트산 31.0 mM 올레인산 13.4 mM

팔미톨레인산 2.8 mM 리놀산 35.6 mM

스테아린산 11.6 mM 리놀렌산 5.6 mM

최종농도 7.6 μM/L를 얻기 위해서 리터당 76 μl/L를 가한다[참고: 체세바우프(Chessebauf) 와 파듀(Padieu), in vitro 20(10): 780: 1984). 상기 인용에 따라서 유리 지방산 혼합액은 세포 배양 배지에서의 최종농도 7.6 μeq/L(=7.6 μM)에서 사용된다.

각각의 지방산 구성성분의 조제

각각의 개별 구성 성분은 다음과 같이 100％ 에탄올(EtOH)에 용해시킨다.

팔미트산 1 M 저장용액, 뜨거운 에탄올에 용해

팔미톨레인산 1 M 저장용액, 에탄올에 용이하게 용해

스테아린산 151 mM 저장용액, 1 g/21mL로 가열된 에탄올에 용해

올레인산 1 M 저장용액, 에탄올에 용이하게 용해

리놀산 1 M 저장용액, ks에탄올에 용이하게 용해

리놀렌산 1 M 저장용액, 에탄올에 용이하게 용해

다음에, 이들 각각의 보존액을 혼합하여 100 mM FFA 혼합물을 얻는다. 각각의 FFA의 혼합액의 소량에 질소를 통기하여 산화를 감소시켜 안정화를 증가시킨다. 보존액은 -20℃에서 동결한다.

P1 환류 완충액 - 아래에 기술된 성분의 각각에 대해 명기하는 최종농도의 칼슘과 마그네슘을 함유하지 않은 환류 완충액(pH 7.2): 118 mM 염화나트륨(NaCl), 4.7 mM 염화칼륨(KCl), 1.2 mM 인산칼륨(K₃PO₄) pH 7.4 2.5 mM 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 0.5 mM EDTA, 5.5 mM 글루코오스, 0.5％ 소 또는 인간 혈청 알부민(BSA), 아스코르브 산(50 ㎍/mL), 인슐린(4 ㎍/mL), 덱사메타손(1 μM)

P2 환류 완충액 - 0.5％ BSA, 아스코르브산(50 ㎍/mL), 인슐린(4 ㎍/mL), 덱사메타손(1 μM)가 첨가된 둘베코(Dulbecco)가 개변 이글 배지 또는 RPMI 1640.
DMEM - 글루코오스, 피루브산나트륨 및 L-글루타민을 함유하고, 다시 5％ 소태아 혈청, 인슐린(4 ㎍/mL) 및 덱사메타손(1 μM)을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지(Gibco)

치(Cheee) 배지 - ITS^+TM 배양 첨가물(5 mL/500mL) 및 덱사메타손(0.1 μM)을 첨가.

퍼콜(Pharmacia, 카탈로그 #17089102)는 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충 생리식염액 10배액으로 9:1로 희석한다.

실시예 3

태아 간장 조직 연구

태아의 간장을 수송 완충액(상기) 및 얼음에 놓는다. 이를 인슐린(Sigma; 5 ㎍/mL), 트랜스페린(Sigma; 5 ㎍/mL셀레륨(Johnson Matthey's 질량 분석 미량 원소: 10^-9M) 및 소 혈청 알부민과 1:1 몰비로 결합된 유리 지방산 혼합액을 첨가한 RPMI1640(Gibco)로 이루어진 "세포 세정 완충액"으로 세정한다. 그런 다음, 태아 간을 15∼20분 동안 콜라게나아제 완충액에 넣고, 800메시 그리드를 갖춘 "콜렉터"(Sigma)를 통해 가볍게 눌러 세포의 작은 응집괴를 얻고; "세포 세정 완충액"을 이용하여 해리 프로세스를 용이하게 한다. 다음에, 프로세스를 용이하게 하기 위하여 "세포 세정 완충액"을 사용하여 70 마이크로 필터(Falcon 세포 여과기 70 ㎛ 나일론, 카탈로그 #2350)로 눌러 세포의 응집괴를 완전히 해리한다. 70 마이크론 필터를 통과한 세포를 여과되지 않은 것과 구별하였다. 두 샘플 모두 동결 보존하고, 트립판 블루 색소 배제 앗세이를 이용하여 생존 백분율을 조사하였다.

실시예 4

성인 간장 조직 연구

간장을 문맥, 대정맥, 또는 쌍방으로부터 삽관하고, 완충액을 환류하여 혈액을 소실시키고: 이어서 콜라게나아제/프로테아제를 함유한 완충액으로 환류하여 세포를 효소적으로 해리한다. 소화후, 간의 크기에 따라 통상 15∼30분이 요하나, 세포의 해리 프로세스를 기계적으로 완전히 하기 위하여, 조직을 치즈 클로스 또는 나일론 필터로 가압하거나, 또는 빗(comb)으로 모은다. 해리된 세포를 혈청을 함유하는 완충액으로 세정하여 환류시 사용되었던 콜라게나제 및 기타 효소를 불활성화시킨다.

환류 완충액, P1 및 P2를 37 ℃의 수욕에 넣는다. 환류는 밀러(Miller) 형의 환류 박스에서 실시하고, 환류 동안 37 ℃로 유지한다. 완충액은 환류 동안 산소 포화한다. 박스 중의 모든 튜브는 70 ％에탄올로 세정한 후, 증류수로 세정하고, P1으로 세정하고, 시스템에서 공기를 제거하였다. 간장을 60 mL 시린지에 부착된 16 게이지 바늘로부터 테프론(등록상표) 캐뉼러를 사용하여 삽관하고, 큰 간장 조각(100∼300 gm)에 관한 간장 절단 표면에서 이용 가능한 각종 혈관을 이용하여 간장에 빙냉 P1 완충액을 흘려보낸다. 전체 간장의 소엽이 이용될 수 있는 경우에는 대정맥의 잔류물을 삽관할 수 있다. 이것이 조직의 최적인 환류를 제공하는 것인가를 알기 위하여 간장 덩어리의 각종 혈관을 조사한다. 이 기법은 또한, 과잉 혈액을 간장에서 제거한다. 선택된 혈관에 삽관하여 의료용 점착테이프를 이용하여 그의 장에 고정한다. 다른 모든 큰 혈관 및 표면 개구부를 의료용 플래스터를 이용하여 폐쇄하고, 필요에 따라서는 개구부의 폐쇄로 역할하기 위하여 점착면을 갖는 Q-팁을 이용한다. 접착제가 건조하면, 간 표본을 적당한 크기의 유리 용기 중에서 나일론 메시 위에 놓는다. 이 용기에 P1 완충액을 첨가하고 완충액에 간을 침지시킨다. 간장을 함유하는 용기를 환류 박스 내부에 놓고 캐뉼러의 출구 튜브를 부착시켰다. P1 완충액을 약 24 mL/분의 속도로 저속으로 15분간 순환시키고, 허용되는 역압으로 유속을 최적으로 하기 위하여 58 mL/분에서 90 mL/분으로 서서히 증가시킨다. 간장으로부터 환류액의 과잉의 누출이 없도록 하지 않으면 안된다. 15분 후 P1 완충액을 용기에서 제거하고, 콜라게나제를 함유하는 P2 완충액으로 교환한다. P2 완충액은 간이 충분히 소화될 때까지(어두운 붉은 색에서 브라운 색으로 간의 색깔 변화 및 간의 걸쭉한 상태에 의해 평가된다) 재순환된다. P2 완충액을 20∼25분 이내에 재순환된다. 일단 환류가 끝나면, P2 완충액을 용기에서 빼내고 간장을 용기에서 후드로 옮긴다.

세포 배양 배지(DMSE)를 용기에 가하고, 캐뉼러와 점착테이프를 간장의 미소화(未消化) 영역과 함께 제거한다. 간의 피막(Glisson's 피막)은 핀셋, 가위를 사용하여 파쇄한다. 이것에 의해 소화한 조직이 배지에 방출되어 결합 조직 및 미소화 재료를 남긴다. 소화한 재료를 DMEM에 넣고, 일련의 상이한 크기의 필터로 여과한다. 여과기는 여과를 돕기 위해 큰 깔때기를 안쪽에 놓는다. 소화된 재료를 처음에 치즈 클로스 1매에 의해 여과하고, 400 ㎛ 나일론 필터, 최종적으로 70 ㎛ 테프론 필터로 여과한다. 여액은 등분하여 원심분리관에 넣고, 70 g에서 4분간 원심분리한다.

윈심분리 후, 퍼콜을 첨가하기 전에 상청액을 분획1(F1)이라고 한다. 세포 침강물에 DMEM 및 등장 퍼콜을 가하여 최종 비율을 각각 3:1로 하였다. 예를 들면, 5 ㎖ 작은 세포 침강물을 DMEM 30 ㎖와 등장 퍼콜 10 ㎖에 부유시킨다. 이 샘플을 5분간 100 g으로 원심분리하여 상청액을 얻었다. 상층을 분획2(F2)라 한다. 퍼콜l의 중간층을 분획3(F3)이라 한다. 남아있는 세포 침강물을 분획4(F4)라 한다. 다른 분획의 세포를 부유시켜 트립판 블루 색소 배제 앗세이를 사용하여 생존율을 평가하였다. 다른 분획들의 생존율을 동결보존 후의 생존율과 함께 표 3에 나타낸다.

간 환류 후, 간 조직의 혈관 또는 담즙 가지에 결합하여 있는 남은 세포를 보존한다. 이들 세포는 효소 환류 후에 얻어진 세포의 당초 현탁액에서 관찰되며, 전형적으로 현탁액의 세포를 통과한 후, 체(즉, 치즈 클로스)의 상부에 남아있다. 이들 혈관 및 담즙 가지의 잔여물을 다시 효소 처리하여 얻어진 세포를 다른 세포와 함께 모아둔다.

퍼콜 분획은 세포 파면 및 사멸 세포로 생각되는 것을 제거하기 위하여 대부분의 연구자들에 의해 루틴하게 사용되고 있으며, 최종적인 침강물만이 보존된다. 환류 방법에 대한 새로운 변법은 본 명세서에서 침강물을 버리고, 낮은 부양 밀도의 세포(즉, 구배 상부에서 회수한 세포)를 유지시키고, 다음 시험에 이용된다. 이들 세포는 더 젊은 실질세포이며, 동결이 상당히 용이하다(동결 보존 참조).

실시예 5

동결 보존실험. 동결 보존 방법에 사용되는 간장은 태아 간과 동일한 어린 공여체(임신기간 12주에서 25주) 및 연력 77세의 공여자로부터 유래된 것이다.

"신규 동결보존 완충액"

2 ％ 인간 혈청(Gibco) 또는 소태아 혈청(Biowhittaker)을 첨가한 비스판(Dupont Catalog#1000-46-06)

10 ％동결보존제[성숙 실질 세포를 위한 디메틸술폭시드(Sigma catalog #D5879 또는 D8779) 또는 전구세포에 사용되는 디메틸술폭시드 또는 글리세롤(Sigma catalog #G6279)]

완충액에 항생제(페니실린 200 U/mL; 스트렙토마이신 100 ㎍/mL)가 첨가되었다.

완충액에 호르몬 및 증식인자; 인슐린(5 ㎍/mL), 트랜스페린(5 ㎍/mL), 에피데르말 증식 인자(50 ㎍/mL), FGF (10 ng/mL), IGF Ⅱ(10 ng/mL)를 첨가하였다.

완충액에 리피드를 첨가한다; 소태아 혈청 알부민(BSA) 또는 사람 혈청 알부민(HSA)에 결합된 유리 지방산(7.6 uM/L) 및 고밀도의 리포단백질(10 ㎍/mL)을 첨가하였다.

완충액에 미량 원소(셀레늄(10^-9M), 구리(10^-7M), 아연(5×10^-11M) 및 항산화제(즉, superoxidase dismutase mimetic인 포르포린 10 ㎍/mL; 아스코르브산 0.1 mg/mL; 또는 당해 분야에 공지된 기타 항산화제)를 첨가하였다.

조성물의 변화는 조성물의 변화는 중요 영양소, 리피드, 호르몬 및 증식 인자를 조합한 것이며, 이들은 간세포를 위해 만들어진 혈청을 함유하지 않는 호르몬 규정 배지의 일부로서 동정된다. 신규 완충액에 의해 F4 분획에 대한 간세포의 생존율은 50 ％이하(매우 나쁜 샘플)의 낮은 생존율에서 80％ 이상(좋은 샘플)의 높은 생존율로 된다. F1∼F3 분획의 생존율은 일관되게 80 ％이상이고, 각각의 의심되는 사실은 이들 분획은 배수성 상태와, 세포외 메트릭스 성분 및/또는 생존율과 증식에 필요한 다른 세포인자 합성에 대하여 보다 전도성의 대사활동을 갖는 보다 젊은 세포를 가지지 때문이다. 이와 같이 이들은 용이하게 동결될 수 있는 가능성이 있다. 과산화 디스무타제 디메틱 모방약을 완충액 중에 사용하면 생포의 생존율은 5∼10 ％ 정도 증가한다.

상기에 대신하는 방법은:

Viaspan을 넣지 않고, 기초배지(RPMI 1640)에 인슐린 (5 ㎍/mL), 트랜스페린(5 ㎍/mL), BSA 결합된 유리 지방산(7.6 uM/l), 고밀도 리포단백질(10 ㎍/mL), 미량 원소(셀레늄(10^-9M), 구리(10^-7M), 아연(5×10^-11M) 및 항산화제를 첨가한 개변 완충액을 사용한다.

세포를 라미닌과 혼합한 유형 IV 콜라겐 또는 유형 I 또는 피브로넥신과 혼합된 유형 Ⅲ 콜라겐과 같은 세포외 메트릭스의 형태로 코팅한다.

상기와 같이 처리된 태아 간장 세포를 동결보존 완충액(상술)에 현탁하고, 3 mL 동결용 바이알에 5∼10×10⁶세포/mL로 나누어 넣고, 그 조건에서 1∼2시간 유지시킨다. 세포를 컴퓨터 제어속도 프리저(Forma Cryomed)를 이용하여, 액상 질소 온도 -100℃∼-180 ℃, 바람직하기로는 -160℃에서 동결하고, 큰 증기상에서, 액체 질소(-160℃)저장 탱크에 보존한다. 세포는 이 프로세스에서 충분히 생존하고, 생존율이 유의한 상실은 50∼270일 범위의 저장 기간에 일어나지 않았다(도 3).

성인 간세포의 분획(F1∼F4)은 명확한 세포 아집단을 함유한다는 것이 판명되었다.: F1은 세포파편, 적혈구, 간 별모양 세포 및 아마도 전구세포 아집단(간 또는 혈구 형성 세포)인 작은 간세포(＜10 u)를 포함한다; 퍼콜 용액의 상부인 F2 분획은 2배체인 보다 큰 간세포(10∼15 u), 작은 실질 세포를 포함한다; 퍼콜의 하단 F3은 2배체와 4배체 세포의 혼합물로 되는 큰 실질 세포(15∼25 u)를 함유한다; F4 분획(다른 연구자가 사용한 것)은 최대의 실질세포(25∼50 u)와 완전한 다배체(4배체 및 8배체)로 이루어진다. 일반적으로 F1-F3 분획의 실질세포는 동결 후의 생존율이 85∼95％이며, F4의 실질 세포는 동결 후의 생존율이 50∼80％이다(도착 시의 간장의 상태에 의존한다). F4 분획의 실질 세포의 생존율에 영향을 미치는 동정된 변수는: 1) 공여자의 나이(공여자의 연령이 높을수록 세포의 예후는 악화한다); 2) "클램프 시간"과 연구실로 수송될 때까지의 시간(짧을수록 좋다); 3) 제거 전의 간 조직의 건강상태(즉, 심각한 허혈 질환은 나쁜 예후를 초래). 이들 요인은 상호작용하기 때문에, 고령의 공여자의 조직의 신속한 수송은 수송에 지나치게 많이 걸린 젊은 환자로부터의 조직보다 매력적일 가능성이 있다.

표 5: 동결보존에 의한 태아 및 성인 간의 평균 생존율 및 접착효율 및 세포 현탁액의 간 전구세포(AFP+세포)의 백분율

처리 후 및 동결 후의 쌍방의 F4 분획의 생존율의 극한적인 범위는 "클램프 시간"과 연구실에서 간을 수령한 시간의 길이가 다양한 것, 간장의 상태가 다양한 기 때문이다(섬유증, 허혈 등). 일반적으로 F4 분획은 간장의 다양한 처치 및 조직의 전반적 건강에 대하여 가장 감수성이 높다. F2 및 F3 분획은 일반적으로 생존율이 높고, 불량한 간 검체로부터 얻어지는 경우에도 용이하게 동결 보존된다. F1 분획은 더욱 변동이 크고, 대량의 세포파편, 지방 방울과 함께 작은 실질 세포(간 전구세포를 함유하는 것으로 가정) 및 다양한 조혈 세포 아집단(즉, 적혈구)의 쌍방을 함유하는 다수의 작은 세포를 포함하고 있다.

표 6: 동결보존: 태아 간장

● 처리＞200 ● 수율

● 제공받은 세포조직 ◆ 그램 당 ∼10⁸ 세포

(제공자의 연령에 따라) 처리된 세포조직

◆ 12주: 침강세포 ∼1 mL ● 생존율

◆ 16주: ∼15∼20 mL ◆ 처리: 75∼85％

◆ 침강 세포=0.5∼1 gm ◆ 융해: ＞95％

◆ 24주: ∼4-5 gm ◆ 소팅: ＞90％

◆ 배양: ＞90％

삭제

표 7: 동결보존: 성인 간

● 처리 ＞80 ● 생존율(처리)

● 제공받은 100∼200 ◆ F1: ＞75％(>12μ)

간장 당 그램수 ◆ F2: ＞90％(12-15μ)

(2.5∼3kg/간장) ◆ F3: ＞90％(15-25μ)

◆ F4: 75∼80％(25∼50μ)

수율: 10⁷-10⁸개/g 조직
● 생존율(동결)

◆ F1∼F3: >80％

접착 양호

◆ F4: 56％

접착 불량

실시예 6

플로우 사이토메트리

세포는 그들이 레이저 광선에 폭로되면 유동 세포(flow cell)를 1열로 통과한다. 각 세포의 대략적인 부피는 "전방 산란(forward scatter)" 이나 빔으로 굴절된 광의 양이 교차한다. 세포핵, 소포체, 골기체(Golgi body), 소포(vesicles) 등과 같은 내부 세포 구조로부터의 산란광인 "측면 산란(side scatter)"들은 내부 복잡도(즉, 정지기의 세포, 또는 보다 젊은 세포보다 내부성분을 보다 많이 함유하는 활성화 세포 및 보다 성숙한 세포)의 양을 결정하기 위하여 사용된다. 세포 특징에 관한 보다 선택적인 정보는 대우 특이적인 특징적인 항원을 세포 표면의 세포 복합체에 결합시킴으로서 얻어진다. 이 항체들은 플루오레세인 이소티오시아네이트(Isothiocyanate)(FITC), 피코에리트린(Phycoerythrin)(PE), 그리고 PE와 사이토크롬의 직렬 접합체 등의 형광분자에 공유 결합될 수 있고, 각각의 형광체에 관하여 특정 파장으로 방출 광을 생성한다. 특정한 항체에 결합된 명확한 발색단의 패널을 선택함으로서 관계하는 세포 집단을 선택한다.

세포는 그의 파라미터(parameter) 입력에 의하여 분석된다. 에펜도르프(Eppendorf)와 원심형 관과, 1초에 40,000이벤트까지의 속도에서 어느 사이즈의 다수의 웰 플레이트를 함유하는 다양한 회수장치를 이용하여 소망의 세포를 채취한다.

염색 기법에서 사용된 항체와 시약

항체 공급자,Cat# Lot#
염소 항인간 AFP 케미콘,AB635, C4P168

모노클로날 마우스 X 인간 Thy 케미콘,MAB1294,293CCD

모노클로날 마우스 항인간AFP-PE 크로마프로브,P41020,A45P7

결합체

비오틴 결합 토끼 항염소 벡터 연구소, BA-5000,J0313

비오틴 결합 토끼 항염소, 잭슨이뮤노케미칼사, 200-152-096,25985

스트렙타비딘/AMCA 결합체, 잭슨이뮤노케미칼사, 016-150-084,40001

당나귀 항양AMCA 결합체, 잭슨이뮤노케미칼사, 713-156-4732202

당나귀 항염소 CY5 결합체, 잭슨이뮤노케미칼사, 705-156-147,387

염소 IgG, 잭슨이뮤노케미칼사, 005-000-002,38837

양 IgG, 잭슨이뮤노케미칼사, 013-000-002,39945

양 항인간 알부민, 세로텍, ABP102,210498

마우스 모노클로날 항인간 항체:

CD14/Tri Color 결합체 파밍겐

ICAM 파밍겐

CD34/FITC 결합체 파밍겐 34374X

CD38/PE 결합체 파밍겐 31015X

CD38/FITC 결합체 파밍겐 31014X

글리코포린A PE 결합체, 파밍겐, 32591A

CD 45/PE 결합체 파밍겐 31255X

CD 45/FITC 결합체 파밍겐 31254X

이소타입 대조 IgG1 PE 파밍겐 33815x

IgG2 FITC 파밍겐 33814X

c_Kit PE 결합체 칼텍 MHCK04

토끼X인간 AFP-FITC 결합체, 정밀, YNRH AFPF 기록 없음

염소 항인간 AFP 비결합체, 정밀 AXL625 061

7아미노 악티노마이신D 몰 프로우브 A-1310, 4981-1

(7AAD)

플로우 사이토메트리를 위한 세포 조제에 사용되는 주요 용액

BSA: 소혈청 알부민(펜텍스 V)

PBS = 인산염 완충 식염수

FBS = 태아 소혈청

AFP = 알파-페토프로테인

호르몬 첨가 둘베코의 개변 이글 배지: HC_DMEM

500 mL DMEM, 페놀 레드가 없는 고 글루코오스

25 mL 태아 소혈청(FBS)

20 mL 5mM EGTA

인슐린(5 ㎍/mL), 트란스페린(5 ㎍/mL)

미량 원소[셀레늄(10^-9M), 구리(10^-7M), 아연(5×10^-11M)]

항생제(페니실린-100 ㎍/mL, 스트렙토마이신-100 ㎍/mL)

500 mg 소혈청 알부민(BSA) 30 mg DNase

BSA 결합된 38μL 유리 지방산 혼합물

0.2 ㎛ 세공을 가진 날젠(Nalgene) 여과 장치로 무균 여과

Hanks 완충 생리 식염수-수정된 방법:HBSS-mod

50 mL 10X HBSS

10 mL 1M Hepes

페니실린-100 ㎍/mL/스트렙토마이신-100 ㎍/mL

500 mL BSA

30 mg DNase

전량을 400 mL로 함

pH를 7.3으로

500 mL로 채움

0.2 ㎛에서 여과 멸균

면역화학을 위한 블록킹(blocking) 완충액

HBSS_mod 100 mL

2.2 mL 45％ 텔레오스텐 피쉬 겔(teleostean fish gel) 과

0.8 g BSA

1％ 사포닌의 HBSS 용액 0.5 mL

면역형광성 현미경용 조제 배지(Mounting medium)

0.5 mL 2X PBS

0.25 g n-프로필 갈레이트(gallate)

5.7g 글리세롤

실시예 7

플로우 사이토메트리를 위한 냉동 간 조직의 조제 수순

동결 간장 조직을 37℃에서 신속히 융해한다. 각각의 간 동결 바이얼(각각 5∼10X10⁶ 세포/mL를 함유하는 완충액 3mL를 함유하고 있다.)을 얼음 중에서 HC-DMEM을 1 mL/분의 속도로 가하여 10mL로 한다. 다음에, 이 샘플을 4℃에서 5분간 1200 RPM으로 원심분리한다. 상청액을 버리고, 세포 침강물을 HC-DMEM 5mL에 재부유시킨다. 상청액이 맑아질 때까지 이 세포의 세정을 반복한다. 그리고 나서 세포를 계수하여 트립판 블루 색소 앗세이를 이용한 혈구 계산판에 의해 생존율을 평가한다. 세포를 실험 프로토콜에 따라 분획으로 분리한다. 표준 시험관을 1∼2 X 10⁶개/mL 사이를 함유하는 대조 데이터에 관하여 조제하고, 통상 5∼10 X 10⁶/mL의 세포 현탁액으로부터 각각에 대해 200 μL를 채취함으로서 행한다. 다음의 표준 시험관이 필요하다:

1) OCS: 염색되지 않은 대조 세포로 구성된 당초 세포 현탁액

2) 배상 보정(compensation adjustments)을 위한 FITC 단독. 5 μL의 FITC-표지 항 글리코포린 A를 200 μL세포 현탁액에 가한다. 이에 대체할 수 있는 것은 FITC-표지 CD34, CD38과 CD45의 혼합액이며, 각각 7 μL를 200μL의 세포에 가한다.

3) 배상 보정을 위한 PE 단독. 글리코포린-PE(HC-DMEM 1 mL에 대해 2μL, 그리하여 200 μL의 세포에 대하여 이것을 30 μL 가한다.)를 사용한다.

4) 배상을 위한 7AAD 단독. 세포 현탁액 200μL를 2％ 파라포름알데히드로 고정하고, 이어서 100 μM 7AAD 5 μL와 세정제(1％ 사포닌) 5 μL를 HBSS-mod 현탁액 1 mL에 가하여 양호한 시그널이 생성된다. 투과된 세포는 7AAD에 의해 강하게 염색된다.

5) 배상을 위한 Cy5 단독. 고정세포 200 μL(2％ 파라포름알데히드)를 2％ 염소 혈청과 함께 40분간 인큐베이트하여 세포 표면을 양 IgG로 표지한다. 그런 다음, 세포를 Cy5 결합 당나귀 항-염소 IgG(1 : 800)와 함께 40분간 반응시킨다.
6) 배상을 위한 AMCA 단독. 7ADD에 관하여는 배상 보정을 위해 인공적으로 강한 시그널이 생성된다. 고정 세포 200 μL(2％ 파라포름알데히드)를 2％ 양 혈청과 함께 40분간 인큐베이션하여 세포 표면을 양 IgG로 표지한다. 그런 다음, 세포를 AMCA 결합 당나귀 항-양 IgG(1: 800)로 90분간 인큐베이트한다.
7) AMCA/Cy5 대조. 고정(2％ 파라포름알데히드) 및 투과(0.05％ 사포닌) 세포를 AMCA 결합 당나귀 항-양 IgG 및 Cy5-결합 당나귀 항-염소 IgG로 90분간 인큐베이트한다.

8) 모노클로날의 아이소 타입 대조. 마우스 IgG1 PE 결합 및 마우스 IgG2 FITC 결합체와 함께 세포를 인큐베이트한다. 농도는 분석용 소팅관을 표지하기 위해 사용된 농도와 일치시킨다.

9) 세포내 아이소 타입 대조. 고정(2％ 파라포름알데히드) 및 투과(0.05％ 사포닌) 세포를 알부민과 알파-페토프로테인질의 동정을 위해 이용된 항체의 대조로서 비면역 양 IgG 및 염소 IgG로 90분간 인큐베이트한다. Cy5-결합 당나귀, 항-염소 IgG 및 AMCA-결합 당나귀 항양 IgG와 함께 90분간 반응시킨다.

소팅관은, CD 마커의 특정 조합을 발현하는 선택된 세포의 집단을 획득하기 위해 조제된다. 통상, 이들 시험관은 50∼70×10⁶개를 함유한다. HC-DMEM + 1％BSA + 500 pM 7AAD(100 μM 보존액의 5 μL)을 함유하는 염색 완충액 1 mL에 세포를 재현탁한다. CD34 FITC, CD38 PE, 또는 CD45 PE 각각 15∼25 μL를, 세포수에 따라 염색된 완충액에 가한다(통상, 10×10⁶개에 대하여 파밍겐 항체 3μL). c-Kit에 대한 항체는 60배 희석액을 가하고, 글리코포린 A는 500배 희석액으로 사용한다. 어두운 곳에서 얼음 위에서 40분 동안 염색한다. 염색 후, HBSS-mod으로 세포를 2회 세정하고, 얼음 위에서 2％ 파라포름알데히드의 PBS용액에 의해 30분간 고정시킨다.

실시예8

세포 소팅을 위한 세포내 염색

플로우 사이토메트리에 의한 알파-페토프로테인(AFP)의 분석을 위한 세포의 세포내 염색에 관하여 세포 현탁액을 0.05％ 사포닌(시그마, S4521)의 HBSS_mod 용액으로 얼음 위에서 10분간 투과된다. 다음에, 1％ 연골 물고기 겔 및 0.8％ BS, 그리고 0.005％ 사포닌을 함유하는 HBSS_mod의 혼합액에 의해 20분간 블록킹한 후, 염소 항인간 AFP 및 양 항인간 알부민(쌍방 모두 블록킹 완충액으로 800배 희석)과 함께 실온의 암실에서 90분간 인큐베이트한다. 0.01％ 사포닌을 함유하는 HBSS_mod로 세포를 2회 세정한 후, Cy5 결합 당나귀 항염소 IgG와 AMCA 결합 당나귀 항양 IgG와 함께 90분간 인큐베이트한다.

또한, 1차 항체의 후, 세포를 비오틴 결합 토끼 항염소 IgG(2％ 인간 혈청 및 0.01％ 사포닌을 함유하는 블록킹 완충액으로 500배 희석)와 함께 실온 암소에서 90분간 인큐베이트한다. 그 다음에 0.01％ 사포닌이 함유된 HBSS_mod로 2회 세정한 후, 9 ㎍/mL 스트렙타비딘/Cy5 결합체의 0.01％ 사포닌/HBSS_mod 용액과 함께 실온의 암소에서 90분간 인큐베이트한다. 마지막으로 세포를 HBSS_mod로 2번 세정한 후, HBSS_mod으로 재부유시킨 후, 50㎛의 체로 여과하고, 분성을 위하여 세포 덩어리를 제거하여 플로우 사이트메트리에서 소팅한다.

간 전구세포를 선택하는 것을 의도하는 경우, 면역선택은 다배체인 세포 및/또는 적혈구 상의 글리코포린 A와 같은 간장으로부터의 성숙 조혈세포에 관련한 마커를 발현하는 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 또한, 모든 성숙 조혈세포에 발현되는 CD45를 나타내는 세포: 모든 간세포와 담즙관 세포에서 관찰되는 코넥신 32와 같은 성숙 간장 세포에 관련한 마커를 나타내는 세포; 그리고 간장 성상 세포의 레티노이드 또는 내피의 윌레브랜드(Willebrand) 인자 또는 제 Ⅷ 인자와 같은 성숙 간엽 세포에 관련한 마커를 나타내는 세포는 모두 제거된다.

실시예 9

소팅된 세포 집단의 면역조직 화학 염색

세포를 분석한 후, 알파-페토프로테인에 관하여 염색하고, 플로우 사이토메트리에 의한 소팅을 행한다. 소팅된 세포의 구획을 1％ BSA를 함유하는 0.3％ HBSS-mod에 회수한다. 연구실에 돌아왔을 때, 채취한 샘플의 용적을 0.5×10⁶개/mL가 되도록 조정하고, 그의 200 μL를 샤돈(shadon) 사이토스핀(cytospin) 장치에 의해 현미경용 슬라이드 유리상에 원심한다. 사이토스핀 슬라이드 조제물은 풍건시키고, 알파-페토프로테인 및/또는 알부민에 관하여 후에 염색하기 위해 보존한다. 현미경용 슬라이드 유리 위에 접착된 "원판상"의 세포를 면역조직 화학적 시약을 적용하기 위해 "웰(well)"을 형성하도록 라버 댐(rubber dam)으로 환상으로 한다. 슬라이드 유리를 0.3％ 트리톤 X를 함유하는 트리스 완충액(pH 7.4, 0.9％ 염화나트륨을 가한 저염)에서 10분간 적신 후, 저염 트리스만으로 10분간 적신다.

다음에, 세포를 위에서 설명한 연골 물고기 겔 블록킹 용액에 함유되어 있는 10％ 토끼 혈청 중에서 실온에서 90분간 블록킹한다. 저염 트리스로 2회 세정한 후, 2％ 토끼 혈청을 함유하는 블록킹 완충액으로 100배 희석한 염소 항인간 AFP 항체로 4℃에서 밤새도록 인큐베이트한다. 트리스 완충액으로 2회 세정한 후, 실온에서 블록킹 완충액 내에서 비오틴 결합 토끼 항염소 IgG(200배 희석)와 함께 90분간 인큐베이트한다. 스트렙타비딘/AMCA 복합체(9 ㎍/mL 저염 트리스 완충액 용액)와 최종적인 인큐베이션을 이용하여 AMCA 형광색소와 비오틴 결합 토끼 항체의 결합을 통해서 AFP-like 면역반응성을 특정한다. 트리스 완충액으로 2회 세정한 후, 세포 조제물을 거의 건조시키면서, 퇴색 방지제 함유 배지(n-프로필 갈레이트 0.25 g의 5.7g 글리세롤과 PBS 용액 1mL)를 가하여 커버 유리를 올려놓는다. 적당해지면, 알부민에 대한 텍사스 레드(Texas red) 결합 토끼 항인간 항체 세포를 1차 항-페토프로테인 항체와 함께 함유시켜 세포를 알부민에 관하여 2회 염색한다.

항 알파 단백질 항체 또는 비오틴 결합 2차 항체의 어느 하나가 존재하지 않는 경우에는 세포의 AMCA 표지는 없다는 것을 증명하기 위하여 1차 또는 2차 항체의 생략함으로서 대조 슬라이드를 조제한다. 청색(450 nm) 영역에서 광을 방출하는 AMCA 색소의 UV 여기(勵起)를 이용하여 슬라이드 유리를 에피형광(epifluorescence) 현미경으로 조사한다.
실시예 10
세포 치료 및/또는 유전자 치료.
인간의 유로키나아제 플라스미노겐 활성화 인자(uPA)는 종을 초월하여 플라스미노겐을 활성화할 수 있기 때문에, RSV-LTR 프로모터로부터 인간의 유로키나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터인 Ad-RSV-uPA를 간 재생을 유도할 목적으로 구축된다. 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축 및 생산에 관하여는, 인간의 uPA의 cDNA를 다음과 같이 준비한다.
단백질 코드 배열을 포함하는 1.326 kb의 HindIII/Asp718 uPA 단편을 Rous Sarcoma Virus LTR(RSV) 프로모터의 전사 제어 하에서 pXCJL.l의 Hindill/Asp718 부위에서, 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 시그널의 상류에 삽입한다. 바이러스는 pJMI7과 Ad-RSV-uPA로 불리는 벡터와 동시 트랜스펙션 후 조제한다. Ad-RSV uPA의 스크리닝은 293 세포의 개개의 플라크의 증폭에 의해 행해진다. 감염 3일 후, ELISA에 의한 면역 반응성 uPA 및 피브린 플라크 앗세이에 의한 섬유소 용해 활성에 관하여 상청을 시험하여, Ad-RSVuPA 감염으로 uPA의 촉매 활성이 생산된 것을 증명한다. 정제 바이러스를 -80℃에서 등분하여 보존하고, HGDMEM 배지로 신선하게 희석하여 주입한다. 바이러스의 역가는 OD측정과 표준 플라크 앗세이에 의해 결정된다. 벡터의 구축은 본질적으로 미국특허제 5,980,886호에 기재된 바와 같이 실시한다. 바이러스 역가는 208F세포에 의해 측정된다.
5∼6주령 C57BL/6 암컷 마우스(잭슨 Laboratories, Bar Harbor, ME)를 특정의 병원체를 함유하지 않는 환경에서 수용한다. 다양한 시간에서의 허혈성 간장 샘플을 안락사 마우스로부터 얻고, 간 전구세포는 전술한 바와 같이 분리된다. 문맥에 삽관하기 위해서, 레시피언트 마우스를 20 mg/mL 2,2,2-Tribromoethanol 0.5 mL의 복막내 투여에 의해 마취된다. 정중 개복을 하여 문맥을 폭로한다. 실리콘 튜브(내경 0.02인치, 외경 0.037인치, S/P 의료용, Baxter, 111)를 문맥에 삽입하고, 헤파린이 첨가된 식염 액으로 환류된다. 그 후, 캐뉼러를 복막으로 관통되어 4.0의 견 봉합사로 봉합한다. 길이 3 cm의 캐뉼러를 말단에 묶고, 앞에서 만든 포켓 내의 피하에 유치한다. 마우스에 24시간 후에 바이러스 감염 전구세포를 투여한다. 마우스에 따라서는, 문맥 삽관은 2/3 간 절제술과 함께 실시한다. 그런 다음, 부분적인 간 절제를 행한다. 문맥을 환류하기 위해서 마우스를 마취하여, 이미 존재하고 있는 복부 절개부의 가까운 부위에서 피부를 절개한다. 캐뉼러를 폭로하여 시린지 펌프에 연결한다. 바이러스 주입을 위해서, DMEM의 아데노바이러스의 조제물을 캐뉼러를 통해 문맥에 5∼10분에 걸쳐서 주입한다.
모든 생화학 및 조직학적 분석은 캐뉼러를 통해 문맥 중에 아데노바이러스 감염된 간전구세포를 실시한다. uPA에 관한 ELISA 앗세이는 uPA의 촉매 및 수용체 결합 도메인에 대하여 만들어진 2개의 다른 모노클로날 항체에 의한다. 하나의 모노클로날 항체를 과산화효소로 표지한다. 혈청 총 단백질 및 알부민은 임상 병리학 연구소의 루틴한 자동 방법에 의해 분석한다. C57BL/6 마우스의 문맥으로 아데노바이러스의 주입은 하나의 세포에 아데노바이러스 DNA 1 카피(copy) 이상을 가지는 간세포를 100％의 형질도입(transduction)하는 것이 알려져 있다. 동일 용량의 Ad-RSV uPA를 이용하면, 사망률은 90％로 되고, 적어도 일부는 출혈에 관련된다. Ad-RSV uPA의 더 적은 양을 사용하면, 사망률은 5％ 미만으로 되고, 이 용량은 간 재생 실험을 위해서 선택된다. Ad-RSV uPA의 주입에 의해 4일 뒤에 약 350 ng/mL(내인성 레벨보다 70∼100배 높다)의 피크 치에 도달하는 혈청 유로키나아제의 일과성 상승을 일으키고, 그 후, 12일까지 백그라운드 농도로 저하한다. uPA의 상승은 혈청 SGPT 농도의 증가에도 관련이 있다. 아데노바이러스 주입 후 다양한 시간에 있어서, 동물에 ³H-티미딘을 주입하고, 세포 증식을 정량하기 위한 수단으로 간장 DNA에 들어간 방사 활성의 양을 측정한다. Ad-RSV-uPA 처리된 동물은 3일부터 시작되어 8일간 지속한 티미딘 흡수의 기간에 증가했다. 이와 같이, Ad-RSV-uPA/oval 세포 처치로 간의 ³H-티미딘 흡수 기간은 부분 간 절제술에 의해 얻어진 경우보다 훨씬 크다. 음성 대조 아데노바이러스의 레시피언트는 4일째에 간의 ³H-티미딘 흡수 피크를 나타내고, 이것은 24시간 후에 기준치 레벨로 돌아오고, 11일째에 ³H-티미딘 흡수의 최소 상승을 나타낸다. 요약하면, SGPT 레벨에 의해 측정한 간 손상과 높은 비율의 ³H-티미딘 흡수율은 간장내 유로키나제 생산에 원인이 되고, 유의한 간생합성적 재생이 일어나는 것을 나타낸다. uPA 없이 주입된 간 전구세포가 uPA 삽입 없는 아데노바이러스보다 더 양호하다.
심장 사체 제공자 유래의 재조합 아데노바이러스/전구세포에 의해 처치된 동물로부터의 현미경 조직학적 발견으로부터 3일까지 처치된 마우스가 마크로파아지 및 호중구를 포함한 중등도의 염증성 침윤물을 갖는 것을 나타낸다. 간세포의 변성적 변화는 액포화(vacuolization), 핵농축 및 적은 분열핵을 포함한다. Ad-RSV uPA/oval 세포 투여 8∼10일 후, 다수의 소상 재생, 다양한 크기의 핵, 및 소수의 변성 간세포에 의한 크게 감소한 염증 반응을 포함한 간장 회복의 증거가 나타난다. 3∼4주에 침윤물은 분해하여, 간장은 정상적으로 보인다.
전체적으로 이러한 시험에 의해 간 전구세포와의 조합에서 유로키나아제 발현이 유의한 간 실질 세포 재생을 유도하는 것이 증명된다.
실시예 11
퍼콜 원심분리에 의한 데벌킹
이 실시예는 간 줄기 세포, 비전구세포 및 전구세포를 포함하는 간 전구세포의 농축방법을 제공한다. 이들 기술의 변종은 당업자에 공지이며, 더욱이 이들이 전구세포의 농축된 집단을 제공하기 위한 간세포 현탁액을 데벌킹하는 목적에 합치하는 한 같은 정도로 적합하다.
예를 들면, 이글 기본배지(BME)와 같은 배지중의 간세포의 실질적으로 단일의 세포 현탁액을 BME 중에 조제한 15％ 퍼콜 층의 상층에 적용된다. Sorvall RT7 원심분리기 및 14 cm의 로터 또는 기타 동등의 로터 윈심분리기 조합을 이용하여, 구배가 600∼1200 rpm, 바람직하기로는 750∼1000 rpm으로 10분간 원심분리한다. 상층액은 회수하고, 다시 1200∼2000 rpm으로, 바람직하기로는 1500rpm으로 다시 원심분리한다. 상청 획분은 전구세포가 농축되어 있고, 침강물(분획 3)은 적어도 하나의 세포 주기가 가능한 세포를 포함한다. 상청 세포는 따로 회수하고, 2000∼3000 rpm, 바람직하기로는 약 2500 rpm으로 다시 원심분리했다. 이러한 후자 원심분리에서, 전구세포는 퍼콜의 상부에 침강하는 것이 많고, 이 상부에는 세포 파쇄편이 잔류하고 있으며, 더욱이 침강물에는 수회의 유사분열 사이클이 가능한 세포를 포함하고 있다. 퍼콜 획분은 즉시 사용하는 것, 동결 보존, 배양의 확립 또는 한층 더한 농축에 적절하다. 한층 더한 농축은 패닝법, 친화성에 의한 선택, FACS 소팅 또는 당해 분야에 공지이거나, 앞서 설명한 기술의 어느 하나에 의해 달성된다. 음성 선택은 CD45, 글리코포린 A 또는 후술하는 다른 마커를 발현하는 세포의 제거에 의해 달성된다. 양성 선택은 CD14, CD34, CD 38, ICAM 또는 다른 전장의 알파-페토프로테인, 알부민 또는 이들 양자의 발현을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 선택에 의해 이루어진다.
실시예 12
용출에 의한 전구세포의 조제
이 실시예는 간 전구세포 및 간 비전구세포를 분리하는 단계를 제공한다. 다양한 기술이 당해 기술분야에 공지되어 있으나, 바람직한 태양의 하나는 상세히 설명되어 있으나, 타른 조제기술도 소망의 목적에 합치하는 한, 같은 정도로 적합한 것으로 이해된다. 예를 들면, 바람직한 한정적이지 않은 기술은 예로 들어 본 명세서에 참조로 하여 넣은, 미국 특허 제5,807,686호, 동제5,916,743호, 동제5,672,346호, 동제5,681,559호, 동제5,665,557호, 동제5,672,346호 및 동제5,663,051호를 참조할 것.
다능성 또는 간장의 작은 간 전구세포는 퍼콜 또는 히스토패쿠(Histopaque) 등의 적당한 밀도 구배의 어느 하나를 이용하여 예비적으로 분리되고, 원심분리 후 배지로 2회 세정하고, 용출 배지 10 mL 중에 재현탁할 수 있다. 항류 용출에 대해서는 세정된 작은 단핵세포를, JE-5 로터 및 표준 챔버를 갖추고 있는 Beckman J6M/E 원심분리기의 유입구에 샘플링 채취부위 연결기를 통해 주입된다. 그러나, 임의의 많은 시판 연속적 유출 원심기 및 밀도에 의해 분리를 촉진하기 위한 수단인 챔버를 포함한 일회용 플라스틱제 유입구를 사용하는 것이 바람직한 용출장치에서, 예를 들면 Deerfield, IL의 Baxter International Inc. 판매의 "Fenwal Models CS 3000" 및 "Autopheresis C"; 또는 Lakewood, CO의 Cobe manufacturing 판매의 Spectra Apherisis v 7/6 등을 사용할 수 있다. 장치의 선택은 당업자에 의해 결정된다. 연동 펌프(Cole Palmer Instruments, Chicago, IL)에서 100 mg/da의 D - 글루코오스, 0.3 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 디나트륨(EDTA) 및 50 mg/dl의 소 혈청알부민을 함유하는 0.9％의 통상의 생리 식염수로 pH 7.2로 조절한 것인 용출용매체인 완충액을 연속적으로 흘려보낼 수 있다. 이 완충액은 사용 전에 멸균한다. 세포를 15 mL/분, 로타 속도 900 g 및 실온에서 흘려보낸다. 용출액 100mL를 회수한 후 유속을 25 mL/분으로 올린다. 로터 속도는 일정하게 유지하면서, 유속은 29 mL/분, 33 mL/분 및 37 mL/분으로 순차적으로 올릴 수 있으며, 각각의 증가한 유속에서 200 mL를 회수한다. 챔버에 남아있는 세포를, 로터를 역으로 하고, 용출액 100 mL에서 챔버를 세정하여 회수한다. 각 세포 획분을 세정하고, 300 g에서 10분간 원심분리했다. 적당한 획분을 회수하고, 트립판 블루 색소 배제 시험에 의해 생존율을 결정하고, 또한 세포 회수율을 세포 카운터(Coulter Electronics, Hialeah, FL)로 결정한다.
혹은 간장 세포는 밀도 구배 분리에 의해 분리되지 않아서, 5％의 소태아 혈청, 0.01％(w/v) EDTA 및 1.0 g/l D - 글루코오스를 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)중에 현탁하고, 다시 10℃에서 로터 속도 1,950 rpm에서 JA-17 로터 및 표준 분리 챔버(Beckman Instruments)를 사용하는 Beckman 향류 윈심 용출 시스템에 주입하고, 또한 시료는 12∼14 mL/분 사이에서 용출한다.
적당한 획분에서 얻어진 세포는 일반적으로 세포직경이 5∼15미크론, 바람직하기로는 8.0∼9.4 미크론을 가지며; 대부분의 세포는 직경이 8.3∼9.2 미크론의 범위 내에 있다. 이들 직경은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 측정한다. 필요에 따라, 다시 세포 마커에 기초한 추가적인 음성 또는 양성 선택이 수행된다.
당업자에 공지된 다양한 다른 항체는 단독으로 또는 간 전구세포 마커와 조합하여 이용할 수 있다. 이 선택은 분리 또는 농축되는 것이 바람직한 세포의 종류에 의해 결정되며, 더욱이 조혈계 및 림프계의 항원에 특이적인 항체와 같은 아래의 것이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다: T세포에 특이적인 항-CD2, 항-CD2R, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD5 및 항-CD8; T세포 부분집단 및 B세포 부분집단에 특이적인 항-CD6; 주요 T세포 부분집단에 특이적인 항-CD7; 항-CD 12, 항-CDl9 및 B세포에 특이적인 항-CD20, 항CD72, 항-CDw78; 단구에 특이적인 항-CD13 및 항-CDl4; 내츄럴 킬러 세포에 특이적인 항-CDl6 및 항-CD56; 혈소판에 특이적인 항-CD41; 흉선 피질세포 및 랑게르한스 세포에 특이적인 항CD1a, CD1b 및 CD1c; pre-B세포, 단구 및 혈소판에 특이적인 항-CD9; 림프 전구세포, C-All 및 과립구에 특이적인 항-CD10; 백혈구에 특이적인 항-CD 11a; 과립구, 단구 및 내츄럴 킬러 세포에 대한 항-CD 11b; 단구, 과립구, 내츄럴 킬러 세포 및 털세포성 백혈병에 특이적인 항-CD 11c; 과립구에 특이적인 항-CD15; 과립구, 단구 및 혈소판에 특이적인 항-CDwl7; 백혈구에 특이적인 항-CD18; 성숙 B세포에 특이적인 항-CD21; B세포 혈장 및 성숙 B세포에 특이적인 항-CD22; 활성화된 B세포에 특이적인 항-CD23; B세포 및 과립구에 특이적인 항-CD24; 활성화된 T- 및 B세포 및 활성화된 마크로파아지에 특이적인 항-CD25 및 항-CD26; 주요 T세포 부분집단에 특이적인 항-CD27 및 항-CD28; 활성화된 T- 및 B세포 및 Sternberg Reed 세포에 특이적인 항-CD30; 혈소판, 단구/마크로파아지, 과립구 및 B세포에 특이적인 항-CD31; 마크로파아지, 과립구, B세포 및 호산구에 특이적인 항-CDw32; 단구, 골수 전구세포 및 골수 백혈병에 특이적인 항-CD33; 조혈 전구세포에 특이적인 항-CD34; 과립구, 단구, B세포, 일부의 NK세포 및 적혈구에 특이적인 항-CD35; 단구/마크로파아지 및 혈소판에 특이적인 항-CD36; 성숙 B세포에 특이적인 항-CD37; 플라즈마 세포, 흉선 세포 및 활성화된 T세포에 특이적인 항-CD38; 성숙한 B 세포에 특이적인 항-CD39; B세포 및 암에 특이적인 항-CD40; 혈소판 및 거핵구에 특이적인 항-CD42 및 42b; 순환 B세포 이외의 백혈구에 특이적인 항-CD43; 백혈구 및 적혈구에 특이적인 항-CD44; 백혈구에 특이적인 항-CD45; T세포, B세포 부분집단, 단핵구 및 마크로파아지에 특이적인 항-CD45RO; B세포, 단핵구 및 T세포 부분집단에 특이적인 항-CD45RA; B세포, T세포 부분집단, 단핵구, 마크로파아지 및 과립구에 특이적인 항-CD45RB; 조혈 및 비조혈 세포에 특이적인 항-CD46, CD55, CD58 및 CD59; 모든 형태의 세포에 특이적인 항-CD47; 백혈구 및 호중구에 특이적인 항-CD48; 혈소판 및 활성화되고 장기간 배양된 T세포에 특이적인 항-CDw49b; 단구, T세포 및 B세포에 특이적인 항-CDw49d; 혈소판 및 거핵구에 특이적인 항-CDw49f; 백혈구에 특이적인 항-CDw50 및 CDw52; 혈소판에 특이적인 항-CD51; 보통 및 종양 플라즈마 세포를 포함한 백혈구에 특이적인 항-CD53; 내피세포에 특이적인 항-CD54; T세포 부분집단 및 혈소판에 특이적인 항-CDw60; 혈소판 및 거핵구에 특이적인 항-CD61; 활성화된 혈소판에 특이적인 항-CD62; 활성화된 혈소판, 단구/마크로파아지에 특이적인 항-CD63; 단핵구(상향 조정된 인터페론γ)에 특이적인 항-CD64; 과립구 및 단구에 대해 이질적 반응에 특이적인 항-CDw65; 과립구에 특이적인 항-CD66 및 67; 단구 및 마크로파아지에 특이적인 항-CD68; 활성화된 B- 및 T-세포, 활성화된 마크로파아지 및 내츄럴 킬러 세포에 특이적인 항-CD69; 활성화된 T- 및 B세포, Sternberg-Reed 세포 및 미분화 큰 세포 임파종에 특이적인 항-CDw70; 활성화된 T- 및 B세포, 마크로파아지, 증식세포에 특이적인 항-CD71; B세포 부분집단 및 T세포 부분집단에 특이적인 항-CD73; B세포 및 단구/마크로파아지에 특이적인 항-CD74; 성숙 B세포에 특이적인 항-CDw75; 성숙 B세포 및 T세포 부분집단에 특이적인 항-CD76; 난포성 중심 B세포에 특이적인 항-CD77; 사이토카인 및 증식 인자(예를 들면 IL1-IL13, EGF, IGF Ⅰ 및 Ⅱ, TGF-α 및 β, TNF-α 및 β, FGF, NGF, CIF, IFN-α 및 β, CSF's)에 대한 항체; 바이러스 항원(예를 들면 Hepatitis B 바이러스 엔벨롭 단백질 또는 HIV 엔벨롭 단백질), 호르몬, 세포 또는 종양 관련 항원 또는 마커, 접착 분자, 지혈 분자 및 내피세포이다. 다른 마커 및 농축 법은 예를 들면, 미국 특허 제 5,840,502호에 개시된 바와 같이 동일하게 적합하다.

실시예 13

고성능 바이오리액터(HPBR)를 인간 간세포의 전구세포 및 이들의 자손을 배양하는 데 사용한다. 이 방법은 의료 목적에 유용한 대량의 세포를 제공하거나 또는 바이오리액터 그 자체로 생물학적으로 유요한 세포 분비 단백질, 및 인자를 제조 유닛 공급한다. 이들 단백질과 인자는 당해 기술분야에 공지의 많은 인자 중에서도 특히, 간세포 증식 인자(HGF), 인슐린-유사 증식 인자 Ⅰ 및 Ⅱ(IGF-Ⅰ 및 Ⅱ), 상피 증식 인자(EGF), a형 및 b형 트랜스포밍 증식 인자(TGF-α 및 TGF-β), 신경 증식 인자(NGF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 혈소판 유래 증식 인자(PDGF), 육종 증식 인자(SGF), 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 증식 인자(GMCSF), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 프로락틴 및 성장 호르몬 방출 인자(GHRF) 및 인터루킨(IL) IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11 등과 같은 각종 조혈 증식 인자, 적혈구 분화 인자(EDF) 또는 난포 자극 호르몬 방출 단백질(FRP), 인히빈, 줄기 세포 증식 인자(SCPF) 및 이들 단백질의 활성 단편, 서브유니트, 유도체 및 조합을 함유하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 본 명세서에서 사용되는 이들 세포인자들은 사이토카인, 림포카인, 인터루킨, 콜로니- 자극 인자, 호르몬, 주화성 인자, 항주화성 인자, 응혈 인자, 혈전용해 단백질, 보체 단백질, 효소, 면역 글로불린, 항원으로 이루어진 군에서 선택된 분비 단백질을 의미한다. 이와 같은 생물학적 활성 단백질 중에서, 당업자는 Factor Ⅷ, Factor Ⅸ, Factor Ⅶ, 에리스로포이에틴, 알파-1-안티트립신, 칼시토닌, 증식 호르몬, 인슐린, 저밀도 리포단백질, 아포리포단백질 E, IL-2 수용기 및 그의 길항제, 과산화 디스무타제, 면역 반응 변형자. 파라티로이드 호르몬, 인터페론(IFN 알파, 베타, 감마), 신경 증식 인자, 글루코세레브로시다제, 콜로니 자극 인자, 인터루킨(IL) 1∼15, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구, 마크로파아지-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 마크로파아지- 콜로니 자극 인자(M-CSF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 혈소판-유래 증식 인자(PDGF), 아데노신 디아미나제, 인슐린 유사 증식 인자(IGF-1 및 IGF-2), 거대 핵세포 촉진 리간드(MPL), 트롬보포이에틴 또는 이들의 조합을 선택할 수 있다.

이 특정의 바이오리액터에서의 세포증식 프로토콜에 제한은 없지만, 당해 분야의 주지의 프로토콜도 동등하게 적용될 수 있고, 본 명세서에 참조 넣은 공개된 미국 특허 제6,001,585호; 동제5,998,184호; 동제5,846,817호; 동제5,622,857호; 동제5,571,720호; 동제5,563,068호; 동제5,512,474호; 동제5,443,985호; 동제5,342,781호; 동제5,330,915호; 동제5,320,963호; 동제5,202,254호; 동제4,833,083호; 및 동제4,760,028호로부터 용이하게 채용할 수 있다.

본 장치는 450 10kD 셀룰로오스 섬유소 540 폴리프로필렌 섬유소를 함유하고, 다른 파라미터의 상세는 예를 들면, 본 명세서에 참고로 넣은 미국 특허 제5,622,857호에 개시되어 있다. 세포는 상기에서 언급한 바와 같이 분리된다. 모든 필요한 재료는 Sigma Chemical Co. 또는 Life Technologies로부터 입수할 수 있다. 장기간 배양용 배지를 위한 부착 배지는 다음과 같다: RPMI 1640(500 mL); 50mL (10％)FBS; 4mM L-글루타민; 1×페니실린/스트렙토마이신; 겐타마이신; 15mM HEPES; 10mU/mL 인슐린; 10 mU/mL 트랜스페린; 셀레늄. HPBR 시스템은 부착배지를 적용하기 전에 하루 동안 배지로 흘렸다. 미리 팽윤시킨 사이토덱스 3 미세 캐리어(Preswollen Cytodex 3 micro carriers) 500 mg을 HPBR의 내측 고리 모양 스페이스에 접종하였다. 산소공급기 파이버는 미세 캐리어를 지지하고, 이들이 ECS를 통해 분배되는 것을 막았다. 생존 능력이 있는 인간 간 전구세포도 내측 고리 모양 스페이스에 접종하고, 이 장치는 잠그고, 세포 및 미세 캐리어가 잘 혼합되도록 수동으로 회전시켰다. 전구세포 및 자손세포는 10∼20 ㎛ 지름으로 추정되는 경우에는 세포 대 미세 캐리어 접종비는 약 500이다. 세포와 미세 캐리어의 점도는 급격히 상승하며, 이는 세포 대 미세 캐리어 및 세포 대 세포 부착이 빨리 진전됨을 나타낸다. 이 혼합 2∼3분 이내에 세포 및 미세 캐리어의 분리된 겔은 내측 고리 모양 스페이스에서 형성되었다. 부착 배지(정지한 상태에서)에서 37 ℃중 하룻밤 인큐베이트한 후, 배지를 장기 배양 배지(2L)로 바꾸었다. 이들 부피는 제한이 없으며, 당분야의 기술을 가진 자는 원하는 대로 생산을 조절한다. 간세포는 이 시스템에 사용되는 신선한 배지로 매주 가하면서, 5주 동안 배양한다. 세포의 신진대사 기능은 매일 샘플을 시험하여 모니터한다. 5주 후, 생육 능력이 있는 세포 및 미세 캐리어의 90％ 이상의 회수가, 하기 절차에 의해 달성된다: PBS를 용매로 하는 0.1 ％ 콜라게나제와 0.44 mL(0.23 M)EDTA의 혼합액을 사용하여 ECS를 세정하고, 또한 HPBr을 10분간 인큐베이션한다: ECS의 내용물을 주사기로부터 멸균 공기와 함께 분출한다; 이 방법은 장기 배양 배지로 사용하여 반복하고, 또한 재료를 회수하고 세정하고, 분리한다.

HPBR은 세포배양 및 유전자 형질전환(예를 들면, HGF 유전자 발현)에 동일하게 적당하다. 이하에 부착 의존 세포(SW 480 P3; ATCC #CCL228)에 관한 유전적 비바이러스 프로토콜이고, 이것은 당업자에 의해 배양 웰 및 배양 접시를 이용하는 공개된 수순으로부터 적절하게 개변 및 최적화할 수 있다. 10 kD 성질을 갖는 중막 선유의 성질이 HPBP에서 바람직하다. 이 바이오리액터는 전술한 방법과 거의 동일하게 조작된다. Cytodex 1 미세 캐리어(Pharmacia 제조, Sigma Chemical Co. 판매)는 부착 의존성 세포의 배양에 널리 사용된다. 세포 밀도가 광범위, 즉, 1×10⁴∼1×10⁵개의 세포 또는 원한다면 더 높은 범위로 HPBR의 ECS로 접종된다. 여기서 추천하는 세포대 미세 캐리어의 접종 비는 약 10이지만, 당업자는 소망의 경우에는 변경할 수 있다. 이 장치는 약 10 cpm(또는 그 이상)에서 천천히 회전시키고, 약 하루(또는 그 이상, 특정 세포에 따라 결정) 동안 세포를 배양한 후, 최적의 집밀도에 도달하여 유효한 트랜스펙션을 얻는다. 세포 대 미세 캐리어의 접종비는 적극적으로 그의 치료 시간 프레임 및 경제적 효율에 영향을 주도록 조절될 수 있다. 트랜스펙션 당일에 DNA 플라스미드 용액(pCMV) 및 양이온 리피드 용액(LIPOFECTIN Reagent, Life Technologies)을 조제한다. 이 시약은 전공정이 혈청의 존재를 필요로 하는 경우이어도, 혈청을 함유하지 않아야 한다. DNA 및 리피드 용액의 적당량을 혼합하고, 이 혼합물을 장치의 ECS에 주입한다. 트랜스펙션 2, 3시간 후(또는 수시간 후인 것도), 적절한 경우에는 혈청의 사용을 재개하고, 다시 전술한 바와 같이, 세포 배양을 거의 2, 3일간 계속한다. 영속적인 형질 변환된 세포를 증식하는 경우, 보다 장기간에 행한다. 전술한 방법과 동일한 방법으로 세포를 회수한다.

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시험예 14

인공 간

당분야에서의 전문가들은 상기 실시예를 확대함으로써, 체외의 간 유지 시스템으로서의 바이오리액터를 용이하게 채용할 수 있다. 이종이식(종 사이의 장기이식)은 동물 장기를 사용함으로서 기증 간 부족을 경감시키는데 도움을 준다. 그러나, 동물장기를 인간에게 이식하는데 있어서의 잠재적인 위험은 공여되는 동물에 감염되어 있는 바이러스가 레시피언트에 감염되는 것이다. 장기이식 레시피언트는 면역체계를 억제하고, 장기의 거부반응을 방지하기 위하여 약물을 복용하여야 하기 때문에, 이들은 감염되어 있는 동물 바이러스의 감염을 막는 것이 불가능하다. 더욱 놀라운 시나리오로서, 동물바이러스는 감염된 숙주에서 정상적인 면역 시스템을 갖는 보균자에 감염시킬 수 있는 형태로 돌연 변이할 것이다. 따라서, 새로운 병원성 인간 바이러스가 생길 수 있다. 인간 장기이식에 사용되는 바람직한 동물은 돼지와 영장류이다. 그러나, 인간 세포에 기초한 인공 간을 사용할 수 있다면, 그것은 동물 간보다 더 바람직하다는 사실이 명백하다.

소망의 배양시간이 경과한 후, 간 전구세포의 농축집단 유래의 증식 간세포 및/또는 담즙관 세포가 얻어진다. 통상, 20∼50억개의 생존력이 높은(80％ 이상) 세포가 얻어진다. 일반적으로 사용되는 배지는 호르몬을 첨가한 웨이마우스(Waymouth) 배지이다. 20∼50억개의 세포를 수용하기 위하여, 이 바이오리액터를 각각 내경 40mm, 높이 100mm의 최대 2개의 폐쇄 용기로 규모를 확대한다. 이러한 특정 환경에서 각 용기에 직경 약 2mm, 총용적 250㎖의 유리 비드를 사용한다. 배지는 재순환 속도 360 ㎖/분로 공급된다. 간세포의 높은 생존율은 안정된 산소 소비율에 의해 증명된다. 이어서, 바이오리액터를 완전한 간부전을 위한 수술에 의해 간 적출한 무간 사람 레시피언트에 장착된다. 마찬가지로, 바이오리액터를 간기능 부전의 인간에게 장착된다. 당업자는 체외의 간 유지 시스템으로서 바이오리액터를 장착하는 수순을 알고 있거나 또는 예를 들면, 본 명세서에 참고로 기재한 미국특허제6,008,049호, 동제5,981,211호, 동제5,976,870호, 동제5,891,713호, 동제5,827,729호, 동제5,643,794호, 동제5,622,857호, 동제5,605,835호, 동제5,270,192호의 실시예로 개시된 바와 같이 당해 기술분야에서 공지의 대체수단을 알고 있을 것으로 생각된다. 공여 인공 간세포는 반드시 인간에게만 한정되지 않으며, 또한 이러한 세포를 종을 초월하여 이용할 수 있다는 사실이 상기 참조문헌으로부터 입증된다. 예를 들면, 돼지 또는 영장류의 간세포의 사용은 인간에게 있어서도 적합하다. 본원발명의 방법과 구성은 세포치료 또는 체외 간 치료에 사용하기 위한 인간 간세포의 조제를 가능하게 하는 것도 부수하는 모든 이점도 함께 명백하다.

좌측 대퇴부 동맥에서 나온 혈액은 민테크사(Minntech) 혈액농축장치로 보내진다. A12 프린지의 튜브를 대퇴부 동맥에 삽입하고, 혈액농축장치에 대한 1/4인치 PVC 튜브에 연결하였다. 혈액농축장치는 혈액을 세포를 함유하지 않는 한외여과 여액획분 및 혈구획분으로 분리한다. 혈구획분은 동일한 튜브를 사용하여 대퇴부 정맥으로 되돌린다. 한외여과 여액은 1/4인치 PVC 튜브를 통해 혈액농축장치에서 배출되고, 또한 회전 펌프를 사용하여 조절된 유속 40㎖/분에서 간세포 바이오리액터 시스템으로 보내졌다. 바이오리액터를 통한 환류 후에, 한외여과 여액은 좌측 경정맥을 통해 환자에게 되돌린다. 체외의 간 물질대사 공급량을 나타내기 위하여, 간에서 대사된다고 알려져 있는 2개의 다른 화학물질, 7-에톡시쿠마린과 리도카인을 바이오리액터의 입구에서 한외여과 여액에 투여된다. 각각의 대사물인 7-OH-쿠마린과 모노에틸글리신엑실리디드(MEGX)를 한외여과 여액이 환자에게 되돌리기 전에 바이오리액터 배출구에서 측정된다. 7-에톡시쿠마린 및 리도카인의 양방의 유의한 대사량이 관찰된다. 따라서, 이들 결과는 체외 간 대사를 제공하는 유지시스템으로서 바이오리액터의 적용을 나타난다. 혈장으로부터 혈구를 분리하는 것은 외래 간세포에 대한 레시피언트의 면역 반응을 최소화한다. 따라서, 간 전구세포와 그의 자손세포는 체외의 간 유지를 제공하는 바이오리액터에서 유용하다.

시험예 15

엑손 1-코드된 펩티드와 항원으로서의 사용

알파-페토프로테인의 엑손 1에 대응하는 짧은 펩티드를 이용하여, 특이적 항체를 이용하여 발현을 평가함으로써 다양한 세포계통에 있어서 알파-페토프로테인을 명백히 구별하는데 이용된다. 엑손 1-코드된 펩티드 배열은 다음과 같다:

삭제

배열번호: 14 MKWVESIFLIFLLNFTESRTLHRNEYGI

이들 아미노산은 또한 ABCDEFGHIJKLMNOPRSTUVWXYZ와 같은 알파벳 문자열로 표시될 수 있으며, 여기서 이 문자열의 문자 A는 펩티드의 M, K, W, V, E, S, I, F, L, I, F, L, L 또는 N에서 시작된다. 엑손 1-코드된 배열에서 길이가 4∼12의 아미노산 잔기인 펩티드가 거대 분자와 결합하여 항원을 작성한다. 이 펩티드는 임의로, 길이 2∼8의 탄소원자의 스페이서에 의해 거대 분자와 연결할 수 있다. 당해 거대 분자는 알부민, 헤모시아닌, 카제인, 난백 알부민 또는 폴리리신이다. 바람직한 펩티드는 표의 펩티드 및 상동성이 적어도 80％ 또는 표준 아미노산 치환과 같은 그의 유사체를 포함한다. 다음의 예는 당업자가 소망의 펩티드 배열을 얻기 위해 해석하는 예이며, 길이는 특정 요구에 따른다.

A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M‥N,

A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M,

A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L,

A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K,

A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J,

A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I,

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A‥B‥C‥D‥E‥F,

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B‥C‥D‥E‥F‥G‥H,

B‥C‥D‥E‥F‥G,

B‥C‥D‥E‥F,

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C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M‥N,

C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M,

C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L,

C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K,

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C‥D‥E‥F‥G,

C‥D‥E‥F,

D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M‥N,

D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M,

D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L,

D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K,

D‥E‥F‥G‥H‥I‥J,

D‥E‥F‥G‥H‥I,

D‥E‥F‥G‥H,

D‥E‥F‥G,

E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M‥N,

E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M,

E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L,

E‥F‥G‥H‥I‥J‥K,

E‥F‥G‥H‥I‥J,

E‥F‥G‥H‥I,

E‥F‥G‥H,

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F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M,

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F‥G‥H‥I‥J‥K,

F‥G‥H‥I‥J,

F‥G‥H‥I,

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G‥H‥I‥J‥K,
G‥H‥I‥J,

H‥I‥J‥K‥L‥M‥N,

H‥I‥J‥K‥L‥M,

H‥I‥J‥K‥L,

H‥I‥J‥K,

I‥J‥K‥L‥M‥N,

I‥J‥K‥L‥M,
I‥J‥K‥L,

삭제

삭제

삭제

J‥K‥L‥M‥N,

J‥K‥L‥M,

K‥L‥N과 기타

여기에서 A‥B‥C‥D‥E‥F‥G‥H‥I‥J‥K‥L‥M 또는 N의 어느 하나는 예를 들면,

삭제

글리신 Gly G

알라닌 Ala A

발린 Val V

로이신 Leu L

이소류신 Ile I

메티오닌 Met M

페닐알라닌 Phe F

트립토판 Trp W

프롤린 Pro P

또는 극성(친수성)

세린 Ser S

트레오닌 Thr T

시스테인 Cys C

티로신 Tyr Y

아스파라긴 Asn N

글루타민 Gln Q

또는 전기적으로 (음)전하를 띠는

아스파르트산 Asp D

글루탐산 Glu E

또는 전기적으로 (양)전하를 띠는

리신 Lys K

아르기닌 Arg R

히스티딘 His H

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와 같은 비극성 아미노산(소수성)이던가, 또는 이들 아미노산이 아닌 것도 있다. 이 문자열은 그들의 허용되는 아미노산 치환 또는 그의 염을 구성할 수 있다. 가장 바람직한 아미노산 치환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe. Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, 또는 그의 역이다.

본 발명은 인간 간 전구세포의 모집단을 함유하는 인간 간 조직에서 유래된 세포 혼합물을 포함하는 성분을 제공하는 방법: 미성숙 세포 및 성숙 세포를 함유하고 다양한 크기의 혼합물을 함유하는 인간 간 조직의 단독 세포 현탁액을 제공; 미성숙 세포 및 상대적으로 크기가 작은 세포는 유지하는 반면, 성숙 세포 및 상대적으로 크기가 큰 세포를 제거하기 위한 조건하에서 현탁액을 데벌킹하여 인간 간 전구세포모집단으로 구성된 세포 혼합물을 생성하고 이들의 자손세포 또는 성숙 형태는 알파-페토프로테인, 알부민 또는 모두를 발현할 마커를 나타낸다. 인간 간 전구세포, 이들의 자손세포, 성숙 형태 또는 이들의 조합의 효과적인 양을 자극적 또는 지속적으로 투여할 수 있다. 따라서 간담관염, 간연화증, 간종대, 간경화, 섬유증, 간염, 중증 간질환, 만성 간질환, 암, 혈액 질병, 혈액 장애, 신진대사의 미성숙 등의 간질병 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

<110> UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPEL HILL <120> HUMAN LIVER PROGENITORS <150> US60/116,331 <151> 1999-01-19 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 accatgaagt gggtggaatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cctgaagact gttcatctcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 taaaccctgg tgttggccag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atttaaactc ccaaagcagc ac 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cttccatatt ggattcttac caatg 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggctaccata ttttttgccc ag 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ctacctgcct ttctggaaga ac 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gagatagcaa gaaggcatcc c 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aaagaattaa gagaaagcag cttg 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggcacaatga agtgggtaac c 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ccataggttt cacgaagagt tg 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gccagtaagt gacagagtca c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ttataagcct aaggcagctt gac 23 <210> 14 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile 20 25

Claims (44)

1. 인간 간 전구세포의 농축집단을 함유하는 조성물을 제공하는 방법에 있어서,

   (a) 인체로부터 기배출된 간장조직으로부터 단일의 세포 현탁액을 제공하는 단계;

   (b) 성숙 세포를 제거하면서 미성숙 세포를 유지하는 조건하에서 세포 크기, 부유 밀도 또는 이들의 조합에 의해 현탁액을 데벌킹하는 단계;

   (c) 데벌킹된 현탁액을 CD14, CD34, CD38, CD117, ICAM 또는 이들의 조합을 발현하는 이들 세포를 선택하는 양성 면역 선택시키던가, 또는 CD45, 글리코포린 A, 코넥신 32, 이들의 조합을 발현하는 이들 세포를 제거하는 음성 면역 선택시켜 세포 혼합물이 인간 간 전구세포의 농축 집단으로 이루어지고, 또한 알파-페토프로테인, 알부민 또는 쌍방의 발현을 나타내는 세포 혼합물이 제공되는 단계

   로 이루어진 방법.
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3. 제 1항에 있어서, 미성숙 세포가 15 마이크론 이하의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 농축 집단이 인간 2배체 간세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 데벌킹이 세포 크기, 부유 밀도 또는 이들의 조합에 의해 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 데벌킹 단계가 원심 세정 분리, 밀도 구배 원심, 패닝, 친화 크로마토그래피, 형광표지부가, 대향 액체 유동, 연속 유동 원심분리, 구역 원심분리(zonal centrifugation), 마그네틱 비드의 사용 또는 이들의 조합으로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 또한 성숙 세포의 선택적 가용화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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14. 제제 1항에 있어서, 면역선택이 알파-페토프로테인, 알부민 또는 양자를 발현하는 세포를 현탁액으로부터 선택함을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에 있어서, 전장 알파-페토프로테인(full-length alpha-fetoprotein) mRNA를 생산하는 세포를 선택함을 특징으로 하는 방법.
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40. 제 3항에 있어서, 미성숙 세포가 5∼15 미크론의 직경을 갖는 것이 특징인 방법.
41. 제 3항에 있어서, 미성숙 세포가 8∼9.4미크론의 직경을 갖는 것이 특징인 방법.
42. 인간 간 전구세포의 농축집단을 함유하는 조성물을 제공하는 방법에 있어서,

    (a) 인체로부터 기배출된 간장조직으로부터 단일의 세포 현탁액을 제공하는 단계;

    (b) 성숙 세포를 제거하면서 미성숙 세포를 유지하는 조건하에서 세포 크기, 부유 밀도 또는 이들의 조합에 의해 현탁액을 데벌킹하는 단계;

    (c) 데벌킹된 현탁액을 CD14, CD34, CD38, CD117, ICAM 또는 이들의 조합을 발현하는 이들 세포를 선택하는 양성 면역 선택시키고, CD45, 글리코포린 A, 코넥신 32, 이들의 조합을 발현하는 이들 세포를 제거하는 음성 면역 선택시켜 세포 혼합물이 인간 간 전구세포의 농축 집단으로 이루어지고, 또한 알파-페토프로테인, 알부민 또는 쌍방의 발현을 나타내는 세포 혼합물이 제공되는 단계

    로 이루어진 방법.
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