MXPA01007334A - Progenitores del higado humano - Google Patents

Abstract

Se describenmétodos de aislamiento y crioconservación de progenitores del hígado humano, los cuales incluyen procesar tejido de hígado humano para proporcionar una suspensión de células substancialmenteúnica que comprende progenitores y no progenitores de uno o más linajes de células encontrados en hígado humano, someter la suspensión a un paso de citoreducción, el cual reduce substancialmente el número de no progenitores en la suspensión, y el cual proporciona la suspensión citoreducida enriquecida con progenitores que exhiben uno o más marcadores asociados con al menos uno de los linajes de una o más células;y seleccionar de la suspensión citoreducida aquellas células, las cuales por ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas expresan uno o más marcadores asociados con al menos uno de los- linajes de una o más células. Entre estos marcadores están CD14, CD34, CD38, CD45, e ICAM. Los progenitores hepáticos se caracterizan por ser de 6-5 ? de diámetro, diploides, glicoforina A-, CD45-, AFP+++, ALB+, ICAM+ y con subcolonias de organismos que varían en expresión de CD 14+ CD34++, CD38++, CD117+. Estas subcolonias de progenitores tienen características esperadas para células que son particularmenteútiles en las terapias celulares y genéticas del hígado y para el establecimiento deórganos bioartificiales.

Description

*«§ PROGENITORES DEL HÍGADO HUMANO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a células 5 germinales hepáticas humanas, células pluripotentes que dan origen a hepatocitos y células biliares, y otras subcolonias de organismos de células progenitoras del higado que tienen la capacidad de expandirse y diferenciarse en uno o más linajes de células del higado incluyendo linajes celulares hemopoyéticos, mesenquimatosos o hepáticos. En particular, la invención se refiere a marcadores y propiedades usadas para identificar progenitores del hígado humano, métodos para su purificación y crioconservación, nuevas aproximaciones que permiten distinguir las subcolonias de organismos hepáticos de hemopoyéticas, y evidencia que proporciona que los progenitores hepáticos existan en hígados a partir de hígados humanos fetales o de adulto. Las invenciones constituyen la base para terapias celulares y genéticas y para el establecimiento de órganos bioartificiales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ref: 131858 •* „ La unidad estructural y funcional primaria del hígado maduro es el ácino, el cual en la sección transversal se organiza igual a una rueda alrededor de dos capas vasculares distintas: 3-7 conjuntos de triadas porta (cada 5 una con una vénula porta, arteriola hepática, y un conducto biliar) para la periferia, y con la vena central en el cubo o eje. Las células del hígado se organizan como placas celulares alineadas en ambos lados por endotelio fenestrado, que define una serie de sinusoides que están contiguos con la vasculatura central y porta. Datos recientes han indicado que los Canales de Hering, conductos pequeños localizados alrededor de cada una de las triadas porta, producen dúctos diminutos que se extienden y se unen en las placas del hígado en toda la zona 1 que forma una configuración similar a aquella de un cepillo para botella (Theise, N. 1999, Hepatology. 30:1425-1433). Un espacio restringido, el Espacio de Disse, separa el endotelio de los hepatocitos a todo lo largo del sinusoide. Como un resultado de esta organización, los hepatocitos tienen dos campos básales, cada uno de los cuales enfrenta una sinusoide, y un campo apical el cual se define por la región de contacto entre hepatocitos adyacentes. Los campos básales hacen contacto con la sangre, ^r y se involucran en la absorción y secreción de componentes de plasma, en tanto que los campos apicales forman canalículos biliares, especializada en la secreción de sales biliares, y se asocian a través de una red de 5 interconexión con los conductos biliares. La sangre fluye desde las vénulas porta y arterioles hepáticos a través de los sinusoides a las vénulas hepáticas terminales y la vena central. Basado en esta configuración microcirculatoria. En ácino se divide en tres zonas: zona 1, la región periporta; zona 2, la región midacinar, y zona 3, la región pericentral. El potencial proliferativo, criterio morfológico, grado de repetición del número básico de cromosomas, y la mayoría de genes específicos del hígado se correlacionan con la locación de zonas (Gebhardt, R., et al. 1988. FEBS Lett . 241:89-93; Gu ucio, J.J. 1989, Vol. 19. Springer International, Madrid; Traber, P. et al. 1988. Gastroenterology. 95:1130-43). Los gradientes en la concentración de componentes de la sangre, incluyendo oxígeno, a través del ácino, y que sigue la dirección del flujo de sangre de las triadas porta a la vena central, son responsables de algunas de estas zonaciones, por ejemplo la formación de compartimentos recíproca de glicólisis y gluconeogenesis. Sin embargo, la zonación periportal de la conexión 26 de la proteína de unión del hueco y la zonación pericentral de la glutamina sintetasa, por nombrar únicamente dos, son insensibles a tales gradientes, son más representativas de la mayoría de genes específicos del tejido y parece que se determinan por factores intrínsecos a las células o a variables menos el flujo sanguíneo en el microambiente. Además de hepatocitos, las células epiteliales del conducto biliar (colangiocitos) , y células endoteliales, la región entre los tractos portal y central contiene otros tipos de células, tales como células Ito y células Kupffer. Estas juegan funciones prominentes en las condiciones patogénicas del hígado, especialmente en la inflamación y fibrosis, pero su contribución directa a las funciones homeostáticas principales del órgano normal es aparentemente menor. El hígado desarrolla como un resultado de la convergencia de un divertículo formado desde la parte delantera del tubo digestivo del embrión caudal y el transverso del septo, parte de la mesénquima esplácnica. La formación de las células hepáticas empieza después de que el epitelio endodermal interactúa con el mesodermo cardiogénico, probablemente vía los factores de crecimiento de fibroblastos. Las células hepáticas específicas proliferan entonces y penetran en la mesénquima del transverso del septo con una forma parecida a un cordón, que forma la gémula del hígado. La interacción epitelial- esénquima directa es crítica es estas etapas de desarrollo temprano del hígado y ordena que células llegarán a ser hepatocitos o colangiocitos, y el endotelio fenestrado, respectivamente. Las mutaciones en los genes específicos de mesénquima hix y j umonli bloquean el desarrollo del hígado, ilustrando la importancia de las contribuciones a partir de este tejido. Tempranamente en su desarrollo, el hígado consiste de clústers de hepatocitos primitivos unidos por un endotelio continuo que carece de una membrana de basamento y células hemopoyéticas abundantes. Cuando el endotelio se transforma para llegar a ser un endotelio fenestrado, discontinuo, el vasculado, especialmente el vasculado portal, llega a estar más desarrollado con la producción de membranas de basamento. El interstitio portal puede proporcionar el disparador para el desarrollo de los conductos biliares, y cuando lo circundan las vénulas porta, arterioles hepáticos, y conductos biliares, se forman las triadas porta. Los hepatocitos inmaduros rápidamente proliferan y se forman placas parenquimales, probablemente en respuesta a los cambios en la cantidad y distribución de tales moléculas que organizan tejidos como C-CAM 105, AgpllO, E-cadherin, y conexinas, coincidente con la colocación nueva de la mayoría de, pero no todas, las células hemopoyéticas a la médula ósea. Estudios recientes sugieren que algunos progenitores hemopoyéticos persisten en el hígado de roedor quiescente adulto, y se han aislado las células germinales hemopoyéticas de tanto el hígado de murina como el hígado adulto (Crosbie, O. M. et al. 1999. Hepatology, 29:1193-8). La organización física madura se logra dentro de las primeras semanas después del nacimiento en roedores, y en humanos, dentro de los primeros años. La zonación metabólica es establecida de acuerdo con algunos programas diferentes para enzimas diferentes, pero llega a ser evidente en el periodo seguido al nacimiento.

Células germinales y progenitores consignados Las células germinales se han definido como células primitivas que se autorreplican, las cuales son pluripotentes, es decir, producen células hijas con más de un destino, que se pueden expandir extensivamente y puede reconstituir un tejido o tejidos. La mayoría de la : literatura sobre células germinales deriva ya sea de la literatura en embriones o aquella en tejidos hemopoyéticos, epidérmicos, o intestinales. En forma más reciente, las definiciones han sido modificadas para reconocer clases particulares de células germinales. Aquellos con el potencial para participar en el desarrollo de todos los tipos de células incluyendo células germinales, son referidos como células germinales tot±potentes e incluyen el cigoto y células embriónicas normales hasta 8 etapas de células (la mórula) . Las células germinales embriónicas, también llamadas células "ES", consisten de poblaciones de células permanentes derivadas de células normales, totipotentes, en blastocistos, las cuales se reportaron primero a principios de 1980. Las líneas de células ES se pueden cultivar in vi tro con el mantenimiento de titopotencia. Las células ES son tumorigénicas si se introducen en hospederos inmunocomprometidos en cualquier sitio menos in útero, que forma teratocarcinomas. Sin embargo, cuando los mismos se inyectan de nuevo en blastocistos normales, los mismos son capaces de resumir el desarrollo embriónico y participa en la formación de un ratón, normal, pero quimérico. Aunque las líneas celulares ES se han establecido a partir de muchas especies (ratón, -,í**,ígiíf rata, cerdo, etc.), sólo el sistema del ratón se ha usado rutinariamente para generar animales con nuevos fenotipos (no transgénicos, transgénicos) interclasificando las células ES modificadas a partir del cultivo a blastocistos y luego se implantan los blastocistos en hospederos pseudopregnantes . Las líneas celulares de germen embriónico (por sus siglas en inglés, EG) , las cuales muestran muchas de las características de células ES, se puede aislar directamente in vi tro de la población de células germinales primordiales. Como con las células ES, las células EG forman teratocarcinomas cuando se inyectan en ratones inmunocomprometido o inmunoarreglados y contribuyen a quimeras, incluyendo la línea germinal, cuando se inyectan en blastocistos. 15 Las células germinales determinadas son células pluripotentes que han restringido su potencial genético a aquel para un número limitado de tipos de células y tienen crecimiento potencial extensivo. El incremento de la evidencia tal como aquella del campo de telomerasa sugiere que las células germinales determinadas no se autorreplican, es decir su progenie puede tener menos crecimiento potencial que el padre o matriz. Las células germinales determinadas conducen a células hijas que pierden pluripotencia oto :y restringiendo su potencial genético a un destino o desarrollo único, por ejemplo, hepatocitos, y son referidos como progenitores comprometidos . En el linaje hepático existen progenitores hepatocíticos comprometidos y progenitores biliares comprometidos. En la actualidad los experimentos altamente publicados han reportado que los cultivos de células ES humanas se pueden establecer a partir de embriones de humanos. Se ha sugerido que estas células ES humanas pueden ser inyectadas en tejidos en la bahía de modo que las mismas son capaces de reconstituir los órganos y tejidos dañados. Dando los hallazgos que las células ES y EG forman tumores cuando se inyectan en sitios menos in útero (visto anteriormente) , el método para inocular células ES humanas en pacientes es poco práctico y con la grave posibilidad de crear tumores en los pacientes. Para superar esta dificultad insuperable, algunos grupos están persiguiendo el método de diferenciar las células ES bajo las condiciones de microambiente-mentales definidas que llegan a ser células germinales determinadas que después se pueden inocular en forma segura en pacientes. Por ejemplo, existen algunas medidas de éxito en la generación de progenitores hemopoyéticos. Sin embargo, la preocupación reside en que #j- ?á*Áek.k A -J?. las células ES residuales en el cultivo podrían poseer el riesgo de tumorigénesis, si los cultivos son inoculados en un paciente. En breve, hasta que la búsqueda en biología del desarrollo revela que la miríada controla el dictamen de los destinos de células durante la embriogénesis, las células ES permanecerán como una herramienta experimental con bahías pequeñas para programas clínicos en terapias con células o genes. La única opinión realista para programas clínicos en terapias con células y genes es para usar células germinales determinadas en las cuales se restringe el potencial genético a un número limitado de tipos de células. En contraste, las células ES pueden mantener grandes compromisos para órganos bioartificiales para aquellos tipos de tejidos (por ejemplo, células hemopoyéticas) que se producen por células ES bajo condiciones conocidas.

Controversia alrededor de las células germinales del higado La presencia de células germinales en hígado normal de adulto es el tema de mayor controversia en el campo de la biología celular del hígado. .Abajo se resumen los diversos modelos prevalecientes que compiten en el campo. El texto italicized indica la idea clave de los diferentes modelos.

Se cree por algunos expertos en el campo que las células germinales hepáticas existen sólo en tejido embriónico, que no existen células germinales en hígados de adulto, y que todas las células del hígado maduro participan igualmente en los procesos regenerativos del hígado (Farber, E. 1992. In The Role of Cell Types in Hepatocarcinogenesis, S.A.E, editor. Academic Press, New York.). El modelo de Farber considera que todas las células parenquimales maduras son fenotípicamente co-iguales y que la heterogeneidad conocida del crecimiento potencial y la expresión del gen en hígado es debido únicamente a microambientes. Farber propone que bajo condiciones oncogénicas, las células parenquimales adultas son retrodiferenciadas y llegan a ser células tumorígenas. Este modelo domina el campo de carcinogénesis del hígado por décadas y todavía tiene impacto en estudios de regeneración del hígado. Otros expertos creen que todas las células del higado son células germinales (Kennedy, S. et al. 1995. Hepatology, 22:160-8; Michalopoulos, G. K. et al. 1997, Science. 276:60-6.). Estos investigadores creen que todas las células parenquimales son co-iguales, son altamente plásticas y con expresión del gen dictada únicamente por el microambiente. Bajo condiciones oncogénicas apropiadas, las células parenquimales maduras son hipotetizadas para llegar a ser células germinales que subsecuentemente se pueden convertir a células tumorígenas. 5 El modelo de células germinales silentes se basa en los estudios de ilson and Leduc (Wilson, J. W. et al. 1958, J. Pathol . Bacteriol . 76:441-449.). Cuando en el campo hemopoyético, este concepto gana la mayor credibilidad a partir de estudios extensivos de la carcinogénesis del hígado (Marceau, N, 1994. Gut. 35:294-6.). Estos investigadores creen que las células progenitoras, incluyendo células progenitoras bipotenciales, pueden persistir en el tejido adulto pero proponen que las mismas son remanentes o restos poco comunes de poblaciones de células a partir del desarrollo embriónico. Los mismos asumen que los progenitores no juegan una función en el funcionamiento normal o regenerativo del hígado pero sólo en estados de enfermedad (Overturf K, et al. 1999. American Journal of Pathology. 155:2135-2143.). Es decir, se supone que las mismas son "silentes", similares a las células satélite en el músculo. Estas células se han descrito como "células oval" debido a la forma distinta de los núcleos de células. Las mismas son pequeñas (~9 um) y expresan un perfil antigénico característico en la superficie de las células. Todas las células del hígado maduro se asume que son co-iguales con respecto al crecimiento y expresión del gen y que todos los aspectos de heterogeneidad de la expresión del gen se establecen sólo por el microambiente celular. Los defensores del modelo de células germinales silentes rechazan fuertemente cualquier idea de movimiento de las células parenquimales a partir de locaciones periportales a pericentrales. La importancia de las células germinales y otros progenitores hepáticos se piensa que es relevante para estados de enfermedad únicamente, especialmente carcinogénesis. Así, estos investigadores han enfocado sus esfuerzos sobre progenitores candidatos en animales tratados con varios insultos oncogénicos. Estos estudios muestran que las "células oval" no forman un cuerpo reconocible de células de rápida proliferación bajo condiciones regenerativas o bajo condiciones de daños ligeros a moderados. Los números significantes de proliferación de poblaciones de células oval se observan únicamente después de daños al hígado muy severos, (Grisham, J. W. et al. 1977. Jn Stem Cells . C. S. Potter, editor. Academic Press, Londres. 233-282) .

Un modelo basado en el fluido en abundancia de células germinales (Arber, N. et al. 1988, Liver. 8:80-7; Zajicek, G. et al. 1991. Liver. 11:347-51.) ha sido severamente criticado y ampliamente ignorado (Jirtle, R. L. 1995. Liver Regeneration and Carcinogenesis: Molecular and Cellular Mechanisms. Academic Press, New York.). Esta propuesta postula que un compartimento de células germinales en cada una de las triadas porta produce células parenquimales adultas que "fluyen en abundancia" hacia la vena central. El proceso de fluir en abundancia llega a las células hijas en contacto con microambientes distintos que resultan en cambios en el fenotipo de las células. De nuevo, se hace hipótesis de que los microambientes sean el determinante crítico del fenotipo. Una mayoría de investigadores han discutido contra este modelo que sugiere que el mismo es inconsistente con estudios que no muestran movimiento de células donadoras marcadas reintroducidas en el hígado (Kennedy, S. et al. 1995. Hepatology. 22:160-8). Sin embargo, aún en estudios que ha provisto la evidencia más definitiva contrarrestan el modelo de fluido abundante, es desconocido si el microambiente o la posición del linaje influye en la expresión de marcadores usados en células donadoras. Además, la hipótesis del hígado de fluido abundante es probable que se vuelva a visitar después de los recientes hallazgos por Thiese y sus asociados (Theise, N, 1999. Hepatology. 30:1425-1433.) que los Canales de Herring, se sospecha ampliamente que se relacionan con progenitores hepáticos, dúctulos extendidos en toda la placa del hígado al menos en la zona 1. Reid y asociados han defendido que el hígado es un sistema de células germinales y linaje de maduración (Sigal, S. H. et al. 1992. Am J Physiol . 263:G139-48) . Los mismos proponen que los tejidos sean organizados como alimentación de linajes de maduración, semejante a un origen, por poblaciones de células germinales o de células progenitoras más tempranas (Brill, S. et al. 1993. Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine. 204:261-9.). El tejido se define como que va desde "células jóvenes, a edad intermedia, a vieja". El proceso de maduración se realiza por cambios dependientes de la posición del linaje en el tamaño de célula, morfología, perfiles antigénicos, potencial de crecimiento y expresión del gen. Se hace hipótesis de que estos cambios se deben a una combinación de cambios celulares autónomos, independientemente del microambiente, y de cambios microambientalmente inducidos; el microambiente comprende los nutrientes, intercambio de • H- gas (oxígeno, C02) , pH, hormonas, interacciones célula- célula y química de la matriz extracelular.

Tabla 1, Se hace hipótesis de que el crecimiento es máximo en las células germinales y progenitores tempranos y disminuye con la evolución a través del linaje. Este modelo toma en cuenta que la mayoría de las células en el tejido del hígado adulto son poliploides, la mayoría tetraploides u bctaploides, menos de un tercio de las células son diploides. Datos recientes soportan el concepto que el 5 volumen del potencial regenerativo en un tejido deriva de la población de células diploides y que las células más viejas contribuyen a la generación incrementando masa celular vía las respuestas hipertróficas asociadas con poliploidía (grado de repetición del número básico de cromosomas) . 10 (Sigal, S. H. et al. 1999. American Journal of Physiology. 276:G1260-72) . Por lo tanto, estos investigadores abogan que las bahías mejores para el crecimiento de células, ya sea en terapias con células o genes o en órganos bioartificiales, es con la población de células diploides del tejido. 15 El modelo de linaje de maduración y célula germinal contradice otros modelos de desarrollo de células del hígado sugiriendo que la malignidad del hígado es un resultado más frecuente, un resultado indirecto, más bien un resultado directo de un ataque oncogénico. Los ataques oncogénicos son propuestos para exterminar más células del hígado, especialmente las células maduras en el linaje, resultando en una inducción dramática de una respuesta regenerativa. La expansión resultante de los progenitores incrementa el riesgo de eventos de mutación secundarios en las células de crecimiento rápido, los progenitores, que pueden resultan en malignidad. Así, las hipótesis más antiguas de que el cáncer<.;- , es la diferenciación bloqueada o que los cánceres son debifo a ataques oncogénicos que forman blanco en células germinales, son aceptadas como correctas pero sin la modificación presentada anteriormente. El incremento de la aceptación de un modelo de linaje de maduración ahora se basa en los datos de que el hígado se llena con características indicativas de un proceso de diferenciación apoptótica o terminal (Sigal, S. H. 1995, Differentiation . 59:35-42.) y los hallazgos de que únicamente ciertas subcolonias de organismos de células del hígado presentes en hígados de adulto son capaces de la división celular extensiva (Oventurf K, et al. 1999. American Journal of Pathology. 155:2135-2143; Tateno, C et al. 2000. Hepatology A. 31:65-74.). En este modelo los progenitores y una subcolonia de organismos de células adultas (se cree que es la subcolonia de organismos diploide) son capaces de reconstituir el tejido del hígado cuando se vuelve a inyectan in vivo, y son capaces de que el crecimiento extensivo incluya el crecimiento clonal.

La Patente Norteamericana No. 5,559,022 de Naughton describe el aislamiento de células a partir del hígado y la purificación adicional por el uso de centrifugación de gradientes. Sin embargo, la población de células aislada es la "población de células parenquimales acidofílicas" las cuales no son los progenitores del hígado de esta invención como se reivindica.

Aplicabilidad Clínica y Pre-clinica de Progenitores del Higado Existe un fuerte interés clínico y comercial en el aislamiento e identificación de células progenitoras inmaduras a partir del hígado, a causa del impacto que tal población de células puede tener en el tratamiento de enfermedades del hígado. Cada año en los Estados Unidos, existen aproximadamente 250,000 personas hospitalizadas por la falla del hígado. Los transplantes de hígado son curativos por algunas formas de falla del hígado, y se realizan aproximadamente 4100 transplantes en un año en Estados Unidos. Uno de los factores limitantes en el transplante de hígado es la disponibilidad de hígados donadores especialmente dada la restricción de que los hígados donadores para el transplante de órganos debe originarse desde los pacientes que han sufrido muerte cerebral pero no paro cardíaco. Los hígados de donadores cadavéricos no han sido exitosos, aunque recientes esfuerzos para usar tales donadores han soportado la posibilidad de usarlos si el hígado es obtenido dentro de una hora de muerto . El transplante de células en el hígado es una terapia alternativa atractiva para más enfermedades del hígado. Los procedimientos quirúrgicos para el transplante de células son menos relativos para aquellos con necesidad de transplante del órgano completo y, por lo tanto, se puede usar para pacientes con varios riesgos quirúrgicos tales como la edad o padecimiento. El uso de células del hígado humano es superior a células del hígado derivadas de otros mamíferos a cautfa de los patógenos potenciales, si existiera cualquiera, son de origen humano y podrían ser mejor tolerados por pacientes y podrían ser fácilmente seleccionados antes de su uso. Los intentos por realizar el transplante de células del hígado han hecho uso de células del hígado maduras no fraccionadas y han mostrado alguna medida de eficacia (Fox, I. J. et al. 1998. New England Journal of Medicine. 338:1422-1426.). Sin embargo, los éxitos requieren la inyección de gran número de células (10-20 billones), puesto que las células no crecen in vivo. Además, la introducción de números substanciales de células del hígado maduras grandes (diámetro celular promedio 30-50 µ) es complicado por su tendencia para formar grandes agregados en la inyección, resultando en embolia potencialmente fatal. Además, estas células producen una respuesta de rechazo inmunológico que obliga a los pacientes a ser mantenidos con fármacos inmunodepresivos para el resto de su vida. Finalmente, las células del hígado maduras no se han crioconservadas exitosamente y se requieren logísticas complicadas para coordinar la disponibilidad del tejido del hígado adecuado, la preparación de suspensiones de células y el suministro inmediato de las células para terapias clínicas.

Avances En el Aislamiento de Progenitores del Higado Se conoce que el aislamiento de progenitores del hígado a partir del hígado es una tarea extremadamente desafiadora debido a la insuficiencia de marcadores que se seleccionan positivamente para las células del hígado. Los anticuerpos únicamente disponibles para candidatos de progenitores hepáticos son aquellos anticuerpos monoclonales que son preparados para las subcolonias de organismos de progenitores hepáticos (células oval) inducidas para proliferar después de la exposición a ataques oncogénicos. Sin embargo, estos anticuerpos tienen reacción cruzada con antígenos presentes en células hemopoyéticas. Se han hecho intentos en el pasado para obtener la población de células progenitoras hepáticas, sugerida por sea la población más versátil para terapia celular o genética del hígado. Las Patentes Norteamericanas Nos. 5,576,207; 5,789,246 de Reid et al., utilizan marcadores de la superficie celular y citometría del flujo de dispersión lateral para proporcionar una subcolonia de organismos definida en el hígado. Las subcolonias de organismos de las células hepáticas de la rata se han aislado por remoción de células sometidas-linaje seguido por la selección para precursores hepáticos inmaduros los cuales se detectan porque son células agranulares que soportan marcadores de células OC.3-positivas (marcador antigénico de célula oval), AFP-positivas, albúmina-positivas, y CK 19-negativas (citoqueratina 19) . Las subcolonias de organismos del hígado de rata anterior demuestran características particulares importantes en el aislamiento e identificación de progenitores hepáticos enriquecidos a partir del hígado de roedor.

El aislamiento de los progenitores del hígado a partir del hígado humano adulto, como se describe aquí, es nuevo e inesperadamente parcial debido a la controversia en lo que respecta a la mera presencia de progenitores del hígado en el adulto en el cual los progenitores hepáticos humanos se han adoptado ya sea que no están presentes o es un residuo fisiológicamente silente de embriogénesis. Por lo tanto, no se ha intentado aislarlos o estudiarlos excepto en estados de enfermedad. En forma de contraste, dentro del desarrollo del hígado la presencia de las proteínas citoplásmicas alfa- fetoproteína (AFP) y albúmina se reconoce como un fuerte indicador positivo de células progenitoras. En la etapa más temprana del desarrollo del hígado, estas células son capaces de producir crías que entran tanto a linajes biliares como de hepatocitos. Si estas células hijas se someten al linaje biliar cesa la expresión alfa- fetoproteína. Sin embargo, la expresión alfa-fetoproteína persiste en el linaje de hepatocitos hasta el periodo perinatal cuando es suprimido, que deja la expresión de albúmina como una de las características principales del hepatocito adulto. 24 .*gáp * *» Sin embargo, puesto que la alfa-fetoproteína es una proteína intracelular y únicamente se puede visualizar después de la fijación y permeabilización de la célula, es inadecuada como un marcador para la identificación de 5 células progenitoras hepáticas viables.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método para proporcionar una composición que comprende una mezcla de 10 células derivadas del tejido de hígado humano, en la cual, la mezcla comprende una población enriquecida de progenitores hepáticos humanos, el método comprende: proporcionar una suspensión celular súbstancialmente única de tejido de hígado humano que comprende una mezcla de 15 células de tamaños variados, que incluye células inmaduras y células maduras; y la citoreducción de la suspensión bajo condiciones que permiten la remoción de las células maduras y aquellas de tamaño relativamente grande, mientras se retienen las células inmaduras y aquellas de tamaño 20 relativamente pequeñas, para proporcionar una mezcla de células comprendidas de una población enriquecida de progenitores hepáticos humanos, en los cuales los mismos progenitores hepáticos humanos, su progenie, o formas más maduras del mismo exhiben uno o más marcadores indicativos de la expresión de alfa-fetoproteína, albúmina, o ambas. Las alfa-fetoproteínas y las albúminas pueden ser de longitud completa o una variante. El proceso de citoreducción puede comprender una separación por tamaño de célula, densidad ligera, o ambas. La citoreducción puede también estar basada en la velocidad de sedimentación, radio hidrodinámico, y sedimentación a la densidad de equilibrio. Alternativamente, la separación puede ser por adherencia relativa de marcadores de la superficie por componentes enlazadores, por ejemplo anticuerpos o lectinas. Los progenitores aislados pueden ser diploides y pueden ser menores de aproximadamente 15 micrones de diámetro. Además, los progenitores o su progenie pueden sintetizar macromoléculas características de progenitores, que incluyen, pero no se limita a alfa-fetoproteína y albúmina. Preferiblemente, la alfa-fetoproteína incluye la secuencia peptídica que codifica al exón l(aFP). Así la alfa-fetoproteína se transcribe de una ARNm mayor de 2kb en tamaño, una .ARNm aFP de longitud completa. Del mismo modo, la albúmina preferiblemente incluye a la secuencia peptídica que codifica al exón 1 (ALB) . Así la albúmina se transcribe de un .ARNm de longitud completa.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de aislamiento, crioconservación, y uso de progenitores de hígado de humano, el cual incluye tejido de hígado humano procesado para proporcionar una suspensión celular substancialmente única que incluye progenitores y no progenitores de uno o más linajes celulares encontrados en el hígado humano; sometiendo la suspensión a un paso de citoreducción, el cual reduce substancialmente el número de no progenitores en la suspensión, para proporcionar una suspensión sometida a citoreducción, enriquecida en progenitores que exhiben uno o más marcadores asociados con al menos uno de los linajes celulares; seleccionados opcionalmente de la suspensión sometida a citoreducción de esas células, las cuales ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas, expresan al menos un marcador asociado con al menos un linaje de células de hígado; opcionalmente, se suspenden las células bajo condiciones óptimas para la criopreservación; y opcionalmente el uso para la producción de factores de crecimiento y para terapia en pacientes. Se seleccionan preferiblemente los progenitores del hígado que expresan proteínas citoplásmicas tales como alfa-fetoproteína. Los procesamientos o pasos de citoreducción de esta invención incluyen preferiblemente una centrifugación de gradiente de densidad o elutriación centrífuga de la suspensión celulars del hígado para separar las células de conformidad con su densidad ligera y/o tamaño, las cuales están asociadas con una o más fracciones de gradientes que tienen una densidad ligera inferior y/o tamaño más pequeño. El método de gradiente de densidad puede incluir centrifugación zonal y centrifugación de flujo continuo. Una modalidad de la invención es la selección negativa de los no progenitores, incluyendo células hepáticas maduras, hemopoyéticas y mesenquimales, mediante el uso de marcadores asociados con células hepáticas maduras, tales como conexina, marcadores asociados con células hemopoyéticas, tales como glicoforina A y CD45, y/o marcadores asociados con las células mesenquimales maduras, tales como retinoides, y el Factor Willebrand von. Los inventores han encontrado que el uso de progenitores hepáticos puede superar muchos de las desventajas asociadas con el uso de células maduras de hígado, haciéndolas células ideales para usarse en las terapias del gen y células y para órganos bioartificiales . Las células son pequeñas (7-15 µ) , por lo tanto, minimizan la formación de embolias grandes. También las células tienen crecimiento extensivo potencial, significando que unas cuantas células sean necesarias para la reconstitución del tejido del hígado en un paciente. Finalmente, los progenitores tienen marcadores antigénicos mínimos que 5 podrían provocar rechazo inmunológico proporcionado la confianza de que poco o ningún fármaco inmunosupresivo podría ser necesario. La terapia con células de hígado involucra ya sea el tratamiento extracorporal o transplante de las células del hígado. Las células, preferiblemente incluyen células progenitoras, son suministradas en varias formas, incluyendo parenteralmente e intraperitonealmente. Una cantidad efectiva de células es necesaria, preferiblemente entre 103 y 1010 células. Más preferiblemente entre 105 y 108 células son transplantadas, óptimamente aproximadamente 106 células. En otra modalidad de la invención, los progenitores de hígados son extremadamente empleados para la producción de factores de crecimiento y otras proteínas. Estos factores están asociados con su propio crecimiento o aquel de otros progenitores en el hígado (por ejemplo, progenitores hemapoyeticos o mesenquimales) , y factores asociados con etapas tempranas en la dedicación de las células progenitoras hepáticas a un linaje particular. Estos nuevos 29 i a *ff* factores de crecimiento se pueden usar para tratar padecimientos del hígado, o para controlar aquellos cánceres que son los transformantes de los progenitores del hígado. Además, los progenitores del hígado son objetivos importantes para la terapia del gen, en donde los progenitores hepáticos insertados genéticamente transformados o normales, promueven la salud de individuos en a quienes son transplantados tales progenitores. Otro aspecto de esta invención es la determinación de perfiles antigénicos únicos en la superficie celular que se correlacionan con la expresión de la alfa-fetoproteína dentro de la célula. La caracterización de células que contienen alfa-fetoproteínas de esta forma, permite el subsecuente enriquecimiento de células progenitoras hepáticas viables mediante la metodología citométrica de flujo a partir de las suspensiones celulares únicas vivas preparadas a partir de lóbulos de hígado o hígados completos. Sin embargo, el aislamiento e identificación de progenitores hepáticos humanos como se describe aquí, se obtiene a través de la aplicación de una combinación de métodos únicos, marcadores y parámetros los cuales los presentes inventores usaron por primera vez para alcanzar la población celular única de esta invención.

Un aspecto adicional de esta invención proporciona progenitores de células de hígado de origen hepático, hematopoyético o mesenquimático. Estos linajes celulares, sus progenies o sus formas más maduras se seleccionan por 5 marcadores antigénicos seleccionados del grupo que consiste de CD14, CD34, CD38, CD45, CD117, ICAM, glicoforina A, y/o marcadores citoplásmicos tales como inmunoreactividad similar a la alfa-fetoproteína, inmunoreactividad similar a la albúmina o ambas. La alfa-fetoproteína se puede derivar de un .ARNm de longitud completa (superior de 2 kb, la forma usualmente expresada en progenitores hepáticos) o de una forma variante (menos de 2 kb, es decir, aproximadamente 0.5, 0.8, 1, 1.5 o 2 kb, la forma usualmente expresada en progenitores hemotopoyéticos) . Los progenitores de hígado de esta invención, se pueden aislar del hígado de un feto, un neonato, un infante, un niño, un joven o un adulto. De conformidad con aún un aspecto adicional de esta invención, los progenitores de hígado humano aislado, se aislan a una forma substancialmente pura altamente enriquecida. Tales progenitores del hígado contienen progenitores hepáticos, hemopoyéticos y mesenquimales. Los progenitores hepáticos tienen la capacidad para desarrollarse en hepatocitos, células biliares, o una combinación de las mismas; los progenitores hematopoyéticos tienen la capacidad para desarrollarse en acrógafos, neutrófilos, granulocitos, linfocitos, plaquetas, neutrófilos, eosinófilos, basófilos o una combinación de los mismos . Los progenitores mesenquimales tienen la capacidad para desarrollarse en células endoteliales, células del estroma, células estrelladas hepáticas (células Ito) , células de cartílago, células de hueso o combinaciones de las mismas. El método de esta invención puede ser usado para seleccionar progenitores mesenquimales que expresan inmunoreactividad similar a la alfa-fetoproteína, CD45, reactividad similar a la albúmina, CD34, osteopontina, sialoproteína ósea, colágeno (tipos I, II, III o IV), o una combinación de los mismos. Un aspecto todavía adicional de esta invención se proporciona para los progenitores del hígado que albergan ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos exógenos pueden codificar al menos un polipéptido de interés, o pueden promover la expresión de al menos un polipéptido de interés. De conformidad con aún un aspecto adicional de esta invención, se proporciona un método para aliviar los efectos negativos de una o más alteraciones o disfunciones humanas mediante la administración a un individuo que sufre de tales efectos negativos, de una cantidad efectiva de progenitores de hígado humano aislado. Los progenitores se pueden administrar ya sea intraperitonealmente, o parenteralmente vía un receptáculo vascular, o administrar directamente en el hígado. La administración directa se puede efectuar quirúrgicamente vía la vena portal, vena mesentérica, arteria hepática, conducto biliar hepático, o combinaciones de los mismos. Alternativamente, los progenitores del hígado se pueden administrar en un sitio ectópico del individuo, tal como el bazo o el peritoneo. Las alteraciones o disfunciones humanas que pueden ser aliviadas por el método de esta invención incluyen: hepatocolangitis, hepatomalacia, hepatomegalia, cirrosis, fibrosis, hepatitis, insuficiencia aguda del hígado, insuficiencia crónica del hígado, o errores congénitos del metabolismo, y cáncer de hígado tales como hepatocarcinoma o hepatoblastoma. El cáncer del hígado puede ser un sitio primario de cáncer o uno que ha formado metástasis en el hígado. El tumor metastático puede derivarse de un número de sitios primarios incluyendo, intestino, próstata, mama, riñon, páncreas, piel, cerebro, pulmón, o una combinación de los mismos.

De conformidad con aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un bioreactor el cual incluye material biológico que comprende progenitores aislados del hígado humano, su progenie, su maduración o descendientes diferenciados, o combinaciones de los mismos, y un medio de cultivo, tal como un medio basal; uno o más compartimentos que mantienen el material biológico o los componentes que comprenden el material biológico; y opcionalmente uno o más puertos que los conectan. Además, el bioreactor puede, opcionalmente, incluir también: matriz extracelular, hormonas de factores de crecimientos, nutrientes, o combinaciones de los mismos; y un fluido biológico tal como el suero, plasma o linfo. El bioreactor se adapta para sostener dichos progenitores en un estado funcional, viable, y puede sostener progenitores del hígado por un periodo que varía desde aproximadamente una semana hasta aproximadamente 55 semanas. Específicamente, el bioreactor se adapta para usarse como un hígado artificial, para la manufacturación del producto, estudios toxicológicos, o estudios metabólicos, incluyen estudios que involucran la actividad del citocroma P450 u otros tipos de metabolismo del fármaco.

De conformidad con aún otro aspecto de esta invención, se proporciona una composición de progenitores asilados de hígado humano, o una suspensión enriquecida en progenitores obtenida del hígado humano. La suspensión celular se proporciona en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y se administra a un sujeto en necesidad del tratamiento. La composición de esta invención incluye los progenitores del hígado que presentan uno o más marcadores asociados con al menos uno de uno o más linajes celulares encontrados en el hígado humano y están substancialmente libre de células maduras. Más particularmente, los progenitores aislados del hígado se derivan de uno o más linajes de células de hígado incluyendo linajes hepáticos, hemopoyéticos o mesenquimales y ellos mismos, su progenie o formas más maduras de los progenitores de los mismos que expresan al menos uno o más de los marcadores antigénicos CD14, CD34, CD38, CD90 o CD117, CD45, glicoforina A, y marcadores citoplásmicos de inmunoreactividad similar a la alfa-fetoproteína, inmunoreactividad similar a la albúmina, o ambas. En una modalidad adicional, las células maduras, su progenie o formas más maduras expresan osteopontina, sialoproteína ósea, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, o una combinación de los mismos. De conformidad con aún otra modalidad de esta invención, se proporciona un sistema de cultivo de células de progenitores de hígado, el cual incluye progenitores aislados del hígado humano, su progenie, sus descendientes de maduración o diferenciados, o combinación de los mismos. El sistema de cultivo celular adicionalmente incluye una matriz extracelular que comprende uno o más colágenos, una o más proteínas de adhesión (laminias, fibronectinas) , y otros componentes tales como proteoglicanos (tales como proteoglicanos sulfatoheparano) ; o un componente de matriz individual. El componente de matriz incluye fragmentos o componentes de matriz, imitadores de matriz que pueden ser materiales sintéticos o biodegradables (es decir, microesferas) revestidas con uno o más de los factores de una de las clases de matrices extracelulares. El sistema de cultivo celular adicionalmente puede incluir un medio basal o enriquecido y otros nutrientes; hormonas, factores de crecimiento, y, opcionalmente, un fluido biológico tal como suero, plasma o linfo. Adicionalmente, el sistema de cultivo celular puede tener uno o más compartimentos que mantienen el material biológico tal como una laminilla de cultivo, - ní^ iÉi?trrh ¡ ít fí? ? ,f i^tát ááM?^M á? im M ?? disco, matraz, botella cilindrica, pozos u otros contenedores . Los cultivos o bioreactores de esta invención se pueden usar en uno o más estudios metabólicos incluyendo estudios que involucran la actividad de los sistemas de la enzima de biotransformación fase I o II, uno o más estudios de transporte que incluyen estudios que involucran la expresión, regulación y actividad de los sistemas de transporte sinusoidal y canalicular, facetas del metabolismo del fármaco, y la actividad del citocroma P450 entre otros. En aún una modalidad adicional de la invención, se proporciona un método para la criopreservación de células adherentes. El método de la criopreservación de células adherentes comprende (a) proporcionar células adherentes y una matriz o un mejorador de la viscosidad; (b) suspender las células en una mezcla de criopreservación que comprende el medio de cultivo, un inhibidor de cristales de hielo, un factor regulador de carbohidratos, un donador de hierro, una lipoproteína, y un lípido; y (c) enfriamiento de la suspensión por debajo del punto de congelamiento de las células. El punto de congelamiento aquí significa la temperatura a la cual las células llegan a ser una masa sólida, mientras que sea un líquido o vidrio superenfriado, una masa microcristalina o macrocristalina. Sin embargo, se describe una mezcla para criopreservación que comprende un medio de cultivo, un inhibidor de cristales de hielo, un factor de regulación de carbohidratos, un donador de hierro, una lipoproteína y un lípido. La mezcla de criopreservación puede también incluir un antioxidante, tal como ácido ascórbico, glicerol (v/v al 10%) o dimetiisulfóxido (DMSO, v/v al 10%), los últimos dos agentes los cuales pueden actuar como inhibidores de la formación de cristales de hielo. El factor de regulación de carbohidratos puede ser insulina o el factor de crecimiento similar a la insulina. El donador de hierro, lipoproteína y lípido, pueden ser transferina, lipoproteína de alta densidad y ácidos grasos libres, respectivamente. Los ácidos grasos libres son opcionalmente formadores de complejos con albúmina. La mezcla de criopreservación puede incluir colágeno, una substancia similar al colágeno, agarosa, metilcelulosa, o gelatina, en donde el colágeno puede ser colágeno I, colágeno III, o colágeno IV. Los componentes de la mezcla de criopreservación pueden prepararse en soluciones de criopreservación de Viaspan o de la Universidad de Wisconsin.

Una modalidad adicional de la invención es una colección, banco de células, catálogo o recipiente biológico que tiene una pluralidad de progenitores hepáticos criopreservados y/o su progenie. Los progenitores pueden ser aislados por el método descrito anteriormente y pueden también ser progenitores aislados hepáticos por cualquier método aceptable que proporciones progenitores hepáticos que expresen la alfa-fetoproteína de longitud completa, albúmina o ambas. De manera similar, los progenitores pueden expresar marcadores indicativos de la expresión de la alfa- fetoproteína de longitud completa, albúmina o ambas. El recipiente puede incluir un sistema de indexación de marcadores celulares. Después de la cebación, las células del recipiente se pueden usar para inocular bioreactores, para iniciar los cultivos celulares o para terapia de pacientes . Una modalidad aún adicional de la invención, comprende una alfa-fetoproteína variante, la cual es el producto de un gen del exón 1 perdido en el ARNm, definido abajo. Como se describe en esta invención, la alfa- fetoproteína variante a menudo está asociada con progenitores hematopoyéticos y su progenie y no está asociado con progenitores hepáticos. Una modalidad todavía adicional de la invención, comprende péptidos de tres a diez aminoácidos tomados de la secuencia que codifica al exon 1 de la alfa-fetoproteína. Otra modalidad de la invención comprende un conjugado de macromoléculas y un péptido que comprende entre tres y diez aminoácidos de la secuencia que codifica al exon 1 de la alfa-fetoproteína y que es adecuado para usarse como un antígeno. Las macromoléculas pueden ser albúmina, hemocianina, caseína, ovalbúmina, polilisina, por ejemplo, poli-L-lisina o poli-D-lisina y cualquier otra macromolécula adecuada conocida en la técnica. El antígeno puede ser usado para generar anticuerpos específicos para la alfa- fetoproteína, cuya expresión es indicativa de progenitores hepáticos y no indicativa de progenitores hemopoyéticos o su progenie. Los anticuerpos pueden producirse por inmunización de un animal con el antígeno en la ausencia o presencia de un adyuvante, o mediante la exposición de las células de los bazos al antígeno, seguida de las células de los bazos para formar hibridomas, como se sabe en la técnica. En otra modalidad de la invención, se describe un método para aislar progenitores a partir del hígado humano, que comprende procesar el tejido de hígado humano para proporcionar una suspensión celular substancialmente única que comprende progenitores y no progenitores de uno o más linajes celulares encontrados en el hígado humano al someter la suspensión a un paso de citoreducción, el cual reduce substancialmente el número de no progenitores en la suspensión, para proporcionar una suspensión sometida a citoreducción enriquecida en los progenitores que presentan uno o más marcadores asociados con al menos uno o más de los linajes celulares, y seleccionando de la suspensión sometida a citoreducción de aquellas células, las cuales ellas mismas, su progenie o formas más maduras de las mismas expresan uno o más marcadores asociados con al menos uno o más de los linajes celulares.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. .Análisis de PCR de ARNm de alfa- fetoproteína. Figura 2. .Análisis de PCR de ARNm de albúmina. Figura 3. Efecto de la Criopreservación en la Biodisponibilidad de Células de Hígado Fetal. Figura 4. Panel izquierdo, histograma de inmunofluorescencia de alfa-fetoproteína por FACS, Panel derecho, Histograma de Inmunofluorescencia de Albúmina por FACS. Figura 5. Porcentaje de células que Expresan Marcadores de Superficie CD14, CD34, CD38, CD45 y Glicoforina A (GA) , en Suspensiones Celulares del Hígado No Fraccionado. Figura 6. Coexpresión de Marcadores de la Superficie Celular y alfa-fetoproteína mediante Células de Hígado Fetal. Figura 7. Superior izquierda, Porcentaje de Células Positivas para alfa-fetoproteína. Superior derecha, Porcentaje de Células Positivas para Albúmina. Inferior, Efecto de la Fraccionación Percoll en la Coexpresión de alfa-fetoproteína y albúmina. Figura 8. .Análisis FACS de una Suspensión celulars de Hígado Fetal para la Co-expresión de CD14, CD38 y alfa- fetoproteínas . Figura 9. Rendimiento de células positivas de alfa- fetoproteína usando selección con CD14 y/o CD38. Figura 10. Cuatro vistas de Influorescencia Representativa de Células Progenitoras Hepáticas Fetales Teñidas por alfa-fetoproteína.

Figura 11. Efecto de la Selección para CD14 (direcha) : Contraste de Interferencia Diferencial (superior) y Vistas de Inmunofluorescencia (inferior) . Figura 12A. Un agrupamiento de Células de Hígado 5 mediante Microscopio de Contraste de Fase. Figura 12B. El mismo agrupamiento de Células de Hígado mediante Inmunofluorescencia con anticuerpos a alfa- fetoproteína. Figura 12C. Un capa de A y B. 10 Figura 13A. Células de Hígado Teñidas con Calceína. Figura 13B. Células de Hígado Teñidas con alfa- fetoproteína, misma vista como el panel A.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I. Definiciones En la descripción siguiente, un número de términos se usan para describir extensivamente la invención. Para 20 proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y reivindicaciones, incluyendo el campo para dar tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones. íé k.i* Mt i tm fljhfl -fr [ n ti^ ta— ^a-nÉÉüMa Inmunoreactividad similar a la Alfa-fetoproteína: Cualquier reacción inmune causada por la alfa-fetoproteína. La Alfa-fetoproteína puede ser de longitud completa o truncada, incluyendo isómeros y variantes de empalme de alfa-fetoproteína. Progenitores Comprometidos: Las células inmaduras que tienen un desarrollo único tales como progenitores comprometidos hepatocítico (dando origen a hepatocitos) o progenitores comprometidos biliares (dando origen a conductos biliares) . El proceso comprometido no se entiende en un nivel molecular. Preferentemente, se reconoce haber ocurrido solamente empíricamente cuando el desarrollo de las células se ha estrechado de aquel tal predecesor. Células hepáticas: Una subpoblación de células de hígado las cuales incluyen hepatocitos y células biliares. Células de Hígados: Como se usa aquí, el término "células de hígado" se refiere a todo tipo de células presentes en el hígado normal, sin considerar su origen o desarrollo. Células del tallo: Como se usa aquí, "células de tallo" se refiere a células inmaduras que pueden dar origen a células hijas con más de un desarrollo, esto es, son pluripotentes. Las células del tallo totipotentes, tales como células del tallo embriónico (células ES), o células embriónicas hasta la etapa celular 8 de un embrión de mamífero, tienen capacidad de auto-renovación (auto- mantienen) en la cual las células del tallo producen células hijas idénticas a ellas mismas. Por el contrario, las células del tallo determinadas, tales como células del tallo hemopoyético, neuronal, de la piel o hepáticas, son pluripotentes y tienen capacidad de crecimiento extensivo pero tienen capacidad de auto-renovación cuestionable. En el caso de células del tallo totipotentes, algunas células hijas son idénticas a las originales, y algunas se "comprometen" a desarrollo específico (s) restringiendo su potencial genético a aquel el cual es menor que el original. En el caso de las células de tallo determinadas, algunas células hijas retienen la puripotencia y algunas la pierden, comprometiéndose a un desarrollo específico, único. Progenitores Hepáticos: Estas células dan origen a células hepatocitos y biliares. Los progenitores hepáticos incluyen tres subpoblaciones : "células del tallo hepáticas", "progenitores hepatocíticos comprometidos", y progenitores biliares comprometidos, los últimos dos son células inmaduras que son descendientes de las células del tallo hepáticas y que tienen un desarrollo único, sus hepatocitos o células biliares, pero no ambos. Células del tallo hepáticas: Una subpoblación de progenitores hepáticos. Progenitores del hígado: Una población celular del hígado, incluyendo progenitores hepáticos, progenitores hemopoyéticos y progenitores mesenquimales. Hemopoyesis: proporciona células sanguíneas con desarrollo o linfocitos celulares (B y T) , plaquetas, macrófagos, neutrófilos, y granulocitos. Meséngenesis: proporciona derivados mesenquimales con desarrollo celular del endotelio, células grasas, células del estroma, cartílago y aún hueso (los últimos dos se originan en el hígado solamente bajo condiciones de padecimientos) . Terapia celular: Como se usa aquí, el término "terapia celular" se refiere a las poblaciones celulares definidas o transferidas in vivo o ex vivo usado como un material autólogo o alogénico y transplantado a, o en los alrededores de, células objetivo específicas de un paciente. Las células pueden transplantarse en cualquier medio, portador, o diluyente adecuado o en cualquier tipo de sistemas de suministro del fármaco incluyendo, microportadores, perlillas, microsomas, microesferas, vesículas y así sucesivamente. Terapia del Gen: Como se usa aquí, el término "terapia del gen" se refiere al material genético definido o transferido in vivo o ex vivo para células objetivo específicas de un paciente, con ello, se altera el genotipo y, en muchas situaciones, se altera el fenotipo de aquellas células objetivo para el propósito final de prevenir o alterar un estado de padecimiento particular. Esto puede incluir la modificación de las células objetivo ex vivo e introducir las células en el paciente. Alternativamente, un vector puede ser objetivo para células progenitoras de hígado in vivo para suministrar el material genético exógeno y transfectar los progenitores. Además, las células progenitores diseñadas genéticamente pueden ser usadas en un bioreactor como una terapia para pacientes como una fuente de productos biológicos. Como esta definición declara, la premisa resumida es que estos procedimientos genéticos terapéuticos se diseñan para finalmente prevenir, tratar o alterar una condición patológica cubierta o abierta. En muchas situaciones, la última meta terapéutica de los procedimientos de la terapia del gen para alterar el fenotipo de la población celular objetivo específica.

CD: "Agrupamiento de diferenciación", o "determinante común" como se usan aquí, se refiere a las moléculas de la superficie celular reconocidas por anticuerpos monoclonales. La expresión de algunos CDs es específica para las células de un linaje particular o trayectoria maduracional y la expresión de otras varían de conformidad con el estado de activación, posición o diferenciación de las mismas células. Cuando los términos "uno", "un", o "una" se usan en esta descripción, significan "al menos uno", o "uno o más", a menos que se indiquen de otro modo.

II. Alfa-fetoproteína y albúmina como marcadores de diagnóstico para linajes hepáticos. Las alfa-fetoproteína (AFP) y albúmina, ambas proteínas citoplásmicas son especialmente marcadores confiables para los linajes hepáticos. La expresión de estas proteínas es la fundación para la identificación de las subpoblaciones hepáticas de otros tipos celulares en el hígado. Las líneas celulares de leucemia humana y los linfocitos T normales después de la estimulación in vi tro pueden también expresar AFP. Los datos sin embargo, no señalan su el ARNm de AFP en las líneas celulares de leucemina y los linfocitos T activados son una forma idéntica al ARNm de AFP auténtico en células hepáticas. Se ha determinado si la expresión de ARNm de AFP o albúmina puede o no ser mediada por ensayos de rutina de la proteína, tales como inmunofluorescencia, manchados western, etc. debido a que el RT-PCR es la técnica más sensible conocida para la identificación de patrones de ARN particulares. Antes de los estudios descritos aquí, no se ha investigado aún en detalle las formas del ARNm de AFP o albúmina en las células hemopoyéticas en humanos. Esta invención demuestra la expresión de las formas variantes de AFP y albúmina en células hematopoyéticas. La Figura 1 ilustra el análisis de las células del hígado y no del hígado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores para varios exones del ARNm de la alfa-fetoproteína. El análisis de PCR revela el AFP truncado en células hemopóyéticas. Se realizó la RT-PCR usando la primer combinación de hAFPl, hAFP2, hAFP3 y hAFP4. Marcadores de peso molecular = M, líneas 1-3= Hep3B, líneas 10-12= fibroblastos STO; líneas 13-15= sin ANR. Nota, existe una banda de porción, una isoforma AFP truncada, en las líneas 2, 4 y 8. Existe una isoforma AFP variante única a las células del hígado notadas en las líneas 1 y 4. Las especies AFP completas se observan en las líneas 3 y 6. Los inventores han diseñado nueve cebadores PCR para caracterizar formas variantes de .ARNm hAFP, como se ejemplifica en el Ejemplo 1. La secuencia codificante de AFP se extiende desde el exon 1 hasta el exon 14. Todas las primeras combinaciones preferentemente una del exon 1 del ARNm de AFP amplifican la porción del ARN, de AFP en una línea celular de eritroleucemia humana, K562, mientras todas las combinaciones detectan el ARNm de AFP en las líneas celulares -hepáticas humanas HepG2 y Hep3B. Esto demuestra que las formas variantes de ARNm de AFP contienen desde el exon 2 hasta el exon 4 como se expresa en K562, pero no cubren la secuencia codificante total de AFP. Los resultados sugieren que someten los cebadores empleados para la identificación de las células hepáticas son aquellas que detectan la porción del exón 1 de AFP, la expresión de la cual está probablemente restringida de una manera específica del tejido. El hecho de que el exon 1 sea único a las subpoblaciones progenitoras hepáticas, permite a uno usarlo como una sonda para la identificación de tipos de células de progenitores hepáticos contra hemopoyéticos.

Puesto que una forma truncada de AFF se encuentra en algunas subpoblaciones de células hemopoyéticas, la albúmina es también analizada tanto en células hepáticas como hemopoyéticos. Los cebadores para la albúmina se desarrollan en una forma análoga a aquellas para AFP (véase anteriormente) y se usan para valorar la expresión de la albúmina en las líneas celulares hepáticas contra hemopoyéticas. Como para AFP, una forma truncada se encuentra en K562, la línea de células hemopoyéticas, y un transcripto que se detectan por el cebador para el exon 12- 14. Esta invención describe el diseño y preparación de los cebadores específicos de RT-PCR para determinar el patrón de expresión de las formas variantes de AFP y ARN de albúmina en poblaciones de células hemopoyéticas contra hepáticas. La invención como se describe aquí, demuestra que las formas variantes tanto de AFP como ARN de albúmina se puede encontrar en progenitores hemopoyéticos. Significa que cuando los ensayos sensibles se usan, el criterio adicional tal como el uso de una sonda del exon 1 para AFP, podrán ser usados para definir las formas hepáticas de las poblaciones de células hemopoyéticas.

La Figura 2 ilustra el análisis de las células del hígado no del hígado por PCR a varios exones de albúmina. Puesto que una forma truncada de ARNm de AFP se encuentra en algunas poblaciones de células hemopoyéticas, la albúmina también se analiza tanto en células hepáticas como hemopotéticas . Los cebadores para la albúmina se desarrollan en una forma análoga a aquella para AFP (véase anteriormente) y se usan para valorar la expresión de la albúmina en las líneas células hemopoyeticas contra hepáticas. Como para AFP, una forma truncada se encuentra en K562, la línea celular hemopoyética y se detecta un transcripto por el cebador para el exon 12-14. Los estudios de desarrollo del hígado demuestran que el hígado fetal es tanto un órgano hematopoyético como hepatopoyética durante el desarrollo intrauterino. Durante varios estados del desarrollo del hígado, el hígado fetal contiene grandes números de células hematopoyéticas, especialmente del linaje eritroide. Además, existe un conocimiento del incremento de que los sistemas hepatopoyéticos y hematopoyéticos están estrechamente interrelacionados y existe la posibilidad de que esta relación incluye la expresión unida del AFP y albúmina, o quizás los isotipos de esta proteína. El hecho de que el exon 1 de AFP es único a las subpoblaciones de progenitores hepáticos permite a uno identificar las subpoblaciones específicas de las células progenitoras del hígado de esta invención. Aunque los análisis de PCR revelan que los progenitores hemopoyéticos pueden expresar especies de ARNm tanto de AFP como albúmina, los niveles de expresión de ARNm son muy pequeños. Efectivamente, cuando el AFP y la albúmina son medidos por análisis citométrico de flujo, el AFP no detectable o la albúmina podrían encontrarse en K652. Aunque tanto el AFP como la albúmina son guías críticas en la identificación de células hepáticas, el AFP es especialmente diagnóstico de las células progenitoras hepáticas después de su purificación mediante citometría de flujo debido a su expresión intensa en los progenitores hepáticos. El AFP es adoptado también para estimar la pureza de los progenitores hepáticos después de cualquier clase de estrategia de fraccionamiento.

II. Procesamiento de los Progenitores de Hígado humano Los inventores han establecido métodos que proporcionan óptimamente progenitores de hígado humano disociado a partir de hígados fetales y adultos. El aislamiento de células de hígado maduras usualmente involucra la disociación enzimática y mecánica del tejido en suspensiones celulares únicas seguidas por el fraccionamiento con centrifugación de gradiente de densidad, elutriación centrífuga, protocolos de digestión enzimática diferencial (es decir, células estrelladas hepáticas), y/o con selección usando cultivos celulares (revisados en Freshney, "Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique" 1983, Alan R Liss, Inc. NY) . La centrifugación de gradiente de densidad es usada rutinariamente por muchos investigadores para eliminar que ellos asumen ser desechos y células muertas mediante el abandono de todas las fracciones y retener solamente la pelotilla final. Mientras otros investigadores usan la pelotilla final después del fraccionamiento de gradiente de densidad, el protocolo descrito aquí es único en que hace uso de las fracciones superiores de gradiente de densidad y excluye a la pelotilla. La nueva variación a la centrifugación de gradiente de densidad, como se describe aquí, es que la pelotilla es descargada y son retenidas las células con una densidad ligera inferior (es decir, células que se colectan a o cerca de la parte superior del gradiente) . Los inventores han encontrado que las más jóvenes (es decir, diploides) y las células más robustas después de la criopreservación, están presentes en la parte superior de o dentro del gradiente de densidad Percoll, preferentemente que en la pelotilla.

IV. Citoreducción La citoreducción es un proceso para el enriquecimiento de los progenitores del hígado. Los progenitores pueden ser cualquiera de los varios linajes, incluyendo hepático, hemopoyético y mesenquimal. Como el hígado tiene una variedad de células maduras, las cuales pueden ser tetraploides o poliploides, se emplean para remover algunas o todas las células madurar para preparar una población enriquecida de progenitores. Es ventajoso pero no esencial, llevar a cabo el paso de citoreducción a 4°C. Después de la preparación de una suspensión células única de células de hígado, las células son separadas en fracciones múltiples de conformidad con el tamaño de célula, densidad ligera, o una combinación de ambas. De conformidad con la invención, las células progenitoras del hígado son de menos de 15 micrones de diámetro. Cualquier método de separación que separa tales células pequeñas de las células más grandes y de las células de desecho, es adecuado, incluyendo la velocidad de sedimentación en un medio de cultivo (el cual puede ser un medio basal o un medio enriquecido) , gradiente de sedimentación, cromatografía usando perlillas de separación de tamaño de poro grande, entre otros. El material del gradiente puede ser sílice revestido con polivinilpirrolidona (Percoll) , sucrosa reticulada (Ficoll), dextrano o cualquiera conocido por aquellos en la técnica, y preparados para ser isotónicos para prevenir la lisis o disolución celular, en por ejemplo, salina amortiguada de fosfato o medio basal Eagle (BME) . La suspensión de las células disociadas es típicamente aplicada en la parte superior de una capa del material gradiente y sometida a un campo centrífugo, mientras se mantiene a 4°C. Alternativamente, la suspensión celular puede ser aplicada a una unidad aféresis, tal como se usa para aislamiento de los componentes sanguíneos, es decir, plasmaferesis. Las células grandes, incluyendo células parenquimales maduras y células tetraploides son sedimentadas más rápido que los progenitores pequeños y las células diploides, y se remueven. El diseño del protocolo de centrifugación toma en cuenta la sensibilidad de las células a tensiones de oxígeno bajas y minimiza el tiempo para el enriquecimiento celular. La suspensión celular puede enriquecerse por progenitores hepáticos por estos métodos. Además, el paso de citoreducción puede comprender elutriación centrífuga, toma panorámica basada en las proteínas de adherencia a la superficie celular, cromatografía de afinidad o procesamiento por lotes, etiquetando con etiquetas fluorescentes, centrifugación zonal, centrifugación de flujo continuo, clasificación magnética después de la incubación con perlillas magnéticas, por ejemplo, perlillas magnéticas formadoras de complejos a los anticuerpos o combinaciones de estos métodos. La centrifugación de gradiente de densidad puede ser un gradiente discontinuo o un gradiente continuo. La fracción Percoll es adecuada para uso inmediato, criopreservación, establecimiento en cultivo, o enriquecimiento adicional. El enriquecimiento adicional se puede acompañar por la toma panorámica, selección de afinidad, clasificación FACS o cualquiera de las técnicas conocidas en el arte y descritas anteriormente. La selección negativa se abarca por la remoción de células que expresan marcadores para CD45, glicoforina A, u otros marcadores como se menciona bajo. La selección positiva está abarcada por la selección de células que expresan CD14, CD34, CD38, ICAM u otros marcadores indicativos de la expresión de alfa- fetoproteína de longitud completa, albúmina o ambas.

En otra modalidad de la citoreducción, los no progenitores son selectivamente removidos por la disolución selectiva. Las células rojas son sometidas a lisis mediante la exposición breve de la suspensión celular a una solución de cloruro de amonio, seguida por dilución con un medio de cultivo y centrifugación para remover las células rojas ?fantasmas" y la hemoglobina libre. De manera similar, los no progenitores son selectivamente e hidrolíticamente sometidos a lisis por el congelamiento usando la mezcla de criopreservación descrita abajo. Los varios métodos de citoreducción para remover las células poliploides, células que expresan marcadores asociados con las células hemopoyéticas maduras, células que expresan marcadores asociados con las células hepáticas maduras, células que expresan marcadores asociados con las células mesenquimales maduras, y combinaciones de estas células.

V. Criopreservación de los progenitores humanos del hígado y su progenie Las metodologías de criopreservación de esta invención son únicas y distintas de los métodos usados en la técnica anterior. Las mayores distinciones son el uso de amortiguadores diferentes y la criopreservación de una población de progenitor hepático la cual es baja en densidad y así, ligera en la centrifugación de gradiente. Los 5 progenitores hepáticos son de tamaño pequeño y diploides. La criopreservación exitosa de las células maduras del hígado humano es altamente deseada pero nunca se ha alcanzado en la técnica. De manera general, la criopreservación es definida como la habilidad para congelar las células a temperaturas de nitrógeno líquido (-160-180°C) y después cebarlas, observando biodisponibilidades de >75° y con la habilidad para unirse en discos de cultivos. Usando métodos más viejos, los hepatocitos maduros de roedores de origen humano, tienen biodisponibilidades de 30-40% sin habilidad para unirse después del enfriamiento bajo las condiciones anteriores (por ejemplo, véase Toledo-Pereya, et al . , Patente Estadounidense No. 4,242,883; Fahy et al . , Patente Estadounidense No. 5,217,869; Mullon et al . , Patente Estadounidense No. 5,795,711; y Fahay et al . , Patente Estadounidense No. 5,472,876). Estas patentes describen una biodisponibilidad muy pobre (<50%) de células, se comportan principalmente con los cultivos celulares (células no individuales en la suspensión celular) y requieren una exposición prolongada de las células al amortiguador antes del congelamiento. La Figura 3 ilustra la excelente biodisponibilidad de las células de hígado criogénicamente almacenadas de conformidad con el método de la invención. Los datos se expresan como el porcentaje de cambio en la biodisponibilidad mediada al tiempo del procesamiento contra el tiempo de cebación. Estos datos indican que la criopreservación no afecta significantemente la biodisponibilidad de las células. No hay cambio significante en la biodisponibilidad sobre un periodo prolongado hasta 550 días en almacenamiento. La metodología de criopreservación especial de esta invención, incluye el uso de un amortiguador nuevo, una población celular nueva, y opcionalmente embeber las células en formas de matrices extracelulares. Esta metodología para el primer tiempo alcanza una biodisponibilidad después de la cebación que no es diferente de la biodisponibilidad mediada antes del congelamiento, inmediatamente después de la dispersión celular. Las biodisponibilidades actuales son variables debido a la condición del tejido después de la llegada y los efectos de preparación de la suspensión celular usando disociación mecánica y enzimática, y, en los estudios -,." actuales, 77% promediado para las células del hígado fetal. Las metodologías de criopreservación no resultan en pérdida significante en la biodisponibilidad mediante los procesos de congelamiento y en las células que podrían unirse y expanderse ex vivo después de la cebación.

VI. Inmunodetección de los Progenitores de Hígado Humano La invención muestra un método para el aislamiento de progenitores a partir de hígado humano que comprende, proporcionar una suspensión celular substancialmente única de tejido de hígado humano, y someter la suspensión a una inmunoselección positiva o negativa. El método de inmunoselección puede comprender seleccionar a partir de la suspensión, aquellas células las cuales ellas mismas, su progenie o formas más maduras de las mismas, expresan al menos, un marcado asociado con al menos uno de los linajes celulares. Estos linajes celulares pueden ser hemopoyéticos, mesenquimales, hepáticos o alguna combinación de estos linajes. El paso de selección celular puede incluir remoción de las células que expresan glicoforina A, CD45, y marcador específico de la célula de hígado adulto, conexina 32, o combinaciones de los mismos. Sin embargo, el método de selección puede incluir itfémoción de las células poliploides, células que expresan marcadores asociados con células hemopoyéticas maduras, células que expresan marcadores asociados con células hepáticas, células que expresan marcadores asociados con células mesenquimales maduras, o combinaciones de los mismos. La selección de las células puede comprender seleccionar células que expresan CD14, CD34, CD38, ICAM o combinaciones de los mismos. Además, el método puede identificar y seleccionar células hemopoyéticas maduras que expresan a la glicoforina A, CD45 o una combinación de estos. Sin embargo, el método de selección puede seleccionar células mesenquimales maduras que expresan retinoides, factor Wilebrand von, Factor VIII, o combinaciones de los mismos. El método de inmunoselección puede llevarse a cabo en conjunto con la citoreducción basada en el tamaño celular, densidad ligera, o combinación de los mismos. El método de selección puede seleccionar células que expresan al menos, un marcador asociado con al menos un linaje celular, el cual puede ser hemopoyético, hepático o mesenquimal. La selección de células, su progenie o formas más maduras de las mismas, puede expresar al menos, un marcador asociado con al menos un linaje celular hepático.

Tal linaje puede ser células parenquimales o hepatocitos o células biliares. Así, los marcadores expresados por las células pueden ser CD14, CD34, CD38, CD117, ICAM o combinaciones de los mismos.

VI. Marcadores Celulares y Citometría de Flujo Usando nuestra definición actual de los progenitores del hígado como poblaciones de células inmaduras que expresan alfa-fetoproteína con o sin la expresión de albúmina, hemos valorado marcadores que se seleccionarán específicamente para estas células usando tecnologías de inmunoselección. Un descubrimiento sorprendente ha sido que muchos de los marcadores (es decir, CD34) que son uno clásicos para los progenitores hemopoyéticos, pueden también identificar subpoblaciones de progenitores hepáticos. Así, las clasificaciones de color únicas para CD34 resultan en el enriquecimiento significante (al menos 9 veces) para las células que expresan AFP. Sin embargo no todas estas células AFP positivas pueden ser verificadas por ser progenitores hepáticos. Basados en el porcentaje de que son albúminas positivas, nosotros estimamos que el 80-90% de las células son progenitores hepáticos, y las otras son ya sea progenitores hepáticos también inmaduros para aún expresar albúmina o posiblemente subpoblaciones he opoyeticas que expresan alfa-fetoproteína. Esta invención usa una estrategia de clasificación citométrica de flujo único. Usando la combinación de AFP y 5 expresión de albúmina como dos singulares características definidas de progenitores hepáticos, nosotros hemos identificado marcadores antígenicos identificados y otros parámetros citométricos de flujo que definen las células progenitoras hepáticas. Las estrategias de clasificación para datos, involucran clases de células pequeñas (< 15 µ por medida de diseminación delantera) , que son diploide (usando fluorescencia de tinte Hoechst 33342), son granulares por diseminación lateral, son negativas para ciertos antígenos hemopoyeticos (es decir, glicoforina A, el antígeno de las células rojas de la sangre y CD45) seguida por marcadores positivos que portan entre las subpoblaciones de células hepáticas y subpoblaciones de células hemopoyeticas (es decir, CD14 y/o CD38) . En los experimentos descritos aquí, los inventores identificaron células progenitoras hepáticas mediante la clasificación de esas células expresan fuertemente la alfa- fetoproteína, la albúmina expresada débilmente, y CD14, CD34, CD38, CD117 expresadas, o una combinación de las mismas. También, aquí de describe la evidencia que las células hemopoyeticas también expresan AFP, aunque en una forma truncada. Los inventores describen una nueva población celular y un proceso de aislamiento, identificación, cultivo, y un método de uso de tales poblaciones celulares. Los sucesos en el aislamiento, identificación, y cultivo de la población celular particular de la invención, se llevan a cabo parcialmente a través de métodos avanzados de aislamiento, afinidad de citoreducción, clasificación de las células activadas fluorescentes de alta velocidad, velocidad mayor y exactitud, y criopreservación modificada y técnicas de cultivos. Los solicitantes demuestran las estrategias de clasificación citometrica de flujo y los métodos para purificar a los progenitores del hígado a partir de suspensiones celulares recientemente aisladas y/o de células de hígado criopreservadas licuadas o cebadas. Estos métodos involucran 1) teñido de las células con varios anticuerpos etiquetados con flúorosonda por marcadores de la superficie celular específica y 2) usando una combinación de estrategias de clasificación negativas y positivas en tecnologías citometricas de flujos multiparamétricos. Los métodos para la purificación de etapas de linaje especifico de poblaciones celulares hepáticas humanas, pueden ser usadas con hígados de cualquier edad de donador, puesto que los marcadores parecen ser específicos de la posición del linaje. Los métodos mejorados de etiquetación de células, y un citómetro de flujo dramáticamente mejoramiento (flujo citometro "un MoFlo" de Cytomation el cual clasifica células a 40,000 células/segundo y realiza 8 clasificaciones de color) sobre el cual se usó en el pasado (Becton Dickenson' s FACSTAR PLUS, el cual clasifica células a 2000-6000 células/segundo y realiza 2-4 clasificaciones de color) ; asiste en el aislamiento exitoso, e identificación de esta nueva población celular. La Figura 4 ilustra una clase de FACS univariante. La suspensión celular se prepara por análisis de inmunofluorescencia de la alfa-fetoproteína (AFP) , usando anticuerpos conjugados al tinte rojo, Cy5, y para albúmina usando anticuerpos conjugados al tinte azul (AMCA) . Treinta mil células se seleccionaron para la fluorescencia roja (AFP) y azul (albúmina) . Los resultados muestran un grupo claro de células positivas para cada proteína. Además los análisis muestran que aproximadamente 80% de las poblaciones positivas para cada proteína son representadas por las mismas células (es decir, co-expresión de dos proteínas) . La expresión de AFP e inmunoreactividad similar a la albúmina, está bien definida en las suspensiones celulares, con un grupo claro de células que muestran una clara diferenciación de la señal antecedente. La alfa-fetoproteína es expresada en 6.9±0.86% de células en suspensiones celulares no fraccionadas y la albúmina se presenta en 7.7+1.1%. Entre células positivas AFP 75.6+4.9% de albúmina se co-expresa mientras 80+5.5% de células positivas de albúmina también expresan AFP. Así, aproximadamente 25% de células expresan alfa-fetoproteína no expresan albúmina y 20% de células que expresan la albúmina no expresan a la alfa-fetoproteína. Las proporciones de células que portan los marcadores de superficie principal usados en este trabajo, se muestran por las suspensiones celulares completas (es decir, que incluyen células rojas) en la Tabla 2 (GA = glicoforina A, un marcador de superficie en las células rojas de la sangre) .

Tabla 2: Porcentaje de Células Positivas CD en Suspensiones Originales de células de hígado y porcentaje de estas que son positivas para AFP.

CD14 CD34 CD38 CD45 GA No fraccionado % en población 3.7+0.8(8) 2.8+0.5 2.210.4 2.6+0.5 36.8+5 % de AFP 81.7+2.2 72.6+4.2 57.6+4.6 22.2+4.4 2.3+0.6 positivo La figura 5. Ilustra el porcentaje de células que expresan marcadores de superficie CD14, CD34, CD38, CD45, y Glicoforina A (GA) en suspensiones de células de hígado no fraccionadas. Se nota que los datos GA se trazan en el eje derecho para preservar la escala. La figura 6 ilustra el porcentaje de células en la suspensión celular original que expresa la alfa-fetoproteína y otros marcadores antigénicos. La Media±SEM para el porcentaje de células positivas para alfa-fetoproteína (AFP) y marcadores de superficie celular específica (CD14, 34, 38, 45 y glicoforina A) . Claramente, las células positivas de glicoforina A (GA) , (es decir, células eritroides) representan un componente principal de la masa celular, pero fracciones insignificantes de las células AFP positivas. La figura 7 (superior) ilustra la co-expresión de alfa-fetoproteína y albúmina. La expresión de alfa-fetoproteína (panel izquierdo) y albúmina (panel derecho) en suspensiones celulares de hígado fetal con o sin la reducción selectiva de células rojas usando fraccionamiento Percoll. El porcentaje de células positivas AFP que coexpresan la albúmina también se incrementa a 80.5+8.2% y la proporción de células positivas de albúmina que co-expresan AFP incrementan a 89±3.1%, aunque ningún cambio sea estadísticamente satisfactorio. La Figura 7 (inferior), ilustra el efecto de citoreducción por fraccionamiento Percoll en la co-expresión de la albúmina y la alfa-fetoproteína. La proporción de células que expresan tanto la alfa-fetoproteína como la albúmina, se expresan como un porcentaje de AFP o células positivas de albúmina. Los datos para las células con y sin reducciones de las células rojas se muestran usando fraccionamiento Percoll. Así, cuando se reducen la suspensiones celulares de las células rojas mediante el fraccionamiento Percoll, la proporción de las células que expresan AFP se incrementa significantemente a 12.9+9% y aquellas que expresan albúmina a 12.1+2.3%. Los resultados de este procedimiento en la proporción de células que llevan los marcadores de la superficie, se muestran en la Tabla 3, junto con la proporción de subgrupo que muestra el teñido positivo para AFP.

XE Tabla 3: Porcentaje de Población Positiva CD en las Suspensiones Celulares después de la Reducción de las Células Rojas y porcentaje de estas que son positivas para 5 AFP.

CD14 CD34 CD38 CD45 GA Disminución de Célula Roja 10 % en población 7.4+1.3 3.4+0.5 4.8+0.9 8.2+0.3 27.5+4.7 % AFP positivo 89.8+1.3 77.1+2.9 53.5+7.2 32.5+1.3 1.8+0.9 La Figura 8 ilustra un análisis de FACS de una suspensión celular de hígado fetal para la co-expresión de CD14, CD38 y AFP. La scattergram bivariata muestra la distribución del teñido tricolor para CD14 (ordenada) contra teñido FITC para CD38 (abscisa) . Las entradas se crean para seleccionar agrupamientos celulares específicos de conformidad con las señales CD14 y CD38. Estas son entonces usadas para mostrar la intensidad del teñido AFP en cada uno de esos grupos. Los resultados AFP muestran que un alto nivel de enriquecimiento para AFP se produce mediante la selección de las células positivas para ya sea CD38 o CD14.

La señal AFP generada de la suspensión celular completa (30000 células) se muestra en la izquierda inferior. En muchos casos, la presencia de AFP en los subgrupos seleccionados mediante los marcadores de la superficie celular se distribuyen continuamente con una clara preponderancia de células que muestran las intensidades de teñidos en el rango positivo. Sin embargo, la distribución de las células positivas CD38 con respecto a la co-expresión de AFP es único. En células positivas CD38 una distribución bimodal para la co-expresión de AFP es aparente, en la cual dos distintos grupos de células son aparentes, un grupo positivo para AFP, el otro, negativo. Los resultados muestran que la alfa-fetoproteína {AFP) se presenta en un 70% de las células en las suspensiones celulares del tejido de hígado fetal (es decir, en la suspensión celular original) . El anticuerpo para la glicoforina A (un antígeno o células rojas de la sangre, eritrocitos) , se encuentra identificando una subpoblación de células que no expresan AFP. Así, Tas células que expresan este antígeno (es decir, células eritroides) , son excluidas de las células propuestas para la caracterización de los progenitores hepáticos. El antígeno CD38 identifica una población de células que muestran incremento significante en W - la proporción de las células positivas AFP (es decir, superiores de 7 veces la proporción en las muestras no fraccionadas. Ambos antígenos muestran un número de isoformas, que dependen de si o no existen secciones de las 5 moléculas codificadas mediante las variantes de empalme presentes. Los anticuerpos están disponibles, que identifican las varias isoformas. Los marcadores clásicos para las células progenitoras hemopoyéticas, CD34, se encuentran presentes en muchas células también expresan AFP. La clasificación de células positivas para CD34 resulta en el enriquecimiento de las células AFP positivas al menos 9 veces sobre aquellas encontradas en la suspensión celular original (67% en las células positivas CD34 contra 7% en la suspensión celular original) . Si embargo, el anticuerpo único más efectivo para el enriquecimiento de las células positivas AFP es el CD14, el cual produce un incremento superior de 11 veces en la proporción de esas células comparadas con la población original (81% contra 7%) . 20 Podrá parecer que el rendimiento de las células positivas AFP podría mejorarse usando una combinación de marcadores de la superficie. Así, la extensión de la coexpresión de AFP con combinaciones seleccionadas de -* *~***. , -*.**,,.. AM.-, *^^t???*^ l*?l* Ía*?*É?iák . ' marcadores de la superficie se determina para establecer la extensión a la cual puede ser incrementada la selección del marcador intracelular. Los datos son expresados como la proporción de células positivas AFP que expresan marcadores 5 de la superficie (llamados el "rendimiento" de células positivas AFP) y como la proporción de todas las células positivas AFP que aparecen en la población definida por el marcador de la superficie (llamado el factor de "enriquecimiento" para las células positivas AFP) . Los 10 resultados para las combinaciones de CD14, CD34 y CD38 se muestran en la Tabla 4, junto con los resultados de marcadores individuales para comparación.

Tabla 4 15 CD14 CD34 CD38 CD14+CD38 CD14+CD34 Enriquecimiento 80.6+2.6 66.7±4.7 53.8±4.5 66.9+3.5 68.2±3.9 Rendimiento 39.8+2.6 26.9±4.4 22.0+2.7 50.6+2.7 52.2+5.5 Enriquecimiento: Porcentaje de células que expresan 20 cualquiera de los dos (o ambos) marcadores de la superficie que son también positivos para AFP.

Rendimiento: Porcentaje de todas las células positivas AFP que también expresan una o ambas de las combinaciones del marcador de la superficie.

La figura 9 ilustra como la selección para CD14 y CD38 se enriquece por células positivas AFP. La proporción de células positivas AFP en la suspensión celular preparada de hígado fetal se incrementa dramáticamente por las células seleccionadas con etiquetación de superficie positiva por los marcadores CD38 y CD14. La combinación de dos marcadores produce un mejor enriquecimiento significante de células que contienen AFP que se obtienen con ya sea solo un marcador. La figura 10 ilustra la microscopía fluorescente de células progenitoras hepáticas en humano. Las células progenitoras hepáticas representativas del hígado fetal, se tiñen por el contenido de AFP. El tamaño de las células indica que tanto los progenitores tempranos como los progenitores hepáticos más avanzados están presentes. La morfología de las células positivas teñidas por AFP son variables y abarcan el rango completo del tamaño y forma de las células en la suspensión celular a partir de hígado fetal pero no del hígado adulto. La más grande de las - . células positivas AFP, de aproximadamente 12-15 µ, es mucho más pequeña que los hepatocitos maduros, que varían de tamaño de 20-50 µ. La figura 11 ilustra células representativas seleccionadas por expresión de AFP. Las células con teñido positivo para CD14 (lado derecho) son características de hepatoblastos . Las células con teñido negativo para marcadores de la superficie son más pequeñas y consistentes en tamaño y morfología con los primeros progenitores hepáticos. En todos los casos, una cierta proporción de células positivas AFP no muestran una expresión de cualquier anticuerpo de superficie usado en esta estudio. La apariencia de estas células "nulas" positivas AFP se ilustra en la figura 11 donde esta puede ser comparada con la apariencia de las células positivas CD14/AFP positivas clasificadas de la misma suspensión. Es claro que mientras ambos tipos celulares son positivos para AFP, las células que se tiñen negativas por los antígenos de la superficie son consistentemente más pequeñas y menos complejas que las células positivas CD14. Así, los marcadores probables para la clasificación de los progenitores hepáticos son: Glycoforina A; CD45", ICAM+, y uno o más CD14+, CD34, CD38+, CD117, diploide, granular (por dispersión lateral), menores de 15 µ (por esparcimiento delantero) . El fenotipo de estas células clasificadas son células pequeñas (< 15 µ) , con citoplasma pequeño (núcleo grande/relación de citoplasma) , albúmina"1" y/o AFP+++.

VII. Caracterización Confocal de Células que Expresan la alfa-fetoproteína en Hígado de Humano Adulto y Fetal.

La microscopía confocal se ha usado para obtener las imágenes de células adultas y fetales de humano que expresan alfa-fetoproteína. Esta metodología permite a uno observar la morfología y tamaño de esas células y muestra directamente la localización de las proteínas intracelulares, tales como AFP y ALB, y de los marcadores de la superficie de la membrana tal como CD34 y CD38. La figura 12 ilustra la microscopía confocal de las células que expresan alfa-fetoproteína, esto es, progenitores hepáticos en hígado humano de adulto. La figura muestra tres vistas de un campo, y que son dos células positivas AFP en este campo. La capa del panel (A) y panel (B) se muestra en el panel (C) e indica la morfología de rir 3- "" - —a***.<°-* *. ...***. ***» I?i ái líím^iii^á??í iát^m M?M células positivas AFP (coloreadas de rosa, en la original) en un grupo de células de hígado. La figura 13 ilustra células que son etiquetadas con calceina (A) para mostrar todos los tipos de células. La Fig. 13 (B) consiste de las mismas células que co-expresan AFP y que muestran que únicamente dos células son AFP positivas. El tamaño de la célula no es un factor para la positividad de AFP. Las células que expresan AFP se encuentran tanto en hígado de adulto como fetal. Los hígados fetales, como se espera, tienen el porcentaje más alto (6-7%), mientras los hígados de adulto tienen un pequeño porcentaje (< 1%) y con los números que declinan con la edad del donador. Los pocos progenitores hepáticos encontrados en hígados de adultos pueden ser enriquecidos significativamente a través de procesos de fraccionamiento Percoll para proporcionar hasta 2% de las células en fracciones Percoll 1 y 2 de los hígados de adulto (Tabla 5) . Las células que no expresan AFP se encuentran en un hígado del donador mayor de 71 años de edad. Tabla 5 muestra el tamaño de célula y la viabilidad de fracciones aisladas de Percoll de células de hígado en adulto. Las células más pequeñas (fracciones 1-3) tiene alta viabilidad superior que la de las células más grandes (fracción 4) después de ser criopreservadas bajo las mismas condiciones de criopreservación.

Percoll Fracciones % Viabilidad Tamaño de Células % de AFP+ (µm) células Fracción 1 82 > 12 0, .5-1 % Fracción 2 84 10-15 2 % Fracción 3 85 15-25 < 0.2 % Fracción 4 56 25-50 < 0.01 % Estos resultados sugieren que los órganos del donador usados para terapias de células de hígado así como también por órganos de transplante, consistirán de aquellos donadores jóvenes (hasta aproximadamente 45 años de edad. Además, los hígados de pacientes geriátricos (> 65 años de edad) serán donadores inapropiados para las terapias celulares y quizás también para los transplantes de órganos completos, especialmente para niños, puestos que tienen poca si es que alguna, capacidad de regeneración de las células progenitoras hepáticas y solamente la capacidad regenerativa ?"#t intermedia o mínima conocida que está disponible de las células maduras.

VIII. Linaje o descendencia de Maduración Por lo tanto, el hígado de los adultos contiene una población de células progenitoras hepáticas capaces de crecer y de diferenciarse en células biliares y hepatocitos bajo condiciones normales y de padecimientos. Esta invención establece la proposición de que cada posición en el linaje del hígado es una etapa de maduración distinta, y que hay múltiples poblaciones de células madre en el hígado. De manera sorprendente, el hígado embriónico de la presente invención genera células progenitoras para 3 linajes de maduración, separadas: hepatopoyesis, con los desarrollos esperados de los hepatocitos y de las células biliares (ducto biliar) ; hemopoyesis, con los desarrollos esperados de las células de los linfocitos (B y T) , plaquetas, macrófagos, neutrófilos, y granulocitos; y la mesengénesis, con los desarrollos esperados de las células del endotelio, células grasas, células del estroma, cartílago, y aún del hueso (las últimas dos se presentan en el hígado solamente bajo condiciones de enfermedad o padecimiento) .

En general, las células madre o progenitoras son células inmaduras que pueden dar lugar a células hijas con más de un desarrollo esperado. Las células madre producen células hijas, algunas de las cuales son idénticas al padre y algunas de las cuales "tienen asignado" un desarrollo esperado específico. El proceso de asignación no está entendido a un nivel molecular. Más bien, se reconoce que se ha presentado sólo empíricamente cuando los desarrollos esperados de las células se han estrechado de aquéllos de un predecesor. Los "progenitores asignados" se definen como células inmaduras que tienen un desarrollo esperado único tal como los progenitores asignados, hepatocíticos (que dan lugar a hepatocitos) o progenitores asignados biliares (que dan lugar a ductos biliares) . Las transiciones de las células madre a las células adultas ocurre en un proceso en forma de etapas generando un linaje o descendencia de maduración en el cual el tamaño celular, la morfología, el potencial de crecimiento y la expresión de los genes está unido al linaje. La metáfora del crecimiento es útil en definir el proceso. Las células "jóvenes" tienen una expresión temprana de genes y el potencial de crecimiento más grande; las células tardías en el linaje tienen una expresión "tardía" de genes y usualmente están limitadas en su crecimiento o no crecen del todo. Las células tardías se pueden considerar "viejas" o en términos biológicos, apoptóticas, y finalmente son mudadas. El proceso de linaje de maduración resulta en una rotación natural para el tejido y permite la regeneración después de los daños o heridas. Los tejidos difieren en la cinética del proceso de maduración. El linaje de maduración de los intestinos es bastante rápido con un ciclo completo que ocurre en menos de una semana; aquél del hígado es un proceso lento y se presenta en el hígado de la rata en aproximadamente un año. El hígado de la rata se forma una vida embriónica en aproximadamente 10 días, referido como "día embriónico 10" ó ElO, con la invaginación de la mesenquima cardiaca mediante el endodermo localizado en la región del intestino medio del embrión (Zaret, K. 1998. Curren t Opinión in Genetics & Development . 8:526-31). El reconocimiento más temprano de las células del hígado en los embriones se ha logrado utilizando estudios de hibridización in si tu para el ARNm que codifica la alfa-fetoproteína (AFP) (Zaret, K. 1998. Current Opinión in Genetics & Developmen t . 8:526-31; Zaret, K. 1999 Developmen tal Biology (Orlando) , 209:1-10). Las células que expresan el AFP se observan en la región media del intestino del embrión cerca de la mesénquima que produce el corazón en los días 9-10 en todos los hígados de las ratas y los ratones ensayados. El hígado se vuelve macroscópicamente visible por E12 y es de aproximadamente 1 mm de diámetro por E13. En paralelo, la hemopoyesis ocurre con las primeras células hemopoyéticas identificables que aparecen por E15-E16 (en roedores) y en el 3ero. al 4to. mes (en humanos) y con el pico o máximo de eritropoyesis (formación de las células eptroides o células rojas de la sangre) que se presentan por E18 (en roedores) y por el 5to.-6to. mes (en humanos) . En el pico o máximo de eritropoyesis, el número de estas células rojas del hígado dominan el hígado y contabilizan más del 70% de los números de células en el hígado. El término del periodo de gestación es de 21 días en roedores y de 9 meses en humanos. Dentro de las horas del nacimiento, los números de células hemopoyéticas declinan dramáticamente tal que por el día 2 de vida post-natal (roedores) y dentro de una semana a dos (humanos) , la gran mayoría de las células hemopoyéticas ha desaparecido habiendo migrado hacia la médula ósea. Nadie sabe la causa de la migración de las células hemopoyéticas. Sin embargo hay dos especulaciones dominantes.

Primero, los progenitores hemopoyéticos prefieren condiciones relativamente anaeróbicas y viajan hacia la médula ósea (la cual es relativamente anaeróbica) con los niveles elevados de oxígeno en el hígado con la activación de los pulmones; y segundo, la pérdida de las hormonas del embarazo son la causa de la migración. Post-natalmente, la pérdida de los progenitores hemopoyéticos en el hígado, está asociada con una reducción dramática en los números de progenitores hepáticos y un incremento paralelo en los números y maduración de los hepatocitos y células biliares. La madurez completa del hígado se completa por las 2-3 semanas de vida post-natal (en roedores) y dentro de pocos meses (en humanos) . Por ese tiempo, las células progenitoras remanentes se localizan en las regiones de las triadas portales en la periferia de cada acinus del hígado. Posteriormente, la arquitectura clásica del acinus del hígado se establece con cada acinus que se define periféricamente por seis conjuntos de triadas portales, cada una teniendo un ducto biliar, una arteria hepática y una vena hepática, y en el centro una vena central que se conecta a la vena cava. Las placas de las células del hígado, como rayos en una rueda, se extienden desde la periferia hacia el centro. Por convención, las placas se dividen en tres zonas: la zona 1 está cerca de las triadas portales; la zona 2 es midacinar o está en el acinus medio; y la zona 3 está cerca de las venas centrales. Las únicas células diploides del hígado están en la zona 1; las células tetraploides están en la zona 2; y las células tetraploides, octaploides y multinucleadas están en la zona 3. El patrón es altamente sugestivo de un linaje de maduración que termina en un proceso apoptótico ( (Sigal, S. H., S et al. 1995. Differentia tion . 59:35-42).

IX. Implicaciones del Concepto de Linaje o Descendencia en los Estudios Pre-clínicos y Clínicos de la Biología del Hígado. Las características de crecimiento y diferenciación in vi tro e in vivo de la población de células de esta invención está de acuerdo con el concepto e implicaciones de un modelo de linaje-linaje de posición en el hígado. Por ejemplo, en un cultivo parenquimal in vi tro, la capacidad de las células parenquimales para dividirse y el número de divisiones celulares se predice como estrictamente dependiente del linaje-posición. Por lo tanto, las células parenquimales periportales deberán tener un potencial de división más grande que las del pericentro. Esto explica el „ f { \ $ mifeterio desde hace tanto tiempo del por qué los cultivos primarios del hígado, el órgano regenerativo más renombrado en el cuerpo, muestra tal división celular limitada en el cultivo. Las células madre o pluripotenciales y sus contrapartes transformadas, los hepatomas, se predice que expresan genes tempranos tales como alfa-fetoproteína y el factor II de crecimiento similar a la insulina, pero no genes expresados posteriormente en el linaje. En el modelo de linaje de maduración ningún hepatoma no deberá expresar genes tardíos, porque la progresión completa a través del linaje requiere una regulación no alterada de la diferenciación, crecimiento, y ciclo celular. Esto de hecho se ha observado en la población de células de la invención. Los estudios biológicos moleculares que comparan la expresión del gen específico del hígado en los tejidos embriónicos contra los tejidos adultos definen varias clases de genes: aquéllos de diagnóstico de los compartimentos (células madre, amplificación, diferenciación) ; aquéllos expresados de límites compartimentales de cruce potencial y de zona; y aquéllos expresados tempranamente, en plazo medio, o tardío en el linaje pero discretamente en pocas células .

Varios patrones de expresión morfológico y de genes de los tumores primarios del hígado se pueden entender estudiando la población de células de la invención. Si los tumores representan la proliferación de células madre transformadas con capacidades variantes de diferenciación, la expresión común de la alfa-fetoproteína en hepatomas no es un marcadores del tumor inducido sino un indicador de una población de células inmaduras expandidas que expresan normalmente la alfa-fetoproteína. La población de células aisladas de esta invención tiene un gran impacto sobre el éxito de la terapia de genes y/o de células dirigidas al hígado. Esta invención, como se describe en los Ejemplos, ha identificado condiciones clave en las cuales los progenitores hepáticos humanos y de primates no humanos se pueden criopreservar exitosamente. Debido a la capacidad para expandirse significativamente in vi tro, la población de células de esta invención, similar a las células en el linaje hemopoyético, se puede utilizar como un "material de biopsia de punción" para proporcionar la siembra de células para la expansión ex vivo . Esto eliminaría la necesidad de resección quirúrgica invasiva mayor del hígado del paciente.

Una vez que los progenitores hepáticos humanos están establecidos en el cultivo, se realiza la transferencia de genes. Esto se puede complementar o realizar con un número de diferentes sistemas de vectores de suministro de genes. Una consideración importante en este punto es que la transferencia exitosa de genes requiere de un cultivo de crecimiento rápidamente, y puesto que los progenitores hepáticos humanos de la invención se dividen significativamente bajo condiciones fisiológicas normales, estás células son candidatos ideales para la transferencia de genes hacia el hígado. También, las características de crecimiento de la población celular de esta invención permite el uso de una transferencia de genes ex vivo utilizando ciertos vectores de suministro del gen (es decir, vectores retrovirales) los cuales requerirán la proliferación celular para una inserción y expresión de genes eficiente. Una metodología alternativa para la terapia de genes es diseñar vectores que tomen como objetivo los progenitores específicamente y luego se inyecten al vector, acoplados con el gen de interés, directamente al paciente. Los vectores tendrán como objetivo y modificarán la población de células progenitoras endógenas.

La población de células progenitoras de esta invención se pueden utilizar en una terapia de genes o de células dirigidas al hígado, alogeneica o autóloga. Claramente, el uso de progenitores hepáticos autólogos eliminará una preocupación significativa en relación al rechazo de las células transplantadas. La población de células de esta invención es particularmente atractiva para la transferencia de células alogénicas, debido a que su perfil antigénico sugiere un fenómeno de rechazo inmunológico, mínimo. Además, otros elementos celulares, tales como las células de la sangre, células endoteliales, células de Kupffer, que son conocidas como altamente inmunogénicas se eliminan substancialmente a través del proceso de purificación. Una vez que los progenitores hepáticos autólogos o alogénicos se purifican y se cultiva aislados, se pueden modificar genéticamente o permanecer intactos, se pueden expandir in vi tro, y luego se transplantan de vuelta al hospedero. Si se desea la modificación genética, después de la modificación genética y antes del transplante, aquellas células modificadas genéticamente se pueden expandir y/o seleccionar en base a la incorporación y expresión de un marcador seleccionable dominado. El transplante se puede traer de vuelta hacia el compartimento hepático o un sitio ectópico o heterotópico. Para el transplante en el compartimento hepático, se puede utilizar la infusión de la vena portal o la inyección intrasplénica. La inyección intrasplénica puede ser la ruta de administración de elección debido a que los progenitores hepáticos transplantados vía una inyección intrasplénica se mueven hacia el compartimiento hepático. Los procedimientos médicos adicionales pueden ayudar en la eficiencia del injerto hepático de los progenitores hepáticos transplantados. Los modelos de animales han demostrado que en una hepatectomía parcial, la administración de factores de angiogénesis, y otros factores de crecimiento ayudan en el injerto y viabilidad de los hepatocitos transplantados. Una metodología alternativa es transplantar los hepatocitos modificados genéticamente a un sitio ectópico. Hasta la fecha, las metodologías de terapia celular con respecto al hígado han mostrado poca eficiencia. Esto puede deberse al hecho de que las células donadores que se utilizan son predominantemente de células de hígado de adulto y son de corta vida después del aislamiento y la reinyección. Además, el uso de las células de adulto da como resultado un rechazo inmunológico fuerte. Las células progenitoras hepáticas de la presente invención ofrecen una mayor eficiencia debido a su capacidad limitada para generar el fenómeno de rechazo inmunológico y debido a su potencial regenerativo extensivo. Con respecto a la terapia de genes, los esfuerzos en curso hacen uso de los "vectores inyectables que tienen un objetivo" la ruta más popular para las terapias clínicas bajo desarrollo. Estas metodologías han tenido una eficiencia limitada debido tanto a los problemas inmunológicos como a la expresión transiente de los vectores. Las únicas rutas para la terapia de genes que han probado tener un mérito valioso han sido la terapia de genes ex vivo y han sido hechas casi exclusivamente en células progenitoras hemopoyéticas. Se ha predicho que la terapia de gen ex vivo con células progenitoras (o el uso de vectores inyectables que tienen como objetivo hasta cierto punto a aquéllas de las poblaciones de células progenitoras) probarán una mayor eficiencia, puesto que los vectores pueden ser introducidos ex vivo dentro de las subpoblaciones purificadas de las células progenitoras; las células modificadas seleccionadas y reintroducidas in vivo. Las ventajas de las células progenitoras son su enorme potencial *,' -r" de expansión, su mínima inducción, si es que la hay, de reacciones inmunológicas, y su capacidad para diferenciarse para producir el linaje completo de células maduras.

X. Linajes o descendencias Comunes o Interdependientes Las metodologías mejoradas permitieron a los inventores un estudio más cercano y caracterizar los progenitores hepáticos. Estos estudios revelaron una relación especialmente cercana entre los progenitores hepáticos y los progenitores hemopoyéticos sugiriendo una relación cercana entre estos dos linajes. De hecho, estos estudios mostraron que las células progenitoras de los linajes hepático y hemopoyético comparten numerosos marcadores antigénicos (CD14, CD34, CD38, CD117 ó ckit, antígenos de células ovales) , comparten propiedades bioquímicas (es decir transferrinas, glutationa-S- transferasas, y una isoforma truncada de alfa-fetoproteína) , y tienen una sobreposición extensiva en los requerimientos de cultivo (formas de matriz extracelular y requerimientos hormonales específicos) para la expansión ex vivo. Las células progenitoras de ambos linajes están localizados en los mismos sitios dentro del acinus del hígado. Finalmente, la señalización paracrina está presente a través de las células de los dos linajes de maduración; esto es las señales producidas por cada uno de los linajes regula las células en el otro linaje. De hecho, se puede concluir que puede haber un linaje común o al menos linajes interdependientes entre las células hepáticas y hemopoyéticas . Las poblaciones celulares descritas aquí están purificadas y se utilizan para producir ya sea células mielo-hemopoyéticas o derivados hepáticos dependiendo de las condiciones bajo las cuales las células se aislan y se cultivan. Por lo tanto, los sistemas del bio-reactor inoculados con poblaciones de células clasificadas para un conjunto de antígenos que define tanto los progenitores hepáticos como hemopoyéticos (por ejemplo CD38+, ckit+, CD45+) pueden dar como resultado poblaciones de células con desarrollos esperados múltiples. El desarrollo esperado depende de cómo las células se reintroducen in vivo o bajo qué condiciones de cultivo se colocan las células. Otro aspecto importante de la población celular de esta invención es que muestran un antígeno CD34 de superficie de células madre, hemopoyético, específico. Las células positivas CD34 de la médula ósea han sido utilizadas ' - tfftfft-tiTtr *-***-—-«• *-<"-» * «- --" ..... «*i^. É*ajaj ii^^ como un marcador de selección positivo, conveniente, para las células madre hemopoyéticas. Sin embargo, hay un número incrementado de reportes que pueden dudar de la especificidad del marcador antigénico CD34 para las células madre hemopoyéticas (Nakauchi H. Na ture Medicine 4:1009-1010 (1998)). La evidencia experimental demuestra la existencia de células en la población negativa CD34 de la médula ósea humana y de la sangre del cordón umbilical que puedan repoblar la médula ósea de ratones inmunodeficientes . Esta invención, como se describe aquí, describe las formas de purificar las poblaciones de células progenitoras tanto hepáticas como hemopoyéticas las cuales se utilizan subsecuentemente en los programas clínicos y pre-clínicos, utilizando las relaciones cercanas entre las células hepáticas y hemopoyéticas. Los usos para los progenitores hepáticos humanos son muchos y diversos. Incluyen: 1) la investigación sobre células humanas; 2) la producción de vacunas o antivirales; 3) estudios toxicológicos; 4) desarrollo de fármacos; 5) fabricación de proteínas (el uso de células como hospederas para la producción de varios factores específicos de humanos) ; 6) terapias celulares del hígado; 7) terapias genéticas del hígado; 8) hígados bioartificiales que se pueden utilizar en la investigación, estudios toxicológicos y antimicrobianos, fabricación de proteínas, o clínicamente como sistema de ayuda del hígado. Considerando la posibilidad de un linaje común entre la hemopoyesis y hepatopoyesis, como se predijo por los inventores de esta invención, las mismas células se pueden utilizar para los desarrollos esperados tanto hepáticos como hemopoyéticos dependiendo del microambiente en el cual se colocan. La disponibilidad de células progenitoras hepáticas humanas, altamente purificadas, permitirá una investigación mucho más extensiva sobre las células humanas, facilitará el desarrollo de formas exitosas de terapia genética y de células del hígado, y permitirá el desarrollo de hígados bioartificiales humanos para el uso tanto en investigación como en dispositivos de ayuda clínica. En el presente, el suministro limitado de tejidos humanos sanos excluye los programas clínicos en la terapia de células del hígado o en los hígados bioartificiales humanos. Las poblaciones de células progenitoras deberán tener un potencial de expansión suficiente para superar, o al menos aliviar grandemente, ese suministro limitado. **é , EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Ej emplo 1 Análisis de las formas variantes de AFP y albúmina expresada en tipos de células hepáticas contra otros tipos de células. Lineas celulares : Dos hepatomas humanos, Hep3B y 10 HepG2, se mantienen en el medio MEM de Eagle suplementado con piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/mL de estreptomicina, solución de aminoácidos no esenciales de MEM 0.1 mM, 5 µg/mL de insulina y FBS al 10%. Una línea celular de eritroleucemia humana, 15 K562 y una línea celular de fibroblastos de ratón, STO, se mantienen en un medio de DMEM/F12 suplementado con L- glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/mL de estreptomicina, 5 x 10"5M de 2-ME y FBS al 10%. RT-PCR: Los ARNs totales se extrajeron de Hep3B, HepG2 y STO mediante el método de Chomcznski y Sacchi N.

Anal . Biochem 162 : 156-159 (1987). Los ADNcs se sintetizan mediante el cebado con oligo-dT y se someten a la amplificación por PCR utilizando los conjuntos de cebadores -* *"-*• »"»»l? iill mili iiiip II iHiiHliMiííÜ tMi iliUlár^ diseñados por los inventores y preparados para la AFP humana o albúmina. Las secuencias del cebador son como sigue, Para AFP: SEC. ID 1 hAFPl: 5' -ACCATGAAGTGGGTGGAATC-3' , SEC. ID 2 hAFP2: 5' -CCTGAAGACTGTTCATCTCC-3' , SEC. ID 3 hAFP3: 5' -TAAACCCTGGTGTTGGCCAG-3' , SEC. ID 4 hAFP4: 5' -ATTTAAACTCCCAAAGCAGCAC-3' , SEC. ID 5 hAFPexon2 : 5'-CTTCCATATTGGATTCTTACCAATG-3' SEC. ID 6 hAFPexon3: 5' -GGCTACCATATTTTTTGCCCAG-3' , SEC. ID 7 hAFPexon4 5' -CTACCTGCCTTTCTGGAAGAAC-3' , SEC. ID 8 hAFPexond: 5'-GAGATAGCAAGAAGGCATCCC-3' , y SEC. ID 9 hAFPexond: 5' -AAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTG-3' , para albúmina SEC. ID 10 hALBl: 5' -GGCACAATGAAGTGGGTAACC-3' , SEC. ID 11 hALB2: 5' -CCATAGGTTTCACGAAGAGTTG-3' , SEC. ID 12 hALB3: 5' -GCCAGTAAGTGACAGAGTCAC-3' , SEC. ID 13 hALB4: 5' -TTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3' , La combinaciones de los cebadores son como sigue; Para AFP: hAFPl y hAFP2, hAFP3 y hAFP4, hAFPl y hAFP4, hAFPexon2 y hAFP4, hAFPexon3 y hAFP4, hAFPexon4 y hAFP4, hAFPexon5 y hAFP4, y hAFPexond y hAFP4. Para albúmina: hALBl y hALB2, hALB3 y hALB4, hALBl y hALB4. La PCR se realiza en un volumen total de 50 µl que consiste de 1 µM de cada cebador, 200 µM de cada dNTP, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8.3, y 1.25 U de polimerasa Amplitaq (Cetus Corp.). Las muestras se calientan a 94 °C durante 3 min. seguidos por amplificación durante 30 ciclos de 2 min. a 94°C, 2 min. a 62°C, y 3 min. a 72°C. Después del último ciclo, se realiza una etapa de extensión final a 72 °C durante 7 min. Luego 5 µl de cada reacción PCR se corre sobre gel de agarosa al 2% que contiene 5 µg/ml de bromuro de etidio en amortiguador de Tris-acetato-EDTA. RT-PCR para AFP: El gen AFP humano consiste de 15 exones (Gibbs et al . , Biochemistry, 26: 1332-1343). Para distinguir los transcriptos truncados del ARNm de AFP completo, funcional, se seleccionan dos diferentes porciones de la secuencia de ADNc de AFP como moléculas objetivo del RT-PCR. La combinación del cebador de hAFPl y hAFP2 se utiliza para la amplificación del exon 1 que contiene la MET ~f de iniciación al exon 3, mientras que aquél de hAFP3 y hAFP4 amplifica el exon 12 al exon 14 que contiene el codón de detención. Los resultados de la PCR se muestran en la Figura 1. Ambas combinaciones de los cebadores dan como resultado bandas de amplificación fuertemente detectadas en el ARN a partir de Hep3B y HepG2 (carriles 1, 2, 4, y 5) . En contraste, solamente la banda específica de la porción C- terminal se detecta por el conjunto cebador de hAFP3 y hAFP4 en el ARN de K562 (carriles 7 y 8) . Este resultado sugiere que la línea celular de eritroleucemia, K562, expresa solamente una forma truncada de AFP sin el N-terminal. En el soporte de esta hipótesis, se realizó el PCR para la región de codificación completa del AFP utilizando los cebadores hAFPl y hAFP4. Como se esperaba, el PCR del ADNc del Hep3B y HepG2 muestra la banda remarcable única de 1.8 Kb (carriles 3 y 6) , mientras que no hay banda en K5S2 (carril 9) . Los controles son muestras sin ARN y una muestra derivada de la línea celular de fibroblastos embriónicos de ratón (STO) . Ninguno mostró cualquier banda detectable. A continuación, se construye una serie de cebadores 5' del exon 2 al exon 6 para ver la diferencia entre la forma auténtica y la forma variante del ARNm del hAFP. En la Figura 1, el resultado muestra que toda la región de codificación excepto el exon 1 se comparte en la forma variante del hAFP en K562 (carril 1, 3, 5, 7, 9, y 11) . RT-PCR para albúmina : El gen de albúmina humana consiste de 15 exones también (Minghetti et al . , J. Biol. Chem., 261: 6747-6757). Como para AFP, la combinación del cebador de hALBl y hALB2 se utiliza para la amplificación del exon 1 que contiene la MET de iniciación al exon 4, mientras que aquél de hALB3 y hALB4 amplifica el exon 12 al exon 14 que contiene el codón de detención. Los resultados de la PCR se muestran en la Figura 17. Ambas combinaciones de los cebadores dan como resultado bandas de amplificación fuertemente detectadas en el ARN a partir de Hep3B y HepG2 (carriles 1, 2, 4, y 5) . En contraste, solamente la banda específica de la porción C-terminal se detecta por el conjunto cebador del hALB3 y hALB4 en el ARN a partir de K562 (carriles 7 y 8) . El PCR para la región de codificación completa de la albúmina utilizando los cebadores hALBl y hALB4 no mostraron banda en K562 (carril 9) . Los controles son muestras sin ARN y una muestra derivada de la línea celular de fibroblastos embriónicos de ratón (STO) . Ninguno mostró cualquier banda detectable.

Los proveedores para reactivos incluyen: Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) Gibco BRL Products (Gaithersburg, MD) Worthington Biochemical Corporation (Frehold, New Jersey) Dupont Pharmaceuticals (Wilmington, Delaware) Falcon - una subsidiaria de Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, New Jersey) Los proveedores para tejidos incluyen: Anatomical Gift Foundation (Atlanta, Georgia) Advanced Biosciences Research, ABR (San Francisco, Cal) Cirujanos de transplantes locales en el Hospital UNC Ej emplo 2 Procesamiento de los Hígados Humanos Hígados Fetales: Los hígados fetales vienen de múltiples clínicas afiliadas con Advanced Biosciences Research, (ABR) , todas en California, o de Anatomical Gift Foundation (AGF) con clínicas en el Sur (es decir, Georgia, Virginia), Noreste (Pennsylvania) u Oeste Medio (Kansas, Colorado) . Los fetos se recolectaron de las clínicas; los tejidos se disectaron libres de los fetos y se colocaron en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con insulina (Sigma, 5 µg/ml), transferrina (Sigma, 5 µg/ml), selenio (10"9M, y suero de bovino fetal al 5% (Gibco) . Las muestras se colocan en hielo y se embarcan por correo hacia nuestro laboratorio, un proceso que toma de 10 a 16 horas. Así, se reciben las muestras aproximadamente 24 horas después de la cirugía. A las muestras se les asigna un número el prefijo REN, dado en orden cronológico al ser recibida (REN 1, 2, 3 etc.), en donde REN es una abreviatura para Renacimiento. Hígados Adultos: Los hígados adultos vienen de Anatomical Gift Foundation o de cirujanos locales (UNC) y consisten de tejido de hígado rechazado, explantes de receptores de transplantes, o hígados donados para el transplante de órganos pero rechazados por razones diferentes a los patógenos. Los pacientes que proporcionan el tejido del explante o los tejidos de donadores rechazados se seleccionan para un arreglo de padecimientos y solamente aquéllos que se encuentran seguros mediante estas pruebas se usan para el procesamiento celular. Después de la remoción de los pacientes, los hígados se colocan en la solución de la Universidad de Wisconsin (también llamada Viaspan) y se embarcan en hielo hacia el laboratorio. El intervalo de tiempo entre la remoción del órgano de un paciente con muerte cerebral ("tiempo de sujeción") y su llegada al laboratorio es extremadamente variable. Los especímenes llegan dentro de menos de 24 horas de "tiempo de sujeción", el tiempo en el cual el hígado se remueve del donador. Hígados Cadavéricos: Los hígados obtenidos postmortem dentro de al menos 30 horas de muerte se obtienen a través de las asociaciones de obtención de órganos locales (por ejemplo Carolina Organ Procurement Association o COPA) . Los hígados se procesan como los hígados de adultos. La lista de elementos verificados para la seguridad del investigador son: HIV I y II, HTLV I y II, hepatitis B y C; tuberculosis. La lista para uso clínico son: HIV I y II, HTLV I y II, hepatitis A, B, C, y G; EBV, CMV; tuberculosis, sífilis, y micoplasma. Los hígados fetales y de adulto se procesan utilizando una combinación de digestión enzimática y disociación mecánica, los hígados fetales se preparan principalmente mediante disociación mecánica, mientras que los hígados de adulto se disocian principalmente mediante digestión enzimática. Una descripción de cada una se da a continuación. Tanto los hígados fetales como adultos se digieren por longitudes variantes de tiempo en un amortiguador de enzimas que sirve para disolver las matrices extracelulares que enlazan las células juntas en un tejido. La mezcla de enzima de colagenasa utilizada para el aislamiento de células del hígado es una preparación de enzimas "Liberase" de alta pureza fabricada por Boehringer- Mannheim, que consiste de una mezcla de colagenasa y elastasa purificadas. Esta mezcla de enzimas se puede utilizar a concentraciones mucho muy bajas y con pocos "efectos colaterales" nocivos. Solución de enzima: la solución de colagenasa de 60-70 mg/100 mis de amortiguador (colagenasa tipo IV de Sigma, catálogo #C5138 ó tipo B de Worthington, catálogo #LS005273; ambos son preparaciones bacterianas enriquecidas en colagenasa pero con muchas impurezas enzimáticas) o Liberase — (preparación de colagenasa/elastasa purificada por Boehrínger-Mannheim, catálogo 1814184) preparada en amortiguador P2 (ver abajo) y utilizada en 0.23 mg/ml. Solución de Lavado Celular: RPMI 1640 (Gibco) suplementado con insulina (5 µg/ml), transferrina (5 µg/ml), mezclas libres de ácidos grasos (ver abajo) enlazadas en una proporción molar 1:1 a la albúmina de suero de bovino o humano, purificada. Mezclas de Ácidos Grasos Libres: Las poblaciones de células inmaduras, y las células del hígado más viejas dañadas, requieren lípidos para mantener y sintetizar sus membranas. Aunque los hepatocitos completamente maduros pueden sintetizar sus membranas a partir de una fuente de ácido grasa (ácido linoleico) las células parenquimales más jóvenes no lo pueden hacer y requieren una mezcla de muchos ácidos grasos diferentes para manejar sus requerimientos de lípidos. Se proporciona una mezcla compleja que se enlaza entonces en una proporción molar 1:1 con una albúmina altamente purificada. Una descripción detallada del método para la preparación de esa preparación de ácidos grasos se da a continuación: Las soluciones de material de reserva se preparan como sigue, para un total combinado de ácidos grasos libres 100 mM. Palmítico 31.0 mM Oleico 13.4 mM Palmitoleico 2.8 mM Linoleico 35.6 mM Esteárico 11.6 mM Linolénico 5.6 mM Para obtener una concentración final de 7.6 µM/L, se agregan 76 µl por litro. [REF: Chessebauf y Padieu, In vitro 20 (10):780: 1984. De acuerdo a la referencia anterior se utiliza una mezcla de ácidos grasos libres a una concentración final de 7.6 µeq/L (= 7.6 µM) en medio de cultivo celular] . Preparación de los Componentes de los Ácidos Grasos Individuales.

Cada componente individual se disuelve en EtOH al 100% como sigue: Palmítico Material de reserva 1 M, soluble en EtOH caliente Palmitoleico Material de reserva 1 M, fácilmente soluble en EtOH Esteárico Material de reserva 151 mM, soluble en EtOH calentado a 1 g/21 ml Oleico Material de reserva 1 M, fácilmente soluble en EtOH Linoleico Material de reserva 1 M, fácilmente soluble en EtOH Linolénico Material de reserva 1 M, fácilmente soluble en EtOH Estos materiales de reserva individuales se mezclan entonces para obtener la mezcla de FFA 100 mM. Las alícuotas de las FFAs individuales y la mezcla de FFA se hacen con el burbujeo de nitrógeno a través de las mismas para reducir la oxidación e incrementar la estabilidad. Los materiales de reserva se congelan a -20°C. Amortiguador de Perfusión Pl — El amortiguador de perfusión libre de calcio y magnesio (pH 7.2) con concentraciones finales como se especificó para cada uno de los siguientes componentes: NaCl 118 mM, KCl 4.7 mM, KP04 1.2 mM, pH 7.4 NaHC03 2.5 mM, EDTA 0.5 mM, glucosa 5.5 mM, albúmina de suero bovino (BSA) o de humano al 0.5% Acido ascórbico (50 µg/ml), insulina (4 µg/ml), dexametasona (1 µM) . Amortiguador de Perfusión P2 — Medio de Eagle modificado con Dulbecco o RPMI 1640 suplementado con BSA al 0.5%, ácido ascórbico (50 µg/ml), insulina (4 µg/ml) y dexametasona (1 µM) . DMEM — Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (Gibco) con glucosa, piruvato de sodio y L-glutamina y suplementado además con suero de bovino fetal al 5%, insulina (4 µg/ml) y dexametasona (1 µM) . Medio de Chee suplementado con el suplemento de cultivo ITS+™ (5 mls/500 mis) y dexametasona (0.1 µM) . Percoll (Pharmacia, catálogo #17089102) se diluye 9:1 con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco 10X.

Ejemplo 3 Estudios de Tejidos de Hígado Fetal Los hígados fetales llegaron en el amortiguador de transporte (descrito arriba) y en hielo. Se enjuagaron con un "amortiguador de lavado celular" que consiste de RPMI 1640 (Gibco) suplementado con insulina (Sigma; 5 µg/ml) , transferrina (Sigma; 5 µg/m de selenio (elementos de traza de espectro de masa de Johnson Matthey; 10"9M) , y una mezcla de ácidos grasos libres enlazados a la albúmina de suero de bovino en una proporción molar de 1:1. Los hígados fetales se colocan en un amortiguador de colagenasa durante 15-20 minutos y luego se presionan suavemente a través de un "cellector" (Sigma) con una rejilla de malla 800 para producir pequeños agregados de células; el "amortiguador de lavado celular" se utiliza para facilitar el proceso de disociación. Los agregados de las células se disocian completamente presionándolos a través de un filtro de 70 de mieras (formador de cepas celulares Falcon, 70 µm de nylon, catálogo #2350) utilizando el "amortiguador de lavado celular" para facilitar el proceso. Las células que pasan a través del filtro de 70 mieras se mantienen separadas de aquéllas que no lo hacen. .Ambas muestras se criopreservan y se verifican para la viabilidad del porcentaje utilizando el ensayo de exclusión de colorante azul de Tripano.

Ejemplo 4 Estudios del Tejido del Hígado de Adulto Los hígados se cateterizan por la vena portal, la vena cava, o por ambas, perfusionadas con los amortiguadores para eliminar la sangre; y luego se perfusionan con amortiguadores que contienen colagenasas/proteasas para disociar enzimáticamente las células. Después de la digestión, tomando usualmente 15-30 minutos dependiendo del tamaño del hígado, el tejido se presiona a través de una tela o estopilla o un filtro de nylon o se rastrillan con un peine para completar mecánicamente el proceso de disociación celular. Las células disociadas se enjuagan con un amortiguador que contiene suero para inactivar la colagenasa y otras enzimas utilizadas en el proceso de perfusión. Los amortiguadores de perfusión, Pl y P2, se colocan en un baño de agua a 37°C. La perfusión se realiza en una caja de perfusión tipo Miller, la cual se mantiene a 37°C durante todo el proceso de perfusión. Los amortiguadores se oxigenan durante la perfusión. Toda la tubería en la caja se enjuaga con etanol al 70%, seguido con agua destilada y luego con Pl para asegurar que el aire ha sido eliminado del sistema. El hígado se cánula utilizando una cánula de Teflon de una aguja de calibre 16 unida a una jeringa de 60 ml para enjuagar con el amortiguador Pl enfriado con hielo a través del hígado utilizando varios recipientes de sangre -T^rm.,.*.. *****..*,,.* ¿^^.^?& A m a m A^ Má disponibles en la superficie de corte del hígado para piezas grandes del hígado (100-300 gms) . Para los casos raros cuando un glóbulo del hígado completo se vuelve disponible, los remanentes de la vena cava se pueden canular. Los diversos vasos sanguíneos en los pedazos de hígado se prueban para saber cuál ofrecerá una perfusión óptima del tejido. Este procedimiento también remueve cualquier exceso de sangre del hígado. El vaso sanguíneo elegido se cánula y se sella en su lugar utilizando un adhesivo de grado médico (" superpegamento" grado médico). Todos los otros vasos grandes y aberturas de superficie se sellan utilizando el adhesivo grado médico, y, si se requiere, utilizando Q-tips con el adhesivo para ayudar a sellar las aberturas. Una vez que el adhesivo se ha secado, el espécimen de hígado se coloca en una malla de nylon dentro de un recipiente de vidrio de tamaño apropiado. Se agrega el amortiguador Pl al recipiente, y el hígado se sumerge en el amortiguador. El recipiente que contiene el hígado se coloca dentro de la caja de perfusión, y se une a la tubería de salida de la cánula. El amortiguador Pl se recircula durante 15 minutos iniciando a una baja velocidad de aproximadamente 24 mls/min. y luego incrementando lentamente a entre 58 mls/min. y 90 mis/minuto para optimizar una velocidad de flujo con una retro-presión aceptable. Se debe verificar qof no haya goteo excesivo del perfusionado del hígado. Después de 15 minutos, el amortiguador Pl se remueve del recipiente y se reemplaza con el amortiguador P2 que contiene la colagenasa. El amortiguador P2 se recircula hasta que el hígado está suficientemente digerido (evaluado mediante la conversión de color del hígado del café rojizo obscuro al café pálido y mediante la adquisición de una textura blanda al hígado) . El amortiguador P2 se recircula durante no más de 20-25 minutos. Una vez que ha terminado la perfusión, el amortiguador P2 se drena del recipiente y el hígado se transfiere en el recipiente a una campana biológica. El medio de cultivo celular (DMEM) se agrega al recipiente, y la cánula y al adhesivo se remueven conjuntamente con cualquier región no digerida del hígado. La cápsula del hígado (cápsula de Glisson) se rompe utilizando pinzas de tejido y tijeras. Esto permite la liberación del tejido digerido hacia el medio saliente detrás del tejido conectivo y de cualquier material no digerido. El material digerido se coloca dentro del DMEM y luego se filtra a través de una serie de filtros de tamaño diferente. Los filtros se colocan dentro de un embudo grande para ayudar la filtración. El material digerido se filtra ^. ¿.^-A. . aft?ato|B)[.)ty . ,tt^fnrfatr , .-..-11f ^ <¡rr1 j jgaafe^a. ^^^^.^^á, .^^^«^ili ff ijgjrr |f|ffc-^g^*fe-«aafea. primero con una sola capa de tela para estopilla, seguido por un filtro de nylon de 400 µm, y finalmente a través de un filtro de Teflon de 70 µm. El filtrado se divide igualmente en tubos de centrífuga y se centrifuga a 70 g durante 4 minutos. Después de la centrifugación, antes de la adición de Percoll, el sobrenadante se refiere como la Fracción 1 (Fl) . A las pelotillas de células, se agrega DMEM y Percoll isotónico para dar una proporción final de 3:1 respectivamente. Por ejemplo, una pelotilla pequeña de células empacadas de 5 ml de volumen se suspendería en 30 mis de DMEM y 10 mis de Percoll isotónico. La muestra se centrifuga a 100 g durante 5 minutos. Se obtiene el sobrenadante: la capa superior se refiere como la Fracción 2 (F2) . La capa media del Percoll se refiere como la Fracción 3 (F3) . Las pelotillas de células que permanecen en la Fracción 4 (F4) . Las células de las fracciones diferentes se suspenden y se evalúan para viabilidad utilizando el ensayo de exclusión de tinte azul de Tripano. Las viabilidades de estas fracciones diferentes se presentan en la Tabla 3, junto con sus viabilidades después de la criopreservación. Se retuvieron las células que permanecen unidas al árbol vascular o biliar del tejido del hígado que siguen a la perfusión del hígado. Estas células se encontraron en la suspensión original de las células obtenidas después de la perfusión enzimática, y se dejan típicamente en la parte superior de los tamices (por ejemplo estopilla) después de pasar a través de las células en suspensión. Estos remanentes del árbol vascular y biliar se procesan nuevamente con enzimas y las células resultantes se conjuntan con las otras células. La fraccionación con Percoll se utiliza rutinariamente por la mayoría de los investigadores para eliminar lo que se asume como desechos y células muertas; solamente se preservan las pelotillas finales. La variación novedosa para la rutina de perfusión, como se describe aquí, es que las pelotillas se descargan y las células con una densidad de flotación inferior (es decir, las células que se colectan en la parte superior del gradiente) se retienen y se usan para estudios posteriores. Estas células son células parenquimales más jóvenes y tienen una facilidad mucho mayor de congelamiento (ver sección de criopreservación) .

Ejemplo 5 Experimentos de Criopreservación. Los hígados utilizados para las metodologías de criopreservación se derivaron de donadores tan jóvenes como hígados fetales (edades de gestación de 12 semanas a 25 semanas) y tan viejos como 77 años de edad. "Amortiguador Criopreservativo Novedoso" • Viaspan (Dupont Catálogo # 1000-46-06) suplementado con suero humano al 2% (Gibco) o suero de bovino fetal (Biowhittaker) . • Criopreservativo al 10% [dimetiisulfóxido (Sigma Catálogo #D5879 ó D8779) utilizado exclusivamente para las células parenquimales maduras o dimetiisulfóxido o glicerol (Sigma Catálogo # G6279) utilizado para los progenitores] . • El amortiguador se suplementa adicionalmente con antibióticos (penicilina a 200 U/ml; estreptomicina a 100 µg/ml) , • El amortiguador se suplementa adicionalmente con hormonas y factores de crecimiento: insulina (5 µg/ml), transferrina (5 µg/ml) , factor de crecimiento epidérmico (50 µg/ml), FGF (10 ng/ml), IGF II (10 ng/ml). • El amortiguador se suplementa adicionalmente con lípidos: ácidos grasos libres (7.6 µM/I) enlazados a la albúmina de suero bovino (BSA) o albúmina de suero humano (HSA) y lipoproteína de alta densidad (10 µg/ml) .

• El amortiguador se suplementa adicionalmente con elementos de trazas (selenio (10"9M), cobre (10"7M), zinc 5 x 10"u M) ) y un antioxidante, (por ejemplo una porforina que es un mimético de la superóxido dismutasa, utilizado a 10 µg/ml; ácido ascórbico, utilizado a aproximadamente 0.1 mg/ml; o cualquier antioxidante conocido en la técnica) . La variación en la composición, como se describe aquí, es para combinar los nutrientes clave, lípidos, hormonas y factores del crecimiento que se identificaron como parte del medio definido hormonalmente, libre de suero, preparado especialmente para las células del hígado. El amortiguador novedoso resulta en viabilidades de las células del hígado para las fracciones F4 que son tan bajas como 50% (de muestras muy pobres) a tan altas como 80% (ara buenas muestras) . Las viabilidades de las fracciones F1-F3 están consistentemente por arriba del 80%, un hecho que se sospecha es debido a que estas fracciones tienen células más jóvenes con estados ploides y actividad metabólica más conductiva a la síntesis de componentes de la matriz extracelular y/u otros factores celulares para la viabilidad y el crecimiento; así, se considera que son más fáciles de congelar. El uso de un mimético de superóxido dismutasa en i.l. . ? ..i dfajfc .j- ijA** ,... Jaiftj . -.,^?a¡^^,;te.ia^ el amortiguador incrementó la viabilidad de las células por 5-10%. Una alterna tiva a lo de arriba es : • utilizar un amortiguador modificado en el cual el Viaspan se elimine y el medio basal (tal como RPMI 1640) se suplemente con insulina (5 ug/ml), transferrina (5 ug/ml), ácidos grasos libres (7.6 µM/1) enlazados a BSA, lipoproteína de alta densidad (10 µg/ml), traza (selenio (10"9M), cobre (10~7M), zinc 5 x 10"11 M) ) y un antioxidante • el revestimiento de las células con una forma de matriz extracelular tal como el colágeno tipo IV mezclado con laminina, o el colágeno tipo I o tipo III mezclado con fibronectina. Las células de hígado fetal, procesadas como se describió arriba, se suspenden en el amortiguador de criopreservación (descrito arriba) , se toman en alícuotas en crioviales de 3 ml a 5-10 x 106 células/ml y se mantienen bajo esas condiciones durante 1-2 horas. Las células se congelan entonces a temperaturas de nitrógeno líquido de -100°C a -180°C, preferiblemente -160°C utilizando un congelador de velocidad controlada por computadora (Forma Cryomed) y luego se almacenan en un tanque de almacenamiento de nitrógeno liquido (-160°C), en fase grande de vapor. Las células sobreviven bien al proceso y no ocurre una pérdida significativa de viabilidad durante los periodos de almacenamiento que varían desde 50-270 días (ver Fig. 3) . Las fracciones de las células de hígado adulto (Fl- F4) se encontraron que contenían distintas poblaciones celulares: Fl contiene desechos, células rojas de la sangre, células de estelato hepático, y células hepáticas pequeñas (< 10 µ) que son probables poblaciones de células progenitoras (de ya sea linajes hepáticos o hemopoyéticos) ; la fracción F2, la parte superior de la solución Percoll, contiene células hepáticas más grandes (10-15 µ) que son diploides, células parenquimales pequeñas; la fracción F3 en la parte inferior del Percoll contiene células parenquimales aún más grandes (15-25 µ) que consisten de una mezcla de células diploides y tetraploides; y la fracción F4 (aquélla utilizada por todos los demás investigadores) que consiste de las más grande se las células parenquimales (25-50 µ) y que son enteramente poliploides (tetraploides y octaploides) . En general, las células parenquimales en la fracción F1-F3 tiene una viabilidad después del congelamiento de 85-95%; las células parenquimales en la fracción F4 tienen una viabilidad de 50-80% después del congelamiento (dependiendo de las condiciones del hígado luego de la llegada) . Las variables identificadas que influyen la viabilidad de las células parenquimales en la fracción F4 son: 1) la edad del donante (entre mayor sea la edad del donante, peor será el pronóstico para las células); 2) el tiempo entre el "tiempo de sujeción" y el suministro al laboratorio (entre más corto sea mejor) ; 3) el estado de salud del tejido antes de la remoción (es decir, la condición isquémica severa confiere un mal pronóstico) . Estos factores son interactivos tal que el rápido suministro del tejido desde un donante de mayor edad puede ser más atractivo que el tejido de un paciente joven que ha tomado mucho tiempo en tránsito.

Tabla 5. Las viabilidades promedio y las eficiencias de unión de los hígados fetal y de adulto con criopreservación y el % de progenitores hepáticos (células AFP+) en la suspensión celular.

El rango extremo de viabilidades de las fracciones F4 tanto después del procesamiento como después del congelamiento son debido a las longitudes variantes del tiempo entre el "tiempo de sujeción" y la recepción de las muestras de laboratorio y también a las condiciones variantes del hígado (fibrótico, isquémico, etc.). En general la fracción F4 es la más sensible a los caprichos del tratamiento de los hígados y la salud general del tejido. Notablemente, las fracciones F2 y F3 fueron rutinariamente viables y se criopreservaron fácilmente aún cuando se obtuvieron de especímenes del hígado, pobres. Las fracciones Fl fueron más variables, conteniendo una gran cantidad de desechos, gotas de grasa e sí como numerosas células pequeñas que incluían tanto células parenquimales pequeñas (que se supone que incluyen progenitores hepáticos) y varias subpoblaciones hemopoyéticas (es decir, eritrocitos) .

Tabla 6. Criopreservación : Hígado Fetal • > 200 procesado • Rendimiento Tejido recibido *> aprox. !08 células por gramo de tejido procesado (por la edad del donador) • Viabilidad * 12 semanas: aprox. 1 mL de células Procesamiento: 75-85% empacadas Descongelamiento: > 95% 16 semanas: aprox. 15-20 mis de * Clasificación: > 90% células empacadas = 0.5-1 gm de * En cultivo: > 90% tejido 24 semanas: aprox. 4.5 gms Tabla 7. Criopreservación: Hígado de Adulto > 80 procesado • Viabilidad (procesamiento) • Recibido 100-200 F 1 : >75% (> 12 µ) • gramos por hígado F2: >90% (12-15 µ) (de 2.5-3 kg/hígado) * F3: >90% (15-25 µ) • Rendimiento: F4: >75-80% (25-50 µ) 7 R 10 -10 células por gramo de tejido • Viabilidad (congelamiento) F1-F3: > 80% buena unión *> F4: 56% unión pobre Ej emplo 6 Citometría de Flujo Las células se hicieron pasar en una sola fila a través de un flujo celular en donde se expusieron a luz láser. El volumen aproximado de cada célula se determinó mediante "dispersión delantera", o la cantidad de luz que se refracta conforme el haz se intersecta. La luz dispersada, "dispersión lateral" de las estructuras celulares internas tales como el núcleo, los cuerpo de Golgi del retículo endoplásmico, las vesículas, etc., se utilizan para determinar la cantidad de complejidad interna (es decir una célula activa y una célula más madura que contiene más componentes internos que una joven o quiescente) . La información más selectiva sobre las características celulares se obtiene mediante el enlace altamente específico, característico de los antígenos a los complejos de proteína sobre la superficie celular. Estos anticuerpos se pueden enlazar covalentemente a las moléculas fluorescentes tales como Isotiocianato de Fluoresceina (FITC) , Picoeritrina (PE) , y conjugados en tándem de PE y Citocromo que se excitan mediante haces láser, generando luz emitida a longitudes de onda específica para cada fluoróforo. Mediante la selección de un panel de cromóforos distintivos se seleccionan conjugados a poblaciones celulares de anticuerpos específicos de interés. Las células se analizan en base a su entrada de parámetros. Una variedad de dispositivos de colección se utilizan para colectar las células deseadas, que incluyen los tubos cónicos y Eppendorf, y placas multi-pozos de cualquier tamaño a una velocidad de hasta 40,000 eventos por segundo o superiores.

Anticuerpos y reactivos utilizados en los procedimientos de teñido Anticuefo Proveedor, Cat. # Lote # AFP anti-humano de cabra Chemicon, AB635, C4P168 Thy de humano de ratón X monoclonal Chemicon, MAB 1294, 293 CCD Conjugado AFP-PE antihumano de Chromaprobe, P41020, A45P7 ratón monoclonal Anti-Cabra de Conejo Biotinilado Vector Laboratories, BA-5000, J0313 Anti-Cabra de Conejo Biotinilado Jackson Immunochemicals, 200- 152-096, 25985 Conjugado de Estreptavidina/AMCA Jackson Immunochemicals, 016- 150- 184, 40001 Conjugado AMCA de anti-oveja de Jackson Immunochemicals, 713-156-4732202 asno Conjugado CY5 anti-Cabra de Asno Jackson Immunochemicals, 705-156-147, 38756 IgG de Cabra Jackson Immunochemicals, 005-000-002, 38837 IgG de Oveja Jackson Immunochemicals, 013-000-002, 39945 Albúmina anti-humana de oveja Serotec, ABP 102, 210498 Anti-humano monoclonal de ratón: Conjugado CD14/Tri Color Pharmingen ICAM Pharmingen Conjugado CD34/FITC Pharmingen 34374X Conjugado CD38/IPE Pharmingen 31015X Conjugado CD38/FITC Pharmingen 31014X Conjugado de Glicoforina A PE Pharmingen 32591 A Conjugado CD 45/PE Pharmingen 31255X Conjugado CD 45/FITC Pharmingen 31254X IgGl PE de controles isotipo Pharmingen 33815X FITC de IgG2 Pharmingen 33814X Conjugado c-Kit PE Caltag MHCK04 Conjugado AFP-FITC Humano de Accurate YNRH Conejo X listada AFP No conjugado anti-humano de " AXL625 061 cabra 7 Amino Actinomicina D (7 AAD) Mol Probes A-l 310,4981-1 Soluciones principales utilizadas en las preparaciones celulares para la citometría de flujo: BSA: albúmina de suero bovino (Pentex V) PBS = solución salina amortiguada con fosfato; FBS = suero de bovino fetal; AFP = alfa-fetoproteína Medio de Eagle Modificado con Dulbecco con Hormonas : HC_DMEM 500 mL de DMEM, alta glucosa sin rojo fenol 25 mL de suero de bovino fetal (FBS) 20 mL de EGTA 5 mM Insulina (5 µg/ml), transferrina (5 µg/ml) Elementos de trazas [selenio (10"9M) , cobre (10"M), zinc 5 x 10"11 M) ] Antibióticos (Penicilina-100 µg/ml, estreptomicina- 100 µg/ml) 500 mg de albúmina de suero bovino (BSA) 30 mg de DNasa 38 µL de mezcla de ácido graso libre enlazado a BSA. Filtrado estéril a través de una unidad de filtración Nalgene con poros de 0.2 µm **m**ií? *l.*^ *??-.á.j ~~mm?mi**?*Ata..a,A»»^k Versión modificada de la Solución Salina Amortiguada de Hanks: HBSS -mod 50 mL de HBSS 10X 10 mL de Hepes ÍM Penicilina-100 µg/mL/Estreptomicina-100 µg/mL 500 mg de BSA 30 mg de DNasa Adición hasta 400 mL pH hasta 7.3 Parte superior hasta 500 mL Filtro Estéril a 0.2 µm Amortiguador de Bloqueo para la Inmunoquímica 100 mis de HBSS-mod 2.2 mL de gel de pez telostean al 45% y 0.8 g de BSA 0.5 mL de saponina al 1% en HBSS Medio de montaje para el Microscopio inmunofluorescente 0.5 mL de PBS 2X 0.25 g de galato de n-propilo 5.7 g de glicerol Ejemplo 7 Procedimientos para la preparación del tejido de hígado congelado para la citometría de flujo El tejido de hígado congelado se descongeló rápidamente a 37°C. Cada criovial de hígado (cada uno conteniendo aproximadamente 3 mL del amortiguador que contiene 5-10 X 106 células/mL) se lleva hasta 10 mL a una velocidad de 1 mL por min. en hielo con KC-DMEM. La muestra se centrifuga entonces a 1200 RPM durante 5 min. a 4°C. El sobrenadante se descarga, y las pelotillas de células se resuspenden en 5 mL de HC-DMEM. El lavado de las células se repite hasta que el sobrenadante se vuelve claro. Entonces las células se contabilizan y se evalúan las viabilidades con un hemocitómetro utilizando el ensayo de exclusión de tinte azul de tripano. Las células se dividen en fracciones de acuerdo al protocolo experimental. Los tubos estándar se preparan para los datos de control que contienen entre 1 y 2 X 106 células, usualmente logrado tomando 200 µL para cada uno de una suspensión de células de 5-10 X 106/mL. Se necesitan los tubos estándar: 1) OCS. Suspensión de células originales que consiste de células de control no teñidas. 2) FITC solo para los ajustes de compensación. Agregar 5 µL de anti-glicoforina A etiquetada con FITC a 200 µL de la suspensión de células. Alternativamente está un cóctel de CD34, CD38 y CD45 etiquetado con FITC, 7 µL de cada uno en 200 µL de células. 3) PE solo para los ajustes de compensación. Uso de una Glicoforina-PE (2 µL a 1 mL de HC_DMEM y agregar 30 µL de esta a 200 µl de células) . 4) 77AAD solo para compensación. Una buena señal se genera fijando 200 µL de la suspensión de células con paraformaldehído al 2% y luego se agregan 5 µL de 7AAD 100 µM y 5 µL de detergente (saponina al 1%) a una suspensión de 1 L de estas células en HBSS_mod. Las células permeabilizadas se tiñen intensamente con 7AAD. 5) Cy5 solo para la compensación de 200 µL de células fijadas (paraformaldehído al 2%) se incuban durante 40 min. en suero de cabra al 2% para etiquetar las superficies celulares con IgG de oveja. Las células se incuban entonces con IgG de anti-cabra de asno conjugado con Cy5 (1:800) durante 40 min. 6) AMCA solo para la compensación. Como con el 7AAD, una señal artificialmente intensa se genera para los ajustes de compensación. 200 µL de células fijadas (paraformaldehído al 2%) se incuban durante 40 min. en suero de oveja u oveja al 2% para etiquetar las superficies celulares con IgG de oveja. Las células se incuban entonces con IgG de anti-oveja de asno conjugado con AMCA (1:800) durante 90 min. 7) Controles AMCA/Cy5. Se incuban células fijadas (paraformaldehído al 2%) y permeabilizadas (saponina al 0.05%) con IgG de anti-oveja de asno conjugado con AMCA (1:800) e IgG de anti-cabra de asno conjugado con Cy5 durante 90 min. 8) Controles de isotipo monoclonales. Se incuban las células con un conjugado de IgGl PE de ratón y un conjugado de IgG2 FITC de ratón. Las concentraciones deberán corresponder a aquéllas utilizadas para etiquetar analíticamente y para clasificar los tubos. 9) Controles de isotipo intracelulares. Se incuban células fijadas (paraformaldehído al 2%) y permeabilizadas (saponina al 0.05%) con IgG de oveja no inmune e IgG de cabra durante 90 min. como controles para los anticuerpos utilizados para la identificación de albúmina y alfa- fetoproteína. Se continua con la incubación con el IgG de anti-cabra de asno conjugado con Cy5 e IgG de anti-oveja de asno conjugado con AMCA durante 90 min. Los tubos clasificados se preparan para la adquisición de poblaciones de células seleccionadas que expresan combinaciones particulares de los marcadores CD. Normalmente estos tubos contienen 50-70 X 106 células. Las células se resuspenden en 1 mL de amortiguador de teñido que comprende HC_DMEM + BSA al 1% + 7AAD 500 pM (5 µL del material de reserva 100 µM) . Entre 15 y 25 µL cada uno de CD 34 FITC, CD38 PE, ó CD 45 PE se agregan al amortiguador de teñido de acuerdo a los números de células (normalmente 3 µL del anticuerpo Pharmingen por 10 X 106 células) . El anticuerpo para el c-Kit se agrega a una dilución 1:60, la glicoforina A se utiliza a una dilución de 1:500. Se tiñe durante 40 min. sobre hielo en la obscuridad. Después del teñido se lavan las células dos veces con HBSS-mod y se fijan con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min. en hielo . Ejemplo 8 Teñido Intracelular para la Clasificación de Células Para el teñido intracelular de las células para el análisis de alfa-fetoproteína (AFP) mediante citometría de flujo la suspensión de células se permeabiliza con una mezcla de saponina (Sigma S4521) 0.05% en HBSS_mod durante 10 min. en hielo. Las células se bloquean entonces en una mezcla de HBSS_mod que contiene gel de pez teleostean al 1% y BS al 0.8% y saponina al 0.005% durante 20 min., seguido por incubación con AFP anti-humano de cabra y albúmina antihumana de oveja (ambos 1:800 en el amortiguador de bloqueo) durante 90 min. a temperatura ambiente en la obscuridad. Las células se lavan dos veces con HBSS_mod que contiene saponina al 0.01% seguido por la incubación con IgG de anticabra de asno conjugado con Cy5 e IgG de anti-oveja de asno conjugado con AMCA durante 90 min. Alternativamente, siguiendo el anticuerpo primario, las células se incuban con IgG de anti-cabra de conejo biotinilado (1:500 en amortiguador de bloqueo que contiene suero de humano al 2% y saponina al 0.01% durante 90 min. a temperatura ambiente en la obscuridad) . Esto es seguido por 2 lavados con HBSS_mod que contiene saponina al 0.01% y luego la incubación con 9 µg/mL de conjugado de estreptavidina/Cy5 en saponina/HBSS-mod durante 90 min. a temperatura ambiente en la obscuridad. Finalmente, las células se lavan 2 veces con HBSS-mod y se resuspenden en HBSS-mod, se filtran a través de un tamiz de 50 µm para remover los aglutinantes de células para análisis y clasificación en el citómetro de flujo. Si se pretende la selección de los progenitores hepáticos, la inmunoselección incluye remover las células que son poliploides y/o expresar los marcadores asociados con las células hemopoyéticas maduras a partir del hígado tal como glicoforina A en las células rojas de la sangre.

Adicionalmente las células que muestran CD45, que se expresan en todas las células hemopoyéticas; las células que muestran los marcadores asociados con las células hepáticas maduras tales como la connexina 32, la cual se encuentra en todos los hepatocitos y células biliares, y las células que expresan los marcadores asociados con las células mesenquimales maduras, tales como los retinoides en las hepáticas en forma de estrella o el Factor de von Willebrand o el Factor 8 en el endotelio, todos se remueven.

Ejemplo 9 Teñido Inmunohistoquímico de las Poblaciones de Células Clasificadas . Las células se tiñen para alfa-fetoproteína después del análisis y se clasifican mediante el citómetro de flujo. Las fracciones de células clasificadas se colectan en HBSS-mod al 0.3% que contiene BSA al 1%. Luego de regresar al laboratorio se ajusta el volumen de muestras recolectadas para proporcionar 0.5 X 106 células/mL y alícuotas de 200 µL se someten a centrifugación sobre porta-objetos de microscopio con el aparato Shandon Cytospin. Las preparaciones del porta-objetos citocentrifugadas se secan al aire y se almacenan para un teñido posterior para la alfa-fetoproteína y/o albúmina. Las células unidas "disco" del porta-objetos del microscopio se forman como un anillo con una barrera de caucho para producir un "pozo" para la aplicación de reactivos inmunohistoquímicos . Los porta- objetos se enjuagan en amortiguador tris (tris 10 mM con "bajo contenido de sal" con NaCl al 0.9% a pH 7.4) que contiene Tritón X al 0.3% durante 10 min., seguido por 10 min. en Tris solo con bajo contenido de sal. Las células se bloquean entonces en suero de conejo al 10% contenido en una solución bloqueadora de gel de teleostean descrito arriba durante 90 min. a temperatura ambiente. Después de dos lavados en Tris con bajo contenido de sal, las células se incuban durante toda la noche a 4°C con anticuerpo AFP anti-humano de cabra diluido a 1:100 en amortiguador de bloqueo que contiene suero de conejo al 2%. Dos lavados en amortiguador Tris son seguidos entonces por una incubación a 90 min. con IgG de anti-cabra de conejo biotinilado (1:200 en el amortiguador de bloqueo a temperatura ambiente. La incubación al final con el complejo de estreptavidina/AMCA (9 µg/mL en amortiguador Tris con bajo contenido de sal) se utiliza para localizar la inmuno- reactividad similar a AFP a través del enlace de fluorocromo de AMCA con el anticuerpo de conejo biotinilado. Después de 2 lavados con el amortiguador Tris las preparaciones de células se dejan cercanas a la sequedad antes de deslizar la cubierta bajo un medio de montaje de anti-intensidad (0.25 g de galato de n-propilo en 5.7 g de glicerol con 1 mL de PBS) . Cuando sea apropiado, las células se tiñen doblemente para la albúmina incluyendo un anticuerpo anti-humano de conejo conjugado con rojo Texas contra la albúmina con el anticuerpo de anti-fetoproteína primario. Los porta-objetos de control se preparan omitiendo el anticuerpo primario o el anticuerpo secundario para demostrar la no etiquetación de AMCA en la ausencia de ya sea el anticuerpo de anti-alfa-proteína o el anticuerpo secundario biotinilado. Los porta-objetos se etiquetan con microscopio de epifluorescencia utilizando la excitación UV del tinte AMCA que emite luz en la región azul (450 nm) .

Ej emplo 10 Terapia de células y/o genes. Puesto que el activador de plasminógeno de la urocinasa humana (uPA) puede activar el plasminógeno a través de las especies un vector adenoviral recombinante que expresa la urocinasa humana del promotor RSV-LTR, se construye el Ad-RSV-uPA con el objeto de inducir la regeneración del hígado. Para la construcción y producción de los vectores adenovirales recombinantes, el ADNc para el uPA humano se prepara como sigue. El fragmento de 1.326 kb de Hindlil/Aspl718 uPA que contiene la secuencia que codifica la proteína se inserta en los sitios Hindill/Asp718 de pXCJL.l bajo el control transcripcional del promotor LTR del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) , y en la dirección 5' de la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. El virus se prepara después de la co-transfección con pJM17 y el vector designado Ad-RSV-uPA. La selección para el Ad-RSV-uPA se realiza mediante la amplificación de las placas individuales en 293 células. Tres días después de la infección el sobrenadante se prueba para el uPA reactivo, inmunológico, mediante ELISA y la actividad fibrinolítica mediante el ensayo en placas de fibrinas demostrando la actividad catalítica del uPA producido luego de la infección con Ad-RSVuPA. El virus purificado se almacena en alícuotas a -80°C y se diluye de manera fresca con el medio HGDMEM antes de la inyección. Los títulos virales se determinan mediante mediciones OD y el ensayo de placa estándar. La construcción de los vectores se realiza esencialmente como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,980,886. Los virus se titulan en células 208F.

Los ratones hembra C57BL/6 de 5 a 6 semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se almacenan en un medio ambiente libre de patógenos, específico. Las muestras de hígado isquémico a varios periodos de tiempo se obtienen a partir de ratones sometidos a eutanasia y los progenitores del hígado se aislan como se describió arriba. Para la canulación de la vena portal, los ratones receptores se anestesian mediante una administración intraperitoneal de 0.5 ml de 20 mg/ml de 2, 2, 2-Tribromoetanol . Se realiza una incisión en la línea media abdominal y la piel se separa del peritoneo para crear una bolsa subcutánea. El peritoneo se abre y se expone la vena portal. Se inserta un tubo de silicón (0.02" D.I., 0.037" D.E., S/P Grado Médico, Baxter, 111.) en la vena portal y se perfusiona con solución salina heparinizada. Posteriormente, la cánula se inserta a través del peritoneo y se asegura con una sutura de seda 4.0. La cánula de 3 cm de longitud se coloca en el extremo distal y se coloca subcutáneamente en la bolsa creada previamente. A los ratones se les dan las células progenitoras infectadas con el virus no antes de las 24 horas posteriores. En algunos ratones la canulación de la vena portal se realiza junto con una hepatectomía de 2/3. Se realiza entonces la hepatectomía parcial. Para perfusionar la vena portal los ratones se anestesian, la piel se abre en el sitio próximo de la incisión abdominal ya existente. La cánula se expone y se conecta a una bomba de jeringa. Para la infusión del virus, los preparados de adenovirus en DMEM se inyectan durante 5 a 10 min. en la vena portal a través de la cánula. Todos los análisis bioquímicos e histológicos se realizan después de la inyección de los progenitores hepáticos infectados con el adenovirus en la vena portal a través del cánula. El ensayo ELISA para la uPA se basa en dos diferentes anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio catalítico y de enlace al receptor de uPA. Uno de los anticuerpos monoclonales se etiqueta con peroxidasa. La proteína total del suero y la albúmina se analizan mediante métodos automatizados de rutina en los laboratorios de patología clínica. La infusión del adenovirus en la vena portal de los ratones C57BL/6 se conoce que resulta en la traducción de 100% de los hepatocitos con más de 1 copia del ADN adenoviral por célula. La misma dosis del Ad-RSV-uPA da como resultado una mortalidad del 90% que al menos en parte está relacionada a la hemorragia. Cuando se usa una dosis disminuida de Ad-RSV-uPA, la taza de mortalidad es menor del 5% y esta dosis se selecciona para les experimentos de regeneración del hígado. La infusión del Ad-RSV-uPA da como resultado las elevaciones transientes de la urocinasa de suero alcanzando un valor máximo de aproximadamente 350 ng/mi (70 a 100 veces más grande que los niveles endógenos) cuatro días más tarde después de caer a concentraciones anteriores por el día 12. El enjuague en uPA también está asociado con un incremento en las concentraciones de SGPT del suero. A tiempos variantes después de la infusión del adenovirus, los animales se infusionan con 3H-timidina, y la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN del hígado se determina como un medio para la proliferación cuantitativa de células. Los animales tratados con Ad-RSV- uPA tuvieron un periodo incrementado de absorción de timidina que empezó en el día 3 y persistió durante 8 días. Así, el periodo de absorción de 3H-timidina hepática con el tratamiento de Ad-RSV-uPA/células ovales es mucho mayor que aquél obtenido con la hepatectomía parcial. Los receptores del adenovirus de control negativo mostraron un máximo de 3H-tim?dina hepática en el día 4 que volvió a los niveles de base 24 horas más tarde y a una elevación mínima en la absorción de 3H-timidina en el día 11. En resumen, el daño hepático como se midió por los niveles de SGPT y las tasas altas de 3H-t?midina se atribuye a la producción de urocinasa intrahepática indicando que la regeneración biosintética del hígado significativa se lleva a cabo. Las células progenitoras hepáticas infusionadas sin uPA son mejores que el adenovirus sin el inserto de uPA. Los hallazgos histológicos microscópicos de animales tratados con los adenovirus recombinantes/progenitores derivados de donadores de cadáveres sin corazón latiente indican que por el día 3 los ratones tratados tuvieron un infiltrado inflamatorio moderado que contenía macrófagos y neutrófilos. Los cambios degenerativos en los hepatocitos incluyeron la vacuolización, picnóticos y pocos núcleos mitóticos. De 8 a 10 días después de la administración de Ad-RSV-uPA/células ovales hay evidencia de recuperación hepática incluyendo la presencia de regeneración multifocal, tamaño heterogéneo de los núcleos, y una reacción inflamatoria muy disminuida con poca degeneración de hepatocitos. Por la tercera a cuarta semanas, el infiltrado se resolvió y el hígado aparece normal. En total, estos estudios demuestra que la expresión de urocinasa en combinación con los progenitores hepáticas indujo una regeneración celular parenquimal del hígado, significativa.

Ejemplo 11 Cito-reducción mediante Centrifugación Percoll Este ejemplo proporciona métodos para el enriquecimiento de los progenitores del hígado, incluyendo las células progenitoras del hígado, progenitoras no asignadas, y progenitoras asignadas. Las variaciones de estas técnicas son conocidas por aquellos hábiles en la técnica y son igualmente adecuadas en tanto que son compatibles con el objetivo de la suspensiones de las células del hígado de la cito-reducción para proporcionar una población enriquecida de progenitoras. Una suspensión de células únicas substancialmente de las células del hígado en el medio de cultivo, por ejemplo el medio basal de Eagle (BME) , se aplica a la parte superior de una capa de Percoll al 15% preparada en BME. Utilizando una centrífuga Sorvall RT7 y un rotor de 14 cm, u otra combinación de centrífuga con rotor equivalente, los gradientes se centrifugan de 600 a 1200 rpm, preferiblemente 750 a 1000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se recolecta y se centrifuga otra vez, pero a 1200 a 2000 rpm, de manera preferible aproximadamente 1500 rpm. La fracción sobrenadante se enriquece en los progenitores y las pelotillas (fracción F3) que contiene las células capaces de al menos un ciclo celular. Las células sobrenadantes se recolectan separadamente y se centrifugan otra vez, de 2000 a 3000 rpm, de manera preferible aproximadamente 2500 rpm. En esta última centrifugación, las células progenitoras frecuentemente se sedimentan las regiones superiores del Percoll, dejando desechos celulares en los niveles celulares, y la pelotilla tiene células capaces de varios ciclos de mitosis. La fracción Percoll es adecuada para uso inmediato, la criopreservación, establecimiento en el cultivo, o enriquecimiento adicional. El enriquecimiento adicional se puede complementar mediante cribado, selección por afinidad, clasificación por FACS o cualquiera de las técnicas conocidas en el arte como se describió arriba. La selección negativa se complementa mediante la remoción de células que expresan marcadores para CD45, glicoforina A, u otros marcadores como se menciona abajo. La selección positiva se complementa mediante la selección de células que expresan CD14, CD34, CD 38, ICAM u otros marcadores indicativos de la expresión de la alfa-fetoproteína de longitud completa, la albúmina, o ambas.

Ejemplo 12 Preparación de las Células Progenitoras mediante Elutriación Este ejemplo proporciona las etapas para un aislamiento de las células progenitoras del hígado asignadas y no asignadas. Mientras que se conocen varias técnicas en el arte, una de las modalidades preferidas se describe en detalle con el entendimiento de que otras técnicas de preparación son igualmente adecuadas en tanto que estén de acuerdo con los objetivos deseados. Para los ejemplos de las técnicas no limitantes, preferidas, ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,807,686, 5,916,743, 5,672,346, 5,681,559, 5,665,557, 5,672,346, y 5,663,051 como se incorporan aquí a manera de referencia. Las células del hígado pequeñas, hepáticas, pluripotentes o asignadas, se pueden aislar preliminarmente utilizando ya sea Percoll u otros gradientes de densidad adecuados tales como Histopaque, y después de la centrifugación, se lavan dos veces con el medio y se resuspenden en 10 ml del medio de elutriación. Para la elutriación a contraflujo, las células mononucleares pequeñas lavadas se inyectan vía un acoplador de sitio de muestreo en la corriente de entrada de una centrífuga Beckman J6M/E equipada con rotor JE-5 y una cámara estándar. Sin embargo, cualquiera de un número de centrífugas de flujo continuo, comercial, y elutriadores que emplean preferiblemente insertos de plástico, desechables, que incluyen medios de cámara para facilitar la separación a base de la densidad se pueden utilizar, tales como el "Fenwal Models CS 3000" y Autopheresis C" vendidos por Baxter International Inc. de Deerfield, IL; o Spectra Apherisis v 7/6, vendido por Cobe manufacturing of Lakewood, CO. La elección de los instrumentos depende de alguien con habilidades en la técnica. Una bomba peristáltica (Colé Palmer Instruments, Chicago, IL) proporciona el flujo continuo del medio de elutriación, el cual es una solución salina normal al 0.9% con 100 mg/dl de D-glucosa, ácido etilendiaminotetraacético de disodio 0.3 Mm (EDTA) y 50 mg/dl de albúmina de suero de bovino con pH ajustado a 7.2. El medio se esteriliza antes del uso. Las células se suministran a una velocidad de flujo total de 15 ml/min., velocidad del rotor de 900 g y a temperatura ambiente. Después se recolectan 100 ml del eluato, la velocidad de flujo se incrementa 25 ml/min. Con la velocidad del rotor se mantiene constante, las velocidades de flujo se incrementan a 29 ml/min., 33 ml/min., y 37 ml/min., se recolectan 200 mL con cada incremento. Las células que permanecen en la cámara se capturan apagando el rotor y lavando la cámara con 100 ml del medio de elutriación. Cada fracción de célula se lava y se centrifuga a 300 g durante 10 minutos. Se colectan las fracciones adecuadas, la viabilidad se determina mediante exclusión con tinte azul de tripano y las células recuperadas se determinan con un contador de células (Coulter Electronics, Hialeah, FL) . Alternativamente las células del hígado no se separan mediante la separación con gradiente de densidad y se suspenden en una solución salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7.4, que contiene suero de ternero fetal al 5%, EDTA al 0.01% peso/volumen, y 1.0 g/1 de D-glucosa, y se inyectan en un sistema de elutriación centrífugo a contraflujo Beckman a 10°C a una velocidad de rotor de 1,950 rpm utilizando un rotor JA-17 y una cámara de separación estándar (Beckman Instruments) y las muestras se eluyen a velocidades de flujo entre 12 y 14 ml/min. Las células obtenidas en las fracciones adecuadas generalmente tienen diámetros de células en un rango de 5 a 15 micrones, preferiblemente 8.0 a 9.4 micrones; la mayoría de las células tuvieron diámetros que caían dentro de un rango de 8.3 a 9.2 micrones. Estos diámetros se miden de acuerdo a las técnicas conocidas en el arte. Si es necesario, se realiza una selección adicional ya sea positiva o negativa, basada en los marcadores de células.

Una variedad de otros anticuerpos conocidas en la técnica por aquellos hábiles en la técnica se pueden utilizar solos o en combinación con marcadores de progenitores del hígado. La elección dependerá del tipo de célula deseado que se va a aislar o enriquecer e incluye, pero no se limita a, anticuerpos específicos para los antígenos hematopoyéticos y linfoides tales como, anti-CD2, anti-CD2R, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5 y anti-CD8 específicos para las células; anti-CD6 específico para el subconjunto de las células T y el subconjunto de células B; anti-CD7 específico para el subconjunto de células T principales; anti-CD12, anti-CD19 y anti-CD20, anti-CD72, anti-CDw78, específicos para las células B; anti-CD13 y anti-CD14 específicos para los monocitos; anti-CD16 y anti- CD56 específicos para las células asesinas naturales; anti- CDla, CDlb y CDlc específicos para los timocitos corticales y las células de Langerhans, anti-CD9 específico para las células pre-B, monocitos y plaquetas; anti-CDlO específico para las células progenitoras linfoides, C-Todas y granulocitos; anti-CDlla específico para los leucocitos, anti-CDllb específico para los granulocitos, monocitos y células asesinas naturales; anti-CDllc específico para los monocitos, granulocitos, células asesinas naturales y leucemia de las células pilosas; anti-CD15 específico para los granulocitos; anti-CDwl7 específico para los granulocitos, monocitos y plaquetas; anti-CD18 específico para los leucocitos; anti-CD21 específico para las células B maduras; anti-CD22 específico para el citoplasma de las células B maduras; anti-CD23 específico para las células B activadas; anti-CD24 específico para las células B y granulocitos; anti-CD25 y anti-CD26 específicos para las células B y T activadas y macrófagos activados; anti-CD27 y anti-CD28 específicos para el subconjunto de células T principales; anti-CD30 específico para las células B y T activadas y las células Sternberg Reed; anti-CD31 específico para las plaquetas, monocitos/macrófagos, granulocitos y células B; anti-CDw32 específicos para los macrófagos, granulocitos, células B y eosinófilos; anti-CD33 específico para los monocitos, células progenitoras mieloides y leucemias mieloides; anti-CD34 específico para las células precursoras hematopoyéticas; anti-CD35 específico para los granulocitos, monocitos, células B, algunas células NK, y eritrocitos; anti-CD36 específico para los monocitos/macrófagos y plaquetas; anti-CD37 específico para células B maduras; anti-CD38 específico para las células del plasma, timocitos y células T activadas; anti-CD39 específico para las células B maduras; anti-CD40 específico para las células B y el carcinoma; anti-CD42 y 42b específicos para las plaquetas y megacariocitos; anti-CD43 específico para los leucocitos excepto las células B circulantes; anti-CD44 específico para los leucocitos y células rojas; anti-CD45 específico para los leucocitos; anti-CD45RO específico para las células T, los subconjuntos de las células B, monocitos y macrófagos; anti-CD45 específico para las células B, monocitos y subconjunto de las células T; anti-CD45RB específico para las células B, subconjunto de las células T, monocitos, macrófagos y granulocitos; anti-CD46, CD55, CD58 y CD59 específicos para las células hemopoyéticas y no hemopoyéticas; anti-CD47 específico para todos los tipos de células; anti-CD48 específico para los leucocitos y neutrófilos; antiw49b específico para las plaquetas, células T activadas y cultivadas a largo plazo anti-CDw49d específico para los monocitos, células T y células B; anti-CDw49f específico para las plaquetas y megacariocitos; anti-CDw50 y CDw52 específicos para leucocitos; anti-CD51 específico para las plaquetas; anti-CD53 específico para los leucocitos que incluyen células del plasma normal y neoplástico; anti-CD54 específico para las células endoteliales; anti-CDw60 específico para el subconjunto de células T y las plaquetas; anti-CD61 específico para las plaquetas y los megacariocitos; anti-CD62 específico para las plaquetas activadas; anti-CD63 específico para las plaquetas activadas, monocitos/macrófagos; anti-CD64 específico para los monocitos (interferón gamma sobre-regulado) ; anti-CDw65 específico para los granulocitos y reactividad de los heterógenos con monocitos; anti-CD66 y 67 específicos para los granulocitos; anti-CD68 específico para los monocitos y macrófagos; anti-CD69 específico para las células B y T activadas, macrófagos activados, y células asesinas naturales; anti-CDw70 específico para las células T y B activadas, células Sternberg-Reed, y el linfoma de las células grandes anaplásticas; anti-CD71 específico para las células T y B activadas, macrófagos, células proliferantes; anti-CD73 específico para el subconjunto de células B y el subconjunto de células T; anti-CD74 específico para las células B y los monocitos/macrófagos; anti-CD75 específico para las células B maduras; anti-CD76 específico para el subconjunto de células T y células B maduras; anti-CD77 específico para las células B del centro folicular; anticuerpos para las citocinas y factores del crecimiento (por ejemplo IL1-IL13, EGF, IGF I y II, TGF-alfa y beta, 4.*..t???ák ..?au?t*.. l B ^^. >aaU>«A»?t *1-'^ll llfliWÉff ill lij- II llílttlil¡i ' TNF-alfa y beta, FGF, NGF, CIF, IFN-alfa y beta, CSF) ; antígenos virales (por ejemplo las proteínas de la envoltura de la Hepatitis B o las proteínas de la envoltura del VIH) , hormonas, antígenos o marcadores celulares o asociados con los tumores, moléculas de adhesión, moléculas de hemostasis, y células endoteliales. Otros marcadores y procedimientos de enriquecimiento están igualmente disponibles tales como los descritos en la Patente Norteamericana No. 5,840,502 incorporada para referencia.

Ejemplo 13 Se emplea un bio-reactor de alta eficiencia (HPBR) para cultivar los progenitores de los hepatocitos humanos y su progenie. Este proceso proporcionará un gran número de células útiles para futuras propósitos médicos o del bioreactor por sí mismo o el bio-reactor por sí mismo sirve como una unidad de producción para las proteínas secretadas útiles biológicamente y los factores que pueden incluir pero no están limitados al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) , el factor I y II de crecimiento similar a la insulina (IGF-I y II), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor de crecimiento de transformación tipo a y tipo b (TGF-a y TGF-beta) , el factor de crecimiento de los nervios (NGF) , el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento del sarcoma (SGF) , el factor de crecimiento estimulante de la colonia de los macrófagos de granulocitos (GM-CSF) , el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , el factor de liberación de la hormona prolactina y del crecimiento (GHRF) y los factores de crecimiento hemopoyéticos tales como las interleucinas (IL) IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, etc., el factor de diferenciación eritroide (EDF) o la proteína de liberación de la hormona de estimulación de los folículos (FRP) , la inhibina, el factor de proliferación de las células progenitoras o madre (SCPF) y los fragmentos activos, subunidades, derivados y combinaciones de estas proteínas entre muchos otros conocidos en la técnica. En general, como se utiliza aquí, estos factores celulares se refieren a una proteína secretada que se selecciona del grupo que consiste de una citocina, una linfocina, una interleucina, un factor de estimulación de las colonias, una hormona, un factor quimiotáctico, un factor anti-quimiotáctico, un factor de coagulación, una proteína trombolítica, una proteína de complemento, una enzima, una inmunoglobulina, y un antígeno.

Entre tales proteínas activas biológicamente alguien con habilidades en la técnica puede seleccionar el Factor VIII, el Factor IX, el Factor VII, la eritropoyetina, la alfa-1- antitripsina, calcitonina, la hormona del crecimiento, insulina, lipoproteína de baja densidad, apolipoproteína E, el receptor IL-2 y sus antagonistas, la dismutasa de superóxido, los modificadores a la respuesta inmune, la hormona paratiroides, los interferones (IFN alfa, beta, o gamma) , los factores del crecimiento nervioso, la glucocerebrosidasa, el factor de estimulación de las colonias, las interleucinas (IL) 1 a 15, el factor de estimulación de las colonias de granulocitos (G-CSF) , los granulocitos, el factor de estimulación de las colonias de macrófagos (GM-CSF) , el factor de estimulación de las colonias de macrófagos (M-CSF) , el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) , el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) , la adenosina desaminasa, los factores del crecimiento similares a la insulina (IGF-1 e IGF-2), los ligandos que promueven los megacariocitos (MPL) , la trombopoyetina, o combinaciones de los mismos, Sin limitarse a este protocolo particular del crecimiento de las células en un bio-reactor, otros procedimientos bien conocidos en el arte están igualmente disponibles y se pueden adoptar fácilmente a partir de~ las publicaciones de Patentes Norteamericanas Nos. 6,001,585; 5,998,184; 5,846,817; 5,622,857; 5,571,720; 5,563,068; 5,512,474; 5,443,985; 5,342,781; 5,330,915; 5,320,963; 5,202,254, 4,833,083; y 4,760,028 como se incorporan aquí a manera de referencia. El presente dispositivo contiene 450 fibras de celulosa de 10 kD y 540 fibras de polipropileno y detalles sobre otros parámetros se encuentran por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 5,622,857 que se incorpora aquí como referencia. Las células se aislan como se describió arriba. Todos los materiales necesarios se obtienen a partir de ya sea Sigma Chemical Co. o de Life Technologies. El medio de unión para el medio de cultivo a largo plazo es como sigue: RPMI 1640 (500 mL) ; 50 mL (10% FBS; L-glutamina 4 mM; Penicilina/estreptomicina lx; Gentamicina; HEPES 15 mM; 10 mU/mL de Insulina ; 10 mU/mL de transferrina; selenio. El sistema HPBR se lava con el medio durante un día antes que se aplique el medio de unión. 500 mg de los microportadores preswollen Cytodex 3 se inoculan en el espacio anular interior del HPBR. Las fibras oxigenadores sostienen los microportadores y evitan que se distribuyan a través del ECS. Los progenitores hepáticos humanos, viables, se inoculan también dentro del espacio anular interior, y el dispositivo se agita y se gira manualmente para lograr un mezclado uniforme de las células y los microportadores. Suponiendo que los progenitores y la progenie están entre 10-20 µm de diámetro, la proporción de inoculo de la célula al microportador es de aproximadamente 500. La viscosidad aparente de las células y los microportadores se incrementa rápidamente, indicando que las uniones célula a microportador y célula a célula proceden rápida y normalmente. Dentro de 2-3 minutos de este mezclado, un gel discreto de células y microportadores se forma dentro del espacio anular interior. Después de una incubación durante toda la noche a 37 °C en un medio de unión (en una posición estacionaria) , el medio se cambia a un medio de cultivo a largo plazo (2 L) . Estos volúmenes no son limitantes de ninguna manera puesto alguien con habilidades en la técnica puede escalar fácilmente la producción al nivel deseado. Los hepatocitos se cultivan durante 5 semanas, con medio fresco aplicado al sistema semanalmente. La función metabólica de las células se monitorean mediante pruebas de las muestras diariamente. Después de 5 semanas, se logra una recuperación > 90% de las células viables y los microportadores mediante el siguiente procedimiento: colagenasa al 0.1% en PBS mezclado con 0.44 mL de EDTA (0.23 M) se usan para lavar el ECS y el HPBRr incubado durante 10 minutos; el contenido del ECS se expele con aire estéril a partir del cilindro de una jeringa; este proceso se repite con un medio de cultivo a largo plazo y los materiales recolectados se lavan y se separan. El HPBR es igualmente adecuado en el cultivo y la transformación genética de las células (por ejemplo expresión del gen de HGF) . El siguiente es un protocolo no viral genética para el anclaje de las células dependientes (por ejemplo, SW 480 P3; ATCC # CCL228), que se puede modificar apropiadamente y optimizar a partir de los procedimientos publicados utilizando pozos y placas de cultivo, por aquellos hábiles en la técnica. La fibra del medio con propiedades de 10 kD se prefieren en el HPBR. El bio-reactor se opera de tal manera como se describe arriba. El microportador Cytodex 1 (Pharmacia, vendido por Sigma Chemical Co.) se utiliza ampliamente para cultivar las células dependientes de anclaje. Un amplio rango de densidades celulares se puede inocular dentro del ECS del HPBR, que varían desde lxlO4 a lxlO15 células o más alto según sea deseado. La proporción del inoculo célula a microportador está en el rango de aproximadamente 10, aunque alguien con habilidades en la técnica lo puede modificar según lo desee. El dispositivo se hace girar suavemente a través del experimento a aproximadamente 10 cpm (o mayor) . Después de cultivar las células durante aproximadamente un día (o más, dependiendo de la célula específica) , se logra la confluencia óptima para obtener una transfección eficiente. La proporción de inoculación de célula a microportador es ajustable para impactar positivamente esta estructura de tiempo para una eficiencia terapéutica y económica. En el día de la transfección, se prepara la solución del plásmido de ADN (por ejemplo, pCMV) , y la solución de lípido catiónica (por ejemplo, LIPOFECTIN Reagent, Life Technologies) . Estos reactivos deben estar libres de suero, aún si el proceso total requiere la presencia del suero. Se mezclan cantidades apropiadas de ADN y soluciones de lípidos, luego se inyecta la mezcla dentro del ECS del dispositivo. Después de aproximadamente unas cuantas horas (o aún varias) de transfección, se retoma el uso del suero, si es apropiado, y se continua el cultivo de las células como se hizo antes durante aproximadamente unos cuantos días. Se pueden utilizar periodos más largos cuando se expanden permanente las células transformadas. Las células se cosechan de una manera similar a aquélla descrita ?.A .A.-.m,.,l*í*:J**eÍ*íi*, previamente.

Ejemplo 14 Hígado Artificial Como una extensión del ejemplo anterior alguien con habilidades en la técnica puede fácilmente adoptar el bioreactor como un sistema de soporte hepático extracorporal . El xenotransplante (el transplante de los órganos entre especies) puede ayudar a aliviar la escasez de los hígados donadores utilizando los órganos de animales. Un peligro potencial del transplante de órganos de animales en humanos, sin embargo, es que los virus que infectan los animales donadores pueden infectar a los receptores. Como los receptores del transplante de órgano estarían tomando fármacos para suprimir el sistema inmune y evitar el rechazo del órgano pueden ser incapaces de lugar contra la infección del virus animal. En un escenario aún más negativo, el virus del animal puede mutar en el hospedero infectado en una forma que puede infectar los contactos humanos con los sistemas inmunológicos normales. Como un resultado, puede surgir un nuevo virus humano patogénico. Una especie animal favorita para el transplante de órganos humanos es el cerdo y también los primates. Sin embargo es claro que si está disponible el hígado artificial a base de células humanas, sería preferible al de los hígados de animales. Después del tiempo deseado en cultivo se obtienen los hepatocitos maduros y/o células biliares derivadas de una población enriquecida en los progenitores del hígado. Rutinariamente se obtienen de 2 a 5 billones de células de alta viabilidad (aproximadamente el 80%) . En general, el medio de cultivo se utiliza en el medio de Waymouth suplementado con hormonas. Para acomodar de 2 a 5 billones de células, el bio-reactor se escala hasta dos recipientes de contención, cada uno con un diámetro interno de 40 mm y una altura de 100 mm. En esta situación particular se usan cuentas de vidrio de aproximadamente 2 mM de diámetro y un volumen de 250 ml por recipiente de contención. Se suministra el medio a una proporción de recirculación de 360 ml/min. La alta viabilidad de los hepatocitos se evidencia media la tasa de consumo de oxígeno estable. El bio-reactor se une entonces a un receptor humano ahepático cuyo hígado se ha removido mediante cirugía debido a una falla hepática total. De manera similar, el bio-reactor se une a un sujeto humano con un hígado disfuncional. Un artesano útil conocerá los procedimientos para unir el bio-reactor como un sistema de soporte hepática extracorporal o conocerá los medios alternativos conocidos en el arte tales como los que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,008,049; 5,981,211; 5,976,870; 5,891,713; 5,827,729; 5,643,794; 5,622,857; 5,605,835; y 5,270,192 incorporada aquí a manera de referencia. Es evidente de tales referencias que las células de hígados artificiales donadores no necesariamente están limitadas a especies humanas y que el uso de tales células de especies cruzadas es ahora posible. Por ejemplo, las células del hígado de cerdos o primates son igualmente adecuadas para el uso humano. Es igualmente evidente que los métodos y composiciones de la presente invención permiten la preparación de células de hígados humanos para el uso en las terapias celular de la terapia del hígado extracorporal, con todas las ventajas relacionadas al mismo. La sangre de la arteria femoral izquierda se dirige hacia un hemoconcentrador de Minntech. Se inserta una cánula elecath de banda de luz 12 dentro de la arteria femoral y se conecta a una tubería de PVC de 1/4" al hemoconcentrador. El hemoconcentrador separa la sangre en una fracción ultrafiltrada libre de células, y un fracción de células de la sangre. La fracción de las células de la sangre se regresa a la vena femoral vía una tubería similar. El ultrafiltrado que sale del hemoconcentrador vía una tubería de PVC de 1/4" y que entra al sistema de bio-reactor de hepatocitos con la velocidad de flujo ajustada a 40 ml/min., utiliza una bomba de rodillo. Después de la perfusión a través del bio-reactor, el ultrafiltrado se regresa al paciente vía la vena yugular izquierda. Para demostrar la provisión del metabolismo hepático extracorporal, dos químicos conocidos por ser metabolizados por el hígado, la 7-etoxicumarina y la lidocaína se administran en el ultrafiltrado en la entrada del bio-reactor, los metabolitos respectivos, la 7-OH-cumarina y la monoetilglicinexilidida (MEGX) , se miden en las salidas de los bio-reactores antes de que el ultrafiltrado se regrese al paciente. Se observa el metabolismo significativo tanto de la 7-etoxicumarina como de la lidocaína. Los resultados por lo tanto demuestran la aplicación del bio-reactor como un sistema de soporte, proporcionando el metabolismo hepático extracorporal. La separación de las células de la sangre del plasma minimiza la reacción inmunológica del receptor a los hepatocitos extraños. Los progenitores hepáticos y su progenie son útiles así en el bio-reactor para proporcionar el soporte hepático extracorporal.

Ej emplo 15 Péptidos que codifican al Exon 1 y usos como Antígenos Los péptidos cortos que corresponden al exon 1 de la alfa-fetoproteína se utilizan para distinguir sin ambigüedad la alfa-fetoproteína en varios linajes celulares evaluando la expresión con los anticuerpos específicos. La secuencia del péptido codificada por el exon 1 es: SEC. ID. 14 MKWVESFLIFLLNFTERSRTLHRNEYGI Estos aminoácidos se pueden también representar mediante una cadena alfabética tal como ABCDEFGHIJKLMNOPRSTUVWXYZ tal que la letra A desde esta cadena inicia desde la posición M, K, W, V, E, S, I, F, L, I, F, L, L, o N del péptido. Los péptidos de la secuencia codificada por el exon 1 y entre cuatro y doce residuos de aminoácidos de longitud se conjugan a una macromolécula para producir un antígeno. El péptido se enlaza opcionalmente a la macromolécula mediante un espaciador desde dos a ocho átomos de carbono de longitud. La macromolécula es albúmina, hemocianina, caseína, ovalbúmina, o polilisina. Los péptidos adecuados incluyen los péptidos en la tabla y análogos con al menos 80% de homología o aminoácidos substitutos estándar. El siguiente es el ejemplo que alguien con habilidades en la técnica construye para obtener la secuencia del péptido deseada en longitud de acuerdo las necesidades específicas : A—B—C—D—E—F—G—H—I—J—K—L—M-N, A—B—C—D—E—F—G—H—I—J—K—L—M, A--B—C—D--E—F—G~H—I—J—K—L, A—B—C—D—E—F—G—H—I--J—K, A—B—C—D—E—F—G--H--1—J, A--B—C--D--E--F--G--H--I, A—B—C—D—E--F--G—H, A—B--C--D—E—F—G, A—B—C—D—E—F, A--B--C--D--E, A--B--C--D, B—C--D—E—F--G--H—I—J—K—L— -N, B--C--D--E--F--G--H—I--J--K--L--M, B—C—D—E—F—G—H—I—J—K—L, B—C--D--E—F--G--H—I—J--K, B--C--D—E—F—G—H—I—J, B--C--D--E--F--G--H--I, B—C—D—E—F—G--H, B--C--D--E--F—G, B--C--D--E--F, B--C--D--E, C--D--E--F-- G— H— I--J--K--L— M-N, C--D--E--F— G— H--I— J— K--L— M, C— D— E— F— G— H--I-- J— K— L, C--D-- E--F--G--H--I--J— K, C--D--E--F--G--H--I--J, C--D-- E--F--G--H-I , C--D— E— F- G-H, C--D--E-F-G, C-D-E-F, D--E--F--G--H--I--J--K--L— -N, D--E--F--G--H--I— J--K--L--M, D--E--F--G— H--I--J--K--L, D--E--F--G--H--I--J--K, D--E--F--G--H--I--J, D--E--F--G--H--I , D--E--F--G--H, D--E— F— G, E--F--G--H--I--J--K--L--M-N, E— F— G— H— I — J— K— L— M, E--F--G--H--I--J--K--L, E--F--G— H--I--J--K, E— F— G--H-- I--J, E--F--G--H--I , E--F-- G— H, F--G--H--I--J--K— L--M-N , F— G— H— I — J--K-- L— M, F--G--H--I--J--K--L, F--G--H--I--J--K, F--G--H--I--J, F— G--H— I , G--H-- I--J— K— L— M-N, G--H--I--J--K— L--M, G--H--I--J--K— L, G--H--I--J--K, G--H--I--J, H--I--J--K--L--M-N, H— I — J— K— L— , H— I — J— K— L, H--I--J--K, I--J— K--L--M-N, I--J--K--L--M, I--J--K— L, J--K--L--M-N, J--K--L--M, K — L--M— N y similares -**"- — '--"ftMfUmflür -->~^-*-^^~^^^** >í**&^ * en donde cualquiera de A—B--C--D—E—F--G—H—I—J—K—L- M—ó N, puede ser aminoácidos no polares (hidrofóbicos) tal como glicina Gly G alanina Ala A valina Val V leucina Leu L isoleucina lie I metionina Met M fenilalanina Phe F triptofano Trp W prolina Pro P o polar (hidrofílico) serina Ser S treonina Thr T cisteína Cys C tirosina Tyr Y asparagina Asn N glutamina Gln Q o eléctricamente cargados (negativo) ácido aspártico Asp D ácido glutámico Glu E o eléctricamente cargados (positivo) lisina Lys K arginina Arg R histidina His H o ausente. La cadena se puede componer de substitutos de aminoácidos aceptables o sales de los mismos. Las substituciones de aminoácidos más frecuentemente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, y viceversa.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención LISTADO DE SECUENCIA <110> Reid, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 accatgaagt gggtggaatc 20 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reid, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 2 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 cctgaagact gttcatctcc 20 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 3 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 taaaccctgg tgttggccag 20 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 4 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 atttaaactc ccaaagcagc ac 22 Ll fUDO DE SECUENCIA <110> Reid, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 5 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 cttccatatt ggattcttac caatg 25 ****..t^j»»^...-~ a.-*-*-aaaA^ üáÉ LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 6 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ggctaccata ttttttgccc ag 22 ü¡m¿¡* á¡¡¡Máii -^ittdiiA Éiíttj l?ÉlifiÉiil^^i itt LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 7 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ctacctgcct ttctggaaga ac 22 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reid, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 8 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 gagatagcaa gaaggcatcc c 21 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reid, Lola <120> Progenitores del Hígado Humano <130> 113918.101 Secuencia 9 <140> Nuevo <141> 2000-01-19 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 aaagaattaa gagaaagcag cttg 24 SECUENCIA <110> Reíd <120> Progenitores del Hígado Humano <130> Secuencia 10 <140> <141> <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ggcacaatga agtgggtaac c 21 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd <120> Progenitores del Hígado Humano <130> Secuencia 11 <140> <141> <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ccataggttt cacgaagagt tg 22 » ^X£? LISTADO DE SECUENCIA <110> Reid <120> Progenitores del Hígado Humano <130> Secuencia 12 <140> <141> <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 gccagtaagt gacagagtca c 21 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd <120> Progenitores del Hígado Humano <130> Secuencia 13 <140> <141> <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ttataagcct aaggcagctt gac 23 LISTADO DE SECUENCIA <110> Reíd <120> Progenitores del Hígado Humano <130> Secuencia 14 <140> <141> <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Trp Val Glu Ser He Phe Leu He Phe Leu Leu Asn Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly He 20 25

Claims (41)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método que proporciona una composición que comprende una mezcla de células derivadas del tejido del hígado humano, la mezcla comprende una colonia de organismos enriquecida de progenitores del hígado humano, caracterizado porque el método comprende: (a) proporcionar una suspensión celular [substancialmente única] del tejido del hígado humano que comprende una mezcla de células que varían de tamaño, incluyendo células inmaduras y células maduras; (b) citorreducción de la suspensión bajo condiciones que permiten la remoción de las células maduras y aquellas de tamaño relativamente grande, mientras reteniendo las células inmaduras y aquellas de tamaño relativamente pequeño; y (c) selección de aquellas células, las cuales por si mismas, su progenie, o formas más maduras de los mismos exhiben uno o más marcadores indicadores de la expresión de la alfa-fetoproteína, albúmina o ambas. * *r?*l?, i.t*m MtJ* M¿ Lhl*^ttosa?ifi | ^Üj para proporcionar una mezcla de células comprendidas de una colonia de organismos enriquecida de progenitores del hígado humano.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido del hígado se obtiene de un feto, un neonato, un infante, un niño, un joven o un adulto.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células inmaduras tienen un diámetro menor de alrededor de 15 mieras.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la colonia de organismos enriquecida comprende células del hígado diploide humano.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los progenitores del hígado son progenitores hepáticos, progenitores hemopoyéticos, progenitores mesenquimales, o mezclas de los mismos.

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la alfa-fetoproteína es la alfa-fetoproteína de longitud completa.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la citorreducción comprende la separación de acuerdo con el tamaño de la célula, densidad boyante, o una combinación de estas.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de citoreducción comprende elutriación centrífuga, centrifugación de densidad del gradiente, lavado en batea, cromatografía de afinidad, marcado con etiquetas fluorescente, flujo de fluido a contracorriente, centrifugación de flujo continuo, centrifugación por zona, uso de perlas magnéticas, o combinaciones de los mismos.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende lisis selectiva de las células maduras.

10. Un progenitor de hígado humano aislado por el método de conformidad con la reivindicación 1.

11. Un método para proporcionar una composición que comprende una colonia de organismos enriquecida de progenitores del hígado humano, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una suspensión celular substancialmente única de tejido de hígado humano, y (b) someter la suspensión a una inmunoselección positiva o negativa, de modo que una mezcla de células se proporciona, esta mezcla de células está comprendida de una colonia de organismos enriquecida de progenitores del hígado humano, estos progenitores del hígado humano por sí mismos, su progenie, o formas más maduras de los mismos, exhiben uno o más marcadores indicativos de expresiones de alfa- fetoproteína, albúmina, o ambas. 12. El método de conformidad con la reivindicación

12, caracterizado porque los progenitores del hígado son progenitores hepáticos, progenitores hemopoyéticos, progenitores mesenquimales, o combinaciones de los mismos.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la inmunoselección comprende seleccionar células que expresan marcadores asociados con células hemopoyéticas, células que expresan marcadores asociados con células hepáticas, células que expresan marcadores asociados con células mesenquimales, o combinaciones de las mismas.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la inmunoselección comprende seleccionar a partir de la suspensión aquellas células, las cuales por ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas exhiben uno o más marcadores indicativos de expresiones de alfa-fetoproteína, albúmina, o ambas.

15. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende seleccionar ' i * i í •) l!*l^3?&j¡-.* .í2**X*?. ,íml*^»* *¿. .. «. ff ifaf ¡¡n^mi aquellas células las cuales por ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas producen .ARNm de alfa-fetoproteína de longitud completa.

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la inmunoselección comprende seleccionar de la suspensión aquellas células que expresan un marcador especifico de células del hígado adulto.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la inmunoselección comprende seleccionar aquellas células, las cuales por ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas, expresan CD14, CD34, CD38, ICAM, CD45, CD117, glicoforina A, conexma 32, osteopontina, sialoproteína del hueso, colágeno I, colágeno II, colágeno III, colágeno IV, o combinación de estos.

18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la inmunoselección comprende seleccionar aquellas células, las cuales por ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas, expresan adicionalmente la inmunoreactividad semejante a la alfa-fetoproteína, in unoreactividad semejante a la albúmina, o una combinación de estas.

19. Un progenitor de hígado humano, caracterizado porque se aisla por el método de la reivindicación 14.

20. Una composición caracterizada porque comprende una colonia de organismos enriquecida de progenitores del hígado humano, su progenie, o formas más maduras de esta, el hígado humano exhibe uno o más marcadores indicadores de la expresión de la alfa-fetoproteína, albúmina, o ambas.

21. La composición de la reivindicación 21, caracterizada porque los progenitores comprenden progenitores hepáticos, progenitores hemopoyéticos, progenitores mesenquimales, o combinaciones de estos.

22. La composición de la reivindicación 21, caracterizada porque los progenitores, su progenie, o formas más maduras de estos expresan CD14, CD34, CD38, CD117, ICAM o combinaciones de estos.

23. La composición de la reivindicación 21, caracterizada porque los progenitores albergan el ácido nucleico exógeno.

24. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque el ácido nucleico exógeno codifica al menos un polipéptido de interés.

25. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque el ácido nucleico exógeno promueve la expresión de al menos un polipéptido de interés.

26. Un método de tratamiento de la disfunción del hígado o enfermedad que responde al tratamiento con progenitores del hígado en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de los progenitores del hígado humano, su progenie, formas más maduras de los mismos, o combinación de estos, en un portador farmacéuticamente aceptable y tratamiento de la disfunción del hígado o enfermedad.

27. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque los progenitores del hígado humano comprenden progenitores hepáticos, progenitores hemopoyéticos, progenitores mesenquimales, o combinaciones de estos.

28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque comprende adicionalmente la administración simultáneamente o secuencialmente en cualquier orden de una cantidad efectiva de los progenitores del hígado de humano adulto, su progenie, formas más maduras de estos, o combinaciones de estos.

29. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque los progenitores del hígado humano son administrados parenteralmente.

30. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque las disfunciones o trastornos del hígado comprenden hepatocolangitis, hepatomalacia, hepatomegalia, cirrosis, fibrosis, hepatitis, falla del hígado aguda, falla del hígado crónica, cáncer, trastornos hematológicos, disfunciones hematológicas, o errores innatos del metabolismo.

31. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el cáncer comprende hepatocarcinoma, hepatoblastoma, o ambos.

32. El método de la reivindicación 31, caracterizado porque el cáncer comprende un tumor metastático en el hígado derivado de un sitio primario seleccionado del grupo que consiste de intestino, próstata, seno, riñon, páncreas, piel, cerebro, y pulmón.

33. El método de la reivindicación 31, caracterizado porque las disfunciones o trastornos hematológicos incluyen anemia, leucemia, o aquellos inducidos por quimioterapia, radiación, fármacos, virus, trauma, o combinaciones de los mismos.

34. Un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad efectiva de progenitores hepáticos humanos, su progenie, o formas más maduras de estos, en el cual los progenitores hepáticos humanos, su progenie, o formas más maduras albergan el ácido nucleico exógeno.

35. Un cultivo de célula caracterizado porque comprende la composición de la reivindicación 21, un componente de matriz extracelular, y un medio de cultivo.

36. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la composición de la reivindicación 21 y un portador farmacéuticamente aceptable.

37. Progenitores del hígado humano, su progenie o formas más maduras de los mismos, caracterizados porque exhiben uno o más marcadores indicadores de la expresión de la alfa-fetoproteína, albúmina, o ambas.

38. Progenitores del hígado humano, su progenie o formas más maduras de los mismos, caracterizados porque exhiben el fenotipo glicoforina A", CD45", alfa- fetoproteína+++, albúmina*, y ICAM+.

39. Los progenitores del hígado humano de la reivindicación 43, caracterizados porque expresan adicionalmente el CD14+, CD34++, CD38++, CD177+, o combinaciones de los mismos.

40. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque las células inmaduras tienen un diámetro mayor que alrededor de 5 mieras.

41. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque las células inmaduras tienen un diámetro mayor que alrededor de 8 mieras. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen métodos de aislamiento y crioconservación de progenitores del hígado humano, los cuales incluyen procesar tejido de hígado humano para proporcionar una suspensión de células substancialmente única que comprende progenitores y no progenitores de uno o más linajes de células encontrados en hígado humano, someter la suspensión a un paso de citoreducción, el cual reduce substancialmente el número de no progenitores en la suspensión, y el cual proporciona la suspensión citoreducida enriquecida con progenitores que exhiben uno o más marcadores asociados con al menos uno de los linajes de una o más células; y seleccionar de la suspensión citoreducida aquellas células, las cuales por ellas mismas, su progenie, o formas más maduras de las mismas expresan uno o más marcadores asociados con al menos uno de los linajes de una o más células. Entre estos marcadores están CD14, CD34, CD38, CD45, e ICAM. Los progenitores hepáticos se caracterizan por ser de 6-5 µ de diámetro, diploides, glicoforina A", CD45", AFP+++, ALB+, ICAM+ y con subcolonias de organismos que varían en expresión de CD 14+, CD34++, CD38++, CD117+. Estas subcolonias de progenitores tienen características esperadas para células que son particularmente útiles en las terapias celulares y genéticas del hígado y para el establecimiento de órganos bioartifleíales . ol 1-33 ^