ES2268241T3 - Procedimiento de fermentacion que utiliza cepas de celulas huespedes microbianas marcadas. - Google Patents
Procedimiento de fermentacion que utiliza cepas de celulas huespedes microbianas marcadas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2268241T3 ES2268241T3 ES03020254T ES03020254T ES2268241T3 ES 2268241 T3 ES2268241 T3 ES 2268241T3 ES 03020254 T ES03020254 T ES 03020254T ES 03020254 T ES03020254 T ES 03020254T ES 2268241 T3 ES2268241 T3 ES 2268241T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- strain
- strains
- host cell
- culture
- carbohydrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/245—Escherichia (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento para producir, en un único recipiente de cultivo, múltiples productos polipeptídicos a partir de cepas de células huéspedes microbianas que utilizan más de una fuente de carbohidrato como sustrato, en donde las cepas de células huéspedes microbianas son cepas de células huéspedes bacterianas, de levadura, o fúngicas, cuyo proceso comprende: (a) cultivar en el recipiente una primera cepa de células huésped que comprende un ácido nucleico que codifica un primer producto polipeptídico que se está fabricando actualmente, y la cual está marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para usar una primera fuente de carbohidrato como sustrato; (b) sembrar una muestra aislada del cultivo de la paso (a) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidratos que no es utilizada por la cepa de células huéspedes como sustrato, y sin otras fuentes de carbohidratos; (c) incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier colonia positiva crezca hasta un nivel detectable; (d) detectar si cualquiera de las colonia está creciendo en el medio de cultivo suplementado, (e) una vez se ha completado el cultivo de la primera cepa de células huéspedes microbianas, retirar el contenido del recipiente de cultivo, y limpiar y esterilizar el recipiente; (f) cultivar en el recipiente una segunda cepa de células huéspedes microbianas que comprende un ácido nucleico que codifica un segundo producto polipeptídico que se está fabricando actualmente, y la cual está marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para usar una segunda fuente de carbohidrato como sustrato, en donde la cepa puede usar la primera fuente de carbohidrato como sustrato; (g) sembrar una muestra aislada del cultivo de la etapa (f) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidratos que no es utilizada como sustrato por la segunda cepa de células huéspedes, y sin otras fuentes de carbohidratos; (h) incubar las célulassembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier colonia positiva crezca hasta un nivel detectable; y (i) detectar si hay cualquiera de las colonias que está creciendo en el medio de cultivo suplementado,
Description
Procedimiento de fermentación que utiliza cepas
de células huéspedes microbianas marcadas.
Esta invención se refiere a un procedimiento que
implica cepas de células huéspedes marcadas genéticamente que son
habitualmente la fuente de fabricación de proteínas producidas de
forma recombinante en una instalación de fermentadores de múltiples
productos.
Se ha reconocido el potencial de los marcadores
genéticos en la identificación de cepas de levadura y se han
desarrollado cepas enológicas marcadas deliberadamente, por Vezinhet
y Lacroix, Bull. O. I. V., 643-644,
759-773 (1984). Petering y col., Am. J. Enol.
Vitic., 42:6 (1991) describen un procedimiento que utiliza la
tecnología del ADN recombinante para la introducción del gen de la
\beta-glucuronidasa (GUS) de E. coli como
marcador en cualquier cepa de levadura deseada. La producción de
nuevas cepas de microorganismos, que es aplicable a microorganismos
en los que la reproducción es normalmente asexual, se ha descrito en
la patente americana U.S. 2.820.742. La función de la luciferasa,
junto con su uso en ensayos luminiscentes y como gen marcador se ha
revisado por Ugarova y col., Biokhimiya,
58:1351-1372 (1993). El gen de la luciferasa puede
insertarse en una bacteria contaminante utilizando bacteriófagos y
los genes de la luciferasa se pueden utilizar como marcadores en
estudios de ADN recombinante, en ensayos del promotor y en otras
actividades. Prosser y col., Critical Reviews in
Biotechnology, 16:157-183 (1996) describen
el
desarrollo de técnicas para detectar y seguir la pista de microorganismos en ambientes naturales, y el desarrollo de sistemas moleculares marcadores para estos estudios. En la enología, el problema reside en la diferenciación de una cepa de una amplia variedad de contaminantes potenciales. Se pueden utilizar dos enfoques: el uso de una característica adquirida y la implantación genética de una propiedad diferenciadora y fácilmente detectable. La primera es poco adecuada para la vinificación. El marcaje genético descrito en el trabajo citado anteriormente, consiste en la adquisición por parte de la cepa de resistencia a antibióticos (cloramfenicol y oligomicina). El determinismo genético de esta resistencia se localiza en el genoma mitocondrial de la célula. El marcaje tiene las siguientes características: el genoma nuclear no se modifica; por tanto el riesgo de alteración del potencial enológico de la cepa es mínimo, las características adquiridas se reconocen con facilidad (por el crecimiento en un medio de cultivo específico) y no comportan una desventaja selectiva para la cepa marcada en condiciones de competencia natural.
desarrollo de técnicas para detectar y seguir la pista de microorganismos en ambientes naturales, y el desarrollo de sistemas moleculares marcadores para estos estudios. En la enología, el problema reside en la diferenciación de una cepa de una amplia variedad de contaminantes potenciales. Se pueden utilizar dos enfoques: el uso de una característica adquirida y la implantación genética de una propiedad diferenciadora y fácilmente detectable. La primera es poco adecuada para la vinificación. El marcaje genético descrito en el trabajo citado anteriormente, consiste en la adquisición por parte de la cepa de resistencia a antibióticos (cloramfenicol y oligomicina). El determinismo genético de esta resistencia se localiza en el genoma mitocondrial de la célula. El marcaje tiene las siguientes características: el genoma nuclear no se modifica; por tanto el riesgo de alteración del potencial enológico de la cepa es mínimo, las características adquiridas se reconocen con facilidad (por el crecimiento en un medio de cultivo específico) y no comportan una desventaja selectiva para la cepa marcada en condiciones de competencia natural.
La llegada de la biotecnología ha llevado al uso
clínico y la posterior aprobación sólo en los Estados Unidos de más
de diez proteínas obtenidas de manera recombinante, incluyéndose el
interferón gamma, el interferón beta, el interferón alfa, la
insulina, el Factor VIII, el activador tisular del plasminógeno, la
hormona de crecimiento humana, el factor estimulador de colonias,
la eritropoyetina y la ADNasa. Además, existen muchos fármacos que
están siendo desarrollados o están en fase clínica para su
aprobación futura. En los sistemas de fermentación la capacidad
está limitada, de manera que se utiliza el mismo fermentador en la
producción de diferentes productos. Un ejemplo es la fabricación de
diferentes anticuerpos en el mismo fermentador. De forma similar,
es posible que en un fermentador adyacente se esté produciendo
simultáneamente un producto distinto. Véase Bader y col.,
"Multiuse Manufacturing Facilities for Biologicals", BioPharm,
5:32-40 (Septiembre 1992) para consultar las
medidas utilizadas en la prevención de la contaminación cruzada en
la fabricación de productos obtenidos con licencia biológica en
sistemas multiuso y las normas reguladoras cuando el sistema se use
para la manufactura de más de un producto.
Existe por tanto, una clara necesidad de poder
detectar cuando un organismo productor de un producto distinto
contamina la producción deseada de un cultivo. En una instalación de
múltiples productos, el contaminante podría ser cualquiera de
varios organismos similares. El ensayo debe ser fácil de llevar a
cabo y debe detectarse sensiblemente cualquiera de los
contaminantes potenciales.
La solicitud de patente internacional WO 94/12
630 describe un proceso para producir un polipéptido de interés a
partir de la fermentación de células huéspedes bacterianas que
comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido, cuyo
procedimiento comprende llevar a cabo la fermentación usando células
huéspedes bacterianas que tienen una cadena de transporte
electrónico desactivada, También se describe un procedimiento para
determinar si un cultivo particular de células bacterianas tienen
tendencia a la inestabilidad del oxígeno disuelto cuando se
fermenta a gran escala.
La presente invención proporciona un proceso de
producción, en un único recipiente de cultivo, de múltiples
productos polipeptídicos procedentes de cepas de células huéspedes
microbianas que utilizan más de una fuente de carbohidratos como
sustrato, en donde las cepas de células huéspedes microbianas son
cepas de células huéspedes bacterianas, de levadura, o de hongo,
cuyo procedimiento comprende:
- (a)
- cultivar en el recipiente una primera cepa de células huéspedes microbianas que comprende el ácido nucleico que codifica un primer producto polipeptídico que se está fabricado actualmente, y la cual está marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para usar una primera fuente de carbohidrato como substrato;
- (b)
- sembrar una muestra aislada del cultivo procedente de la etapa (a) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidrato no utilizada por la cepa de células huéspedes como sustrato, y sin otras fuentes de carbohidratos;
- (c)
- incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que cualquier colonia positiva crezca hasta un nivel detectable;
- (d)
- detectar si cualquiera de las colonia está creciendo en el medio de cultivo suplementado;
- (e)
- una vez se ha completado el cultivo de la primera cepa de células huéspedes microbianas, retirar los contenidos del recipiente de cultivo y limpiar y esterilizar el recipiente;
- (f)
- cultivar en el recipiente una segunda cepa de células huéspedes microbianas que comprende el ácido nucleico que codifica un segundo producto polipeptídico que se está fabricado actualmente, y la cual está marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para usar una segunda fuente de carbohidrato como substrato, en donde la cepa puede usar la primera fuente de carbohidratos como sustrato;
- (g)
- sembrar una muestra aislada del cultivo procedente de la etapa (f) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidrato no utilizada como sustrato por la segunda cepa de células huéspedes, y sin otras fuentes de carbohidratos;
- (h)
- incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que cualquier colonia positiva crezca hasta un nivel detectable y
- (i)
- detectar si cualquiera de las colonias está creciendo en el medio de cultivo suplementado.
Tal y como se utiliza en la presente, células
"contaminantes" son aquellos materiales que no se desea que
estén presentes en un cultivo determinado de interés.
Para los objetivos en la presente, "recipiente
de cultivo" es un recipiente que se utiliza para cultivar al
cepa o cepas de células huéspedes microbianas. Esto incluiría los
matraces de agitación, así como los fermentadores, tales como los
destinados a la producción de polipéptidos a gran escala. El
fermentador es convenientemente de cualquier tamaño, incluyendo
tanques de 1 L, 10 L, 1000 L, 10.000 L y 1000.000 L.
Tal y como se utiliza en la presente, el término
"polipéptido" o "polipéptido de interés" se refiere
generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de
aproximadamente diez aminoácidos. Preferentemente, los polipéptidos
son "exógenos", lo que significa que son "heterólogos", es
decir, extraños a la célula huésped que se está utilizando, tal
como una proteína humana producida por E. coli.
Ente los ejemplos de polipéptidos de mamíferos
se incluyen moléculas tales como, por ejemplo: la renina, una
hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana;
la hormona de crecimiento bovina; el factor liberador de la hormona
de crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora de
la tiroides; las lipoproteínas; la
\alpha1-antitripsina; la cadena A de la insulina;
la cadena B de la insulina; la proinsulina; la trombopoyetina; la
hormona estimuladora del folículo; la calcitonina; la hormona
luteinizante; el glucagón; los factores de coagulación, tales como
el factor VIIIC; el factor IX; el factor tisular y el factor von
Willebrand, factores anti-coagulantes, tales como
la Proteína C, el factor atrial natriurético; el tensoactivo de
pulmón; un activador del plasminógeno, tal como la uroquinasa o
activador de plasminógeno de la orina o del tipo tisular humano
(t-PA); la bombesina; la trombina; el factor del
crecimiento hematopoyético; el factor alfa y beta de necrosis
tumoral; la encefalinasa; una albúmina sérica, tal como la albúmina
sérica humana; la sustancia inhibidora de mulleriana; las cadenas A
y B de la relaxina; la prorelaxina; el péptido asociado a la
gonadotropina de ratón; proteínas microbianas, tal como la beta
lactamasa; la ADNasa; la inhibina; la activina; el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF); los receptores para hormonas
o factores de crecimiento; las integrinas; las proteínas A o D; los
factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como el factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la
neurotrofina-3, -4, -5 y -6 (NT-3,
NT-4, NT5, y NT-6), o un factor del
crecimiento nervioso, tal como el NGF-\beta; las
cardiotrofinas (factores cardíacos hipertróficos), tales como la
cardiotrofina-1 (CT-1); el factor
de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); el factor del
crecimiento de los fibroblastos, tales como aFGF y bFGF; el factor
de crecimiento epitelial (EGF); el factor de crecimiento
transformante (TGF), tal como TGF-alfa y
TGF-beta, incluidos el TGF-\beta1,
TGF-\beta2, TGF-\beta3,
TGF-\beta4, TGF-\beta5; el
factor de crecimiento tipo insulina-I y II
(IGF-I y IGF-II);
des(1-3)IGF-I (cerebro
IGF-1), las proteínas de unión al factor de
crecimiento tipo insulina; las proteínas CD, tales como
CD-3, CD-4, CD-8 y
CD-19; la eritropoyetina; los factores
osteoinductores; las inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea
(BMP); los interferones, tales como el interferón alfa, beta y
gamma; los factores estimuladores de colonias (CSFs), por ejemplo,
los M-CSF, GM-CSF, y
G-CSF; interleucinas (ILs) por ejemplo, de la
IL-1 a IL-10; el anticuerpo
anti-HER-2; la superóxido dismutasa;
los receptores de células T; las proteínas de la superficie de
membrana; el factor acelerador de la degradación; los antígenos
virales, tal como, por ejemplo, una parte de la cápside del virus
del SIDA; las proteínas de transporte; los receptores autoguiados;
las adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y los
fragmentos de cualquier de los polipéptidos enumerados
anteriormente.
Los polipéptidos exógenos preferidos de interés
son polipéptidos de mamíferos. Entre los ejemplos de dichos
polipéptidos de mamíferos se incluyen enzimas, hormonas, citocinas,
quimiocinas, inmunotoxinas, componentes virales, anticuerpos,
neurotrofinas y antígenos. Dichas proteínas adecuadas abarcan
polipéptidos humanos, tales como el t-PA, gp120,
anti-CD-11a,
anti-CD-18,
anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, activina,
inhibina, anti-HER2, ADNasa, IGF-I,
IGF-II, IGF-I cerebral, hormona del
crecimiento, cadenas de relaxina, factor liberador de la hormona
del crecimiento, cadenas de la insulina y la proinsulina, NGF,
NT-3, BDNF, y uroquinasa. Entre los polipéptidos de
mamíferos particularmente preferidos se incluyen, por ejemplo,
t-PA, gp120(IIIb),
anti-HER-2,
anti-CD-11a,
anti-CD18, anti-VEGF, VEGF, ADNasa,
IGF-I, IGF-II,
TGF-beta, IGFBP-3,
IGFBP-2, IGFBP-1, hormona del
crecimiento, NGF, NT-3, NT-4,
NT-5, y NT-6. El polipéptido más
preferido es el IGF, y más preferiblemente el
IGF-I.
Tal y como se utiliza en la presente, el término
"IGF-I" hace referencia al factor de
crecimiento de tipo insulina de diferentes especies, incluyéndose
el bovino, el ovino, el porcino, el equino y preferentemente el
humano, en su secuencia nativa o en una forma variante y producida
de manera recombinante. En un procedimiento preferido, se clona el
IGF-I, y su ADN se expresa en bacterias, por
ejemplo, mediante el procedimiento descrito en EP 128.733,
publicada el 19 de diciembre de 1984.
Tal y como se utiliza en la presente,
"genéticamente marcado" significa que tiene uno o más
marcadores genéticos, o marcadores cromosómicos, que causan que la
cepa en el que el marcador o marcadores están presentes no utilice
una fuente de carbohidrato como substrato.
La expresión "fuente de carbohidrato"
significa cualquier fuente de carbohidrato, incluyendo por ejemplo
la ribosa, la xilosa, la manosa, la maltosa, la glucosa, la
sacarosa, la fucosa, la fructosa, la lactosa y la ramnosa.
Preferiblemente, la fuente de carbohidrato en la presente invención,
no es la que se utiliza conjuntamente con la inducción de un
promotor para la producción de la cepa de células huéspedes, tales
como la lactosa o la arabinosa. Más preferiblemente, la fuente de
carbohidrato es la maltosa, la ribosa, la fucosa o la ramnosa.
"Revertientes o supresoras de la utilización
de la fuente de carbohidrato" se define como aquellas cepas
mutadas que han revertido de nuevo a su estado no mutado o que han
adquirido una mutación supresora en otro sitio, típicamente
mediante la modificación espontánea del organismo huésped. En los
genotipos revertientes, el gen que está mutado en la cepa implica
un mecanismo de utilización de carbohidratos que tiene la capacidad
de revertir el gen a su forma salvaje. Una alteración
"no-revertiente" es una alteración genética que
no causa que la cepa revierta a su estado no mutado. Una alteración
"no-supresora" es aquella en la cual el
organismo no adquiere una mutación supresora en otro sitio.
"Cepas de células huéspedes microbianas que
utilizan más de una fuente de carbohidrato como substrato" son
aquellos microorganismos que tienen la capacidad normal, o nativa de
utilizar dos o más carbohidratos como substrato, tal como la
mayoría de bacterias y al menos ciertos hongos y levaduras,
incluyendo, sin limitación Aspergillus, Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, y Pichia,
más preferiblemente A. awamori, S. Cerevisiae, S. Dairensis,
Schizosaccharomycespombe, K. marxianus, K. thermotolerans, C.
albicans, C. anatomiae, y P. pastoris.
Una "muestra" de cultivo es una pequeña
parte del cultivo celular que se obtiene para realizar el ensayo
aquí descrito.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
concreto. Entre las secuencias de control que son apropiadas para
los microorganismos se incluyen un promotor, tal como el de la
fosfatasa alcalina para bacterias, opcionalmente una secuencia
operadora, y un sitio de unión de ribosomas.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está colocado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
secuencia precursora o líder secretor está unido operativamente al
ADN para un polipéptido si se expresa como una
pre-proteína que participa en la secreción del
polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a
una secuencia codificante si afecta la transcripción de la
secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido
operativamente a una secuencia codificante si está situado de
manera que facilita la traducción. En general, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que están
unidas son contiguas y, en el caso del líder secretor, contiguas y
en la fase de lectura. La unión se consigue mediante ligación en
los sitios de restricción adecuados. Si estos sitios no existen, se
utilizan adaptadores o enlazadores sintéticos de oligonucleótidos de
acuerdo con la práctica convencional.
Tal y como se utilizan en la presente, las
expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo
celular" se usan de manera indistinta y todas estas
designaciones incluyen la progenie. De este modo, las palabras
"transformantes" y "células transformadas" incluyen la
célula primaria de interés y los cultivos derivados de la misma,
sin tener en cuenta el número transferencias. También se entiende
que no toda la progenie podría ser exactamente idéntica en
contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se
incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad
biológica tal como se seleccionó en la célula originalmente
transformada. Si se utilizan diferentes denominaciones, su
significado será evidente según el contexto.
La técnica de la "reacción en cadena de la
polimerasa" o "PCR" se utiliza aquí generalmente en
referencia a un procedimiento donde se amplifican cantidades
ínfimas de fragmentos específicos de ARN y/o ADN, tal como se
describe en la patente americana U.S. 4.683.195 publicada el 28 de
julio de 1987. Generalmente, para diseñar los oligonucleótidos
cebadores, se necesita que la información de la secuencia de los
extremos de la región de interés o de más allá esté disponible;
estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las
cadenas opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos del
extremo 5'-terminal de los dos cebadores podrían
coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede
utilizarse para amplificar secuencias específicas de ARN, de
secuencias de ADN específicas de ADN genómico total y de ADNc
transcrito a partir del ARN celular total, de secuencias de
bacteriófago o plasmídicas, etc. Véase en general, Mullis y col.,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); ed.
Erlich, PCR Technology (Stockton Press, NY. 1989). Para una revisión
reciente de los avances de la PCR, véase Erlich y col.,
Science, 252; 1643-1650 (1991).
Tal como se utiliza usa aquí, la PCR se
considera un ejemplo, pero no el único, del procedimiento de la
reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación de una
muestra de ensayo de ácidos nucleicos, el cual comprende la
utilización como cebador de un ácido nucleico conocido, y de una
polimerasa para amplificar y generar un fragmento específico de
ácido nucleico.
"Medio mínimo" se refiere al medio de
cultivo, diseñado para las placas de siembra, que contiene la
cantidad mínima de ingredientes necesarios para el crecimiento de
colonias celulares. Habitualmente, el medio mínimo es medio mínimo
de agar. Un ejemplo es el medio que contiene por litro entre
0.1-0.2 g de MgSO_{4} heptahidrato, 15 g de
Bacto-agar, NH_{4}Cl10 mM, 10-12 g
de K_{2}HPO_{4}, 4-5 g de KH_{2}PO_{4} y
0.5 g de citrato sódico dihidrato.
Se utilizan parámetro de fermentación y la
producción del polipéptido se realiza de una manera convencional,
al igual que en aquellos procedimientos descritos más adelante.
Durante el proceso de producción del polipéptido de interés, el
marcador o marcadores genéticos, en caso de mutación o alteración,
son silenciosos, puesto que el microorganismo no encuentra el
carbohidrato durante el proceso fermentativo.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido de
interés es convenientemente un ADNc o un ADN genómico procedente de
cualquier fuente, a condición de que codifique el polipéptido o
polipéptidos de interés, y generalmente es la secuencia nativa.
El ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc
o ADN genómico) se inserta convenientemente en un vector replicable
para su expresión en el microorganismo bajo el control de un
promotor adecuado. Para este propósito, están disponibles muchos
vectores, y la selección del vector apropiado dependerá
principalmente del tamaño del ácido nucleico a insertar en el
vector y de la célula huésped particular a ser transformadas por el
vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de la
célula huésped particular con la que es compatible. Dependiendo del
tipo de huésped concreto, los componentes del vector incluyen
generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los componentes
siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o
más genes marcadores, un promotor, y una secuencia terminadora de la
transcripción.
En general, los vectores plasmídicos que
contienen un replicón y secuencias control derivadas de especies
compatibles con el huésped se usan junto con el huésped microbiano.
El vector ordinariamente lleva un lugar de replicación, así como
secuencias de marcado que son capaces de proporcionar la selección
fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo E. coli
se transforma habitualmente con pBR322, un plásmido derivado de
E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar y col., Gene, 2;
95 [1977]). PBR322 contiene genes para la resistencia a la
ampicilina y la tetraciclina y por tanto proporciona medios fáciles
para la identificación de células transformadas. El plásmido
pBR322, u otros plásmidos o fagos microbianos, generalmente también
contienen, o se les modifica para que contengan, promotores que
pueden usarse en la expresión de genes marcadores de selección.
El ADN codificante del polipéptido de interés
aquí podría expresarse no sólo directamente, sino también como una
fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u
otro polipéptido que tenga dianas de corte específico en el extremo
N-terminal del polipéptido maduro. En general, la
secuencia señal podría ser un componente del vector o podría ser
una parte del ADN codificante del polipéptido que se inserta en el
vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debería ser una
secuencia que es reconocida y procesada (es decir, cortada por una
peptidasa señal) por la célula huésped.
En las células huéspedes procariotas que no
reconocen ni procesan la secuencia señal del polipéptido nativo, la
secuencia señal se substituye por una secuencia señal procariota
seleccionada, por ejemplo, de un grupo consistente en la fosfatasa
alcalina, la penicilina, el lpp, o líderes de la enterotoxina II
estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia
señal nativa puede substituirse, por ejemplo, por las secuencias
líderes de la invertasa de levadura, del factor alfa, o de la
fosfatasa ácida, la secuencia líder de la glucoamilasa de C.
Albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril del 1990), o la
secuencia señal descrita en WO 90/13.646 publicada el 15 de
noviembre del
1990.
1990.
Los vectores de expresión contienen una
secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una
o más células huéspedes seleccionadas. Tales secuencias son bien
conocidas para una variedad de bacterias y levaduras. El origen de
replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de
bacterias Gram negativas, y el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para levaduras.
Los vectores de expresión contienen generalmente
un gen de selección, también denominado marcador de selección. Este
gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el
crecimiento de las células huéspedes transformadas en un medio de
cultivo selectivo. Las células huéspedes no transformadas con el
vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio
de cultivo. Este marcador de selección es diferente de los
marcadores genéticos utilizados y definidos por la presente
invención. Los genes de selección característicos codifican
proteínas que (a) confieren resistencia frente antibióticos u otras
toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metrotexato o
tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas
distintas a las causadas por la presencia de marcadores genéticos,
o (c) aportan nutrientes críticos que no están disponibles en el
medio complejo, por ejemplo, el gen de la D-alanina
racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de esquema de selección utiliza un
fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. En este
caso, aquellas células que han sido transformadas con éxito con el
ácido nucleico de interés producen un polipéptido que confiere
resistencia al fármaco y por tanto sobreviven al régimen selectivo.
Los ejemplos de selección dominante utilizan fármacos como la
neomicina (Southern y col. J. Molec Apppl. Genet, 1:327
[1982]), el ácido micofenólico (Mulligan y col., Science,
209:1422 [1980], o la higromicina (Sugden y col., Mol.
Cell Biol., 5:410-413 [1985]. Los tres ejemplos
citados más arriba emplean genes bacterianos bajo el control
eucariótico para proporcionar la resistencia al fármaco apropiado
G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), e
higromicina, respectiva-
mente.
mente.
El trp1 es un gen de selección adecuado
para su utilización en levadura presente en el plásmido de levadura
YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman y
col., Gene, 7:141 [1979]; o Tschemper y col.,
Gene, 10:157 [1980]). El gen trp1 proporciona un
marcador de selección para una cepa de levadura mutante que ha
perdido la capacidad para incorporar triptófano, por ejemplo, la
ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics,
85:12 [1977]). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de
las células de levadura huéspedes proporciona un entorno efectivo
para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia
de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes
en Leu-2 (ATCC 20,622 o 38.626) se
complementan con plásmidos conocidos que llevan el gen
Leu2.
Leu2.
El vector de expresión para la producción del
polipéptido de interés, contiene un promotor adecuado que es
reconocido por la mayoría de organismos microbianos y está unido
operativamente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de
interés. Entre los promotores adecuados para ser usados con
huéspedes procariotas se incluyen los promotores de la
\beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col.,
Nature, 275:615 [1978]; Goeddel y col., Nature,
281:544 [1979]), el promotor de la arabinosa (Guzman y col., J.
Bacteriol., 174:7716-7728 [1992], la fosfatasa
alcalina, un sistema promotor del promotor del triptófano
(trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] y
EP 36.776) y los promotores híbridos como el promotor tac
(deBoer y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 [1983]). Sin embargo, otros promotores
bacterianos también son adecuados para su utilización. Sus
secuencias nucleotídicas han sido publicadas, permitiendo así que un
experto en la materia pueda unirlas operativamente al ADN que
codifica el polipéptido de interés (Siebenlist y col., Cell,
20:269 [1980]) mediante engarces o adaptadores que proporcionan
cualquier diana de restricción requerida.
Los promotores que se usan en los sistemas
bacterianos contienen también generalmente una secuencia tipo
Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que
codifica el polipéptido de interés. El promotor puede extraerse del
ADN de origen bacteriano mediante digestión con enzimas de
restricción, e insertarse en el vector que contiene el ADN
deseado.
Las secuencias promotoras son conocidas en
eucariotas como las levaduras y los hongos. Prácticamente todos los
genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada
aproximadamente entre 25 y 30 bases cadena arriba del sitio de
iniciación de la transcripción. Otra secuencia, que se encuentra
entre 70 y 80 bases cadena arriba del sitio de inicio de la
transcripción de muchos genes, es una región ACXCAAT, en donde X
puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de
genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que funciona como la
señal para la unión de la cola de poli-A en el
extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias
pueden insertarse convenientemente en vectores de expresión
eucariota.
Los ejemplos de secuencias promotoras que pueden
utilizarse en huéspedes levaduras incluyen los promotores para la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J
Biol. Chem., 255:2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas
(Hess y col., J Adv. Enzyme Reg., 7:149[1968]); y
Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978], tales como la enolasa,
la gliceraldehído 3-fosfatasa deshidrogenasa,
hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfatasa isomerasa, la 3
-fosfogliceratomutasa, la piruvatoquinasa, la triosa fosfato
isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras son los promotores
inducibles. Tienen la ventaja adicional de que la transcripción se
controla por las condiciones de crecimiento, y son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, enzimas degradadores asociados con el metabolismo
del nitrógeno, la metalotioneína, la
gliceraldehido-3-la fosfatasa
deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y la galactosa. Vectores y promotores adecuados para
utilizar en la expresión de levaduras se describen en Hitzemanm y
col., patente europea EP73. 657A
Los potenciadores de levadura se utilizan de
manera ventajosa con los promotores de levaduras. Véase, por
ejemplo, Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)
sobre potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El
potenciador puede ayustarse al vector en una posición 5' o 3' de la
secuencia codificante del polipéptido de interés, pero
preferentemente se sitúa en el extremo 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en las
células huéspedes eucariotas, incluyendo las levaduras y hongos,
también contienen las secuencias necesarias para la terminación de
la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas
secuencias están comúnmente disponibles en las regiones no
traducidas de los extremos 5' y, en algunos casos, de los extremos
3' en ADN o ADNc eucariotas o virales.
En la construcción de los vectores adecuados,
que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente,
se emplean las técnicas estándares de ligación. Los plásmidos
aislados o los fragmentos de ADN se cortan, se adaptan, y se
religan en la forma deseada para generar los plásmidos
requeridos.
En el análisis para la confirmación de las
secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de
ligación se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli
K12 (ATCC 31.446) u otras cepas, y los transformantes obtenidos se
seleccionan mediante la resistencia a ampicilina o tetraciclina
según convenga. De los transformantes se preparan plásmidos, se
analizan con endonucleasas de restricción y se secuencian mediante
el método de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74:5463-5467 (1977) o Messing y col.,
Nucleic Acid Res., 9:309 (1981), o por el método de Maxam
y col., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).
Las células huéspedes microbianas utilizadas
aquí para la expresión de vectores son procariotas, levaduras y
hongos, siempre que cumplan con el criterio descrito más arriba de
utilización de los carbohidratos y estén genéticamente marcadas tal
como se define en la presente. Entre los procariotas adecuados se
incluyen las bacterias como las arqueobacterias y las eubacterias,
abarcando organismos Gram+ o Gram-. Para el propósito de la
presente invención, son preferibles las eubacterias y más
especialmente las Enterobacteriaceae. Los ejemplos de
bacterias de utilidad incluyen especies como Escherichia,
Enterobacter, Azotobacter, Enwima, Bacillus, Psuedomonas,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigela, Rhizobia,
Vitreoscilla y Paracoccus, por ejemplo, E. coli,
B. Subtilis, P. aeruginosa, S. Typhimurium o Serratia
marcescens.
Las E. coli huéspedes preferibles como
huéspedes iniciales para ser marcadas incluyen E. coli W3 110
(ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B y
E. coli X1776 (ATTC 31,537). Estos ejemplos son ilustrativos
más que limitantes. Las células mutantes de cualquiera de las
bacterias arriba mencionadas pueden utilizarse como huéspedes
iniciales y marcarse después. Es, desde luego, necesario seleccionar
una bacteria apropiada, teniendo en cuenta la replicabilidad del
replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies
de E. coli, Serratia o Salmonella pueden usarse
como huéspedes cuando se usan plásmidos muy conocidos como pBR322,
pBR325, pACYC177, o pKN410 para proporcionar el replicón.
La cepa 10 de E. coli W31 es el huésped
preferido para ser marcado genéticamente porque es una cepa común
para productos de fermentación de ADN recombinante. Preferiblemente,
la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas
proteolíticas. Los ejemplos de huéspedes bacterianos iniciales para
ser marcados, junto con sus genotipos, se incluyen en la tabla
siguiente:
Para generar la cepa son adecuados también las
intermediarias 36F8, 27B4 (patente americana U.S. 5.304.472) y 35E7
(una colonia aislada espontáneamente resistente a la temperatura y
con mejor crecimiento que la 27B4), así como la intermediaria en la
generación de la cepa 48A4, cepa 46H9 descrita en el Ejemplo III de
más adelante. Una cepa adicional adecuada consiste en la E.
coli que tiene una proteasa(s) periplasmática descrita en
la patente americana U.S. 4.946.783, publicada el 7 de Agosto de
1990.
Además de los microbios procariotas, los
eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son también
huéspedes adecuados en la presente invención, siempre que cumplan
con los criterios de utilización de carbohidratos. Saccharomyces
cerevisiae, o la levadura común del pan, es el microorganismo
huésped eucariota más comúnmente utilizado. También se utilizan
otros géneros y especies frecuentemente disponibles como:
Saccharomyces dairensis; Schizosaccharomyces pombe [Beach y
Nurse, Nature, 290:140 (1981); EP 139.393 publicada el 2 de
Mayo del 1985]; el huésped Kluyveromyces (U.S. 4.943.529),
así como por ejemplo, K. lactis [Louvencourt y col., J
Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis, K. bulgaricus, K.
thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia [EP 402.226];
Pichia pastoris [EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic
Microbiol, 28; 265-278 (1988)]; huéspedes de
Candida como por ejemplo, Candida albicans y Candida
anatomiae; Trichoderma reesia [Ep 244,234]; Neurospora
crassa [Case y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 76;
5259-5263 (1979)]; y hongos filamentosos tales como
por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO
91/00357 publicada el 10 de enero de 1991], y de Aspergillus
tales como A. nidulans [Ballance y col., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 112:284-289 (1983)] y A.
niger. [Kelly y Hynes, EMBO J.,
4:475-479 (1985)].
En una faceta preferida de la presente
invención, el marcador genético se crea alterando el genotipo de la
cepa. Esta alteración puede ser no-revertiente y/o
no supresora, revertiente o supresora, o una combinación de las
mismas. Además la cepa se puede marcar varias veces. La capacidad de
la cepa para tener más de un marcador genético puede representar
una ventaja al permitir utilizar una gran variedad de huéspedes. Las
cepas marcadas de forma múltiple pueden contener alteraciones en
dos o más rutas diferentes de utilización de carbohidratos,
utilizando, por ejemplo, enzimas de la propia ruta, componentes del
transporte y componentes reguladores.
Si se usan dos vías diferentes de utilización de
carbohidratos, la cepa puede marcarse con una mutación no-
revertiente, no-supresora y con una mutación
revertiente o supresora. Un ejemplo es cuando la mutación
no-revertiente se halla en la utilización de una
ribosa y la mutación revertiente es una mutación puntual en la
utilización de la ramnosa, como por ejemplo la mutación
\Delta(rbs7) y la mutación rhaR.
La cepa también puede marcarse con dos
mutaciones no-revertientes (y no supresoras) que
afecten la utilización de carbohidratos. Por ejemplo, una mutación
no-revertiente afecta la utilización de la maltosa
y la otra mutación no revertiente afecta la utilización de la
ribosa, como por ejemplo la mutación \Delta(malE) y la
mutación \Delta(rbs7).
EL número total de cepas marcadas independientes
(TMS) que pueden derivarse está en función del número total de
marcadores (TM) y del número de marcadores por cepa (MPS) según la
siguiente ecuación:
TMS =
(TM)!/(MPS)!(TM-MPS)
Así, con dos marcadores por cepa, el número
total de cepas marcas independientes es:
Nº de marcadores | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
Nº de cepas marcadas | 1 | 3 | 6 | 10 | 15 | 21 |
Con tres marcadores por cepa, el número total de
cepa marcadas independientes es:
Nº de marcadores | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
Nº de cepas marcadas | 1 | 4 | 10 | 20 | 35 |
Por tanto, deben necesitarse más de diez cepas
marcadas antes de que compense insertar tres marcadores en cada
cepa.
Los ejemplos de cepas bacterianas marcadas que
son adecuadas en la presente invención, se indican en la tabla
siguiente:
De las que se indican en la tabla anterior, la
cepa más idónea es la 46D5 y la 48A4.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido de
interés se inserta en las células huéspedes. Preferiblemente, esto
se consigue transfectando, y en especial transformando, las células
huéspedes con los vectores de expresión citados anteriormente, y
cultivándolas en medio con nutrientes convencionales y medios
modificados, según sea apropiado, para inducir los diversos
promotores.
Por transfección se entiende la incorporación de
un vector de expresión por una célula huésped independientemente de
que las secuencias codificantes se expresen. El término
"transfección" incluye técnicas como la transformación, la
conjugación y la transducción. Existen numerosos procedimientos de
transfección conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo,
el del CaPO_{4} y la electroporación, así como los métodos de
transformación descritos más adelante. Una transfección exitosa se
reconoce generalmente cuando se observa cualquier indicación de la
operación de este vector en la célula huésped.
La transformación significa introducir un ADN en
un organismo de modo que dicho ADN sea replicable, bien como un
elemento extracromosómico o como un integrante del cromosoma.
Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se
realiza utilizando técnicas estándares apropiadas en esas células.
El tratamiento con calcio, empleando cloruro cálcico, tal como se
describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual [Nueva York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1982], se usa normalmente con células procariotas
u otras células que contienen paredes celulares que representan una
barrera importante. Otro método para la transformación emplea
polietilén glicol/DMSO, tal como se describe en Chung y Miller,
Nucleic Acid Res., 16:3580 (1988). Otro método más es la
técnica de electroporación. Las transformaciones en levaduras se
realizan normalmente mediante el método de Solingen y col., J.
Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl Acad.
Sci. (USA), 76:3829 (1979).
Las células procariotas utilizadas para producir
el polipéptido de interés se cultivan en un medio adecuado, tal
como se describe de forma general en Sambrook y col. supra.
Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y
similares, son las mismas que previamente se usaron con la célula
huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para un
experto en la materia.
Si se utiliza el promotor de la fosfatasa
alcalina, las células bacterianas para producir el polipéptido
interés en esta invención se cultivan en un medio adecuado, en el
cual el promotor de la fosfatasa alcalina puede estar parcial o
completamente inducido, tal como se describe en Sambrook y col.,
supra. El cultivo no tiene lugar en ausencia de fosfato
inorgánico o en niveles de privación de fosfato. En un principio, el
medio contiene fosfato inorgánico en unos niveles por encima del
nivel de inducción de síntesis de proteínas y suficiente para el
crecimiento bacteriano. A medida que las células crecen utilizan
fosfato, disminuye el nivel de fosfato en el medio y de ese modo se
causa la inducción de la síntesis del polipéptido.
Además del carbono, el nitrógeno, y las fuentes
de fosfatos inorgánicos otros ingredientes necesarios se deben
incluir en el medio en las concentraciones apropiadas, solos o como
mezcla con otro ingrediente o medio, como por ejemplo una fuente
compleja de nitrógeno. El pH del medio puede hallarse entre
5-9, dependiendo principalmente del organismo
huésped.
Si el promotor es inducible, para que ocurra la
inducción, las células se cultivarán hasta alcanzar cierta densidad
óptica, por ejemplo una A_{550} de aproximadamente
60-80, punto en el que se inicia la inducción (por
ejemplo, por adición de un inductor, por depleción de un componente
del medio, etc.) para inducir la expresión del gen codificante del
polipéptido de interés.
La expresión génica puede medirse directamente
en una muestra, por ejemplo, por un método convencional de
transferencia de Southern, transferencia de Northern para
cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), transferencia de
mancha (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando
una sonda marcada adecuada, basada en la secuencia del polipéptido.
Es posible utilizar diferentes marcajes, más corrientemente
radioisótopos y en particular el ^{32}P. Sin embargo, se pueden
utilizar otras técnicas como emplear nucleótidos modificados con
biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina sirve
como sitio de unión de la avidina o de anticuerpos, que a su vez
pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores como los
radionúclidos, los fluorógenos, las enzimas o similares. De manera
alternativa, se pueden utilizar ensayos o geles para la detección de
la proteína.
Para la secreción de un producto génico
expresado, la célula huésped se cultiva en condiciones suficientes
para la secreción del producto génico. Condiciones que incluyen por
ejemplo, temperatura, nutrientes y densidad celular que permitan la
secreción por la célula. Estás condiciones son aquellas en las que
la célula realiza sus funciones celulares básicas de transcripción,
traducción y trasiego de proteínas de un compartimento celular a
otro, como bien se conoce por los expertos en la materia.
En la aplicación de este ensayo, se obtiene una
muestra del cultivo de fermentación microbiana. Si el cultivo es
una fermentación a alta densidad, la muestra contiene
preferentemente de 10^{8} a 10^{10} unidades formadoras de
colonias (CFU) por ml de cultivo. Típicamente, esta muestra se
obtiene al término de la fermentación, pero puede obtenerse en
cualquier momento durante el cultivo. Las células de la muestra
aislada se siembran en una o más placas con medio de cultivo
complementado con una de las fuentes de carbohidratos no utilizadas
por el huésped marcado. Preferiblemente, se utilizan dos placas,
cada una complementada con una de las fuentes de carbohidratos no
utilizadas por el huésped marcado. En otra realización preferida,
las placas contienen medio mínimo o preferentemente agar de medio
mínimo.
Si se utiliza un fermentador de alta densidad
como recipiente de cultivo, dependiendo del tipo de marcaje
genético de la cepa de célula huésped, las células se siembran
directamente (preferentemente a aproximadamente 10^{8} a
10^{11} CFU/ml de cultivo) o se diluyen a un nivel suficiente para
evitar la detección de revertientes o supresores de la utilización
de carbohidratos y se aplican a las placas. Si las células se
diluyen, preferentemente se realizan diluciones en serie, empezando
con aproximadamente 10^{8} a 10^{11} CFU/ml de cultivo y
finalizando con aproximadamente 10^{5} a 10^{8} CFU/ml en, por
ejemplo, medio de cultivo o solución salina tamponada con fosfato
(PBS). Por ejemplo, una dilución está indicada cuando la mutación
marcadora es una mutación revertiente o puede ser suprimida, por
ejemplo, mediante una modificación espontánea del organismo huésped,
de modo que se crea, o se produce, un revertiente o supresor de la
utilización de carbohidratos. La dilución se realiza para asegurar
que la reversión o la supresión de la mutación marcadora no
interfiere con los resultados (falsos positivos). La dilución de la
muestra a aproximadamente 10^{6} CFU/ml proporciona un nivel
satisfactorio de sensibilidad con un margen adecuado de seguridad
para la eliminación de resultados falsos positivos. Otro motivo
para realizar una dilución sería si se deseara una reducción de la
sensibilidad del ensayo.
El medio de cultivo en las placas se puede
aumentar individualmente o en combinación con aminoácidos,
oligoelementos, vitaminas o bases nucleotídicas en una concentración
que permita el crecimiento de cualquier cepa auxotrófica que se
desee detectar. Cualquier ingrediente que se pueda utilizar como
única fuente de carbono por una bacteria como E. coli,
debería añadirse a una concentración lo suficientemente baja para no
permitir la formación de colonias de la cepa marcada.
A continuación, se incuban las placas a una
temperatura adecuada y durante un tiempo apropiado para permitir el
crecimiento suficiente de una colonia para su detección, es decir,
detección fiable y exacta. El período de tiempo necesario para la
incubación dependerá, por ejemplo, de la temperatura de incubación,
del tipo de marcador y del tipo de cepa microbiana. De forma
característica, la temperatura varía desde aproximadamente
20-40ºC, más preferiblemente de
30-38ºC y más preferiblemente de 37ºC; y el tiempo
de incubación varía desde aproximadamente 24 a 120 horas, más
preferiblemente desde 35-90 horas si la temperatura
es de unos 30-38ºC, más preferiblemente entre
48-72 horas si la temperatura es de 37ºC.
Por último, se utiliza una etapa de detección
para determinar si hay colonias creciendo en las placas. La
presencia de colonias, determinada fácilmente mediante inspección
visual, indica la presencia de cepas microbianas contaminantes, ya
que pueden crecer sobre la fuente de carbohidrato con la que se ha
complementado la placa. De acuerdo con la normativa establecida
para las CFU de la muestra tras el plaqueado, la sensibilidad del
ensayo implica la detección de aproximadamente 1 cada 10^{6} a 1
cada 10^{10} organismos de contaminación cruzada de huésped.
En otra etapa, se puede identificar cualquier
colonia detectada que proceda de la cepa celular huésped microbiana
cultivada o de otra cepa. Por ejemplo, si se desea que la cepa
huésped sea E. coli, estos organismos se pueden identificar
como contaminantes E. coli o no-E. coli. Si las
colonias proceden de la cepa huésped de E. coli, se puede
identificar la cepa huésped por su utilización exclusiva de
carbohidratos. En consecuencia, se puede identificar el polipéptido
contaminante, el polipéptido heterólogo presunto y se puede separar
del producto deseado, ya que el polipéptido se producirá a partir
de la cepa contaminante asociada o identificada con éste.
En un aspecto del procedimiento de
identificación, después de la etapa de detección, se recupera
cualquier colonia que crezca con el medio complementado y se
siembra en diversos medios con distintos tipos de carbohidratos
para identificar cualquier célula huésped contaminante por su
deficiencias únicas y específicas en la utilización de
carbohidratos.
El ensayo en la presente invención es también
particularmente útil en un procedimiento para la fabricación de
múltiples polipéptidos en un solo recipiente de cultivo o en una
instalación única, de modo que las células huésped residuales
productoras de un tipo de polipéptido no contaminen un cultivo de
célula huésped productora de otro tipo de polipéptido. El ensayo se
lleva a cabo tal como se describió en la etapa de detección. Si en
la placa, crecen colonias positivas, el operador determinará si el
lote necesita ser descartado o puede continuarse su utilización.
Después de que la primera cepa de células huésped microbianas se
cultive hasta alcanzar la meseta, los contenidos de los recipientes
de cultivo se vacían y los recipientes se limpian y esterilizan. A
continuación, una segunda cepa huésped microbiana se introduce en un
cultivo en el mismo recipiente o en uno adyacente. Esta segunda
cepa contiene el ácido nucleico que codifica para una segundo
polipéptido y está marcada genéticamente por un marcador o
marcadores distintos a los utilizados en el cultivo de la primera
cepa. Dichos marcadores causan que la cepa no utilice una fuente de
carbohidrato distinta como sustrato. Esta segunda cepa es capaz de
utilizar la primera fuente de carbohidrato como
sustrato.
sustrato.
El procedimiento para producir más de un
polipéptido en el mismo fermentador comprende además las etapas de:
aislamiento y siembra de una muestra del segundo cultivo de células
productoras de polipéptidos en un medio de cultivo complementado
con una fuente de carbohidratos no utilizados por la segunda cepa
huésped; incubación de placas a una temperatura y durante un tiempo
suficientes para que las colonias positivas crezcan completamente;
y detección de cualquier colonia que crezca en las placas. Estas
etapas se realizan tal como se describió anteriormente. Después de
vaciar el recipiente de cultivo, limpiarlo y esterizarlo, se pueden
repetir las etapas anteriores indefinidamente, comenzando con la
etapa de cultivo, utilizando una tercera o más de una cepa que no
utilice una tercera fuente de carbohidrato como sustrato, pero que
sea capaz de utilizar la primera y la segunda fuente de
carbohidratos como sustratos, siendo todas las fuentes
distintas.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como
ilustración y sin ánimo de limitación.
Las cepas marcadas genéticamente se construyeron
introduciendo en el huésped una mutación de supresión en una vía de
utilización de carbohidratos. Las mutaciones de supresión se
construyeron (1) mediante PCR in vitro y se recombinaron en
el cromosoma, o (2) se obtuvieron a partir de una fuente externa y
se introdujeron en el huésped E. coli mediante transducción
con P1. Las deleciones génicas construidas por PCR se crearon
utilizando oligonucleótidos para generar dos extremos del gen,
eliminando aproximadamente 500 pb en la porción interna del gen.
Los dos extremos del gen se ligaron juntos mediante una diana SpeI.
El fragmento que contenía la supresión se subclonó en pS1080. Este
plásmido, pS1080, tiene un origen R6K oriR de replicación, el
poliengarce de clonaje y la región intergénica del bacteriófago f1,
el gen de la beta-lacatamasa de PBR322 y el gen sacB
de Bacillus subtilis. Mediante transducción de M13 y
selección con carbenicilina, el plásmido completo se recombinó en
el cromosoma de un derivado w3110 que no soporta la replicación
independiente del vector plasmídico. La transducción consiguiente
de P1 se utilizó para traspasar el plásmido de supresión integrado
en el cromosoma a otros huéspedes de E. coli utilizando la
selección con carbenicilina. Para obtener plásmidos resolventes, se
seleccionaron derivados resistentes a sacarosa a temperatura
ambiente y se rastrearon para la pérdida de resistencia a
carbenicilina. Mediante la PCR se confirmó que el ADN cromosómico de
las colonias sensibles a carbenicilina y resistentes a sacarosa
portaba la supresión planificada. El fenotipo negativo de
carbohidratos también se confirmó en agar de MacConkey con 1% del
azúcar deseado.
Ejemplo
I
En este ejemplo se describe un ensayo sensible
para la detección de organismos contaminantes en un sistema de
fabricación multiuso. EL organismo productor se marcó con una
mutación no revertiente en una ruta de utilización de
carbohidratos. El impacto de la mutación se silenció en el estadío
de producción de la proteína recombinante; sin embargo, en ensayos
subsiguientes, el organismo diana podría distinguirse por un test
simple de utilización de carbohidrato de otros organismos E.
coli potencialmente contaminantes por contaminación cruzada de
huésped.
La cepa 37D6, derivada de E. coli
K-12 W3110, lleva un plásmido productor de proteína
recombinante, con genotipo W3110
IN(rmD-rrnE)1 \DeltafhuA phoA
\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ptr3
degP41 (kan^{R}) \DeltaompTilvG2096^{R}
\Delta(rbs7), 37\Delta6 deriva de la cepa 27C7
descrita en la patente nº 5.288.931 y el número de registro del
American Type Culture Collection nº. 55.244. La mutación
\Delta(rbs7) (Lopilato y col., J Bacteriol.,
158:665-673 [1984]) se introdujo por
co-transducción con P1 de manera que este huésped
pudiera ser diferenciado de otros huéspedes recombinantes mediante
un simple ensayo de utilización de carbohidrato. La supresión rbs
se introdujo por cotransducción de P1 con Tn10 insertado en
el gen ilv. La auxotrofía isoleucina/valina se transdujo a
prototrofía mediante el fago P1 crecido en una cepa que lleva la
mutación ilvG2096^{R} (Lawther y col., Proc Natl. Acad,
Sci. USA, 78:922-925 [1981]), que repara un
cambio en la pauta de lectura responsable de la sensibilidad a la
valina en la cepa salvaje de E. coli K-12. Se
confirmó la deficiencia en la utilización de la ribosa en la
resultante 37D6 utilizando medio mínimo con ribosa como fuente de
carbono.
Se obtuvo una muestra al final de los 10 l. de
fermentación (realizado tal como se describe en la patente
americana U.S. 5.288.931), utilizando una técnica estéril y se
guardó a 4ºC antes de sembrarla. Se realizaron diluciones seriadas
de 10 veces en PBS. Se sembraron un total de 0,1 ml de muestra en
medio mínimo conteniendo ribosa al 0,2%-0,4% como fuente de
carbono. La composición del medio por litro fue de: NH_{4}Cl10
mM; 11.27 gramos de K_{2}HPO_{4}; 4.83 gramos de
KH_{2}PO_{4}; 0.5 gramos de citrato sódico dehidratado; 0.123
gramos de MgSO_{4} heptahidratado; 15 gramos de
Bacto-agar y 0.2%-0.4% de la fuente de carbono
deseada. Las placas se preincubaron a 37ºC entre
48-72 horas, tiempo suficiente para que una colonia
positiva pueda alcanzar un tamaño detectable. Un cultivo control
que podía utilizar la ribosa se utilizó como control positivo por
su crecimiento en este medio.
Se determinaron las unidades formadoras de
colonias, es decir, la densidad de población celular (CFU/ml), en
dos fermentaciones. Las condiciones de fermentación fueron para
SI275 de 1,0 x 10^{10} CFU/ml y para SI276, 4.0 x 10^{10}
CFU/ml. Por placa se sembraron entre 10^{9-}10^{4} CFU. No se
observaron colonias tal como se indica en la Tabla 1. El cultivo
control creció como se esperaba en las placas de ribosa. Estos
resultados indican que la mutación \Delta(rbs7) es no
revertiente y no supresora. También se detectaron mutaciones
compensadoras que permitían el crecimiento en ribosa. Por tanto
podría sembrarse un cultivo conteniendo 10^{9} CFU/placa del
organismo deseado y la sensibilidad del ensayo con una mutación no
revertiente sería aproximadamente de un organismo contaminante por
cada 10^{9} células sembradas.
\vskip1.000000\baselineskip
37D6CFU | Colonias Detectadas |
Fermentación SI275 | |
\hskip0,5cm 1 x 10^{9} | ninguna |
\hskip0,5cm 1 x 10^{8} | ninguna |
\hskip0,5cm 1 x 10^{7} | ninguna |
\hskip0,5cm 1 x 10^{6} | ninguna |
\hskip0,5cm 1 x 10^{5} | ninguna |
\hskip0,5cm 1 x 10^{4} | ninguna |
Fermentación SI276 | |
\hskip0,5cm 4,0 x 10^{9} | ninguna |
\hskip0,5cm 4,0 x 10^{8} | ninguna |
\hskip0,5cm 4,0 x 10^{7} | ninguna |
\hskip0,5cm 4,0 x 10^{6} | ninguna |
\hskip0,5cm 4,0 x 10^{5} | ninguna |
\hskip0,5cm 4,0 x 10^{4} | ninguna |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
II
Para aumentar el número de cepas productoras
marcadas, se pueden marcar cepas de forma múltiple. Este ejemplo
describe el uso de cepas doblemente marcadas. Cada organismo
productor contenía mutaciones en dos rutas de utilización de
carbohidratos. En este ejemplo el organismo productor se marcó con
una mutación no revertiente (utilización de ribosa) y una mutación
revertiente (mutación puntual de utilización de la ramnosa). La
reversión de la mutación puntual se observó aproximadamente en un
revertiente por cada 10^{8} células sembradas. En este caso, se
prefirió una dilución del organismo productor a un nivel suficiente
por debajo de la detección de los revertientes. Estudios de
sensibilidad con organismos que pueden utilizar tanto ribosa como
ramnosa y ribosa indican que el ensayo es tan sensible como se
podría esperar del número de organismos punteados sembrados en
césped procedentes del organismo no utilizador del carbohidrato.
La cepa utilizada en este ejemplo se derivó de
E. coli K-12 W3110 (que contiene un plásmido
productor de una proteína recombinante).
La cepa 46D5, W3110
IN(rrnD-rrnE)1 \DeltafhuA
\Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41
(\DeltaPst1-kan^{s})\DeltaompTphoS*(T10Y)cyo::kan^{R}
rhaR \Delta (rbs 7) ilvG2096^{R} se derivó de la cepa 27C7
(ver más arriba). Los pasos adicionales en la construcción de la
cepa 46D5 se detallan más adelante.
Una inserción Tn10 en el gen ilv
se introdujo en la 27C7 por transducción con P1. La auxotrofía para
isoleucina/valina se transdujo a prototrofía utilizando el fago P1
crecido en una cepa que lleva la mutación ilvG2096^{R}
(Lawther y col., supra), que repara un cambio en la pauta de
lectura causante de la sensibilidad a la valina en la cepa salvaje
de E. coli K-12. La cepa resultante fue 43D3.
El locus ilvG2096 se confirmó por la resistencia del huésped
43D3 a 40 \mug/ml de valina (0.3 mM).
La mutación
degP4(\DeltaPSt1-kan^{R}) se
reemplazó utilizando la transducción con P1 con la mutación
degP41(\DeltaPst1-kan^{s}). Se
introdujo proAB::Tn10 unido a degP en la cepa 43D3. La auxotrofía a
la prolina se transdujo mediante prototrofía mediante el fago P1
crecido en una cepa llevando la mutación degPkan^{S}.
Puesto que degP está unida por cotransudcción a fhuA,
se confirmó que la nueva cepa, 43E7, retiene la resistencia para el
bacteriófago T1.
El gen salvaje para la fosfatasa alcalina se
reintrodujo en el genoma del huésped para aprovechar los beneficios
obtenidos con la mutación phoS* descrita más abajo. La
cotransducción con P1 de la inserción Tn5 en el gen
proC con phoA* se usó para reintroducir el gen de la
fosfatasa alcalina de tipo salvaje en el genoma el huésped. La
transducción con P1 para la prototrofía de la prolina restauró el
gen proC. La cepa resultante, 44D6, retiene la expresión de
la fosfatasa alcalina y mantuvo la mutación responsable para el
fenotipo Lac\Delta(argF-lac).
Se introdujo una mutación que da como resultado
una proteína de unión a fosfato, phoS* (T10Y) (patente
americana U.S. 5.304.472). La proteína phoS* tiene una
afinidad reducida por el fosfato en el medio. El resultado es que
la inducción del promotor de fosfatasa alcalina tiene lugar a una
concentración de fosfato superior a la del tipo salvaje. Esto
permite la expresión del producto del promotor APasa sin privar de
forma severa el cultivo de fosfato. PhoS se une mediante la
cotransducción con P1 a ilv. Una inserción Tn10 en el gen
ilv se reintrodujo mediante transducción con P1. La
auxotrofía isoleucina/valina se transdujo a prototrofía utilizando
el fago P1 crecido en una cepa portadora de phoS* (T10Y) y
mutaciones ilv2090^{R}. La presencia de la mutación phoS*
da como resultado colonias azules sobre medio de agar con alta
concentración de fosfato y el sustrato cromogénico,
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato.
La cepa resultante fue 45F8.
La mutación cyo::kan^{R} (Oden y col.,
Gene, 96:29-36 [1990]) en el gen para la
citocromo o oxidasa se introdujo mediante transducción. Esta
mutación se construyó in vitro reemplazando una porción del
gen cyo con un gen de resistencia a la kanamicina. La
introducción de esta mutación evita el cambio entre las citocromo
oxidasas de baja y elevada afinidad, cyo y cyd,
respectivamente (patente americana U.S. 5.342.763). El fenómeno de
cambio de citocromos puede conducir a inestabilidades del oxígeno
disuelto y a fermentaciones incompletas. La cepa resultante fue la
45F9.
Por último, dos mutaciones en las vías de
utilización del carbohidrato se introdujeron para permitir que este
huésped se diferenciara de otros huéspedes recombinantes mediante un
ensayo sencillo de utilización de carbohidratos. La mutación
rhaR (Moralejo y col., J. Bacteriol.,
175:5585-5594 [1993]) se introdujo mediante
cotransducción con P1 con argE. Se introdujo una mutación
argE::Tn1o. Se restableció la prototrofía de la cepa
utilizando el fago P1 crecido en una cepa portadora de la mutación
rahR. Se confirmó que la cepa resultante, 46F1, era incapaz
de utilizar una fuente de carbono de ramnosa.
La mutación \Deltarbs7 (citada
anteriormente) se introdujo mediante cotransducción con P1 con una
inserción Tn10 ligada en el gen ilv. La auxotrofía
isoleucina/valina se transdujo a prototrofía utilizando el fago P1
en una cepa portadora de la mutación ilvG2096^{R}. La
presencia del defecto de utilización de ribosa en la cepa
resultante, 46D5, se confirmó utilizando medio mínimo que contenía
ribosa como fuente de carbono. La retención de la phoS*
(T10Y) también se confirmó tal como se describió
anteriormente.
Utilizando una técnica aséptica, se obtuvo una
muestra del final de la fermentación de 100-l y se
plaqueó tal como se describe en el Ejemplo 1. Las CFU/ml para la
producción del organismo fueron de 8,5 x 10^{10}. Tal como se
indica en la Tabla 2, no se detectaron colonias sobre las placas que
contenían ribosa para 10^{9} células plaqueadas o durante
cualquiera de las diluciones posteriores sembradas en placas. Sin
embargo, se detectaron colonias sobre medio mínimo con ramnosa a un
nivel de 8,2 x 10^{2} CFU/ml. La reversión de la mutación puntual
de ramnosa se observó a aproximadamente 1 revertiente por cada
10^{8} células plaqueadas.
Producción del organismo | Medio mínimo de ramnosa | Medio mínimo de ribosa |
100 l (D.O 164) | ||
8,5 x 10^{10} CFU/ml | 8,2 x 10^{2} CFU/ml | ninguna |
Los resultados de un estudio de punteado se
muestran en la Tabla 3. Para el huésped 46D5, se plaquearon de
10^{6} a 10^{7} CFU sobre medio mínimo de ramnosa o medio mínimo
de ribosa. Se realizaron diluciones de 10 veces del organismo
punteado en PBS. El organismo punteado fue un
Rha^{+}\Deltarbs \Deltamal (cepa con marcaje múltiple)
o un organismo de tipo salvaje (Rha^{+} Rbs^{+}
Mal^{+}). Se plaquearon 0,1 ml de diluciones 10^{-6},
10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} junto con el organismo de
producción. Las placas se incubaron a 37ºC durante
48-72 h. Los resultados esperados para la detección
de los organismos punteados fueron equivalentes a los observados
para la detección de los organismos punteados, con un error
experimental normal. En este ejemplo, en donde la producción de
organismos necesita diluirse para evitar la detección de falsos
positivos (revertientes o supresores), la sensibilidad del ensayo es
de aproximadamente un organismo contaminante por cada 10^{6} o
10^{7} células plaqueadas.
Ejemplo
III
Se puede lograr un ensayo altamente sensible si
se utiliza una cepa marcada doblemente con dos mutaciones
no-revertientes. Esta cepa es una cepa derivada de
E. coli K-12, denominada 48A4, con genotipo
W3110 \DeltafhuA \DeltamalE \Delta(rbs7). La
cepa de inicio de E. coli W3110 es un derivado de E.
coli K-12 que es F^{-} y lambda^{-}. Se ha
demostrado que porta una inversión cromosómica entre rrnD y
rrnE. El gen fhuA (patente americana U.S. 5.304.472)
se suprimió a partir de W3110 mediante escisión imprecisa de
Tn10 después de su inserción en el gen fhuA. La cepa
resultante, 1A2, es resistente a los bacteriófagos T1, T5 y 80. Se
introdujeron dos mutaciones en las vías de utilización de
carbohidratos. Una supresión de malE se construyó mediante PCR y se
incorporó en un vector plasmídico, pS1080, que contenía la
beta-lactamasa y la sacarosa de levan. Bass y col.,
J. Bacteriol., 178:1154-1161 (1996). El
plásmido se recombinó mediante transducción con M13 y resistencia a
la carbenicilina en el cromosoma de un derivado W3110 que no
soportará la replicación independiente del vector plasmídico
(BW16824). Metcalf y col., Gene, 138:1-7
(1994); Basset y col., supra. La cepa 1A2 se transdujo a
resistencia a carbenicilina con el fago P1 crecido en la cepa
portadora del plásmido de supresión malE e integrado en su
cromosoma. Los derivados resistentes a sacarosa se seleccionaron y
rastrearon para la pérdida de resistencia a carbenicilina y la
incapacidad para utilizar la maltosa. Mediante PCR, se confirmó que
la cepa resultante, 46H9, portaba la supresión mal
planificada.
La mutación \Delta(rbs7) (citada
anteriormente) se introdujo mediante cotransducción con P1 con una
inserción Tn10 en el gen ilv. Se obtuvo un prototrofo
ilv^{+} plaqueando sobre medio mínimo de glucosa. La cepa
resultante se denominó 48A4.
Una muestra del cultivo en LB de toda la noche
se centrifugó y concentró aproximadamente 10 veces de modo
aséptico. Se realizaron diluciones en serie de 10 veces en PBS. Se
plaquearon 0,1 ml en medio mínimo (descrito anteriormente) que
contenía un 0,2%-0,4% de fuente de carbono, indicada en la Tabla 4.
Las placas se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 48
horas.
Las CFU/ml para el organismo test, 48A4, fueron
2,2 x 10^{10} CFU/ml. Se plaquearon 10^{9} a 10^{5} CFU por
placa. No se observaron colonias, tal como se indica en la Tabla 4.
Los resultados indican la ausencia de reversión o supresión de dos
marcadores de carbohidratos. En consecuencia, si se siembra un
cultivo que contenga 10^{9} CFU/placa del organismo deseado, se
obtendría una sensibilidad del test para un organismo
no-revertiente y doblemente marcado como el 48A4
aproximadamente de un contaminante por cada 10^{9} células
plaqueadas.
Colonias detectadas | ||
CFU plaqueadas de | Medio mínimo de | Medio mínimo de |
48A4 | ribosa | maltosa |
2,2 x 10^{9} | Ninguna | Ninguna |
2,2 x 10^{8} | Ninguna | Ninguna |
2,2 x 10^{7} | Ninguna | Ninguna |
2,2 x 10^{6} | Ninguna | Ninguna |
2,2 x 10^{5} | Ninguna | Ninguna |
Ejemplo
IV
Un organismo de contaminante cruzada de huésped
que necesite un aminoácido determinado o tenga cualquier otro
requisito auxotrófico podría detectarse ajustando la composición del
medio. En este ejemplo, se muestra que puede detectarse un
auxótrofo de leucina utilizando el medio descrito más adelante. 26G5
es un derivado de la cepa de E. coli K-12
W31 10 \DeltafhuA que contiene una supresión en
leuA. Este organismo, que tiene un requerimiento para el
aminoácido leucina, se utilizó para estudios de punteado que se
muestran más adelante. La leucina se añadió al medio mínimo a una
concentración de 0,3 mM o como parte de una mezcla de componentes
(suplementos completos) que podrían soportar el crecimiento de la
mayoría de cepas de E. coli auxotróficas. El suplemento
completo está compuesto de componentes que se sabe no son utilizados
por el organismo E. coli como única fuente de carbono. Los
componentes del suplemento completo incluyen: 0,3 mM de los
aminoácidos L-arginina,
L-asparagina, L-ácido aspártico,
L-glicina, L-histidina,
L-valina, L-leucina,
L-metionina, L-treonina,
L-isoleucina, L-glutámico,
L-triptófano, L-fenilalanina y
L-lisina; 15 \mug/ml (0,1 mM) de hipoxantina;
vitaminas (0,2 \mug/ml de mio-inositol, 0,1
\mug/ml de pantotenato, 0,1 \mug/ml de niacianamida, 0,1
\mug/ml de piridoxal HCl, 0,1 \mug/ml de cloruro de colina, 0,1
\mug/ml de ácido fólico, 0,01 \mug/ml de riboflavina, 0,34
\mug/ml de ácido para-aminobenzoico y 0,5
\mug/ml de tiamina); y oligoelementos (27 \mug/ml de cloruro
férrico hexahidrato, 8 \mug/ml de sulfato de zinc, 7 \mug/ml de
cloruro de cobalto hexahidrato, 7 \mug/ml de molibdato sódico, 8
\mug/ml de sulfato cúprico pentahidrato, 2 \mug/ml de ácido
bórico y 5 \mug/ml de sulfato de manganeso monohidrato).
Los procedimientos de construcción de la cepa
para 46D5 y 48A4 se describen en mayor detalle en los Ejemplos II y
III, respectivamente. Una muestra del cultivo LB de toda la noche se
centrifugó y concentró aproximadamente 10 veces de forma aséptica.
Se realizaron diluciones seriadas de 10 veces en PBS. Para el
huésped 46D5, se plaquearon 10^{6} o 10^{7} CFU en medio mínimo
de ramnosa suplementado con sólo medio mínimo de
ramnosa-leucina con suplementos completos.
Para el huésped 48A4, se plaquearon 10^{9} CFU
en medio mínimo de maltosa suplementado sólo con leucina o medio
mínimo de maltosa con suplementos completos. No se detectaron
colonias para ningún organismo en ausencia del cultivo
punteado.
Se realizaron diluciones seriadas de 10 veces en
PBS del organismo auxotrófico para leucina 26G5 para representar un
contaminante putativo. Se plaquearon un total de 0,1 ml las
diluciones 10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} junto con el
organismo productor. Las placas se incubaron a 37ºC durante
48-72 h. Los resultados se muestran en la Tabla
5.
Los estudios de punteado con un auxotrofía por
la leucina indican que el ensayo es tan sensible como puede
esperarse de organismos punteados y plaqueados mediante siembra en
césped sobre un organismo no utilizador. En el caso de que el
organismo productor no necesite ser diluido, la sensibilidad es
aproximadamente de un contaminante por cada 10^{9} células
plaqueadas. Si es necesario, el organismo productor puede necesitar
ser diluido para evitar la detección de falsos positivos
(revertientes o supresores) y en este caso, la sensibilidad es del
orden de un organismo contaminante por cada 10^{6} o 10^{7}
células plaqueadas. La complementación de un aminoácido como la
leucina o una complementación más amplia que detectara la mayoría de
cepas de E. coli auxotróficas produciría resultados
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Procedimiento para producir, en un único
recipiente de cultivo, múltiples productos polipeptídicos a partir
de cepas de células huéspedes microbianas que utilizan más de una
fuente de carbohidrato como sustrato, en donde las cepas de células
huéspedes microbianas son cepas de células huéspedes bacterianas, de
levadura, o fúngicas, cuyo proceso comprende:
- (a)
- cultivar en el recipiente una primera cepa de células huésped que comprende un ácido nucleico que codifica un primer producto polipeptídico que se está fabricando actualmente, y la cual está marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para usar una primera fuente de carbohidrato como sustrato;
- (b)
- sembrar una muestra aislada del cultivo de la paso (a) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidratos que no es utilizada por la cepa de células huéspedes como sustrato, y sin otras fuentes de carbohidratos;
- (c)
- incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier colonia positiva crezca hasta un nivel detectable;
- (d)
- detectar si cualquiera de las colonia está creciendo en el medio de cultivo suplementado,
- (e)
- una vez se ha completado el cultivo de la primera cepa de células huéspedes microbianas, retirar el contenido del recipiente de cultivo, y limpiar y esterilizar el recipiente;
- (f)
- cultivar en el recipiente una segunda cepa de células huéspedes microbianas que comprende un ácido nucleico que codifica un segundo producto polipeptídico que se está fabricando actualmente, y la cual está marcada genéticamente para que carezca de su capacidad nativa para usar una segunda fuente de carbohidrato como sustrato, en donde la cepa puede usar la primera fuente de carbohidrato como sustrato;
- (g)
- sembrar una muestra aislada del cultivo de la etapa (f) en un medio de cultivo suplementado con una fuente de carbohidratos que no es utilizada como sustrato por la segunda cepa de células huéspedes, y sin otras fuentes de carbohidratos;
- (h)
- incubar las células sembradas a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que cualquier colonia positiva crezca hasta un nivel detectable; y
- (i)
- detectar si hay cualquiera de las colonias que está creciendo en el medio de cultivo suplementado,
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde las cepas de células huéspedes microbianas son cepas de
células huéspedes procariotas o de levadura.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
donde las cepas de células huéspedes microbianas son cepas de
células huéspedes procariotas.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
donde las cepas de células huéspedes procariotas son cepas de
células huéspedes bacterianas.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
donde las cepas de células huéspedes bacterianas son Gram
negativas.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
donde las cepas de células huéspedes bacterianas son cepas de
Enterobacteriaceas.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde las cepas de células huéspedes bacterianas son E.
coli.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde los polipéptidos son exógenos a la cepa de células huéspedes
microbianas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
donde los polipéptidos son de mamífero.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
donde los polipéptidos son humanos.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde las fuentes de carbohidratos son la maltosa, ramnosa o
ribosa.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde las cepas de células huéspedes microbianas se marcan
genéticamente mediante la alteración de sus genotipos.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
donde la alteración es una alteración no-revertiente
y no-supresora.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
donde la alteración de lugar a un revertiente o supresor de la
utilización de carbohidratos.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US74172696A | 1996-10-31 | 1996-10-31 | |
US741726 | 1996-10-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2268241T3 true ES2268241T3 (es) | 2007-03-16 |
Family
ID=24981916
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES03020254T Expired - Lifetime ES2268241T3 (es) | 1996-10-31 | 1997-10-10 | Procedimiento de fermentacion que utiliza cepas de celulas huespedes microbianas marcadas. |
ES97912958T Expired - Lifetime ES2214614T3 (es) | 1996-10-31 | 1997-10-10 | Ensayo que utiliza cepas de celulas hospedadoras microbianas marcadas. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES97912958T Expired - Lifetime ES2214614T3 (es) | 1996-10-31 | 1997-10-10 | Ensayo que utiliza cepas de celulas hospedadoras microbianas marcadas. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5962252A (es) |
EP (3) | EP1021556B9 (es) |
JP (1) | JP2001502917A (es) |
AT (2) | ATE257518T1 (es) |
AU (1) | AU716496B2 (es) |
CA (1) | CA2267655C (es) |
DE (2) | DE69736210T2 (es) |
DK (2) | DK1021556T5 (es) |
ES (2) | ES2268241T3 (es) |
IL (2) | IL129357A (es) |
NZ (1) | NZ335026A (es) |
PT (1) | PT1021556E (es) |
WO (1) | WO1998018955A1 (es) |
ZA (1) | ZA979496B (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6114137A (en) * | 1996-10-31 | 2000-09-05 | Genentech Inc | Assay using marked microbial host cell strains |
US6068993A (en) * | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
CA2415569A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Eisai Co., Ltd. | Fungal cell wall synthesis gene |
GB0513901D0 (en) * | 2005-07-06 | 2005-08-10 | Airbus Uk Ltd | Method and apparatus for measuring the structural integrity of a safe-life aircraft component |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2820742A (en) * | 1951-10-24 | 1958-01-21 | Nat Res Dev | Synthesis of strains of micro-organisms |
US3171793A (en) * | 1962-04-25 | 1965-03-02 | Ronald L Searcy | Fermentative analytical procedure and apparatus therefor |
US4729954A (en) * | 1985-02-19 | 1988-03-08 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | pLS010 plasmid vector |
US5134063A (en) * | 1990-07-06 | 1992-07-28 | Biolog, Inc. | Methods for detection, identification and specification of listerias |
US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
US5342763A (en) * | 1992-11-23 | 1994-08-30 | Genentech, Inc. | Method for producing polypeptide via bacterial fermentation |
US5783410A (en) * | 1993-06-14 | 1998-07-21 | Lin He | Bacteria identification method and apparatus |
-
1997
- 1997-01-23 ZA ZA979496A patent/ZA979496B/xx unknown
- 1997-09-10 US US08/926,527 patent/US5962252A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-10 ES ES03020254T patent/ES2268241T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-10 DE DE69736210T patent/DE69736210T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-10 IL IL129357A patent/IL129357A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-10-10 DE DE69727160T patent/DE69727160T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-10 AT AT97912958T patent/ATE257518T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-10 WO PCT/US1997/019473 patent/WO1998018955A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-10 CA CA002267655A patent/CA2267655C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-10 EP EP97912958A patent/EP1021556B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-10 NZ NZ335026A patent/NZ335026A/xx unknown
- 1997-10-10 DK DK97912958T patent/DK1021556T5/da active
- 1997-10-10 JP JP10520676A patent/JP2001502917A/ja not_active Ceased
- 1997-10-10 ES ES97912958T patent/ES2214614T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-10 DK DK03020254T patent/DK1398385T3/da active
- 1997-10-10 EP EP03020254A patent/EP1398385B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-10 PT PT97912958T patent/PT1021556E/pt unknown
- 1997-10-10 AT AT03020254T patent/ATE331036T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-10 AU AU50019/97A patent/AU716496B2/en not_active Ceased
- 1997-10-10 EP EP06011712A patent/EP1746166A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-06-26 IL IL184248A patent/IL184248A0/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1021556A1 (en) | 2000-07-26 |
IL129357A (en) | 2007-09-20 |
ZA979496B (en) | 1999-04-23 |
DK1398385T3 (da) | 2006-10-23 |
DE69727160D1 (de) | 2004-02-12 |
DE69727160T2 (de) | 2004-11-25 |
IL129357A0 (en) | 2000-02-17 |
EP1398385B1 (en) | 2006-06-21 |
NZ335026A (en) | 2000-04-28 |
US5962252A (en) | 1999-10-05 |
DE69736210D1 (de) | 2006-08-03 |
DK1021556T5 (da) | 2005-05-30 |
WO1998018955A1 (en) | 1998-05-07 |
ATE331036T1 (de) | 2006-07-15 |
EP1398385A1 (en) | 2004-03-17 |
JP2001502917A (ja) | 2001-03-06 |
CA2267655A1 (en) | 1998-05-07 |
PT1021556E (pt) | 2004-05-31 |
ATE257518T1 (de) | 2004-01-15 |
AU5001997A (en) | 1998-05-22 |
IL184248A0 (en) | 2007-10-31 |
EP1021556B9 (en) | 2005-01-26 |
DE69736210T2 (de) | 2007-05-24 |
EP1021556B1 (en) | 2004-01-07 |
DK1021556T3 (da) | 2004-05-10 |
ES2214614T3 (es) | 2004-09-16 |
CA2267655C (en) | 2008-02-19 |
AU716496B2 (en) | 2000-02-24 |
EP1746166A1 (en) | 2007-01-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fowler et al. | Decoding a Salmonella Typhi regulatory network that controls typhoid toxin expression within human cells | |
US8569007B2 (en) | Method for reducing the appearance of false positive bands in SDS-page analysis of proteolytic digestion of a sample | |
US20230062579A1 (en) | Activity-specific cell enrichment | |
US20240016858A1 (en) | Compositions and methods for nucleic acid expression and protein secretion in bacteroides | |
JP5737947B2 (ja) | クロストリジウム・ディフィシルを検出及び/又は同定する方法 | |
ES2268241T3 (es) | Procedimiento de fermentacion que utiliza cepas de celulas huespedes microbianas marcadas. | |
FI96697C (fi) | Uudet Streptococcus thermophilus -kannat ja niiden käyttö antibioottie n määrittämiseen | |
US10174294B1 (en) | Recombinant K2 bacteriophages and uses thereof | |
US20080286824A1 (en) | System for Screening Cells for High Expression of a Protein of Interest (Poi) | |
GB2059990A (en) | Enhancement of the sensitivity of viable microbial cell count by bioluminescent assay of ATP and its use for identification of microbes by means of a short incubation in nutrient media | |
US10900025B2 (en) | Recombinant B11 bacteriophages and uses thereof | |
EP3068894B1 (en) | Method for detecting bacteriolytic conditions in a sample | |
WO2022153596A1 (en) | Vector set for measuring transposase activity, kit, transposase activity measuring method, and cell separation method | |
US6114137A (en) | Assay using marked microbial host cell strains | |
Kotova et al. | Inducible specific lux-biosensors for the detection of antibiotics: Construction and main parameters | |
MXPA99003907A (es) | Ensayo utilizando cepas de celulas huesped microbianas marcadas | |
US20190226005A1 (en) | Multidifferential Agar with Chromogenic Substrates | |
Hüsing et al. | Controlling membrane barrier during bacterial type-III protein secretion | |
JP2020146014A (ja) | トランスポゼース活性測定用ベクター、トランスポゼース活性測定用キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法 | |
KR102047827B1 (ko) | 아미노산 정량 분석 바이오칩, 이를 포함하는 아미노산 정량 분석 키트 및 이를 이용한 아미노산 정량 분석 방법 | |
CN117106101B (zh) | 质粒及asfv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法 | |
JP5406253B2 (ja) | タンパク質発現に基づくアミノ酸バイオアッセイ法 | |
JP2002253216A (ja) | 糞便中サルモネラの検出用培地 |