JP5950235B2 - 肝細胞の分化誘導方法、ヒト化肝臓キメラ非ヒト動物の作製方法 - Google Patents
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Description
1.生体外の細胞培養法を用いた分化誘導法は確立されていない。
2. 成熟ヒト肝細胞は増殖性が乏しい上に入手が困難である。
3. 成熟肝細胞を利用して作ったキメラマウスは移植効率が低く、また、製造コストが高いことから産業応用には適していない。
4. 移植したヒト細胞の増殖が早く、移植後の置換効率の高いキメラマウスは報告されていない。
5. ヒトと実験動物の間では、化学物質を代謝する能力が大きく異なる。そのため実験動物を用いた結果からヒトへの影響を正確に予測することは難しい。
KO等)へヒト肝細胞の移植が行われているが、生着効率は改善されていない。
従来行われている成熟肝細胞を使用した移植モデルでは置換効率が悪く、製造コストも高い。そこで本発明者らは、ヒト胎児肝幹/前駆細胞と未熟ヒト肝細胞をドナー細胞として用いた。この細胞は成熟肝細胞と比較して、増殖能力が高く、安定供給を行うことが可能である。しかし、in vitroでのヒト胎児肝幹/前駆細胞・未熟ヒト肝細胞の分化誘導法、機能維持の方法は確立されていない。
Alb-TRECK/scidマウスをレシピエントとし、ヒト胎児肝幹/前駆細胞・未熟肝細胞をドナーとすることにより、以下の点の改善を行った。
1. ヒト由来細胞の肝臓への置換効率を上昇させた。
2. 生体内に移植することにより、ヒト胎児肝幹/前駆細胞、未熟肝細胞の分化を誘導した。
また、自然発症型肝傷害uPA-NOGマウスでも、同様若しくはそれ以上の効果が確認された。
(1)肝障害を起こした免疫不全非ヒト動物へヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞を移植し、肝細胞に分化誘導させることを含む、ヒト化肝臓を持つ非ヒト動物の作製方法。
(2)肝障害が肝細胞特異的である(1)記載の方法。
(3)肝障害を起こした非ヒト動物が、ジフテリア毒素受容体であるヒトHB-EGFを肝細胞に発現する免疫不全非ヒト動物にジフテリア毒素を投与して肝炎を発病させた非ヒト動物である(1)又は(2)に記載の方法。
(4)ヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞が、CDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性の細胞である(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)ヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞が、CDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性/CD13陽性の細胞である(4)記載の方法。
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載の方法で作製した、ヒト化肝臓を持つ非ヒト動物。
(7)(6)記載の非ヒト動物を用いて、被験物質の薬物動態及び/又は肝毒性を調べる方法。
(8)肝障害を起こした非ヒト動物へヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞を移植し、肝細胞に分化誘導させることを含む、ヒト肝細胞の作製方法。
(9)(8)記載の方法で作製したヒト肝細胞を用いて、被験物質の薬物動態及び/又は肝毒性を調べる方法。
2. ヒト胎児肝幹/前駆細胞及び未熟肝細胞は、成熟肝細胞と比較して増殖能が高く、生体内での定着性も高い。この特性を利用してヒト肝細胞の動物生体内での大量生産が可能になる。
3. Alb-TRECK/scidマウスを用いたキメラマウスモデルでは、ヒト肝細胞の置換率は最大84.5%、生存日数は100日を越えている。肝特異的機能性遺伝子の発現は、ヒト胎児肝臓組織と比較して同等の発現を示している。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2011‐215977の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明のヒト化肝臓を持つ非ヒト動物は、ヒト型薬物代謝酵素(例えば、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、2D6, 1A2など)を発現しうるので、ヒト肝臓と同様の薬物代謝を行うと考えられる。従って、この動物を用いて、被験物質の薬物動態及び/又は肝毒性を調べることは、創薬研究に役立つ。本発明は、肝障害を起こした非ヒト動物へヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞を移植し、肝細胞に分化誘導させることにより作製したヒト化肝臓を持つ非ヒト動物を用いて、被験物質の薬物動態及び/又は肝毒性を調べる方法を提供する。
被験物質の薬物動態を調べるには、例えば、被験物質を非ヒト動物に投与あるいはヒト肝細胞に添加した後、その代謝物または、排泄物、血漿、肝臓組織などを回収し、質量分析、HPLC分析などの方法により測定する。
1.材料及び方法
ヒト肝細胞の供給源
本研究に用いるヒト胎児肝臓細胞は、米国のACBRI(Applied Cell Biology Research Institute a registered Washington non-profit research institution)により提供者の同意の下に分離され、米国セルシステムズ社により無償で供与されているものである(Cat No. CS-ABI-3716)。本邦においては、大日本製薬株式会社から初代ヒト胎児肝細胞 (Human
primary fetal hepatocytes; Cat No. CS-ABI-3716)として供給されており、本研究においてはこれを使用した。感染症の検査(HIV, HBV, HCV)と細菌類検査(真菌、細菌、マイコプラズマ)については陰性である。本研究については、本学倫理委員会において審議され許可されている。
既に確立され、報告されているコロニー形成能を持つ胎児肝細胞低密度培養系(Zheng YW, Taniguchi H, et al. Transplant Proc 2000;32:2372-2373; Suzuki A, Zheng YW, et
al. Hepatology 2000;32:1230-1239)に以下のような改変を行った。
浮遊細胞を、氷上で30分間、蛍光標識モノクローナル抗体(mAb)の至適濃度下で遮光してインキュベートした。2% FBSを添加したPBSを洗浄液及び抗体希釈液として用いた。ビオチン標識一次抗体を用いた際はストレプトアビジン標識の施された蛍光抗体で二次反応を行った。すべての蛍光標識モノクローナル抗体はBecton Dickinsonから購入した。フルオレセイン-イソチオシアネート(FITC)結合抗ヒトCD66 (hCD66FITC)、アロフィコシアニン(APC)結合hCD90、フィコエリトリン(PE)結合hCD318。ソーティングは高速セルソーターMoFlo (DakoCytomation)を用いて行った。*CD318はCDCP1と称されることもある。
多重免疫細胞化学染色の際は、細胞を冷エタノールで30分間固定し、10%正常ヤギ血清(NGS)で60分間ブロッキングを行った後、一次抗体を1%NGS添加PBSで希釈し、湿室にて4℃で一晩反応させた。二次抗体を10%グリセロールを含むPBSで希釈し、湿室にて室温で60分間反応させた。細胞核をDAPIで染色し、FAマウント液で封入した。(画像は、Zeiss AxioImager顕微鏡で取得した。)
免疫細胞化学には、一次抗体としてマウス抗ヒトアルブミンmAb(SIGMA)、マウス抗ヒトCK19 mAb (Progen)、及びモルモット抗CK8/18 pAb (Progen)、マウス抗ヒトNuclei mAb (Millipore)。二次抗体としてAlexa488標識ヤギ抗guinea pig IgG、Alexa-555標識ヤギ抗マウスIgG2a、Alexa647結合ヤギ抗マウスIgG1 (Invitrogen, Molecular Probes)を用いた。
細胞又は細胞コロニー由来の全RNAをIsogen試薬(Nippon Gene, Toyama, Japan)を用いて抽出した。逆転写(RT)の前に、150 ngのランダムプライマーと1 μlの10 mM dNTP混合物を全RNA溶液に添加した。反応混合物を65℃で5分間加熱し、氷上で1分間インキュベートした後、1x first-strand buffer、0.5 mM dNTP mix、5mM DTT及び200 unitsのSuper Script III (invitrogen)を加え、25℃で5分間、50℃で45分間、70℃で15分間インキュベートし、全RNA からcDNAを合成した。
本研究で用いたマウスは、標的細胞ノックアウトマウス(Toxin Receptor Mediated Cell Knockout マウス: TRECKマウス)と重症免疫不全マウス(SCIDマウス)を交配して作出したTRECK/SCIDマウスをレシピエントとして用いた(東京都医学総合研究所より提供)。マウス肝実質細胞を標的とするため、マウスALBプロモーターにヒト由来のジフテリア毒素受容体を連結したDNA 組換え体を用いて、トランスジェネシスを施しており、ジフテリア毒素を投与すると、ヒトの受容体を発現した臓器のみを特異的に殺すことが可能である。このマウスの遺伝的背景を均一化するため、戻し交配を3回行い、安定的な状態を保っている。細胞移植には四週齢から八週齢のTRECK/SCIDマウスを用い、移植48時間前に1.5ug/kgのジフテリア毒素(Diphtheria toxin : DT)を投与し肝障害を引き起こし、1 mg/ml の抗アシアロ GM1 (Wako, Japan) 100ulを投与し、マウスのNK細胞活性除去を施した。48時間後に尾静脈から血液をサンプリングし、4000rpm 20分間 4℃で遠心分離を行い、血清成分を得た。得られた血清成分のトランスアミラーゼ(GOT)とアラニントランスアミナーゼ(GPT)の活性をFUJIFILM DRY-CHEM kitを用いて測定した。DT処理を施し、肝障害を引き起こしたTRECK/SCIDマウスの脾臓に1x106個の胎児肝幹細胞(hepatic stem cell : HSC)もしくは胎児肝臓細胞(fetal liver cell : FLC)を移植した。移植後のマウスは6週間後に肝臓をサンプリングし、免疫染色、H&E染色、遺伝子解析、ELISAを行った。ELISA解析は移植後4週間以上のキメラマウスの尾静脈から血液をサンプリングし、血清成分を分離し、サンプルとして用いた。ヒトアルブミンELISA kit (Bethyl Laboratories)を用いて血清中のヒトアルブミンの分泌量を測定した。
胎児肝臓細胞(FLC)より単離した肝幹細胞がin vivo で分化誘導能や機能性を有するかを検討した。本発明者らは、CDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性の肝幹細胞(HSC)を、DT投与によって肝障害を引き起こさせたTRECK/SCIDマウスに移植を行った。In vivo に定着し、肝幹細胞によって再構築されたマウスの肝臓を40日後にサンプリングし、組織学的な解析を行った。
移植前後のTRECK/SCIDマウスの肝臓の状態を比較した。左上図はDT処理前の正常肝臓、左下図はDT投与後48時間が経過した肝臓である。DT投与後では肝臓が白く変色し、肝障害が引き起こされていることが見た目からも分かる。しかし、DT投与後に肝幹細胞を5週間移植した肝臓(右図)では、肝臓の血色も良くなり、正常肝臓へと回復しつつある。激しく損傷していた肝臓が、肝幹細胞を移植することによって組織を再構築し、肝障害を緩和していた。
移植した肝幹細胞が定着している状態をより正確に可視化するためにGFPを発現させた肝幹細胞を移植に用いた。移植後20日目の肝臓では肝組織の半分以上がGFP陽性を示す肝幹細胞由来の肝臓であった。置換効率は最大で84.5%となっていた。平均的な置換率は65.6±17.5%(n=3).
作成したヒト由来キメラ肝臓の組織学的な解析を行った。H&E染色を行った結果、ヒト由来肝幹細胞が見られた(図3の点線内)。
移植を行ったヒト肝幹細胞がin vivoの環境下で分化誘導されているかを検証するためにヒトアルブミン、humanCK19の免疫染色を行った。ヒトアルブミン陽性/CK19陰性細胞群は比較的アルブミン分泌が高く、成熟肝細胞と同程度の発現を示していた(図5)。Human nuclear antigenとhuman CK8/18の免疫染色結果より、マウス肝臓にヒト由来細胞も大量に存在を示した(図6)。この結果から、移植した肝幹細胞はレシピエントマウスの肝臓内において、肝細胞と胆管細胞の二方向へ分化することとなり、さらに組織再構築能を持っていることが示唆された。
In vivoの解析からヒト由来キメラ肝臓が機能性を有している可能性が示唆された。そこで、このキメラ肝臓の遺伝子発現の解析を行った。薬物代謝酵素であるCYP3A4,CYP2C9,CYP2C19、肝特異的発現を示すhALBの発現を定量PCRにて解析を行った。その結果、移植前のドナー細胞と比較して、肝幹細胞(HSC)を移植した肝臓組織では、全ての遺伝子発現が上昇していた(図7)。hALBの遺伝子発現では、およそ66万倍の上昇、CYP3A4の発現ではおよそ22.7 万倍と高い上昇が見られ、肝幹細胞がin vivoの環境下で分化誘導されていることが示唆された。さらに胎児肝臓細胞と比較した場合、肝幹細胞を移植した肝臓は遺伝子発現が高く、より分化が誘導されやすく、移植に適している細胞だと考えられた。
これまでの解析より、肝幹細胞由来キメラ肝臓が機能性を持っていることが示唆されている。そこで本発明者らは、キメラマウス血清中のヒトアルブミン分泌量をELISAにて解析した。コントロールとして使用した、非移植TRECK/SCIDマウス(Control)の血清中にはヒトアルブミンは検出されなかった。しかし、肝幹細胞を移植したヒト由来キメラ肝臓を持つマウス(#220, #221)では、移植50日後の血清中に1381ng/ml、1679ng/mlとヒトアルブミンの分泌が確認された。この結果から、移植した肝幹細胞は、TRECK/SCIDマウスの肝臓内で機能性を持った細胞に分化している事が示された。肝幹細胞と初代胎児肝細胞を移植して、ヒト化肝臓を持つキメラマウスの生存日数について120日を越えていることも観察された。
マウス肝臓内で作成したヒト胎児肝幹細胞由来キメラ肝臓の分化度を検証するため、網羅的な遺伝子プロフィールの解析を行った。対象群としてドナー細胞である胎児肝幹細胞とヒト成人肝細胞(XenoTech CatNo: H1500.H15A+)を用い、発現パターンを比較検証した。その結果、胎児肝幹細胞では発現が確認されず、キメラ肝臓と成人肝細胞にのみに発現する1049遺伝子が確認された。その中には、肝臓特異的マーカーとして用いられるALB、AFP、HNF4aや、薬物代謝酵素であるCYP2C9、CYP2C19、CYP2D6の発現が確認された。マイクロアレイ中のCYP遺伝子プローブ全53個中、キメラ肝臓では27遺伝子の発現が見られた。成人肝細胞では49遺伝子、胎児肝幹細胞では15遺伝子の発現であったことから、キメラ肝臓は分化誘導が進み、成人肝細胞へと分化していると考えられる。その他にも脂質代謝、アンモニア代謝、アルコール代謝に関与する機能性遺伝子の発現が確認された。キメラ肝臓と胎児肝幹細胞との間で、2倍以上の発現上昇が見られる遺伝子を検証したところ、各種CYP遺伝子、肝臓マーカーであるCEBPAやKRT遺伝子、各種代謝に関与する遺伝子の上昇が見られた。このことから、ヒト胎児肝幹細胞はマウス生体内環境下において分化誘導が促進し、成人肝細胞へ近づきながら、肝臓組織を再構築していることが示唆された。
なお、ドナー細胞としては、大日本製薬株式会社から初代ヒト胎児肝細胞 (Human primary fetal hepatocytes; Cat No. CS-ABI-3716)として供給されている細胞、その培養細胞や継代培養細胞からFACSで分離したCDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性の細胞を用いた。この細胞の調製方法は、WO2009/139419に記載されている。
作成したヒト肝細胞キメラマウスの肝臓が機能を有し、肝障害に対する治療効果を有するか否かを検討するため、生存率解析を行った。その結果、移植を行わなかったコントロール(SHAM)群と比較して、移植群では優位に生存率が高く、マウス肝臓内でヒト胎児肝細胞が機能性を有していることが示唆された。コントロール群(SHAM)と比べて、ヒト肝幹細胞を移植したマウスは有意な長期間生存ができた(P=0.0169, Log-rank (Mantel-Cox)test)。ヒト肝細胞に対する毒性や薬効のin vivo評価系としてもその利用対象になりうる。
ヒト肝細胞を移植したTRECK/SCIDマウスにケトプロフェン(15 mg/kg)を静脈内投与した。対照として、偽手術したマウスを用いた。尿(0-4時間)を0.5 M 酢酸バッファー (pH 5.0)中に集めた。尿サンプルに1 N KOHを添加し、80℃で3時間インキュベーションし、その後、等容量の1 N HCLを用いて中和した。1%酢酸を含むアセトニトリルを添加し、遠心にかけた(15000 rpm, 4oC, 5分)。上清を液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC/MS/MS)にかけた。液体クロマトグラフィー実験には、Intersil ODS-3カラム(ジーエルサイエンス株式会社、東京、日本)を備えたLC-20Aシリーズ(島津、京都、日本)を用いた。クロマトグラフィーによる分離は、Intersil ODS-3カラム(5 μm, 4.6 x 150 mm I.D.; ジーエルサイエンス株式会社、東京、日本)を用いて達成した。カラム温度は40℃に維持した。0.1%酢酸(溶媒A)および0.1%酢酸含有アセトニトリル(溶媒B)からなる移動相を、以下の勾配スケジュールに従って、流速0.5 mL/分で注入した:25-80%溶媒Bの直線勾配(0-15分)、80%溶媒B(15-25分)、80-25%溶媒Bの直線勾配(25-26分)、および25%溶媒B(26-35分)。液体クロマトグラフィーは、4000 Q Trapシステム(AB SCIEX, Foster City, CA)に連結し、陰性エレクトロスプレーイオン化モードで操作した。turboガスは600℃に維持した。親および/または断片イオンは第一の四極子でろ過し、そして衝突ガスとして窒素を用いて衝突セル内で解離した。イオンスプレー電圧は-4500Vで、ケトプロフェンおよび1-ヒドロキシケトプロフェンの分析された m/z移行(Q1/Q3)は、それぞれ253.1/209.3 および 269.1/209.3であった。
キメラマウス(n=3)およびコントロールマウス(n=4)におけるデブリソキンに対するデブリソキン代謝物4-OHDBの血清比。デブリソキン(2.0 mg/kg)を経口投与した。データは経口投与8時間後、平均値±標準偏差で表す。
ヒト胎児肝細胞、肝幹細胞或いは自己複製能強化したBMI導入し幹細胞株(WO2009/139419参照)を用い、肝障害を引き起こしたTRECK/Scidマウスに移植を行い、再構築されたマウスの肝臓を40日後にサンプリング、組織学的解析を行った。移植後約3から7週後にサンプリング、組織学的解析を行った。さらに詳しく置換率を検討するため、定量PCRを用いて検討した。プライマー設計をマウスACTB特異的配列とヒトACTB特異的配列、両種のACTBを検出する配列で作成し、置換率を求めた。その結果、平均置換率はFLC: 79.9±26.4% (mean±SD, n=10); HSC: 65.5±28.9% (n=9), BMI1 clone3: 69.3±32.9% (n=5)と高く、最も高い個体ではHSC由来、99.9%と98.4%と、高効率でマウス肝細胞と置き換わっていた。
hACTB F gcacaatgaagatcaagatcattg(配列番号1)
hACTB R taaagccatgccaatctcatc(配列番号2)
mACTB F aagatcaagatcattgctcctcct(配列番号3)
mACTB R gccatgccaatgttgtctctta(配列番号4)
hm ACTB F gcaccacaccttctacaatga(配列番号5)
hm ACTB R gctggggtgttgaaggtctc(配列番号6)
uPA-NOGを用いたキメラマウスの作成
マウスアルブミン遺伝子エンハンサー/プロモーターを用いて肝臓特異的にmouse urokinase -type plasminogen activator(uPA)を発現させる自然発症型肝傷害uPA-NOG(uPA-NOD/scid Il2KO)免疫不全マウスは(財)実験動物中央研究所から提供された。
移植した肝幹細胞が定着している状態をより正確に可視化するためにGFPを発現させた肝幹細胞を移植に用いた。移植後30日目の肝臓では肝組織のほぼ100%がGFP陽性を示す肝幹細胞由来の肝臓であった。より広範囲な組織学的解析を行うためH&E染色、免疫染色を行ったキメラ肝組織の“Scan large imaging”を行った。H&E染色では広範囲に定着したヒト由来肝細胞が確認され、ヒト細胞由来のコロニーが多数確認された。免疫染色では、ヒト核陽性細胞が、全組織中およそ50.0%以上が確認された。さらにヒトアルブミン陽性、ヒト核陽性細胞が確認され、移植したヒト由来肝幹細胞が、uPA-NOGマウスの肝臓内で機能性を持っていることが確認された。肝実質細胞マーカーであるALBと胆管上皮細胞マーカーであるCK19共発現細胞が見られ、肝細胞、胆管上皮細胞の双方向に分化した細胞が存在することが示唆された。
未熟ヒト肝細胞を用いて、自然発症型肝傷害uPA-NOGマウスに移植を行い、再構築されたマウスの肝臓を4から7週間後に肝臓組織と血清をサンプリング、置換率を検討するため、定量PCRを用いて検討した。プライマー設計をマウスACTB特異的配列とヒトACTB特異的配列、両種のACTBを検出する配列で作成し、置換率を求めた。その結果、平均置換率は76.6±17.7% (mean±SD, n=10)と高く、最も高い個体ではHSC由来、93.3%と、高効率でマウス肝細胞と置き換わっていた。更に、ヒトアルブミンをマウス血清に存在するか、ELISA法で調べました。移植しないマウスに、ヒトのアルブミンを全く検出されない、ヒト肝幹細胞由来移植群は1000ng/mlの血清アルブミンとヒトアルブミン分泌が確認された。
In vivoの解析からヒト由来キメラ肝臓が機能性を有している可能性が示唆された。そこで、このキメラ肝臓の遺伝子発現解析を行った。薬物代謝酵素であるCYP2C9, CYP2C18,CYP2C19,CYP3A4,CYP3A7肝特異的発現を示すhALBの発現を定量PCRにて解析を行った。その結果、移植前ドナー細胞と比較して、移植した肝臓組織では、全ての遺伝子発現が上昇していた。成熟肝細胞(adult hepoatocyte)の遺伝子発現と比較して、一部サンプルは、CYPs遺伝子に関しては、同程度の発現が見られ、未熟肝細胞in vivoの環境下で分化誘導されていることが示唆された。
配列番号1は、ヒトACTB特異的配列を検出するプライマー(フォワード)のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、ヒトACTB特異的配列を検出するプライマー(リバース)のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、マウスACTB特異的配列を検出するプライマー(フォワード)のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、マウスACTB特異的配列を検出するプライマー(リバース)のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、ヒト及びマウスの両種のACTBを検出するプライマー(フォワード)のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、ヒト及びマウスの両種のACTBを検出するプライマー(リバース)のヌクレオチド配列を示す。
Claims (9)
- 肝障害を起こした免疫不全非ヒト動物へヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞を移植し、肝細胞に分化誘導させることを含む、ヒト型薬物代謝酵素を発現するヒト化肝臓を持つ非ヒト動物の作製方法であって、前記ヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞がCDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性の細胞である前記方法。
- 肝障害が肝細胞特異的である請求項1記載の方法。
- 肝障害を起こした免疫不全非ヒト動物が、ジフテリア毒素受容体であるヒトHB−EGFを肝細胞に発現する免疫不全非ヒト動物にジフテリア毒素を投与して肝炎を発病させた非ヒト動物である請求項1又は2に記載の方法。
- 肝障害を起こした免疫不全非ヒト動物が、アルブミン遺伝子エンハンサー/プロモーターを用いて肝臓特異的にurokinase −type plasminogen activatorを発現させた自然発症型肝傷害免疫不全非ヒト動物である請求項1又は2に記載の方法。
- ヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞が、CDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性/CD13陽性の細胞である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の方法で作製した、ヒト化肝臓を持つ非ヒト動物。
- 請求項6記載の非ヒト動物を用いて、被験物質の薬物動態及び/又は肝毒性を調べる方法。
- 肝障害を起こした非ヒト動物へヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞を移植し、肝細胞に分化誘導させることを含む、ヒト型薬物代謝酵素を発現するヒト肝細胞の作製方法であって、前記ヒト肝幹細胞及び/又は肝前駆細胞及び/又は未熟肝細胞がCDCP1陽性/CD90陽性/CD66陰性の細胞である前記方法。
- 請求項8記載の方法で作製したヒト肝細胞を用いて、被験物質の薬物動態及び/又は肝毒性を調べる方法。
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