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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft die Gentechnik
und liefert Nukleinsäuresonden
zum Nachweis von pathogenem Escherichia coli O157:H7 in Lebensmitteln
und fäkalen
Proben.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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E. coli O157:H7 ist ein virulenter,
aus Lebensmitteln stammender pathogener OOrganismus, der eine akute,
hämorrhagische
Kolitis (blutige Entzündung
des Kolons) bewirkt und manchmal zu einem schweren, hämolytischen,
urämischen
Syndrom (HUS) in Kindern führt.
Dieser Zustand kann tödlich
sein oder einen dauerhaften Leberschaden bewirken und die Lebenserwartung
verringern. Die Möglichkeiten
zur Behandlung dieser Infektion sind begrenzt, die Vorbeugung vor
der menschlichen Infektion ist daher von größter Wichtigkeit.
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E. coli O157:H7 Epidemien werden
im Allgemeinen auf kontaminiertes Wasser oder Fleisch zurückgeführt, besonders
auf nicht genügend
erwärmte
Hamburger. Nach dem massiven Ausbruch im Jahr 1993 im Staat Washington
verschwand der Stamm, der für
die Epidemie verantwortlich war, bald nach dem Rückruf der verseuchten Ware.
Der Verzehr von verunreinigtem Rindfleisch scheint daher die Hauptursache
für eine
humane Infektion zu sein und nicht die Ausbreitung durch Übertragung
von Person zu Person. Wegen des schnellen Eintretens lebensbedrohender
Komplikationen, ist eine brauchbare Diagnose von äußerstem
Interesse für
jene, die mit diesem E. coli Stamm infiziert sind, besonders, wenn
der Patient ein Kind ist. Weil jedoch die frühen Symptome dieser Krankheit ähnlich zu
denen anderer Krankheiten sind, können Patienten, die mit diesem
Organismus infiziert sind, während
der Frühstadien
neuer Epidemien nicht auf E. coli O157:H7 untersucht werden, bis
andere Ursachen ausgeschlossen sind. Sobald der Verdacht einer Infektion
mit E. coli O157:H7 besteht, benötigen
die Testmethoden, die zur Zeit für
eine Diagnose zur Verfügung
stehen, ungefähr einen
Tag zur Durchführung,
bevor eine endgültige
Diagnose bestätigt
werden kann. Jedes Mittel, diese gefährliche Verzögerung abzukürzen, würde das
Risiko infizierter Patienten und ihrer Familienmitglieder erhöhen, die
durch eine Übertragung
von Person zu Person infiziert werden könnten.
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Von äußerster Wichtigkeit, um den
Ausbruch von E. coli O157:H7 zu kontrollieren, ist der schnelle Nachweis
in einer verunreinigten Lebensmittelquelle. Eine allgemein gebräuchliche
Methode, um E. coli O157:H7 nachzuweisen, besteht in der Inkubation
auf Sorbitol-haltigem Agar, ein Substrat, das das Wachstum der meisten
fäkalen
E. coli Stämme
unterstützt,
das der Stamm O157:H7 aber nicht metabolisieren kann. Der Defekt,
Sorbitol zu fermentieren, liefert jedoch keine eindeutige Diagnose,
da nichtpathologische E. coli Stämme
existieren, die Sorbitol auch nicht fermentieren können. Ein
Latex-Agglutinierungstest zur Identifizierung der Serogruppe O157
von der Firma Oxoid (Unipath Limited, Basingstoke, Hampshire, England)
empfiehlt, den Test auf Isolate anzuwenden, bei denen schon vorher
bestimmt wurde, das ihnen die Fähigkeit
fehlt, Sorbitol zu fermentieren. Diesem Antikörper-basierten Test fehlt es
an Spezifität:
Einige Stämme
von E. hermnali teilen das Antigen, das das Antiserum nachweist;
daher muß dieser
Test durch weitere Untersuchungen zur Fermentation bestätigt werden,
bevor ein Isolat schlüssig
als E. coli O157:H7 identifiziert werden kann. Darüber hinaus können nicht-zytotoxische
E. coli das E. coli O157 Antigen enthalten, was zu falschpositiven
Reaktionen in solchen O157-Antigen-Nachweissystemen führen kann.
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Andere diagnostische Methoden für E. coli
O157:H7 wurden vorgeschlagen. Die immunfluoreszente Untersuchung
von frischem Stuhl mit O157-spezifischem, markiertem Antiserum wurde
kürzlich
als eine schnelle Methode zur Identifizierung von Patienten vorgeschlagen,
deren Stuhl E. coli O157:H7 enthält
(Park et al., Am. J. Clin. Path. 101: 91–94, 1994). Antikörper-umhüllte Magnetperlen
(Dynal) sind verfügbar,
die mit E. coli O157:H7 reagieren. Die Antigendetektionstests jedoch
sollten durch eine Kultur von Stuhlproben bestätigt werden (Tarr, Clinical
Infectious Diseases, 20: 1–8,
1995).
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Ein Testkit für E. coli O157:H7, von dem
berichtet wurde, dass es diesen Organismus in Fleisch nachweisen
kann, ist verfügbar
(Organon Teknika, Durham, N. C.). Es handelt sich um eine Antigen-basierte
Technologie, bei der bakterielle Antigene als Angriffspunkte verwendet
werden, um den Organismus zu identifizieren. Der Test benötigt einen
Tag (d. h. über
Nacht), um einen mutmaßlich
positiven Test zu erhalten. Eine weitere Technik, die vorgeschlagen
wurde, besteht in einem schnellen Immuntest mit einem Messstab,
um enterohämorrhagische
E. coli O157:H7 in Hackfleisch, das im Einzelhandel verkauft wird,
nachzuweisen (Kim et al., Applied Environmental Microbiology 58:
1764–1767,
1992).
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Für
diagnostische Zwecke können
konventionelle, mikrobiologische und Antikörperbasierte Untersuchungsmethoden
ausreichend sein, um einen Ausbruch einer HUS-Epidemie unter Kontrolle zu halten.
Zum Zeitpunkt des Auftretens von HUS ist bei Zweidrittel der Patienten
kein E. coli mehr O157:H7 im Stuhl vorhanden. Darüber hinaus
ist die Anzahl an Organismen, die in verunreinigten Lebensmittelproben
vorhanden sind, oft zu gering, um sie nachzuweisen. Spezifische
DNA-Sonden für
diesen pathogenen Organismus würden
eine alternative Methode liefern, die geeignet ist, um eine kleine
Zahl an Organismen nachzuweisen. In der Vergangenheit waren die
meisten Anstrengungen solche Sonden zu entwickeln, auf das Gen gerichtet,
das die Shigaähnlichen
Toxine (SLTs) kodiert, von denen angenommen wird, dass sie für viele
der pathogenen Wirkungen des Stamms O157 verantwortlich sind. Siehe:
Levine et at., The Journal of infectious Diseases 156(1): 175–182, 1987;
Samadpour et al., Applied and Environmental Microbiology 56(5):
1212–1215,
1990; Pollard et al., Journal of Clinical Microbiology 28(3): 540–545, 1990;
Pollard et al., The Journal of Infectious Diseases 162: 1195–1198, 1990.
Die Pathogenität
vieler SLT-Gen-enthaltender Stämme
ist jedoch fraglich (Tarr, Clinical Infectious Diseases, 20: 1–8, 1995).
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PCR-Tests zum Nachweis von O157:H7
Stämmen,
unter Verwendung des uidA Gens, wurden auch beschrieben (Feng et
at., Applied and Environmental Microbiology 57(1): 320–323, 1991;
Feng, Molecular and Cellular Probes 7: 151–154, 1993.).
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Kürzlich
wurde ein Multiplex-PCR-Test beschrieben, der drei Sätze an Primern
benötigt,
wobei zwei davon auf konservierte Regionen in den Genen, die SLT-I
und SLT-II kodieren, gerichtet sind und das dritte Set gegen das
uidA-Gen (Cebula et at., Journal of Clinical Microbiology 33(1):
248–250,
1995).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung liefert eine Nukleinsäuresonde
zum Nachweis der Anwesenheit von enterohämorrhagischem E. coli O157:H7,
umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit
der SEQ ID NO: 1 oder dem Komplement davon und zur DNA von O157:H7
hybridisiert, aber nicht mit der DNA des klonal verwandten enteropathogenen
E. coli O55:H7.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung liefert ein DNA-Fragment
(SEQ ID NO: 1), das für
den Nachweis von E. coli O157:H7 in Lebensmitteln und fäkalen Proben
nützlich
ist. Dieses DNA-Fragment, isoliert aus E. coli O157:H7, hybridisiert
nicht mit den bekannten Genen für
Shiga-Toxine aus Shigella dysenteriae oder dem uidA-Gen, das die β-Glucuronidase
in E. coli kodiert. Vielmehr enthält dieses DNA-Fragment unerwarteterweise
zwei Gene, die zu dem vermeintlichen Transmembran-Exportprotein
aus Yersinia pseudotuberculosis (Kessler et al., Journal of Bacteriology
175(5): 1412–1422,
1993) und dem rfbE-Gen, von dem berichtet wurde, dass es Perosaminsynthetase
in Vibrio Cholerae kodiert, homolog sind (Stroeher et al., Proc.
Natl. Acad. Sci, U.S.A. 89: 2566–2570, 1992).
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Das erfindungsgemäße DNA-Fragment wurde zufällig bei
Untersuchungen zur Rolle des O157-Lipopolysaccharids bei der Pathogenese
von E. coli O157:H7 gefunden. In Kürze zusammengefasst, die TnpHoA-Insertionsmutagenese
wurde verwendet, um E. coli Mutanten zu generieren, die dieses Antigen
nicht exprimierten. Es wurde festgestellt, dass solche Mutanten
hyperadhärent
waren, d. h., dass sie eine ausgeprägte Steigerung in ihrer Fähigkeit
aufwiesen, an HeLa-Zellen zu binden. Nach dem Durchmustern von ungefähr 3000
TnphoA-Mutanten von E. coli O157:H7 auf den Verlust des Antigens
durch den Latexpartikel-Agglutinierungstest, wurden zwei O157 hyperadhärente Mutanten,
als 20D2B und F12 bezeichnet, für
eine genauere Analyse ausgewählt.
Beide mutante Stämme
zeigten eine ungefähr
achtfach erhöhte
Adhärenz
zu HeLa-Zellen, im Vergleich zum Elternstamm. Die Southernblots
zeigten, dass diese Mutanten zwei bzw. eine TnphoA-Insertion enthielten.
Eine Analyse der Nukleinsäuresequenz
der DNA-Regionen,
die die F12-Insertion flankieren, ergab, dass zwei offene Leseraster
vorliegen, die eine signifikante Homologie mit dem vermeintlichen
Transmembran-Exportprotein von Yersinia pseudotuberculosis und dem
rfbE-Gen aus Vibrio cholerae, aufweisen. Durch Verwendung von PCR-Primern
(unten bezeichnet) aus diesen flankierenden Regionen wurde das erfindungsgemäße DNA-Fragment
aus E. coli O157:H7 kloniert. Dieses Fragment wird hier als „die F12-Region" bezeichnet und dessen
Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 1 angegeben.
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Diese Erfindung liefert Nukleinsäuresonden,
die von der F12-Region abgeleitet sind. Bevorzugte Sonden werden
aus den zwei offenen Leserastern ausgewählt, die den Nukleotiden 1-1026
(SEQ ID NO: 2) und den Nukleotiden 1029–2123 (SEQ ID NO: 3), in SEQ
ID NO: 1 gezeigt, entsprechen. Exemplarisch ist die Verwendung einer
Nukleinsäuresonde
(SEQ ID NO: 4) beschrieben, entsprechend den weiter unten in SEQ
ID NO: 1 gezeigten Nukleotiden 913–2199. Andere Nukleinsäuresonden
können
leicht aus den angrenzenden Nukleotiden innerhalb der offenbarten
Sequenzen) ausgewählt
werden und sowohl auf Sensitivität
(für den Stamm
O157:H7) als auch auf Spezifität
(Fehlen der Sensitivität
gegenüber
anderen mikrobielle Verunreinigungen in Lebensmitteln und Fäkalien),
durchgemustert werden, indem ein geeignetes Panel an positiven und negativen
genomischen Kontrollen verwendet wird.
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In dem Durchmusterungs-Test diente
E. coli O157:H7 als positive genomische Kontrolle. Negative genomische
Kontrollen wurden aus anderen mikrobiellen Stämmen ausgewählt, die typischerweise als
Verunreinigung in zu testenden Lebensmittel-, landwirtschaftlichen
und klinischen Proben vorliegen. Solche negativen, genomischen Kontrollen
werden vorzugsweise aus E. coli Stämmen ausgewählt, die genetisch und antigenisch
verwandt sind und bevorzugt klonal verwandt zum Stamm O157:H7 sind.
Die klonale Verwandtschaft zwischen den E. coli Stämmen, die
eine hämorrhagische
Kolitis und Diarrhoe bei Kindern verursachen, ist bei Whittam et
al., Infection and Immunity 61: 1619–1629, 1993. 4 zeigt
einen phylogenetischer Stammbaum genomisch eng verwandter Stämme. In
der gleichen Linie wie O157:H7 sind die folgenden klonal verwandten Stämme zu finden,
die als geeignete Negativkontrollen dienen können, nämlich: der enterohämorrhagische Stamm
O55:H7 (der am nächsten
verwandte Stamm), O111:H12 und O55:H6. Andere E. coli Stämme, die
als geeignete Negativkontrollen dienen können, schließen die
nicht-toxischen und zytotoxischen E. coli Stämme der Serotypen O157:H43,
O111:H8, O26:H11, 0128:H7, O128:H21, O111:H21, O128:H2 und O111:H2
ein.
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Die Bakterienstämme zur Verwendung in dem Durchmusterungs-Panel
können
von den Referenz-Sammlungen erhalten werden: "The Centers for Disease Control (CDC)", Atlanta, Ga.; "The E. coli Reference
Center", University
Park, Pa.; „The
American Type Culture Collection" (ATCC),
Rockville, Md.; "The
Center for Vaccine Development",
Baltimore, Md.; "The
Division of Microbiology, Food and Drug Administration (FDA)", Washington, D.
C.; "The Center
for Disease Control, Ottawa, Canada"; Universitats-Krankenhaus, Hamburg, Deutschland; und „The Statens
Seruminstitut, Kopenhagen, Dänemark.
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Solch ein Referenz-Panel an Bakterien
kann verwendet werden, um Nukleinsäuresonden aus der F12-Region,
in SEQ ID NO: 1 gezeigt, zu identifizieren, die die benötigte Sensitivität und Selektivität liefern, um
den E. coli Stamm O157:H7 von anderen Bakterien, einschließlich verwandter
Stämme
von E. coli, zu unterscheiden. In einem repräsentativen Durchmusterungssystem
werden die Bakterien aus dem Test-Panel auf Tryptikase-Soja-Agar ausplattiert,
wie bei Samadpour et al., 1990, beschrieben, die Veröffentlichung
ist dadurch durch Referenz eingefügt. Kandidaten-Oligonukleotidsonden,
die zufällig
aus benachbarten Nukleotiden innerhalb der F12-Region ausgewählt wurde, werden mit Hilfe
eines DNA-Synthesegerätes
synthetisiert, den Angaben des Herstellers folgend. Eine Sonde,
die der SEQ ID NO: 4 entspricht, von der gezeigt wurde, dass sie
die erforderliche Spezifität
aufweist, kann als eine Kontrollsonde verwendet werden. Alle Sonden
wurden mit konventionellen Methoden markiert. Aliquots chromosomaler
DNA, von jedem Bakterienstamm aus dem Panel extrahiert, wurden unter
stringenten Bedingungen mit den markierten Kandidaten- und Kontrollsonden hybridisiert.
Wildtyp E. coli O157:H7 diente als Positivkontrolle. Von Kandidatensonden,
die unter stringenten Bedingungen mit O157:H7 hybridisieren, aber nur
wenig oder gar nicht mit den Stämmen
der Negativkontrolle, wird angenommen, dass sie die erforderliche
Spezifität
besitzen, um E. coli O157:H7 in Proben aus Hackfleisch, Rinderkot
und Proben von klinischem Interesse nachzuweisen.
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Das F12-Fragment (SEQ ID NO: 1) kann
auch verwendet werden, um Nukleinsäuresonden aus dem E. coli O157:H7
Genom zu identifizieren, die die F12-Region flankieren und die benötigte Sensitivität und Spezifität liefern.
Um diese benachbarten Sequenzen unter Verwendung der F12-Region
zu identifizieren, wird eine Bibliothek von zufälligen DNA-Fragmenten durch
partiellen Endonuklease-Verdau hergestellt, in einen geeigneten
Vektor kloniert und mit der F12-Sonde durchgemustert. Die klonierte
DNA wird auf einem Chromosom lokalisiert, um festzustellen, ob in
der eingefügten
DNA zur F12-Region benachbarte Regionen vorliegen und durch Homologie
zur F12-Region identifiziert. Die benachbarte DNA wird sequenziert
und auf Spezifität
und Sensitivität
zur Verwendung als Sonde zum E. coli O157:H7 Nachweis untersucht.
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Die Länge der Nukleinsäuresonde
wurde nach gebräuchlichen
Kriterien ausgewählt.
Zehn Nukleotide sind normalerweise die untere Grenze für solche
Nukleotid-Segmente, weil kleinere Sequenzen manchmal keine stabilen
Duplex-Hybride bilden können
oder unspezifisch mit nicht-verwandten Genen, die kurze Bereiche komplementärer Sequenz
mit der gewünschten
Gensequenz teilen, hybridisieren. Dementsprechend weisen die Sonden
in bevorzugten Ausführungsformen
mindestens 10 Nukleotide in der Länge auf, wobei die Oligonukleotide
fähig sind,
stabile Duplexe mit der Sequenzen) der F12-Region zu bilden. Bevorzugter sind Sonden mit
mindestens 15 Nukleotiden, da solche Sonden wahrscheinlicher stabile
Duplexe mit ihren komplementären Sequenzen
bilden. Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 15 Basen
sind sehr wahrscheinlich spezifisch, da Sequenzen dieser Länge zufällig nicht
mehr als einmal im Säugergenom
auftreten, und daher es extrem unwahrscheinlich ist, dass sie zufällig im
Bakteriengenom vorzukommen. Bevorzugte Sonden haben eine Länge zwischen
15 bis 50 Basen, da Sonden in diesem Bereich zu vernünftigen
Kosten unter Verwendung verfügbarer
DNA-Synthesegeräte oder
Service-Firmen, die Oligonukleotide synthetisieren, hergestellt
werden können.
Diese Erfindung zieht in Betracht, dass DNA-Fragmente, die sogar
länger
als 50 Nukleotide sind, durch die Verwendung von Restriktionsendonukleasen
oder durch die Verwendung von PCR-Primern und nachfolgendes Klonieren
dieser langen Fragmente, aus der F12-Region erhalten werden können.
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Zur Verwendung in dem beschriebenen
Selektionssystem oder für
die Analyse von Lebensmitteln und fäkalen Proben, müssen die
Sonden markiert werden, um in den in den Tests gebildeten Hybriden
nachweisbar zu sein. Synthetische Sonden werden durch Verwendung
der Polynukleotidkinase konventionell mit radioaktivem Phosphor
markiert. Alternativ können
die Proben mit einem Affinitätsreagenz
markiert werden, wie Biotin oder Streptavidin, so dass die Sonde
an ein Enzym binden kann, das eine chromogene Gruppe abspalten kann (für genauere
Angaben, siehe Sambrook et al.).
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Verschiedene konventionelle Protokolle
können
für den
Hybridisierungsschritt verwendet werden. Im Allgemeinen liegt die
markierte Sonde in einer geeigneten Hybridisierungslösung vor,
während
die Ziel-Nukleinsäure
an ein unlösliches
Substrat, wie derivatisiertes Nylon, gebunden ist. In der bevorzugten
Ausführungsform
werden die Ziel-DNA-Sequenzen und die markierten Sonden unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Unter solchen Bedingungen
versteht man üblicherweise
solche, die es erlauben, nur perfekt oder nahezu perfekt zueinander
passende Hybride entstehen zu lassen, und ihre Verwendung wird sicherstellen,
dass die Sonden spezifisch mit den Sequenzen aus E. coli O157:H7
hybridisieren. Die destabilisierenden Wirkungen von falsch gepaarten
Basen nehmen mit abnehmender Sondenlänge zu, so dass bei Sonden,
die kürzer
als 20 Nukleotide sind, stringente Hybridisierungsbedingungen nur
selten irgendwelche falsch gepaarten Basen tolerieren. Bei längeren Sonden
ist es möglich,
dass wenige falsch gepaarte Basen sogar in den unter stringenten
Bedingungen gebildeten Hybriden vorliegen können.
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In einigen Situationen können die
Anwender durch Ergebnisse, die falsch-gepaarte Hybride betreffen, fehlgeleitet
werden, aber in dem vorliegendem Fall stellen die Durchmusterungsmethoden
Sonden zur Verfügung,
die die geeignete Spezifität
aufweisen, unabhängig
davon, ob Basen falsch gepaart sind oder nicht. Dies liegt daran,
dass bei der Durchmusterung Sonden identifiziert werden, die mit
dem Ziel, dem O157:H7 Stamm, reagieren (und im optimalen Fall mit
der positiven Kontroll-F12-Region),
aber nicht mit den negativen Kontroll-Bakterien. Das heißt, es ist
unwesentlich, ob eine gegebene Sonde ein perfektes oder nur nahezu
perfektes Hybrid bildet, da die Fähigkeit, diese zwei Gruppen
von Bakterien zu unterscheiden, die einzige angemessene Maßnahme darstellt,
in Hinblick auf die vorliegenden Tests.
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Eine Vielzahl an funktionierenden
Hybridisierungsbedingungen ist dem Fachmann auf seinem Gebiet bekannt,
z. B. in Sambrook et al. beschrieben. Für längere Sonden als 200 Nukleotide
wird die Hybridisierung normalerweise bei ungefähr 25°C unterhalb der Schmelztemperatur
des Hybrids durchgeführt,
da dann die Rate der Duplex-Bildung optimal ist. Für kürzere Sonden
wird die Hybridisierung normalerweise näher an der berechneten Schmelztemperatur
eines perfekten Hybrids durchgeführt,
z. B. 10–15°C unterhalb
der Schmelztemperatur. Für
Proben unterschiedlicher Länge
können
die Schmelztemperaturen für
perfekt gepaarte Hybride empirisch bestimmt werden oder können mit
Hilfe einer der Formeln, die in Sambrook et al. beschrieben sind,
ausgerechnet werden. Eine exemplarische Hybridisierungslösung für Oligonukleotide
enthält
6 × SSC (ca.
1 M [Na+]) und 0.5% Natriumdodecylsulfat.
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Die erfindungsgemäßen Sequenzen können auch
für den
Nachweis von E. coli O157:H7 in polymikrobiellen Proben unter Verwendung
der Polymerasekettenreaktions (PCR)-Methodik eingesetzt werden. Nukleotidprimer
zum Beispiel, die mit hoher Wahrscheinlichkeit spezifisch für E. coli
O157:H7 sind, können
durch Anwendung der oben beschriebenen Technik bestimmt werden und
können
in PCR Tests eingesetzt werden, um in Anreicherungskulturen, die
wahrscheinlich den Zielorganismus enthalten, für E. coli O157:H7 spezifische,
genomische Sequenzen nachzuweisen. Zum Beispiel wird eine Probe,
von der angenommen wird, E. coli O157:H7 in seiner natürlichen
Umgebung zu enthalten (z. B. Hackfleisch oder Rinderkot), in einer
Anreicherungskultur auf Grundlage von Brühe inkubiert, die DNA mit Standardtechniken
extrahiert, an die DANN mittels PCR geeignete Primer gebunden, und
die resultierenden Banden in Agarosegelen werden auf die Produkte
dieser Reaktion hin untersucht. Eine positive Bande legt die Anwesenheit
von E. coli O157:H7 nahe. Es wird geschätzt, dass so eine Methode innerhalb
mehrerer Stunden nach Start der Inkubation durchgeführt werden
kann, also in einer Zeitspanne, die erheblich kürzer ist als bei vorliegenden
Methoden, die auf der Amplifikation des Organismus zu einem Ausmass
beruhen, das es erlaubt, Antigene nachzuweisen.
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In einer anderen Ausführungsform
werden die Expressionsprodukte (SEQ IDs NO: 5 bzw. NO: 6) der in
SEQ ID NOs: 2 und 3 gezeigten Nukleotidsequenzen als Kandidaten-Immunogene in Betracht
gezogen, um Antikörper-Reagenzien
zum Nachweise des O157:H7 Stammes herzustellen.
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Weiter wird die Erfindung durch das
nachfolgende Beispiel illustriert, das den Nachweis von E. coli O157:H7
durch Verwendung einer Nukleinsäuresonde
(SEQ ID NO: 4) beschreibt, die die offenbarte rfbE-homologe Sequenz
(SEQ ID NO: 3) umfasst.
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BEISPIEL
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Die Gesamt-Bakterien-DNA (chromosomale
und Plasmid DNA) wurde aus einer Vielzahl aus Bakterien gewonnen,
einschließlich:
E. coli O157:H7 Stamm 86–24,
ein Stamm, der 1986 einen Ausbruch einer Infektion in einem Fastfood-Restaurant
in Walla Walla, Washington verursachte (Griffin et al., Annals of
Internal Medicine, 109: 705–712,
1988), als Positivkontrolle (die F-12 Region stammte von diesem
Stamm); E. coli NM544 (ein Labor-Stamm) als negative Kontrolle (Raleigh
et al., Nucleic Acids Research, 16: 1563– 1575, 1988); fünf Test-Stämme der
diarrhoeischen E. coli Gruppe 5 (alle E. coli O55:H7); ein E. coli
Klon, der eng verwandt mit E. coli O157:H7 ist (Whittam et al.,
Infection and Immunity, 61: 1619–1629, 1993); und fünf Test-Stämme von
E. coli O157:H43. Die DNA von jedem dieser Organismen wurde mit
EcoRI verdaut, gelelektrophoretisch in 0.7% Agarose aufgetrennt
und auf eine Nylon-Trägermembran
transferiert. Die immobilisierte DNA wurde dann mit einem Fragment
der F12 DNA (SEQ ID NO: 4) hybridisiert und homologe DNA-Sequenzen
wurden detektiert in: E. coli O157:H7 Stamm 86–24; und vier der fünf E. coli
O157:H43 Stämme,
die untersucht wurden, allerdings in geringerer Intensität. Diese
Sonde (SEQ ID NO: 4) identifizierte ein EcoRI-Fragment von 6 Kb
in den Stämmen,
die positiv waren. Die Sonde identifizierte keine homologe DNA in
der Negativ-Kontrolle, den E. coli O55:H7 Stämmen und einem der E. coli
O157:H43 Stämme.
Es ist jedoch wichtig festzustellen, dass der nicht-reaktive E.
coli O157:H43 Stamm nur sehr schwach positiv in dem Oxoid-Latexpartikel-Agglutinierungstest
war (unähnlich
zu den anderen E. coli O157:H43 Stämmen), und seine Identität als eine
Mitglied der O157 Serogruppe nicht gesichert ist.
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Das pF-12 Plasmid, das die SEQ ID
NO: 7 enthält
(d. h. die Nukleotide 32-2199 der SEQ ID NO: 1) wurde am 14. April
1995 bei der „American
Type Culture Collection",
12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, U.S.A.) hinterlegt.
pF12 ist ein PCR-Produkt des klonierten Homologs des V. cholerae
rfbE-Gens und dem Gen, das das mutmaßliche Transmembran-Exportprotein
aus Y. pseudotuberculosis kodiert, aus dem E. coli O157:H7 Stamm
86–24
sowie einige seiner flankierenden Sequenzen. Für seine Klonierung wurden als Primer
die Sequenzen 5'CTT
CTG GCA TGA TTG ATT GGC3' (SEQ
ID NO: 8) und 3'CGA
GTG GGG CGG TGG AAT TG5' (SEQ
ID NO: 9) verwendet, abgeleitet aus den Nukleotidsequenzen des klonierten
DNA-Segments, das die TnphoA Insertion im Stamm F12 umgibt. Die
Primer wurden so modifiziert, dass sie BamHI- bzw. EcoRI-Stellen
beinhalten, die verwendet wurden, um das PCR-Produkt in pSK+ (Stratagene)
an diesen Stellen einzufügen.
Die Sequenzierung, zwecks Bestätigung
der PCR-Produkte und der klonierten Regionen, die die TnphoA-Insertion
flankieren, zeigten zwei Fehler in diesen klonierten Segmenten.
(SEQ ID NO: 1 ist die korrekte Sequenz.) Diese weisen ein T an Position
964 auf (welches ein fehlerhaftes C in dem klonierten Insert ist,
das bei der ATCC hinterlegt wurde) und ein C an Position 1510 (welches
ein fehlerhaftes T in dem klonierten Insert ist, was bei der ATCC
hinterlegt wurde).
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Die Anwendung dieser vorliegenden
Erfindung wird, wenn nicht anders angezeigt, eine Vielzahl an konventionellen
Techniken der Molekular- und Zellbiologie, der rekombinanten DNA,
Mikrobiologie und Immunologie verwenden, die dem Fachmann auf seinem
Gebiet geläufig
sind. Solche Techniken sind vollständig in der wissenschaftlichen
Literatur und ausführlichen
experimentellen Protokollen, die in einer großen Zahl an methodisch Handbüchern verfügbar sind,
erklärt,
siehe zum Beispiel: F. M. Ausubel et at. (eds.), "Current Protocols
in Molecular Biology," (1987
and 1993); Kriegler, M. (ed.), "Gene
Transfer and Expression, a Laboratory Manual," (1990), W. H. Freeman Publishers; Sambrook,
Fritsch, und Maniatis, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual," Second
Edition (1989); Erlich, H. A. (ed.) "PCR Technology: Principles and Applications
for DNA Amplification," (1989),
Stockton Press; Langone, J. J. und H. Van Vunakis (eds.), "Immunological Techniques, Part
I: Hybridoma technology and monoclonal antibodies," Methods in Enzymology
121: 1–947
(1986); Hurrell, J. G. R. (ed.), "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques
and Applications," (1982),
CRC Press, Boca Raton, Fla.; Coligan, J. E. et al. (eds), "Current Protocols
in Immunology," (1991),
Greene Publishing und Wiley-Interscience, N. Y.; Weir, D. M., "Handbook of Experimental
Immunology," (1986),
Blackwell Scientific; Kurstack, E., "Enzyme Immunodiagnostics," (1986), Academic
Press, San Diego; Polak, J. M. und S. Van Noorden (eds.), "Immunocytochemistry:
Practical Applications in Pathology and Biology," (1983), John Wright PSG, Littleton,
Mass.; Stemberger, L. A., "Immunocytochemistry," (1986), Wiley, N.
Y.; und primäre
Referenzen, die dort zitiert sind.
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