KR20080091776A - 간 기능장애 치료에 간 전구체를 이용하는 방법 - Google Patents

간 기능장애 치료에 간 전구체를 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간 기능장애 치료에 간 전구체를 이용하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 면역-억제량의 면역 억제제가 존재하지 않는 상태에서 간 기능장애 치료에 간 줄기 세포를 포함하는 간 전구체 세포를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

간 기능장애 치료에 간 전구체를 이용하는 방법{METHOD OF USING HEPATIC PROGENITORS IN TREATING LIVER DYSFUNCTION}
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2005.12.22.에 출원한 미국 가출원 제60/752,597호 기초해 우선권을 주장하고 있고, 상기 출원의 내용은 모두 본 명세서에 참조 자료로 포함된다.
본 발명은 넓게는 간 기능장애 치료에 간 전구체를 사용하는 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 간 기능장애 치료에 간 줄기 세포를 포함하는 간 전구체 세포를 이용하되 면역 억제제를 함께 사용하지 않는 방법에 관한 것이다.
전체 및 부분 간 이식의 효율은 실질적으로 호스트의 면역 반응에 의존한다(예, 이식편대 숙주병("GVHD")). 실제로, 유전적으로 비-이상적 환자들인 경우, 호스트의 몸은 수시간 내에 도너 조직을 거부할 수 있다. 이러한 잠재적 문제를 해결하기 위해, 상당한 시간과 노력이, 도너를 잠정적 호스트와 유전적으로 매칭하는데 소모된다.
그러나, 유전적으로 동일한 쌍동이가 아닌 경우에는, 심지어 최적으로 매칭된 수혜자(recipient)의 면역계 조차도 도너 조직에 대해 거부 반응을 할 수 있다. 따라서, 거의 모든 조직 이식 이후에, 이식이 지속되는 기간 동안은 아니지만, 단 기간 동안 면역 억제제를 실질적으로 사용하게 된다. 간 이식과 관련하여, 예를 들어 칼시네우린 저해제, 타크롤리무스 및 사이클로스포린이 동종이식 거부를 예방하기 위해 널리 사용되고 있다.
안타깝게도, 면역 억제제는 만능이 아니다. 첫째, 면역 억제제가 항상 효과적인 것은 아니며 정해진 스케줄에 따라 복용되어야 한다. 둘째, 이러한 약물을 장기간 사용하는 것은 환자를 세균 및 바이러스 감염에 취약하게 하여 그들의 상태를 더욱 악화시킬 수 있다. 실제로, 칼시네우린 저해제들은 콩팥 독성을 야기할 수 있고, 이식 후에 종종 장기 신부전을 일으킬 수 있다. 또 다른 장기(long-term) 부작용은 포도당 불내성 및 고지혈증을 포함한다.
따라서, 면역 반응을 일으키지 않는 동종 세포들을 이용하여 간 기능장애를 치료하는 방법이 요구된다. 또한, 면역 억제제들을 거의 또는 전혀 사용하지 않고 간세포를 이식하는 방법이 요구된다.
발명의 요약
본 발명의 일 구체예로, (a) 분리된 간 전구체들을 제공하는 단계, 및 (b) 상기 분리된 간 전구체들을 포유동물의 간 분획에 투여하는 단계를 포함하되; 상기 투여는 낮은 수준의 면역 억제제와 함께 수행되는, 포유동물의 간 분획을 재증식시키는 방법이 제공된다. 상기 투여는 이식 또는 주입에 의할 수 있다. 또한, 낮은 수준의 면역 억제제는 약 0 mg 내지 약 10 mg이다. 보다 바람직하게, 낮은 수준의 면역 억제제는 약 0 mg 내지 약 5 mg이다.
이와 같이, 당해 기술분야의 당업자는 명세서에 기재된 기술적 사상이 본 발명의 여러 목적을 수행하기 위한 별도의 구조, 방법 및 시스템을 설계함에 있어 기초로서 용이하게 사용될 수 있다는 것을 예측할 것이다. 따라서, 청구항은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 그의 균등물도 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 현재의 표준 용량을 전혀 사용하지 않거나 매우 작은 양의 면역 억제제를 사용하여, 간 전구체 세포들을 포유동물에 이식하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 간 전구체들은, 거부 반응을 예방하기 위한 면역 억제제를 전혀 사용하지 않거나 극히 소량만을 사용하여, 동종 호스트에 도입될 수 있다.
현대에서, 전부는 아니지만 대부분의 경우에서, 동종 수혜자에 대한 부분 또는 전체 간이식은 이식된 조직의 면역 거부(즉, GVHD)를 예방하기 위해 면역 억제제 사용을 필요로 한다. 면역 억제제의 용량 및 투여 기간은 조직, 상대적 유전적 매칭과 같은 요인들에 의해 이식 케이스들 내에서 크게 달라지지만, 본 발견 및 발명은 약물들의 전체 사용량을 현저히 감소시틴다. 일반적인 면역 억제제들은 프레드니손(예, ORASONE®), 아자치오프린(예, IMURAN®), 사이클로스포린(예, SANDIMMUNE®, NEORAL®) 및 마이코페놀레이트(예, CELLCEPT®)를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
현대에서, 통상의 면역 억제제 용량은 약 5 mg 내지 약 20 mg의 범위이다. 하기 표 1을 참조. 본 발명은 간 세포들의 동종 이식에 대해, 서브-면역 억제량(sub-immune suppressing amounts)의 면역 억제제 용량을 제공하거나, 바람직하게는 면역 억제제를 전혀 제공하지 않는다. 다른게는, 개별 수혜자에 대해, 서브-면역 억제량의 면역 억제제는 개인의 면역 반응을 억제할 수 있는 양보다 작은 양으로 정의된다. 면역 억제를 얻을 수 있는, 면역 억제제의 적정 용량을 측정하는 분석법이 가용하며, 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 알려져 있다. 이러한 시험법은 예를 들어 정량적 방사선 수용체 분석법(quantitative radioreceptor assays), 섬광 근접 분석법(scintillation proximity assays), MTT 분석법, 및 상업적으로 시판되고 있는 임상 키트와 분석기(예, Abbott Labs이 시판하는 미세입자 효소면역측정법(MEIA) 기술을 이용한 IMx® Sirolimus assay; Roche Diagnostics이 시판하는 CEDIA CsA PLUS)를 포함한다. 또한, 아래에 기재되는 것과 같은 시험관내(in vitro) 분석법이 또한 생체내(in vivo) 유효 용량 커브에 대해 상당한 상관관계를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 적정 용량 반응의 약 30% 미만의 용량 반응, 바람직하게는 약 60% 미만의 용량 반응, 보다 바람직하게는 약 90% 미만의 용량 반응이 서브-면역으로 생각될 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 따른 서브-면역 억제 용량은 바람직하게는 약 0 mg 내지 약 10 mg, 보다 바람직하게는 약 0 mg 내지 약 5 mg, 가장 바람직하게는 약 0 mg 내지 약 3 mg의 범위이다.
표 1. 수혜자에게 프레드니손을 테이퍼링(tepering)하기 위한 장기간의 프레드니손 용량 및 용법을 나타내는 일반적인 가이드라인.
(참조:http://med.stanford.edu/shs/txp/livertxp/outpatient.management/management.htmWt3.)
이식-후 시간 용량(mg)
타크롤리무스-기초한 면역 억제
0-2 주 20
2-8 주 15
8-16 주 10
4-6 개월 7.5
6-9 개월 5
>9 개월 테이퍼 및 중단
만성 감염 B 또는 C를 가진 환자에서의 타크롤리무스
0-2 주 20
2-4 주 15
4-8 주 10
2-3 개월 7.5
3-6 개월 5
>6 개월 테이퍼 및 중단
사이클로스포린-기초한 면역 억제
0-2 주 20
2-26 주 15
6-9 개월 10
9-12 개월 7.5
12-18 개월 5.0
도 1은 동정된 간세포 집단들에 대한 비분획 PBMCs의 반응을 나타낸다.
도 2는 동정된 간세포 집단들에 대한 정제된 T 세포들의 반응을 나타낸다.
도 3은 동정된 간세포 집단들에 대해 수행된 혼합 림프구 반응 분석으로부터 얻은 결과를 나타낸다. 3A: PBMC 반응. 3B: 정제된 T-세포 반응.
도 4는 EpCAM 양성 간세포들에 대한 정제된 T 세포 반응을 나타낸다.
도 5는 EpCAM 양성 간세포들에 대한 별도의 정제된 T 세포 반응을 나타낸다.
도 6은 EpCAM 양성 간세포들에 대한 별도의 정제된 T 세포 반응을 나타낸다.
도 7은 EpCAM 양성 간세포들에 대한 별도의 정제된 T 세포 반응을 나타낸다.
도 8은 EpCAM 양성 간세포들에 의해 혼합 림프구 반응이 억제되는 것을 나타낸다.
이하, 본 발명을 비-제한적인 실시예로 설명한다.
인간 세포의 분리
본 발명에 따라 시험관내 증식에 적합한 간 전구체들은 특정 방법에 의해 분리되거나 동정된 것으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 간 전구체들을 분리 및 동정하는 방법이 USP 제6,069,005호 및 USP 출원 제09/487,318호; 제10/135,700호; 및 제10/387,547호에 기재되어 있고, 이들 내용은 본 명세서에 참조 자료로 포함된다.
간 줄기 세포들 및 간모 세포들은 특징적인 항원 프로파일을 가지고 있고, 상술한 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 간 줄기 세포들 및 간모 세포들은 다양한 항원들(예, 사이토케라틴스 8, 18 및 19, 알부민, CD 133/1 및 상피세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule, "EpCAM"))을 공유하고, 조혈 마커들(예, 글리코포린 A, CD34, CD38, CD45) 및 간엽 세포 마커들(예, CD146)에 대해서는 음성이다. 이와 달리, 간 줄기 세포들 및 간모 세포들은 크기(줄기 세포는 7-9 ㎛; 간모 세포는 10-12 ㎛) 또는 항원(N-CAM은 간 줄기 세포에 존재하는 반면, 알파-페토 단백질(AFP) 및 ICAM1은 간모 세포에 의해 발현)에 의해 서로 분리될 수 있다.
본 실시예에서의, 이종 간 이식에 적합하지는 않지만, 공여된 간들은 연방기관에 의해 지정된 기관 조달 기관들로부터 얻었다. 연구 목적으로 간을 사용하는 것에 대해서는 친지로부터 동의를 얻었다. 세포들을 분리하기 위해, 성인 및 소아 간들의 문맥 및 간동맥에 EGTA-함유 버퍼를 15 분간 주입한 뒤, 125 mg/L 리베라제(Liberase (Roache))를 30분간 34℃에서 주입하였다. 세포들을 공극 크기가 1,000,500,250 및 150 미크론인 필터들에 순차적으로 통과시키고, 밀도 구배에서 500 x g로 원심분리하였다.
자기 세포 선별(Magnetic Cell Selection)
자기 세포 선별은 종종 이종 세포 집단으로부터 특정 표면 항원을 발현하는 세포들을 분리하는 편리한 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상업적으로 시판되는 시스템("MACS" MicroBeads, Miltenyi Biotec)이 간 전구체 세포들에 대한 마커인 EpCAM에 대해 양성인 세포들을 선별하는데 사용된다. 관심 항원에 대한 단클론 항체가 산화철 및 다당류 코트를 포함하는 수퍼 상자성 마이크로비드에 커플링될 수 있다. 마이크로비드는 지름이 약 50 나노미터이고, 부피는 보통의 포유동물 세포의 약 백만분지 일이다. 이들은 충분히 작아 콜로이드 부유물로 잔류할 수 있고, 이는 세포 표면 분자에 빠르고 효과적인 항체-매개 결합을 허용한다. 제조업자들을 마이크로비드가 유세포 측정기와 간섭을 하지 않고, 생분해되며, 세포 기능에 대해 무시할만한 효과를 나타낸다는 증거를 제공해왔다.
선별에 사용된 항체는 상술한 바와 같이 직적접으로 사용되거나, 간접적으로 사용될 수 있고, 간접 방법에서 비드는 플루오레세인 또는 비오틴과 같은 리간드에 대한 단클론 항체에 공유 결합된 뒤, 리간드로 변형된 단클론 항체가 표면에 부착된 세포를 포획하는데 사용된다. 직접적 또는 간접적 면역 선별 방법을 이용하여, 표지된 비드와 함께 인큐베이션된 세포들은 강한 자기장의 존재하여 컬럼을 통과함으로써 항원-양성 세포들은 잔류하는 반면, 음성 세포들은 씻겨 내려가도록 한다. 자기장을 제거한 후, 양성으로 표지된 세포들을 수집한다.
항원 마커에 대한 FACs 분석
세포 표면 마커(예, EpCAM)에 대해, 1 X lO6 세포들을 500 x g로 5 분간 펠렛으로 만들고, 2% FBS 및 0.01% NaN3를 함유하는 100 ㎕ PBS에 재현탁시켰다. 그후, 1 ㎍의 관심 항체를 첨가하고 30 분간 암실에서 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하고, 최종 세포 펠렛을 0.5 ml의 1% 파라포름알데히드에 재현탁시켰다. 1 ㎍의 마우스 IgG1 FITC 및 마우스 IgG1 PE를 적정 대조군 세포에 첨가하였다.
면역원성에 대한 혼합 림프구 반응
혼합 림프구 반응(MLR) 분석은 시험관내에서 상대적인 면역원성을 분석하는데 사용된다. 이 방법은 동종 자극 집단에 대한 반응자 T 세포들의 증식을 측정한다. 요약하면, 인간 말초 혈액 단핵 세포들(PBMCs)을 피콜/하이팩(ficoll/hypaque)으로 원심분리하여 전혈로부터 정제한다. 이들 세포들과, PBMC 집단으로부터 분리한 T 세포들,을 MLR에서 응답자 세포로 사용한다. T 세포들은 B 세포들 및 단핵 세포들을 항체-코팅된 자기 비드로 태깅(tagging)하고, 자석으로 이들을 제거하는 음성 선별 기법에 의해 순도가 높아진다(enrich). 자극 세포들은 금방 분리된 간 세포들 및 분리된 간 전구체 세포들이다.
각각의 자극 세포 집단을 미토마이신 C (10 ㎍/ml 미토마이신 C, 3 시간)로 처리하거나 조사하여 자극 세포들이 분석 중 증식하는 것을 예방하였다. 도너외의 다른 개체로부터 얻은 반응자 T 세포들(leukopacks을 Poietics, Inc.로부터 구매)(2x105 세포/웰)을 다양한 수의 각 자극 집단(0.2-2.0x105 세포들/웰)과 함께, 96 웰 플랫-보톰 플레이트에서 5% 인간 AB 세럼으로 보강된 조직 배양 배지를 이용하여 배양하였다. 응답자 또는 자극 세포들로 구성된 추가의 대조군 배양물들은 각자 배양되었다. 각각의 처리에 대해 4배수 배양을 하였다. 배양물을 37℃로, 가습된, 5% CO2-함유 대기에서 6일간 배양하였다. 그 후, 배양물은 1 uCi/웰 3H-티미딘으로 16 시간 동안 펄싱(pulse)되고, 유리 섬유 필터로 수집하여 섬광 계수기로 카운트하였다.
도입된 방사선 활성(cpm)의 양은 T 세포 증식에 비례하는 것으로 나타났다. 델타 cpms은 자극 집단에 대한 T 세포 반응에 기초하여 계산하였고, 반응자 및 자극 집단을 단독으로 배양하여 얻은 적절한 백그라운드 값을 제하였다.
면역 억제에 대한 혼합 림프구 반응
본질적으로 상술한 바와 같은, MLR 분석은 또한 동종 자극 세포 집단을 이용하여 수행될 수 있다. 이 반응에는, 비-억제 지라 섬유모세포(5x103, 10x103 및 2Ox1O3 세포들)를 대조군으로 적정(titrated)하였다. 금방 분리한 전구체 세포와의 평형 반응들을 실험적으로 적정하였다. 그 후, T 세포들로의 3H-티미딘 도입을 측정하였다. 실험에서 얻은, 대조군과 같거나 많은 3H-티미딘 도입 수준은 간 전구체 세포들이 면역 반응을 억제할 수 없다는 것을 의미하는 것으로 해석된다.
결과
비분획된 간세포 혼합물("Umix")과 Umix 세포들(확장된 간세포들)을 3일 배양하여 얻은 부착 집단을 연구하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 비분획된 PBMCs는 6,000/웰, 30,000/웰 및 150,000/웰(오직 확장된 간세포들)의 용량 수준에서 조사된 Umix 및 확장된(expanded) 간세포에 대해 자기 백그라운드 반응보다 유의하게 높게 반응하였다. 또한, 확장된 간세포들에 대한 반응은 모든 용량에서 Umix 세포들에 대한 방응보다 유의하게 높았다(p<0.05). 가장 높은 용량인 150,000 간세포들/웰에서의 반응은 낮았고, 이는 크라우딩(crowding)에 의했을 가능성이 가장 높 다(Umix 세포들 및 확장된 간세포들은 30,000 세포들/웰 용량에서 웰을 완전히 덮을 정도로 크다). 가장 낮은 자극 세포들의 용량에서, 간 세포 집단들은 모두 동종 PBMCs보다 자극적이었다. 높은 용량에서, PBMCs가 보다 자극적이었다.
도 2에 도시된 바와 같이, 정제된 T 세포들은 Umix 및 확장된 간세포들에 대해 유사한 반응 패턴을 나타냈다. 확장된 간세포들은 모든 용량에서 백그라운드 수준 이상으로 유의하게 T 세포들을 자극하였고, 확장된 집단에 대한 반응은 Umix 세포들에 대한 반응보다 유의하게 높았다. 정제된 T-세포들(항원 표시 세포들이 결핍 (APCs))은 확장된 간세포들에 대해 격렬히 반응하여, 이들 세포가 APCs로 기능할 수 있다는 것을 제시하였다. T 세포들은 Umix 집단에 대해 PBMC 반응자 세포들 (APCs 함유)보다 덜 격렬한 반응을 보였으며, 이는 APCs에 대한 외래원이 반응에 요구된다는 것을 제시한다.
유사한 실험들을 EpCAM에 대한 항체를 이용하여 면역 선별되고 자기 활성 세포 소팅에 의해 분리된 성인 간 줄기/전구체 세포들에 대해 먼저 수행하였다. 분리된 세포 집단에 대한 FACs 분석은 약 82%의 순도를 나타냈다. 이들 세포들에 대한 MLR 실험 결과를 도 3에 나타냈다. 말초 혈액 단핵 세포들로 구성된 반응자 세포들(PMBCs, 패널 A; 3x105 세포들) 및 정제된 T 세포들(패널 B; 2x105 세포들)을 자가(auto) PMBCs(xAuto), 동종 PMBCs(xAllo), 또는 성인 간 전구체 세포들(xHep)을 포함하는 자극 세포들과 혼합하였다. 상이한 양의 자극 세포들이 시험되었다(청색 막대=12.5x103 세포들; 자주색 막대=25x103 세포들; 황생 막대=50x103 세포들).
동종 PMBCs은, 증식성 T 세포 집단의 증가된 3H-티미딘 흡수에 의해 검출되었듯이, 면역 반응을 나타냈다. 반면, 성인 간 전구체 세포들에 대한 T 세포 증식의 정도는 자가 대조군 PBMCs에 대한 반응과 유의할 정도로 다르지 않았다. 이들 데이터는 성인 간 줄기/전구체 세포들이 면역원성이 아니라는 결론을 뒷받침한다.
별도로 성인 간 줄기/전구체 세포들 준비하여, 이들 세포들에 대한 면역원성 평가 실험을 수행했다. 이들 세포들의 면역 억제 능력을 평가하기 위해 추가 실험들을 또한 수행했다. 도 4-7은 EpCAM+ 세포들이 두 개의 상이한 PMBC 및 T 세포 도너 중 어느 것으로부터도 T 세포 증식성 반응을 자극하지 않는다는 것을 나타낸다.
면역 억제 실험으로부터 얻은 결과를 도 8에 나타냈다. 데이타는 성인 간 줄기/전구체 세포들이 MLR 반응을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. 이 실험의 결론은 EpCAM 세포들이 면역 억제 능력을 가지지 않는다는 것이다.
내용을 정리하면, Umix 및 확장된 간세포들은 자가 PMBCs에 대한 백그라운드 반응보다 유의하게 높은 양의 T 세포 증식을 자극하였으므로, 이들은 모두 면역원성이다. 그러나, 확장된 간세포들이 Umix 세포들보다 유의하게 높은 면역원성을 가지며, 직접적으로 정제된 T 세포들을 자극하여, 이들 세포(또는 이들 세포의 아집단)가 항원 표시 세포들로 작용할 수 있다는 것을 제시한다. 반면, Umix 세포들은 반응자 PMBCs와 비교하여 정제된 T 세포들을 상대적으로 약하게 자극하여, Umix 세포들이 APCs로서 기능할 수 없고, 반응을 자극하기 위해서는 PBMC 집단으로부터의 APC 도움을 필요로 한다는 것을 제시한다.
이들 데이터는 세포 집단들(Umix 및 확장된 간세포들)이 모두, 온전한 면역계를 갖춘 동종 수혜자에게 이식된 경우, T 세포 반응을 유발할 수 있다는 것을 제시한다. 확장된 간세포 집단은 생체내에서 Umix 세포보다 격렬한 면역 반응을 유도할 것으로 예측된다.
성인 간 줄기/전구체 세포들은, 자가 PMBCs에 대한 백그라운드 반응보다 유의하게 높은 양으로 T 세포 증식을 자극하지 못하는 점에서 입증된 바와 같이, 면역원성을 나타내지 않는 것처럼 보인다. 또한, 성인 간 줄기/전구체 세포들은, 자가 PMBCs에 대한 백그라운드 반응보다 유의하게 높은 양으로 T 세포 증식을 억제하지 못하는 점에서 입증된 바와 같이, 면역 억제성이 아니다. 결론적으로, 이들 결과는 성인 간 줄기/전구체 세포들(EpCAM 양성 세포들)이 MHC 분자를 전혀 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하고(아마도, 클래스 II가 없음), 공자극 분자들(CD80, CD86)의 발현 결핍이 있을 가능성이 크다는 것을 제시한다. 따라서, 성인 간 줄기/전구체 세포들(EpCAM 양성 세포들)은 동종 세포 이식을 위한 훌륭한 후보자가 될 수 있다.
실제로, 성인에서 유래된 인간 간 줄기/전구체 세포들은, EpCAM, Alb 및 CK19의 발현에 의해 나타내어지듯이, 면역-특혜 간세포 치료물로서 유용하다. 성인에서 유래된 인간 간 줄기/전구체 세포들을 이용한 생체내 이종이식 생존 분석이 통상(즉, 비-면역-특혜)의 자리, 예를 들어, 신피막 밑에 확립된 기술들을 이용하여 이식될 수 있다. 바람직한 경우, 동일한 수의 성인 유래된, 성숙한 간세포들이 대조군 동물들에 이식될 수 있다.
수혜 마우스의 옆구리 피부를 절개하고, 근육 벽을 절개하여 신장을 밖으로 끄집어내었다. 피막하 주머니를 신장과 신장피질 사이에 생성하고, 이식에 사용되는 세포들을 주머니에 위치시켰다. 신장은 복강 내로 대체될 수 있고, 피부를 클립으로 닫았다. 이식 생존에 관한 생체내 평가는 이식 후 선택된 시점에 현미경을 이용하여 시각적으로 관찰하여 평가할 수 있다. 이식 외양(즉, 괴사) 및 혈관 신생에 대한 평가를 시간 경과에 따라 수행하였다(예, 1 시간, 1 일, 7, 14, 21, 28 일).
또한, 신막 하에 위치한 이식물의 냉동 절편에 대해 유사한 시간 대에 CD45에 대한 조직화학 연구를 추가로 수행할 수 있다. CD45 항원은 티로신 포스파타아제이고, 또한 백혈구 공통 항원(LCA)으로도 알려져 있다. CD45는 적혈구 세포들, 혈소판 및 이들의 전구 세포들을 제외한, 조혈세포 기원의 모든 인간 세포들에 존재한다. CD45 분자는 T 세포 및 B 세포 활성화에 요구되고, 세포의 활성화 상태에 따라 적어도 5개의 아이소폼으로 발현된다. 이식 지점에 CD45+ 세포들의 축적이 결여된 것은 일반적으로 호스트에 의한 면역 반응이 결여된 것을 나타내고, 이식된 세포들이 비-면역원성이라는 생각을 지지한다. 이러한 발견은 성인 간 줄기/전구체 세포들의 이식으로부터 예측될 수 있다. 대조적으로, 성인 유래된 성숙한 간세포가 이식되는, 대조군 마우스는 괴사 이식된 세포들, 혈관 신생의 결여 및 CD45+ 세포들의 축적에 의해 나타내지는 격렬한 면역 반응을 나타낼 것이다.
이러한 방법으로, 실질적으로 비-면역원성인 간 줄기 세포들을 이용한 간 기능장애 치료는 많은 부분에서 또는 전체적으로 통상의 면역 억제제에 대한 요구를 해소할 수 있을 것이다. 따라서, 간 줄기 세포들은 포유동물 환자에서 사멸한 및/ 또는 기능장애 간을 재생하도록 채택될 수 있고, 부분적으로, 상실된 간 기능을 회복시킨다.
실험실에서는, 이러한 능력을 예를 들어 암컷 Balb/c 마우스 (8 내지 12 주령)를 이용하고, 이들에게 1 ml/체중kg의 CCl4과 같은 테라토젠을 일주일에 두번 총 8회 주입하여 간 손상을 야기함으로써 결정할 수 있다. 알라닌 트랜스아미나아제에 관한 혈액 화학 검사가 간 손상 보고를 위한 치료 기간의 마지막에 마우스에 대해 수행될 수 있다. 비처리된 대조군 마우스와 비교하여 상대적인 효소 수준의 증가는 본 연구에 동물을 투입하기 전에 평가되어야 한다. 성인 인간 간 줄기 세포들을 수혜 마우스에 이식하는 것은 이식 주입에 의해 수행될 수 있다.
다양한 용량의 세포들이, 바람직한 최대 용량을 106 세포/마우스로 하여, 각각의 조건 하에 10 마리의 동물들로 이루어진 코호트들에 이식될 수 있다. 동물들은 하기 기준에 의한 개선된 간기능 증거를 찾기 위해 시간 경과에 따라 모니터될 수 있다: 알라닌 트랜스아미나아제, 알부민, 총 단백질, 콜레스테롤 및 트리글리세리드. 연구 중에 고통을 나타내는 동물은 안락사시켜야 하지만, 동물이 죽은 시점을 기점으로 연구가 종결되지는 않는다.
따라서, 각 이식 조건 하에서, 다섯 마리의 동물로된 그룹들을 이식 후 4 및 16주에 안락사시켰다. 다음 기관을 수집하였다: 간, 신장, 뇌, 심장, 폐, 지라. 세럼 샘플이 또한 통상의 혈액 화학 및 CBC를 통해 얻어질 수 있다. 유사하게, 기관은 면역 조직 화학법, H&E 및 RNA 분석으로 처리될 수 있다. 샘플은 이식된 세포들 에 대한 마커를 검출하기 위해 항체(항-베타 갈락토시다아제 항체들)로 염색된다
별도로, Y 크로모좀 검출을 위한 FISH 분석법이 이식된 수컷 세포들을 동정하는데 사용될 수 있다. 연속된 섹션들이 간 단백질(간에서) 발현 및 DAPI 염색에 대해 모니터되고, DAPI 염색은 세포의 배수성을 결정하는데(세포 융합 가능성을 평가하는데) 사용된다. 지라, 신장, 뇌, 폐, 심장의 연속 섹션들이 간 밖에 이식된 세포들에 관한 증거를 제공한다.
별도의 방법이, 성인 인간 간 줄기 세포들을 ApoE 결핍 마우스에 이식하는 것을 포함할 수 있다. 요약하면, Apoetm1Unc 돌연변이에 대한 마우스 동형은 나이 또는 성별에 의해 영향을 받지 않는 총 플라즈마 콜레스테롤 수준이 현저한 증가하는 것을 보여준다. 근위부 대동맥에서 지방 줄무늬가 3 월령에 발견되었다. 병변은 나이와 함께 증가하였고, 지방을 덜 가지지만 보다 신장된 세포들, 전형적인 전-죽상경화 병변으로 보다 발전된 상태,을 가진 병변으로 발전하였다. 트리글리세라이드 수준이 완만한 증가가 혼합된 C57BL/6 x 129 유전적 백그라운드에 대해 돌연변이를 가진 마우스에서 보고되었다. 노쇠한 APOE 결핍 마우스(> 17 개월)는, 주로 결정형 콜레스테롤 열, 지방구 및 거품 세포로 구성된 황생종성 병변을 뇌에서 발생시켰다. 더 작은 황생종성이 맥락층 및 벤트랄 포르닉스(ventral fornix)에서 관찰되었다. 최근의 연구들은 APOE 결핍 마우스가 반응들을 스트레스로 변환하고, 손상된 공간 습득 및 메모리, 변형된 장기간(long-term) 상승작용, 및 시냅스 손상을 가지는 것으로 나타내었다.
이들 마우스는 인간 간 줄기 세포들을 이식 주입에 의해 4-6주령의 동형 B6.129P2-Apoetm1Unc 마우스에 이식하기 위한 호스트로 사용될 수 있다. 수혜자 그룹은 각각의 그룹에 다섯 마리를 포함할 수 있다: 그룹 1: 대조군 - 식염수 주입; 세포 없음; 그룹 2 - 1x106 인간 줄기 세포들; 그룹 3 - 2x106 인간 줄기 세포들; 그룹 4 - 5x105 인간 줄기 세포들, 그룹 5 - 1x106 인간 성숙 간세포. 대조군에 기초할 때, 이식 실험에서 ~15%의 사멸율이 예상될 수 있다.
이식 후 시간 경과에 따라 수행된 엔드-포인트(End-point) 분석법은 ApoE (2 주, 4 주, 8 주, 12 주의 선택된 시점에 웨스턴 블록 분석법에 의해 세럼을 분석)를 포함한다. 성인 인간 간 줄기 세포를 이식한 후에, 앞의 결핍된 마우스로부터의 ApoE 검출은 이들 세포들이 수혜자를 면역 억제하지 않으면서, 간 기능을 회복하는데 사용될 수 있다는 생각을 뒷받침한다.
본 발명이 특정 구체예와 연관하여 기재되었지만, 본 발명은 임의의 변형, 사용, 변경을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 청구범위에 기재된 사항과 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어나지 않는 한 그의 균등물도 포함한다.
본 발명은 건강한 도너 조직 세포들을 이용하여 사멸되었거나 기능장애를 나타내는 간 조직을 재증식시키는 유용성이 있다. 정상 작동하는 간 조직을 이용하여 사멸되었거나 기능장애를 나타내는 간을 재증식시켜, 적어도 부분적으로는, 기능 장애로 손실된 활성을 대체할 수 있다. 이 방법으로, 간질병들이 치료될 수 있다.

Claims (14)

  1. (a) 분리된 비-면역원성 간 전구체들을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 분리된 간 전구체들을 포유동물의 간 분획에 도입하는 단계를 포함하되, 상기 도입은 면역-억제량(immune-suppressing amount)의 면역 억제제가 존재하지 않는 상태에서 수행되는 포유동물의 간 분획을 재증식시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분리된 간 전구체들은 이식 또는 주입에 의해 도입되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 서브-면역-억제량(sub-immune-suppressing amount)의 면역 억제제가 포유동물에 투여되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 서브-면역-억제량은 면역 억제제가 포유동물 1 킬로그램 당 약 10 mg 미만인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 서브-면역-억제량은 면역 억제제가 포유동물 1 킬로그램 당 약 5 mg 미만인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 서브-면역-억제량은 면역 억제제가 포유동물 1 킬로그 램 당 약 3 mg 미만인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 서브-면역-억제량은 면역 억제제가 포유동물 1 킬로그램 당 약 0.1 mg 미만인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 면역 억제제는 프레드니손, 아자치오프린, 사이클로스포린 및 마이코페놀레이트로 구성된 그룹에서 선택되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 포유동물은 비-인간인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인간은 동종 수혜자(recipient)인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 동종 수혜자는 면역-저하 및 면역-특혜가 아닌 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 분리된 비-면역원성 간 전구체들은 추가적으로 비-면역 억제성인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 분리된 비-면역원성 간 전구체들은 EpCAM 발현에 대해 양성인 방법.
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