ES2214614T3 - Ensayo que utiliza cepas de celulas hospedadoras microbianas marcadas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para analizar los contaminantes potenciales en un recipiente de cultivo utilizado para la fabricación de múltiples productos polipeptídicos, en donde los contaminantes potenciales son células huéspedes bacterianas, levaduras, o fúngicas que en la forma nativa utilizan carbohidratos, comprendiendo dicho procedimiento: (a) cultivar en el recipiente una cepa de células huésped que utilice más de una fuente de carbohidratos como sustrato, pero que esté marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para utilizar al menos un carbohidrato como sustrato y que comprenda el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se fabrica; (b) plaquear una muestra aislada del cultivo de la etapa (a) en un medio de cultivo complementado con una fuente de carbohidratos que no es utilizada por las células huésped y sin ninguna otra fuente de carbohidratos; (c) incubar las células plaqueadas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier colonia positiva pueda crecer a un nivel detectable; y (d) detectar el crecimiento de colonias en medio de cultivo complementado.

Description

Ensayo que utiliza cepas de células hospedadoras microbianas marcadas.

Antecedentes de la invención Ámbito de la invención

La invención hace referencia a un ensayo relacionado con la producción de cepas huéspedes marcadas genéticamente que son habitualmente fuente de obtención de proteínas recombinantes y que se generan en un fermentador de producción múltiple. Esta invención hace también referencia al uso de mezclas de cultivos en un fermentador.

Descripción de materias relacionadas

Se ha señalado el uso potencial de marcadores genéticos en la identificación de cepas de levadura y se han desarrollado cepas de uso enológico, por Vezinhet y Lacroix, Bull.O.I.V., 646-644, 759-773 (1984). Petermg y col., Am. J. Enol. Vitic. 42:6 (1991) describen un procedimiento que utiliza la tecnología del DNA recombinante para la introducción del gen de la \beta-glucuronidasa (GUS) de E. coli como marcador en cualquier cepa de levadura deseada. La producción de nuevas cepas de microorganismos, referida a microorganismos en los que la reproducción es normalmente asexual, se ha descrito en la patente americana U.S. 2.820.742. El papel de la luciferasa, junto con su uso en ensayos luminiscentes y como gen marcador se ha revisado por Ugarova y col., Biokhimiya, 58: 1351-1372 (1993). El gen de la luciferasa puede insertarse en una bacteria contaminante utilizando bacteriófagos y los genes de la luciferasa se pueden utilizar como marcadores en estudios de DNA recombinante, en ensayos de análisis del promotor y en otras aplicaciones. Prosser y col., Critical Reviews in Biotechnology 16:157-183(1996) describen el desarrollo de técnicas para detectar y seguir la pista de microorganismos en ambientes naturales, y el desarrollo de sistemas moleculares marcadores para estos estudios. En la enología, el problema reside en la diferenciación de una cepa de interés de la amplia variedad de entre las potencialmente contaminantes. Se pueden utilizar dos enfoques: el uso de una característica adquirida y la implantación genética de una propiedad diferenciadora y fácilmente detectable. La primera es poco adecuada para la vinificación. El marcaje genético descrito en el trabajo citado anteriormente, consiste en la adquisición por parte de la cepa de interés de resistencia a antibióticos (cloramfenicol y oligomicina). La determinación genética de esta resistencia se localiza en el genoma mitocondrial de la célula. El marcaje tiene las siguientes características: el genoma nuclear no se modifica; por tanto el riesgo de alteración del potencial enológico de la cepa es mínimo, las catacterísticas adquiridas se reconocen con facilidad (por el crecimiento en un medio de cultivo específico) y no comportan una desventaja selectiva para la cepa marcada en condiciones de competencia natural.

El advenimiento de la biotecnología ha llevado al uso clínico y la subsiguiente aprobación sólo en los Estados Unidos de más de diez proteínas obtenidas de manera recombinante, incluyéndose el interferón gamma, el interferón beta, el interferón alfa, la insulina, el Factor VIII, el activador tisular del plasminógeno, la hormona de crecimiento, el factor estimulador de colonias, la eritropoyetina y la DNAasa. Además, hay muchos fármacos que están siendo desarrollados o en fase clínica para su aprobación futura. En los sistemas de fermentación la capacidad está limitada, ya que se utiliza un mismo fermentador en la producción de diferentes productos. Un ejemplo es la obtención de diferentes antibióticos en el mismo fermentador. De igual manera, es posible que en un fermentador adyacente se esté produciendo simultáneamente un producto distinto. Véase Baaer y col., "Multiuse Manufacturing Facilities for Biologicals",
BioPharm, 5:32-40 (Septiembre 1992) para consultar las medidas utilizadas en la prevención de la contaminación cruzada en la obtención de productos obtenidos con licencia biológica en sistemas multiuso y las normas reguladoras cuando el sistema se use para la manufactura de más de un producto.

Existe por tanto, una clara necesidad de poder detectar cuando un organismo productor de un producto distinto contamina la producción deseada de un cultivo. En un sistema de producción múltiple, el contaminante podría evitarse.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona un procedimiento para el análisis de los contaminantes potenciales en un recipiente de cultivo utilizado para la fabricación de múltiples productos polipeptídicos, donde los contaminantes potenciales son bacterias, levaduras u hongos que en su forma nativa utilizan carbohidratos. Dicho procedimiento comprende:

(a) cultivar en un recipiente una cepa de células huéspedes que utiliza más de un carbohidrato como fuente de substrato pero está genéticamente marcada para perder su capacidad nativa de utilizar al menos un carbohidrato como substrato y que comprende también el DNA codificante del producto peptídico de interés que está siendo producido normalmente;

(b) sembrar una muestra aislada del cultivo de la etapa (a) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidrato no utilizado por la células de la cepa huésped como substrato, sin adición de ninguna otra fuente de carbohidrato;

(c) incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que una colonia positiva pueda crecer a un nivel detectable y

(d) detectar cualquier colonia que esté creciendo en el medio de cultivo suplementado.

En una realización de la invención, se proporciona un ensayo para la identificación de microorganismos huéspedes contaminantes en recipientes de cultivo conteniendo una cepa que utiliza más de una fuente de carbohidrato como substrato, en donde las células huéspedes microbianas contaminantes como la cepa de interés se reconocen por sus características específicas de utilización de carbohidratos, incluyéndose:

(a) cultivar la cepa del microorganismo huésped que contiene el DNA codificante para el polipéptido de interés y está genéticamente marcada por la no utilización de la fuente de carbohidrato como substrato;

(b) sembrar una muestra aislada del cultivo de la etapa (a) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidrato no utilizada como substrato por la cepa del microorganismo huésped;

(c) incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que cualquier colonia positiva sea detectable

(d) detectar cualquier colonia que esté creciendo en el medio de cultivo suplementado.

(e) recuperar del medio de cultivo suplementado las colonias que estén creciendo y

(f) sembrar las colonias recuperadas en un medio con diferentes carbohidatos para identificar cualquier célula huésped contaminante por sus características específicas de utilización del carbohidrato. Normalmente, en este ensayo, un producto proteico contaminante se identifica a través de la identificación de la célula huésped contaminante. Cada organismo productor a introducir en el fermentador debe estar genéticamente marcado por un único marcador o por la combinación de varios.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento de producción, en un único recipiente de cultivo, de múltiples polipéptidos de interés a partir de cepas de microorganismos que utilizan más de una fuente de carbohidratos como substrato. Dicho procedimiento comprende:

(a)

cultivar en el recipiente la primera cepa microbiana que contiene el DNA codificante del primer polipéptido de interés y que está marcada para no utilizar una primera fuente de carbohidrato como fuente de substrato.

(b)

sembrar una muestra aislada del cultivo de la etapa (a) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidrato no utilizada por la cepa de células huéspedes.

(c)

Incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para detectar una colonia en crecimiento a un nivel suficiente.

(d)

detectar cualquier colonia que esté creciendo en el medio de cultivo suplementado.

(e)

después de completar el cultivo de la primera cepa de células, se extraen los contenidos del recipiente de cultivos y se procede a la limpieza y esterilización del recipiente.

(f)

cultivar en el recipiente una segunda cepa de células huéspedes que contiene el DNA codificante del segundo polipéptido de interés y que está genéticamente marcada para no utilizar una segunda fuente de carbohidrato como substrato, mientras que sí puede usar la primera fuente de carbohidrato como substrato;

(g)

sembrar una muestra aislada del cultivo de la etapa (f) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidrato no utilizada por la segunda cepa de células huéspedes;

(h)

incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier célula positiva crezca a un nivel detectable y

(i)

detectar cualquier colonia que esté creciendo en el medio de cultivo suplementado y determinar si existe contaminación de la primera cepa de células huéspedes.

Hay algunas características de este test que lo hacen atractivo. Se trata de un test sencillo que puede ser muy sensible en el reconocimiento de microorganismos extraños y no deseados. La sensibilidad puede ajustarse adaptando las características de las mutaciones marcadoras utilizadas. Hay una larga lista de huéspedes que pueden marcarse, desde, por ejemplo E. coli que puede utilizar un amplio espectro de fuentes de carbono. El número de falsos positivos es bajo, especialmente cuando se utilizan mutaciones por deleción.

En los últimos años, además, la producción de GMP ha sido limitada debido a que las contaminaciones cruzadas no podían detectarse. Por eso, incluso cuando ocurre una fina alteración en el contenido total, todo el lote de la fermentación debe ser descartado para evitar el riesgo de un nivel inaceptable de contaminación cruzada en el producto. Esta invención permite la medición de cantidades anteriormente indetectables de contaminación cruzada entre huéspedes, por tanto puede determinarse si los contaminantes están en límites aceptables y por tanto si es necesario desechar el lote. Esto evita descartar innecesariamente lotes que quizás estén en los límites permisibles aunque no pueda asegurarse de manera definitiva si son aceptables.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

Tal como se utiliza en la presente invención, células "contaminantes" son aquellos materiales que no se desea que estén presentes en un cultivo determinado de interés.

Para los propósitos de la presente invención, "recipiente de cultivo" es un recipiente que se utiliza en los cultivos de cepas de células huéspedes microbiológicas. Estos incluyen frascos de agitación y fermentadores, así como aquellos utilizados en cultivo a gran escala para la producción de polipéptidos.

Los fermentadores disponibles incluyen tanques de tamaños de 1-l, 10-l, 1000-l, 10.000-l y 1000.000-l.

Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptido" o "polipéptido de interés" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de diez aminoácidos. Preferentemente, los "polipéptidos" son "exógenos", lo que significa que son "heterólogos", es decir extraños a la cepa de células huéspedes utilizada, como por ejemplo una proteína humana producida en E. coli.

Ejemplos de polipéptidos de mamíferos incluyen moléculas como p.ej.: la renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana; la hormona de crecimiento bovina; el factor liberador de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora de la tiroides; las lipoproteínas; la \alpha1-antitripsina; la cadena A de la insulina; la cadena B de la insulina; la proinsulina; la trombopoyetina; la hormona estimuladora de folículo; la calcitonina; la hormona luteinizante; el glucagón; los factores de coagulación como el factor VIIIC; el factor IX; el factor tisular y el factor von Willebrand, factores anti-coagulantes como la Proteína C, el factor atrial natriurético; el tensioactivo de pulmón; los activadores del plasminógeno como la uroquinasa o el activador del plasminógeno tejido específico (t-PA); la bombesina; la trombina; el factor del crecimiento hematopoyético; el factor alfa y beta de necrosis tumoral; la encefalinasa; una albúmina sérica como la albúmina sérica humana; la hormona inhibidora de Müller; las cadenas A y B de la relaxina; la prorelaxina; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; proteínas microbianas, como la beta lactamasa; la DNasa; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento vascular (VEGF); los receptores para hormonas o factores de crecimiento; las integrinas; las proteínas A o D; los factores reumatoides; los factores neurotróficos, como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina-3, -4, -5 y -6
(NT-3, NT-4, NT5, y NT-6), o factores del crecimiento nerviosos como el NGF-\beta; las cardiotrofinas (factores cardíacos hipertróficos) como la cardiotrofina-1 (CT-1); el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDFG); el factor del crecimiento de los fibroblastos como aFGF y bFGF; el factor de crecimiento epitelial (EGF); el factor de crecimiento transformante (TGF) como TGF-alfa y TGF-beta, incluidos el TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, TGF-\beta5; el factor similar a la insulina-I y II (IGF-I y IGF-II); des(1-3)IGF-I (cerebro IGF-1), los transportadores de los factores similares a la insulina (IGFBPs); las proteínas CD como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; la eritropoyetina; los factores osteoinductores; las immunotoxinas; una proteína morfógena ósea (BMP); los interferones como el interferón alfa, beta y gamma; los factores estimuladores de colonias (CSFs), p.ej. M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs) p.ej., de la IL-1 a IL-10; el anticuerpo anti-HER-2; la superóxido mutasa; los receptores de células T; las proteínas de la superficie de la membrana; el factor acelerador de la desintegración; los antígenos virales tal como por ejemplo una porción de la cápside del virus de la SIDA; las proteínas de transporte; los receptores autoguiados; las adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y los fragmentos de cualquier de los polipéptidos enumerados.

Los polipéptidos exógenos preferidos de interés son los polipéptidos de mamíferos. Entre los ejemplos de polipéptidos de mamíferos se incluyen enzimas, hormonas, citoquinas, quimoquinas, immunotoxinas, componentes virales, anticuerpos, neurotrofinas y antígenos. Dichas proteínas adecuadas abarcan polipéptidos humanos como el t-PA, gp120, anti-CD-11a, anti-CD-18, anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, activina, inhibina, anti-HER2, DNasa, IGF-I, IGF-II, IGF-I cerebral, hormona del crecimiento, cadenas de relaxina, factor liberador de la hormona del crecimiento, cadenas de la insulina y la proinsulina, NGF, NT-3, BDNF, y uroquiinasa. Especialmente preferidos son los polipéptidos de mamíferos que incluyen p.ej., t-PA, gp120(IIIb), anti-HER-2, anti-CD-11a, anti-CD18, anti-VEGF, VEGF, Dnasa, IGF-I, IGF-III, TGF-beta, IGFBP-3, IGFBP-2, IGFBP-1, hormona del crecimiento, NGF, NT-3, NT-4, NT-5, y NT-6. El polipéptido más preferido es el IGF-I.

Tal como se utiliza aquí, el término "IGF-I" hace referencia al factor similar a la insulina de diferentes especies, incluyéndose el bovino, el ovino, el porcino, el equino y preferentemente el humano en su secuencia nativa o variante producida de manera recombinante. Un procedimiento preferido consiste en clonar el IGF-I y expresar su DNA en bacterias, p.ej., mediante el procedimiento descrito en la patente europea EP 128.733, publicada el 19 de Diciembre de 1984.

Tal como se utiliza aquí, el término "genéticamente marcado" significa que tiene uno o más marcadores genéticos o marcadores cromosómicos que causan que la cepa en el que el marcador está presente no utilice una fuente de carbohidrato como substrato.

La expresión "fuente de carbohidrato" significa cualquier fuente de carbohidrato, incluyendo por ejemplo la ribosa, la xilosa, la manosa, la maltosa, la glucosa, la sacarosa, la fucosa, la fructosa, la lactosa y la ramnosa. Preferentemente, la fuente de carbohidrato en la presente invención, no es la que se utiliza para la inducción del promotor en la producción con la cepa de células huéspedes, como la lactosa o la arabinosa. Más preferentemente, la fuente de carbohidratos es la maltosa, la ribosa, la fucosa o la ramnosa.

"Revertantes o supresores de la utilización de la fuente de carbohidrato" se definen como aquellas cepas mutantes que han revertido a un estado de no-mutación o han adquirido una mutación supresora en otro lugar, usualmente mediante modificación espontánea del organismo huésped. En los genotipos revertantes, la mutación revierte el gen a su forma salvaje, de modo que puede utilizar la vía degradación del carbohidrato. Una "alteración no-revertante" es una alteración genética que no produce una reversión a un estado de no-mutación. Una alteración "no-supresora" es aquella en la cual el organismo no adquiere una mutación con capacidad supresora en otro lugar.

"Cepa microbiana huésped que utiliza más de una fuente de carbohidrato como substrato" son aquellos microorganismos que pueden de manera normal o nativa, utilizar dos o más carbohidratos como substrato, como por ejemplo la mayoría de bacterias y algunos hongos y levaduras, incluyendo sin limitación Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, y Pichia, más preferentemente A. swamori, S. Cerevisiae, S. Dairensis, Schizosaccharomycespombe, K. marxianus, K. thermotolerans, C. albicans, C. anatomiae, y P. pastoris.

Una "muestra" de cultivo es una pequeña parte del cultivo celular que se obtiene para realizar el ensayo aquí descrito.

La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped concreto. Las secuencias control propias de microorganismos incluyen un promotor como el de la fosfatasa alcalina bacteriana, opcionalmente una secuencia operadora y un lugar de unión al ribosoma.

Una secuencia de DNA está "unida operativamente" cuando tiene una relación funcional con otra secuencia. Por ejemplo el DNA para una secuencia precursora o líder secretor está unida operativamente al DNA mediante un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificadora si está situado de manera que se facilita la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de DNA unidas son contiguas y en el caso del líder secretor son contiguas y están en la misma fase de lectura. La unión se consigue mediante ligación en las dianas de restricción adecuadas. Si estos lugares no existen, se utilizan oligonucleótidos adaptadores según las necesidades prácticas.

Tal como se utiliza aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable y todas las designaciones incluyen la descendencia. Las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria y los cultivos derivados sin tener en cuenta el número transferencias. Se sabe que no toda la progenie es idéntica en contenido de DNA debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Por tanto, en la descendencia se incluyen los descendientes mutados que tienen la misma función o actividad biológica que se investiga en la célula transformada original. Si se utilizan diferentes denominaciones, su significado será evidente según el contexto.

La técnica de la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se utiliza aquí generalmente en referencia a un procedimiento donde se amplifican cantidades ínfimas de fragmentos específicos de RNA y/o DNA, tal como se describe en la patente americana U.S. 4.683.195 publicada el 28 de julio de 1987. Generalmente, para diseñar los oligonucleótidos cebadores, se necesita la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o de más allá; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos del extremo 5-terminal de los dos cebadores deben de coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede ser utilizada para la amplificación de secuencias específicas de RNA, de secuencias de DNA específicas de DNA genómico total y de cDNA transcrito a partir del RNA celular total, de secuencias de bacteriófago o plasmídicas, etc. Véase en general Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY. 1989). Para una revisión reciente de los avances de la PCR, véase Erlich y col., Science, 252; 1643-1650 (1991).

Tal como se utiliza usa aquí, la PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación de ácidos nucleicos de una muestra ensayo que comprende la utilización de un ácido nucleico conocido como cebador y de una polimerasa para amplificar y generar un fragmento específico de ácido nucleico.

"Medio mínimo" se refiere al medio de cultivo diseñado para las placas de siembra que contiene la cantidad mínima de ingredientes necesarios para el crecimiento de colonias celulares. Habitualmente, el medio mínimo es medio mínino de agar. Un ejemplo es el medio que contiene por litro entre 0.1-0.2 g de MgSO_{4} heptahidrato, 15 g de Bacto-agar, NH_{4}Cl10 mM, 10-12 g de K_{2}HPO_{4}, 4-5 g de KH_{2}PO_{4} y 0.5 g de citrato sódico dihidrato.

Modos para la realización de la invención

El ensayo de esta invención comprende un procedimiento en múltiples etapas para identificar los microorganismos contaminantes en un cultivo. En la primera etapa, una cepa microbiana que utiliza más de una fuente de carbohidrato como sustrato, tal como se definió con anterioridad, se cultiva en medio de cultivo en un recipiente al uso para el crecimiento de las células. Esta cepa contiene el ácido nucleico codificante del polipéptido que se desea producir. Además está genéticamente marcada, de modo que la cepa no utiliza una fuente de carbohidrato como substrato.

Se utilizan parámetro de fermentación y la producción del polipéptido se conduce de una manera convencional, al igual que en aquellos procedimientos descritos más adelante. Durante el proceso de producción del polipéptido de interés, si el marcador o marcadores genéticos, ya sea una mutación o una alteración, es silencioso, entonces el miroorganismo no utiliza el carbohidrato durante el proceso fermentativo.

I. Fermentación A. Inserción de un ácido nucleico en un vector replicable

El ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés es un cDNA o un DNA genómico procedente de cualquier fuente adecuada, que proporciona el polipéptido(s) de interés, corresponde generalmente con la secuencia nativa.

El ácido nucleico heterólogo codificante del polinucleótido de interés (p.ej., cDNA o DNA genómico) se inserta en un vector replicable de expresión bajo el control de un promotor adecuado en el microorganismo. Para este propósito, están disponibles diversos vectores y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico a insertar n el vector y de las células huéspedes particulares a ser transformadas por el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de la célula huésped particular con la que es compatible. Dependiendo del tipo de huésped particular, los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los componentes siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un promotor, y una secuencia terminadora de la transcripción.

En general, los vectores plasmídicos que contienen un replicón y secuencias control derivadas de especies compatibles con el huésped se usan junto con el huésped microbiano. El vector originariamente lleva un lugar de replicación, al mismo tiempo que secuencias de marcado que pueden servir para la selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo E. coli se transforma habitualmente con pBR322, un plásmido derivado de E. coli (véase, e. g. Bolivar y col., Gene, 2; 95 [1977]). PBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y por tanto proporciona recursos fáciles para la identificación de células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos o fagos microbianos, contienen habitualmente o se les modifica para que contengan, promotores que pueden usarse en la expresión de genes marcadores de selección.

(i) Secuencia señal

El DNA codificante del polipéptido de interés aquí se expresa no sólo directamente, sino también como fusión con otro polipéptido, preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga dianas de corte en el extremo N-terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del DNA codificante del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una secuencia que pueda ser reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa señal) por la célula huésped.

En las células huéspedes procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal del polipéptido nativo, la secuencia señal se substituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, de un grupo consistente en la fosfatasa alcalina, la penicilina, el lpp, o líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa puede substituirse, por ejemplo, por la secuencia líder a la invertasa de levadura, del factor alfa o de la fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (patente europea EP 362. 179 publicada el 4 de abril del 1990), o la secuencia señal descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre del 1990.

(ii) Origen de replicación

Los vectores de expresión contienen secuencias de ácidos nucleicos que permiten al vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas. Estas secuencias son bien conocidas por su variedad en bacterias y levaduras. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram negativas y el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para levaduras.

(iii) Gen de selección

Los vectores de expresión contienen generalmente un gen de selección, también denominado marcador de selección. Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huéspedes transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huéspedes no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Este marcador de selección es diferente de los marcadores genéticos utilizados y definidos por la presente invención. Genes de selección característicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metrotexate o tetraciclina, (b) complementan auxotróficamente otras deficiencias auxotróficas distintas a las causadas por la presencia de marcadores genéticos, o (c) aportan nutrientes críticos que no están disponibles en un medio complejo, p.ej., el gen de la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo del esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. En cuyo caso, aquellas células que han sido transformadas con éxito con el ácido nucleico de interés producen un polipéptido que confiere resistencia al fármaco y por tanto sobreviven al régimen selectivo. Ejemplos de selección dominante utilizan fármacos como la neomicina (Southern y col. J. Molec Apppl. Genet, 1: 327 [1982]), el ácido micofenólico (Mulligan y col., Science, 209: 1422 [1980], o la higromicina (Sugden y col., Mol. Cell Biol. 5: 410-413 [1985]. Los tres ejemplos dados arriba emplean genes bacterianos bajo el control eucariótico para proporcionar la resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), e higromicina, respectivamente.

Un gen de selección adecuado para su utilización en levadura es el trp1, un gen presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman y col., Gene, 7: 141 [1979]; o Tschemper y col., Gene, 10: 157 [1980]). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa de levadura mutante que ha perdido la capacidad para incorporar triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de las células de levadura huéspedes proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, cepas de levadura deficientes en Leu-2 (ATCC 20,622 o 38.626) son complementadas por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

(iv) Promotor

El vector de expresión para la producción del polipéptido de interés, contiene un promotor adecuado que es reconocido por la mayoría de organismos y está unido operativamente al ácido nucleico codificante del polipéptido de interés. Promotores adecuados para ser usados con huéspedes procariotas incluyen los protomores de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col., Nature, 275: 615 [1978]; Goeddel y col., Nature, 281:544 [1979]), el promotor de la arabinosa (Guzman y col., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 [1992], la fosfatasa alcalina, el promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] y EP 36, 776) y los promotores híbridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). Sin embargo, otros promotores bacterianos también son adecuados para su utilización. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas, permitiendo así que un experto en la materia pueda unirlas operativamente al DNA codificante del polipéptido de interés (Siebenlist y col., Cell, 20: 269 [1980]) mediante engarces o adaptadores que permitan solventar cualquier requerimiento de las dianas de restricción.

Los promotores que se usan en los sistemas bacterianos contienen también generalmente una secuencia unida operativamente al DNA codificante del polipéptido de interés, del tipo Shine-Dalgamo (S.D.). El promotor puede extraerse de la fuente bacteriana de DNA mediante digestión con enzimas de restricción e insertarse en un vector que contenga el DNA deseado.

Las secuencias promotoras son conocidas en eucariotas, así como en levaduras y hongos. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 ó 30 bases cadena arriba del sitio de iniciación de la transcripción. Otra secuencia que se encuentra a 70 ó 80 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de muchos genes es una región ACXCAAT, en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que funciona como la señal para la unión de la cola de poli-A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias pueden insertarse en vectores de expresión eucariota.

Ejemplos de secuencias promotoras que pueden utilizarse en huéspedes levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J Biol. Chem., 255: 2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J Adv. Enzyme Reg., 7: 149[1968]); y Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978], tales como la enolasa, la gliceraldehido 3-fosfatasa deshidrogenasa, hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfatasa isomerasa, la 3-fosfogliceratomutasa, la piruvatoquinasa, la triosa fosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras son los promotores inducibles. Tienen la ventaja adicional de que la transcripción se controla por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C, la fosfatasa ácida, enzimas degradadores asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehido-3-la fosfatasa deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen en Hitzemanm y col., patente europea EP73. 657A

Los intensificadores se utilizan de manera ventajosa con los promotores de levaduras. Véase, por ejemplo, Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre intensificadores para la activación de promotores eucariotas. El intensificador puede colocarse en el vector en una posición 5' ó 3' de la secuencia codificante del polipéptido de interés, pero preferentemente se sitúa en el extremo 5' del promotor.

(v) Terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células huéspedes eucariotas, incluyendo levaduras y hongos, también contienen las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Estas secuencias están comúnmente disponibles de en las regiones no traducidas de los extremos 5' y en algunos casos de los extremos 3' en DNAs o cDNAs eucariotas o virales.

(vi) Construcción y análisis de los vectores

En la construcción de los vectores adecuados conteniendo uno o más de los componentes listados anteriormente, se emplean las técnicas estándares de ligación. Los plásmidos aislados o los fragmentos de DNA se cortan, se modifican sus extremos y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis y la confirmación de las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar la cepa de E. coli K12 294 (ATCC 31, 446) u otras cepas, y los transformantes obtenidos se seleccionan mediante la resistencia con ampicilina o tetraciclina según convenga. De los transformantes se preparan plásmidos, se analizan con endonucleasas de restricción y se secuencian mediante el método de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) o Messing y col., Nucleic Acid Res., 9:309 (1981),o por el método de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

B. Selección y transformación de células huéspedes

Las células huéspedes microbianas utilizadas aquí para la expresión de vectores son procariotas, levaduras y hongos, siempre que cumplan con el criterio descrito más arriba de utilización de los carbohidratos y estén genéticamente marcadas. Entre los procariotas adecuados se incluyen las bacterias como las arqueobacterias y las eubacterias, abarcando organismos Gram+ o Gram-. Para el propósito de la presente invención, son preferibles las eubacterias y más especialmente las Enterobacteriaceae. Ejemplos de bacterias de utilidad incluyen especies como Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Enwima, Bacillus, Psuedomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigela, Rhizobia, Vitreoscilla and Paracoccus, e.j.; E. coli, B. Subtilis, P. aeruginosa, S. Typhimurium o Serratia marcescens.

E. coli huéspedes preferibles como huéspedes de inicio para ser marcadas incluyen E. coli W3 110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B y E. coli X1776 (ATTC 31,537). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Las células mutantes de cualquiera de las bacterias arriba mencionadas pueden utilizarse como huéspedes de inicio y marcarse después. Es, desde luego, necesario seleccionar una bacteria apropiada, teniendo en cuenta la replicabilidad del replicon en la células de bacteria. Por ejemplo, especies de E. coli, Serratia o Salmonella pueden usarse como huéspedes cuando plásmidos muy conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para proporcionar el replicón.

La cepa de E. coli W31 10 es el huésped preferido para ser marcado genéticamente y es una cepa común para productos de fermentación de DNA recombinante. Preferentemente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Ejemplos de huéspedes bacterianos iniciales para ser marcados, junto con sus genotipos, se incluyen en la tabla siguiente:

1

También son adecuados los intermediarios para generar la cepa 36F8, 27B4 (patente americana U.S. 5.304.472) y 35E7 (una colonia aislada espontáneamente resistente a la temperatura y mejor crecimiento que la 27B4), así como la intermediaria en la generación de la cepa 48A4, cepa46H9 descrita en el Ejemplo III de más adelante. Una cepa adicional adecuada consiste en la E. coli que tiene una proteasa(s) periplasmática descrita en la patente americana
U.S. 4.946.783, publicada el 7 de Agosto de 1990.

Además de los microbios procariotas, los eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son también huéspedes adecuados en la presente invención, siempre que cumplan con los criterios de utilización de carbohidratos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común del pan, es el microorganismo huésped eucariota más comúnmente utilizado. También se utilizan otros géneros y especies frecuentemente disponibles como: Saccharomyces dairensis; Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature, 290: 140(1981); EP 139, 393 publicado el 2 de Mayo del 1985]; el huésped Kluyveromyces (U.S. 4, 943, 529), así como p.ej., K. lactis [Louvencourt y col., J Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia [EP 402,226]; Pichia pastoris
[EP 183,070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol, 28; 265-278 (1988)]; huéspedes de Candida como p.ej., Candida albicans y Candida anatomiae; Trichoderma reesia [Ep 244,234]; Neurospora crassa [Case y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 76; 5259-5263 (1979)]; y hongos filamentosos tales como p.ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991], y de Aspergillus tales como A. nidulans [Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289(1983)] y A. niger. [Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)].

En una faceta preferente de la presente invención, el marcador genético se crea alterando el genotipo de la cepa. Esta alteración puede ser no-revertante y/o no supresora, revertante o supresora o una combinación de lo mismo. Además la cepa se puede marcar varias veces. La habilidad de la cepa de tener más de un marcador genético puede representar una ventaja al permitir utilizar una gran variedad de huéspedes. Las cepas marcadas de forma múltiple pueden contener alteraciones en dos o más rutas diferentes de utilización de carbohidratos, utilizando, por ejemplo, enzimas de la propia ruta, componentes del transporte y componentes reguladores.

Si dos carbohidratos diferentes utilizan la misma ruta, la cepa puede marcarse con una mutación no-revertante, no-supresora y con una no-revertante o no supresora. Un ejemplo sería si la mutación no-revertante se halla en la utilización de una ribosa y la mutación revertante fuera una mutación puntual en la utilización de la ramnosa, como por ejemplo la mutación \Delta(rbs7) y la mutación rhaR.

La cepa también puede marcarse con dos mutaciones no-revertantes (y no supresoras) que afecten la utilización de carbohidratos. Por ejemplo, una mutación no-revertante en la utilización de la maltosa y la otra mutación no revertante en la utilización de la ribosa, como por ejemplo la mutación \Delta(malE) y la mutación \Delta(rbs7).

El número total de cepas marcadas independientes (TMS) que pueden derivarse está en función del número total de marcadores TM y del número de marcadores por cepa (MPS) según la siguiente ecuación:

TMS = (TM)!/(MPS)!(TM-MPS)

Así, con dos marcadores por cepa, el número total de cepas marcas independientes es:

Nº de marcadores	2	3	4	5	6	7
Nº de cepas marcadas	1	3	6	10	15	21

Con tres marcadores por cepa, el número total de cepa marcadas independientes es:

Nº de marcadores	3	4	5	6	7
Nº de cepas marcadas	1	4	10	20	35

Por tanto, para más de diez cepas marcadas es mejor insertar tres marcadores en cada cepa.

Ejemplos de cepas bacterianas marcadas que serían adecuadas en la presente invención, se indican en la tabla siguiente:

2

De las que se indican en la tabla anterior, la cepa más idónea es la 46D5 y la 48A4.

El ácido nucleico codificante del polipéptido de interés se inserta en las células huéspedes. Preferentemente esto se consigue mediante transfección y en especial transformando las células huéspedes con los vectores de expresión citados anteriormente y cultivándolas en medio con nutrientes convencionales y medios modificados para inducir los diversos promotores.

Por transfección se entiende la incorporación de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de que las secuencias codificantes se expresen. El término "transfección" incluye técnicas de transformación, conjugación y transducción. Generalmente se utilizan procedimientos de transfección conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, el del CaPO_{4} y la electroporación, así como los métodos de transformación descritos más adelante. Una transfección ha sido satisfactoria cuando es posible reconocer en la célula huésped cualquier actividad procedente del vector.

La transformación significa introducir un DNA en un organismo de modo que dicho DNA sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o como un integrante del cromosoma. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas apropiadas para cada célula. El tratamiento con calcio, empleando cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982], se usa normalmente para células procariotas o otras células que contengan paredes celulares que representan una barrera importante. Otro método para la transformación emplea polietilén glicol/DMSO, tal como se describe en Chung y Miller, Nucleic Acid Res., 16: 3580(1988). Otro método más es la técnica de electroporación. Las transformaciones en levaduras se realizan normalmente mediante el método de Solingen y col., J. Bact., 130:946(1977) and Hsiao y col., Proc. Natl Acad.Sci.(USA), 76:3829(1979).

C. Cultivo de células huéspedes

Las células procariotas utilizadas para producir el polipéptido de interés se cultivan en un medio adecuado, tal como se describe en Sambrook y col. supra. Las condiciones de cultivo, temperatura, pH son las mismas que previamente se usaron con las células huéspedes seleccionadas para la expresión y por lo tanto serán evidentes para un experto en la materia.

Si se ha utiliza el promotor de la fosfatasa alcalina, las células bacterianas para producir el polipéptido interés en esta invención se cultivan en medio adecuado para que el promotor de la fosfatasa alcalina pueda ser parcial o completamente inducido, tal como se describe en Sambrook y col., supra. El cultivo no tiene lugar en ausencia de fosfato inorgánico o en niveles de deprivación de fosfato. En un principio, el medio contiene fosfato inorgánico en unos niveles por encima del nivel de inducción de síntesis de proteínas y suficiente para el crecimiento bacteriano. A medida que las células crecen utilizan fosfato, disminuyendo éste en el medio y causando la inducción de la síntesis del polipéptido.

Además del carbono, el nitrógeno, y las fuentes de fosfatos inorgánicos otrosingredientes necesarios se deben incluir en el medio en concentraciones apropiadas, solos o como mezcla con otro ingrediente o medio, como por ejemplo una fuente compleja de nitrógeno. El pH del medio puede hallarse entre 5-9, dependiendo principalmente del organismo huésped.

Si el promotor es inducible, para que ocurra la inducción, las células se cultivarán hasta alcanzar cierta densidad óptica, e.j. una A_{550} de aproximadamente 60-80, punto en el que se inicia la inducción (p.ej., por adición de un inductor, por depleción de un componente del medio, etc.) para inducir la expresión del gen codificante del polipéptido de interés.

D. Detección de la expresión

La expresión génica puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, por un método convencional de transferencia de Southern, transferencia de northern para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), transferencia de mancha (análisis de DNA) o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuada, basada en la secuencia del polipéptido. Es posible utilizar diferentes marcajes, más corrientemente radioisótopos y en particular el P^{32}. Sin embargo, se pueden utilizar otras técnicas como emplear nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina sirve como sitio de unión de la avidina o de anticuerpos que a su vez pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores como los radionúclidos, los fluorógenos, las enzimas o similares. De manera alternativa, se pueden utilizar ensayos o geles para la detección de la proteína.

Para la secreción de un producto génico expresado, la célula huésped se cultiva en condiciones suficientes para la secreción del producto génico. Condiciones que incluyen p.ej., temperatura, nutrientes y densidad celular que permitan la secreción por la célula. Estás condiciones son aquellas en las que la célula realiza sus funciones celulares básicas de transcripción, traducción y trasiego de proteínas de un compartimento celular a otro, como bien se conoce por los expertos en la materia.

II. Ensayo

En la aplicación de este ensayo, se obtiene una muestra del cultivo de fermentación microbiana. Si el cultivo es una fermentación a alta densidad, la muestra contiene preferentemente de 10^{8} a 10^{10} unidades formadoras de colonias (CFU) por ml de cultivo. Típicamente, esta muestra se obtiene al término de la fermentación, pero puede obtenerse en cualquier momento durante el cultivo. Las células de la muestra aislada se siembran en una o más placas con medio de cultivo complementado con una de las fuentes de carbohidratos no utilizadas por el huésped marcado. Preferentemente, se utilizan dos placas, cada una complementada con una de las fuentes de carbohidratos no utilizadas por el huésped marcado. En otra realización preferida, las placas contienen medio mínimo o preferentemente agar de medio mínimo.

Se utiliza un fermentador de alta densidad como recipiente de cultivo, dependiendo del tipo de marcaje genético de la cepa de célula huésped, y las células se siembran directamente (preferentemente a aproximadamente 10^{8} a 10^{11} CFU/ml de cultivo) o se diluyen a un nivel suficiente para evitar la detección de revertantes o supresores de la utilización de carbohidratos y se aplican a las placas. Si las células se diluyen, preferentemente se realizan diluciones seriadas, empezando con aproximadamente 10^{8} a 10^{11} CFU/ml de cultivo y finalizando con aproximadamente
10^{5} a 10^{8} CFU/ml en, por ejemplo, medio de cultivo o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por ejemplo, una dilución está indicada cuando la mutación marcadora es una mutación revertante o puede ser suprimida, p.ej., mediante una modificación espontánea del organismo huésped, de modo que se crea, o se produce, un revertante o supresor de la utilización de carbohidratos. La dilución se realiza para asegurar que la inversión o la supresión de la mutación marcadora no interfiere con los resultados (falsos positivos). La dilución de la muestra a aproximadamente 10^{6} CFU/ml proporciona un nivel satisfactorio de sensibilidad con un margen adecuado de seguridad para la eliminación de resultados falsos positivos. Otro motivo para realizar una dilución sería si se deseara una reducción de la sensibilidad del ensayo.

El medio de cultivo en las placas se puede aumentar individualmente o en combinación con aminoácidos, oligoelementos, vitaminas o bases nucleotídicas en una concentración que permita el crecimiento de cualquier cepa auxotrófica que se desee detectar. Cualquier ingrediente que se pueda utilizar como única fuente de carbono por una bacteria como E. coli, debería añadirse a una concentración lo suficientemente baja para no permitir la formación de colonias de la cepa marcada.

A continuación, se incuban las placas a una temperatura adecuada y durante un tiempo determinado para permitir el crecimiento suficiente de una colonia para su detección, es decir, detección fiable y exacta. El período de tiempo necesario para la incubación dependerá, por ejemplo, de la temperatura de incubación, del tipo de marcador y del tipo de cepa microbiana. De forma característica, la temperatura varía desde aproximadamente 20-40ºC, más preferentemente de 30-38ºC y más preferentemente de 37ºC; y el tiempo de incubación varía desde aproximadamente 24 a 120 horas, más preferentemente desde 35-90 horas si la temperatura es de unos 30-38ºC, más preferentemente entre
48-72 horas si la temperatura es de 37ºC.

Por último, se utiliza una etapa de detección para determinar si hay colonias creciendo en las placas. La presencia de colonias, determinada fácilmente mediante inspección visual, indica la presencia de cepas microbianas contaminantes, ya que pueden crecer sobre una fuente de carbohidrato con la que se ha complementado la placa. De acuerdo con la normativa establecida para las CFUS de la muestra tras el plaqueado, la sensibilidad del ensayo implica la detección de aproximadamente 1 cada 10^{6} a 1 cada 10^{10} organismos de contaminación cruzada de huésped.

En otra etapa, se puede identificar cualquier colonia detectada que proceda de la cepa celular huésped microbiana cultivada o de otra cepa. Por ejemplo, si se desea que la cepa huésped sea E. coli, estos organismos se pueden identificar como contaminantes E. coli o no-E.coli. Si las colonias proceden de la cepa huésped de E. coli, se puede identificar la cepa huésped por su utilización exclusiva de carbohidratos. En consecuencia, se puede identificar el polipéptido contaminante, el polipéptido heterólogo presunto y se puede separar del producto deseado, ya que el polipéptido se producirá a partir de la cepa contaminante asociada o identificada con éste.

En un aspecto del procedimiento de identificación, después de la etapa de detección, se recupera cualquier colonia que crezca con el medio complementado y se siembra en diversos medios con distintos tipos de carbohidratos para identificar cualquier célula huésped contaminante por su deficiencias únicas y específicas en la utilización de carbohidratos.

El ensayo es también particularmente útil en un procedimiento para la fabricación de múltiples polipéptidos en un solo recipiente de cultivo o fermentador, de modo que las células huésped residuales productoras de un tipo de polipéptido no contaminen un cultivo de célula huésped productora de otro tipo de polipéptido. El ensayo se lleva a cabo tal como se describió en la etapa de detección. Si en la placa, crecen colonias positivas, el operador determinará si el lote necesita ser descartado o puede continuarse su utilización. Después de que la primera cepa de células huésped microbianas se cultive hasta alcanzar la meseta, los contenidos de los recipientes de cultivo se vacían y los recipientes se limpian y esterilizan. A continuación, una segunda cepa huésped microbiana se introduce en un cultivo en el mismo recipiente o en uno adyacente. Esta segunda cepa contiene el ácido nucleico que codifica para una segundo polipéptido y está marcada genéticamente por un marcador o marcadores distintos a los utilizados en el cultivo de la primera cepa. Dichos marcadores causan que la cepa no utilice una fuente de carbohidrato distinta como sustrato. Esta segunda cepa es capaz de utilizar la primera fuente de carbohidrato como sustrato.

El procedimiento para producir más de un polipéptido en el mismo fermentador comprende además las etapas de: aislamiento y siembra de una muestra del segundo cultivo de células productoras de polipéptidos en un medio de cultivo complementado con una fuente de carbohidratos no utilizados por la segunda cepa huésped; incubación de placas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que las colonias positivas crezcan completamente; y detección de cualquier colonia que crezca en las placas. Estas etapas se realizan tal como se describió anteriormente.

Después de vaciar el recipiente de cultivo, limpiarlo y esterizarlo, se pueden repetir las etapas anteriores indefinidamente, comenzando con la etapa de cultivo, utilizando una tercera o más de una cepa que no utilice una tercera fuente de carbohidrato como sustrato, pero que sea capaz de utilizar la primera y la segunda fuente de carbohidratos como sustratos, siendo todas las fuentes distintas.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y sin ánimo de limitación.

III. Ejemplos Construcción de las cepas

Las cepas marcadas genéticamente se construyeron introduciendo en el huésped una mutación de deleción en una vía de utilización de carbohidratos. Las mutaciones por deleción se construyeron (1) mediante PCR in vitro y se recombinaron en el cromosoma, o (2) se obtuvieron a partir de una fuente externa y se introdujeron en el huésped E. coli mediante transducción con P1. Las deleciones génicas construidas por PCR se crearon utilizando oligonucleótidos para generar dos extremos del gen, eliminando aproximadamente 500 pb en la porción interna del gen. Los dos extremos del gen se ligaron juntos mediante una diana SpeI. El fragmento que contenía la deleción se subclonó en pS1080. Este plásmido, pS1080, tiene un origen R6K oriR de replicación, el poliengarce de clonaje y la región intergénica del bacteriófago f1, el gen de la beta-lacatamasa de PBR322 y el gen sacB de Bacillus subtilis. Mediante transducción de M13 y selección con carbenicilina, el plásmido completo se recombinó en el cromosoma de un derivado w3110 que no soporta la replicación independiente del vector plasmídico. La transducción consiguiente de P1 se utilizó para traspasar el plásmido de deleción integrado en el cromosoma a otros huéspedes de E.coli utilizando la selección con carbenicilina. Para obtener plásmidos resolventes, se seleccionaron derivados resistentes a sacarosa a temperatura ambiente y se rastrearon para la pérdida de resistencia a carbenicilina. Ee confirmó que el DNA cromosómico de las colonias sensibles a carbenicilina y resistentes a sacarosa portaba la deleción planificada mediante PCR. El fenotipo negativo de carbohidratos también se confirmó en agar de MacConkey al 1% del azúcar deseado.

Ejemplo I Cepa marcada con una única mutación no-revertante de carbohidrato

En este ejemplo se describe un ensayo sensible para la detección de organismos contaminantes en un sistema de fabricación multiuso. EL organismo productor se marcó con una mutación no revertante en una ruta de utilización de carbohidratos. El impacto de la mutación se silenció en el estadío de producción de la proteína recombinante; sin embargo, en ensayos subsiguientes, el organismo diana podría distinguirse por un test simple de utilización de carbohidrato de otros organismos E. coli potencialmente contaminantes por contaminación cruzada de huésped.

La cepa 37D6, derivada de E. coli K-12 W3110, lleva un plásmido productor de proteína recombinante, con genotipo W3110IN(rrnD-rrnE)1\DeltafhuAphoA\DeltaE15(argF-lac)169 ptr3 degP41 (kan^{R})\DeltaompT ilvG2096^{R}\Delta(rbs7), 37\Delta6 deriva de la cepa 27C7 descrita en la patente Pat. No. 5.288,931 y el número de registro del American Type Culture Collection No. 55.244. La mutación \Delta(rbs7)(Lopilato y col., J Bacteriol., 158:665-673 [1984]) se introdujo por P1 co-transducción con P1 de manera que este huésped pudiera ser diferenciado de otros huéspedes recombinantes por un simple test de utilización de carbohidrato. La delección rbs se introdujo por cotransducción de P1 con Tn10 insertado en el gen ilv. La auxotrofía isoleucina/valina se transdujo a la prototrofía mediante el fago P1 crecido en una cepa que lleva la mutación ilvG2096^{R}(Lawther y col., Proc Natl. Acad, Sci. USA, 78: 922-925 [1981]), que repara un cambio en la pauta de lectura responsable de la sensibilidad a la valina en la cepa salvaje de E.coli K-12. Se confirmó la deficiencia en la utilización de la ribosa en la resultante 37D6 utilizando medio mínimo con ribosa como fuente de carbono.

Se obtuvo una muestra al final de los 10 l. de fermentación (realizado tal como se describe en la patente americana U.S. 5.288.931), utilizando una técnica estéril y se guardó a 4ºC antes de sembrarla. Se realizaron diluciones seriadas de 10 veces en PBS. Se sembraron un total de 0,1 ml de muestra en medio mínimo conteniendo ribosa al 0,2%-0,4% como fuente de carbono. La composición del medio por litro fue de: NH_{4}Cl10 mM; 11.27 gramos de K_{2}HPO_{4}; 4.83 gramos de KH_{2}PO_{4}; 0.5 gramos de citrato sódico dihidratado; 0.123 gramos de MgSO_{4} heptahidratado; 15 gramos de Bacto-agar y 0.2%-0.4% de la fuente de carbono deseada. Las placas se preincubaron a 37º entre 48-72 horas, tiempo suficiente para que una colonia positiva pueda alcanzar un tamaño detectable. Un cultivo control que podía utilizar la ribosa se utilizó como control positivo por su crecimiento en este medio.

Se determinaron para dos fermentaciones las unidades formadoras de colonias, es decir, la densidad de población celular (CFU/ml). Las condiciones de fermentación fueron para SI275 de 1,0 x10^{10} CFU/ml y para SI276, 4.0x10^{10} CFU/ml. Por placa se sembraron entre 10^{9-}10^{4}CFU. No se observaron colonias tal como se indica en la Tabla 1. El cultivo control creció como se esperaba en las placas de ribosa. Estos resultados indican que la mutación \Delta(rbs7) es no revertante y no supresora. También se detectaron mutaciones compensadoras que permitían el crecimiento en ribosa. Por tanto podría sembrarse un cultivo conteniendo 10^{9} CFU/placa del organismo deseado y la sensibilidad del ensayo con una mutación no revertante sería aproximadamente de un organismo contaminante por cada 10^{9} células sembradas.

TABLA

37D6CFU	COLONIAS DETECTADAS
Fermentación SI275
1x10^{9}	ninguna
1x10^{8}	ninguna
1x10^{7}	ninguna
1x10^{6}	ninguna
1x10^{5}	ninguna
1x10^{4}	ninguna
Fermentación SI276
4,0x10^{9}	ninguna
4,0x10^{8}	ninguna
4,0x10^{7}	ninguna
4,0x10^{6}	ninguna
4,0x10^{5}	ninguna
4,0x10^{4}	ninguna

Ejemplo II Marcado múltiple de una cepa con una mutación para carbohidrato no revertante y una revertante (mutación puntual)

Para aumentar el número de cepas productoras marcadas, se pueden marcar cepas de forma múltiple. Este ejemplo describe el uso de doble marcado de cepas. Cada organismo productor contenía mutaciones en dos rutas de utilización de carbohidratos. En este ejemplo el organismo productor se marcó con una mutación no revertaente (utilización de ribosa) y una mutación revertante (mutación puntual de utilización de la ramnosa). La reversión de la mutación puntual se observó aproximadamente en un revertante por cada 10^{8} células sembradas. En este caso, se prefirió una dilución del organismo productor a un nivel suficiente por debajo de la detección de los revertantes. Estudios de sensibilidad con organismos que pueden utilizar tanto ribosa como ramnosa y ribosa indican que el ensayo es tan sensible como se podría esperar del número de organismos punteados sembrados en césped procedentes del organismo no utilizador del carbohidrato.

La cepa utilizada en este ejemplo se derivó de E. coli K-12 W3110 (que contiene un plásmido productor de una proteína recombinante).

La cepa 46D5, W3110IN(rrnD-rrnE)1\DeltafhuA\Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41 (\DeltaPst1-kan^{s})\DeltaompTphoS*(T10Y)
cyo::kan^{R}rhaR)\Delta(rbs7)ilvG2096^{R} se derivó de la cepa 27C7 (ver más arriba). Los pasos adicionales en la construcción de la cepa 46D5 se detallan más adelante.

Una inserción Tn10 en el gen ilv se introdujo en la 27C7 por transducción con P1. La auxotrofía para isoleucina/valina se transdujo a la prototrofía utilizando el fago P1 crecido en una cepa que lleva la mutación ilvG2096^{R}(Lawther y col., supra), que repara un cambio en la pauta de lectura causante de la sensibilidad a la valina en la cepa salvaje de E.coli K-12. La cepa resultante fue 43D3. El locus ilvG2096 se confirmó por la resistencia del huésped 43D3 a 40 \mug/ml de valina (0.3 mM).

La mutación degP4(\DeltaPSt1-kan^{R}) se reemplazó utilizando la transducción con P1 con la mutación adegP41(\DeltaPst1-kan^{s}). Se introdujo proAB::Tn10 unido a degP en la cepa 43D3. La auxotrofía a la prolina se transdujo mediante prototrofía mediante el fago P1 crecido en una cepa llevando la mutación degPkan^{S}. Ya que degP está unida por cotransudcción a fhu A, se confirmó que la nueva cepa, 43E7, retiene la resistencia para el bacteriófago T1.

El gen salvaje para la fosfatasa alcalina se reintrodujo en el genoma del huésped para aprovechar los beneficios obtenidos con la mutación phoS* descrita más abajo. La cotransducción con P1 de la inserción Tn5 en el gen proC con phoA* se usó para reintroducir el gen de la fosfatasa alcalina de tipo salvaje en el genoma el huésped. La transducción con P1 para la prototrofía de la prolina restauró el gen proC. La cepa resultante, 44D6, retiene la expresión de la fosfatasa alcalina y mantuvo la mutación responsable para el fenotipo Lac, \Delta(argF-lac).

Se introdujo una mutación que da como resultado una proteína de unión a fosfato, phoS* (T10Y) (patente americana U.S. 5.304.472). La proteína phoS* tiene una afinidad reducida por el fosfato en el medio. El resultado es que la inducción del promotor de fosfatasa alcalina tiene lugar a una concentración de fosfato superior a la del tipo salvaje. Esto permite la expresión del producto del promotor APasa sin privar de forma severa el cultivo de fosfato. PhoS se une mediante la cotransducción con P1 a ilv. Una inserción Tn10 en el gen ilv se reintrodujo mediante transducción con P1. La auxotrofía isoleucina/valina se transdujo a prototrofía utilizando el fago P1 crecido en una cepa portadora de phoS* (T10Y) y mutaciones ilv2090^{R}. La presencia de la mutación phoS* da como resultado colonias azules sobre medio de agar con alta concentración de fosfato y el sustrato cromogénico, 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato. La cepa resultante fue 45F8.

La mutación cyo::kan^{R} (Oden y col., Gene, 96:29-36 [1990]) en el gen para la citocromo o oxidasa se introdujo mediante transducción. Esta mutación se construyó in vitro reemplazando una porción del gen cyo con un gen de resistencia a la kanamicina. La introducción de esta mutación evita el cambio entre las citocromo oxidasas de baja y elevada afinidad, cyo y cyd, respectivamente (patente americana U.S. 5.342.763). El fenómeno de cambio de citocromos puede conducir a inestabilidades del oxígeno disuelto y a fermentaciones incompletas. La cepa resultante fue la 45F9.

Por último, dos mutaciones en las vías de utilización del carbohidrato se introdujeron para permitir que este huésped se diferenciara de otros huéspedes recombinantes mediante un test sencillo de utilización de carbohidratos. La mutación rhaR (Moralejo y col., J. Bacteriol., 175:5585-5594 [1993]) se introdujo mediante cotransducción con P1 con argE. Se introdujo una mutación argE::Tn1o. Se restableció la prototrofía de la cepa utilizando el fago P1 crecido en una cepa portadora de la mutación rahR. Se confirmó que la cepa resultante, 46F1, era incapaz de utilizar una fuente de carbono de ramnosa.

La mutación \Deltarbs7 (citada anteriormente) se introdujo mediante cotransducción con P1 con una inserción Tn10 ligada en el gen ilv. La auxotrofía isoleucina/valina se transdujo a prototrofía utilizando el fago P1 en una cepa portadora de la mutación ilvG2096^{R}. La presencia del defecto de utilización de ribosa en la cepa resultante, 46D5, se confirmó utilizando medio mínimo que contenía ribosa como fuente de carbono. La retención de la phoS* (T10Y) también se confirmó tal como se describió anteriormente.

Utilizando una técnica aséptica, se obtuvo una muestra del final de la fermentación de 100-l y se plaqueó tal como se describe en el Ejemplo 1. Las CFU/ml para la producción del organismo fueron de 8,5 x 10^{10}. Tal como se indica en la Tabla 2, no se detectaron colonias sobre las placas que contenían ribosa para 10^{9} células plaqueadas o durante cualquiera de las diluciones posteriores sembradas en placas. Sin embargo, se detectaron colonias sobre medio mínimo con ramnosa a un nivel de 8,2x10^{2} CFU/ml. La reversión de la mutación puntual de ramnosa se observó a aproximadamente 1 revertante por cada 10^{8} células plaqueadas.

TABLA 2

Test de contaminación cruzada de huésped para un organismo productor de IgF
Producción del organismo	Medio mínimo de ramnosa	Medio mínimo de ribosa
100 l (D.O 164)	8,2x10^{2} CFU/ml	ninguna
8,5x10^{10} CFU/ml

Los resultados de un estudio de punteado se muestran en la Tabla 3. Para el huésped 46D5, se plaquearon de 10^{6} a 10^{7} CFU sobre medio mínimo de ramnosa o medio mínimo de ribosa. Se realizaron diluciones de 10 veces del organismo punteado en PBS. El organismo punteado fue un Rha+\Deltarbs \Deltamal (cepa con marcaje múltiple) o un organismo de tipo salvaje (Rha+ Rbs+ Mal+). Se plaquearon 0,1 ml de diluciones 10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} junto con el organismo de producción. Las placas se incubaron a 37ºC durante 48-72 h. Los resultados esperados para la detección de los organismos punteados fueron equivalentes a los observados para la detección de los organismos punteados, con un error experimental normal. En este ejemplo, en donde la producción de organismos necesita diluirse para evitar la detección de falsos positivos (revertantes o supresores), la sensibilidad del ensayo es de aproximadamente un organismo contaminante por cada 10^{6} ó 10^{7} células plaqueadas.

TABLA 3

3

Ejemplo III Marcaje múltiple de la cepa con dos mutaciones de carbohidratos no-revertantes

Se puede lograr un ensayo altamente sensible si se utiliza una cepa marcadadoblemente con dos mutaciones no-revertantes. Esta cepa es una cepa derivada de E. coli K-12, denominada 48A4, con genotipo W3110\DeltafhuA \DeltamalE \Delta(rbs7). La cepa de inicio de E. coli W3110 es un derivado de E. coli K-12 que es F^{-} y lambda^{-}. Se ha demostrado que porta una inversión cromosómica entre rrnD y rrnE. El gen fhuA (patente americana U.S. 5.304.472) se delecionó a partir de W3110 mediante escisión imprecisa de Tn10 después de su inserción en el gen fhuA. La cepa resultante, IA2, es resistente al bacteriófago T1, T5 y 80. Se introdujeron dos mutaciones en las vías de utilización de carbohidratos. Una deleción de malE se construyó mediante PCR y se incorporó en un vector plasmídico, pS1080, que contenía la beta-lactamasa y la sacarosa de levan. Bass y col., J. Bacteriol., 178:1154-1161 (1996). El plásmido se recombinó mediante transducción con M13 y resistencia a la carbenicilina en el cromosoma de un derivado W31 10 que no soportará la replicación independiente del vector plasmídico (BW16824). Metcalf y col., Gene, 138:1-7 (1994); Basset y col., supra. La cepa 1A2 se transdujo a resistencia a carbenicilina con el fago P1 crecido en la cepa portadora del plásmido de deleción malE e integrado en su cromosoma. Los derivados resistentes a sacarosa se seleccionaron y rastrearon para la pérdida de resistencia a carbenicilina y la incapacidad para utilizar la maltosa. Mediante PCR, se confirmó que la cepa resultante, 46H9, portaba la deleción mal planificada.

La mutación \Delta(rbs7) (citada anteriormente) se introdujo mediante cotransducción con P1 con una inserción Tn10 en el gen ilv. Se obtuvo un prototrofo ilv+ plaqueando sobre medio mínimo de glucosa. La cepa resultante se denominó 48A4.

Una muestra del cultito en LB de toda la noche se centrifugó y concentró aproximadamente 10 veces de modo aséptico. Se realizaron diluciones seriadas de 10 veces en PBS. Se plaquearon 0,1 ml en medio mínimo (descrito anteriormente) que contenía un 0,2%-0,4% de fuente de carbono, indicada en la Tabla 4. Las placas se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 48 horas.

Las CFU/ml para el organismo test, 48A4, fueron 2,2x10^{10} CFU/ml. Se plaquearon 10^{9} a 10^{5} CFU por placa. No se observaron colonias, tal como se indica en la tabla 4. Los resultados indican la ausencia de reversión o supresión de dos marcadores de carbohidratos. En consecuencia, si se siembra un cultivo que contenga 10^{9} CFU/placa del organismo deseado, se obtendría una sensibilidad del test para un organismo no-revertante y doblemente marcado como el 48A4 aproximadamente de un contaminante por cada 10^{9} células plaqueadas.

TABLA 4

	Colonias detectadas
CFU plaqueadas de 48A4	Medio mínimo de ribosa	Medio mínimo de maltosa
2,2x10^{9}	Ninguna	Ninguna
2,2x10^{8}	Ninguna	Ninguna
2,2x10^{7}	Ninguna	Ninguna
2,2x10^{6}	Ninguna	Ninguna
2,2x10^{5}	Ninguna	Ninguna

Ejemplo IV Detección de un organismo auxotrófico contaminante

Un organismo de contaminante cruzada de huésped que necesite un aminoácido determinado o tenga cualquier otro requisito auxotrófico podría detectarse ajustando la composición del medio. En este ejemplo, se muestra que puede detectarse un auxótrofo de leucina utilizando el medio descrito más adelante. 26G5 es un derivado de la cepa de
E. coli K-12 W31 10 \DeltafhuA que contiene una deleción en leuA. Este organismo, que tiene un requerimiento para el aminoácido leucina, se utilizó para estudios de punteado que se muestran más adelante. La leucina se añadió al medio mínimo a una concentración de 0,3 mM o como parte de una mezcla de componentes (suplementos completos) que podrían soportar el crecimiento de la mayoría de cepas de E. coli auxotróficas. El suplemento completo está compuesto de componentes que se sabe no son utilizados por el organismo E. coli como única fuente de carbono. Los componentes del suplemento completo incluyen: 0,3 mM de los aminoácidos L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glicina, L-histidina, L-valina, L-leucina, L-metionina, L-treonina, L-isoleucina, L-glutámico, L-triptófano, L-fenilalanina y
L-lisina; 15 \mug/ml (0,1 mM) de hipoxantina; vitaminas (0,2 \mug/ml de mio-inositol, 0,1 \mug/ml de pantotenato,
0,1 \mug/ml de niacianamida, 0,1 \mug/ml de piridoxal HCl, 0,1 \mug/ml de cloruro de colina, 0,1 \mug/ml de ácido fólico, 0,01 \mug/ml de riboflavina, 0,34 \mug/ml de ácido para-aminobenzoico y 0,5 \mug/ml de tiamina); y oligoelementos
(27 \mug/ml de cloruro férrico hexahidrato, 8 \mug/ml de sulfato de zinc, 7 \mug/ml de cloruro de cobalto hexahidrato,
7 \mug/ml de molibdato sódico, 8 \mug/ml de sulfato cúprico pentahidrato, 2 \mug/ml de ácido bórico y 5 \mug/ml de sulfato de manganeso monohidrato).

Los procedimientos de construcción de la cepa para 46D5 y 48A4 se describen en mayor detalle en los Ejemplos II y III, respectivamente. Una muestra del cultivo LB de toda la noche se centrifugó y concentró aproximadamente 10 veces de forma aséptica. Se realizaron diluciones seriadas de 10 veces en PBS. Para el huésped 46D5, se plaquearon 10^{6} ó 10^{7} CFU en medio mínimo de ramnosa suplementado con sólo medio mínimo de ramnosa-leucina con suplementos completos.

Para el huésped 48A4, se plaquearon 10^{9} CFU en medio mínimo de maltosa suplementado sólo con leucina o medio mínimo de maltosa con suplementos completos. No se detectaron colonias para ningún organismo en ausencia del cultivo punteado.

Se realizaron diluciones seriadas de 10 veces en PBS del organismo auxotrófico para leucina 26G5 para representar un contaminante putativo. Se plaquearon un total de 0,1 ml las diluciones 10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} junto con el organismo productor. Las placas se incubaron a 37ºC durante 48-72 h. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Los estudios de punteado con un auxotrofía por la leucina indican que el ensayo es tan sensible como puede esperarse de organismos punteados y plaqueados mediante siembra en césped sobre un organismo no utilizador. En el caso de que el organismo productor no necesite ser diluido, la sensibilidad es aproximadamente de un contaminante por cada 10^{9} células plaqueadas. Si es necesario, el organismo productor puede necesitar ser diluido para evitar la detección de falsos positivos (revertantes o supresores) y en este caso, la sensibilidad es del orden de un organismo contaminante por cada 10^{6} ó 10^{7} células plaqueadas. La complementación de un aminoácido como la leucina o una complementación más amplia que detectara la mayoría de cepas de E. coli auxotróficas produciría resultados
similares.

TABLA 5

4

5

Claims (6)

1. Procedimiento para analizar los contaminantes potenciales en un recipiente de cultivo utilizado para la fabricación de múltiples productos polipeptídicos, en donde los contaminantes potenciales son células huéspedes bacterianas, levaduras, o fúngicas que en la forma nativa utilizan carbohidratos, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) cultivar en el recipiente una cepa de células huésped que utilice más de una fuente de carbohidratos como sustrato, pero que esté marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para utilizar al menos un carbohidrato como sustrato y que comprenda el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se fabrica;

(b) plaquear una muestra aislada del cultivo de la etapa (a) en un medio de cultivo complementado con una fuente de carbohidratos que no es utilizada por las células huésped y sin ninguna otra fuente de carbohidratos;

(c) incubar las células plaqueadas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier colonia positiva pueda crecer a un nivel detectable; y

(d) detectar el crecimiento de colonias en medio de cultivo complementado.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los contaminantes de las células hospedadoras y la cepa de las células hospedadoras son bacterias.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los contaminantes de células hospedadoras y la cepa de células hospedadoras son E. coli.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sensibilidad es de aproximadamente 1 contaminante por cada 10^{6} células plaqueadas.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sensibilidad es de aproximadamente 1 contaminante por cada 10^{7} células plaqueadas.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sensibilidad es de aproximadamente 1 contaminante por cada 10^{9} células plaqueadas.