ES2316353T3 - Celulas progenitoras del higado humanas. - Google Patents

Abstract

Método para proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células progenitoras hepáticas humanas, comprendiendo el método: (a) proporcionar una suspensión sustancialmente de una única célula de tejido del hígado humano extraído; (b) reducir el volumen de la suspensión basándose en el tamaño de célula, la densidad de flotación o una combinación de los mismos para eliminar las células maduras al tiempo que se conservan las células inmaduras; y (c) someter la suspensión con volumen reducido a una inmunoselección positiva que comprende seleccionar aquellas células que expresan CD14, CD34, CD38 o combinaciones de las mismas, y/o una inmunoselección negativa que comprende eliminar aquellas células que expresan CD45, glicoforina A o una combinación de las mismas, de tal manera que se proporciona una mezcla de células, mezcla de células que está compuesta por una población enriquecida de células progenitoras hepáticas humanas y expresa alfa-fetoproteína, albúmina o ambas.

Description

Células progenitoras del hígado humanas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para proporcionar una composición que comprende una mezcla de células derivadas de tejido del hígado humano, mezcla que comprende una población enriquecida de células progenitoras del hígado humanas. Estas células progenitoras del hígado humanas son células madre hepáticas humanas, células pluripotentes que dan origen a hepatocitos y células biliares y otras subpoblaciones de células progenitoras del hígado que pueden expandirse y diferenciarse en uno o más linajes de células del hígado incluyendo linajes de células hemopoyéticas, mesenquimatosas o hepáticas. En particular, la invención se refiere a marcadores y propiedades usadas para identificar células progenitoras del hígado humanas, métodos de su purificación, enfoques novedosos que permiten distinguir subpoblaciones hepáticas de hemopoyéticas y pruebas que demuestran que las células progenitoras hepáticas existen en hígados desde hígados humanos fetales hasta adultos. Las invenciones constituyen la base para las terapias celulares y génicas y para la creación de órganos bioartificiales.

Antecedentes

La unidad funcional y estructural principal del hígado maduro es el ácino, que en sección transversal se organiza como una rueda alrededor de dos lechos vasculares distintos: 3-7 conjuntos de tríadas portales (cada una con una vénula porta, una arteriola hepática y una vía biliar) para la periferia y con la vena central en el cilindro. Las células del hígado se organizan como placas celulares alineadas en ambos lados mediante endotelios fenestrados, que definen una serie de sinusoides que son contiguas con la vasculatura porta y central. Datos recientes han indicado que los canales de Hering, pequeños conductos ubicados alrededor de cada una de las tríadas portales, producen dúctulos minúsculos que se extienden y se unen en las placas del hígado a lo largo de toda la zona 1 formando un patrón similar al de un cepillo (Theise, N. 1999 Hepatology. 30: 1425-1433).

Un espacio estrecho, el espacio de Disse, separa los endotelios de los hepatocitos a lo largo de la sinusoide. Como resultado de esta organización, los hepatocitos tienen dos dominios basales, cada uno de los cuales está frente a una sinusoide y un dominio apical que se define por la región de contacto entre hepatocitos adyacentes. Los dominios están en contacto con la sangre y están implicados en la absorción y secreción de componentes plasmáticos, mientras que los dominios apicales forman canalículos biliares, especializados en la secreción de sales biliares y se asocian a través de una red de interconexión con las vías biliares. La sangre fluye desde las vénulas porta y arteriolas hepáticas a través de las sinusoides hasta las vénulas hepáticas terminales y la vena central.

Basándose en este patrón microciculatorio, el ácino se divide en tres zonas: zona 1, la región periportal; zona 2, la región media del ácino y zona 3, la región pericentral. El potencial proliferativo, criterios morfológicos, ploidía y la mayoría de los genes específicos del hígado se correlacionan con la ubicación zonal (Gebhardt, R., et al. 1988. FEBS Lett. 241: 89-93; Gumucio, J. J. 1989, Vol. 19. Springer International, Madrid; Traber, P. et al. 1988. Gastroenterology. 95: 1130-43). Los gradientes en la concentración de componentes sanguíneos, incluyendo oxígeno, a lo largo del ácino y siguiendo la dirección de flujo sanguíneo desde las tríadas portales hasta la vena central, son responsables de algo de esta zonación, por ejemplo la compartimentación recíproca de glicólisis y gluconeogénesis. Sin embargo, la zonación periportal de la proteína de conexión comunicante conexina 26 y la zonación pericentral de glutamina sintetasa, por citar solamente dos, son insensibles a tales gradientes, son más representativas de la mayoría de los genes específicos de tejido y parecen determinarse por factores intrínsecos a las células o a variables diferentes de flujo sanguíneo en el microentorno.

Además de los hepatocitos, las células epiteliales de las vías biliares (colangiocitos) y las células endoteliales, la región entre las vías porta y central contiene otros tipos de célula, tales como las células de Ito y células de Kupffer. Estas desempeñan papeles prominentes en estados patogénicos del hígado, especialmente en inflamación y fibrosis, pero su contribución directa a las principales funciones homeoestáticas del órgano normal es aparentemente pequeña.

El hígado desarrolla como resultado de la convergencia de un divertículo formado desde el intestino anterior caudal y el tabique transverso, parte del mesénquima esplácnico. La formación de las células hepáticas empieza después de que el epitelio endodérmico interacciona con el mesoderma cardiogénico, probablemente por medio de factores de crecimiento de fibroblastos. Las células hepáticas especificadas entonces proliferan y penetran en el mesénquima del tabique transverso de una manera similar a un cordón, formando el primordio del hígado. La interacción directa epitelio-mesénquima es crítica en estas fases de desarrollo tempranas del hígado y dicta qué células serán hepatocitos o colangiocitos y los endotelios fenestrados, respectivamente. Las mutaciones en los genes específicos del mesénquima hlx y jumonji bloquean el desarrollo del hígado, ilustrando la importancia de las contribuciones de este tejido. De manera temprana en su desarrollo, el hígado consiste en agrupaciones de hepatocitos primitivos unidos por un epitelio continuo que carece de una membrana basal y abundantes células hemopoyéticas. Cuando el endotelio se transforma para volverse un endotelio discontinuo, fenestrado, la vasculatura, especialmente la vasculatura portal, se desarrolla más con la producción de membranas basales. El intersticio portal puede proporcionar el desencadenante para el desarrollo de las vías biliares y cuando rodea las vénulas porta, arteriolas hepáticas y vías biliares, se forman las tríadas portales. Los hepatocitos inmaduros proliferan rápidamente y se forman placas parenquimatosas, probablemente en respuesta a los cambios en la cantidad y distribución de tales moléculas de organización de tejido como C-CAM 105, Agpl 10, E-caderina y conexinas, coincidentes con la reubicación de la mayoría, pero no todas, de las células hemopoyéticas en la médula ósea. Estudios recientes sugieren que algunas células progenitoras hemopoyéticas persisten en el hígado de roedor quiescente adulto y células madre hemopoyéticas se han aislado tanto de hígado humano como murino adulto (Crosbie, O. M. et al. 1999. Hepatology. 29: 1193-8). La organización física madura se logra en el plazo de las primeras semanas después del nacimiento en roedores y en seres humanos, en los primeros años. La zonación metabólica se establece según programas algo diferentes para enzimas diferentes, pero se vuelve evidente en el periodo después del nacimiento.

Células madre y células progenitoras comprometidas

Se han definido las células madre como células primitivas que se autorreplican, que son pluripotentes, es decir producen células hijas con más de un destino, que pueden expandirse por todas partes y pueden reconstituir un tejido o tejidos. La mayoría de la bibliografía sobre células madre deriva o bien de la bibliografía sobre embriones o bien aquellas sobre tejidos hemopoyéticos, epidérmicos o intestinales.

Más recientemente, se han modificado las definiciones para reconocer clases particulares de células madre. Aquellas con el potencial para participar en el desarrollo de todos los tipos de células, incluyendo células germinales se denominan células madre totipotentes e incluyen el cigoto y las células embrionarias normales hasta la fase de 8 células (la mórula). Células madre embrionarias, también denominadas células "ES", consisten en poblaciones celulares permanentes derivadas de células totipotentes, normales en blastocitos, que se notificaron por primera vez en los primeros años 80. Las líneas celulares ES pueden cultivarse in vitro con el mantenimiento de la totipotencia. Las células ES son oncogénicas si se introducen en huéspedes inmunocomprometidos en cualquier sitio distinto del útero, formando teratocarcinomas. Sin embargo, cuando se inyectan de nuevo en blastocistos normales, son capaces de reanudar el desarrollo embrionario y participar en la formación de un ratón normal, pero quimérico. Aunque las líneas celulares ES se han establecido a partir de muchas especies (ratón, rata, cerdo, etc.), solamente el sistema de ratón se ha usado rutinariamente para generar animales con fenotipos novedosos (desactivados, transgénicos) fusionando células ES modificadas a partir del cultivo con blastocistos y entonces implantando los blastocistos en huéspedes pseudopreñados. Las líneas celulares germinales embrionarias (EG), que muestran muchas de las características de las células ES, pueden aislarse directamente in vitro de la población de células germinales primordiales. Tal como con las células ES, las células EG forman teratocarcinomas cuando se inyectan en ratones inmunocomprometidos y participan en quimeras, incluyendo la línea germinal, cuando se inyecta en blastocistos.

Las células madre determinadas son células pluripotentes que tienen restringido su potencial genético al de un número limitado de tipos celulares y tienen un potencial de crecimiento extenso. Más pruebas tales como aquellas del campo de la telomerasa sugieren que las células madre determinadas no se autorreplican, es decir que su progenie puede tener menos potencial de crecimiento que su progenitor. Las células madre determinadas dan origen a células hija que pierden pluripotencia restringiendo su potencial genético a un destino único, por ejemplo hepatocitos y se denominan células progenitoras comprometidas. En los linajes hepáticos hay células progenitoras de hepatocitos comprometidas y células progenitoras biliares comprometidas.

Recientemente, experimentos sumamente divulgados han notificado que cultivos de células ES humanas pueden establecerse a partir de embriones humanos. Se ha sugerido que estas células ES humanas pueden inyectarse en tejidos con la esperanza de que puedan reconstituir órganos y tejidos dañados. Dados los hallazgos de que células ES y EG forman tumores cuando se inyectan en sitios distintos del útero (véase anteriormente), el plan de inocular células ES humanas en pacientes es poco realista y con la grave posibilidad de crear tumores en los pacientes. Para superar este problema, algunos grupos están persiguiendo el plan de diferenciación de las células ES en condiciones de microentorno definidas para que se vuelvan células madre determinadas que entonces pueden inocularse de manera segura en pacientes. Por ejemplo, existe alguna medida de éxito para generar células progenitoras hemopoyéticas. Sin embargo, la preocupación permanece en que las células ES residuales en el cultivo pueden tener el riesgo de oncogénesis, si se inoculan los cultivos en un paciente. En resumen, hasta que la investigación en biología del desarrollo revele las miríadas de controles que dictan los destinos de las células durante la embriogénesis, las células ES permanecerán como una herramienta experimental con pocas esperanzas para obtener programas clínicos en terapias celulares o génicas. La única opción realista para obtener programas clínicos en terapias celulares y génicas es usar células madre determinadas en las que el potencial génico se restringe a un número limitado de tipos celulares. En comparación, las células ES pueden ser la gran promesa para obtener órganos bioartificiales para aquellos tipos de tejido (por ejemplo, células hemopoyéticas) que se producen mediante células ES en condiciones conocidas.

Controversia con respecto a células madre del hígado

La presencia de células madre en hígado normal adulto es el tema de gran controversia en el campo de la biología de células del hígado. A continuación se resumen los diversos modelos que prevalecen compitiendo en el campo. El texto en cursiva indica la idea clave de los diferentes modelos.

Algunos expertos en el campo acreditan que las células madre hepáticas existen solamente en tejido embrionario, que no existen células madre en hígados adultos y que todas las células del hígado maduras participan igualmente en los procesos regenerativos del hígado (Farber, E. 1992. In The Role of Cell Types in Hepatocarcinogenesis. S. A. E, editor. Academic Press, Nueva York). El modelo de Farber considera que todas las células parenquimatosas maduras son análogas fenotípicamente y que la heterogeneidad conocida de potencial de crecimiento y expresión génica en hígado se debe solamente al microentorno. Farber propone que en estados oncogénicos, las células parenquimatosas adultas se retrodiferencian y se vuelven células tumorales. Este modelo predominó en el campo de la oncogénesis del hígado durante décadas y todavía tiene impacto en estudios de regeneración del hígado.

Otros expertos acreditan que todas células del hígado son células madre (Kennedy, S. et al. 1995. Hepatology. 22: 160-8; Michalopoulos, G. K. et al. 1997, Science. 276: 60-6). Estos investigadores acreditan que todas las células parenquimatosas son análogas, son sumamente plásticas y con expresión génica dictada solamente por el microentorno. En estados oncogénicos apropiados, las células parenquimatosas maduras se vuelven hipotéticamente células madre que pueden convertirse posteriormente en células tumorales.

El modelo de célula madre silenciosa se basa en los estudios de Wilson y Leduc (Wilson, J. W. et al. 1958. J. Pathol. Bacteriol. 76: 441-449). Tal como en el campo hemopoyético, este concepto ganó la mayor credibilidad a partir de los estudios extensos de ovogénesis del hígado (Marceau, N. 1994. Gut. 35: 294-6). Estos investigadores acreditan que las células progenitoras, incluyendo las células progenitoras bipotenciales, pueden persistir en tejido adulto pero proponen que son vestigios raros o remanentes de poblaciones celulares del desarrollo embrionario. Suponen que las células progenitoras no desempeñan un papel en el funcionamiento del hígado normal o regenerativo pero solamente en estado de enfermedad (Overturf K, et al. 1999. American Journal of Pathology. 155: 2135-2143). Es decir, suponen que son "silenciosas", similar a las células satélites en el músculo. Estas células se han descrito como "células ovales" debido a la forma distintiva de los núcleos de células. Éstas son pequeñas (\sim9 um) y expresan un perfil antigénico característico en la superficie celular. Se supone que todas las células del hígado maduras son análogas con respecto al crecimiento y la expresión génica y que todos los aspectos de heterogeneidad de expresión génica se establecen sólo por el microentorno celular. Los proponentes del modelo de la célula madre silenciosa rechazan fuertemente cualquier idea de movimiento de las células parenquimatosas desde las ubicaciones periportales hasta las pericentrales. Se piensa que la importancia de las células madre y otras células progenitoras hepáticas es relevante solamente para estados de enfermedad, especialmente la oncogénesis. Por tanto, estos investigadores han concentrado sus esfuerzos en células progenitoras candidatas en animales tratados con diversas lesiones oncogénicas. Estos estudios muestran que las "células ovales" no forman un cuerpo reconocible de células en proliferación de manera rápida en estados regenerativos o en estados de daños medios a moderados. Se observan números significativos de poblaciones de células ovales en proliferación solamente sólo tras producirse lesiones del hígado bastante graves, (Grisham, J. W. et al. 1997. in Stem Cells. C. S. Potter, editor. Academic Press, Londres. 233-282).

Un modelo basado en el flujo de células del hígado (Arber, N. et al. 1988. Liver. 8: 80-7; Zajicek, G. et al. 1991. Liver. 11: 347-51) se ha criticado con dureza e ignorado en buena parte (Jirtle, R. L. 1995. Liver Regeneration and Carcinognesis: Molecular and Celular Mechanisms. Academic Press, Nueva York). Esta proposición postula que un compartimiento de célula madre en cada una de las tríadas portales proporciona células parenquimatosas adultas que "fluyen" hacia la vena central. El proceso de flujo pone las células hija en contacto con distintos microentornos dando como resultado cambios en el fenotipo de las células. De nuevo, se realiza la hipótesis de que el microentorno es el determinante crítico del fenotipo. Una gran parte de los investigadores han discutido en contra de este modelo, lo que sugiere que no concuerda con los estudios que no muestran movimientos de células donadoras marcadas reintroducidas en el hígado (Kennedy, S. et al. 1995. Hepatology. 22: 160-8). Sin embargo, incluso en estudios que han proporcionado las pruebas más definitivas en respuesta al modelo de flujo, se desconoce si el microentorno o la posición de linaje influyen en la expresión de marcadores usados en las células donadoras. Además, la hipótesis de hígado con flujo probablemente se volverá a visitar tras los hallazgos recientes de Thiese y sus asociados (Theise, N. 1999. Hepatology. 30: 1425-1433.) que los canales de Herring, que se sospecharon por mucho tiempo de estar relacionados con las células progenitoras hepáticas, extienden dúctulos por toda la placa del hígado al menos en la zona 1.

Reid y asociados han defendido que el hígado es un sistema de linaje madurativo y células madre (Sigal, S. H. et al. 1992. Am J Physiol. 263: G 139-48). Proponen que los tejidos se organizan como linajes madurativos alimentados, como una fuente, mediante células madre o poblaciones de células progenitoras tempranas (Brill, S. et al. 1993. Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine. 204: 261-9). Se define el tejido como que van desde "jóvenes, a edad media hasta células viejas". El proceso madurativo está acompañado de cambios dependientes de posición de linaje en el tamaño de célula, la morfología, los perfiles antigénicos, el potencial de crecimiento y la expresión génica. Se realiza la hipótesis de que estos cambios se deben a una combinación de cambios celulares autónomos, independientes del microentorno y de cambios inducidos por el microentorno; el microentorno comprende los nutrientes, intercambio de gases (oxígeno, CO_{2}), pH, hormonas, interacciones entre células y química de la matriz extracelular.

TABLA 1

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Se realiza una hipótesis de que el crecimiento es máximo en las células madre y las células progenitoras tempranas y que decae con la progresión a lo largo del linaje. Este modelo tiene en consideración que la mayoría de las células en el tejido del hígado adulto son poliploides, la mayor parte tetraploide u octaploide, menos de un tercio de las células son diploides. Datos recientes soportan el concepto de que el volumen del potencial regenerativo en un tejido deriva de la población de células diploides y de que las células más viejas contribuyen a la regeneración aumentando la masa celular por medio de respuestas hipertróficas asociadas con poliploidía. (Sigal, S. H. et al. 1999. American Journal of Physiology. 276: G1260-72). Por tanto, estos investigadores defienden que las mejores esperanzas para el crecimiento celular, ya sean en terapias celulares o génicas o en órganos bioartificiales, están con la población de células diploides del tejido.

El modelo de célula madre y linaje madurativo contradice otros modelos de desarrollo de células del hígado sugiriendo que el tumor de hígado es lo más frecuente un resultado indirecto, más que directo, de una lesión oncogénica. Se propone que las lesiones oncogénicas matan a la mayoría de las células del hígado, especialmente las células maduras en el linaje, dando como resultado una inducción drástica de una respuesta regenerativa. La expansión resultante de las células progenitoras aumenta el riesgo de acontecimientos mutacionales secundarios en las células en crecimiento de manera rápida, las células progenitoras, que pueden dar como resultado un tumor. Por tanto, las antiguas hipótesis de que el cáncer es una diferenciación bloqueada o de que los cánceres se deben a lesiones oncogénicas que seleccionan como diana a las células madre se aceptan como correctos pero con la modificación presentada anteriormente.

La aceptación creciente de un modelo de linaje madurativo se basa ahora en los datos de que el hígado está repleto de características indicativas de un proceso de diferenciación terminal o apoptótica (Sigal, S. H. 1995. Differentiation. 59: 35-42.) y los hallazgos de que solamente ciertas subpoblaciones de células del hígado presentes en hígados adultos puede producir la división celular extensa (Overturf K, et al. 1999. American Journal of Pathology. 155: 2135-2143; Tateno, C et al. 2000. Hepatology. 31: 65-74). En este modelo, las células progenitoras y una subpoblación de células adultas (que se supone que es la subpoblación diploide) pueden reconstituir tejido del hígado cuando se vuelven a inyectar in vivo y pueden producir el crecimiento extenso incluyendo el crecimiento clonal.

La patente estadounidense número 5.559.022 concedida a Naughton da a conocer el aislamiento de células del hígado y la purificación adicional mediante el uso de centrifugación por gradiente. Sin embargo, la población de células aislada es la "población de células parenquimatosas acidófila" que no son las células progenitoras del hígado de esta invención tal como se reivindica.

Aplicabilidad preclínica y clínica de células progenitoras hepáticas

Hay un fuerte interés clínico y comercial para aislar e identificar células progenitoras inmaduras del hígado debido al impacto que tal población de células puede tener para tratar enfermedades del hígado. Cada año en los Estados Unidos, existen aproximadamente 250.000 personas hospitalizadas por insuficiencia hepática. Los trasplantes de hígado son curativos para algunas formas de insuficiencia hepática y se realizan aproximadamente 4100 trasplantes por año en los Estados Unidos. Uno de los factores limitativos en el trasplante de hígado es la disponibilidad de hígados de donantes, especialmente dada la restricción de que los hígados de donantes para el trasplante de órganos deben originarse de pacientes que hayan experimentado muerte cerebral pero no paro cardíaco. Los hígados de donantes cadavéricos no han tenido éxito, aunque esfuerzos recientes para usar tales donantes han apoyado la posibilidad de usarlos si se obtiene el hígado en el plazo de una hora de la muerte.

El trasplante celular en el hígado es un tratamiento alternativo atractivo para la mayoría de las enfermedades del hígado. Los procedimientos quirúrgicos para el trasplante celular son menores con respecto a aquellos necesarios para el trasplante de todo el órgano y, por tanto, pueden usarse para pacientes con diversos riesgos quirúrgicos tales como la edad o la dolencia. El uso de células del hígado humanas es superior a las células del hígado derivadas de otros mamíferos porque los posibles patógenos, si hay alguno, son de origen humano y pueden tolerarse mejor por los pacientes y podrían detectarse fácilmente antes del uso.

Los intentos para realizar un trasplante de células del hígado han hecho uso de células del hígado maduras no fraccionadas y han mostrado alguna medida de eficacia (Fox, I. J. et al. 1998. New England Journal of Medicine. 338: 1422-1426). Sin embargo, los éxitos requieren la inyección de grandes números de células (10-20 mil millones), puesto que las células no crecen in vivo. Además, se complica la introducción de números sustanciales de células del hígado maduras grandes (diámetro celular promedio de 30-50 \mu) por su tendencia a formar grandes agregados tras la inyección, dando como resultado émbolos potencialmente mortales. Además, estas células provocan una respuesta de rechazo inmunológica marcada forzando a los pacientes a mantenerse con fármacos inmunosupresores para el resto de sus vidas. Finalmente, las células del hígado maduras no se han crioconservado con éxito y se requieren logísticas complicadas para coordinar la disponibilidad de tejido del hígado adecuado, la preparación de suspensiones celulares y la administración inmediata de las células para tratamientos clínicos.

Avances en el aislamiento de células progenitoras del hígado

Se sabe que el aislamiento de células progenitoras del hígado a partir del hígado es una tarea extremamente desafiante debido a una escasez de marcadores que seleccionan positivamente las células del hígado. Los únicos anticuerpos disponibles para ser candidatos de células progenitoras hepáticas son los anticuerpos monoclonales que se preparan frente a subpoblaciones de células progenitoras hepáticas (células ovales) inducidas para proliferar después de la exposición a lesiones oncogénicas. Sin embargo estos anticuerpos reaccionan de manera cruzada con antígenos presentes en células hemopoyéticas.

Se han realizado anteriormente intentos para obtener la población de células progenitoras hepáticas, que sugirieron ser la población más versátil para terapia celular y génica del hígado. Las patentes estadounidenses números 5.576.207; 5.789.246 concedidas a Reid et al. utilizan marcadores de superficie celular y citometría de flujo con dispersión lateral para proporcionar una subpoblación definida en el hígado. Se han aislado subpoblaciones de células hepáticas de rata mediante eliminación de células comprometidas de linaje seguido por la selección de células precursoras hepáticas inmaduras que se detectaron que eran células agranulares que portan marcadores celulares positivos para OC.3 (marcador antigénico de célula oval), positivos para AFP, positivos para albúmina y negativos para CK19 (citoqueratina 19). Las subpoblaciones de hígado de rata anteriores demuestran características particulares importantes en el aislamiento y la identificación de células progenitoras hepáticas enriquecidas a partir de hígado de roedor.

El aislamiento de células progenitoras del hígado a partir de hígado humano adulto, tal como se da a conocer en el presente documento, es novedoso e inesperado debido parcialmente a la controversia con respecto a la mera presencia de células progenitoras del hígado en el adulto en el que se ha supuesto que las células progenitoras hepáticas humanas o bien no están presentes o bien es un remanente fisiológicamente silencioso de la embriogénesis. Por tanto, no se han realizado intentos para aislarlas o estudiarlas excepto en estados de enfermedad.

A modo de contraste, dentro del hígado en desarrollo, la presencia de las proteínas citoplasmáticas alfa-fetoproteína (AFP) y albúmina se reconoce como un indicador fuertemente positivo de células progenitoras. En las fases más tempranas del desarrollo del hígado estas células pueden producir progenie que entra tanto en los linajes biliares como los de hepatocitos. Si estas células hija se comprometen hasta el linaje biliar, la expresión de alfa-fetoproteína cesa. Sin embargo, la expresión de alfa-fetoproteína persiste en el linaje de hepatocitos hasta el período perinatal cuando se suprime, dejando la expresión de albúmina como una de las características principales del hepatocito adulto.

Sin embargo, dado que la alfa-fetoproteína es una proteína intracelular y solamente puede visualizarse tras la fijación y permeabilización de la célula, es inadecuada como marcador para la identificación de células progenitoras hepáticas viables.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método para proporcionar una composición que comprende una mezcla de células derivadas de tejido del hígado humano, mezcla que comprende una población enriquecida de células progenitoras hepáticas humanas, comprendiendo el método: (a) proporcionar una suspensión sustancialmente de una única célula de tejido del hígado humano extraído; (b) reducir el volumen de la suspensión basándose en el tamaño de célula, la densidad de flotación o una combinación de los mismos para eliminar las células maduras al tiempo que se conservan las células inmaduras; y (c) someter la suspensión con volumen reducido a una inmunoselección positiva que comprende seleccionar aquellas células que expresan CD14, CD34, CD38 o combinaciones de las mismas, y/o una inmunoselección negativa que comprende eliminar aquellas células que expresan CD45, glicoforina A o una combinación de las mismas, de tal manera que se proporciona una mezcla de células, mezcla de células que está compuesta por una población enriquecida de células progenitoras hepáticas humanas y expresa alfa-fetoproteína, albúmina o ambas. La alfa-fetoproteína y la albúmina pueden ser de longitud total o un variante. El procedimiento de reducción de volumen puede comprender una separación por tamaño de célula, densidad de flotación o ambos. La reducción de volumen también puede basarse en la velocidad de sedimentación, el radio hidrodinámico y la sedimentación hasta densidad de equilibrio. Alternativamente, la separación puede ser mediante adherencia relativa de marcadores de superficie para unir componentes, por ejemplo anticuerpos o lecitinas. Las células progenitoras aisladas pueden ser diploides y pueden ser inferior a aproximadamente 15 micras de diámetro. Además, las células progenitoras pueden sintetizar macromoléculas características de células progenitoras, incluyendo, pero sin limitarse a alfa-fetoproteína y albúmina. Preferiblemente, la alfa-fetoproteína incluye la secuencia peptídica codificada por el exon 1 de (aFP). Por tanto la alfa-fetoproteína se transcribe a partir de un ARNm superior a 2 Kb de tamaño, un ARNm de aFP de longitud completa. Igualmente, la albúmina preferiblemente incluye la secuencia peptídica codificada por el exon1 de (ALB). Por tanto la albúmina se transcribe a partir de un ARNm de longitud completa.

En una realización de la invención, el tejido del hígado se obtiene de un recién nacido, un lactante, un niño, un joven o un adulto.

En otra realización de la invención, la población enriquecida comprende células del hígado diploides humanas.

En una realización adicional de la invención, la etapa de reducción del volumen comprende la elutriación centrífuga, centrifugación por gradiente de densidad, adsorción "panning", cromatografía de afinidad, etiquetado con etiquetas fluorescentes, flujo fluido a contracorriente, centrifugación de flujo continuo, centrifugación zonal, uso de perlas magnéticas o combinaciones de los mismos.

En otra realización, la invención comprende la lisis selectiva de las células maduras.

En una realización de la invención, las células inmaduras tienen un diámetro entre 5 y 15 micras.

En otra realización de la invención, las células inmaduras tienen un diámetro entre 8 y 9,4 micras.

La presente invención se refiere a un método de aislamiento de células progenitoras de hígado humano que incluye procesar tejido del hígado humano para proporcionar una suspensión sustancialmente de una única célula incluyendo células progenitoras y células no progenitoras de uno o más linajes celulares encontrados en el hígado humano; someter la suspensión a una etapa de reducción del volumen, que reduce sustancialmente el número de células no progenitoras en la suspensión, para proporcionar una suspensión de volumen reducido enriquecida en células progenitoras que muestran uno o más marcadores asociados con al menos uno de los linajes celulares; seleccionar de la suspensión con volumen reducido aquellas células que expresan al menos un marcador asociado con al menos un linaje de células del hígado, es decir CD14, CD34, CD38 o combinaciones de las mismas. Las etapas de procesamiento o de reducción del volumen de esta invención preferiblemente incluyen una centrifugación por gradiente de densidad o elutriación centrífuga de la suspensión de células del hígado para separar las células según su densidad de flotación y/o tamaño, que se asocian con una o más fracciones de gradiente que tienen una densidad de flotación inferior y/o menor tamaño. El método de gradiente de densidad puede incluir centrifugación zonal y centrifugación de flujo continuo.

Una realización de la invención es la selección negativa de células no progenitoras incluyendo células mesenquimatosas, hemopoyéticas y hepáticas maduras mediante el uso de marcadores asociados con células hepáticas maduras, marcadores asociados con células hemopoyéticas, tales como glicoforina A y CD45.

Los inventores han encontrado que el uso de células progenitoras hepáticas puede superar muchas de las deficiencias asociadas con el uso de células del hígado maduras, haciéndolas células ideales para su uso en terapias celulares y génicas y para obtener órganos bioartificiales. Las células son pequeñas (7-15 \mu), minimizando de ese modo la formación de émbolos grandes. Además, las células tienen potencial de crecimiento extenso lo que significa que pocas células son necesarias para la reconstitución de tejido del hígado en un paciente. Finalmente, las células progenitoras tienen marcadores antigénicos mínimos que podrían provocar rechazo inmunológico proporcionando la esperanza de que pudiera ser necesario poco o ningún fármaco inmunosupresor. El tratamiento con células del hígado implica o bien tratamiento extracorpóreo o bien trasplante de células del hígado. Las células, preferiblemente incluyendo células progenitoras, se suministran de cualquiera de diversas formas, incluyendo por vía parenteral y por vía intraperitoneal. Una cantidad eficaz de células es necesaria, preferiblemente entre 103 y 10 10 células. Se trasplantan más preferiblemente entre 105 y 108 células, de manera óptima aproximadamente 106 células.

Las células progenitoras del hígado son extremamente útiles para la producción de factores de crecimiento y otras proteínas. Estos factores están asociados con su propio crecimiento o el de otras células progenitoras en el hígado (por ejemplo células progenitoras mesenquimatosas o hemopoyéticas) y factores asociados con etapas tempranas en la dedicación de células progenitoras hepáticas a un linaje particular. Estos factores de crecimiento novedosos pueden usarse para tratar enfermedades del hígado o para controlar aquellos cánceres que son transformantes de las células progenitoras del hígado. Además, las células progenitoras del hígado son importantes dianas para terapia génica, en la que las células progenitoras hepáticas normales o transformadas genéticamente insertadas promueven la salud del individuo en el que se trasplantan tales células progenitoras hepáticas.

Se da a conocer en el presente documento la determinación de perfiles antigénicos únicos en la superficie celular que se correlacionan con la expresión de alfa-fetoproteína dentro de la célula. La caracterización de células que contienen alfa-fetoproteína de este modo permite el posterior enriquecimiento de células progenitoras hepáticas viables mediante metodología de citometría de flujo de suspensiones de una única célula viva preparadas a partir de hígados enteros o lóbulos de hígado. Además, el aislamiento y la identificación de células progenitoras hepáticas humanas tal como de describe en el presente documento se obtuvieron a través de la aplicación de una combinación de métodos, marcadores y parámetros únicos que los presentes inventores usaron por primera vez para lograr la población de células únicas de esta invención.

Un aspecto adicional de esta invención proporciona células progenitoras del hígado de origen hepático, hematopoyético o mesenquimatoso. Estos linajes celulares se seleccionan mediante marcadores antigénicos seleccionados del grupo que consiste en CD14, CD34, CD38, CD45, y/o glicoforina A y expresa marcadores citoplásmicos tales como alfa-fetoproteína, albúmina o ambos. La alfa-fetoproteína puede derivarse de un ARNm longitud completa (superior a 2 Kb, la forma expresada normalmente en células progenitoras hepáticas) o a partir de una forma variante (inferior a 2 Kb, es decir de aproximadamente 0,5, 0,8, 1, 1,5 ó 2 Kb, la forma expresada normalmente en células progenitoras hemopoyéticas). Las células progenitoras del hígado de esta invención pueden aislarse del hígado de un feto, un recién nacido, un lactante, un niño, un joven o un adulto.

Según aun un aspecto adicional de esta invención, se aíslan células progenitoras del hígado humanas aisladas de forma sumamente enriquecida a sustancialmente pura. Tales células progenitoras del hígado contienen células progenitoras hepáticas, hemopoyéticas y mesenquimatosas. Las células progenitoras hepáticas pueden desarrollarse en hepatocitos, células biliares o una combinación de las mismas; las células progenitoras hematopoyéticas pueden desarrollarse en macrófagos, neutrófilos, granulocitos, linfocitos, plaquetas, neutrófilos eosinófilos, basófilos o una combinación de los mismos. Las células progenitoras mesenquimatosas pueden desarrollarse en células endoteliales, células del estroma, células estrelladas hepáticas (células de Ito), células cartilaginosas, células óseas o combinaciones de las mismas.

Las células progenitoras del hígado pueden albergar ácido nucleico exógeno. Tal ácido nucleico exógeno puede codificar para al menos uno polipéptido de interés o puede promover la expresión de al menos un polipéptido de interés.

Los efectos negativos de uno o más trastornos o disfunciones humanos pueden mejorarse administrando a un individuo que padece tales efectos negativos una cantidad eficaz de células progenitoras del hígado humanas aisladas. Las células progenitoras pueden administrarse o bien por vía intraperitoneal o bien por vía parenteral por medio de un vaso vascular o administrarse directamente en el hígado. La administración directa puede efectuarse quirúrgicamente por medio de la vena porta, vena mesentérica, arteria hepática, vía biliar hepática o combinaciones de las mismas. Alternativamente, las células progenitoras del hígado pueden administrarse en un sitio ectópico del individuo, tales como el bazo o peritoneo.

Los trastornos o disfunciones humanos que pueden mejorarse mediante la administración de las células progenitoras del hígado humanas aisladas dadas a conocer en el presente documento incluyen: hepatocolangitis, hepatomalacia, hepatomegalia, cirrosis, fibrosis, hepatitis, insuficiencia hepática aguda, insuficiencia hepática crónica o enzimopatía congénita y cáncer de hígado tales como hepatocarcinoma o hepatoblastoma. El cáncer de hígado puede ser un sitio primario de cáncer o uno que se ha metastatizado en el hígado. El tumor metastásico podría derivarse de cualquier número de sitios primarios incluyendo, intestino, próstata, mama, riñón, páncreas, piel, cerebro, pulmón o una combinación de los mismos.

Además, un biorreactor puede incluir material biológico que comprende células progenitoras aisladas del hígado humano; y medios de cultivo, tales como medios basales; uno o más compartimentos que soportan el material biológico o los componentes que comprenden el material biológico; y opcionalmente uno o más puertos de conexión. Además el biorreactor opcionalmente también puede incluir: matriz extracelular; hormonas, factores de crecimiento, nutrientes o combinaciones de los mismos; y un fluido biológico tal como suero, plasma o linfa.

El biorreactor está adaptado para sostener dichas células progenitoras en un estado funcional, viable y puede sostener células progenitoras del hígado durante un periodo que oscila desde aproximadamente una semana hasta aproximadamente 55 semanas. Específicamente, el biorreactor está adaptado para su uso como hígado artificial, para la fabricación de productos, estudios toxicológicos o estudios metabólicos, incluyendo estudios que implican la actividad del citocromo P450 u otros tipos de metabolismo de fármacos.

Se da a conocer en el presente documento una composición de células progenitoras del hígado humanas aisladas o se proporciona una suspensión enriquecida en células progenitoras obtenidas del hígado humano. La suspensión celular puede proporcionarse en un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y se administra a un sujeto que necesita el tratamiento. La composición dada a conocer incluye células progenitoras del hígado que muestran uno o más marcadores asociados con al menos uno de uno o más linajes celulares encontrados en el hígado humano y están sustancialmente libres de células maduras. Más particularmente, las células progenitoras del hígado aisladas se derivan de uno o más linajes de células del hígado incluyendo linajes de células hepáticas, hemopoyéticas o mesenquimatosas y expresan al menos uno o más de marcadores antigénicos CD14, CD34, CD38 y marcadores citoplásmicos de alfa-fetoproteína, albúmina o ambos. En una realización adicional, las células inmaduras, su progenie o formas más maduras expresan osteopontina, sialoproteína ósea, colágeno I, colágeno III, colágeno IV o una combinación de los
mismos.

Un sistema de cultivo celular de células progenitoras del hígado puede incluir células progenitoras aisladas del hígado humano. El sistema de cultivo celular adicionalmente incluye matriz extracelular que comprende uno o más colágenos, una o más proteínas de adhesión (lamininas, fibronectinas) y otros componentes tales como proteoglicanos (tales como proteoglicanos de heparán sulfato); o un componente de matriz individual. El componente de matriz incluye fragmentos de componentes de matriz, miméticos de matriz que pueden ser materiales sintéticos y biodegradables (es decir microesferas) recubiertos con uno o más de los factores de una de las clases de matrices extracelulares. El sistema de cultivo celular adicionalmente puede incluir medios basales o enriquecidos y otros nutrientes; hormonas, factores de crecimiento, y, opcionalmente, un fluido biológico tal como suero, plasma o linfa. Adicionalmente, el sistema de cultivo celular puede tener uno o más compartimentos que soportan el material biológico tales como una placa de cultivo, placa, matraz, botella de cultivo rotatoria, Transwell u otro recipiente de este tipo.

Los cultivos o biorreactores pueden usarse en uno o más estudios metabólicos incluyendo estudios que implican la actividad de sistemas enzimáticos de biotransformación en fase I o II, uno o más estudios de transporte incluyendo estudios que implican la expresión, regulación y actividad de sistemas de transporte canaliculares y sinusoidales hepáticos, facetas de metabolismo de fármacos y la actividad del citocromo P450 entre otros.

Un método para la crioconservación de células adherentes puede comprender (a) proporcionar células adherentes y una matriz o un potenciador de la viscosidad; (b) suspender las células en una mezcla de crioconservación que comprende medio de cultivo, un inhibidor de cristales de hielo, un factor de regulación de hidratos de carbono, un donador de hierro, una lipoproteína y un lípido; y (c) enfriar la suspensión hasta por debajo del punto de congelación de las células. El punto de congelación en el presente documento significa la temperatura a la que las células se vuelven una masa sólida, ya sea o no un vidrio o líquido superenfriado, una masa microcristalina o macrocristalina. Además, se da a conocer una mezcla para la crioconservación que comprende un medio de cultivo, un inhibidor de cristales de hielo, un factor de regulación de hidratos de carbono, un donador de hierro, una lipoproteína y un lípido. La mezcla de crioconservación también puede incluir un antioxidante, tales como ácido ascórbico, glicerol (10% v/v) o dimetilsulfóxido (DMSO, al 10% v/v), los dos últimos agentes que pueden actuar como inhibidores de la formación de cristales de hielo. El factor de regulación de hidratos de carbono puede ser insulina o factor de crecimiento similar a insulina. El donador de hierro, la lipoproteína y el lípido pueden ser transferrina, lipoproteína de alta densidad y ácidos grasos libres, respectivamente. Los ácidos grasos libres se complejan opcionalmente con albúmina. La mezcla de crioconservación puede incluir colágeno, una sustancia similar a colágeno, agarosa, metilcelulosa o gelatina, en la que el colágeno puede ser colágeno I, colágeno, III o colágeno IV. Los componentes de la mezcla de crioconservación pueden prepararse en disolución de crioconservación de Viaspan o de la Universidad de Wisconsin.

Además, una colección, un banco de células, un catálogo o depósito biológico pueden tener una pluralidad de células progenitoras hepáticas crioconservadas. Las células progenitoras pueden aislarse mediante el método descrito anteriormente. Por tanto, las células progenitoras pueden expresar marcadores indicativos de la expresión de alfa-fetoproteína de longitud completa, albúmina o ambas. El depósito puede incluir un sistema de indización de marcadores de células. Tras descongelar, las células del depósito pueden usarse para inocular biorreactores, para iniciar los cultivos celulares o para el tratamiento de pacientes.

El término alfa-fetoproteína tal como se utiliza en el presente documento comprende una alfa-fetoproteína variante que es el producto génico de un gen o ARNm en el que falta el exón 1, definido a continuación. Tal como se da a conocer en esta invención, la alfa-fetoproteína variante se asocia a menudo con células progenitoras hemopoyéticas y su progenie y no se asocia con células progenitoras hepáticas.

Puede tomarse un péptido de tres a diez aminoácidos de la secuencia codificada por el exón 1 de la alfa-fetoproteína.

Un conjugado de una macromolécula y un péptido que comprende entre tres y diez aminoácidos de la secuencia codificada por el exón 1 de la alfa-fetoproteína pueden ser adecuados para su uso como antígeno. La macromolécula puede ser albúmina, hemocianina, caseína, ovoalbúmina, polilisina, por ejemplo poli-L-lisina o poli-D-lisina, y cualquier otra macromolécula adecuada conocida en la técnica. El antígeno puede usarse para generar anticuerpos específicos para la alfa-fetoproteína cuya expresión es indicativa de células progenitoras hepáticas y no es indicativa de células progenitoras hemopoyéticas o su progenie. Los anticuerpos pueden producirse inmunizando un animal con el antígeno en ausencia o presencia de adyuvante, o exponiendo células del bazo al antígeno seguido por fusión de las células del bazo para formar hibridomas, tal como se conoce en la técnica.

En otra realización de la invención, se da a conocer un método para aislar células progenitoras de hígado humano, que comprende procesar tejido hepático humano para proporcionar una suspensión celular sustancialmente única que comprende células progenitoras y células que no son progenitoras de uno o más linajes celulares que se encuentran en el hígado humano, someter la suspensión a una etapa de reducción de volumen, que reduce sustancialmente el número de células que no son progenitoras en la suspensión para proporcionar una suspensión de volumen reducido enriquecida en células progenitoras que muestran uno o más marcadores asociados con al menos uno del uno o más linajes celulares, y seleccionar de la suspensión de volumen reducido aquellas células, que expresan uno o más marcadores mencionados anteriormente que se asocian con al menos uno del uno o más linajes celulares.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Análisis mediante PCR de ARNm de alfa-fetoproteína.

Figura 2. Análisis mediante PCR de ARNm de albúmina.

Figura 3. Efecto de la crioconservación sobre la viabilidad de células de hígado fetal.

Figura 4. Panel izquierdo, histograma de inmunofluorescencia de alfa-fetoproteína mediante FACS. Panel derecho, histograma de inmunofluorescencia de albúmina mediante FACS.

Figura 5. Tanto por ciento de células que expresan los marcadores de superficie CD14, CD34, CD38, CD45 y glicoforina A (GA) en suspensiones de células de hígado no fraccionadas.

Figura 6. Coexpresión de marcadores de la superficie celular y alfa-fetoproteína por células de hígado fetal.

Figura 7. Parte superior izquierda, tanto por ciento de células positivas para alfa-fetoproteína. Parte superior derecha, tanto por ciento de células positivas para albúmina. Parte inferior, efecto del fraccionamiento con Percoll sobre la coexpresión de alfa-fetoproteína y albúmina.

Figura 8. Análisis mediante FACS de una suspensión de células de hígado fetal para la coexpresión de CD14, CD38 y alfa-fetoproteína.

Figura 9. Rendimiento de células positivas para alfa-fetoproteína usando selección con CD14 y/o CD38.

Figura 10. Cuatro vistas de inmunofluorescencia representativas de células progenitoras hepáticas fetales teñidas para alfa-fetoproteína.

Figura 11. Efecto de la selección para CD14 (parte derecha): contraste por interferencia diferencial (parte superior) y vistas de inmunofluorescencia (parte inferior).

Figura 12A. Un grupo de células hepáticas mediante microscopía de contraste de fase.

Figura 12B. El mismo grupo de células hepáticas mediante inmunofluorescencia con anticuerpo contra alfa-fetoproteína.

Figura 12C. Una superposición de A y B.

Figura 13A. Células del hígado teñidas con calceína.

Figura 13B. Células del hígado teñidas con alfa-fetoproteína, misma vista que en el panel A.

Descripción detallada de realizaciones preferidas I. Definiciones

En la descripción que sigue, se usan varios términos para describir extensamente la invención. Con el fin de proporcionar un entendimiento claro y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que ha de darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

Inmunorreactividad de tipo alfa-fetoproteína: cualquier reacción inmunitaria provocada por la alfa-fetoproteína. La alfa-fetoproteína puede ser de longitud total o truncada, incluyendo isómeros y variantes de corte y empalme de alfa-fetoproteína.

Células progenitoras comprometidas: células inmaduras que tienen un único destino tales como células progenitoras comprometidas hepatocíticas (que dan lugar a hepatocitos)) o células progenitoras comprometidas biliares (que dan lugar a vías biliares). El proceso de compromiso no se entiende a nivel molecular. Más bien, se reconoce que se ha producido solamente de forma empírica cuando los destinos de las células se han limitado a partir del de un predecesor.

Células hepáticas: una subpoblación de células del hígado que incluye hepatocitos y células biliares.

Células del hígado: tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "células del hígado" se refiere a todos los tipos de células presentes en un hígado normal, independientemente de su origen o destino.

Células madre: tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "células madre" se refiere a células inmaduras que pueden dar lugar a células hija con más de un destino, es decir, son pluripotentes. Las células madre totipotentes, tales como células madre embrionarias (células ES) o células embrionarias hasta el estadio de 8 células de un embrión de mamífero, tienen capacidad de autorrenovación (automantenimiento) en la que la célula madre produce una célula hija idéntica a sí misma. Por el contrario, células madre determinadas, tales como células madre hemopoyéticas, neuronales, cutáneas o hepáticas, son pluripotentes y tienen una extensa capacidad de crecimiento pero tienen una capacidad de autorrenovación cuestionable. En el caso de células madre totipotentes, algunas células hija son idénticas a la parental, y algunas "se comprometen" a un/os destino(s) específico(s) limitando su potencial genético a aquel que es inferior al parental. En el caso de células madre determinadas, algunas células hija conservan su pluripotencia y algunas la pierden, comprometiéndose a un único destino específico.

Células progenitoras hepáticas: Estas células dan lugar a hepatocitos y células biliares. Las células progenitoras hepáticas incluyen tres subpoblaciones: "células madre hepáticas", "células progenitoras hepatocíticas comprometidas" y células progenitoras biliares comprometidas, siendo estas dos últimas células inmaduras que son descendientes de la célula madre hepática y que tienen un único destino, o bien hepatocitos o bien células biliares, pero no ambos.

Células madre hepáticas: una subpoblación de células progenitoras hepáticas.

Células progenitoras del hígado: una población celular del hígado, que incluye células progenitoras hepáticas, células progenitoras hemopoyéticas y células progenitoras mesenquimatosas.

Hemopoyesis: producción de células sanguíneas con destinos celulares de linfocitos (B y T), plaquetas, macrófagos, neutrófilos y granulocitos.

Mesengénesis: producción de derivados mesenquimatosos con destinos celulares de endotelio, adipocitos, células del estroma, cartílago e incluso hueso (produciéndose estos dos últimos en el hígado solamente en estados patológicos).

Terapia celular: tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "terapia celular" se refiere a la transferencia in vivo o ex vivo de poblaciones celulares definidas usadas como material autólogo o alogénico y trasplantadas a, o en las proximidades de, células diana específicas de un paciente. Las células pueden trasplantarse en cualquier medios, vehículos o diluyentes adecuados, o cualquier tipo de sistemas de administración de fármacos incluyendo, microvehículos, perlas, microsomas, microesferas, vesículas, etcétera.

Terapia génica: tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "terapia génica" se refiere a la transferencia in vivo o ex vivo de material genético definido para células diana específicas de un paciente, alterando así el genotipo y, en la mayoría de las situaciones, alterando el fenotipo de esas células diana para el fin último de prevenir o alterar un estado patológico particular. Esto puede incluir modificar la célula diana ex vivo e introducir las células en el paciente. Alternativamente, puede dirigirse un vector hasta células progenitoras del hígado in vivo para insertar el material genético exógeno y transfectar las células progenitoras. Además, pueden usarse células progenitoras modificadas mediante ingeniería genética en un biorreactor como terapia para pacientes o como fuente de productos biológicos. Tal como establece esta definición, la premisa subyacente es que estos procedimientos genéticos terapéuticos están diseñados para prevenir, tratar o alterar en última instancia un estado patológico sintomático o asintomático. En la mayoría de las situaciones, el objetivo terapéutico final de los procedimientos de terapia génica es alterar el fenotipo de una población celular diana específica.

CD:"grupo de diferenciación" o "determinante común" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a moléculas de la superficie celular reconocidas por anticuerpos monoclonales. La expresión de algunos CD son específicos para células de un linaje o ruta madurativa particular, y la expresión de otros varía según el estado de activación, posición o diferenciación de las mismas células.

Cuando se usan los términos "uno", "una" o "un" en esta descripción, significan "al menos uno/a" o "uno/a o más", a menos que se indique lo contrario.

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II. Alfa-fetoproteína y albúmina como marcadores de diagnóstico para linajes hepáticos

La alfa-fetoproteína (AFP) y la albúmina, ambas proteínas citoplasmáticas, son marcadores especialmente fiables para los linajes hepáticos. La expresión de estas proteínas es la base para la identificación de las subpoblaciones hepáticas de otros tipos de células en el hígado.

Las líneas celulares de leucemia humana y los linfocitos T normales, tras estimulación in vitro, también pueden expresar AFP. Sin embargo, los datos no tratan sobre si el ARNm de AFP en las líneas celulares de leucemia y los linfocitos T activados son una forma idéntica al ARNm de AFP auténtico en las células hepáticas. Ha de determinarse si puede medirse o no la expresión ARNm de AFP o albúmina mediante ensayos de proteínas de rutina, tales como inmunofluorescencia, inmunotransferencias, etc., porque la RT-PCR es la técnica más sensible conocida para identificar moldes de ARN particulares.

Antes de los estudios descritos en el presente documento, nadie había investigado en detalle las formas del ARNm de AFP o albúmina en células hemopoyéticas en seres humanos. En el presente documento, se demuestra esa expresión de las formas variantes de AFP y albúmina en células hemopoyéticas.

La figura 1 ilustra el análisis de células de hígado y que no son de hígado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores para varios exones del ARNm de la alfa-fetoproteína. El análisis por PCR revela AFP truncada en células hemopoyéticas. Se realizó RT-PCT usando la combinación de cebadores de hAFP1, hAFP2, hAFP3 y hAFP4. M = marcadores de peso molecular, carriles 1-3 = Hep3B; carriles 10-12 = fibroblastos STO; carriles 13-15 = sin ARN. Nota, hay una banda compartida, una isoforma de AFP truncada, en los carriles 2, 4 y 8. T en este caso es una isoforma de AFP variantes única para las células del hígado observada en los carriles 1 y 4. La especie de AFP completa se observa en los carriles 3 y 6. Los inventores han diseñado nueve cebadores de PCR con el fin de caracterizar formas variantes de ARNm de hAFP, tal como se pone un ejemplo en el ejemplo 1. La secuencia codificante de AFP se extiende desde el exón 1 hasta el exón 14. Todas las combinaciones de cebadores distintas a la exón 1 del ARNm de AFP amplifican la parte del ARNm de AFP en una línea celular de eritroleucemia humana, K562, mientras que todas las combinaciones detectaron ARNm de AFP en las líneas celulares hepáticas humanas HepG2 y Hep3B. Esto demuestra que las formas variantes del ARNm de AFP contienen desde el exón 2 hasta el exón 14, tal como se expresa en K562, pero no cubren la secuencia codificante completa de AFP. El resultado sugiere que los únicos cebadores útiles para identificar células hepáticas son aquellos que detectan la parte del exón 1 de AFP, cuya expresión está limitada más probablemente de manera específica para el tejido. El hecho de que el exón 1 es único para subpoblaciones de células progenitoras hepáticas permite que se use como sonda para identificar tipos de células hepáticas frente a células progenitoras hemopoyéticas.

Puesto que se encuentra una forma truncada de AFP en algunas subpoblaciones de células hemopoyéticas, también se analiza la albúmina tanto en células hepáticas como hemopoyéticas. Se desarrollan cebadores para la albúmina de modo análogo al usado para AFP (véase anteriormente) y se usan para evaluar la expresión de albúmina en líneas celulares hepáticas frente a hemopoyéticas. Como para AFP, se encuentra una forma truncada en K562, la línea celular hemopoyética, y un transcrito que se detecta por el cebador para el exón 12-14.

Puede usarse este conocimiento para diseñar y preparar cebadores específicos para RT-PCR para determinar el patrón de expresión de formas variantes de ARNm de AFP y albúmina en poblaciones celulares hepáticas frente a hemopoyéticas. En el presente documento, se demuestra que pueden encontrarse formas variantes tanto de ARNm de AFP como de albúmina en células progenitoras hemopoyéticas. Significa que cuando se usan tales ensayos sensibles, deben usarse criterios adicionales, tales como el uso de una sonda de exón 1 para AFP, para definir las poblaciones celulares hepáticas frente a las hemopoyéticas.

La figura 2 ilustra el análisis de células de hígado y que no son de hígado mediante PCR para varios exones de albúmina. Puesto que se encuentra una forma truncada de ARNm de AFP en algunas subpoblaciones de células hemopoyéticas, también se analiza la albúmina tanto en células hepáticas como hemopoyéticas. Se desarrollan cebadores para la albúmina de modo análogo al usado para AFP (véase anteriormente) y se usan para evaluar la expresión de albúmina en líneas celulares hepáticas frente a hemopoyéticas. Como para AFP, se encuentra una forma truncada en K562, la línea celular hemopoyética, y un transcrito que se detecta por el cebador para el exón 12-14.

Estudios de desarrollo del hígado demuestran que el hígado fetal es un órgano tanto hepatopoyético como hematopoyético durante el desarrollo intrauterino. Durante diversos estadios del desarrollo del hígado, el hígado fetal contiene grandes números de células hematopoyéticas, especialmente del linaje eritroide. Además, existe una mayor conciencia de que los sistemas hepatopoyético y hematopoyético están estrechamente interrelacionados y existe la posibilidad de que esta interrelación incluya la expresión conjunta de AFP y albúmina, o quizá de isotipos de esta proteína. El hecho de que el exón 1 de AFP sea único para subpoblaciones de células progenitoras hepáticas permite identificar subpoblaciones de células progenitoras del hígado específicas.

Aunque los análisis de PCR revelan que las células progenitoras hemopoyéticas pueden expresar tanto especies de ARNm de AFP como de albúmina, los niveles de expresión de ARNm son muy pequeños. De hecho, cuando se miden AFP y albúmina mediante análisis por citometría de flujo, no pudo encontrarse AFP o albúmina detectable en K562. Aunque tanto la AFP como la albúmina son guías críticas en la identificación de células hepáticas, AFP sirve especialmente como diagnóstico de las células progenitoras hepáticas tras su purificación mediante citometría de flujo debido a su intensa expresión en las células progenitoras hepáticas. AFP también se adopta para estimar la pureza de las células progenitoras hepáticas tras cualquier clase de estrategia de fraccionamiento.

III. Procesamiento de células progenitoras del hígado humanas

Los inventores han establecido métodos que producen de manera óptima células progenitoras del hígado humanas disociadas a partir de hígados fetales o de adulto. El aislamiento de células del hígado maduras normalmente implica la disociación enzimática y mecánica del tejido en suspensiones celulares únicas seguido por fraccionamiento con centrifugación por gradiente de densidad, elutriación centrífuga, protocolos de digestión enzimática diferencial (es decir, células estrelladas hepáticas), y/o con selección usando cultivo celular (revisado en Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique" 1983, Alan R Liss, Inc. NY). La centrifugación por gradiente de densidad se usa rutinariamente por la mayoría de los investigadores para eliminar lo que suponen que son residuos y células muertas desechando todas las fracciones y conservando solamente el sedimento final.

Mientras que todos los demás investigadores usan el sedimento final tras fraccionamiento en gradiente de densidad, el protocolo dado a conocer en el presente documento es único porque hace uso de las fracciones superiores de un gradiente de densidad y excluye el sedimento. La variación novedosa a la centrifugación por gradiente de densidad, tal como se da a conocer en el presente documento, es que se desecha el sedimento y se conservan las células con una menor densidad de flotación (es decir, células que se reúnen en o cerca de la parte superior del gradiente). Los inventores han encontrado que están presentes células más jóvenes (es decir, diploides) y más robustas tras la crioconservación en la parte superior de o dentro del gradiente de densidad con Percoll, en lugar de en el sedimento.

IV. Reducción de volumen

La reducción de volumen es un proceso para el enriquecimiento de células progenitoras del hígado. Las células progenitoras pueden ser de cualquiera de varios linajes, incluyendo hepático, hemopoyético y mesenquimatoso. Como el hígado tiene una variedad de células maduras, que pueden ser tetraploides o poliploides, es útil retirar algunas, o todas, las células maduras para preparar una población enriquecida de células progenitoras. Es ventajoso pero no esencial llevar a cabo la etapa de reducción de volumen a 4ºC.

Tras la preparación de una suspensión celular única de células hepáticas, las células se separan en múltiples fracciones según el tamaño celular, la densidad de flotación o una combinación de ambos. Según la invención, las células progenitoras del hígado tienen menos de 15 micras de diámetro. Es adecuado cualquier método de separación que separe tales células pequeñas de las células más grandes y de los residuos celulares, incluyendo la velocidad de sedimentación en el medio de cultivo (que puede ser medio basal o medio enriquecido), sedimentación en gradiente, cromatografía usando perlas de separación de gran tamaño de poro, entre otros. El material del gradiente puede ser sílice recubierta con polivinilpirrolidona (Percoll), sacarosa reticulada (Ficoll), dextrano o cualquiera conocido por los expertos en la técnica, y prepararse para ser isotónico para evitar la lisis celular, por ejemplo, en solución salina tamponada con fosfato o medio basal de Eagle (BME). La suspensión de células disociadas se aplica normalmente a la parte superior de una capa del material del gradiente y se somete a un campo centrífugo, mientras se mantiene a 4ºC. Alternativamente, la suspensión celular puede aplicarse a una unidad de aféresis, tal como se usa para el aislamiento de componentes sanguíneos, es decir plasmaféresis. Las células grandes, incluyendo células parenquimatosas maduras y células tetraploides sedimentan más rápidamente que las células progenitoras y células diploides pequeñas, y se retiran. El diseño del protocolo de centrifugación tiene en cuenta la sensibilidad de las células a bajas tensiones de oxígeno y minimiza el tiempo para el enriquecimiento celular. La suspensión celular puede enriquecerse para células progenitoras hepáticas mediante estos métodos. Además, la etapa de reducción de volumen puede comprender elutriación centrífuga, adsorción "panning" basada en proteínas de adherencia a la superficie celular, cromatografía de afinidad o procesamiento discontinuo, etiquetado con marcadores fluorescentes, centrifugación zonal, centrifugación de flujo continuo, clasificación magnética tras incubación con perlas magnéticas, por ejemplo perlas magnéticas complejadas a anticuerpos, o combinaciones de estos métodos. La centrifugación por gradiente de densidad puede ser un gradiente discontinuo o un gradiente continuo. La fracción de Percoll es adecuada para su uso inmediato, crioconservación, establecimiento en cultivo, o enriquecimiento adicional. El enriquecimiento adicional puede lograrse mediante adsorción "panning", selección por afinidad, clasificación por FACS o cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica y descritas anteriormente. La selección negativa se logra mediante la retirada de las células que expresan marcadores para CD45, glicoforina A, u otros marcadores tal como se menciona a continuación. La selección positiva se logra mediante la selección de células que expresan CD14, CD34, CD38 u otros marcadores indicativos de expresión de albúmina, alfa-fetoproteína de longitud completa o ambas.

En otra realización de reducción de volumen, se retiran selectivamente células que no son progenitoras mediante lisis selectiva. Se lisan glóbulos rojos mediante una breve exposición de la suspensión celular a una disolución isotónica de cloruro de amonio, seguido por dilución con medio de cultivo y centrifugación para retirar los glóbulos rojos "fantasmas" y la hemoglobina libre. De manera similar, se retiran selectivamente células que no son progenitoras y se lisan hidrolíticamente usando la mezcla de crioconservación descrita a continuación. Los diversos métodos de reducción de volumen retiran células poliploides, células que expresan marcadores asociados con células hemopoyéticas maduras, células que expresan marcadores asociados con células hepáticas maduras, células que expresan marcadores asociados con células mesenquimatosas maduras y combinaciones de estas células.

V. Crioconservación de células progenitoras del hígado humanas y su progenie

Las metodologías de crioconservación dadas a conocer en el presente documento son únicas y distintas de los métodos usados en la técnica anterior. Las principales distinciones son el uso de diferentes tampones y la crioconservación de una población de células progenitoras hepáticas que tiene baja densidad y, por tanto, que flota en una centrifugación en gradiente. Las células progenitoras hepáticas son de pequeño tamaño y diploides.

La crioconservación satisfactoria de células del hígado humanas maduras es altamente deseable pero nunca se ha conseguido en la técnica. Generalmente, la crioconservación satisfactoria se define como la capacidad para congelar las células a temperaturas del nitrógeno líquido (-160-180ºC) y luego para descongelarlas, observar viabilidades de > 75% y con la capacidad para unirlas sobre placas de cultivo. Usando los métodos antiguos, hepatocitos maduros de origen humano o de roedores tienen viabilidades del 30-40% sin capacidad de unión tras congelación en las condiciones anteriores (por ejemplo véase Toledo-Pereya, et al., patente estadounidense número 4.242.883; Fahy et al., patente estadounidense número 5.217.860; Mullon et al., patente estadounidense número 5.795.711; y Fahy et al., patente estadounidense número 5.472.876). Estas patentes dan a conocer una viabilidad muy escasa (< 50%) de las células, principalmente tratan de cultivos celulares (no células individuales en suspensión celular) y requieren una exposición prolongada de las células al tampón antes de la congelación.

La figura 3 ilustra la excelente viabilidad de células hepáticas que se almacenan criogénicamente tal como se da a conocer en el presente documento. Se expresan los datos como el cambio en porcentaje de la viabilidad medido en el tiempo de procesamiento frente al tiempo de descongelación. Estos datos indican que la crioconservación no afectó significativamente a la viabilidad de las células. No hubo un cambio significativo de la viabilidad durante un periodo que se extiende hasta 550 días en almacenamiento. La metodología de crioconservación especial dada a conocer en el presente documento incluye el uso de un tampón novedoso, una población celular novedosa y opcionalmente incluir las células en formas de matriz extracelular. Esta metodología consigue por primera vez una viabilidad tras la descongelación que no es diferente de la viabilidad medida antes de la congelación, inmediatamente tras la dispersión celular. Las viabilidades reales son variables debido a la condición del tejido a la llegada y a los efectos de la preparación de la suspensión celular usando disociación mecánica y enzimática, y, en los presentes estudios, promedió el 77% para las células del hígado fetales. Las metodologías de crioconservación no dieron como resultado una pérdida significativa de viabilidad por el proceso de congelación y en células que podrían unirse y expandirse ex vivo tras la descongelación.

VI. Inmunoselección de células progenitoras del hígado humanas

La invención enseña un método de aislamiento de células progenitoras a partir de hígado humano que comprende proporcionar una suspensión celular sustancialmente única de tejido del hígado humano, y someter la suspensión a una inmunoselección positiva o negativa. El método de inmunoselección puede comprender seleccionar de la suspensión esas células, que ellas mismas, su progenie o formas más maduras de las mismas expresan al menos un marcador asociado con al menos uno de los linajes celulares. Estos linajes celulares pueden ser hemopoyéticos, mesenquimatosos, hepáticos o alguna combinación de estos linajes celulares. La etapa de selección celular puede incluir retirar las células que expresan glicoforina A, CD45, un marcador específico de células del hígado de adulto o combinaciones de éstas. Además, el método de selección puede incluir retirar las células poliploides, células que expresan marcadores asociados con células hemopoyéticas maduras, células que expresan marcadores asociados con células hepáticas maduras, células que expresan marcadores asociados con células mesenquimatosas maduras, o combinaciones de las mismas. La selección de células puede comprender seleccionar células que expresan CD14, CD34, CD38, o combinaciones de los mismos. Además, el método puede identificar y seleccionar células hemopoyéticas maduras que expresan glicoforina A, CD45, o una combinación de éstas.

El método de inmunoselección se lleva a cabo en conjunción con reducción de volumen basándose en el tamaño de la célula, la densidad de flotación, o una combinación de los mismos. El método de selección puede seleccionar células que expresan al menos un marcador asociado con al menos un linaje celular, que puede ser hemopoyético, hepático o mesenquimatoso. La selección de células, su progenie, o más formas maduras de las mismas pueden expresar al menos un marcador asociado con al menos un linaje de células hepáticas. Ese linaje pueden ser células parenquimatosas o hepatocitos, o células biliares. Por tanto, los marcadores expresados por las células pueden ser CD14, CD34, CD38 o combinaciones de los mismos.

VI. Marcadores celulares y citometría de flujo

Usando la presente definición de células progenitoras del hígado como poblaciones de células inmaduras que expresan alfa-fetoproteína con o sin expresión de albúmina, se han evaluado marcadores que seleccionarán específicamente estas células usando tecnologías de inmunoselección. Un sorprendente descubrimiento ha sido que muchos de los marcadores (es decir, CD34) que son clásicos para las células progenitoras hemopoyéticas, también identifican subpoblaciones de células progenitoras hepáticas. Por tanto, las clasificaciones con un solo color para CD34 dieron como resultando un enriquecimiento significativo (al menos de 9 veces) para las células que expresan AFP. Sin embargo, no puede verificarse que todas estas células positivas para AFP son células progenitoras hepáticas. Basándose en el porcentaje que son positivas para albúmina, se estima que el 80-90% de las células son células progenitoras hepáticas, y las demás son o bien células progenitoras hepáticas demasiado inmaduras para expresar todavía albúmina o posiblemente subpoblaciones hemopoyéticas que expresan alfa-fetoproteína.

Esta invención usa una estrategia de clasificación mediante citometría de flujo única. Usando la combinación de expresión de AFP y albúmina como las dos características que definen de manera única las células progenitoras hepáticas, se han identificado marcadores antigénicos y otros parámetros de la citometría de flujo que definen las células progenitoras hepáticas. Hasta la fecha, las estrategias de clasificación suponen clasificaciones de células pequeñas (< 15, \mu mediante mediciones de dispersión frontal), que son diploides (usando fluorescencia debida al colorante 33342 de Hoechst), son agranulares mediante dispersión lateral, son negativas para ciertos antígenos hemopoyéticos (es decir, glicoforina A, el antígeno de los glóbulos rojos y CD45) seguido por marcadores positivos compartidos entre subpoblaciones de células hepáticas y subpoblaciones de células hemopoyéticas (es decir, CD14 y/o CD38). En los experimentos descritos en el presente documento, los inventores identifican las células progenitoras hepáticas mediante la clasificación de aquellas células que expresan fuertemente alfa-fetoproteína, expresan débilmente albúmina y expresan CD14, CD34, CD38, o una combinación de las mismas. También, se describe en el presente documento la evidencia de que las células hemopoyéticas también expresan AFP, si bien es cierto que una forma truncada. Los inventores describen una población celular novedosa y el procedimiento de aislamiento e identificación de tal población celular. El éxito en el aislamiento y la identificación de la población celular particular de la invención se logra en parte a través de métodos de aislamiento avanzados, reducción de volumen por afinidad, clasificación de células activada por fluorescencia de alta velocidad, mayor velocidad y precisión, y técnicas de cultivo y crioconservación modificadas.

Los solicitantes muestran estrategias de clasificación mediante citometría de flujo y métodos para purificar células progenitoras del hígado procedentes de suspensiones celulares recién aisladas y/o procedentes de células hepáticas crioconservadas descongeladas. Estos métodos suponen 1) teñir las células con varios anticuerpos marcados con fluorosondas contra marcadores de la superficie celular específicos y 2) usar una combinación de estrategias de clasificación negativa y positiva en tecnologías de citometría de flujo multiparamétrica. Los métodos para la purificación de estadios específicos del linaje a partir de poblaciones de células hepáticas humanas pueden usarse con hígados procedentes de donantes de cualquier edad, puesto que parece que los marcadores son específicos de la posición en el linaje.

Los métodos mejorados de marcaje de las células, y un citómetro de flujo mejorado de manera espectacular (un citómetro de flujo "MoFlo" de Cytomation que clasifica las células a 40.,000 células/segundo y realiza clasificaciones con 8 colores) con respecto al que se usaba en el pasado (FACSTAR PLUS de Becton Dickenson que clasifica las células a 2000-6000 células/segundo y que realiza clasificaciones con 2-4 colores); ayudan en el aislamiento satisfactorio y la identificación de esta población celular.

La figura 4 ilustra una clasificación mediante FACS univariante. Se prepara la suspensión celular para el análisis de inmunofluorescencia de alfa-fetoproteína (AFP) usando anticuerpos conjugados con el colorante rojo, Cy5, y para albúmina usando anticuerpos conjugados con el colorante azul (AMCA). Se examinan treinta mil células para determinar fluorescencia roja (AFP) y azul (albúmina). Los resultados muestran un grupo claro de células positivas para cada proteína. El análisis adicional muestra que aproximadamente el 80% de las poblaciones positivas para cada proteína está representado por las mismas células (es decir, coexpresión de las dos proteínas). La expresión de AFP y albúmina como inmunorreactividad está bien definida en las suspensiones celulares, con un grupo claro de células que muestran una clara diferenciación con respecto a la señal de fondo. La alfa-fetoproteína se expresa en el 6,9 \pm 0,86% de las células en las suspensiones celulares no fraccionadas y está presente albúmina en el 7,7 \pm 1,1%. Entre las células positivas para AFP, el 75,6 \pm 4,9% coexpresaron albúmina mientras que el 80 \pm 5,5% de las células positivas para albúmina también expresaron AFP. Por tanto, aproximadamente el 25% de las células que expresan la alfa-fetoproteína no expresan albúmina y el 20% de las células que expresan albúmina no expresan alfa-fetoproteína.

Se muestran las proporciones de células que portan los marcadores de superficie de principio usados en este trabajo para las suspensiones de células completas (es decir, incluyendo glóbulos rojos) en la tabla 2 (GA = glicoforina A, un marcador de superficie en los glóbulos rojos).

TABLA 2 Porcentaje de células positivas para CD en la suspensión original de células del hígado y porcentaje de aquellas que son positivas para AFP

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La figura 5 ilustra el tanto por ciento de células que expresan los marcadores de superficie CD14, CD34, CD38, CD45 y glicoforina A (GA) en suspensiones de células hepáticas no fraccionadas. Obsérvese que los datos de GA se representan gráficamente en el eje derecho para conservar la escala. La figura 6 ilustra el porcentaje de células en la suspensión celular original que expresan alfa-fetoproteína y otros marcadores antigénicos. Media \pm EEM para el tanto por ciento de células positivas para alfa-fetoproteína (AFP) y marcadores de la superficie celular específicos (CD14, 34, 38, 45 y glicoforina A). Claramente, las células positivas para glicoforina A (GA) (es decir, células eritroides) representan un componente principal de la masa celular pero una fracción insignificante de las células positivas para AFP.

La figura 7 (parte superior) ilustra la coexpresión de alfa-fetoproteína y albúmina. La expresión de alfa-fetoproteína (panel izquierdo) y albúmina (panel derecho) en suspensiones de células del hígado fetales con o sin reducción selectiva de los glóbulos rojos usando fraccionamiento con Percoll. El tanto por ciento de células positivas para AFP que coexpresan albúmina también aumenta hasta el 80,5 \pm 8,2% y la proporción de células positivas para albúmina que coexpresan AFP aumentó hasta el 89 \pm 3,1%, aunque ningún cambio es estadísticamente significativo.

La figura 7 (parte inferior) ilustra el efecto de la reducción de volumen mediante fraccionamiento con Percoll sobre la coexpresión de alfa-fetoproteína y albúmina. La proporción de células que expresan tanto alfa-fetoproteína como albúmina, expresada como un porcentaje de células positivas para AFP o albúmina. Se muestran los datos para las células con y sin reducción de los glóbulos rojos usando fraccionamiento con Percoll. Por tanto, cuando se reducen los glóbulos rojos de las suspensiones celulares mediante fraccionamiento con Percoll, la proporción de células que expresan AFP aumenta significativamente hasta el 12,91,9% y aquellas que expresan albúmina hasta el 12,1+2,3%.

Se muestra el resultado de este procedimiento sobre la proporción de células que portan los marcadores de superficie en la tabla 3, junto con la proporción de cada subgrupo que muestra tinción positiva para AFP.

TABLA 3 Porcentaje de poblaciones positivas para CD en suspensión de células del hígado tras la reducción de glóbulos rojos y porcentaje de éstas que son positivas para AFP

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La figura 8 ilustra un análisis mediante FACS de una suspensión de células hepáticas fetales para determinar la coexpresión de CD14, CD38 y AFP. El diagrama de dispersión bivariante muestra la distribución de la tinción tricolor para CD14 (ordenadas) frente a la tinción con FITC para CD38 (abscisas). Se crean compuertas para seleccionar agrupamientos celulares específicos según las señales de CD14 y CD38. Entonces, se usan éstas para visualizar la intensidad de la tinción de AFP en cada de uno de estos subgrupos. Los resultados de AFP muestran que se produce un alto nivel de enriquecimiento para AFP seleccionando las células positivas para o bien CD38 o bien CD14. La señal de AFP generada a partir de la suspensión celular completa (30.000 células) se muestra en la parte inferior izquierda. En la mayoría de los casos, la presencia de AFP en los subgrupos seleccionados mediante el marcador de la superficie celular se distribuye de manera continua con una clara preponderancia de células que muestran intensidades de tinción en el intervalo positivo. Sin embargo, la distribución de células positivas para CD38 con respecto a la coexpresión de AFP fue única. En las células positivas para CD38, es evidente una distribución bimodal para la coexpresión de AFP, en la que son evidentes dos grupos diferenciados de células, un grupo positivo para AFP, el otro negativo.

Los resultados muestran que está presente alfa-fetoproteína (AFP) en el 7% de las células en suspensiones celulares únicas de tejido del hígado fetal (es decir, en la suspensión celular original). Se encuentra que el anticuerpo contra la glicoforina A (un anticuerpo en los glóbulos rojos, eritrocitos) identifica una subpoblación de células que no expresan AFP. Por tanto, las células que expresan este antígeno (es decir, células eritroides) se excluyen de las células destinadas para la caracterización de células progenitoras hepáticas. El antígeno CD38 identifica una población de células que muestra una potenciación significativa de la proporción de células positivas para AFP (es decir, superior a 7 veces la proporción en las muestras no fraccionadas. Ambos antígenos muestran varias isoformas, dependiendo de si hay o no presentes secciones de la molécula, codificadas por variantes de corte y empalme. Se dispone de anticuerpos que identifican las diversas isoformas.

Se encuentra que el marcador clásico para las células progenitoras hemopoyéticas, CD34, está presente en muchas células que también expresan AFP. La clasificación de células positivas para CD34 da como resultado un enriquecimiento de las células positivas para AFP de al menos 9 veces con respecto al que se encuentra en la suspensión celular original (67%, en las células positivas para CD34 frente al 7% en la suspensión celular original). Sin embargo, el anticuerpo individual más eficaz para el enriquecimiento de las células positivas para AFP es CD14, que produce un aumento superior a 11 veces de la proporción de estas células en comparación con la población original (el 81% frente al 7%).

Parecería que podría mejorarse el rendimiento de células positivas para AFP usando una combinación de marcadores de superficie. Por tanto, se determina el grado de coexpresión de AFP con combinaciones seleccionadas de marcadores de superficie para establecer el grado en que puede aumentarse la selección del marcador intracelular. Se expresan los datos como la proporción de células positivas para AFP que expresan marcadores de superficie (denominado el "rendimiento" de las células positivas para AFP) y como la proporción de todas las células positivas para AFP que aparecen en la población definida por el marcador de superficie (denominado el factor de "enriquecimiento" para las células positivas para AFP). Se muestran los resultados para las combinaciones de CD14, CD34 y CD38 en la tabla 4 junto con los resultados de marcadores individuales para comparación.

TABLA 4

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Enriquecimiento.

El tanto por ciento de células que expresan cualquiera (o ambos) de los marcadores de superficie que son también positivas para AFP.

Rendimiento.

El tanto por ciento de todas las células positivas para AFP que también expresan uno o ambos de la combinación de marcadores de superficie.

La figura 9 ilustra cómo la selección de CD14 y CD38 enriquece las células positivas para AFP. La proporción de células positivas para AFP en suspensiones celulares preparadas a partir de hígado fetal aumenta de manera espectacular seleccionando células con marcaje de superficie positivo para los marcadores CD38 y CD14.

La combinación de los dos marcadores produce un enriquecimiento significativamente mejor de las células que contienen AFP que el que se obtiene con cualquier marcador solo.

La figura 10 ilustra la microscopía de fluorescencia de células progenitoras hepáticas humanas.

Se tiñeron células progenitoras hepáticas representativas del hígado fetal para determinar el contenido en AFP. Los tamaños celulares indican que están presentes tanto células progenitoras tempranas como células progenitoras hepáticas más avanzadas. La morfología de las células con tinción positiva para AFP es variable y engloba el intervalo completo de tamaño y forma celular en la suspensión celular a partir de los hígados fetales pero no del hígado de adulto. La mayor de las células positivas para AFP, de aproximadamente 12-15 \mu, es mucho más pequeña que los hepatocitos maduros, que oscilan en tamaño desde 20-50 \mu).

La figura 11 ilustra células representativas seleccionadas por la expresión de AFP. Las células con tinción positiva para CD14 (lado derecho) son características de hepatoblastos. Las células con tinción negativa para los marcadores de superficie son más pequeñas y concuerdan en tamaño y morfología con las células progenitoras hepáticas tempranas. En todos los casos, una cierta proporción de células positivas para AFP no muestran expresión de ninguno de los anticuerpos de superficie usados en este estudio. Se ilustra el aspecto de estas células "nulas" positivas para AFP en la figura 11 en la que puede compararse con el aspecto de las células positivas para CD14/positivas para AFP clasificadas a partir de la misma suspensión. Queda claro que aunque ambos tipos celulares son positivos para AFP, las células con tinción negativa para los antígenos de superficie son sistemáticamente más pequeñas y menos complejas que las células positivas para CD14.

Por tanto, los marcadores probables para clasificar células progenitoras hepáticas son: Glicoforina A^{-}, CD45^{-} y uno o más de CD14^{+}, CD34^{+}, CD38^{+}, diploides, agranulares (mediante dispersión lateral), inferiores a 15 \mu (mediante dispersión frontal). El fenotipo de estas células clasificadas es células pequeñas (< 15, \mu), con citoplasma pequeño (alta razón de núcleo/citoplasma), albúmina^{+} y/o AFP^{+}.

VII. Caracterización confocal de células que expresan alfa-fetoproteína en hígado humano fetal y de adulto

Se ha usado la microscopia confocal para obtener las imágenes de células humanas fetales y de adulto que expresan alfa-fetoproteína. Esta metodología permite que se observen la morfología y el tamaño de estas células y que se muestre directamente la ubicación de proteínas intracelulares, tales como AFP y ALB, y la de marcadores de superficie de la membrana tales como CD34 y CD38.

La figura 12 ilustra la microscopia confocal de células que expresan alfa-fetoproteína, es decir, células progenitoras hepáticas en hígados humanos de adultos. La figura muestra tres vistas de un campo, y que hay dos células positivas para AFP en este campo. La superposición del panel (A) y el panel (B) se muestra en panel (C) e indica la morfología de células positivas para AFP (de color rosa, en el original) en un grupo de células de hígado.

La figura 13 ilustra células que se marcan con calceína (A) para mostrar todos los tipos celulares. La figura 13 (B) consiste en las mismas células que coexpresan AFP y que muestran que solamente dos células son positivas para AFP. El tamaño celular no es un factor para la positividad para AFP.

Se encuentran células que expresan AFP tanto en hígados fetales como de adulto. Los hígados fetales, tal como se esperaba, tienen el mayor porcentaje (6-7%), mientras que los hígados de adulto tienen un pequeño porcentaje (< 1%) y disminuyendo los números con la edad del donante. Las pocas células progenitoras hepáticas que se encuentran en los hígados de adulto pueden enriquecerse significativamente a través del proceso de fraccionamiento con Percoll para producir hasta el 2% de las células en las fracciones 1 y 2 de Percoll procedentes de los hígados de adulto (tabla 5). No se encuentran células que expresan AFP en un hígado de donantes con más de 71 años de edad.

La tabla 5 muestra el tamaño celular y la viabilidad de fracciones aisladas con Percoll de células de hígado de adulto. Las células más pequeñas (fracciones 1-3) tienen mayor viabilidad que las células más grandes (fracción 4) tras haberse crioconservado en las mismas condiciones de crioconservación.

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Estos resultados sugieren que los órganos de los donantes útiles para las terapias con células de hígado así como para el trasplante de órganos consistirán en aquellos de donantes jóvenes (hasta aproximadamente 45 años de edad). Además, los hígados de pacientes geriátricos (> 65 años de edad) serán donantes inapropiados para terapias celulares y, quizás, también para trasplantes de órgano completo, especialmente para niños, puesto que tendrán poca, si alguna, capacidad regenerativa a partir de células progenitoras hepáticas y solamente la capacidad regenerativa intermedia o mínima que se sabe que está disponible a partir de las células maduras.

VIII. Linaje madurativo

Por tanto, el hígado de adulto contiene una población de células progenitoras hepáticas que pueden crecer y diferenciarse en hepatocitos y células biliares tanto en estados normales como patológicos. Esta invención representa la proposición de que cada posición en el linaje del hígado es un estadio madurativo diferenciado, y que existen múltiples poblaciones de células madre en el hígado.

Sorprendentemente, el hígado embrionario de la presente invención produce células progenitoras para 3 linajes madurativos separados: hepatopoyesis, con destinos celulares de hepatocitos y células biliares (vía biliar); hemopoyesis, con destinos celulares de linfocitos (B y T), plaquetas, macrófagos, neutrófilos y granulocitos; y mesengénesis, con destinos celulares de endotelio, adipocitos, células del estroma, cartílago e incluso hueso (produciéndose estos dos últimos en el hígado solamente en estados patológicos).

En general, las células madre son células inmaduras que pueden dar lugar a células hija con más de un destino. Las células madre producen células hija, algunas de las cuales son idénticas a la parental y algunas de las cuales "se comprometen" a un destino específico. El proceso de compromiso no se entiende a nivel molecular. Más bien, se reconoce que se ha producido solamente de forma empírica cuando los destinos de las células se han limitado a partir del de un predecesor. "Las células progenitoras comprometidas" se definen como células inmaduras que tienen un único destino tales como células progenitoras comprometidas hepatocíticas (que dan lugar a hepatocitos) o células progenitoras comprometidas biliares (que dan lugar a vías biliares).

Las transiciones desde la célula madre hasta las células adultas se produce en un proceso por etapas que produce un linaje madurativo en el que el tamaño celular, la morfología, el potencial de crecimiento y la expresión génica están relacionados con el linaje. La metáfora del envejecimiento es útil en la definición del proceso. Las células "jóvenes" tienen una expresión génica temprana y el mayor potencial de crecimiento; las células tardías en el linaje tienen una expresión génica "tardía" y normalmente tienen un crecimiento limitado o no crecen en absoluto. Las células tardías pueden considerarse "viejas" o en términos biológicos, apoptóticas, y en última instancia se eliminan. El proceso del linaje madurativo da como resultado un recambio natural para el tejido y permite la regeneración tras lesiones. Los tejidos difieren en la cinética del proceso madurativo. El linaje madurativo del intestino es bastante rápido produciéndose un ciclo completo en menos de una semana; el del hígado se produce lentamente, y en el hígado de rata es de aproximadamente un año.

El hígado de rata se forma en la vida embrionaria aproximadamente en el día 10, denominado como "día embrionario 10" o E10, con la invaginación del mesénquima cardiaco por el endodermo ubicado en la región del intestino medio del embrión (Zaret, K. 1998. Current Opinion in Genetics & Development. 8: 526-31). Se ha conseguido el reconocimiento más temprano de las células hepáticas en los embriones usando estudios de hibridación in situ para ARNm que codifica para alfa-fetoproteína (AFP) (Zaret, K. 1998. Current Opinion in Genetics & Development. 8: 526-31; Zaret, K. 1999 Developmental Biology (Orlando). 209: 1-10). Se observan células que expresan AFP en la región del intestino medio del embrión cerca del mesénquima que produce el corazón en el día 9-10 en todos los hígados de rata y ratón sometidos a ensayo. El hígado se vuelve macroscópicamente visible para el E12 y tiene aproximadamente 1 mm de diámetro para E13.

En paralelo, se produce hemopoyesis apareciendo las primeras células hemopoyéticas identificables para E15-E16 (en roedores) y para del 3^{er} al 4º mes (en seres humanos) y produciéndose el máximo de eritropoyesis (formación de células eritroides o glóbulos rojos) para E18 (en roedores) y para el 5º-6º mes (en seres humanos). En el máximo de eritropoyesis, los números de estos glóbulos rojos predominan en el hígado y representan más del 70% de los números de células en el hígado. El final del periodo gestacional es en el día 21 en roedores y a los 9 meses en seres humanos. En el plazo de unas horas desde el parto, los números de células hemopoyéticas disminuyen drásticamente de tal manera que a los 2 días de vida posnatal (roedores) y en el plazo de una semana o dos (seres humanos), la amplia mayoría de las células hemopoyéticas han desaparecido, habiendo migrado a la médula ósea. No se sabe la causa de la migración de las células hemopoyéticas. Sin embargo, existen dos especulaciones predominantes.

En primer lugar, las células progenitoras hemopoyéticas prefieren condiciones relativamente anaerobias y se escapan a la médula ósea (que es relativamente anaerobia) con los elevados niveles de oxígeno en el hígado con la activación de los pulmones; y en segundo lugar, la pérdida de las hormonas del embarazo son la causa de la migración. De manera posnatal, la pérdida de las células progenitoras hemopoyéticas en el hígado está asociada con una reducción drástica en los números de células progenitoras hepáticas y un aumento paralelo en los números y la madurez de los hepatocitos y las células biliares. La madurez total del hígado se completa en 2-3 semanas de vida posnatal (en roedores) y en el plazo de unos cuantos meses (seres humanos). Para entonces, las células progenitoras hepáticas restantes se ubican en las regiones de las tríadas portales en la periferia de cada ácino del hígado.

Posteriormente, se establece la arquitectura clásica del ácino del hígado, estando definido cada ácino periféricamente por seis conjuntos de tríadas portales, teniendo cada uno una vía biliar, una arteria hepática y una vena hepática, y en el centro una vena central que conecta con la vena cava. Se extienden placas de células hepáticas, como los radios de una rueda, desde la periferia hasta el centro. Por convención, las placas están divididas en tres zonas: la zona 1 está cerca de las tríadas portales; la zona 2 es acinar media; y la zona 3 está cerca de las venas centrales. Las únicas células diploides del hígado están en la zona 1; las células tetraploides están en la zona 2; y las células tetraploides, octaploides y multinucleadas están en la zona 3. El patrón sugiere en gran medida un linaje madurativo que termina en un proceso apoptótico (Sigal, S. H., S. et al. 1995. Differentiation. 59: 35-42).

IX. Implicaciones del concepto de linaje en estudios preclínicos y clínicos de la biología del hígado

Las características de crecimiento y diferenciación in vitro e in vivo de la población celular dadas a conocer en el presente documento están de acuerdo con el concepto y las implicaciones de un modelo de linaje de posición en el linaje en hígado. Por ejemplo, en un cultivo de parénquima in vitro, se pronostica que la capacidad de las células parenquimatosas para dividirse y el número de divisiones celulares dependen estrictamente de la posición en el linaje. Por tanto, las células parenquimatosas periportales deben tener mayor potencial de división que las pericentrales. Esto explica el antiguo misterio de por qué los cultivos primarios de hígado, el órgano regenerativo de más renombre en el organismo, muestran una división celular en cultivo tan limitada.

Se pronostica que las células madre y sus homólogos transformados, los hepatomas, expresan genes tempranos tales como alfa-fetoproteína y el factor de crecimiento similar a la insulina II, pero no genes expresados posteriormente en el linaje. En el modelo de linaje de madurez, ningún hepatoma debe expresar genes tardíos, porque la progresión total a través del linaje requiere la regulación no perturbada de la diferenciación, el crecimiento y los ciclos celulares. De hecho, esto se ha observado en la población celular dada a conocer en el presente documento. Estudios de biología molecular que comparan la expresión génica específica del hígado en tejidos embrionarios frente a de adulto definen varias clases de genes: aquellos con diagnóstico de los compartimentos (célula madre, amplificación, diferenciación); aquellos expresados de manera zonal y que posiblemente cruzan límites compartimentales; y aquellos expresados de manera temprana, intermedia o tardía en el linaje pero de manera discreta en unas cuantas células.

Pueden entenderse diversos patrones morfológicos y de expresión génica de tumores de hígado primarios mediante el estudio de la población celular dada a conocer en el presente documento. Si los tumores representan la proliferación de células madre transformadas con capacidades de diferenciación variables, la expresión común de alfa-fetoproteína en hepatomas no es un marcador tumoral inducido sino un indicador de una población de células inmaduras expandida que normalmente expresa alfa-fetoproteína.

La población celular aislada dada a conocer en el presente documento tiene un gran impacto sobre el éxito de la terapia génica y/o celular dirigida al hígado. Los ejemplos identifican condiciones clave en las que las células progenitoras hepáticas humanas y de primate no humano pueden crioconservarse satisfactoriamente.

Debido a la capacidad para expandirse significativamente in vitro, la población celular dada a conocer en el presente documento, similar a las células en el linaje hemopoyético, puede usarse como "material de biopsia con sacabocados" para proporcionar la simiente celular para la expansión ex vivo. Esto eliminaría la necesidad de resección quirúrgica invasiva mayor del hígado del paciente.

Una vez que se establecen en cultivo las células progenitoras hepáticas humanas, se realiza la transferencia génica. Esto puede lograrse con varios sistemas de vector de inserción génica diferentes. Una importante consideración en este punto es que la transferencia génica satisfactoria requiere un cultivo en crecimiento rápido, y puesto que las células progenitoras hepáticas humanas de la invención se dividen significativamente en condiciones fisiológicas normales, estas células son candidatos ideales para la transferencia génica al hígado. Además, las características de crecimiento de la población celular dada a conocer en el presente documento permite el uso en una transferencia génica ex vivo usando ciertos vectores de inserción génica (es decir, vectores retrovirales) que requerirán proliferación celular para una inserción y expresión génica eficaces.

Un enfoque alternativo para la terapia génica es diseñar vectores que seleccionan como diana las células progenitoras específicamente y luego inyectar el vector, acoplado con el gen de interés, directamente en el paciente. Los vectores seleccionarían como diana y modificarían la población de células progenitoras endógenas.

La población de células progenitoras dada a conocer en el presente documento puede usarse en una terapia génica o celular dirigida al hígado autóloga o alogénica. Claramente, el uso de células progenitoras hepáticas autólogas eliminará una preocupación significativa referente al rechazo de las células trasplantadas. La población celular dada a conocer en el presente documento es particularmente atractiva para la transferencia de células alogénicas, porque su perfil antigénico sugiere fenómenos de rechazo inmunológico mínimos. Además, se eliminan a través del proceso de purificación otros elementos celulares, tales como células sanguíneas, células endoteliales, células de Kupffer, que se sabe que son altamente inmunogénicas.

Una vez que se aíslan, purifican y cultivan las células progenitoras hepáticas autólogas y alogénicas, pueden modificarse genéticamente o permanecer intactas, expandirse in vitro y luego trasplantarse de nuevo al huésped. Si se desea la modificación genética, tras la modificación genética y antes del trasplante, aquellas células modificadas genéticamente pueden expandirse y/o seleccionarse basándose en la incorporación y expresión de un marcador seleccionable predominante. El trasplante puede ser de nuevo en el compartimento hepático o un sitio ectópico o heterotópico. Para el trasplante en el compartimento hepático, podría usarse infusión en la vena porta o inyección intraesplénica. La inyección intraesplénica puede ser la vía de administración de elección porque las células progenitoras hepáticas trasplantadas por medio de una inyección intraesplénica se mueven hacia el compartimento hepático.

Procedimientos médicos adicionales pueden ayudar en la eficacia del injerto hepático de las células progenitoras hepáticas trasplantadas. Los modelos con animales han demostrado que en la hepatectomía parcial, la administración de factores de la angiogénesis, y otros factores de crecimiento ayuda en el injerto y la viabilidad de los hepatocitos trasplantados. Un enfoque alternativo es trasplantar los hepatocitos modificados genéticamente a un sitio ectópico.

Hasta la fecha, los enfoques de terapia celular con respecto al hígado han mostrado poca eficacia. Esto puede deberse al hecho de que las células de donante que están usándose son predominantemente células de hígado de adulto y tienen una corta vida tras el aislamiento y la nueva inyección. Además, el uso de células de adulto da como resultado un fuerte rechazo inmunológico. Las células progenitoras hepáticas dadas a conocer en el presente documento ofrecen mayor eficacia debido a su capacidad limitada para provocar fenómenos de rechazo inmunológico y debido a su extenso potencial regenerativo.

Con respecto a la terapia génica, los esfuerzos en curso hacen uso de "vectores inyectables dirigidos", la vía más popular para las terapias clínicas en desarrollo. Estos enfoques han tenido una eficacia limitada debido tanto a problemas inmunológicos como a la expresión transitoria de los vectores. Las únicas vías para la terapia génica que han demostrado ser dignas de mención han sido la terapia génica ex vivo y se han realizado casi exclusivamente en células progenitoras hemopoyéticas. Se pronostica que la terapia génica ex vivo con células progenitoras (o el uso de vectores inyectables dirigidos de algún modo a esas poblaciones de células progenitoras) demostrará ser más eficaz, puesto que los vectores pueden introducirse ex vivo en subpoblaciones purificadas de las células progenitoras; seleccionarse las células modificadas y volverse a introducir in vivo. Las ventajas de las células progenitoras son su enorme potencial de expansión, su inducción mínima, si la hay, de reacciones inmunológicas y su capacidad para diferenciarse para producir el linaje completo de células maduras.

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X. Linajes comunes o interdependientes

Las metodologías mejoradas permitieron a los inventores estudiar más detenidamente y caracterizar las células progenitoras hepáticas. Estos estudios revelaron un relación especialmente estrecha entre las células progenitoras hepáticas y las células progenitoras hemopoyéticas, lo que sugiere un estrecha relación entre estos dos linajes. De hecho, estos estudios muestran que las células progenitoras de los linajes hepático y hemopoyético comparten numerosos marcadores antigénicos (CD14, CD34, CD38), comparten propiedades bioquímicas (es decir, transferrinas, glutatión-S-transferasas, y una isoforma truncada de la alfa-fetoproteína), y tienen un extenso solapamiento en los requisitos de cultivo (formas de matriz extracelular y requisitos hormonales específicos) para la expansión ex vivo. Las células progenitoras de ambos linajes están ubicadas en los mismos sitios dentro del ácino del hígado. Finalmente, hay señalización paracrina presente en la totalidad de las células de los dos linajes madurativos; es decir, señales producidas por cada uno de los linajes regulan células en el otro linaje. De hecho, puede concluirse que puede haber un linaje común o al menos linajes interdependientes entre las células hepáticas y hemopoyéticas.

Las poblaciones celulares dadas a conocer en el presente documento se purifican y utilizan para producir o bien células mielohemopoyéticas o bien derivados hepáticos dependiendo de las condiciones en las que se aíslan y cultivan las células. Por tanto, los sistemas de biorreactor inoculados con poblaciones celulares clasificadas para un conjunto de antígenos que define tanto las células progenitoras hepáticas como hemopoyéticas (por ejemplo CD38+, CD45+) pueden dar como resultado poblaciones celulares con múltiples destinos. El destino depende de cómo se vuelven a introducir las células in vivo o en qué condiciones de cultivo se ponen.

Otro aspecto importante de la población celular dada a conocer en el presente documento es que presentan un antígeno de superficie de célula madre hemopoyética específico, CD34. Se han usado células de médula ósea positivas para CD34 como un marcador de selección positiva conveniente para las células madre hemopoyéticas. Sin embargo, existe un número creciente de informes que ponen en duda la especificidad del marcador antigénico CD34 para las células madre hemopoyéticas (Nakauchi H. Nature Medicine 4: 1009-1010 (1998)). La evidencia experimental demuestra la existencia de células en la población negativa para CD34 de sangre del cordón y la médula ósea humana que pueden repoblar la médula ósea de ratones inmunodeficientes.

Esta invención, tal como se da a conocer en el presente documento, da a conocer maneras de purificar tanto poblaciones de células progenitoras hemopoyéticas como hepáticas que pueden usarse posteriormente en programas clínicos y preclínicos, utilizando la estrecha relación entre las células hepáticas y hemopoyéticas.

Los usos de células progenitoras hepáticas humanas son muchos y diversos. Incluyen: 1) investigación sobre células humanas; 2) producción de vacunas o antivirales; 3) estudios toxicológicos; 4) desarrollo de fármacos; 5) fabricación de proteínas (usando las células como huéspedes para la producción de diversos factores específicos del ser humano); 6) terapias con células de hígado; 7) terapias con genes de hígado; 8) hígados bioartificiales que pueden usarse en estudios de investigación, toxicológicos y antimicrobianos, fabricación de proteínas o clínicamente como un sistema de soporte del hígado. Considerando la posibilidad de un linaje común entre la hemopoyesis y la hepatopoyesis, tal como adelantan los inventores de esta invención, pueden usarse las mismas células tanto para los destinos hepático o hemopoyético dependiendo del microentorno en el que se ponen.

La disponibilidad de células progenitoras hepáticas humanas sumamente purificadas permitirá una investigación mucho más extensa sobre las células humanas, facilitará el desarrollo de formas satisfactorias de terapia génica y con células de hígado, y permitirá el desarrollo de hígados bioartificiales humanos para su uso tanto en investigación como dispositivos de soporte clínico. En la actualidad, el suministro limitado de tejidos humanos sanos excluye programas clínicos en la terapia con células de hígado o en hígados bioartificiales humanos.

Las poblaciones de células progenitoras deben tener suficiente potencial de expansión para superar, o al menos aliviar en gran medida, ese suministro limitado.

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Ejemplos Ejemplo 1 Análisis de formas variantes de AFP y albúmina expresadas en células hepáticas frente a otros tipos de células

Líneas celulares: se mantienen dos hepatomas humanos, Hep3B y HepG2, en medio MEM de Eagle complementado con piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 ceg/ml, disolución de aminoácidos no esenciales en medio MEM 0,1 mM, insulina en gel 54 y FBS al 10%. Se mantienen una línea celular de eritroleucemia humana, K562 y una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón, STO, en medio DMEM/F12 complementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 ag/ml, 2-ME 5 x 10-^{5} M y FBS
al 10%.

RT-PCR: se extraen ARN totales de Hep3B, HepG2 y STO mediante el método de Chomcznski y Sacchi N. Anal. Biochem 162: 156-159 (1987). Se sintetizan los ADNc mediante cebado con oligo-dT y se someten a amplificación por PCR usando juegos de cebadores diseñados por los inventores y preparados para albúmina o AFP humana. Las secuencias de cebadores son tal como sigue

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Las combinaciones de los cebadores son tal como sigue:

Para AFP: hAFP 1 y hAFP2, hAFP3 y hAFP4, hAFP 1 y hAFP4, hAFPexon2 y hAFP4, hAFPexon3 y hAFP4, hAFPexon4 y hAFP4, hAFPexon5 y hAFP4, y hAFPexon6 y hAFP4.

Para albúmina: hALB 1 y hALB2, hALB3 y hALB4, hALB 1 y hALB4.

La PCR se realiza en un volumen total de 5041 que consiste en IkiM de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3 y polimerasa Amplitaq 1,25 U (Cetus Corp). Se calientan muestras hasta 94ºC durante 3 min. seguido por amplificación durante 30 ciclos de 2 min. a 94ºC, 2 min. a 62ºC y 3 min. a 72ºC. Tras el último ciclo, se realiza una etapa de extensión final a 72ºC durante 7 min. Después, se hacen pasar 5 \mul de cada reacción de PCR sobre gel de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio 5 \betag/ml en tampón Tris-acetato-EDTA.

RT-PCR para AFP: el gen de la AFP humana consiste en 15 exones (Gibbs et al., Biochemistry, 26: 1332-1343). Para distinguir transcritos truncados de ARNm de AFP completo funcional, se seleccionan dos partes diferentes de la secuencia de ADNc de AFP como moléculas diana de RT-PCR. Se usa la combinación de cebadores de hAFP 1 y hAFP2 para la amplificación del exón 1 que contiene el MET de iniciación hasta el exón 3, mientras que la de hAFP3 y hAFP4 amplifica del exón 12 al exón 14 que contiene el codón de parada. Los resultados de la PCR se muestran en la figura 1. Ambas combinaciones de los cebadores dan como resultado bandas de amplificación fuertemente detectadas en el ARN de Hep3B y HepG2 (carriles 1, 2, 4 y 5). En cambio, sólo la banda específica de la parte C-terminal se detecta por el conjunto de cebadores de hAFP3 y hAFP4 en el ARN de K562 (carriles 7 y 8). Este resultado sugiere que la línea celular de eritroleucemia, K562, solamente expresa una forma truncada de AFP sin el extremo N-terminal. En apoyo de esta hipótesis, se realiza la PCR para la región codificante completa de AFP usando los cebadores hAFP1 y hAFP4. Tal como se espera, la PCR de ADNc de Hep3B y HepG2 muestra la banda notable única de 1,8 Kb (carriles 3 y 6), mientras que no hay banda en K562 (carril 9). Los controles son muestras sin ARN y una muestra derivada de la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (STO). Ninguno muestra ninguna banda detectable.

A continuación, se construye una serie de cebadores en 5' desde el exón 2 hasta el exón 6 para observar la diferencia entre la forma auténtica y la variante del ARNm de hAFP. En la figura 1, el resultado muestra que toda la región codificante excepto el exón 1 se comparte en la forma variante de hAFP en K562 (carril 1, 3, 5, 7, 9 y 11).

RT-PCR para albúmina: el gen de la albúmina humana también consiste en 15 exones (Minghetti et al., J. Biol. Chem, 261: 6747-6757). En cuanto a la AFP, se usa la combinación de cebadores de hALB1 y hALB2 para la amplificación del exón 1 que contiene el MET de iniciación hasta el exón 4, mientras que la de hALB3 y hALB4 amplifica del exón 12 al exón 14 que contiene el codón de parada. Los resultados de la PCR se muestran en la figura 17. Ambas combinaciones de los cebadores dan como resultado bandas de amplificación fuertemente detectadas en el ARN de Hep3B y HepG2 (carriles 1, 2, 4 y 5). En cambio, solamente la banda específica de la parte C-terminal se detecta por el conjunto de cebadores de hALB3 y hALB4 en el ARN de K562 (carriles 7 y 8). La PCR para la región codificante completa de albúmina usando cebadores hALB1 y hALB4 no muestra ninguna banda en K562 (carril 9). Los controles son muestras sin ARN y una muestra derivada de la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (STO). Ninguna muestra ninguna banda detectable.

Los proveedores de reactivos incluyen:

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Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo)

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Gibco BRL Products (Gaithersburg, MD)

\quad

Worthington Biochemical Corporation (Frehold, Nueva Jersey)

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Dupont Pharmaceuticals (Wilmington, Delaware)

\quad

Falcon (una filial de Becton Dickinson Labware) (Franklin Lakes, Nueva Jersey)

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Los proveedores de tejidos incluyen:

\quad

Anatomical Gift Foundation (Atlanta, Georgia)

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Advanced Biosciences Research, ABR (San Francisco, Cal)

\quad

Cirujanos de trasplantes locales en el hospital UNC.

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Ejemplo 2 Procesamiento de hígados humanos

Hígados fetales: Los hígados fetales proceden de múltiples clínicas afiliadas a Advanced Biosciences Research (ABR), todas en California, o de la Anatomical Gift Foundation (fundación de donaciones anatómicas - AGF) con clínicas en el sur (es decir, Georgia, Virginia), nordeste (Pensilvania) o el medio oeste (Kansas, Colorado). Los fetos se recogen de clínicas; se separan los tejidos de los fetos mediante disección y se colocan en medio RPMI 1640 (Gibco) complementado con insulina (Sigma, 5 \mug/ml), transferrina (Sigma, 5 \mug/ml), selenio (10^{-9} M) y suero bovino fetal al 5% (Gibco). Después se colocan las muestras sobre hielo y se envían mediante mensajero al laboratorio, un procedimiento que puede llevar 10-16 horas. Por tanto, se reciben las muestras aproximadamente 24 horas tras la cirugía. Se asigna un número a las muestras con el prefijo REN, facilitado en orden cronológico de recepción (REN 1, 2, 3, etc.), en el que REN es una abreviatura de renovación.

Hígados de adulto: Los hígados de adulto proceden de la Anatomical Gift Foundation o de cirujanos locales (UNC) y consisten en tejido de hígado rechazado, explantes de receptores de trasplantes o hígados donados para el trasplante de órganos pero rechazados después por motivos distintos a patógenos. Se analizan los pacientes que proporcionan tejido de explante o tejido de donante rechazado para detectar una serie de enfermedades y solamente se usan para el procesamiento de células aquéllos que se encuentra que son seguros mediante estas pruebas. Tras la extirpación a partir de los pacientes, se colocan los hígados en una disolución de la Universidad de Wisconsin (también denominada Viaspan) y se envían sobre hielo al laboratorio. El intervalo de tiempo entre la extirpación de órganos de un paciente en muerte cerebral ("momento de pinzamiento") y su llegada al laboratorio es extremadamente variable. Las muestras llegan en un plazo inferior a 24 horas desde el "momento de pinzamiento", el momento en el que se extirpa el hígado del donante.

Hígados de cadáveres: Los hígados obtenidos tras la muerte en el plazo de al menos 30 horas desde la muerte se obtienen a través de asociaciones de obtención de órganos locales (por ejemplo, la Carolina Organ Procurement Association (asociación de obtención de órganos de Carolina) o COPA). Se procesan los hígados al igual que los hígados de adulto.

La lista de elementos que se comprueban para la seguridad del investigador es: VIH I y II, VLTH I y II, hepatitis B y C; tuberculosis. La lista para uso clínico es: VIH I y II, VLTH I y II; hepatitis A, B, C y G; VEB, CMV; tuberculosis, sífilis y micoplasma.

Los hígados fetales y de adulto se procesan usando una combinación de digestión enzimática y disociación mecánica, los hígados fetales se preparan principalmente mediante disociación mecánica, mientras que los hígados de adulto se disocian principalmente mediante digestión enzimática. A continuación se facilita una descripción de cada una. Tanto los hígados fetales como de adulto se digieren durante duraciones de tiempo variables en un tampón enzimático que sirve para disolver las matrices extracelularse que unen las células entre sí en un tejido. La mezcla enzimática colagenasa usada para el aislamiento de células de hígado es una preparación enzimática "Liberase" de alta pureza fabricada por Boehringer-Mannheim, que consiste en una mezcla de elastasa y colagenasa purificadas. Esta mezcla enzimática puede usarse a concentraciones mucho menores y con menos "efectos secundarios" perjudiciales.

Disolución enzimática: disolución de colagenasa (60-70 mg/100 ml de tampón (colagenasa tipo IV de Sigma, nº de catálogo C5138 o tipo B de Worthington, nº de catálogo LS005273; siendo ambas preparaciones bacterianas enriquecidas en colagenasa pero con muchas impurezas enzimáticas) o Liberase (preparación de colagenasa/elastasa purificada de Boehringer-Mannheim, nº de catálogo 1814184)) preparada en tampón P2 (véase a continuación) y usada a 0,23 mg/ml.

Disolución de lavado celular: medio RPMI 1640 (Gibco) complementado con insulina (5 \mug/ml), transferrina (5 \mug/ml), mezcla de ácidos grasos libres (véase a continuación) unida en una razón molar 1:1 a albúmina sérica humana o bovina purificada.

Mezcla de ácidos grasos libres: Las poblaciones de células inmaduras y células de hígado más antiguas dañadas, requieren lípidos para mantener y sintetizar sus membranas. Aunque los hepatocitos completamente maduros pueden sintetizar sus membranas a partir de una única fuente de ácido graso (ácido linoleico), las células parenquimatosas más jóvenes no pueden y por tanto requieren una mezcla de muchos ácidos grasos diferentes para tratar sus requisitos de lípidos. Se proporciona una mezcla compleja que después se une en una razón molar 1:1 con una albúmina sumamente purificada. A continuación se facilita una descripción detallada del método para la preparación de esa preparación de ácidos grasos.

Se preparan las disoluciones madre tal como sigue, para un total combinado de ácidos grasos libres 100 mM:

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100

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Para obtener una concentración final de 7,6 \muM/l, se añaden 76 \mul por litro. [ref: Chessebauf y Padieu, In vitro 20 (10): 780: 1984. Según la referencia anterior, se usa una mezcla de ácidos grasos libres a una concentración final de 7,6 \mueq/l (=7,6 \muM) en medios de cultivo celular].

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Preparación de los componentes de ácidos grasos individuales

Se disuelve cada componente individual en EtOH al 100% tal como sigue:

Disolución madre de palmítico 1 M, soluble en EtOH caliente

Disolución madre de palmitoleico 1 M, fácilmente soluble en EtOH

Disolución madre de esteárico 151 mM, soluble en EtOH calentado a 1 g/21 ml

Disolución madre de oleico 1 M, fácilmente soluble en EtOH

Disolución madre de linoleico 1 M, fácilmente soluble en EtOH

Disolución madre de linolénico 1 M, fácilmente soluble en EtOH

Después se mezclan estas disoluciones madre individuales para obtener la mezcla de AGL 100 mM. Se prepararon alícuotas de los AGL individuales y la mezcla de AGL con burbujeo de nitrógeno a través para reducir la oxidación y aumentar la estabilidad. Se congelan las disoluciones madre a -20ºC.

Tampón de perfusión PI: tampón de perfusión libre de calcio y magnesio (pH 7,2) con concentraciones finales tal como se especifica para cada uno de los siguientes componentes: NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, KPO_{4} 1,2 mM, pH 7,4, NaHCO_{3} 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, glucosa 5,5 mM, albúmina sérica humana o bovina (BSA) al 0,5%, ácido ascórbico (50 \mug/ml), insulina (4 \mug/ml), dexametasona (1 \muM).

Tampón de perfusión P2: medio de Eagle modificado por Dulbecco o medio RPMI 1640 complementado con BSA al 0,5%, ácido ascórbico (50 \mug/ml), insulina (4 \mug/ml) y dexametasona (1 \muM).

DMEM: medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) con glucosa, piruvato de sodio y L-glutamina y complementado además con suero bovino fetal al 5%, insulina (4 \mu/ml) y dexametasona (1 \muM).

Medio de Chee complementado con complemento de cultivo ITS+^{TM} (5 ml/500 ml) y dexametasona (0,1 \muM)

Se diluye 9:1 Percoll (Pharmacia, nº de catálogo 17089102) con 10X solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco.

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Ejemplo 3 Estudios de tejido de hígado fetal

Los hígados fetales llegan en el tampón de transporte (descrito anteriormente) y sobre hielo. Se aclaran con un "tampón de lavado celular" que consiste en medio RPMI 1640 (Gibco) complementado con insulina (Sigma; 5 \mug/ml), transferrina (Sigma; 5 \mug/ml) selenio (oligoelementos de espectrometría de masas de Johnson Matthey; 10^{-9} M) y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina sérica bovina en una razón molar 1:1. Después se colocan los hígados fetales en un tampón de colagenasa durante 15-20 minutos y después se prensan suavemente a través de un "colector" (Sigma) con una rejilla de 800 de malla para dar pequeños agregados de células; se usa el "tampón de lavado celular" para facilitar el proceso de disociación. Después se disocian completamente los agregados de células prensándolos a través de un filtro de 70 micras (filtro celular Falcon, de nailon de 70 \mum, nº de catálogo 2350) usando el "tampón de lavado celular" para facilitar el proceso. Las células que pasan a través del filtro de 70 micras se mantienen separadas de las que no pasan. Se crioconservan ambas muestras y se comprueban para determinar su viabilidad en porcentaje usando el ensayo de exclusión con colorante azul trípano.

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Ejemplo 4 Estudios de tejido de hígado adulto

Se cateterizan los hígados por la vena porta, la vena cava o por ambas, se realiza una perfusión de tampones para eliminar la sangre; y después se realiza una perfusión de tampones que contienen colagenasas/proteasas para disociar enzimáticamente las células. Tras la digestión, que tarda normalmente 15-30 minutos dependiendo del tamaño del hígado, se prensa el tejido a través de estopilla o un filtro de nailon o se rastrilla con un peine para completar mecánicamente el proceso de disociación celular. Se aclaran las células disociadas con un tampón que contiene suero para inactivar la colagenasa y otras enzimas usadas en el proceso de perfusión.

Se colocan los tampones de perfusión, PI y P2, en un baño de agua a 37ºC. Se lleva a cabo la perfusión en una caja de perfusión de tipo Miller, que se mantiene a 37ºC a lo largo de la perfusión. Se oxigenan los tampones durante la perfusión. Se aclaran todos los tubos en la caja con etanol al 70%, seguido por agua destilada y después con PI para garantizar que se ha eliminado el aire del sistema. Se introducen cánulas en el hígado usando una cánula de teflón a partir de una aguja de calibre 16 fijada a una jeringuilla de 60 ml para hacer pasar tampón PI helado a través del hígado usando diversos vasos sanguíneos disponibles sobre la superficie cortada del hígado para trozos grandes de hígado (100-300 g). Para los casos poco frecuentes en los que hay un lóbulo hepático entero disponible, pueden introducirse cánulas en los restos de la vena cava. Se someten a prueba los diversos vasos sanguíneos en trozos de hígado para aprender cuál ofrecerá una perfusión óptima del tejido. Este procedimiento también elimina cualquier sangre en exceso del hígado. Se introduce una cánula en el vaso sanguíneo elegido y se sella en su lugar usando adhesivo de calidad médica ("supercola" de calidad médica). Todos los demás vasos grandes y aberturas de la superficie se sellan usando el adhesivo de calidad médica y, si se requiere, usando hisopos de algodón Q-tip con el adhesivo para ayudar a sellar las aberturas. Una vez secado el adhesivo, se coloca la muestra de hígado sobre una malla de nailon dentro de un recipiente de vidrio de tamaño apropiado. Se añade el tampón PI al recipiente y se sumerge el hígado en el tampón. Se coloca el recipiente que contiene el hígado dentro de la caja de perfusión, y se fija el tubo de salida de la cánula. Se hace circular el tampón PI durante 15 minutos comenzando a una velocidad baja de aproximadamente 24 ml/min. y después se aumenta lentamente hasta entre 58 ml/min. y 90 ml/minuto para optimizar la velocidad de flujo con una contrapresión aceptable. Debe comprobarse que no hay fugas excesivas del perfundido desde el hígado. Tras 15 minutos, se retira el tampón PI del recipiente y se sustituye por tampón P2 que contiene la colagenasa. Se hace circular el tampón P2 hasta que el hígado está lo suficientemente digerido (evaluado mediante conversión del color del hígado desde un marrón rojizo oscuro hasta un marrón pálido y mediante adquisición de una textura blanda del hígado). El tampón P2 no se hace circular durante más de 20-25 minutos. Una vez terminada la perfusión, se drena el tampón P2 del recipiente y se transfiere el hígado en el recipiente a una campana
biológica.

Se añade el medio de cultivo celular (DMEM) al recipiente, y se retiran la cánula y el adhesivo junto con cualquier región no digerida del hígado. Se rompe la cápsula del hígado (cápsula de Glisson) usando tijeras y pinzas para tejidos. Esto permite la liberación del tejido digerido en el medio dejando atrás el tejido conjuntivo y cualquier material no digerido. Se coloca el material digerido en el medio DMEM y después se filtra a través de una serie de filtros de diferentes tamaños. Se colocan los filtros dentro de un gran embudo para ayudar a la filtración. En primer lugar, se filtra el material digerido con una única capa de estopilla, seguido por un filtro de nailon de 400 \mum y finalmente a través de un filtro de teflón de 70 \mum. Se divide en partes iguales el filtrado en tubos de centrífuga y se centrifuga a 70 g durante 4 minutos.

Tras la centrifugación, antes de la adición de Percoll, al sobrenadante se le denomina fracción 1 (F1). Al sedimento de células se le añaden medio DMEM y Percoll isotónico para dar una razón final de 3:1 respectivamente. Por ejemplo, un sedimento pequeño de células empaquetadas de 5 ml de volumen se suspenderá en 30 ml de medio DMEM y 10 ml de Percoll isotónico. Se centrifuga la muestra a 100 g durante 5 minutos. Se obtiene el sobrenadante: la capa superior se denomina fracción 2 (F2). La capa media de Percoll se denomina fracción 3 (F3). El sedimento de células que queda es la fracción 4 (F4). Se suspenden las células de las diferentes fracciones y se evalúan para determinar la viabilidad usando el ensayo de exclusión con colorante azul trípano. Las viabilidades de estas diferentes fracciones se presentan en la tabla 3, junto con sus viabilidades tras la crioconservación.

Se conservaron las células que permanecían unidas al árbol vascular o biliar del tejido hepático tras la perfusión del hígado. Estas células se encuentran en la suspensión de células original obtenida tras la perfusión enzimática, y normalmente se dejan sobre la parte superior de los tamices (por ejemplo estopilla) tras hacer pasar a su través las células en suspensión. Estos restos del árbol vascular y biliar vuelven a procesarse con enzimas y las células resultantes se combinan junto con las otras células.

El fraccionamiento con Percoll se usa de manera rutinaria por la mayor parte de los investigadores para eliminar lo que suponen que son residuos y células muertas; solamente se conserva el sedimento final. La variación novedosa con respecto a la rutina de perfusión, tal como se da a conocer en el presente documento, es que se descartó el sedimento y se conservan las células con una menor densidad de flotación (es decir, recogida de células en la parte superior del gradiente) y se usan para estudios adicionales. Estas células son células parenquimatosas más jóvenes y tienen una facilidad mucho mayor para congelarse (véase la sección sobre la crioconservación).

Ejemplo 5 Experimentos de crioconservación

Los hígados usados para metodologías de crioconservación se han derivado de donantes de tan sólo hígados fetales (edades de gestación de 12 semanas a 25 semanas) y de hasta 77 años de edad.

Tampón de crioconservación novedoso

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Viaspan (Dupont, nº de catálogo 1000-46-06) complementado con suero humano al 2% (Gibco) o suero bovino fetal (Biowhittaker),

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crioconservante al 10% [dimetilsulfóxido (Sigma, nº de catálogo D5879 o D8779) usado exclusivamente para células parenquimatosas maduras o dimetilsulfóxido o glicerol (Sigma, nº de catálogo G6279) usado para células progenitoras].

\bullet

El tampón se complementa además con antibióticos (penicilina a 200 U/ml; estreptomicina a 100 \mug/ml),

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El tampón se complementa además con hormonas y factores de crecimiento: insulina (5 \mug/ml), transferrina (5 \mug/ml), factor de crecimiento epidérmico (50 \mug/ml), FGF (10 ng/ml), IGF II (10 ng/ml),

\bullet

El tampón se complementa además con lípidos: ácidos grasos libres (7,6 \muM/l) unidos a albúmina sérica bovina (BSA) o albúmina sérica humana (HSA) y lipoproteína de alta densidad (10 \mug/ml)

\bullet

El tampón se complementa además con oligoelementos (selenio (10^{-9} M), cobre (10^{-7}), zinc (5 X 10^{-11} M)) y un antioxidante (por ejemplo una porforina que es un mimético de superóxido dismutasa, usado a 10 \mug/ml; ácido ascórbico, usado a aproximadamente 0,1 mg/ml; o cualquier antioxidante conocido en la técnica).

La variación en la composición, tal como se da a conocer en el presente documento, es combinar los nutrientes clave, lípidos, hormonas y factores de crecimiento que se identificaron como parte de medios definidos hormonalmente libres de suero preparados a medida para células hepáticas. El tampón novedoso da como resultado viabilidades de las células de hígado para las F4 fracciones que son de tan sólo el 50% (a partir de muestras muy malas) a hasta el 80% (para muestras buenas). Las viabilidades de las fracciones F1-F3 son constantemente superiores al 80%, un hecho que se sospecha que se debe a que estas fracciones tienen células más jóvenes con estados de ploidía y actividad metabólica más propicios para la síntesis de componentes de la matriz extracelular y/u otros factores celulares necesarios para la viabilidad y el crecimiento; por tanto, es probable que sean más fáciles de congelar. El uso de un mimético de superóxido dismutasa en el tampón aumentó la viabilidad de las células en un 5-10%.

Una alternativa a lo anterior es:

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usar un tampón modificado en el que se elimina el Viaspan y se complementa el medio basal (tal como medio RPMI 1640) con insulina (5 \mug/ml), transferrina (5 \mug/ml), ácidos grasos libres (7,6 \muM/l) unidos a BSA, lipoproteína de alta densidad (10 \mug/ml), oligoelementos (selenio (10^{-9} M), cobre (10^{-7} M), zinc (5 X 10^{11} M)) y un antioxidante

\bullet

recubrir las células con una forma de matriz extracelular tal como colágeno tipo IV mezclado con laminina, o colágeno tipo I o tipo III mezclado con fibronectina.

Se suspenden células de hígado fetales, procesadas tal como se describió anteriormente, en el tampón de crioconservación (descrito anteriormente), se preparan alícuotas en crioviales de 3 ml a 5-10 X 10^{6} células/ml y se mantienen en esas condiciones durante 1-2 horas. Después se congelan las células hasta temperaturas de nitrógeno líquido de -100ºC a -180ºC, preferiblemente -160ºC usando un congelador de velocidad controlada por ordenador (Forma Cryomed) y después se almacenan en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido (-160ºC) de fase de vapor grande. Las células sobreviven bien al proceso y no se produce una pérdida significativa de viabilidad a lo largo de periodos de almacenamiento que oscilan desde 50-270 días (véase la figura 3).

Se encontró que las fracciones de células hepáticas de adulto (F1-F4) contenían poblaciones celulares diferenciadas: F1 contiene residuos, glóbulos rojos, células estrelladas hepáticas y células de hígado pequeñas (<10 \mu) que son probables poblaciones de células progenitoras (de linajes o bien hepático o bien hematopoyético); la fracción F2, la parte superior de la disolución de Percoll, contiene células hepáticas más grandes (10-15 \mu) que son células parenquimatosas pequeñas, diploides; la fracción F3 en la parte inferior del Percoll contiene células parenquimatosas aún más grandes (15-25 \mu) que consisten en una mezcla de células diploides y tetraploides; y la fracción F4 (la usada por todos los demás investigadores) que consiste en las más grandes de las células parenquimatosas (25-50 \mu) y que son totalmente poliploides (tetraploides y octaploides). En general, las células parenquimatosas en la fracción F1-F3 tienen una viabilidad tras la congelación del 85-95%; las células parenquimatosas en la fracción F4 tienen una viabilidad del 50-80% tras la congelación (dependiendo de las condiciones del hígado a la llegada). Las variables identificadas que influyen sobre la viabilidad de las células parenquimatosas en la fracción F4 son: 1) edad del donante (cuanto mayor sea el donante, peor es el pronóstico para las células); 2) el tiempo entre el "momento de pinzamiento" y la entrega al laboratorio (cuanto menor sea, mejor); 3) el estado de salud del tejido hepático antes de la extracción (es decir, un estado isquémico grave da un mal pronóstico). Estos factores son interactivos, de tal manera que una rápida entrega de tejido de un donante anciano puede ser más atractiva que tejido de un paciente joven que ha pasado demasiado tiempo en el transporte.

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TABLA 5 Las viabilidades promedio y eficacias de fijación de hígados fetales y de adulto con crioconservación y el % de células progenitoras hepáticas (células AFP+) en la suspensión celular

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El intervalo extremo de viabilidades de las fracciones F4 tanto tras el procesamiento como tras la congelación se debe a las duraciones de tiempo variables entre el "momento de pinzamiento" y la recepción de las muestras en el laboratorio y también a los estados variables del hígado (fibrótico, isquémico, etc.). En general, la fracción F4 es la más sensible a las variaciones de tratamiento de los hígados y la salud general del tejido. De manera notable, las fracciones F2 y F3 eran viables de manera rutinaria y se crioconservaban fácilmente incluso cuando se obtenían a partir de muestras de hígado malas. Las fracciones F1 eran más variables, conteniendo una gran cantidad de residuos, gotas de grasa así como numerosas células pequeñas que incluían tanto células parenquimatosas pequeñas (que se supone que incluyen células progenitoras hepáticas) y diversas subpoblaciones hemopoyéticas (es decir, eritrocitos).

TABLA 6 Crioconservación: hígado fetal

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TABLA 7 Crioconservación: Hígado de adulto

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Ejemplo 6 Citometría de flujo

Se hacen pasar las células en una única fila a través de una célula de flujo en la que se exponen a luz láser. Se determina el volumen aproximado de cada célula mediante "dispersión directa", o la cantidad de luz que se refracta cuando se corta el haz. Se usa la luz dispersada, "dispersión lateral" a partir de estructuras celulares internas tales como el núcleo, retículo endoplasmático, aparato de Golgi, vesículas, etc., para determinar la cantidad de complejidad interna (es decir, una célula activa y una célula más madura contendrá más componentes internos que una quiescente o una más joven). Se obtiene información más selectiva sobre las características celulares uniendo antígenos característicos, sumamente específicos, a complejos proteicos sobre la superficie celular. Estos anticuerpos pueden unirse covalentemente a moléculas fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) y conjugados en tándem de PE y citocromo que se excitan mediante los haces láser, generando luz emitida a longitudes de onda específicas para cada fluoróforo. Seleccionando un panel de cromóforos distintivos conjugados con anticuerpos específicos, se seleccionan poblaciones celulares de interés.

Se analizan células basándose en la introducción de sus parámetros. Se usa una variedad de dispositivos de recogida para recoger las células deseadas, incluyendo tubos cónicos y Eppendorf, y placas de múltiples pocillos de cualquier tamaño a una velocidad de hasta 40.000 acontecimientos por segundo o superior.

Anticuerpos y reactivos usados en procedimientos de tinción

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Anticuerpo monoclonal de ratón anti-ser humano

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Disoluciones principales usadas en preparaciones celulares para la citometría de flujo

BSA: albúmina sérica bovina (Pentex V)

PBS = solución salina tamponada con fosfato;

FBS = suero bovino fetal;

AFP = alfa-fetoproteína

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Medio de Eagle modificado por Dulbecco con hormonas: HC DMEM

500 ml de DMEM, alto contenido en glucosa sin rojo de fenol

25 ml de suero bovino fetal (FBS)

20 ml de EGTA 5 mM

Insulina (5 \mug/ml), transferrina (5 \mug/ml)

Oligoelementos [selenio (10^{-9} M), cobre (10^{-7} M), zinc (5 X 10^{-11} M)]

Antibióticos (penicilina 100 \mug/ml, estreptomicina 100 \mug/ml)

500 mg de albúmina sérica bovina (BSA), 30 mg de ADNasa

38 \mul de mezcla de ácidos grasos libres unidos a BSA.

Filtrado en condiciones estériles a través de una unidad de filtración Nalgene con poros de 0,2 \mum

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Solución salina tamponada de Hanks - versión modificada: HBSS-mod

50 ml de 10X HBSS

10 ml de Hepes 1 M

Penicilina 100 \mug/ml/\mug/ml/Estreptomicina 100 \mug/ml

500 mg de BSA

30 mg de ADNasa

Completar hasta 400 ml

pH hasta 7,3

Llenar hasta 500 ml

Filtro estéril a 0,2 \mum

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Tampón de bloqueo para inmunoquímica

100 ml de HBSS-mod

2,2 ml de gel de peces teleósteos al 45% y

0,8 g de BSA

0,5 ml de saponina al 1% en HBSS

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Medio de montaje para microscopia inmunofluorescente

0,5 ml de 2X PBS

0,25 g de galato de n-propilo

5,7 g de glicerol.

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Ejemplo 7 Procedimientos para la preparación de tejido de hígado congelado para citometría de flujo

Se descongela rápidamente tejido de hígado congelado a 37ºC. Se lleva cada criovial de hígado (conteniendo cada uno aproximadamente 3 ml de tampón que contiene 5-10 X 10^{6} células/ml) hasta 10 ml a una velocidad de 1 ml por min. sobre hielo con HC-DMEM. Después se centrifuga la muestra a 1200 RPM durante 5 min. a 4ºC. Se descarta el sobrenadante, y se resuspende el sedimento de células en 5 ml de HC-DMEM. Se repite el lavado de las células hasta que el sobrenadante se vuelve transparente. Entonces se cuentan las células y se evalúan las viabilidades con un hemocitómetro usando el ensayo de exclusión con colorante azul trípano. Se dividen las células en fracciones según el protocolo experimentas. Se preparan tubos patrón para datos de control que contienen entre 1 y 2 X 10^{6} células, logrados habitualmente tomando 200 \mul para cada uno de una suspensión celular de 5-10 X 10^{6}/ml. Se necesitan los siguientes tubos patrón:

1) OCS. Suspensión celular original que consiste en células control no teñidas.

2) FITC soplo para ajustes de compensación. Se añaden 5 \mul de anticuerpo anti-glicoforina A marcado con FITC a 200 \mul de suspensión celular. Una alternativa es un cóctel de CD34, CD38 y CD45 marcadas con FITC, 7 \mul de cada una en 200 \mul de células.

3) PE solo para ajustes de compensación. Se usa una glicoforina-PE (de 2 \mul a 1 ml de HC-DMEM y se añaden 30 \mul de esto a 200 \mul de células).

4) 7AAD solo para compensación. Se genera una buena señal fijando 200 \mul de suspensión celular con paraformaldehído al 2% y después añadiendo 5 \mul de 7AAD 100 \muM y 5 \mul de detergente (saponina al 1%) a una suspensión de 1 ml de estas células en HBSS-mod. Las células permeabilizadas se tiñen intensamente con 7AAD.

5) Cy5 solo para compensación. Se incuban 200 \mul de células fijadas (paraformaldehído al 2%) durante 40 min. en suero de cabra al 2% para marcar las superficies celulares con IgG de oveja. Después se incuban las células con anticuerpo de burro anti-IgG de cabra conjugado con Cy5 (1:800) durante 40 min.

6) AMCA solo para compensación. Tal como con 7AAD, se genera una señal intensa de manera artificial para ajustes de compensación. Se incuban 200 \mul de células fijadas (paraformaldehído al 2%) durante 40 min. en suero de oveja al 2% para marcar las superficies celulares con IgG de oveja. Después se incuban las células con anticuerpo de burro anti-IgG de oveja conjugado con AMCA (1:800) durante 90 min.

7) Controles de AMCA/Cy5. Se incuban células fijadas (paraformaldehído al 2%) y permeabilizadas (saponina al 0,05%) con anticuerpo de burro anti-IgG de oveja conjugado con AMCA y anticuerpo de burro anti-IgG de cabra conjugado con Cy5 durante 90 min.

8) Controles de isotipo monoclonal. Se incuban células con un conjugado de IgG1 de ratón/PE y un conjugado de IgG2 de ratón/FITC. Las concentraciones deben corresponder con las usadas para etiquetar tubos analíticos y de clasificación.

9) Controles de isotipo intracelular. Se incuban células fijadas (paraformaldehído al 2%) y permeabilizadas (saponina al 0,05%) con IgG de cabra e IgG de oveja no inmunitaria durante 90 min. como controles para anticuerpos usados para la identificación de albúmina y alfa-fetoproteína. Se continúa con la incubación con anticuerpo de burro anti-IgG de cabra conjugado con Cy5 y anticuerpo de burro anti-IgG de oveja conjugado con AMCA durante 90 min.

Se preparan tubos de clasificación para la adquisición de poblaciones celulares seleccionadas que expresan combinaciones particulares de marcadores CD. Normalmente, estos tubos contienen 50-70 X 10^{6} células. Se resuspenden las células en 1 ml de tampón de tinción compuesto por HC-DMEM + BSA al 1% + 7AAD 500 pM (5 \mul de disolución madre 100 mM). Se añaden entre 15 y 25 LL de cada uno de CD34 FITC, CD38 PE o CD45 PE al tampón de tinción según los números de células (normalmente 3 \mul de anticuerpo de Pharmingen por 10 X 10^{6} células). Se añade anticuerpo contra el kit c a una dilución 1:60, se usa glicoforina A a una dilución 1:500. Se tiñe durante 40 min. sobre hielo en la oscuridad. Tras la tinción se lavan dos veces las células con HBSS-mod y se fijan con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min. sobre hielo.

Ejemplo 8 Tinción intracelular para la clasificación celular

Para la tinción intracelular de células para el análisis de alfa-fetoproteína (AFP) mediante citometría de flujo, se permeabiliza la suspensión celular con una mezcla de saponina (Sigma S4521) al 0,05% en HBSS-mod durante 10 min. sobre hielo. Después se bloquean las células en una mezcla de HBSS-mod que contiene gel de peces teleósteos al 1% y BS al 0,8% y saponina al 0,005% durante 20 min., seguido por incubación con anticuerpo de cabra anti-AFP humana y anticuerpo de oveja anti-albúmina humana (ambos 1:800 en tampón de bloqueo) durante 90 min. a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavan dos veces las células con HBSS-mod que contiene saponina al 0,01% seguido por incubación con anticuerpo de burro anti-IgG de cabra conjugado con Cy5 y anticuerpo de burro anti-IgG de oveja conjugado con AMCA durante 90 min.

Alternativamente, tras el anticuerpo primario, se incuban las células con anticuerpo biotinilado de conejo anti-IgG de cabra (1:500 en tampón de bloqueo que contiene suero humano al 2% y saponina al 0,01% durante 90 min. a temperatura ambiente en la oscuridad). Esto se sigue por 2 lavados con HBSS-mod que contiene saponina al 0,01% y después la incubación con conjugado de estreptavidina/Cy5 9 \mug/ml en saponina al 0,01%/HBSS-mod durante 90 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, se lavan 2 veces las células con HBSS-mod y se resuspenden en HBSS-mod, se filtran a través de un tamiz de 50 \mum para eliminar aglutinamientos de células para su análisis y clasificación en el citómetro de flujo.

Si se pretende la selección de células progenitoras hepáticas, la inmunoselección incluye eliminar células que son poliploides y/o expresan marcadores asociados con células hemopoyéticas maduras del hígado tales como glicoforina A sobre glóbulos rojos. Adicionalmente, se eliminan todas las células que presentan CD45, que se expresa sobre todas las células hemopoyéticas maduras.

Ejemplo 9 Tinción inmunohistoquímica de poblaciones celulares clasificadas

Se tiñen células para detectar alfa-fetoproteína tras el análisis y la clasificación mediante el citómetro de flujo. Se recogen las fracciones celulares clasificadas en HBSS-mod al 0,3% que contiene BSA al 1%. Tras volver al laboratorio, se ajusta el volumen de muestras recogidas para proporcionar 0,5 X 10^{6} células/ml y se centrifugan alícuotas de 200 \mul sobre portaobjetos de microscopio con un aparato Shandon Cytospin. Se secan al aire las preparaciones de portaobjetos sometidas a citocentrifugación y se almacenan para detectar más tarde la tinción para alfa-fetoproteína y/o albúmina. El "disco" de células fijadas del portaobjetos de microscopio se enmarca en un círculo con un dique de goma para producir un "pocillo" para la aplicación de reactivos inmunohistoquímicos. Se empapan los portaobjetos en tampón tris (tris con "bajo contenido en sal" 10 mM con NaCl al 0,9% a pH 7,4) que contiene Triton X al 0,3% durante 10 min., seguido por 10 min. en Tris con bajo contenido en sal solo.

Después se bloquean las células en suero de conejo al 10% contenido en una disolución de bloqueo de gel de teleósteo descrita anteriormente durante 90 min. a temperatura ambiente. Tras dos lavados con Tris con bajo contenido en sal, se incuban las células durante la noche a 4ºC con anticuerpo de cabra anti-AFP humana diluido hasta 1:100 en tampón de bloqueo que contiene suero de conejo al 2%. Después se siguen dos lavados en tampón Tris por una incubación durante 90 min. con anticuerpo biotinilado de conejo anti-IgG de cabra (1:200) en tampón de bloqueo a temperatura ambiente. Se usa una incubación final con complejo de estreptavidina/AMCA (9 \mug/ml en tampón Tris con bajo contenido en sal) para ubicar inmunorreactividad de tipo AFP mediante la unión del fluorocromo AMCA con el anticuerpo biotinilado de conejo. Tras 2 lavados con tampón Tris se deja que las preparaciones celulares se aproximen a la sequedad antes de cubrir bajo un medio de montaje que evita la pérdida de fluorescencia ("antifade") (0,25 g de galato de n-propilo en 5,7 g de glicerol con 1 ml de PBS). Cuando es apropiado, se tiñen doblemente las células para detectar albúmina incluyendo un anticuerpo de conejo anti-ser humano conjugado con rojo de Texas contra albúmina con el anticuerpo primario anti-fetoproteína.

Se preparan portaobjetos de control mediante la omisión del anticuerpo primario o secundario para demostrar la ausencia de marcaje con AMCA de células en ausencia o bien del anticuerpo anti-alfa-proteína o bien del anticuerpo biotinilado secundario. Se inspeccionan los portaobjetos con microscopia de epifluorescencia usando excitación UV del colorante AMCA que emite luz en la región del azul (450 nm).

Ejemplo 10 Terapia celular y/o génica

Ya que el activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) humano puede activar el plasminógeno a través de especies, se construye un vector de adenovirus recombinante, Ad-RSV-uPA, que expresa la urocinasa humana a partir del promotor de LTR del VSR, con el objetivo de inducir la regeneración del hígado. Para la construcción y producción de los vectores de adenovirus recombinante, se prepara el ADNc para uPA humano tal como sigue. Se inserta el fragmento de uPa de 1,326 kb HindiII/Asp718 que contiene la secuencia codificante de proteína en los sitios HindiII/Asp718 de pXCJL.1 bajo el control transcripcional del promotor de LTR del virus del sarcoma de Rous (VSR), y en sentido 5' de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Se prepara el virus tras la cotransfección con pJMI7 y al vector se le denomina Ad-RSV-uPA. La exploración para detectar Ad-RSV-uPA se lleva a cabo mediante amplificación de placas individuales en células 293. Tres días tras la infección se somete a prueba el sobrenadante para detectar uPA reactivo inmunológico mediante ELISA y actividad fibrinolítica mediante ensayo en placas de fibrina demostrando la actividad catalítica de uPA producida tras la infección con Ad-RSV-uPA. Se almacena el virus purificado en alícuotas a -80ºC y se diluye de manera reciente con medios HGDMEM antes de la inyección. Se determinan los títulos virales mediante mediciones de DO y ensayo en placas convencional. La construcción de los vectores se lleva a cabo esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense número 5.980.886. Se titulan los virus en células 208F.

Se alojan ratones hembra C57BL/6 de 5 a 6 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) en un entorno libre de patógeno específico. Se obtienen muestras de hígado isquémico en diversos periodos de tiempo a partir de ratones sacrificados y se aíslan células progenitoras de hígado tal como se dio a conocer anteriormente. Para la inserción de cánula en la vena porta, se anestesian ratones receptores mediante una administración intraperitoneal de 0,5 ml de 2,2,2-tribromoetanol 20 mg/ml. Se realiza una incisión en la línea media abdominal y se separa la piel del peritoneo para crear una bolsa subcutánea. Se abre el peritoneo y se expone la vena porta. Se inserta un tubo de silicona (0,02'' de D.I., 0,037'' de D.O., calidad médica S/P, Baxter, 111.) en la vena porta y se realiza la perfusión con solución salina heparinizada. Posteriormente, se introduce la cánula a través del peritoneo y se fija con una sutura de seda 4,0. Se ata la cánula de 3 cm de longitud al extremo distal y se coloca por vía subcutánea en la bolsa previamente creada. Se administran a los ratones las células progenitoras infectadas con virus no antes de 24 h. después. En algunos ratones la introducción de la cánula en la vena porta se realiza junto con una hepatectomía 2/3. Después se lleva a cabo la hepatectomía parcial. Para realizar la perfusión de la vena porta, se anestesian los ratones, se abre la piel en el sitio proximal de la incisión abdominal que ya existe. Se expone la cánula y se conecta a una bomba de jeringuilla. Para la infusión de virus, se inyectan las preparaciones de adenovirus en DMEM a lo largo de 5 a 10 min. en la vena porta a través de la cánula.

Todos los análisis bioquímicos e histológicos se realizan tras la inyección de células progenitoras hepáticas infectadas con adenovirus en la vena porta a través de la cánula. El ensayo de ELISA para detectar uPA se basa en dos anticuerpos monoclonales diferentes dirigidos contra el dominio de unión a receptor y catalítico de uPA. Uno de los anticuerpos monoclonales está marcado con peroxidasa. Se analizan la albúmina y las proteínas totales en suero mediante métodos automatizados rutinarios en los laboratorios de patología clínica. Se sabe que la infusión de adenovirus en la vena porta de ratones C57BL/6 da como resultado la transducción del 100% de los hepatocitos con más de 1 copia de ADN adenoviral por célula. La misma dosis de Ad-RSV-uPA da como resultado una mortalidad del 90% que estaba relacionada al menos en parte con la hemorragia. Cuando se usa una dosis inferior de Ad-RSV-uPA, la tasa de mortalidad es inferior al 5% y esta dosis se selecciona para los experimentos de regeneración del hígado. La infusión de Ad-RSV-uPA da como resultado elevaciones transitorias de urocinasa sérica que alcanzan un valor máximo de aproximadamente 350 ng/ml (de 70 a 100 veces superior a los niveles endógenos) cuatro días después antes de caer hasta concentraciones previas en el día 12. El aumento de uPA también está asociado con un aumento de las concentraciones séricas de SGPT. En tiempos variables tras la infusión de adenovirus, se realiza la infusión a los animales de 3H-timidina, y se determina la cantidad de radiactividad incorporada en el ADN del hígado como medio para cuantificar la proliferación celular. Los animales tratados con Ad-RSV-uPA tuvieron un periodo aumentado de captación de timidina que comenzó en el día 3 y continuó durante 8 días. Por tanto, el periodo de captación de 3H-timidina hepática con tratamiento con Ad-RSV-uPA/células ovales es muy superior al obtenido con hepatectomía parcial. Los receptores del adenovirus de control negativo muestran máximos de captación de 3H-timidina hepática en el día 4 que volvió a los niveles iniciales 24 h después y un aumento mínimo de la captación de 3H-timidina en el día 11. En resumen, el daño hepático tal como se mide mediante los niveles de SGPT y las altas tasas de captación de 3H-timidina se atribuyen a la producción de urocinasa intrahepática, lo que indica que se produce una regeneración biosintética del hígado significativa. Las células progenitoras hepáticas infundidas sin uPA son mejores que el adenovirus sin inserto de uPA.

Hallazgos histológicos microscópicos de animales tratados con adenovirus recombinante/células progenitoras derivadas de donantes cadáveres con corazón parado indican que el día 3 los ratones tratados tenían un infiltrado inflamatorio moderado que contenía macrófagos y neutrófilos. Los cambios degenerativos en los hepatocitos incluían vacuolización, núcleos picnóticos y algunos mitóticos. De ocho a 10 días tras la administración de Ad-RSV-uPA/células ovales, hay evidencias de recuperación hepática incluyendo la presencia de regeneración multifocal, tamaño heterogéneo de núcleos y una reacción inflamatoria muy disminuida con pocos hepatocitos en degeneración. A las de tres a cuatro semanas, el infiltrado se resolvió y el hígado parece normal.

En total, estos estudios demuestran que la expresión de urocinasa en combinación con células progenitoras hepáticas indujo una regeneración significativa de células parenquimatosas de hígado.

Ejemplo 11 Reducción del volumen mediante centrifugación de Percoll

Este ejemplo proporciona métodos para enriquecer células progenitoras de hígado, incluyendo células madre de hígado, células progenitoras no comprometidas y células progenitoras comprometidas. Los expertos en la técnica conocen variaciones de estas técnicas y son igualmente adecuadas siempre que concuerden con el objetivo de reducir el volumen de suspensiones de células de hígado para proporcionar una población enriquecida de células progenitoras.

Se aplica una suspensión celular sustancialmente única de células de hígado en medio de cultivo, por ejemplo el medio basal de Eagle (BME), a la parte superior de una capa de Percoll al 15% preparada en BME. Usando una centrífuga Sorvall RT7 y un rotor de 14 cm, u otra combinación de centrífuga y rotor equivalente, se centrifugan los gradientes a de 600 a 1200 rpm, preferiblemente de 750 a 1000 rpm durante 10 min. Se recoge el sobrenadante y vuelve a centrifugarse, pero a de 1200 a 2000 rpm, preferiblemente a aproximadamente 1500 rpm. La fracción de sobrenadante se enriquece en células progenitoras y el sedimento (fracción F3) contiene células que pueden realizar al menos un ciclo celular. Se recogen las células sobrenadantes por separado y vuelven a centrifugarse, a de 2000 a 3000 rpm, preferiblemente a aproximadamente 2500 rpm. En esta última centrifugación, las células progenitoras sedimentan con frecuencia en las regiones superiores de Percoll, dejando residuos celulares en los niveles superiores, y el sedimento tiene células que pueden realizar varios ciclos de mitosis. La fracción de Percoll es adecuada para su uso inmediato, la crioconservación, el establecimiento en cultivo o el enriquecimiento adicional. Puede lograrse un enriquecimiento adicional mediante adsorción "panning", selección por afinidad, clasificación por FACS o cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica y descritas anteriormente. La selección negativa se logra mediante la eliminación de células que expresan marcadores para CD45, glicoforina A. La selección positiva se logra mediante la selección de células que expresan CD14, CD34, CD38.

Ejemplo 12 Preparación de células progenitoras mediante elutriación

Este ejemplo proporciona etapas para un aislamiento de células progenitoras hepáticas comprometidas y no comprometidas. Aunque en la técnica se conocen diversas técnicas, se da a conocer con detalle una de las realizaciones preferidas entendiendo que otras técnicas de preparación son igualmente adecuadas siempre que concuerden con los objetivos deseados. Para ejemplos de técnicas preferidas, no limitativas, véanse por ejemplo las patentes estadounidenses números 5.807.686, 5.916.743, 5.672.346, 5.681.559, 5.665.557, 5.672.346 y 5.663.051.

Pueden aislarse de forma preliminar células del hígado pequeñas, hepáticas comprometidas o pluripotentes usando o bien Percoll o bien otros gradientes de densidad adecuados tales como Histopaque, y tras centrifugación, se lavan dos veces con medios y se resuspenden en 10 ml de medios de elutriación. Para la elutriación a contracorriente, se inyectan las células mononucleares pequeñas lavadas por medio de un acoplador al sitio de muestreo en la corriente de entrada de una centrífuga Beckman J6M/E equipada con un rotor JE-5 y una cámara convencional. Sin embargo, puede usarse cualquiera de varias centrífugas de flujo continuo comerciales y elutriadores que emplean preferiblemente insertos de plástico desechables incluyendo medios de cámara para facilitar la separación basada en la densidad, tales como los equipos "Fenwal Models CS 3000" y "Autopheresis C" comercializados por Baxter International Inc, de Deerfield, IL; o Spectra Apherisis v 7/6, comercializado por Cobe manufacturing de Lakewood, CO. La elección de los instrumentos depende de un experto en la técnica. Una bomba peristáltica (Cole Palmer Instruments, Chicago, IL) proporciona un flujo continuo de medio de elutriación, que es solución salina normal al 0,9% con D-glucosa 100 mg/dl, ácido etilendiaminotetraacético de disodio 0,3 mM (EDTA) y albúmina sérica bovina 50 mg/dl con pH ajustado hasta 7,2. Se esteriliza el medio antes de usarse. Se suministran las células a una velocidad de flujo total de 15 ml/min., velocidad del rotor de 900 g y a temperatura ambiente. Tras recoger 100 ml de eluato, se aumenta la velocidad de flujo hasta 25 ml/min. Con la velocidad del rotor mantenida constante, se aumentan secuencialmente las velocidades de flujo hasta 29 ml/min, 33 ml/min y 37 ml/min, recogiendo 200 ml con cada incremento. Se recogen las células que quedan en la cámara apagando el rotor y lavando la cámara con 100 ml de medios de elutriación. Se lava cada fracción celular y se centrifuga a 300 g durante 10 minutos. Se recogen las fracciones adecuadas, se determina la viabilidad mediante exclusión con colorante azul trípano y se determinan las recuperaciones celulares con un contador de células (Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Alternativamente, no se separan las células hepáticas mediante separación por gradiente de densidad y se suspenden en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, que contiene suero de ternero fetal al 5%, EDTA al 0,01% p/v y D-glucosa 1,0 g/l, y se inyectan en un sistema de elutriación centrífuga a contracorriente Beckman a 10ºC a una velocidad de rotor de 1.950 rpm usando un rotor JA-17 y una cámara de separación convencional (Beckman Instruments) y se eluyen muestras a velocidades de flujo de entre 12 y 14 ml/min.

Las células obtenidas en las fracciones adecuadas tienen generalmente diámetros celulares en un intervalo de 5 a 15 micras, preferiblemente de 8,0 a 9,4 micras; la mayor parte de las células tenían diámetros que se encontraban en un intervalo de 8,3 a 9.2 micras. Estos diámetros se miden según técnicas conocidas en la técnica. Si es necesario, se lleva a cabo una selección adicional o bien positiva o bien negativa, basada en marcadores celulares.

Puede usarse una variedad de otros anticuerpos conocidos por los expertos en la técnica solos o en combinación con marcadores de células progenitoras del hígado. La elección dependerá del tipo de célula que se desea aislar o enriquecer e incluye, pero no se limita a, anticuerpos específicos contra antígenos hematopoyéticos y linfoides tales como anti-CD2, anti-CD2R, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5 y anti-CD8 específicos para células T; anti-CD6 específico para un subconjunto de células T y un subconjunto de células B; anti-CD7 específico para un subconjunto de células T principal; anti-CD 12, anti-CD 19 y anti-CD20, anti-CD72, anti-CDw78, específicos para células B; anti-CD13 y anti-CD14 específicos para monocitos; anti-CD16 y anti-CD56 específicos para linfocitos citolíticos naturales; anti-CD41 para plaquetas; anti-CD1a, CD1b y CD1c específicos para timocitos corticales y células de Langerhans; anti-CD9 específico para células pre-B, monocitos y plaquetas; anti-CD10 específico para células progenitoras linfoides, C-All y granulocitos; anti-CD11a específico para leucocitos; anti-CD11b específico para granulocitos, monocitos y linfocitos citolíticos naturales; anti-CD11c específico para monocitos, granulocitos, linfocitos citolíticos naturales y leucemia por tricoleucitos; anti-CD15 específico para granulocitos; anti-CDw17 específico para granulocitos, monocitos y plaquetas; anti-CD18 específico para leucocitos; anti-CD21 específico para células B maduras; anti-CD22 específico para citoplasma de células B y células B maduras; anti-CD23 específico para células B activadas; anti-CD24 específico para células B y granulocitos; anti-CD25 y anti-CD26 específicos para células T y B activadas y macrófagos activados; anti-CD27 y anti-CD28 específicos para un subconjunto de células T principal; anti-CD30 específico para células T y B activadas y células de Sternberg Reed; anti-CD31 específico para plaquetas, monocitos/macrófagos, granulocitos y células B; anti-CDw32 específico para macrófagos, granulocitos, células B y eosinófilos; anti-CD33 específico para monocitos, células progenitoras mieloides y leucemias mieloides; anti-CD34 específico para células precursoras hematopoyéticas; anti-CD35 específico para granulocitos, monocitos, células B, algunas células NK y eritrocitos; anti-CD36 específico para monocitos/macrófagos y plaquetas; anti-CD37 específico para células B maduras; anti-CD38 específico para células plasmáticas, timocitos y células T activadas; anti-CD39 específico para células B maduras; anti-CD40 específico para células B y carcinoma; anti-CD42 y 42b específicos para plaquetas y megacariocitos; anti-CD43 específico para leucocitos excepto células B circulantes; anti-CD44 específico para leucocitos y glóbulos rojos; anti-CD45 específico para leucocitos; anti-CD45RO específico para células T, un subconjunto de células B, monocitos y macrófagos; anti-CD45RA específico para células B, monocitos y un subconjunto de células T; anti-CD45RB específico para células B, un subconjunto de células T, monocitos macrófagos y granulocitos; anti-CD46, CD55, CD58 y CD59 específicos para células hemopoyéticas y no hemopoyéticas; anti-CD47 específico para todos los tipos de células; anti-CD48 específico para leucocitos y neutrófilos; anti-CDw49b específico para plaquetas, células T activadas y cultivadas a largo plazo; anti-CDw49d específico para monocitos, células T y células B; anti-CDw49f específico para plaquetas y megacariocitos; anti-CDw50 y CDw52 específicos para leucocitos; anti-CD51 específico para plaquetas; anti-CD53 específico para leucocitos incluyendo células plasmáticas normales y neoplásicas; anti-CD54 específico para células endoteliales; anti-CDw60 específico para un subconjunto de células T y plaquetas; anti-CD61 específico para plaquetas y megacariocitos; anti-CD62 específico para plaquetas activadas; anti-CD63 específico para plaquetas activadas, monocitos/macrófagos; anti-CD64 específico para monocitos (interferón gamma regulado por incremento); anti-CDw65 específico para granulocitos y reactividad heterogénea con monocitos; anti-CD66 y 67 específicos para granulocitos; anti-CD68 específico para monocitos y macrófagos; anti-CD69 específico para células B y células T activadas, macrófagos activados y linfocitos citolíticos naturales; anti-CDw70 específico para células T y B activadas, células de Sternberg-Reed y linfoma anaplásico de células grandes; anti-CD71 específico para células T y B activadas, macrófagos, células en proliferación; anti-CD73 específico para un subconjunto de células B y un subconjunto de células T; anti-CD74 específico para células B y monocitos/macrófagos; anti-CDw75 específico para células B maduras; anti-CD76 específico para un subconjunto de células T y células B maduras; anti-CD77 específico para células B del centro folicular; anticuerpos contra citocinas y factores de crecimiento (por ejemplo IL1-IL13, EGF, IGF I y 11, TGF-alfa y beta, TNF-alfa y beta, FGF, NGF, CIF, IFN-alfa y beta, CSF); antígenos virales (por ejemplo proteínas de la envuelta del virus de la hepatitis B o proteínas de la envuelta del VIH), hormonas, marcadores o antígenos asociados con tumores o celulares, moléculas de adhesión, moléculas de hemostasis y células endoteliales. Otros marcadores y procedimientos de enriquecimiento son igualmente adecuados, tales como los dados a conocer en la patente estadounidense número 5.840.502.

Ejemplo 13 Biorreactor

Se emplea un biorreactor de alto rendimiento (HPBR) para cultivar células progenitoras de hepatocitos humanos y su progenie. Este proceso proporcionará un gran número de células útil para fines médicos adicionales o el propio biorreactor sirve como unidad de producción para proteínas y factores secretados por células biológicamente útiles que pueden incluir, pero no se limitan a, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a insulina I y II (IGF-I y II), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante de tipo a y tipo b (TGF-a y TGF-beta), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de sarcoma (SGF), factor de crecimiento estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor liberador de hormona del crecimiento (GHRF) y prolactina y diversos factores de crecimiento hemopoyéticos tales como interleucinas (IL) IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, etc., factor de diferenciación eritroide (EDF) o proteína liberadora de la hormona estimulante del folículo (FRP), inhibina, factor de proliferación de células madre (SCPF) y fragmentos activos, subunidades, derivados y combinaciones de estas proteínas entre muchas otras conocidas en la técnica. Generalmente, tal como se usa en el presente documento, estos factores celulares se refieren a una proteína secretada que se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una linfocina, una interleucina, un factor estimulante de colonias, una hormona, un factor quimiotáctico, un factor anti-quimiotáctico, un factor de coagulación, una proteína trombolítica, una proteína del complemento, una enzima, una inmunoglobulina y un antígeno. Entre tales proteínas biológicamente activas, un experto en la técnica puede seleccionar factor VIII, factor IX, factor VII, eritropoyetina, alfa-1-antitripsina, calcitonina, hormona del crecimiento, insulina, lipoproteína de baja densidad, apolipoproteína E, receptor de IL-2 y sus antagonistas, superóxido dismutasa, modificadores de la respuesta inmunitaria, hormona paratiroidea, los interferones (IFN alfa, beta o gamma), factores de crecimiento nerviosos, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias, interleucinas (IL) 1 a 15, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), adenosina desaminasa, factores de crecimiento similares a insulina (IGF-1 y IGF-2), ligando promotor de megacariocitos (MPL), trombopoyetina o combinación de los mismos.

Sin limitarse a este protocolo particular de hacer crecer células en un biorreactor, otros procedimientos bien conocidos en la técnica son igualmente adecuados y pueden adoptarse fácilmente a partir de las patentes estadounidenses publicadas números 6.001.585; 5.998.184; 5.846.817; 5.622.857; 5.571.720; 5.563.068; 5.512.474; 5.443.985; 5.342.781; 5.330.915; 5.320.963; 5.202.254; 4.833.083 y 4.760.028.

El presente dispositivo contiene 450 fibras de celulosa de 10 kD, 540 fibras de polipropileno y detalles sobre otros parámetros se encuentran, por ejemplo, en la patente estadounidense número 5.622.857. Se aíslan células tal como se dio a conocer anteriormente. Todos los materiales necesarios se obtienen o bien de Sigma Chemical Co. o bien de Life Technologies. Los medios de fijación para los medios de cultivo a largo plazo son tal como sigue: medio RPMI 1640 (500 ml); 50 ml de FBS (10%); L-glutamina 4 mM; 1x penicilina/estreptomicina; gentamicina; HEPES 15 mM; insulina 10 mU/ml; transferrina 10 mU/ml; selenio. Se lava el sistema HPBR con medios durante un día antes de aplicar los medios de fijación. Se inoculan 500 mg de microvehículos Cytodex 3 previamente hinchados en el espacio anular interno del HPBR. Las fibras del oxigenador sostenían los microvehículos e impedían que se distribuyeran por la totalidad del ECS. También se inoculan células progenitoras hepáticas humanas viables en el espacio anular interno, y se balancea y se hace girar el dispositivo a mano para lograr un mezclado uniforme de células y microvehículos. Suponiendo que las células progenitoras y la progenie tienen entre 10-20 \mum de diámetro, la razón de inóculo de células con respecto a microvehículo es de aproximadamente 500. La viscosidad aparente de las células y los microvehículos aumenta rápidamente, indicando que las fijaciones célula a microvehículos y célula a célula avanzan rápida y normalmente. En el plazo de 2-3 minutos desde este mezclado, se forma un gel diferenciado de células y microvehículos en el espacio anular interno. Tras una incubación durante la noche a 37ºC en medios de fijación (en una posición estacionaria), se cambian los medios por medios de cultivo a largo plazo (2 l). Estos volúmenes no son de ningún modo limitativos ya que un experto en la técnica puede cambiar fácilmente la escala de la producción hasta el nivel deseado. Los hepatocitos se cultivan durante 5 semanas, aplicándose nuevos medios al sistema semanalmente. Se monitoriza la función metabólica de las células sometiendo diariamente muestras a prueba. Tras 5 semanas, se logra >90% de recuperación de células viables y microvehículos mediante el siguiente procedimiento: se usa colagenasa al 0,1% en PBS mezclada con 0,44 ml de EDTA (0,23 M) para lavar el ECS y se incuba el HPBR durante 10 minutos; se extrae el contenido del ECS con aire estéril desde un cilindro de jeringuilla; se repite este proceso con medios de cultivo a largo plazo y se lavan y se separan los materiales recogidos.

El HPBR es igualmente adecuado en el cultivo y la transformación genética de células (por ejemplo, expresión génica de HGF). Lo siguiente es un protocolo genético no viral para células dependientes de anclaje (por ejemplo, SW 480 P3; nº ATCC CCL228), que puede modificarse apropiadamente y optimizarse a partir de procedimientos publicados usando placas y pocillos de cultivo por los expertos en la técnica. En el HPBR se prefieren fibras de medios con propiedades de 10 kD. El biorreactor se hace funcionar básicamente de la misma manera descrita anteriormente. Los microvehículos Cytodex 1 (Pharmacia, comercializado por Sigma Chemical Co.) se usan ampliamente para cultivar células dependientes de anclaje. Puede inocularse un amplio intervalo de densidades celulares en el ECS del HPBR, que oscilan desde 1 x 10^{4} hasta 1 x 10^{15} células o más según se desee. La razón de inóculo recomendada de células con respecto a microvehículos está en el intervalo de aproximadamente 10, aunque un experto en la técnica puede modificar esto según se desee. Se hace girar suavemente el dispositivo a lo largo del experimento a aproximadamente 10 cpm (o más). Tras cultivar las células durante aproximadamente un día (o más, dependiendo de la célula específica), se alcanza una confluencia óptima para obtener una transfección eficaz. La razón de inoculación de células con respecto a microvehículos puede ajustarse para tener un impacto positivo sobre este intervalo de tiempo para la eficacia terapéutica y económica. El día de la transfección, se prepara la disolución de plásmido de ADN (por ejemplo, pCMV), y la disolución de lípido catiónico (por ejemplo, reactivo LIPOFECTIN, Life Technologies). Estos reactivos deben estar libres de suero, aunque el proceso global requiera la presencia de suero. Se mezclan cantidades apropiadas de disoluciones de ADN y de lípido, después se inyecta la mezcla en el ECS del dispositivo. Tras aproximadamente unas pocas (o incluso varias) horas de transfección, se reanuda el uso de suero, si es apropiado, y se continúa cultivando células tal como anteriormente durante aproximadamente unos pocos días. Pueden usarse periodos más largos cuando se expanden células transformadas permanentemente. Se recogen las células de una manera similar a la descrita anteriormente.

Ejemplo 14 Hígado artificial

Como ampliación del ejemplo anterior un experto en la técnica puede adoptar fácilmente el biorreactor como sistema de soporte hepático extracorpóreo. El xenotrasplante (el trasplante de órganos entre especies) puede ayudar a aliviar la escasez de hígados de donante usando órganos de animales. Sin embargo, un posible riesgo de trasplantar órganos de animales en seres humanos es que los virus que infectan a los animales donantes pueden infectar a los receptores. Ya que los receptores de trasplantes de órganos estarán tomando fármacos para suprimir el sistema inmunitario y evitar el rechazo del órgano, puede que no puedan luchar contra el virus del animal que les infecta. En una situación aún más alarmante, el virus del animal puede mutar en el huésped infectado para dar una forma que pueda infectar a contactos humanos con sistemas inmunitarios normales. Como resultado, puede surgir un nuevo virus humano patógeno. Una especie animal favorita para el trasplante de órganos a seres humanos es el cerdo y también los primates. No obstante, queda claro que si hay un hígado artificial basado en células humanas disponible, sería preferible a los hígados de animales.

Tras el tiempo en cultivo deseado, se obtienen hepatocitos maduros y/o células biliares derivadas de una población enriquecida en células progenitoras hepáticas. De manera rutinaria, se obtienen de 2 a 5 billones de células de alta viabilidad (superior al 80%). En general, el medio de cultivo usado es el medio de Waymouth complementado con hormonas. Para alojar de 2 a 5 billones de células, se amplia a escala el biorreactor hasta dos recipientes de contención, cada uno con un diámetro interno de 40 mm y una altura de 100 mm. En esta situación particular, se usan perlas de vidrio de aproximadamente 2 mm de diámetro y un volumen total de 250 ml por recipiente de contención. Se suministra medio a una velocidad de recirculación de 360 ml/min. La alta viabilidad de los hepatocitos se evidencia por la tasa de consumo de oxígeno estable. Después, se fija el biorreactor a un receptor humano sin hígado cuyo hígado se extirpa mediante cirugía debido a una insuficiencia hepática total. De manera similar, se fija el biorreactor a un sujeto humano con disfunción hepática. Un experto en la técnica conocerá los procedimientos para fijar el biorreactor como sistema de soporte hepático extracorpóreo o conocerá medios alternativos conocidos en la técnica tales como los dados a conocer, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.008.049; 5.981.211; 5.976.70; 5.891.713; 5.827.729; 5.643.794; 5.622.857; 5.605.835 y 5.270.192. Resulta evidente a partir de tales referencias que las células de hígado artificiales de donante no se limitan necesariamente a especies humanas y ahora es posible el uso en especies cruzadas de tales células. Por ejemplo, las células de hígados de cerdos o primates son igualmente adecuadas para su uso en seres humanos. Resulta igualmente evidente que los métodos y las composiciones de la presente invención permiten la preparación de células hígado humano para su uso en terapia celular o en terapia de hígado extracorpóreo, con todas las ventajas que comporta.

Se dirige sangre de la arteria femoral izquierda al hemoconcentrador Minntech. Se inserta una cánula de Elecath de 12 ribetes en la arteria femoral y se conecta a un tubo de PVC de 1/4'' al hemoconcentrador. El hemoconcentrador separó la sangre en una fracción de ultrafiltrado libre de células y una fracción de células sanguíneas. Se devuelve la fracción de células sanguíneas a la vena femoral por medio de un tubo similar. Se sacó el ultrafiltrado del hemoconcentrador por medio de un tubo de PVC de 1/4'' y se introdujo en el sistema de biorreactor de hepatocitos con la velocidad de flujo ajustada hasta 40 ml/min, Usando una bomba de rodillos. Tras la perfusión a través del biorreactor, se devuelve el ultrafiltrado al paciente por medio de la vena yugular izquierda. Para demostrar que se proporciona metabolismo hepático extracorpóreo, se administran dos productos químicos diferentes que se sabe que se metabolizan por el hígado, 7-etoxicumarina y lidocaína, en el ultrafiltrado a la entrada del biorreactor. Se miden los metabolitos respectivos, 7-OH-cumarina y monoetilglicina-xilidida (MEGX), en las salidas de los biorreactores antes de devolver el ultrafiltrado al paciente. Se observa un metabolismo significativo tanto de 7-etoxicumarina como de lidocaína. Por tanto, los resultados demuestran la aplicación del biorreactor como sistema de soporte, proporcionando metabolismo hepático extracorpóreo. La separación de las células sanguíneas del plasma minimiza la reacción inmunológica del receptor frente a los hepatocitos foráneos. Por tanto, las células progenitoras hepáticas y su progenie son útiles en el biorreactor para proporcionar soporte hepático extracorpóreo.

Ejemplo 15 Péptidos codificados por el exón 1 y uso como antígenos

Se usan péptidos cortos correspondientes al exón 1 de la alfa-fetoproteína para distinguir de manera inequívoca la alfa-fetoproteína en diversos linares celulares evaluando la expresión con anticuerpos específicos. La secuencia peptídica codificada por el exón 1 es: SEQ ID 14 MKWVESIFLIFLLNFTESRTLHRNEYGI. Estos aminoácidos también pueden representarse mediante una cadena alfabética tal como ABCDEFGHIJKLMNOPRSTUVWXYZ de tal manera que la letra A de esta cadena comienza desde la posición M, K, W, V, E, S, I, F, L, I, F, L, L o N del péptido. Se conjugan péptidos de la secuencia codificada por el exón 1 y de entre cuatro y doce residuos de aminoácido de longitud con una macromolécula para producir un antígeno. Opcionalmente, se une el péptido a la macromolécula mediante un espaciador de desde dos hasta ocho átomos de carbono de longitud. La macromolécula es albúmina, hemocianina, caseína, ovoalbúmina o polilisina. Péptidos adecuados incluyen los péptidos en la tabla y análogos con una homología de al menos el 80% o aminoácidos sustitutos convencionales. Lo siguiente es el ejemplo que un experto en la técnica interpreta para obtener la secuencia peptídica y la longitud deseadas según las necesidades
específicas:

13

14

15

en la que cualquiera de A--B--C--D--E--F--G--H--I--J--K--L--M-- o N, pueden ser aminoácidos no polares (hidrófobos) tales como

glicina Gly G

alanina Ala A

valina Val V

leucina Leu L

isoleucina Ile I

metionina Met M

fenilalanina Phe F

triptófano Trp W

prolina Pro P,

o polares (hidrófilos)

serina Ser S

treonina Thr T

cisteína Cys C

tirosina Tyr T

asparagina Asn N

glutamina Gln Q

o cargados eléctricamente (negativos)

ácido aspártico Asp D

ácido glutámico Glu E

o cargados eléctricamente (positivos)

lisina Lys K

arginina Arg R

histidina His H

o estar ausentes. La cadena puede estar compuesta por sustitutos de aminoácidos aceptables o sales de los mismos. Las sustituciones de aminoácidos más frecuentes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly y viceversa.

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm22

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Reid, Lola

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> 113918-101 Secuencia 8

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<140> Nueva

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<141> 19-01-2000

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm23

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Reid, Lola

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> 113918-101 Secuencia 9

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<140> Nueva

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<141> 19-01-2000

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm24

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Reid

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> Secuencia 10

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<140>

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<141>

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip1cm25

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Reid

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> Secuencia 11

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<140>

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<141>

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm26

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LISTADO DE SECUENCIAS

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\vskip0.400000\baselineskip

<110> Reid

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> Secuencia 12

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<140>

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<141>

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm27

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Reid

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> Secuencia 13

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<140>

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<141>

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm28

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LISTADO DE SECUENCIAS

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\vskip0.400000\baselineskip

<110> Reid

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<120> Células progenitoras del hígado humanas

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<130> Secuencia 14

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<140>

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<141>

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<160> 1

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<170> Patent En Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

29

Claims (9)

1. Método para proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células progenitoras hepáticas humanas, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una suspensión sustancialmente de una única célula de tejido del hígado humano extraído;

(b) reducir el volumen de la suspensión basándose en el tamaño de célula, la densidad de flotación o una combinación de los mismos para eliminar las células maduras al tiempo que se conservan las células inmaduras; y

(c) someter la suspensión con volumen reducido a una inmunoselección positiva que comprende seleccionar aquellas células que expresan CD14, CD34, CD38 o combinaciones de las mismas, y/o una inmunoselección negativa que comprende eliminar aquellas células que expresan CD45, glicoforina A o una combinación de las mismas, de tal manera que se proporciona una mezcla de células, mezcla de células que está compuesta por una población enriquecida de células progenitoras hepáticas humanas y expresa alfa-fetoproteína, albúmina o ambas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el tejido del hígado se obtiene de un recién nacido, un lactante, un niño, un joven o un adulto.

3. Método según la reivindicación 1, en el que las células inmaduras tienen un diámetro inferior a 15 micras.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la población enriquecida comprende células del hígado diploides humanas.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la reducción de volumen comprende una separación según el tamaño de célula, la densidad de flotación o una combinación de los mismos.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de reducción del volumen comprende la elutriación centrífuga, centrifugación por gradiente de densidad, adsorción "panning", cromatografía de afinidad, etiquetado con etiquetas fluorescentes, flujo fluido a contracorriente, centrifugación de flujo continuo, centrifugación zonal, uso de perlas magnéticas o combinaciones de los mismos.

7. Método según la reivindicación 1, que comprende además la lisis selectiva de las células maduras.

8. Método según la reivindicación 3, en el que las células inmaduras tienen un diámetro de entre 5 y 15 micras.

9. Método según la reivindicación 3, en el que las células inmaduras tienen un diámetro de entre 8 y 9,4 micras.