DE69934815T2 - Bacillusstamm und nachweismethoden - Google Patents

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Description

  • Ganzzell-Assays für spezifische Inhibitoren von B. subtilis-Proteinen, die an der Chromosomenverteilung und Zellteilung beteiligt sind, sind bekannt. Die Eigenschaft, die Chromosomenverteilung und Zellteilung zu hemmen, ist ein Hinweis auf tatsächliche oder mögliche antimikrobielle Eigenschaften. Der Erfinder hat drei derartige Assays entwickelt: Sie sind in WO 97/00325; WO 98/26087 und WO 98/26088 beschrieben, die unten zusammengefasst und als Quelle angeführt sind.
  • Neue Verbindungen, die auf beliebige Chromosomenverteilungs- und Zellteilungsfunktionen hemmend wirken, besitzen wahrscheinlich ein breites Aktivitätsspektrum gegen eine große Bandbreite von Bakterien, einschließlich bedeutender Pathogene, weil die anvisierten Funktionen hoch konserviert zu sein scheinen. Allerdings ist es möglich, dass einige der entdeckten Verbindungen sich als relativ spezifisch für B. subtilis-Proteine herausstellen können, in welchem Fall sie als universelle antimikrobielle Agenzien nicht zweckdienlich wären.
  • Ein ähnliches Problem entsteht in jedem Ganzzell-Assay für einen Inhibitor eines spezifischen Gens eines beliebigen Mikroorganismus. Das Problem ist, dass ein Inhibitor eines spezifischen Gens eines bestimmten Stamms oder Mikroorganismus für diesen Stamm spezifisch sein kann, oder alternativ hemmende Eigenschaften besitzen kann, die bei einem eher großen Spektrum an Mikroorganismen wirken. Die vorliegende Erfindung widmet sich diesem Problem, indem ein Target-Gen in einem Mikroorganismus, der für einen Ganzzell-Assay genutzt wird, durch ein homologes Gen von einem anderen Organismus ersetzt wird, z.B. einem Mikroorganismus von unmittelbarerem Interesse.
  • Folglich stellt die Erfindung mit einem Aspekt bereit: einen Bacillus-Stamm, der zu Wachstum und Sporulation fähig ist, mit einem Chromosom, in welchem:
    • a) wenigstens ein Target-Gen teilweise oder vollständig durch ein homologes Gen von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und
    • b) ein künstlich eingeführtes Reportergen vorhanden ist und in einer Weise exprimiert wird, so dass die Reportergen-Expression in Verbindung mit einer Veränderung im Aktivitätsgrad des homologen Genexpressionsprodukts erhöht oder vermindert wird
    und wobei in diesem Bacillus-Stamm:
    • A) a) ein spoIIIE-Gen durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und b) zwei Reportergene vorhanden sind, die jeweils an einen Promotor geknüpft sind und auf die Aktivität σF während der Sporulation ansprechen, wobei ein erstes Reportergen in einem Segment der DNA lokalisiert ist, das in einem Vorsporen-Kompartiment eingefangen ist, wenn die SpoIIIE-Funktion beeinträchtigt ist, und ein zweites Reportergen außerhalb dieses Segments lokalisiert ist; oder
    • B) a) ein Zellteilungsgen teilweise oder vollständig durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und b) zwei künstlich eingeführte Reportergene vorhanden sind, wobei ein erstes Reportergen einen Promotor aufweist, der von aktiven σF oder σE-Faktoren abhängt, und ein zweites Reportergen ein Maß der Synthese des (inaktiven) σF oder σE-Faktors liefert; oder
    • C) wobei der Stamm durch eine Mutation eines spoIIIE-Gens modifiziert ist, welches den Transfer des Vorsporen-Chromosoms blockiert, und; a) ein spoOJ-Gen durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und b) ein oder zwei Reportergene vorhanden sind, wobei ein erstes Reportergen einen Promotor aufweist, der vom σF-Faktor abhängig ist und an einer Lokalisation platziert ist, an der eine beeinträchtigte SpoOJ-Funktion zu einem erhöhten Trapping führt und folglich zu einer erhöhten Expression in der Vorspore, und/oder wobei ein zweites Reportergen einen Promotor aufweist, der vom σF-Faktor abhängt und an einer Lokalisation platziert ist, an der eine beeinträchtigte SpoOJ-Funktion zu einem verminderten Trapping und folglich zu einer verminderten Expression in der Vorspore führt.
  • Mit einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bewertung eines Agens auf seine antibiotische Aktivität bereit, wobei dieses Verfahren eine Inkubation des definierten Mikroorganismus in Gegenwart eines Agens und die Beobachtung des Reportergens oder-gene umfasst.
  • Der Mikroorganismus ist eine Bacillus-Spezies, die in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen zu wachsen und zu sporulieren, und für die genetische Konstrukte hergestellt werden können. B. subtilis ist einfach zu erhalten, gut charakterisiert und wird bevorzugt.
  • Ein homologes Gen ist ein funktionell äquivalentes Gen von einem anderen Mikroorganismus. Bei den Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung ist wenigstens ein Gen (das Target-Gen) teilweise oder vollständig durch ein homologes Gen von einem anderen Mikroorganismus ersetzt worden. Vorzugsweise ist das Gen ein Gen, das über viele verschiedene Spezies von Bakterien oder anderen Mikroorganismen gut konserviert ist. Es ist erforderlich, dass das homologe Gen funktionsfähig eingebaut ist, damit es zu einer Expression in vivo fähig ist. Wenn das Target-Gen teilweise oder vollständig durch ein homologes Gen ersetzt wird, ist es erforderlich, dass das homologe Gen in der Lage ist, ein Expressionsprodukt zu bilden, das sich in jeder Hinsicht vom Expressionsprodukt des Target-Gens unterscheidet. Geeignete Target-Gene umfassen Gene, die an der DNA-Replikation, RNA-Synthese, Proteinsynthese, Zellwandsynthese, Transport und Zellteilung beteiligt sind.
  • Für Mikroorganismen, die Bacillus-Spezies sind, z.B. B. subtilis, umfassen die Zellteilungsgene divIB (auch als ftsQ bezeichnet), divIC, divIVA, ftsA, ftsL (auch als mraR bezeichnet), ftsZ, pbpB wie auch spoOJ und spoIIIE und weitere, sowohl bekannte als auch noch zu entdeckende Gene. Da diese Zellteilungsgene im Wesentlichen über viele bakterielle Spezies konserviert sind, ist es plausibel, dass diese hergestellten Bacillus-Stämme mit einer vernünftigen Effizienz wachsen und sporulieren werden. Das homologe Gen kann von einem anderen Bacillus oder eng verwandten Organismus, wie Clostridia oder Listeria, genommen werden. Bevorzugter kann das homologe Gen von einem pathogenen Bakterium, wie Staphylococci und Streptococci, genommen werden. Molekulargenetische Methoden für B. subtilis machen es einfach, ein beliebiges Gen durch ein homologes Gen von einem anderen Bakterium zu ersetzen.
  • Ein künstlich eingeführtes Reportergen ist ein Gen, das im fraglichen Stamm nicht natürlicherweise vorkommt, und das mit Hilfe einer genetischen Manipulation eingeführt worden ist. Ein Reportergen ist ein Gen, das bei Expression einen leicht nachweisbaren oder beobachtbaren Phänotyp hervorruft. Zum Beispiel kann das exprimierte Protein ein Enzym sein, das auf ein Substrat wirkt, um ein Produkt zu ergeben, das einfach zu beobachten ist, z.B. weil es farbig, chemilumineszierend oder fluoreszierend ist. Reportergene, die in Bacillus-Spezies und anderen Mikroorganismen exprimiert werden können, sind gut bekannt und in der Literatur genannt. Reportergene werden vorzugsweise so gewählt, dass ihre Produkte ohne weiteres gleichzeitig getestet werden können. lacZ ist schon mehr als 10 Jahre mit großem Erfolg in B. subtilis eingesetzt worden, und es besteht ein ganzes Spektrum an zweckdienlichen Substraten, die farbige oder fluoreszierende Produkte nach einer Hydrolyse von β-Galactosidase erzeugen können. Das uidA-Gen von E. coli ist vor kurzem für ähnliche Zwecke eingesetzt worden, wobei das Spektrum an Substraten, die für das Genprodukt, β-Glucuronidase, verfügbar sind, dem für β-Galactosidase ähnlich ist.
  • In einem Beispiel werden zwei unterschiedliche fluorogene Substrate eingesetzt, um die Aktivitäten der beiden Reportergene gleichzeitig in einer einzigen Reaktion zu untersuchen.
  • Bei Inkubation des Mikroorganismus, z.B. bei Zellteilung oder Sporulation, wird ein Reportergen in einer auf die Aktivität eines Expressionsprodukts, z.B. eines Zellteilungsproteins, des homologen Gens bezogenen Weise exprimiert. Zum Beispiel kann eine verminderte Aktivität dieses Proteins entweder mit einer erhöhten Expression oder verminderten Expression des Reportergens in Verbindung stehen. Wenn zwei Reportergene verwendet werden, ist vorzugsweise in Verbindung mit einer Veränderung im Aktivitätsgrad dieses Proteins die Expression des einen Reportergens erhöht und die Expression des anderen vermindert.
  • Das bevorzugte Assay-Verfahren der Erfindung umfasst die Induktion der Sporulation des beschriebenen Bacillus-Stamms in der Gegenwart eines möglicherweise antimikrobiellen Agens. Vorzugsweise wird der Bacillus-Stamm direkt vor einer asymmetrischen Zellteilung mit dem Agens in Kontakt gebracht. Um Agenzien in großem Maßstab zu durchmustern, können Proben des Bacillus-Stamms in einem Sporulationsmedium kultiviert werden, um die Sporulation zu stimulieren; entweder in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, zu denen das Agens gegeben wird; oder in einem Großansatz, der in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte verteilt wird, deren einzelne Vertiefungen ein oder mehrere verschiedene Agenzien enthalten. Nach einer geeigneten Inkubation wird die Expression eines oder mehrerer Reportergene beobachtet. Sind zum Beispiel die Expressionsprodukte zweier Reportergene verschiedene Enzyme, so können Substrate für die beiden Enzyme zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben werden, woraufhin die Beobachtung von z.B. chemilumineszierenden oder fluoreszierenden oder farbigen Produkten der Enzymaktivität erfolgt.
  • Die Verwendung derartiger Stämme weist mehrere praktische Konsequenzen auf:
    • i) Sie ermöglicht die Identifizierung von Inhibitoren, die auf das Proteinprodukt eines Pathogens, nicht jedoch auf dasjenige eines elterlichen Mikroorganismus, z.B. B. subtilis, wirken.
    • ii) Im Falle eines Assays auf Inhibitoren der Zellteilung kann sie die Identifizierung des spezifischen Ziels des Inhibitors erleichtern. Durch eine Durchmusterung von vielversprechenden Verbindungen mit einer Reihe von Stämmen, in denen die Zell teilungsgene durch homologe Gene von anderen Organismen systematisch ersetzt worden sind, wird das spezifische Ziel der hemmenden Verbindung offensichtlich. Folglich wäre zum Beispiel ein Nachweis einer Verbindung, die den elterlichen B. subtilis-Stamm, nicht aber einen Abkömmling hemmt, der das S. aureus-Homologon von ftsZ trägt, ein starker Hinweis auf eine Verbindung, die auf das FtsZ-Protein gerichtet ist.
    • iii) Ein Panel von Stämmen mit einem gegebenen Target-Gen, das durch Gene von einem anderen Organismus systematisch ersetzt worden ist, liefert ebenfalls eine Information über das Aktivitätsspektrum eines jeden potenziellen Inhibitors. Zum Beispiel dürften einige der Verbindungen, die das B. subtilis SpoIIIE-Protein hemmen, nicht auf Stämme wirken, die sein S. aureus-Homologon tragen. Andere Verbindungen dürften eine nicht Spezies-spezifische Hemmung zeigen und auf ein Spektrum an Genprodukten anderer Organismen wirken. Derartige Tests stellen zweckdienliche Mittel bereit, um sicherzustellen, dass neue Inhibitoren ein breites Aktivitätsspektrum besitzen.
  • Folglich stellt mit einem anderen Aspekt die Erfindung ein Panel der definierten Mikroorganismen bereit, worin in verschiedenen Mitgliedern des Panels Gene teilweise oder vollständig durch homologe Gene von anderen Mikroorganismen ersetzt worden sind. Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zum Bewerten eines Agens auf seine antibiotische Aktivität, wobei dieses Verfahren die Inkubation der Mitglieder des Panels in Gegenwart des Agens und die Beobachtung der Expression des Reportergens oder -gene in verschiedenen Mitgliedern des Panels umfasst.
  • Gemäß WO 97/00325 stellt ein einzigartiger Sporulationsphänotyp, der auftritt, wenn spoIIIE inaktiviert ist, das Potenzial für einen sehr leistungsfähigen und spezifischen Assay bereit. Bei Fehlen eines funktionsfähigen spoIIIE wird das Chromosom teilweise innerhalb und teilweise außerhalb des Vorsporen-Kompartiments gefangen, wobei jedoch der Vorsporen-spezifische Transkriptionsfaktor σF normal aktiviert wird. Von σF abhängige Reportergene werden exprimiert, wenn sie an bestimmten Stellen im Chromosom lokalisiert sind, und werden blockiert, wenn sie an anderer Stelle liegen. Diese Erfindung stellt einen Bacillus-Stamm mit einem Chromosom mit zwei Reportergenen bereit, die jeweils an einen Promotor geknüpft sind und auf die Wirkung von σF während der Sporulation ansprechen, wobei ein erstes Reportergen in einem Segment der DNA lokalisiert ist, das in einem Vorsporen-Kompartiment gefangen wird, wenn die spoIIIE-Funktion beeinträchtigt ist, und ein zweites Reportergen außerhalb dieses Segments lokalisiert ist. Ein Assay-Verfahren unter Verwendung des Bacillus-Stamms ist ebenfalls beschrieben.
  • Das B. subtilis spoIIIE-Gen ist für eine Verlagerung des Vorsporen-Chromosoms durch ein asymmetrisch positioniertes Septum während der Sporulation von B. subtilis erforderlich. Obwohl dies auf den ersten Blick ein sehr spezialisierter Mechanismus zu sein scheint, sind spoIIIE-artige Gene über alle Bakterien hoch konserviert. Eine allgemeinere Funktion für das B. subtilis-Gen wurde mit Experimenten gezeigt, in denen Wildtyp-Zellen und spoIIIE-mutierte Zellen von B. subtilis subletalen Konzentrationen von Inhibitoren der DNA-Replikation ausgesetzt wurden (Sharpe and Errington, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8630–8634). Unter diesen Bedingungen ist die Wahrscheinlichkeit, dass chromosomale DNA im Teilungsseptum gefangen wird, erhöht. Wildtyp-Zellen konnten sich von diesem Zustand wieder regenieren, in spoIIIE-Mutanten jedoch blieb das Chromosom gefangen, und folglich waren diese Mutanten für derartige Inhibitoren empfindlicher.
  • Falls eine Verlagerung von chromosomaler DNA von dem Teilungsseptum die allgemeine Funktion des SpoIIIE-Proteins ist und seine Wirkung während der Sporulation nur eine extreme Demonstration dieser Funktion ist, so könnten die spoIIIE-artigen Gene von nicht-sporulierenden Bakterien in der Lage sein, den Defekt der spoIIIE-Mutanten von B. subtilis funktionell zu beheben und ihre Sporulationsfähigkeit wiederherzustellen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das spoIIIE-Gen teilweise oder vollständig durch ein homologes Gen von einem anderen Bakterium ersetzt. Die Verwendung des homologen Gens von Streptococcus pneumoniae wird im Beispiel unten beschrieben.
  • Gemäß WO 98126087 liefern die Wirkungen von spoOJ-Mutationen auf die Orientierung des Vorsporen-Chromosoms und die Möglichkeit, dies durch die Verwendung einer spoIIIE-Mutante mit diesem Hintergrund zu detektieren, das Potenzial für einen sehr spezifischen Ganzzell-Assay auf Inhibitoren der spoOJ-Funktion. Das Vorhandensein eines beliebigen gegebenen Segments von chromosomaler DNA in der Vorspore kann durch die Verwendung eines Reportergens nachgewiesen werden, das von einem Faktor σF kontrolliert wird, der nur in dem kleinen Vorsporen-Kompartiment aktiviert wird (ein Vorgang, der nicht von Störungen der Chromosomenverteilung beeinflusst wird).
  • WO 98/26087 stellt folglich einen Bacillus-Stamm mit einem Chromosom mit den folgenden Modifikationen bereit:
    • a) einer Mutation eines spoIIIE-Gens, das den Transfer des Vorsporen-Chromosoms blockiert,
    • b) einer Mutation in dem soj-Gen, das den Verlust der spoOJ-Funktion von einer blockierenden Sporulation verhindert, zusammen mit
    • c) einem ersten Reportergen mit einem Promotor, der vom σF-Faktor abhängig ist und an einer Stelle platziert ist, wo eine beeinträchtigte spoOJ-Funktion zu einem vermehrten Trapping und folglich zu einer erhöhten Expression von der Vorspore führt und/oder
    • d) einem zweiten Reportergen mit einem Promotor, der vom σF-Faktor abhängig ist und an einer Stelle platziert ist, wo eine beeinträchtigte spoOJ-Funktion zu einem verminderten Trapping und folglich zu einer verminderten Expression in der Vorspore führt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Bacillus-Stamm von dieser Art bereit, bei dem das spoOJ-Gen durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist.
  • Die Synthese des σF-Faktors beginnt beim Einsetzen der Sporulation, wobei aber sein Produkt durch die Wirkung eines anti-Faktors spoIIAB anfänglich in einem inaktiven Stadium gehalten wird. Die Aufhebung der Inhibition erfordert eine konzertierte Aktion von wenigstens zwei weiteren Proteinen, SpoIIAA und SpoIIE, die dazu dienen, die Freisetzung von σF-Aktivität erst dann zuzulassen, nachdem die sporulierende Zelle eine asymmetrische Zellteilung durchlaufen hat, und die σF-Aktivität auf den kleineren Vorsporen-Zelltyp zu beschränken. Gemäß WO 98126088 wird diese Abhängigkeit der σF-Aktivierung von der Septumformierung als der Grundlage für einen empfindlichen Assay auf Inhibitoren der Zellteilung genutzt. Folglich stellt diese Beschreibung einen Bacillus-Stamm mit zwei Reportergenen bereit, einem ersten Reportergen mit einem Promotor, der von aktivem σF (oder σE) abhängig ist, und einem zweiten Reportergen mit einem Promotor, das ähnlich wie das Gen reguliert wird, das den σ-Faktor codiert, um ein Maß der Synthese des (inaktiven) σ-Faktor zu liefern. Ein Ganzzell-Durchmusterungsverfahren für die Identifizierung antimikrobieller Agenzien umfasst die Verwendung des Bacillus-Stamms.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein beliebiges Bacillus-Zellteilungsgen, das an diesen Aktivitäten beteiligt ist, durch ein homologes Gen von einem anderen Bakterium teilweise oder vollständig ersetzt. Das Bacillus-Gen kann zum Beispiel divIB (auch als ftsQ bezeichnet), divIC, divIVA, ftsA, ftsL (auch als mraR bezeichnet), ftsZ, pbp8, wie auch, spoOJ und spoIIIE sein.
  • Beispiel
  • Die Erfinder konstruierten einen Stamm von B. subtilis, in dem die letzten 310 Aminosäure-Reste des spoIIIE-Gens durch den äquivalenten Abschnitt des Gens von Streptococcus pneumoniae-Stamm R6 entweder in der korrekten oder inversen Orientierung ersetzt worden waren. In der korrekten Orientierung sollte der Stamm ein hybrides Protein herstellen, das die gering konservierte Membran-Ankerregion, die von dem B. subtilis-Gen codiert wird, das an die hoch konservierte C-terminate codierende Region des Streptococcus pneumoniae Gens fusioniert ist, umfasst.
  • Bei Stämmen mit dem Streptococcus-Gen, das entweder in der korrekten oder in der inversen Orientierung, bezogen auf das spoIIE-Gen des Wirts, inseriert worden war, wurde eine Sporulation mit einem Resuspensions-Standardverfahren, und gleichzeitig bei einem isogenen Wildtyp-Stamm, induziert. Nach 9 Stunden wurde die Anzahl an gebildeten Sporen auf Basis der Hitzeresistenz durch 10-minütiges Erhitzen auf 80 °C und dann Ausplattieren der Verdünnungsreihen auf Nähragar ermittelt. Die Kolonien wurden nach einer Inkubation über Nacht ausgezählt. In dem Stamm, bei dem die Streptococcus-DNA in der inversen Orientierung inseriert war und der somit ohne intaktes spoIIIE-Gen war, blieb die Sporulation vollkommen aus (< 10 hitzeresistente Kolonie-bildende Einheiten [KBE] pro ml Kultur). Mit der Streptococcus-DNA in der korrekten Orientierung wurde jedoch festgestellt, dass die Hitzeresistenz der Sporen auf eine ungefähr gleiche Häufigkeit (2,0 × 108 KBE pro ml) wie die des Wildtyps (1,3 × 108 KBE pro ml) zunahm. Das Auswachsen einer neuen Kolonie von einer hitzeresistenten Spore setzt voraus, dass die Spore ein vollständiges Chromosom erhalten hat. Folglich muss das Hybridgen die Fähigkeit besessen haben, den Chromosomentransfer in das Sporen-Kompartiment ebenso wie das SpoIIIE-Protein des Wildtyps zu katalysieren.

Claims (14)

  1. Bacillus-Stamm, der zu Wachstum und Sporulation fähig ist, mit einem Chromosom, in welchem: a) wenigstens ein Target-Gen teilweise oder vollständig durch ein homologes Gen von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist; und b) ein künstlich eingeführtes Reportergen vorhanden ist und in einer Weise exprimiert wird, so dass die Reportergen-Expression in Verbindung mit einer Veränderung im Aktivitätsgrad des homologen Genexpressionsprodukts erhöht oder vermindert wird und worin in dem Bacillus-Stamm: A) a) ein spoIIIE-Gen durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und b) zwei Reportergene vorhanden sind, die jeweils an einen Promotor geknüpft sind und auf die Aktivität σF während der Sporulation ansprechen, wobei ein erstes Reportergen in einem Segment der DNA lokalisiert ist, das in einem Vorsporen-Kompartiment eingefangen ist, wenn die spoIIIE-Funktion beeinträchtigt ist, und ein zweites Reportergen außerhalb dieses Segments lokalisiert ist; oder B) a) ein Zellteilungsgen teilweise oder vollständig durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und b) zwei künstlich eingeführte Reportergene vorhanden sind, wobei ein erstes Reportergen einen Promotor aufweist, der von aktiven σF oder σE-Faktoren abhängt, und ein zweites Reportergen ein Maß der Synthese des (inaktiven) σF oder σE-Faktors liefert; oder C) wobei der Stamm durch eine Mutation eines spoIIIE-Gens modifiziert ist, welches den Transfer des Vorsporen-Chromosoms blockiert, und; a) ein spoOJ-Gen durch sein Homologon von einem anderen Bakterium ersetzt worden ist, und b) ein oder zwei Reportergene vorhanden sind, wobei ein erstes Reportergen einen Promotor aufweist, welcher vom σF-Faktor abhängig ist und an einer Lokalisation platziert ist, an der eine beeinträchtigte SpoOJ-Funktion zu einem erhöhten Trapping führt und folglich zu einer erhöhten Expression in der Vorspore, und/oder wobei ein zweites Reportergen einen Promotor aufweist, der vom σF-Faktor abhängt und an einer Lokalisation platziert ist, an der eine beeinträchtigte SpoOJ-Funktion zu einem verminderten Trapping führt und folglich zu einer verminderten Expression in der Vorspore führt.
  2. Bacillus-Stamm nach Anspruch 1, wobei das Gen an der DNA-Replikation, RNA-Synthese, Proteinsynthese, Zellwandsynthese, Transport oder Zellteilung beteiligt ist.
  3. Bacillus-Stamm nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem zwei künstlich eingeführte Reportergene vorhanden sind und in einer Weise exprimiert werden, so dass die Expression des einen erhöht ist und die Expression des anderen vermindert ist, in Verbindung mit einer Veränderung im Aktivitätsgrad des homologen Genprodukts.
  4. Bacillus-Stamm nach Anspruch 1(A), worin ein spoIIIE-Gen teilweise oder vollständig durch ein homologes Gen von Streptococcus pneumoniae ersetzt worden ist.
  5. Bacillus-Stamm nach einem der vorangehenden Ansprüche, welcher ein B. subtilis-Stamm ist.
  6. Verfahren zum Auswerten eines Agens auf seine antibiotische Aktivität, welches Verfahren das Inkubieren des Bacillus-Stamms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Gegenwart des Agens und Beobachten der Expression des Reportergens oder -gene umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Bacillus-Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Sporulieren in Gegenwart des Agens induziert wird.
  8. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Agens die SpoIIIE-Funktion in Bacillus-Spezies hemmt, welches Verfahren das Induzieren des Bacillus-Stamms nach Anspruch 1(A) oder Anspruch 4 zum Sporulieren in Gegenwart des Agens und Beobachten der Expression der ersten und der zweiten Reportergene umfasst.
  9. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Agens die Zellteilung in Bacillus-Spezies hemmt, welches Verfahren das Induzieren des Bacillus-Stamms nach Anspruch 1(B) zum asymmetrischen Teilen, wie während der Sporulation, in Gegenwart des Agens, und das Beobachten der Expression der ersten und zweiten Reportergene umfasst.
  10. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Agens die SpoOJ-Funktion in Bacillus-Spezies hemmt, welches Verfahren das Induzieren des Bacillus-Stamms nach Anspruch 1(C) zum asymmetrischen Teilen, wie während der Sporulation, in Gegenwart des Agens, und das Beobachten der Expression des ersten und/oder des zweiten Reportergens umfasst.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Bacillus-Stamm zum Sporulieren induziert wird und, direkt vor der asymmetrischen Zellteilung, mit dem Agens kontaktiert wird.
  12. Panel der Bacillus-Stämme nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin bei verschiedenen Mitgliedern des Panels Gene teilweise oder vollständig durch homologe Gene von unterschiedlichen Bakterien ersetzt worden sind.
  13. Verfahren zum Auswerten eines Agens auf seine antibiotische Aktivität, welches Verfahren das Inkubieren der Mitglieder des Panels aus Anspruch 12 in Gegenwart des Agens und Beobachten der Expression des Reportergens oder -gene bei verschiedenen Mitgliedern des Panels umfasst.
  14. Verfahren, welches das Inkubieren eines Bacillus-Stamms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Gegenwart eines Agens, Beobachten der Expression der ein oder mehreren Reportergene und dabei Bestimmen, dass das Agens das Wachstum des Bacillus-Stamms hemmt und als ein Antibiotikum verwendet werden kann, umfasst.
DE69934815T 1998-11-10 1999-11-10 Bacillusstamm und nachweismethoden Expired - Lifetime DE69934815T2 (de)

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