AT505849B1 - Verfahren zur bestimmung von mikroorganismen - Google Patents

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Description

österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Beschreibung [0001] Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen.
[0002] Mikroorganismen sind in der Regel Einzeller und können einerseits Erreger verschiedenster Krankheiten bei Menschen und Tieren sein, und andererseits zur Herstellung bzw. Veredelung von beispielsweise Lebensmitteln verwendet werden. Die exakte Bestimmung von Erregern ist nicht nur für die Diagnose einer Erkrankung entscheidend, sondern auch um eine entsprechende Therapie gezielt durchzuführen. Ferner ist es auch nützlich, wenn Mikroorganismen, die zur Herstellung bzw. bei der Behandlung von Lebensmitteln eingesetzt werden, bestimmt werden können. Dadurch lassen sich beispielsweise Fermentationen besser kontrollieren, um insbesondere Fehlgärungen zu verhindern oder rechtzeitig vor Prozessende entsprechend zu korrigieren.
[0003] Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe eine rasche und eindeutige Bestimmung von Mikroorganismen durchgeführt werden kann. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden zur Verfügung zu stellen, die in oben genannten Verfahren verwendet werden können. Diese Sondenkombination ist in der Lage anhand der in dieser Erfindung inkludierten spezifischen Auswertung mehr als nur eine Spezies pro Probe zu identifizieren.
[0004] Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: [0005] a) Bereitstellen einer Probe, [0006] b) Isolierung von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren, [0007] c) Inkontaktbringen der isolierten Nukleinsäuren mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der Nukleinsäure des mindestens einen zu identifizierenden Mikroorganismus bindet, und mindestens 80 % ident ist mit einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmente davon, welche Fragmente mindestens 20 Nukleotide umfassen, und deren reverskomplementären Sequenzen, wobei die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, [0008] d) Nachweisen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde und [0009] e) Identifizieren eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle A angeführten Mikroorganismen.
[0010] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Mikroorganismen jeglicher Art (ausgewählt aus Tabelle A und B), beispielsweise Lebensmittel-relevante Mikroorganismen, Mikroorganismen, welche für Infektionen (z.B. Euterinfektionen) verantwortlich oder an diesen beteiligt sind, in jeglicher Art von Probe bestimmt bzw. nachgewiesen werden. Die Probe kann erfindungsgemäß von verschiedensten Quellen bezogen werden, in denen das Vorhandensein von Mikroorganismen vermutet oder aber auch bestätigt werden soll. Daher können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei der Auswahl von zu bestimmenden Mikroorganismen die hierin beschriebenen, und geoffenbarten, spezifischen Sonden gemäß Tabellen A und B herangezogen werden. Der Fachmann ist in der Lage anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens die Sonden der zu bestimmenden Mikroorganismen auszuwählen. Erfindungsgemäß ist es daher möglich, die Anwesenheit von mindestens 1, vorzugsweise mindestens 2, noch mehr bevorzugt mindestens 10, (oder aber 20 oder 50), Mikroorganismen in einer Probe gleichzeitig zu bestimmen. Dabei können erfindungsgemäß alle oder 1 bis 5 oder 1 bis 3 oder 1 bis 2 Sonden pro zu bestimmenden Mikroorganismus verwendet werden. Erfindungsgemäß werden im Verfahren mindestens eine, vorzugsweise mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 80, 100 Sonden gleichzeitig verwendet. Die an einem festen Träger (z.B. Slide, Bead oder Matrix) immobilisier- 1 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 ten Sonden sind in der Lage spezifisch DNA zu binden, die den entsprechenden Mikroorganismen gemäß Tabelle A und B zugeordnet werden können. Es ist erfindungsgemäß auch möglich Fragmente der in den Tabellen A und B angeführten Sonden einzusetzen. Um ausreichende Spezifität zu gewährleisten ist es jedoch bevorzugt, dass diese Sondenfragmente zumindest 15, noch mehr bevorzugt mindestens 20, Nukleotide umfassen.
[0011] Mit dem erfindungsgemäßen DNA-basierten Verfahren kann insbesondere mikrobielle DNA in einer manuell hergestellten DNA-Suspension bestehend aus prokaryotischer und euka-ryotischer DNA detektiert werden. Diese künstlich hergestellte DNA-Suspension ist das Ergebnis einer im Grund frei wählbaren DNA-Isolierungsmethode, welche neben DNA auch noch andere Makromoleküle (z.B. Proteine, Lipide, Kohlehydrate,...) enthalten kann.
[0012] Das Ausgangsmaterial für die Herstellung dieser DNA-Suspension ist zumeist natürlichen Ursprungs (z.B. klinische Proben der Human-Medizin, insbesondere Körperflüssigkeiten (wie etwa Blut, Urin, Speichel oder Liquor), und Abstriche, Proben der Veterniärmedizin, insbesondere tierische Körperflüssigkeiten, wie Blut, Milch, Speichel und Liquor; Proben aus der allgemeinen Tierhaltung und Fleischproduktion; Proben aus Lebensmittelproduktion beginnend vom Rohprodukt bis zur fertigen Ware, z.B. im Zuge der Bewertung von Hygienekriterien oder der Überwachung und Bewertung von Fermentationsprozessen (z.B. alkoholische Fermentation, Milchsäuregärung oder Joghurtherstellung und der Produktion von speziellen Fleischprodukten); Lebensmittelproben insgesamt, z.B. für die Vorbeugung von Zoonosen; Proben aus der technischen Produktion, insbesondere der Fernmentation zur Herstellung Sekundär-Metaboliten (wie etwa Zitronensäure oder Buttersäure) oder Proben für die Bewertung von Fermentationsprozessen im Zuge der pharmazeutischen Produktion).
[0013] Des Weiteren kann die erfindungsgemäße Sonde bzw. Sondenkombination auch intrazelluläre Keime (z.B. Mycoplasmen, Chlamydien und Rickettsien) detektieren (konventionelle Methoden mittels Kultivierung würden bis zu vier Wochen dauern).
[0014] Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals pathogene neben nicht-pathogenen Keimen und auch intrazelluläre Keime aus einer Suspension mit einer Vielfalt von differenter DNA zu detektieren. Hierbei ist es nicht nötig, dass die mikrobiellen Spezies einzeln vorliegen, sondern können auch direkt aus einer Mischung von Mikrobenpopulationen detektiert, identifiziert und erfasst werden. Dieses Verfahren ist durch die Verwendung eines Auswerteverfahrens besonders vorteilhaft, welches innerhalb einer Sondenkombination das spezifische Hybridisierungsmuster einer Einzel-Hybridisierung erkennt und bewertet und dann dieses spezifische Hybridisierungsmuster auch innerhalb von Hybridisierung mit mehreren Keimen (z.B. zwei verschiedene Bakterienspezies) erkennen und somit beide Keime eindeutig identifizieren kann.
[0015] Die vorliegende Erfindung umfasst daher weiters ein Sonden-Panel bestehend aus Speziesspezifischen und multispezifischen Sonden mit dem dazugehörenden Hybridisierungs-muster-Auswertever-fahren zur parallelen Identifikation von mehreren Spezies aus einer Probe (z.B. Nearest centroid Algorithmus).
[0016] Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiters einen Verfahrensschritt umfassen, bei dem prokaryotische DNA (Gram positive und Gram negative sowie intrazelluläre Keime) von eukaryotischer DNA getrennt wird, um dadurch die mikrobielle Ziel-DNA spezifisch in der Probe anzureichern und somit die Sensitivität und Spezifität zu verbessern. Dies gilt insbesondere im Falle von intrazellulären Keimen (z.B. aus klinischen Proben der Humanmedizin, Veterinärmedizin oder auch der Lebensmittelkontrolle).
[0017] Alternativ zur Anwendung der gesamten Sondenkombination für z.B. einen Mikroarray für die Mikroben-Detektion basierend auf spezifischen DNA-Sequenzen in einer beliebigen DNA-Suspension, kann das gesamte Panel aufgeteilt werden und so kleinere Sondenkombinationen generiert werden. Diese enthält die DNA-Sonden, welche spezifisch für bestimmte Spezies einer definierten Anwendung (z.B. Mastitis, Zoonose, Sepsis, intrazelluläre Keime usw.) sind und auf technische Plattformen (z.B. Mikroarray) mit kleineren Sondenkombinationen 2/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 zusammengestellt werden können.
[0018] Erfindungsgemäß können die Sonden über Spacer-Moleküle (Leiter) an dem festen Träger gebunden werden (z.B. mehrere Thymidin-Reste usw.). Alternativ dazu können die Sonden an sich chemisch derart modifiziert werden, dass die Sonden an dem festen Träger zu binden vermögen (z.B. Amino- oder Thiolmodifikationen). Diese Modifikationen können auch an einem Spacer vorgesehen sein.
[0019] Der Ausdruck „Identität", wie hierin verwendet, gibt an, ob zwei (oder mehrere) Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die bis zu einem bestimmten Grad („% Identität") miteinander identisch sind. Dieser Grad kann unter Verwendung bekannter Computer-Algorithmen, wie dem „FAST A"-Programm bestimmt werden, wobei beispielsweise die Standardparameter („default Parameters") wie in Pearson et al. (1988) PNAS USA 85: 2444 verwendet werden (andere Programme inkludieren das GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) Nucleic Acids Res., 12, 387-395), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, Hrg., Academic Press, San Diego, 1994, und Carillo et al, (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Beispielsweise kann das BLAST-Tool der NCBI-Datenbank zur Bestimmung der Identität verwendet werden. Zu anderen im Handel oder öffentlich erhältlichen Programmen zählen das DNAStar "MegA-lign"-Programm (Madison, Wl) und das University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap"-Programm (Madison, Wl)). Die prozentuelle Identität von Nukleinsäure-Molekülen kann weiters beispielsweise durch Vergleich der Sequenz-Information unter Verwendung eines GAP-Computer-Programms bestimmt werden (z.B. Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443, in der Neubearbeitung von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Kurz gesagt definiert das GAP-Programm die Identität als Anzahl der fluchtenden Symbole (d.h., Nukleotide oder auch Aminosäuren), die identisch sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Symbole in der kürzeren der beiden Sequenzen. Die Standard-parameter für das GAP-Programm können inkludieren: (1) eine unäre Vergleichs-Matrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und für Nicht-Identitäten) und die gewichtete Vergleichs-matrix von Gribskov et al., 14:6745, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, S. 353-358 (1979) beschrieben; (2) ein Pönale von 3,0 für jede Lücke und ein zusätzliches 0,10-Pönale für jedes Symbol in jede Lücke; und (3) kein Pönale für End-Lücken.
[0020] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die verwendeten Sonden zu mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, mehr bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere 100 %, Identität mit den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 auf.
[0021] Im Lebensmittel-Bereich können beispielsweise Mikroorganismen in Milch und Milchprodukten bestimmt und identifiziert werden, die einerseits als Indikator für unzureichende Hygiene dienen und andererseits - bei fermentierten Milchprodukten - das Feststellen einer etwaigen Fehlfermentation ermöglichen.
[0022] Bei Milch, beispielsweise, kann qualitativ und semi-quantitativ die Gesamtkeimzahl bestimmt werden.
[0023] Für die Evaluierung der hygienischen Bedingungen während der Milchgewinnung bzw. -Stapelung, sowie der Eignung der Milch für die Weiterverarbeitung zu Milchprodukten bzw. deren Verteilung an weiterverarbeitende Betriebe wird im Rahmen der Qualitätskontrolle eine Bestimmung der Mikroben-Population durchgeführt.
[0024] In gesunder Milch sind Keimzahlen von 104 bis 107 Keimen pro ml zu erwarten. Daher ist eine Beurteilungs-Möglichkeit der Vitalität und Keimart sehr wichtig. Im Rahmen einer Kontrolle des Wirkungsgrades der Pasteurisierung (z.B. anlässlich einer Qualitätskontrolle) kann durch die Anwendung von DNA-Mikroarrays die Zeit der Bestimmung von mehreren Tagen (bei konventionellen Methoden mit Anzucht) auf ca. 5 Stunden, oder je nach eingesetzter Technologie noch weniger, reduziert werden und somit das Rohprodukt in einem frischeren Zustand weiter- 3/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 verarbeitet bzw. ausgeliefert werden.
[0025] Ziel ist die möglichst rasche Identifizierung von Mikroorganismen, das Erkennen eventuell vorhandener pathogener Keime und deren vollständige Ausschaltung bzw. eine Indikation für eine erforderliche Reduktion der Gesamtkeimzahl im Sinne einer Erhöhung der Haltbarkeit bei Kühllagerung.
[0026] In gesunder Milch können unterschiedliche Keimarten Vorkommen (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): [0027] Keimgruppen in Abhängigkeit ihrer Herkunft: [0028] - Euterflora: Micrococcen, Staphylococcen, Lactococcen, Streptococcen, Corynebac-terien [0029] - Luftflora: Enterobacterien, Enterococcen, Micrococcen, Pseudomonaden, Sporenbildner (Clostridien, Bacillen), Hefen, Schimmel, [0030] - Gerätschaftskontamination: aus Milchresten und der Umgebung (s.o.) [0031] Mögliche Belastung der Rohmilch von pathogenen Keimen: [0032] - Mycobacterium tuberculosis, Brucella abortus und Brucella melitensis [0033] - Corynebakterien (Diphtherie); [0034] - Mastitis-Erreger (siehe Mastitis) [0035] - Enteritis-Erreger (siehe Enteritis) [0036] - Listeria monocytogenes [0037] - Mycobacterium avium subsp. paratuberculosi [0038] - Coxiella burnetti [0039] Bei der Herstellung von fermentierten Milchprodukten ermöglicht die optimale Kombination der Mikroorganismen (Starterkulturen) einen optimierten Fermentationsprozess, wobei durch Kenntnis der Stoffwechselprodukte das Endprodukt hinsichtlich Qualität, Sensorik, Beschaffenheit, Geruch und Geschmack beeinflusst werden kann. Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäße Microarray zur Unterstützung der Qualitätskontrolle, wie in Lebensmittel-Produktion üblich, dienen.
[0040] Durch die Anwendung von Hybridisierungs-Technologien kann die Zeit der Identifizierung von Keimen deutlich beschleunigt werden und die Produkte können früher ausgeliefert werden. Die Frische eines Produkts hat einen sehr großen Einfluss auf deren Qualität.
[0041] Unter fermentierten Milchprodukten werden erfindungsgemäß Joghurt, Sauermilch, Sauerrahm, Buttermilch, Kefir, Probiotika, Käse und dergleichen subsummiert.
[0042] Durch die Kontrolle der Mikroorganismen-Zusammensetzung während der Gärung soll eine möglichst rasche Kontrolle des Fermentationsprozesses möglich sein, um Fehlgärungen zu entdecken bzw. zu vermeiden. Das Überwachen der Mikroben-Kulturen soll als Steuerungs-Werkzeug für die eingestellten Fermentationsbedingungen dienen, um einen allfälligen Eingriff in den Stoffwechsel bestimmter Gruppen durch Messergebnisse zu unterstützen. Des Weiteren unterstützt die Mikroben-Populationsbestimmung des fertigen Produktes Datenmanagement, Datensammlung und Produktevaluierung auch im Rahmen eines Qualitätsmanagements. In diesem Zusammenhang entsteht auch die Informationsgewinnung über Produkteigenschaften und Fermentationsverlauf sowie über die Sicherstellung der Erfüllung vorgeschriebener Qualitätskriterien.
[0043] Um eine kontrollierte Fermentation von Milch bzw. vorbearbeiteter Milch zu erlangen werden dem Substrat (Ausgangsprodukt) verschiedene Starterkulturen zugesetzt: Lactococcus (z.B. Lc. lactis, Lc. diacetilactis, Lc. Cremoris); Streptococcus (z.B. Sc. salivarius, Sc. ther- 4/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 mophilus); Leuconostoc (z.B. Ln. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp. cremoris, citreum); Lactobacillus (z.B. Lb. delbrueckii, Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. reuteri, Lb. Kefir); Bifidobacterium (z.B. B. bifidum, B. longum); Hefen (z.B. Saccharomyces, Candida); Propionibacterium freudenreichii.
[0044] Buttereikulturen werden für die biologische Rahmreifung eingesetzt und dienen der Erhaltung eines aromatischen Sauerrahms durch Milchsäure- und Diacetylbildung. Hierbei entsteht die Milchsäure aus der enthaltenen Lactose und das Diacetyl aus Citrat. Die Bebrütung mit Buttereikulturen erfolgt bei tiefen Temperaturen (um die physikalische Reifung nicht zu egalisieren) und längeren Bebrütungszeiten. Herkömmlicher Nachweis der Kulturen erfolgt über Kultivierung.
[0045] Häufig eingesetzte Buttereikulturen sind: Lactococcus lactis, Lc.cremoris, Lc. diacetilac-tis, Leuconostoc mesenteroides, Ln. citrovorum und Lactobacillus helveticus.
[0046] Für die Aufbereitung des Käsesubstrates werden verschiedene Kulturen als Milchsäurebildner, Starterkulturen bzw. Säurewecker eingesetzt. Diese bewirken eine rasche homofermentative Milchsäuregärung (aus Milchzucker), sowie eine schwache Proteolyse (von Casein) im Zuge der Reifung von Käse.
[0047] Ein Monitoring des Fermentationsverlaufs ist für die Qualität des Produkts wichtig. Traditionell eingesetzte Kulturen sind Joghurtkulturen (für Hart- und Schnittkäse), Buttereikulturen (für Schnitt- und Weichkäse) und käsereispezifische Lactobacillen: Lb. casei, Lb. lactis, helveticus. Probiotische Kulturen umfassen Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus und Bifidobakterien. Spezielle Käsereikulturen sind beispielsweise Propionibakterium freudenreichii ssp. Shermanii, etc. Für Schimmelkäse wird häufig Penicillium roqueforti, candidum eingesetzt. Für das Schmieren der Oberfläche dienen Brevibacterium-Iinens, Arthrobacter globiformis, Microbacterium sp., Coryneforme-Bakterien; und Hefen aus der Umgebung, wie Saccharomyces, Debaryomyces, Candida. Die Aromabildung innen wird durch Lactococcen (bei allen gereiften Käsen, eher schwach), Lactobacillus casei (+Subspecies) und Enterococcus faecium (mittelmäßig) bewirkt.
[0048] Probleme bei der Käseherstellung ergeben sich durch Enterococcen (führt zu einer Nachgärung), Clostridium tyrobutyricum (bewirkt Spätblähung) und durch coliforme Keime, oder Lactose-positive Hefen oder heterofermentative Lactobacillen (führen zu Fehlgärungen).
[0049] Auch die mikrobielle Qualität bzw. Belastung von Fleisch und dessen Produkten kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Mikroarrays bestimmt werden.
[0050] Fleisch dient als Ausgangsprodukt für viele weitere Lebensmittelerzeugnisse. Durch seine nährstoffreiche Beschaffenheit und hohen Feuchtegehalt ist jedoch das Fleisch einer hohen Kontaminationsgefahr unterworfen. Auch die Aufarbeitung des Schlachtkörpers bietet eine Reihe von Kontaminationsquellen. Umso wichtiger ist eine durchgehende Kontrolle des Ablaufs auf Vorhandensein von mikrobiellen Keimen, welche die Verwertbarkeit des Fleisches beeinflussen bzw. sogar unmöglich machen würden. Die Einhaltung von strengen Hygienevorschriften bei der Handhabung von Fleisch ist daher von höchster Dringlichkeit. Die Verwendung von molekularbiologischen Methoden zur Detektion von Keimen bietet hier eine schnelle und zuverlässige Alternative zur zeitaufwändigen Kultivierung, um die Frische der Lebensmittel zu garantieren.
[0051] Biologische Indikatoren für den Frischezustand sind die Gesamtkeimzahl und insbesondere E.coli und andere Enterobakterien. Eine Testung auf das Vorhandensein von pathogenen Keimen ist ebenfalls unerlässlich: Salmonellen, Campylobacter, Listerien.
[0052] Ferner lässt sich erfindungsgemäß auch die Mikroorganismenflora im Zuge des mikrobiellen Reifeprozesses von Fleisch und Rohwürste verfolgen (z.B. Salami, Kantwurst, Mettwurst).
[0053] Wie bereits für fermentierte Milch diskutiert, sind diese Punkte auch für fermentierte Fleischprodukte zutreffend.
[0054] Bestimmte Fleischprodukte, aber auch rohes Fleisch werden zur Veränderung des 5/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Geschmacks oder zur Erhöhung der Haltbarkeit einem fermentativen Reifungsprozess unterzogen. Derartige Methoden sind oft auch auf traditionellen Überlieferungen bedingt. Eine Kontrolle der Mikroben-Population ist gerade bei Fleisch äußerst wichtig. Besonders während der ersten Tage der Lagerung ist aufgrund des hohen aw-Wertes die Gefahr des mikrobiellen Verderbs äußerst hoch. Milchsäurebakterien bilden Milchsäure (homofermentativ), führen so zur Senkung des pH-Wertes und hemmen weiters das Wachstum von pathogenen Keimen (insbesondere Salmonellen und Listerien). Micrococcen und Staphylococcen wachsen generell nur schwach. Hefen tragen durch Lipolyse und Proteolyse zur Aromabildung bei und verleihen ein typisches Aussehen. Hefe und Schimmel werden außen aufgetragen. Typische Mikroorganismen, die in Reifungsprozessen von Fleisch Anwendung finden, sind u.a. Milchsäurebakterien, wie Lactobacillus sake, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. farciminis, Lb. alimentarius (L. virides-cens), Lb. carnis, Lb. casei, Lb. bulgaricus; Pediococcus acidilactici, (ehemals cerevisiae), Pediococcus pentosaceus, P. acidilacti; Carnobacterium divergens, Lactococcus sp., Leuco-nostoc mesenteroides, Kokken, wie Staphylococcus xylosus, carnosus, sciuri, simulans, xylo-sus; Micrococcus varians; Streptococcus diacetylactis, Streptococcus lactis, Hefen, wie Deba-ryomyces hansenii, (D. kloeckeri, D. cantarelli, D. pfaffii), Candida utilis, Streptomyces griseus, Schimmelpilze, wie Aspergillus sp. (z.B. fumigatus) und Pseudonomaden, wie Pseudomonas fragi, P. fluorescens; P. putida, P. Mephitica.
[0055] Grün-Schimmer von fermentiertem Fleisch unter aeroben Bedingungen (bei hohem pH-Wert) wird oft verursacht von folgenden Keimen: Hafnia alvei, Serratia liquefaciens, Alteromo-nas putrefaciens, Aeromonas hydrophilia.
[0056] Bei der Entstehung von Schwefel-Verbindungen und Alkyl-Estern, die zu geschmacklicher Ungenießbarkeit unter aeroben Bedingungen bei Lagerung bei tiefen Temperaturen führen, sind insbesondere Mikroorganismen Hafnia alvei, Enterobacter agglomerans, Serratia liquefaciens, Alteromonas putrefaciens und Aeromonas hydrophilia beteiligt.
[0057] Bei Vakuum-verpackten Lebensmitteln, insbesondere Fleischprodukte, können folgende Mikroorganismen zu Verderb führen: Leuconostoc mesenteroides, Brochothrix thermosphacta. Keimzahlen bis 108 pro cm2 können dabei vorgefunden werden, wobei auch Clostridium sp. eine Rolle spielen kann.
[0058] Bei der Sterilisation von Fleischkonserven liegt das Hauptaugenmerk bei Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus.
[0059] Bei Fisch und Fischprodukten sind generell ähnliche Faktoren wie bei Fleisch relevant.
[0060] Der Frischezustand des Fisches lässt sich anhand der Gesamtkeimzahl, Enterobakte-rien, psychrotoleranter Keime, etc. bestimmen. Häufig auftretende pathogene Keime in Fisch sind Salmonellen.
[0061] Neben tierischen Lebensmitteln ist die Keimbelastung auch bei pflanzlichen Produkten zu beachten (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): [0062] - Sauerteig: enthält Lactobacillen, Saccharomyceten [0063] - Bier und Wein: Saccharomyceten, Leuconostoc, und andere Sauerkraut (& saure Gemüsesäfte): [0064] - Milchsäurebakterien Essig: Gluconobacter [0065] - Kakaobohnen: Milchsäurebakterien, Hefen, Gluconobacter, wobei die Milchsäurebakterien insbesondere Lactobacillus sake, curvatus, plantarum, brevis; Pediococcus acidilactici, (Pediococcus cerevisiae), Pediococcus sp., Lactococcus sp., Leuconostoc sp., sind.
[0066] Nicht nur bei der Herstellung von Lebensmitteln spielen Mikroorganismen eine wichtige Rolle, auch beim Lebensmittelverderb ist es von Vorteil, die am Verderb beteiligten Mikroorganismen zu bestimmen. 6/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [0067] Die Folgen des Lebensmittelverderbs sind unerwünschte aerobe und anaerobe stoffliche Umsetzungen und damit verbundene sensorische Veränderungen im Sinne der Nichterfüllung der berechtigten Verbrauchererwartung bzw. des Lebensmittelsverderbs. Die charakteristische Verderbsflora ist insbesondere abhängig vom Lebensmitteltyp (Inhaltsstoffe, pH-Wert, aw-Wert), der Umgebungstemperatur und der Gegenwart/Abwesenheit von Luft. Eine exakte Bestimmung der dominanten Keimflora eines bestimmten Produktes oder einer Produktgruppe ist für die Bestimmung und Risikoanalyse eines allenfalls gegebenen Lebensmittelverderbs sehr wichtig (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): Brot, Gebäck, Getreide: Schimmelpilze [0068] Obst: Schimmelpilze, Hefen [0069] Fleisch, Ei, Fisch: Pseudomonaden, Enterobakterien, [0070] Micrococcen, Brochothrix [0071] Milch: Milchsäurebakterien, Enterobakterien, Pseudomonaden, Enterococcen, Bacillen [0072] Käse: Coliforme Keime, Clostridien [0073] Fetthaltige Speisen: Schimmelpilze, Corynebakterien [0074] Für die Gärung bei Lebensmitteln sind insbesondere die folgenden Mikroorganismen verantwortlich: [0075] Alkohol: Hefen, Zymomonas [0076] Milchsäure: Milchsäure-Bakterien, Bifidobakterien, [0077] Probionsäure: Propionibakterien [0078] Buttersäure: Clostridien Ameisensäure: Enterobakterien [0079] Der Protein- und Fettabbau in Lebensmitteln erfolgt mit Proteolyten, die von Pseudomonaden, Enterococcen, Brevibakterien stammen können, bzw. von Lipolyten, die von Pseudomonaden, Corynebakterien, Schimmelpilz stammen können.
[0080] Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäße Microarray kann auch dazu verwendet werden, Lebensmittelinfektionen (Lebensmittelvergiftungen) festzustellen. Infektionsquellen für Lebensmittelinfektionen sind kranke Tiere, davon stammende Lebensmittel und kranke Menschen (Kontaktkontamination, Ausscheidung).
[0081] Für eine Infektion sind relativ wenig Keime notwendig, das Lebensmittel dient hierbei oft als Transportmittel und weniger als Substrat.
[0082] Krankheitsformen und Erreger (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): [0083] Enteritis: Salmonella enteritidis (mit versch. Serotypen) Enteropathogene E. coli [0084] Vibrionen: Vibrio parahaemolyticus, cholerae, Yersinia enterocolitica Campylobacter jejuni Aeromonas hydrophilia [0085] Encephalitis: Listeria monocytogenes [0086] Ulcus: Helicobacter pylori [0087] Tuberkulose: Mycobacterium tuberculosis [0088] Brucellose: Brucella abortus Diphtherie: Corynebacterium diphtheriae [0089] Typhus: Salmonella typhi [0090] Ruhr: Shigella dysenteriae 7/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 [0091] Cholera: Vibrio cholerae [0092] Andere Mikroorganismen, die bei Lebensmittelinfektion eine Rolle spielen, sind (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): pathogene Enterobakterien, Listerien, Staphylococcen, Shigellen, Aeromonas hydro-philia, Clostridium difficile, Mycobacterium bovis, Coxiella burnetti, Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Salmonella Paratyphi, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Plesiomonas shigelloides, Francisella tularensis, Bacillus cereus; Campylobacter coli, Campy-lobacter laridis, Arcobacter cryaerophilus, A. butzleri, enterovirulente E. coli, Shigella dysente-riae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei, Yersinia enterocolitica, (Y. pseudotuberculosis), Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, Enterobacter sakazakii, Legionella pneumophila, Mycobacterium avium ssp paratuberculosis, Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, Francisella tularensis, Coxiella burnetti, Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii.
[0093] Ein Charakteristikum von Lebensmittelintoxikationen ist die hohe Keimzahl der genannten Bakterienarten bzw. der toxigenen Stämme, die benötigt wird, genügend große Mengen an Toxin herzustellen (gilt auch für das Mycelwachstum von Schimmelpilzen). In diesem Fall dienen die Lebensmittel als gutes Anreicherungsmedium. Besonders wichtig ist, dass Negativbefunde bezüglich Toxinbildner nichts über eventuell schon vorher erfolgte Keimbelastungen plus Toxinanreicherungen aussagen (Notwendigkeit der Kultivierung, dies ist bei vorhergehender Inaktivierung nicht mehr möglich => die Toxine bleiben jedoch aktiv).
[0094] Bekannte Krankheitsformen und Erreger, auf denen Lebensmittelintoxikationen beruhen, sind: [0095] Botulismus: Clostridium botulinum [0096] Diarrhoe/Vomitus: Staph. aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens [0097] Unspez. LM-Vergift.: Pseudomonaden, Enterococcen [0098] Weitere Mikroorganismen, die zu Lebensmittelintoxikationen führen sind: Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophilia, E. coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica.
[0099] Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch - durch eine geeignete Auswahl an einem festen Träger gebundenen Nukleinsäuren - sowohl erwünschte als auch unerwünschte Mikroorganismen gleichzeitig zu bestimmen. Einsatzgebiet eines derartigen Mikroarrays ist beispielsweise die Identifizierung von bei der Fermentation erwünschten Mikroben, kombiniert mit Lebensmittel-Verderb-Mikroben für das Monitoring des Wachstums von Lebensmittel-Keimen.
[00100] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch Septikämie oder Sepsis und Blutvergiftung durch Bakterien oder Pilze, die sich im Blut vermehren, nachgewiesen werden bzw. können genau die dafür verantwortlichen Keime indentifiziert werden, wodurch die Theraphie effektiver gestaltet werden kann.
[00101] Die Erreger können aus einer infizierten Körperstelle, durch eine Verletzung oder bei einem chirurgischen Eingriff in den Kreislauf gelangen. Typische Kennzeichen der Septikämie sind Schüttelfrost, Fieber, Erschöpfung, Thrombosen und Infektionen innerer Organe. Befinden sich die Bakterien nur kurze Zeit im Blut, spricht man von Bakteriämie; eine durch Bakterien verursachte Septikämie wird mit Antibiotika behandelt. Im Verlauf einer Septikämie kann als Komplikation ein lebensbedrohlicher septischer Schock auftreten, der durch Blutdruckabfall und Erhöhung der Herzfrequenz gekennzeichnet ist und dem durch Verabreichung von Hydrocortison begegnet werden kann.
[00102] Blutvergiftung ist die häufigste Todesursache nach schweren Unfällen, Operationen und manchen Krebstherapien. Nach Angaben von 2001 sterben allein in den USA jährlich 225 000 Menschen an Septikämie. 8/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [00103] Herkömmliche Detektionsverfahren der Sepsis basieren auf der Kultivierung des Erregers und dauern 2 bis 4 Tage. Andere molekularbiologische Methoden können nur eine stark begrenzte Anzahl von Erregern nachweisen (z.B. FISH oder real-time PCR). Im Vergleich dazu ist es mit einem Mikroarray und der benötigten Sondenkombination möglich die Anzahl der detektierbaren Erreger beliebig zu erweitern. Andere Mikroarray-Anwendungen können nur eine Spezies automatisiert detektieren und identifizieren. Mit der hier vorgestellten Auswertungsmethode ist jedoch eine eindeutige Identifizierung von auch 2 Pathogenen möglich (10 % aller Sepsis-Fälle).
[00104] Die mit dieser Sondenkombination detektierbaren typischen Erreger der Blutvergiftung sind (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): Staphylococcus aureus, St. epidermidis, Enterococcus faecalis, E. faecium, Vertreter der Farn. Enterobacteriaceae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, C. parapsilo-sis, C. glabrata, Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. suis.
[00105] Lungenentzündung ist eine Sammelbezeichnung für etwa 50 Lungenkrankheiten, bei denen ein zäher Auswurf abgesondert wird. Lungenentzündung kann von Bakterien, Viren, Rickettsien, Mycoplasmen, Pilzen oder Protozoen hervorgerufen werden.
[00106] Bevor es Antibiotika gab, war die Lobärpneumonie, eine akute Infektion, die häufigste Todesursache bei Erwachsenen. Der Erreger ist Streptococcus pneumoniae. Lobärpneumonie tritt häufig im Winter auf, insbesondere nach einer Virusinfektion der oberen Atemwege. Zu den Symptomen gehören ein einmaliger, starker Schüttelfrost, gefolgt von Fieber bis zu 40° C, Brustschmerzen beim Atmen, Husten und blutiger Auswurf. Die Erreger befallen in der Regel einen ganzen Lungenlappen oder Teile davon. Bei der beidseitigen Pneumonie sind beide Lungenflügel betroffen.
[00107] Die wichtigste andere Form der bakteriellen Lungenentzündung ist die Bronchopneumonie, die im Gegensatz zur Lobärpneumonie die Lungenbereiche in der Nähe der Bronchiolen in Mitleidenschaft zieht. Die Erreger sind manchmal ebenfalls Pneumokokken, aber die Krankheit kann auch von Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae sowie verschiedenen Staphylokokken und Streptokokken hervorgerufen werden. Die Bronchopneumonie bricht weniger plötzlich aus als die Lobärpneumonie, und das Fieber steigt nicht so hoch. Eine weitere Form der bakteriellen Lungenentzündung entdeckte man 1976: Diese Krankheit, die von Legio-nella Pneumophilia hervorgerufen wird, nennt man Legionärskrankheit. Die meisten Formen der bakteriellen Lungenentzündung sind mit Antibiotika gut zu behandeln.
[00108] Eine häufige Form der Lungenentzündung, die man früher primäre atypische Pneumonie nannte, wird von Mycoplasma pneumoniae hervorgerufen, einem winzigen Prokaryonten. In epidemischer Form tritt eine Mycoplasmenpneumonie gelegentlich in Schulen und Kasernen auf.
[00109] Die mit dieser Sondenkombination detektierbaren typischen Erreger der Lungenentzü-dung sind: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Legio-nella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Vertreter der Enterobacter iaceae, Pseudomonas aeruginosa, Candida sp.
[00110] Harnwegsinfektionen sind entzündliche Erkrankungen der harnableitenden Wege, des Hohlsystems, das von den Nierenkelchen, den Nierenbecken (obere Harnwege) über den Harnleiter und die Harnblase zur Harnröhre reicht (untere Harnwege). Symptome sind schmerzhaftes Wasserlassen, unter Umständen Schmerzen in der Nierengegend, Fieber, Krankheitsgefühl. Über 80 Prozent der Harnwegsinfektionen werden vom Darmbakterium Escherichia coli und anderen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae verursacht. Der Nachweis des massenhaften Auftretens von Bakterien im Urin sichert die Diagnose.
[00111] Am häufigsten von Infekten der Harnwege betroffen sind Frauen, weil deren Harnröhre im Vergleich zur männlichen Harnröhre viel kürzer ist. Bei unkomplizierter Harnröhren- oder 9/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Blasenentzündung wird eine Einmal- oder Kurzzeittherapie mit einem harnwegspezifischen Antibiotikum und gute Spülung durch Vieltrinken angeordnet. Eine Langzeittherapie kann erforderlich sein.
[00112] Intrazelluläre Keime können die Ursache von vielen verschiedenen Infektionskrankheiten sein. Wie bereits erwähnt können Spezies der Gattung Mycoplasma die atypische Lungenentzündung verursachen. Wieder andere intrazelluläre Erreger sind verantwortlich für schwerwiegende Infektionen des Urogenitaltraktes sowie an Schleimhäuten. Des Weiteren können durch parasitierende Insekten (z.B. Zecken) verschiedene Spezies von intrazellulären Erregern übertragen werden, welche im menschlichen (und auch tierischen) Organismen zu Entzündungsreaktionen führen können (z.B. Borreliose verursacht durch den Erreger Borrelia burgdorferi) [00113] Bezüglich des Nachweises von Eutererkrankungen, insbesondere von Mastitis, sind in der Literatur nur Verfahren beschrieben, die einerseits auf PCR basieren und andererseits das Anzüchten der für Mastitis charakteristischen Mikroorganismen. Diese Verfahren sind jedoch aufgrund der relativ langen Verfahrensdauer nicht geeignet um routinemäßig eingesetzt zu werden. Es ist entscheidend für eine effiziente Therapie, die für die Mastitis verantwortlichen Organismen rasch zu bestimmen.
[00114] Mastits ist die bedeutendste Rinderkrankheit mit einem Verbreitungsgrad von 20 % der Kühe pro Jahr. Für die Landwirtschaft entstehen dadurch hohe Kosten in Form von Milchgeldverlust, Behandlungskosten und verringerte Nutzungsdauer der Kühe. Für den Konsumenten entsteht ein erhöhtes Risiko im Falle einer Rohmilchkonsumation. Des Weiteren ändert sich der Nährwert der Milch durch eine Änderung der Milchzusammensetzung. Für die milchverarbeitende Industrie entsteht ein hoher Schaden bei der Käseproduktion (infolge Milchqualitätseinbußen: Casein- und Calciumabnahme, pH-Anstieg), Sauermilchprodukten (infolge allfälliger Antibiotika-Rückstände) und der Trinkmilch (durch Zunahme thermolabiler Molkeneiweiße).
[00115] Die konventionelle Mastitisindikation beruht auf der Bestimmung der somatischen Zellen (Leukozyten und Epithelzellen) (die so genannte „Zellzahl") durch direkte mikroskopische Zählung, Elektronische Zählverfahren und Zellmassenermittlung. Bis 10.000 bis 100.000 Zellen entspricht es dem Normbereich. 100.000 bis 500.000 kann beim Einzeltier noch im Normalbereich liegen. Über 500.000 Zellen pro ml besteht Mastitis-Gefahr und ab 1 Million Zellen pro ml liegt Mastitis vor.
[00116] Eine weitere Möglichkeit ist die kombinierte Kontrolle von Zellzahl und Bakteriologie, hierbei wird jedoch nur auf die Präsenz vom hämolytischen Keimen getestet. Eine erste Beurteilung auf Vorliegen einer Mastitis wird direkt am Produktionsbetrieb mittels des Laugentests oder Schalmtests durchgeführt. Für eine schnelle und erfolgreiche Behandlung ist jedoch die Bestimmung der Art des Erregers unerlässlich. Die Unkenntnis des Erregertyps wird als Hauptgrund für das Nichtgelingen der Tilgung von Mastitis angegeben. Hinzu kommt die Problematik der Probensammlung und Versand. Die Bestimmung von hartnäckigen Fällen der Mastits wird in zentralen Labors durchgeführt, wodurch der Versand bereits bis zu einem Tag dauert und dadurch der Großteil der Erreger ihre Viabilität verlieren und konventionelle Bestimmungsmethoden mittels Kultivierung nicht mehr anwendbar sind. Demgegenüber können molekularbiologische Verfahren auch an nicht mehr teilungsfähige Keime exakte Bestimmungen liefern.
ERREGER
[00117] - Staphylococcus aureus, St. xylosus, St. intermedius, St. hyicus, St. epidermidis [00118] - Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis [00119] - Coliforme: E.coli, Klebsiella pneumoniae, K. ozeane, K. oxytoca, Enterobacter clo-acae, E. aerogenes, E. ag-glomerans, E. sakazakii, Citrobacter freundii, C. di-versus, C. amalo-naticus; [00120] - Arcanobacterium pyogenes (früher: Actinomyces pyogenes) 10/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [00121] - Mycoplasma bovis, M. colifornicum, M. bovigenitalicum, (selten: M. canadese, M. alkalescens) [00122] - Nocardia asteroides [00123] - Pseudomonas aeruginosa [00124] - Corynebacterium pyogenes, C. bovis [00125] - Sporenbildner: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, [00126] - Hefen: Candida sp., Rodotorula sp.
[00127] - Pilze: Aspergillus fumigatus, [00128] - Algen: Prototheca zopfii [00129] Mikroarrays mit speziellen, kleineren Sondenkombinationen für die einzelnen Mikroorganismen der folgenden Erkrankungen: [00130] - Arthritis: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Vertreter der Enterobacte-riaceae, Pseudomonas sp.
[00131] - Pneumonie: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Vertreter der Ente-robacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Candida sp.
[00132] - Blutvergiftung: Staphylococcus aureus, St. epidermidis, En-terococcus faecalis, E. faecium, Vertreter der Farn. Entero-jbacteriaceae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. suis, [00133] - Enteritis: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus, E. coli, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Clostridium dif-ficile, Shigella sp., Salmonella enterica, Vibrio cholereae; [00134] - Endokarditis: Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Enterobacteriaceae, [00135] - Tuberkulose: Erreger ist Mycobacterium tuberculosis; Nachweis aus der Milch möglich; hohes Erkrankungsrisiko bei Rohmilchkonsum [00136] - Brucelose: Erreger: Brucella abortus (bei Rind), Brucella melitensis (bei Ziegen und Schafen); Nachweis des Keimes in Milch durch kulturelle Methoden (jedoch schwierig); Ansteckungsrisiko bei Rochmilchkonsum sehr hoch.
[00137] - Darminfektion (Enteritis) (unterschiedlicher Genese): Erreger: Salmonella enteri-ca/enteritidis (diverse Serotypen), Enteropathogene E.coli, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica; [00138] Enteritis hat ein breites Infektionsspektrum und ist in gleicher Weise für den Menschen problematisch. Nachweis der Keime in Milch mit kulturellen Methoden möglich (jedoch sehr zeit-und materialaufwändig) und direkte mikroskopische Identifizierung. Bei der Bestimmung von Mikroorganismen bei speziellen Fermentationen sind insbesondere folgende Mikroorganismen zu bestimmen (Vorsehen der entsprechenden Sonden auf einem festen Träger, z.B. Microar-ray).
MILCHSÄURE-GÄRUNG
[00139] - Species sind Vertreter der folgenden Gattungen: Lactococcen, Enterococcen, Streptococcen, Lactobacillen, Leuconostoc;
[00140] - Propionsäure-Gärung: z.B. Propionibacterium freudenreichii, AMEISENSÄURE-GÄRUNG 11 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 [00141] Durch Vertreter der Familie Enterobacteriaceae: z.B.: E. coli, Enterobacter aerogenes, Eb. cloacae, Klebsiella pneumoniae; [00142] Buttersäure-Gärung: Vertreter der Gattung Clostridium [00143] Erfindungsgemäß wird unter „Isolieren von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren" nicht nur das direkte Isolieren der Nukleinsäure aus einer Probe verstanden (z.B. durch Extraktionsverfahren, wie das Phenolverfahren, oder durch Säulen) bei dem u.a. die Probe, insbesondere die zu detektierenden Mikroorganismen, aufgeschlossen werden, sondern auch das Gewinnen der Mikroorganismen aus einer Probe (z.B. durch Zentrifugation) und anschließendem Aufschließen der Mikroorganismen im Zuge einer Amplifikationsrekation (z.B. durch PCR (Hitze führt zur Lyse der Mikroorganismen)).
[00144] Erfindungsgemäß kann die Probe eine Lebensmittel- oder humane oder veterinärmedizinische Probe sein. Selbstverständlich ist es auch möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Fermentationslösungen zu untersuchen. Unter „Fermentationslösung" wird erfindungsgemäß eine im Zuge einer Fermentation gewinnbare Lösung verstanden (z.B. umfassend Nährmedium).
[00145] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lebensmitteln Milch, Milchprodukten, insbesondere Butter, Rahm oder fermentierten Milchprodukten, Fleisch, Fleischprodukten, insbesondere Rohwürsten, Fisch, Fischprodukten, Meeresfrüchten, insbesondere Muscheln, und pflanzlichen Lebensmittel, insbesondere Essig und Bier.
[00146] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das milchgebende Säugetier ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel, Pferd und Kamel.
[00147] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das humanmedizinische Produkt anzuwenden für Pathogenidentifizierung bei Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutvergiftung, Lungenentzündung, Harnwegsinfektionen, Meningitis, Peritonitis und Identifizierungen von anderen Abstrichen und Körperflüssigkeiten, wie Liquor und Sputum.
[00148] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das veterinärmedizinische Produkt anzuwenden für Pathogenidentifizierung bei Tierkrankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Euterentzündung, Blutvergiftung, Lungenentzündung, Harnwegsinfektionen, Meningitis und Identifizierungen von anderen Körperflüssigkeiten, wie Liquor.
[00149] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Sonde eine RNA- und/oder DNA-Sonde, insbesondere eine DNA-Sonde.
[00150] Um die Menge der zu detektierenden Nukleinsäuren in der Probe zu erhöhen, wird vorzugsweise nach Schritt b) eine Amplifikation des 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gens der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik umfasst.
[00151] Die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens weisen vorzugsweise die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 auf.
[00152] Detektionsverfahren zur Feststellung der Bindung von DNA an immobilisierte Sonden (insbesondere in der Microarray-Technologie) benötigen in den meisten Fällen Farbstoffmarkierte Moleküle. Daher ist die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzfarbstoff. Des Weiteren können auch Methoden ohne vorhergehende Markierung des DNA Stranges angewandt werden. Dazu zählt der Einsatz von elektronischen Sonden zur Messung von Hybridisierungs-Ereignissen z.B. basierend auf Impendanz-, Resonanz- oder Potentialänderung (Albers J et al., Anal.Bioanal.Chem. (2003) 377:521-527). 12/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [00153] Die Anzahl der am festen Träger immobilisierten Sonden hängt davon ab, welche Mikroorganismen in einer Probe bestimmt werden sollen. Die isolierte Nukleinsäure wird vorzugsweise mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831.
[00154] Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: [00155] a) Bereitstellen einer Probe, [00156] b) Isolierung von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren, [00157] c) Inkontaktbringen der isolierten Nukleinsäuren mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der Nukleinsäure des mindestens einen zu identifizierenden Mikroorganismus bindet, wobei der mindestens eine Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes defragrans, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Arcanobacterium pyogenes, Arcobacter butzerli, Arcobacter cryoaerophilus, Arthrobacter globiformis, Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Brevibacterium casei, Brevi-bacterium epidermidis, Brevibacterium linens, Brochothrix thermosphacta, Brucella abortus, Brucella melitensis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candida, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida sake, Candida tropicalis, Candida utilis, Carnobacterium divergens, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium bovis, Corynebacterium casei, Cory-nebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, Cryptococcus, Debaryomyces hansenii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Entero-coccus, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faeci-um, Enterococcus saccharolyticus, Escherichia coli, Flavobacterium, Francisella tularensis, Gluconobacter, Gluconobacter asaii, Gluconobacter oxydans, Hafnia alvei, Helicobacter pylori, Klebsialla pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bifermentas, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus plantarium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus cremoris, Lacto-coccus diacetilactis, Lactococcus lactis, Lactococcus luteus, Legionella pneumophilia, Leuco-nostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Microbacterium lacticum, Microbacterium schleiferi, Micrococcus lylae, Micrococcus tyrobutyricum, Micrococcus varians, Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma bovialkalescens, Mycoplasma bo-vigenitalium, Mycoplasma bovis, Mycoplasma californicum, Mycoplasma canadense, Nocardia asteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Plesiomonas shigelloides, Propionibacterium freudenreichii, Prototheca zopfii, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mephitica, Pseudomonas putida, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Shewanella putrefaciens, Shigella, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Sporolactobacillus inulins, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis, Streptomyces griseus, Torulaspora, Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Zy-momonas mobilis und die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, [00158] d) Nachweisen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Son- 13/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 de und [00159] e) Identifizieren eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle A angeführten Mikroorganismen, mit der isolierten Sonde.
[00160] Erfindungsgemäß können mit diesem Verfahren mindestens 1,10, 20, 30, 50, 70, 80 oder 100 Organismen detektiert werden.
[00161] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 835.
[00162] Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise als Sonden bei der Detektion von DNA auf einem festen Träger immobilisiert verwendet werden. Dieser feste Träger kann in Form eines Platte, eines Beads oder einer Matrix vorliegen. Ferner eignen sich diese Sonden aufgrund von deren Spezifität als Sonden in PCR-Techniken, wie Echtzeit-PCR („Real time PCR"). Dabei können sie als Hybridisierungs-Sonden, TaqMan-Sonden (auch Hydrolyse-Sonden), Molecular Beacons und Scorpion-Primer eingesetzt werden. Es sei hierbei anzumerken, dass anstelle des Nukleotids U auch das Nukleotid T eingesetzt werden kann.
Tabelle A:
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3·) SEQ ID Nr. E. coli Aeromonas hy-drophilia ahy 118 AAUGCCUGGGAAÄUUGCCCAGUCGAG 1 118 ahy 129 AAUUGCCCAGUCGAGGGGGAUAACAGU 2 129 ahy 210 GGGCCUUGCGCGAUUGGAUAUGCCCA 3 210 ahy 216 UGCGCGAUUGGAUAUGCCCAGGUGGG 4 216 Alcaligenes defragrans ade 76 GAAGAGCUUGCUCUUUGGUGGCGAG 5 76 ade 450 AAACGGCGCGGGCUAAUAACCUGUG 6 450 ade 832 UUGGGGUUUAUUAACCUUAGUAGCGC 7 832 ade 1239 UGGUCGGGACAGAGGGUÖGCCAAGCCG 8 1239 Alcaligenes faecalis afe 476 UGCUGACGGÜAUCUGCAGAAUAAG 9 476 afe 636 UUUUAACUGCCGAGCUAGAGUAUGUCA 10 636 afe 739 UGGGAUAAÜACUGACGCUCAGACAC 11 739 afe 818 AUGUCAACÜAGCUGUUGGGGCCGUUA 12 818 Alcaligenes latus ala 64 AACGGUAACGGGCCUUCGGGUGCCG 13 64 ala 119 ACGCAUCGGAACGUGCCCAGUGGUGG 14 119 ala 429 AAACCGCUUUUUGUCAAGGGAAGGA 15 429 ala 823 AACUGGUUGUUGGGUGGGUUUCUAC 16 823 Arcanobacteri-um pyogenes apy 174 CCGGAUAUUCUGCUUUÜGCCGCAUG 17 174 14/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli apy 440 AGUÄCAGAAGAAGCAUÜUUUGUGAC 18 440 apy 997 ACACUGCGAUGÜGCCAGAGAUGGUGCA 19 997 apy 1128 CAGCAUGÜUGUGGUGGGGACÜCACGG 20 1128 Arcobacter butzerli abu 730 GCGAUCUACUGGAACAAUAUUGACGCU 21 730 abu 991 UGACAUAGUAAGAAUGAUUUÄGAGAUA 22 991 abu 1021 UAGÖGUCUGCÜUGCAGAÄACUUGCAU 23 1021 Arcobacter cryoaerophilus acr 184 ACAGAAGUUAAUAAGGGAAAGAUUUAU 24 184 acr 836 GAGACUUGAUCUUGCAGUAAUGCAGU 25 836 acr 1149 UAAACAGACUGCCUACGCAAGUAGGAGG 26 1149 Arthrobacter globiformis agl 58 AAGUCGAACGAUGAOCCGGDGCUOGC 27 58 agl 993 ACAUGGACCGGACCGCCGCAGAAAUGUG 28 993 agl 1013 AAAUGUGGUÜÜCUCCUUÜÜGGGGCCG 29 1013 Aspergillus fumigatus afu 830 GAUCGGGCGGUGUUUCUAÜGAUGA 30 830 afu 1420 GAAUGGCUCGGUGAGGCCUUCGG 31 1420 afu 1447 AGGGGAGUUGGCAACGACUCCC 32 1447 afu 1450 CAACGACUCCCCAGAGCCGG 33 1450 Bacillus ce-reus bce 58 AAGUCGAGCGAAUGGAUUAAGAGC 34 58 bce 69 UGGAUDAAGAGCUUGCUCUUAUGAA 35 69 bce 82 CUUGCUCUUAUGAAGUUAGCGGCGGA 36 82 bce 170 AAUACCGGAöAACAUUUUGAAC 37 170 bce 982 ACCAGGUCUÜGACAUCCUCUGAÄAAC 38 982 bce 1015 AUAGGGCUÜCUCCUUCGGGAGCAGAG 39 1015 Bacillus stearothermo- philus bst 129 ACCÜGCCCGCAAGACCGGGAUAACUCC 40 129 bst 174 CCGGAUAACACCGAAGACCGCAUGGU 41 174 bst 820 GAGÜGCUAAGUGUUAGAGGGGUCACAC 42 820 bst 999 CCUGACAACCCAAGAGAUUGGGCGUU 43 999 Bacillus sub-tilis bsu 68 GACAGAUGGGAGCÜUGCUCCCU 44 68 bsu 86 CUCCCUGAUGUUAGCGGCGGACGGG 45 86 bsu 180 GGUUGUUUGAACCGCAUGGUUCAAAC 46 180 bsu 192 UUCAAACAUAAAAGGUGGCUUCGG 47 192 15/218 österreichisches Patentamt AT 505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3’) SEQ ID Nr. E. coli bsu 207 UUCGGCUACCACUUACAGAUGGACC 48 207 bsu 1267 GAGGUÖÄAGCCAAUCCCACAAAÜCÜ 49 1267 Bifidobacteri-um bifidum bbi 68 GAÜCCAUCAAGCOUGCÜUGGUGGUGA 50 68 bbi 183 AUCGCAUGÖGAUUGUGGGAAAGAUÜC 51 183 bbi 820 GGACGCUGGAÜGÜGGGGCACGUUCCA 52 820 bbi 833 GGGGCACGUUCCACGUGUUCCGÜGÜ 53 833 bbi 992 GACAUGUUCCCGACGACGCCAGAGA 54 992 bbi 1317 AACCCGGCUCCGUGAAGGCGGAGUC 55 1317 Bifidobacteri-um longum blo 183 CCAGÜÜGAOCGCAÜGGÜCOÜCOGGGA 56 183 blo 193 CUGGGAAAGCUÜUCGCGGUAÜGGGAUGG 57 193 blo 267 CCACCGUGGCUUCGACGGGÜAGCCGGC 58 267 blo 1246 UACAACGGGAUGCGACGCGGCGACGCG 59 1246 blo 1259 GACGCGGCGACGCGGAGCGGAUCCC 60 1259 Brevibacterium casei bca 833 GGGGGGCAUU CCACGOUCUCCGCGC 61 833 bca 1010 ÜGGAAACAGGUCCUCUUCUÜUGAAG 62 1010 bca 1249 AGAGAGAGGCGAACCCGUGAGGGCAA 63 1249 Brevibacterium epidermidis bep 72 AAGCCGACAGCOüGCOGOUGGOGGA 64 72 bep 135 CCCU GAUUUCGGGAUAAGCCUGGGA 65 135 bep 997 ACACUGGACCGOOCOGGAAACAGUUCUO 66 997 bep 1249 AGAGAGAGGCGAACCCGÖGAGGGOAA 67 1249 Brevibacterium linens bli 384 CCUGAOGCAGCGACGCAGCGUGCGGG 68 384 bli 629 CGUGCAGOGGGOACGGGCUGACÜAGA 69 629 bli 723 GGCGAAGGCGGGACUCUGGGCüGUAA 70 723 bli 1201 UCAUGCCCUUUAUGUCUUGGGCUUCA 71 1201 bli 1306 UCGÜAGUCUGCAAUUCGACUACGUG 72 1306 Brochothrix thermosphacta bth 88 CUUOÜGAAGUUAGUGGCGGACGGGUGA 73 88 bth 183 UCAOAAGAUGUUCAAGU GAAAGACGGU 74 183 bth 451 ACAOGGGUGAGAGUAACUGUUCACC 75 451 bth 987 GOCOUGACAUCCUUUGACCAUUCUGGAG 76 987 bth 1270 GOGGAGCCAAUCCCAUAAÄAUUAUUCU- CA 77 1270 bth 1438 GÖUUGGUAACCUUCGGGAGCUAGCCGÜ 78 1438 16/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli Brucella abor-tus bab 126 GGAACGUACCAUUUGCUACGGAAUA 79 126 bab 644 GGAAGUCUUGAGUAUGGUAGAGGÜG 80 644 bab 824 GUUAGCCGUCGGGGUGUUUACACUUCG 81 824 bab 831 GUCGGGGUGUUUACACUUCGGUGGC 82 831 bab 837 GU GUUUACACUUCGGUGGCGCAGCU 83 837 bab 994 CAUCCCGGUCGCGGUUAGUGGAGACA 84 994 bab 1007 UUAGOGGAGACACUAUCCUUCAGUUAG 85 1007 Brucella meli-tensis bme 128 AACGUACCAÜUUGCÜACGGAAUAACU 86 128 bme 824 GÜOAGCCGUCGGGGÜGUUUACACUOC 87 824 bme 835 GGGÜGOUUACACUOCGGUGGCGCAG 88 835 bme 995 AUCCCGGUCGCGGUUAGUGGAGACACU 89 995 bme 1007 UUAGUGGAGACACOADCCÜUCAGÜÜAG 90 1007 Campylobacter coli cco 183 UAACACAAGUUGAGUAGGGAAAGU 91 183 cco 599 UUUUGUGAAAUCUAAUGGCUUAACCAUU 92 599 cco 828 GUUGUUGCUCUGCUAGUCAGGGC 93 828 cco 1007 UUUUAGAGAUAAGAGGGÜGCOAGCUU 94 1007 Campylobacter jejuni cje 168 CUAAUACUCUÄUACÜCCÜGCÜÜAACA 95 168 cje 183 CUUAACACAAGUUGAGUAGGGAAAGU 96 183 cje 437 UUUCUÜAGGGÄAGÄAUÜCUGACG 97 437 cje 609 CUAAUGGCUUÄACCAUUAAAC 98 609 cje 984 CUGGGCUUGAUAUCCUAAGAACCUUAU 99 984 cje 1007 UUAUAGAGAUAUGAGGGUGCÜAGCUU 100 1007 cje 1114 ACGUAÜUUAGUUGCUAACGGUUCGG 101 1114 Campylobacter lari cla 643 UGGUAAÜCUAGAGUGGGGGAGAGGCA 102 643 cla 1117 UAUÜÜAGUÜGCUÄACACUÜCGGGUGAG- CA 103 1117 Candida can 174 CAUGCÜUAAAAUCCCGACUGUÜUGGA 104 174 can 830 GAUCGGUUGUUGUUCUUUUAÜUGACGC 105 830 can 840 UCUÜOÜAÜUGACGCAAUCGGCACCÜU 106 840 Candida albicans cal 587 ÖUGGGCÜUGGCUGGCCGGUCCAÜCUUU 107 587 cal 611 CAUCUUUUUGAUGCGUACUGGACCCAG 108 611 cal 651 GGUAGCCAUÜÜAUGGCGAACCAGGACU 109 651 17/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. Σ. coli Candida gla-brata cgi 193 MAUCAAÜGÜCOUCGGACUUUUUGAÜ 110 193 cgi 611 CGAUUUUUUCGU GUACUGGAAU GCACC 111 611 cgi 649 CCAAGUCCUUGUGGCUUGGCGGCGA 112 649 cgi 833 CGGGUGGUGUUUUUUUAGUGACCCA 113 833 cgi 1128 GGUGCUAGCAUUUGCUGGUUGUCCAC 114 1128 Candida parap-silosis cpa 611 CÄUCUUUÜUUGAUGCGUACUGGACCCA 115 611 cpa 645 GAGCCUUUCCUUCUGGCUAGCCUUUU- UGG 116 645 cpa 650 UUUCCUUCÜGGCUAGCCUUUÜUGGC- GAAC 117 650 Candida sake csa 598 AGCCGGUCCGCCUUUUGGUGAGUACU 118 598 csa 610 CCGCCUUUUGGUGAGUACUGGAUCUA 119 610 csa 651 AACCUUUCUUUCGGGGAAGGCGAACC 120 651 Candida tropicalis ctr 823 GAUUAGGGAUCGGUUGUUGUUCUUUAAU 121 823 ctr 837 UGUUGUUCUUUAAUUGACGCCAUUGGGC 122 837 Candida utilis ctr 613 CUUUUUGGCGAGUACUGACCCUGCC 123 613 ctr 943 ÄAACDCACCAGGUCAGGGAAACUCA 124 943 ctr 1131 ACUAGCUUUUGCUGGUGCUGACGCU 125 1131 Carnobacterium divergens cdi 68 ACGAAGUUGAAAAGCUÜGCUUÜUCGA 126 68 cdi 183 ÜGACCGCAÜGGUCGCUÜGAOGAAAGG 127 183 cdi 188 AUGGUCGCUUGAÜGAAAGGUGGCUOCGG 128 188 cdi 1242 AU GGUACAACGAGUCGCGAAGUC GU GAG 129 1242 cdi 1250 ACGAGUCGCGAAGUCGUGAGGCCAAGC 130 1250 Citrobacter amalonaticus cam 73 AGGAAGCAGCUUGCUGCUUUGCU 131 73 cam 82 CUUGCUGCUUUGCÖGACGAGUGGCGG 132 82 cam 177 CAUAAUGUCGCAAGACCAAAGAGGG 133 177 cam 447 AGGAAGGGGUUAAGGUUAAUAACCU- UAGCC 134 447 cam 468 ACCUUAGCCAUUGACGUUACCCGCAG 135 468 cam 471 UUAGCCÄUUGÄCGUUACCCGCAGAAG 136 471 cam 636 UCGAAACUGGCAGGCUUGAGUCUCGUA 137 636 Citrobacter freundii cfi 58 1AAGUCGAACGGUAGCACAGAGGAGCU 138 58 18/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli cfi 63 GAACGGUAGCACAGAGGAGCUUGCUC- COUG 139 63 cfi 75 AGAGGAGCUUGCUCCUUGGGUGACGAGU 140 75 cfi 119 AUGUCUGGGAAACÜGCCCGAUG 141 119 Clostridium botulinum cbo 54 AUGCAAGÜCGAGCGAUGAAGCUÜCCU 142 54 cbo 82 UÜCGGGAAGUGGAUÜAGCGGCGGACG 1.43 82 cbo 84 CGGGAAGÜGGAUUAGCGGCGGACGGGÜG 144 84 cbo 644 GGAOAÜCUAGAGÜGCAGGAGAGGAAA 145 644 Clostridium butyricum cbu 193 CAAUUAAAGGAGÜAAUCCGCUAOGA- GAUG 146 193 cbu 830 ÜGOAGGGGUUGUCAUGACCUCUGOGC 147 830 cbu 994 CAUCUCCUGAAUUACUCUGÜAAUGGA 148 994 cbu 1266 CGAGAGUGAGCAAAACÜAUAAAACC 149 1266 cbu 1426 UACCCAAAGUUCGUGÄGCUAACCGCAA 150 1426 Clostridium difficile cdi 58 AAGÜUGAGCGAUÜÜACUUCGGOAAA 151 58 cdi 131 CUACCCÜGUACACACGGAUAACAÜÄ 152 131 cdi 193 AUCAAAGGUGAGCCAGÜACAGGAUG 153 193 cdi 998 CAAUGACAUCUCCÜUAAUCGGAGAGÖÜ 154 998 Clostridium novyi cno 998 CUUGACAUCUCCUGÄAUUACUCGUAA 155 998 cno 1119 GUUAGUUGCUACUAUUAAGUUAAGCA 156 1119 Clostridium perfringens cpe 61 UCGAGCGAUGAAGUUÜCCUUCGGG 157 61 cpe 183 GAAÄGAUGGCAUCAUCAUUCAACC 158 183 cpe 432 GCÜCUGUCUUUGGGGAAGAUAAUGA 159 432 cpe 582 AGGCGGAUGAUUAAGÜGGGAÖGUGA 160 582 cpe 585 CGGAUGAUUAAGUGGGAUGUGAAAUACC 161 585 cpe 827 AGGUGÜGGGGGUUUCAACACCUCCG 162 827 cpe 993 ACAUCCCUUGCAUUACöCUUAAUCG 163 993 cpe 1203 AUGCCCCUUAUGUGUAGGGCUACACAC 164 1203 Clostridium tetani cte 180 AAAGUÜAAGGÜUUCGCAUGAAACUU 165 180 cte 689 GGUGAAAUGCGUAGAGGAUUAGGAAG 166 689 cte 744 UGUAACOGACGCAGAGGCACGAAAGCGU 167 744 cte 1151 AUGAGACUGCCUGGGUGAACCAGGAGG 168 1151 Corynebacteri- cbo 170 AAOACCGGAUAGGACCGUGCüüUAGU 169 170 19/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli um bovis cbo 439 CGGCAGGGACGAAGCÜUUUGUGAC 170 439 cbo 983 CÜGGGCUUGACAUGGGCAGGACCGGC 171 983 cbo 1000 AGGACCGGCGOGGAGACACGUCUUC 172 1000 cbo 1250 GGUOGCGAUGCCGCGAGGCÜCAGCUA 173 1250 Corynebacteri-um casei cca 134 CCCUGCACUUUGGGAUAAGCUUGG 174 134 cca 208 UUUGCGGUGUGGGAUGAGCCUGCGGCCU 175 208 cca 431 ACUCCUUUCGCUAUCGACGAAGCCACU 176 431 cca 830 UGUAGGGGGCUUCCACGUCUUCUGOG 177 830 cca 988 GCUUGACÄUGUACCGGAUUGGGCUA 178 988 Corynebacteri-um diphtheriae cod 64 AACGGAAAGGCCUAGCUÜGCUAGGUA 179 64 cod 433 CUCUUUCGCUAGGGACGAAGCUUOUGU 180 433 cod 1004 UCGGCGUAGUGAUACGUÜÜUCCCUUGU 181 1004 Coxiella bur-netii cob 61 UCGAACGGCAGCGCGGGGAGCUUGCU 182 61 cob 440 GGUGGGGAAGAAAÜUCÜCAAGGGÜAA 183 440 cob 462 GUAAUAOCCUUGGGCGOOGACGUÖAC 184 462 cob 579 CGÜAGGUGGAUAOOOAAGOCGGAUGÜ 185 579 cob 829 CUGUUGGGAAGUÜCACUÜCÜUAGUA 186 829 cob 990 UCGGAACUUGUCAGAGAUGAOOOGGU 187 990 Cryptococcus cry 0 UGCCUGUUUGAGUGüCAUGAAA 188 0 cry 1 CAÜGCCÜGUÜUGAGÜGÜCAÜGAAAA 189 1 cry 2 CAUGCCUGUUUGAGUGUCAUGAAÄ 190 2 Debaryomyces hansenii dha 193 GCUUUUCGGAGCUCUUÜGAUGAÜUC 191 193 dha 595 GUUGGCCGGUCCGCCUOUUUGGCGÄG 192 595 dha 610 CCGCCUUUUUGGCGAGUACUGGACCC 193 610 dha 642 ACCGAGCCUUÜCCUUCUGGCUAACCU- UOCG 194 642 dha 651 UCCUüCUGGCUÄÄCCüuUCGCCCü 195 651 Enterobacter aerogenes eae 431 AGUACUUUCAGCGAGGAGGAAGGCGÜ- ÜAA 196 431 eae 440 AGCGAGGAGGAAGGCGUÜAAGG 197 440 eae 450 AAGGCGUUAAGGUUAAUAACCUUGGC 198 450 eae 464 AAUAACCUUGGCGAUUGACGUUACUCG 199 464 1eae 470 CUUGGCGAUUGACGUUACUCGCAGA 200 470 20/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli Enterobacter agglomerans eag 622 CCUGGGAACUGCAUUGGAAACUGGCA 201 622 eag 809 CCCUAAACGAÜGÜCGACÜÜGGAGGUO 202 809 eag 986 GGCCOUGACAUCCACGGAAUÜUGGCA 203 986 eag 1367 ACGGUGAAUÄCGGGCCCGGGCC 204 1367 eag 1373 AAUACGGGCCCGGGCCUÜGUACA 205 1373 eag 991 UGACAUCCACGGAAUUUGGCAGAGAU 206 991 eag 1449 CCUUCGGGAGGGCGCUUACCUCUUUG 207 1449 Enterobacter CGAACGGOAGCACAGAGAGCÜÜGCÜ- cloacae ecl 62 CUCG 208 62 ecl 75 AGAGAGCUÜGCUCUCGGGUGACGAGOGG 209 75 ecl 86 COCÖCGGGUGACGAGUGGCGGACGG 210 86 ecl 629 ACUGCAOUCGAAACüGGCAGGCUGGAG 211 629 Enterobacter sakazakii esa 69 UAACAGGGAGCAGCUUGCUGCUCUG 212 69 esa 452 GGÜGUÜGUGGUUAAUAACCGCAGCAAU 213 452 esa 577 CACGCAGGCGGÜUGAÜUAAGUCAGAU 214 577 esa 633 CAUUÜGAAACUGGÜCAGCÜÜGAGÜCUC 215 633 esa 644 GGOCAGCOUGAGUCUCGUAGAGG 216 644 esa 984 CUGGUCUUGACAUCCAGAGAAUCCUGCA 217 984 Enterococcus enc 75 CACCGGAGCUUGCUCCACCG 218 75 enc 199 CGCUÜUUGCGUCACUGAUGGAU 219 199 enc 214 GCGUCACUGAUGGAUGGACCCGC 220 214 Enterococcus avium eav 88 CCACCGAAAGAAAAGGAGUGGCGAAC 221 88 eav 93 GAAAGAAAAGGAGUGGCGAACGGGUGA 222 93 eav 188 AUGGUUUCGGUUUGAAAGGCGCUUUUG 223 188 eav 452 CAAGGAUGAGAGUAGAAUGUUCAUCC 224 452 Enterococcus durans edu 58 AAGUCGUACGCUUCUUUUUCCACCG 225 58 edu 183 AAUCGAAACCGCAUGGUUUUGAUUU 226 183 edu 464 AACUGUUCÄUCCCUUGACGGUAUCUA 227 464 edu 1286 AAAGCUUCUCUCAGUUCGGAUUGUA 228 1286 Enterococcus faecalis efc 437 GUUGUUAGAGAAGAAC AAGGAC GUU A 229 437 efc 444 GAGAAGAACAAGGACGUUAGUAACU 230 444 efc 477 CCUGACGGUAUCUAACCAGAAAGCCACG 231 477 Enterococcus efm 68 CUUCUUUUUCCACCGGAGCUUGCUCC 232 68 21 /218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (aense) (5'->3') SEQ ID Nx. E. coli faecium efm 193 UUGAAAGGCGCUUUCGGGÜGUCGCUG 233 193 efm 207 ÜUCGGGUGÜCGCUGAUGGAÜGGACCC 234 207 efm 464 AACUGUUCAUCCCUUGACGGUAUCDA 235 464 efm 1237 AAUGGGAAGUACAACGAGÜUGCGAAGÜ 236 1237 Enterococcus saccharolyti- cus ens 462 AGAGAAUGUUCAUCCCUUGACGGUAü- CUA 237 462 ens 466 AAUGOUCAÜCCCUÜGACGGÜAUCUAAC- CA 238 466 ens 846 CCUUCAGÜGCÜGCAGCAAACGCAUUA 239 846 ens 1238 AUGGGAAGÜACAACGAGUÜGCGAAGU 240 1238 ens 1255 ÜUGCGAAGOCGCGAGGCUAAGCUAÄU 241 1255 Escherichia coli eco 64 ÜGGCAAGCOUGAGUCUCGUAGAGGGG 242 64 eco 429 AAAGUACUOÜCAGCGGGGAGGAAGGGAGUAAA 243 eco 447 AGGAAGGGAGÜAAAGÜÜAAÜACCUÜUG 244 447 eco 468 CCÜUUGCUCAOUGACGÜUACCCGCAGAA 245 468 eco 625 GGGMCUGCAUCUGAUACÜGGCAAGCU- UGAG 246 625 eco 643 UGGCAAGCUUGAGUCUCGUAGAGGGG 247 643 Flavobacterium fla 688 AACUAGAAUAÜGUAGUGUAGCGGUGA 248 688 fla 1195 AÄAUCAUCACGGCCCUUACGCCÜUG 249 1195 Franciselia tularensis ftu 216 GUCGCÄGAUGGAUGAGCCUGCGUUGG 250 216 ftu 455 CUCAAGGÜUAAUAGCCÜUGGGGGAG 251 455 ftu 657 ACGGUAGAGGAAUGGGGAAUUUCUGGU 252 657 ftu 857 AGCUGUUGGAGUCGGUGUAAAGGCUC 253 857 ftu 1152 UGAGACUGCCGCUGACAAGGCGGAGG 254 1152 Gluconobacter glu 724 GCGAAGGCGGCAACCUGGCUCGAUAC 255 724 glu 837 UAACUUAGUUACUCAGUGUCGAAGCU 256 837 Gluconobacter asaii gas 987 GACUUGCAUGGGGAGGACGUACUCAGA 257 987 gas 1007 ACUCAGAGAUGGGUAUUUCUUCGGÄCC 258 1007 gas 1268 GGCGACAUGGUGCUGACJCUCUAAAAGC 259 1268 Gluconobacter oxydans gox 998 GGGAGGACCGGÖUCAGAGÄUGGACCU 260 998 gox 1264 GGUGACAUGGUGCUGAÜCUCUAAAAGC 261 1264 22/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli Hafnia alvei hal 256 GGGGÜAAUGGCUCACCUAGGCGACGAU- CUCU 262 256 hal 585 CGGUUGAUÜAAGUCAGAUGUGAAAUC 263 585 hal 635 UUUGAAACUGGUCAGCUAGAGUCUUG 264 635 Helicobacter pylori hpy 129 AUGUGCCUCUUAGÜUUGGGAUAGCC 265 129 hpy 208 U U AUC GCUAAGAG AU C AGC C UAU GUC 266 208 hpy 580 GUAGGCGGGAUAGÜCAGUCAGGUGUGA 267 580 hpy 836 AGGGCUUAGUCUCUCCAGÜAAUGCAGC 268 836 hpy 988 GCUUGACAÜUGAGAGAAUCCGCUAGA 269 988 hpy 1443 CUAAAOÜGGCÜACÜGCCCACGGCACAC 270 1443 Klebsialla pneumoniae kpn 56 GCAAGUCGAGCGGOAGCACAGAGAGCUU 271 56 kpn 78 GAGCUUGCOCUCGGGUGACGAGCGG 272 78 kpn 198 UGGGGGACCUUCGGGCCUCAUGCCAUC 273 198 kpn 214 CUCAOGCCAUCAGAUGUGCCCAGAÜ 274 214 Klebsiella oxytoca kox 84 UGCUCUCGGGUGACGAGUGGCGGACGGG 275 84 kox 634 AUUCGAAACUGGCAGGCUGGAGUCUUGU 276 634 kox 646 CAGGCUGGAGUCUOGUAGAGGGGGGÜA 277 646 Lactobacillus lac 725 CGAAGGCGGCUCUCUGGUCÜGCAACU 278 725 lac 838 GGUUUCCGCCUCUCAGUGCUGC 279 838 Lactobacillus acidophilus Iba 266 CCUACCAAGGCAAUGAUGCAUAGCCGA- Gü 280 266 Iba 466 CUGGCCUUUAUUUGACGGUAAUCAACC 281 466 Lactobacillus alimentarius lal 85 GCAÜCAUGAUUUAGAUCUAAGUGAGU 282 85 lal 195 AAGAUGGUUUUGCUÄUCUCUUCUGG 283 195 lal 627 GAAGUGCUUCGAAAACUGGUGAACU 284 627 lal 992 GACAUACCAUGAAAAGCUAAGAGAU 285 992 lal 1436 CGGUGGGGUAACCCUUCGGGGAACU 286 1436 Lactobacillus bifermentas lbi 75 CAGAAGGUGCUUGCACUGGAAGUUG 287 75 lbi 172 UACCGCAUAAAAGUUGAGAUCACAU 288 172 lbi 449 GAACAGGGACUAGAGUAACUGUUAGU 289 449 lbi 1443 GUAACCUCUUUGAGGAGCUAGCCGUC 290 1443 Lactobacillus brevis lbr 64 AACGAGCUUCCGUUGAAÜGACGUG 291 64 23/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli lbr 122 CGUGGGAAAÖCUGCCCAGAAGCAG 292 122 lbr 453 CCUUUGAGAGUAACUGÜÜCAAGGGUU 293 453 lbr 1436 CGGUGAGAUAACCUUCGGGAGUCAG 294 1436 Lactobacillus casei lea 86 GCAÜGGUÜCÜÜGGCÖGÄÄAGÄÜGGC 295 86 lca 437 GUUGUUGGAGAAGAAUGGUCGGCAG 296 437 lca 451 AUGGUCGGCAGAGUAACÖGUUGUCGG 297 451 lca 465 AACÜGUUGUCGGCGÜGACGGUAUCCA 298 465 lca 985 AGGUCUUGACAÜCUUUUGAUCACCUG 299 985 lca 1443 GUAACCCUÜÜUAGGGAGCGAGCCGU 300 1443 Lactobacillus coryniformis lco 75 ACCGAAGCÜGCÜUGCAGÜGGACGOÜG 301 75 lco 173 ACCGCAUAACCAUUCAGACCACAUG 302 173 lco 465 ACUGUÜAGÜCCÜÜÜGACGGÜAÜCCAA 303 465 Lactobacillus curvatus lcu 68 ACUCU C GUUAGAUU GAAGAAGC 304 68 lcu 91 GAÜÜGAUAACAÜUÜGAGÖGAGOGGC 305 91 lcu 455 OUUGAUAGUAACUGAUCAGGaAGUGACG 306 455 Lactobacillus delbrueckii lde 58 AAGUCGAGCGÄGCÜ GAAOÜCAAAGAU 307 58 lde 171 AUACCGGAOAACAACAUGAAÜCGCAU 308 171 lde 187 CAÜGAÜUCAAGÜUUGAAAGGCGGCG 309 187 lde 437 GUUGUUGGÜGAAGAAGGAUAGAGGCAGU 310 437 lde 570 UAAAGCGÄGCGCAGGCGGAAOGAUAAG 311 570 lde 1267 GAGGGUAAGCGGAUCUCÜUAAAGCUG 312 1267 Lactobacillus farminis lfa 68 AACCAÜCCOGAAGAÜUGAAGCUUGCÜ 313 68 lfa 183 CUACUUUCACAUGAUCGUAGCÖUGAA 314 183 Lactobacillus fermentum lfe 183 UUGUUCGCAUGAACAACGCUUAAA 315 183 lfe 199 UGGCUUCUCGCUAUCACUUCUGGAUG 316 199 lfe 480 GACGGOAUUUAACCAGAAAGUCACGG 317 480 Lactobacillus helveticus lhe 170 AAUACCGGAUAAGAAAGCAGAUCGCÄ 318 170 lhe 572 AAGCGAGCGCAGGCGGAAGAAUAAG 319 572 lhe 628 AACUGCAUCGGAAACUGÜUUUUCÜÜG 320 628 lhe 1273 AAGCGAAUCUCUGAAÄGCUGÜUCUC 321 1273 Lactobacillus lke 56 GCAAGUCGAACGCGUUUCCGUUAUUG 322 56 24/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Sp0zies Sonde Sequenz (eense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli kefir lke 92 AAUGÄUUUAACACGAAACGAGUGGCGA 323 92 lke 126 GGUAACCUGCCCUUGAAGUAGGGGAU 324 126 lke 185 CACAUGGUUUUGGUUUÄAAAGAUGGCU 325 185 lke 451 ACAGGUGUCAGAGUÄACUGUUGACAU- CUU 326 451 Lactobacillus plantarium lpl 86 CAUCAUGAUUUACAUUUGAGUGAGÜG 327 86 lpl 177 CAUAACAACUUGGACCGCAUGGUCC 328 177 lpl 454 AUCUGAGAGUAACUGUUCAGGUAUUG 329 454 lpl 471 UCAGGUAUOGACGGUAUUUAACCAGA 330 471 Lactobacillus reuteri Ire 54 AUGCMGUCGUACGCACUGGCCCAAC 331 54 Ire 172 UACCGCAUAACAACAAAAGCCGCAUG 332 172 Ire 198 AUGGCUUUGGCUAOCACUCÜGGGAUG 333 198 Ire 573 AGCGAGCGCAGGCGGUUGCUUAGGUC 334 573 Ire 988 UCÖUGACAUCUUGCGCUAACCUUAGA 335 988 Lactobacillus rhamnosus lrh 64 AACGAGUÖCUGAUUAUUGAAAG 336 64 lrh 75 AUUGAAAGGUGCOUGCAUCOUGAUUU 337 75 lrh 448 AGAAÜGGUCGGCAGAGUAACUGUÜGÜC 338 448 lrh 984 CAAGOCUUGACAÜCÜUUUGAÜCACCÜG 339 984 Lactobacillus sake lsa 79 GAGCOUGCUCCUCAUUGADAÄACAÜ 340 79 lsa 93 GAUAAACAUUUGAGUGAGUGGCGGACGG 341 93 lsa 186 GCAUGGUGUAGGGUUGAAAGAUGGUÜ 342 186 lsa 437 GOÜGUUGGÄGAAGAAUGUAUCUGAÜA 343 437 lsa 465 ACUGAUCAGGUAGUGACGGUÄÜCCA 344 465 Lactococcus cremoris lcr 59 AGUUGAGCGAUGAAGAUUGGUGCUUGC 345 59 lcr 170 AAUACCGCAUAACAACUUUAAACAUAAG 346 170 lcr 183 AAACAUAAGUUUUAAGUUUGAAAGAUGC 347 183 Lactococcus diacetilactis ldi 68 UGAAGGUUGGUACUUGUACCGACUGGA 348 68 ldi 82 GUACÜUGUACCGACUGGAUGAGCAGCGA 349 82 ldi 89 CGACUGGAÜGAGCAGCGAACGGGUGAG 350 89 Lactococcus lactis 11a 429 AAAACÜCUGUÜGGUAGAGAAGAACGUU 351 429 25/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli 11a 450 AACGUÜGGUGAGAGUGGAAAGCUC 352 450 11a 487 ACUACCCAGAAAGGGACGGCUÄACUA 353 487 11a 574 GCGAGCGCAGGUGGUUUAUUAAGUCU 354 574 11a 625 UUGUAUGCAUUGGAAACUGGÜAGAC 355 625 11a 1419 UUGGGAGÜACCCGAAGUAGGUÜGCCUA 356 1419 Lactococcus luteug llu 193 UGUUGGAAAGAUUUAUCGGUÜUUGGA 357 193 llu 599 UGUCGÜGAAAGUCCGGGGCUOAACC 358 599 llu 616 GCUUAACCCCGGAUCUGCGGÜGGGU 359 616 llu 837 ACCAUUCCACGGUUÜCCGCGCCGCAG 360 837 llu 988 GCUUGACAUGUUCUCGAUCGCCGUA 361 988 llu 1012 GAGAUACGGUUUCCCCUUUGGGGCG 362 1012 Legionelia pneumophilia lpn 1128 CAGCÄUGUGAUGGUGGGGACÜCDAAG 363 1128 lpn 1246 UACAGAGGGCGGCGAAGGGGCGACCU 364 1246 Leuconostoc citreum lei 653 GAGUGUUGUAGAGGUAAGUGGAACUC 365 653 lei 656 UGUUGUAGAGGUAAGUGGAACÜCCA 366 656 lei 1250 ACGAGUUGCCAACCOGCGAAGGUGAG 367 1250 lei 1281 CUCUUAAAGUACGUCüCAGUOCGGACü 368 1281 Leuconostoc lactis lei 178 AUAAAÄCUÜAGUAUCGCAUGAÜACAAA 369 178 lei 403 GUGUGUGAOGAAGGCUUUAGGGUCGU 370 403 lei 446 GAAGAAAUGCUAGAAÜAGGGAAUGAU 371 446 lei 1007 UUCUAGAGAUAGAAGUGUUCUCUUCGG 372 1007 Leuconostoc mesenteroides lme 79 Gü GCUUGCACCUUUCAAGUGAGUGG 373 79 lme 126 GACAACCUGCCUCAAGGCUGGGGAUAA 374 126 lme 179 UAAAACUUAGUGUCGCAUGACACAAA 375 179 lme 428 OAAAGCACU GUUGUAD GGGAAGAÄ-CAGCU 376 428 lme 477 UUUGACGGUACCAUACCAGAAAGGGACG 377 477 lme 1012 GAGAUAGAAGUGUUCOCUUCGGAGAC 378 1012 Listeria lis 62 CGAACGAACGGAGGAAGAGCUUGCUC 379 62 lis 133 GCCUGUAAGÜUGGGGAUAACÜCCGG 380 133 lis 430 AAGUACU GUUGUUAGAGAAGAACAAG 381 430 Listeria iva-novii 1liv 168 CÜAAUACCGAAUGAÜAAGUAGUGACG 382 168 26/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli liv 183 AÜAAGÖAGUGACGCAUGUCAUCACÜUU 383 183 Listeria mono-cytogenes lmo 63 GAACGAACGGAGGÄAGAGCUUGCUC 384 63 lmo 68 ACGGAGGAAGAGCÜUGCÜCUUCCAAA 385 68 lmo 133 GCCUGUAAGUUGGGGAÜAACUCCGG 386 133 lmo 193 GCUUUUGAAAGAÖGGÜÖUCGGCUAOCGC 387 193 lmo 198 AUGGÜUÜCGGCUAUCGCUUACAGA 388 198 lmo 202 UUUCGGCUAUCGCUÜACAGAUGGGCC 389 202 lmo 423 GAÜCGUAAAGÜACDGOOGOÜAGAGAA 390 423 lmo 466 CÜGCOÜGOCCCUOGACGGÜAÜCUAA 391 466 lmo 634 AÜOGGAAACÜGGAAGACOGGAGÜGCA 392 634 lmo 1005 CACUCÜGGAGACAGAGCUÜÜCCCÜD 393 1005 lmo 1148 CUAAAGOGÄCUGCCGGUGCAAGCC 394 1148 Listeria see-ligeri lse 168 CUAAUACCGAAUGAUAAGGAGUGACGC 395 168 lse 180 GAUAAGGAGUGACGCAUGUCACüGC 396 180 Microbacterium lacticum mla 1149 ÄUGGAAUACUGCCGGGGUCAACUCGG 397 1149 mla 1166 UCAACUCGGAGGAAGGUGAGGAÜGAC 398 1166 mla 1249 AAUGGGCUGCAAUACCGCÄAGGUGGA 399 1249 Microbacterium schleiferi msc 68 GUGAAGCAGAGCUUGCUCUGÜGGAUC 400 68 msc 183 GAAGGCAÜCUUCAGCAGCÜGGAAAG 401 183 msc 189 UCUUCAGCAGCÖGGAAAGAAUDOCGG 402 189 msc 196 AGAAUUUCGGUCAGGGAUGAGCüCG 403 196 Micrococcus lylae mly 133 GCCCUUGACÜCUGGGAUAAGCCOUGG 404 133 mly 185 CGCAUGGUGGGUGUUGGAAAGAAUUU 405 185 mly 599 UGCCGUGAAAGUCCGGGGCUUAACü 406 599 mly 616 GCÜUAACUCCGGAÜCUGCGGOGGG 407 616 Micrococcus tyrobutyricum mty 180 AAAGCCAAGUUUCACAUGGAAü 408 180 mty 989 COUGACAOCCCCUGAAUAACCUAGA 409 989 mty 1274 AGCCAAACUCAAAAACUGCCCUCA 410 1274 mty 1438 GOAGUCUAACGUAAGAGGACGCGG 411 1438 Micrococcus varians mva 985 AAGGCUUGACAUACACCGGACCGGUCC 412 985 mva 1018 GAUCUÜCCCCCUUGUGGGGCÜGGUGUA- 413 1018 27/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SBQ ID Nr. E. coli CA mva 1302 UCGGAUCGUGGUCUGCAACUCGACCAC 414 1302 mva 1321 CGACCACGUGAAGUCGGAGUCGCUAG 415 1321 Mycobacterium avium mav 77 CUCUUCGGAGGUACUCGAGUGGCGAAC 416 77 mav 126 GGCAAUCUGCCCUGCACUUCGGGAUAA 417 126 mav 190 GUCUUCUGGUGGAAAGCüUUUGCGGUG 418 190 mav 1266 UAAGGUUAAGCGAAUCCUÜUUA 419 1266 Mycobacterium tuberculosis mtu 64 AACGGAÄAGGUCÜCUUCGGAGAÜA 420 64 mtu 168 CÜAAÜACCGGAÜAGGACCACGGGAÜG 421 168 mtu 193 GGUGGAAAGCGCUUUAGCGGÜG 422 193 mtu 197 GCGCÜOÜAGCGGUGUGGGAÜGAGCCC 423 197 mtu 1269 GGUDAAGCGAAUCCUUAAAAGCCGG 424 1269 Mycoplasma bo-vialkalescens mbo 62 CGAGCGAGGUOÜÜUUAAACCUAGC 425 62 mbo 64 AGCGAGGUUUÜÜUAÄACCUAGCGG 426 64 mbo 189 UGAUUUUGUUGUGAÄAGGAGCCUU 427 189 mbo 440 AUAGGGAAAGAAAACÜÜGGUOGAG 428 440 mbo 448 AGAAAACUUGGUUGAGGAAAUGCÜ 429 448 mbo 638 GAÜACUGGÜAAACÜAGAGOUGGAUA 430 638 mbo 1015 AUAUAGUCGAGGÜÜAACGGAGOGA 431 1015 mbo 1153 GAÜACÜGCCOGGGUAACUGGGAGGA 432 1153 Mycoplasma bo-vigenitalium myb 68 AAGUGAUUUAÜCACDÜAGCGGC 433 68 myb 136 CÜUCAGÜUUGGCAUAGCGGUUG 434 136 myb 180 ACUCGUAGAUGCCGCAUGGCAUUUACGG 435 180 myb 196 AGACGCCUUAAAGCGUCGCUGGAG 436 196 myb 470 CCACUAUAUUGAAUGUACCUUAUÜA- GAÄA 437 470 myb 1242 CCGGUACAAAGUGAAGCAACCUGGUGA 438 1242 myb 1433 AGUCGGUUUAUUAACAAACUGC 439 1433 Mycoplasma bovis myc 56 GCAUGUCGAGCGAUGAUAGCAAÜ 440 56 myc 81 AGCAÄUAUCAUAGCGGCGÄÄUG 441 <—l CO myc 139 UAGAUUGGGAUAGCGGAOGG 442 139 myc 150 AGCGGAÜGGAAACAUCCGAUAAU 443 150 myc 193 AAAAGGAAGCGUUUGCUUCGCU 444 193 28/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli myc 286 UAGCGGGGUUGAGAGAUUGAUCCG 445 286 myc 290 GGGGUUGAGAGAUUGAUCCG 446 290 myc 422 GGGUÜGUAAACUGCUGUGGUUA 447 422 myc 432 CUGCÜGUGGÜUAGGGAAGAA 448 432 myc 486 ACCUGAUUAGAAAGCAACGG 449 486 myc 596 GUCUGGCGUUAAAUUUUGGG 450 596 myc 620 AÄCCCCAAAACGCGOUGGAÜ 451 620 myc 715 ACAUCAAUAÜGGCGAAGGCA 452 715 myc 823 CAUUAGUUGAUGGGGAACUCAUCGA 453 823 myc 834 GGGGAACUCAUCGACGCAGC 454 834 Mycoplasma ca-lifornicum mca 197 GACGCCUUUAAAGCGUCGCUGGAGGAG- CG 455 197 mca 414 AGGCCUAUGGGUUGUAAACUGCOGUG- GÜAA 456 414 mca 463 GAAÄUGCCACUGUAUUGAAUGU 457 463 mca 1151 AGGAGACUGCCUGAGUAAUCGGGAGGA 458 1151 mca 1270 AGU GAGC AAAC C AC AAAAAACU GGO C 459 1270 Mycoplasma ca-nadense mpc 64 AGCGAGGÜUCÜÜUÜGAACCUAG 460 64 mpc 137 GGUUAGCUAACCÜCGGAGGCGACC 461 137 mpc 188 AUGAUUUCAAÜGÜGAAAGGAGCCCU 462 188 mpc 595 AGUCÜGGAGÜCAAAÜACCAGGGCÜ 463 595 mpc 600 GGAGUCAAAUACCÄGGGCUCAA 464 600 mpc 633 CUUUGGAUACUGGUAAACOAGAGUÜAG 465 633 mpc 993 ACAÜCCUUCGCAAUGCUAUAGA 466 993 mpc 1001 CGCAAUGCUAUAGAGAUAUAGCGGAG 467 1001 mpc 1019 AGCGGAGGUUAACGGAGUGACAGAUG 468 1019 mpc 1156 ACÜGCCÜGGGUAACUGGGAGGA 469 1156 Nocardia aste-roides nas 120 CACGÖGGGUGAUCUGCCUCGUACOUC 470 120 nas 127 GUGÄUCUGCCUCGUACUUCGGG 471 127 nas 178 AÜAUGACCUOCGGAOGCAUGÜCUGAG 472 178 nas 208 UUAUCGGUACGAGAUGGGCCCGCGG 473 208 nas 598 CGAUCGUGAAAACUUGGGGCtJCAAC 474 598 nas 614 GGGCUCAACCCCAAGCUOGCGGGCG 475 614 nas 623 CCCAAGCUUGCGGGCGAUACGGGC 476 623 Pediococcus acidilactici pac 196 AGAUGGCUCUGCUAUCACUUCUGGA 477 196 29/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli pac 201 GCUCÜGCUAUCACUUCÜGGAUGGACC 478 201 pac 214 CÜAUCACUUCUGGAUGGACCCGCGGCG- CA 479 214 pac 261 ÄÄCGGCUCACCAAGGCGAUGAUGCGUA 480 261 pac 624 GÄAGAAGU GCAU U GGAAAC U GGGAGAC 481 624 pac 1266 CGAGGUUUAGCUAAUCUCUUAAAACCAU 482 1266 Pediococcus pentosaceus ppe 272 AAGGCAGUGAUACGUAGCCGACCU 483 272 ppe 999 UCUGACAGUCUAAGAGAUUAGAGGU 484 999 Plesiomonas shigelloides psh 212 ACCUCAUGCÖAUCGGAUGAACCCAGGU 485 212 psh 461 GUUAAÜACCÜAGUGGCAUUGACGUUACU 486 461 psh 467 ACCUAGUGGCAUDGACGUUACUCGCAG 487 467 psh 1272 UGAGCGAAUCCCAUAAAGUAUGUCGOAG 488 1272 Propionibacterium freuden-reichii pfr 121 ACGUGAGGAACGUGCCCUUGACUÜCG 489 121 pfr 991 UGACAUGUACÜGGAAGCGUOCAGAG 490 991 pfr 1019 GCGUGCCUUUÜUGGCUGGUACACAG 491 1019 pfr 1130 GCAGÜÜCGGCOGGGGACÜCAUÜGGA- GACC 492 1130 Prototheca zopfii pzo 439 AGGGCAAACOAAACCCCACACCGAGG 493 439 pzo 575 AGCUCGUAGOUGGAUGUAGACGGÜCGC 494 575 pzo 651 CGGCACAGGÄCUCUGGCCUGUCCCGÜ 495 651 pzo 824 ACÖAGGGAÖCGGGGAGGCGCÜCAAUC 496 824 pzo 1274 GACGACUCUCCCAACCCGCGCCGU 497 1274 Pseudomonas pse 225 AGAUGAGCCUAGGUCGGAUUAGCUAG 498 225 pse 419 UUCGGAUUGUAAAGCACUUÜAAGUUGG 499 419 pse 677 UUCCUGUGUAGCGGUGAAAÜGCGUA 500 677 pse 704 UAUAGGAAGGAACAC CAGUGGC 501 704 Pseudomonag aeruginosa psa 136 UGGUAGUGGGGGAUAACGUCCGGA 502 136 psa 150 AACGUCCGGAAACGGGCGCUAAUAC 503 150 psa 161 ÄCGGGCGCUAAUACCGCAUACGUCCUGA 504 161 psa 180 ACGUCCUGAGGGAGAAAGUGGG 505 180 psa 265 GCCUACCAAGGCGACGAUCCGUAACUGG 506 265 psa 639 AAACUACUGAGCUAGAGUACGGÜAG 507 639 30/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli Pseudomonas fluorescens pfl 455 CAGUUACCÜAAUACGUGAUUGU 508 455 pfl 466 UACGÜGAUUGUUÜOGACGUUACCGA 509 466 pfl 469 GÖGAUÖGUOUUGACGUUACCGACAGA 510 469 Pseudomonas fragi pfr 118 AAOACCUAGGAAUCÜGCCUGAUAGU 511 118 pfr 262 AU GGCÜCACCAAGGCÜACGAÜCCGUAA 512 262 pfr 455 CAUUAACCUAAUACGUUGGUGUCUUG 513 455 pfr 468 CGUUGGUGUCUUGACGUUACCGACAG 514 468 pfr 474 UGUCUUGACGUUACCGACAGAAUAA 515 474 pfr 841 UUGAACUCUUAGUGGCGCAGCUAAC 516 841 Pseudomonas mephitica pme 69 CAGCACGGAGCUUGCUCUGGUGGCGA 517 69 pme 454 GGUGAGAGCUAAUAUCUCUUGCUAA 518 454 pme 992 GACAUGGCUGGAAUCCUUGAGAGAUCA 519 992 pme 1274 AGCUAAUCGCAGAAAGUGUAUCGÜA 520 1274 Pseudomonas putidä ppu 818 AUGUCAACUAGCCGUUGGAÄUCCUUG 521 818 Rhodotorula glutinis rgl 85 CCUCCGGAUUGGCUAUUGGGAGCOC 522 86 rgl 96 GÄUÜGGCÜAUUGGGAGCUCGCGAGAGCA 523 96 rgl 106 GCCUCCGGAUUGGCÜAUUGGGAGCUCG 524 106 rgl 116 UUGGCUAUUGGGAGCUCGCGAGAGCAC 525 116 Saccharomyces cerevisiae sce 613 AUUUUÜUCGUGUACUGGAUUUCCAAC 526 613 sce 626 CGUGUACUGGAUUUCCAACGGGGCCU 527 626 sce 1453 UCÖCAGAGCGGAGAAUUUGGACAAAC 528 1453 Salmonella sal 148 AUAACUACUGGAAACGGUGGCU 529 148 sal 818 AUGOCUACUUGGAGGUUGUGCCCUUG 530 818 Salmonella en- terica sen 72 CAGGAAGCAGCUUGCUGCUUUGCUGA 531 72 sen 83 UUGCUGCUUUGCUGACGAGUGGCGGA 532 83 sen 233 CCAGAUGGGAUUAGCUUGUUGGUGA 533 233 sen 281 UCUACUUGGAGGUUGUGCCCUUGAGG 534 281 Salmonella en- teritidis sae 89 CUUCGCUGACGACUGGCGGACGAGUG 535 89 sae 635 UCUGAAACUGGCUUGCUUGAGUCUCGU 536 635 sae 993 ACAUCCACAGAAGAAUCCAGAGAUCCA 537 993 31 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3’) SEQ ID lir. E. coli sae 1000 CAGAAGAAUCCAGAGAUCCAÜUUGU 538 1000 sae 1016 UCCAUUUGUGCCUUAGGGAACUGÜG 539 1016 Shewanella pu-trefaciens spu 1267 GAGGUGGAGCUAAUCUCACAAAGCUCG 540 1267 spu 1278 AAUCUCACAAAGCUCGUCGUAGUCCGGA 541 1278 spu 1287 AAGCUCGUCGUAGUCCGGAUÜGGAGU 542 1287 Shigella shi 820 GAAUGUUAGCCGUCGGGGUGUUUACA 543 820 shi 832 UCGGGGUGUUUACACUUCGGUGGCG 544 832 Shigella boy-dii sbo 73 AGGAAGCAGCÜÜGCÜGÜÜUCGC 545 73 sbo 468 CCUUUGCUCAUUGACGUUAUCCGCA 546 468 sbo 481 ACGUUAUCCGCAGAAGAAGCACCGGC 547 481 Shigella dys-enteriae sdy 74 GGAAGCAGCUUGCUGCUUÜGCOGAC 548 74 sdy 986 GGUCUUGACAUCCACAGAACCUUGU 549 986 sdy 1016 UACGAGGGUGCCOUCGGGÄACUGUGAG 550 1016 Shigella flex-neri sfl 73 AGGAAGCAGCUUGCUGUUUCGCUGAC 551 73 sfl 86 CUGÜUUCGCUGACGAGUGGCGGACG 552 86 sfl 737 CCUGGACGAAGACUCACGCUCAGGUGC 553 737 sfl 824 ACUUGGAGGUUGUGCCCUUGAGGUGUGG 554 824 sfl 1409 ACCAUGGGAGOGGGUUGUAAAAGAAGU 555 1409 Shigella son-nei sso 55 UGCAAGUCGAACGGUAACAGGAAACA 556 55 sso 73 AGGAAACAGCUUGCUGUUUCGCUGAC 557 73 Sporolactoba-cillus inulins sin 189 UGGUGCGAGGÜUGAÄAGAÜGGUUUCG 558 189 sin 462 GGAAAUGCUGGUGCUGUGACGGUAU 559 462 sin 1436 CGGÖGUGGGAACCUUUAUGGACCCAG 560 1436 Staphylococcus aureus sau 183 GAACCGCAUGGÜUCAAAAGUGA 561 183 sau 222 UAUAGAUGGAUCCGCGCUGCAO 562 222 sau 236 CGCUGCAUUAGCUAGUUGGUAA 563 236 Staphylococcus carnosus sca 164 GGGGCUAAUGCCGGÄUAAUAUGCAGAA 564 164 sca 187 CAUGGUUCUGCAAUGAAAGACGGUU 565 187 sca 450 AACAAGÜGCGUAGGUAACUAUGCGCA 566 450 Staphylococcus stp 194 AAAGACGGUUUUGCUGUCACUU 567 194 32/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3’) SEQ ID Nr. E. coli epidermidis stp 201 GUUUUGCÜGÜCACUUAUAGAUGGAUCC 568 201 stp 214 CUGUCACÜUAUAGAUGGAUCCGCGCCG- CÄ 569 91 A £ ±H stp 231 AUCCGCGCCGCAUUAGCUAGUUGGUAA 570 231 stp 452 AAAUGUGUÄAGÜAACUAUGCACGUC 571 452 Stp 469 AUGCACGUCUUGACGGUACCUAAUCA 572 469 Staphylococcus hyicus shy 66 CGAACAGAUGAGGAGCUUGCUCCUUUG 573 66 shy 989 CUUGACAUCUUUUGAUCGCUCU 574 989 shy 1020 GUUUUCCUCUUCGGAGGACAAAAUG 575 1020 shy 1442 AGUAÄCCAUUUÜGGAGCUAGCC 576 1442 Staphylococcus intermedius sti 163 CGGGGCUAAUGCCGGAUAACAU 577 163 sti 171 AUGCCGGAUAÄCAUGUUGÄACCGCA 578 171 sti 183 ÜGÖUGAACCGCAUGGUUCUACA 579 183 sti 236 CGCCGUAUUAGCUAGUUGGUGGGG 580 236 sti 1111 CCCUUGAACUUAGUUGCCAUCAUUCA 581 1111 sti 1442 AGOAACCAUUUUGGAGCUAGCC 582 1442 Staphylococcus sciuri ssc 68 ACAGAUGAGAAGCUUGCUUCUCUGAÜ 583 68 ssc 193 ÜCAAUAGUGAAAGACGGOUOCGGCO 584 193 ssc 446 GAAGAACAAAÖOUGÖDAGOAACUGAA 585 446 ssc 453 AAUUUGÖÖAGOAACUGAACAAGUCUÖ 586 453 ssc 466 CÜGAACAAGÜCUUGACGGÜACCOAA 587 466 Staphylococcus simulans ssi 188 AUGGOÖUCAOGAOGAAAGACGGÜUÜ 588 188 ssi 439 UAÜÜAGGGAAGAACAAGGAUGÜAAGÜ 589 439 ssi 457 UGUAAGUAACUAÜGCAUCCCUUGÄC 590 457 Staphylococcus xylosus sxy 77 AGGAGCUUGCOCCUUUGAAGUU 591 77 sxy 90 UUÜGÄAGUÜAGCGGCGGACGGG 592 90 sxy 172 UACCGGAUAACAUUUAGAACCG 593 172 sxy 185 CGCAUGGUUCUAAAGUGAAAGA 594 185 sxy 193 CUAAAGUGAAAGAUGGUUUUGCUAUCÄ 595 193 sxy 439 UAOUAGGGAAGAACAAAUGUGUAAGUAACUGU 596 sxy 579 CGUAGGCGGUUUCUUAAGUCUGA 597 579 sxy 1004 AAACUCUAGAGAUAGAGCCOUC 598 1004 33/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Hz. E. coli sxy 1139 ÜAAGÜÜGGGCACUCOAGGÜUGA 599 1139 sxy 1265 GCGAGGUCAUGCAAAUCCCAUA 600 1265 sxy 1445 AACCAÜÜUAUGGAGCÜAGCCGÜ 601 1445 Streptococcus agalactiae sag 443 AGAGäAGAACGUUGGUäGGävjÜ 602 443 sag 462 GUGGAAÄAÖCUACCAAGUGACG 603 462 sag 624 AUUGUACGCUÜUGGAAACUGGAGGACU 604 624 sag 993 ACAUCCUUCUGACCGGCCUAGA 605 993 sag 1015 AUAGGCUUUCUCUUCGGAGCAGAA 606 1015 Streptococcus bovis sbo 122 CGÜAGGUÄACCÜGCCUACUAGCGGGG 607 122 sbo 135 CUACUÄGCGGGGGAUAACUAUÖGGAA 608 135 sbo 443 ÄGAGAAGAACGUGUGÜGAGAGUGGAAA 609 443 sbo 625 UUGÜUCGCUUÜGGAAÄCUGUUAGAC 610 625 sbo 1260 AGUCGGUGACGGCAAGCAAAUCUCU 611 1260 sbo 1270 GGCAAGCAAAUCUCUUAAAGCCAAU 612 1270 Streptococcus dysgalactiae sdy 64 AACGCUGAGGACUGGUGCUUGCACCG 613 64 sdy 277 OGCAUCACUAUGAGAUGGACCU 614 277 sdy 443 AGAGAÄGAAUGAUGGUGGGAGU 615 443 sdy 545 UGGUGGGAGUGGAAAAUCCACCAUGü 616 545 sdy 843 CCGGGGCUUAGUGCCGGAGCUA 617 843 sdy 1004 CCGGUCUAGAGAÜAGGCUUUCC 618 1004 Streptococcus equi seq 207 AACAGCUCCACUAUGAGAUGGACCU 619 207 seq 447 AAGAACAGUGAUGGGAGUGGAAAGUC 620 447 seq 461 AGUGGAAAGUCCAUCAUGUGACGGU 621 461 seq 468 AGUCCAUCAUGUGACGGUAACUAACCäG 622 468 seq 620 AACCAUUGUAUGCUUUGGAAACUGU 623 620 seq 1006 UUCUUAGAGAUAAGAAGUUACU 624 1006 Streptococcus mitis smi 55 ÜGCAAGUAGAACGCUGAAGGAGGAGC 625 55 smi 218 CACUACCAGAUGGACCUGCGUUGUA 626 218 smi 472 CACACUGUGACGGÜAÜCÜUACCAGAA 627 472 smi 645 UUUAACUÜGAGUGCAAGAGGGGAGA 628 645 smi 660 AGAGGGGAGAGUGGAAÜÜCCAUGÜGÜA 629 660 smi 733 GCÜCUCUGGCUOGUAACÜGACGCUGA 630 733 smi 843 CCGGGGUOUAGUGCCGCAGCUAACGC 631 843 34/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sende Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. Σ. aoli smi 993 ACAUCCCÜCUGACCGCOCUAGAGAUA 632 993 smi 1018 GAGUUÜÜCCÜOCGGGACAGAGGÜGAC 633 1018 Streptococcus pneumoniae spn 163 GAOAGCÖAAUACCGCÄÜAAGAGUAGA 634 163 spn 183 GUAGAUGUUGCAUGACAUUUGCUUAA 635 183 spn 200 GCACUUGCAUCACUACCAGAUGGACCU 636 200 spn 207 ACUÜGCAUCACUACCAGAUGGACCUG 637 207 spn 442 AAGAGAAGAACGAGUGUGAGAGUGGAA 638 442 spn 444 GAGAAGAACGAGUGOGAGAGUGGAAAG 639 444 spn 657 GCAAGAGGGGAGAGÜGGAAUUCCAUGU 640 657 Streptococcus pyogenes spy 173 ACCGCAÜAAGAGAGACÜAACGCAUG 641 173 spy 440 GUUAGAGAAGAAUGAUGGUGGGAGDG 642 440 spy 469 AUCCACCAAGüGACGGUAACUAACCA- GAA 643 469 spy 1029 UCGGUACAUCGGUGACAGGUGGUGC 644 1029 Streptococcus salivarius ssa 208 AÜUGCUCCACÜACAAGAÜGGACCÜG 645 208 ssa 608 ÄGGCUGOGGCUCAACCAUAGOUCGC 646 608 ssa 835 GAUCCUÜÜCCGGGAÜÜCAGÜGCCGC 647 835 ssa 1240 GGUUGGUACÄACGAGUUGCGAGUCG 648 1240 ssa 1249 AACGAGUÜGCGAGUCGGUGACGGCAAG 649 1249 Streptococcus suis ssu 478 UUGACGGUAUCUÜACCAGAAAGGGACG 650 478 ssu 573 AGCGAGCGCAGGCGGUUUGAUAAGUCU 651 573 ssu 599 UGAAGUAAAAGGCUGUGGCUUAACC 652 599 ssu 613 GUGGCUÖAACCAUAGUACGCOUUGGA 653 613 ssu 827 AGGUGUUGGGUCCUUUCCGGGACUCA 654 827 ssu 1018 GGGUUÜCUCUUCGGAGCAUCGGUGAC 655 1018 Streptococcus thermophilus sth 193 UUUGAAAGGGGCAAUUGCUCCACUA 656 193 sth 443 AGUCAAGAACGGGUGöGAGAGUGGAA 657 443 sth 470 UUCACACUGUGACGGOAGCUAACCA 658 470 sth 482 CGGUAGCÜAACCAGAAAGGGACGG 659 482 sth 1249 AACGAGUUGCGAGOCGGOGACGGCGA 660 1249 sth 1259 GAGUCGGUGACGGCGAGCUAAÜCOC 661 1259 Streptococcus uberis sub 193 CCOAUOUAAAAGGGGCAAAOGCOUC 662 193 35/218 österreichisches AT 505 849 B1 2010-01-15 Patentamt 36/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli sub 443 AGAGAAGAACGGUÄAUGGGAGUGG 663 443 sub 470 UCCAUUACGUGACGGUAACUAA 664 470 sub 610 GCUGUGGCUUAACCAUAGUUCGCUU 665 610 sub 999 GAUGCCCGCUCUAGAGAUAGAGCOU 666 999 Streptomyces griseus sgr 1264 CGCGAGGCGGAGCGAAUCUCAAAA 667 1264 Torulaspora tor 620 UUUCGUGUACUGGUUUCCAACCGGG 668 620 tor 834 GGGUGGUGUUUUUUUACUGACCCACU 669 834 Vibrio vib 55 UGCAAGUCGAGCGGAAACGAGUUA 670 55 vib 89 AACGAUAACGGCGUCGAGCGGCGGAC 671 89 vib 159 AAACGAUGGCUAAUACCGCAUGAU 672 159 Vibrio chole-rae vch 116 GUAAUGCCUGGGAAAUUGCCCGGUAGAG 673 116 vch 210 GGGCCUUGCGCUACCGGAUAUGCCCA 674 210 vch 435 CUUUCAGUAGGGAGGAAGGUGGUUAAG 675 435 vch 466 UACCUUAAUCAUUUGACGUUACCUAC 676 466 vch 994 CAUCCAGAGAAUCUAGCGGAGACGCU 677 994 Vibrio parahaemolyti- cus vpa 626 GGAAUU GCAUUU GAAACUGGCAGACU 678 626 vpa 1236 CAAUGGCGCAUACAGAGGGCAGCCAA 679 1236 Vibrio vul-nificus vvu 79 AAACUUGUUUCUCGGGUGGCGAGCGG 680 79 vvu 808 GCUGUAAACGAUGUCUACUOGGAGGUU 681 808 Yersinia en-terocolitica yen 81 GUUUACUACUUUGCCGGCGAGCGGCG 682 81 yen 177 CAUAACGUCUUCGGACCAAAGUGG 683 177 yen 208 UCGGGCCUCACGCCAUCGGAUGUGCCCA 684 208 yen 431 AGCACÜOÜCAGCGAGGAGGAAGGC 685 431 yen 1248 CAAAGÖGAAGCGAACUCGCGAGAGCAAG 686 1248 yen 1270 AGCAAGCGGACCACAÜAAAGÜCÜGÜC 687 1270 Zymomonas mo-bilis zmo 623 UCÜGGAACUGCCUUÜGAGACÜGUÜAGA 688 623 zmo 732 GACUUACUGGUCUAUAGUUGACGC 689 732 zmo 1006 GAAAGUGGAGACACAUUCUUUCAGUUC 690 1006 37/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 [00163] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Bestimmung von Euterinfektionen bei milchgebenden Säugetieren, wobei das milchgebende Säugetier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel und Pferd verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren oder eine erfindungsgemäße Oligonukleotid/Nuk-leinsäure kann zur Überwachung von technischen Fermentationen, vorzugsweise bei der Produktion von organischen Substanzen, wie Lebensmittel-Zusatzstoffen, basierend auf Mikroorganismen und/oder zur raschen Kontrolle von sterilen und kontaminationsfreien Bedingungen verwendet werden.
[00164] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Detektion von intrazellulären Bakterien.
[00165] Intrazelluläre Erreger spielen eine bedeutende Rolle in der Humanmedizin als auch in Tierhaltung und somit in der Lebensmittelproduktion und der menschlichen Ernährung. Über Infektionen des Atem- und Genitaltrakts von Nutz- und Haustieren können sie schwerwiegende Erkrankungen wie Lungenentzündungen verursachen.
[00166] Darüber hinaus wurden sie als kontaminierende Keime in Zellkulturen nachgewiesen. Durch deren Vermehrung in der Wirtszelle können sie deren Stoffwechsel beeinflussen. Viele biologische Produkte werden mittels Zellkulturen erzeugt. Eine Infektion der Zelllinie mit intrazellulären Keimen könnte die Produktion beeinflussen und somit die Ausbeute verringern bzw. das Produktionsgleichgewicht zu Gunsten eines anderen Metaboliten verschieben.
[00167] Herkömmliche Bestimmungsmethoden basieren auf einer Anreicherung der intrazellulären Keime bzw. auf molekularen Techniken, wie DNA Fluorochrome Färbung, Immunofluores-zenz-Methoden (z.B. ELISA) oder Polymerase chain reaction (PCR). Alle Methoden sind jedoch mit Nachteilen behaftet: die Kultivierung von intrazellulären Keimen ist, wenn überhaupt möglich, schwierig und dauert sehr lange (4 Tage bis mehrere Wochen). Andere Methoden sind schwierig zu interpretieren und können so zu falschen Ergebnissen führen (DNA Fluorochrome-Färbung). Immunofluoreszenz-Methoden sind nur beschränkt einsetzbar, da Mycoplasmen ähnliche Antigene haben wie Streptococcus milleri und Staphylococcus aureus.
[00168] Andere molekularbiologische Methoden (z.B. PCR) können nur ein eingeschränktes Keimspektrum identifizieren, da Limitierungen durch die Anzahl an Primer gegeben sind.
[00169] Bisherige auf Mikroarrays basierende Methoden zielen lediglich auf eine kleine Gruppe von Mycoplasmen ab. Andere intrazelluläre Keime bzw. Mitglieder der Gattungen Chlamydia und Rickettsia können somit nicht erfasst werden. Allein zur Gattung Mycoplasma zählen über 100 verschiedene Spezies.
[00170] Die hier vorliegende Erfindung kann sowohl andere Gattungen der Mollicutes als auch andere intrazelluläre Keime identifizieren. Des Weiteren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein größeres Spektrum innerhalb der Gattung Mycoplasma bestimmt werden.
[00171] Die Klasse der Mollicutes enthält folgende Ordnungen: Acholeplasmatales, Anae-roplasmatales, Entomoplasmatales, Mycoplasmatales.
[00172] Zur Ordnung Mycoplasmatales werden unter anderem folgende Gattungen gezählt: Mycoplasma und Ureaplasma (Klassifizierung nach J.P. Euzeby - Procaryotic names Standing in nomenclature).
[00173] Die relevanten Spezies und Genera der Mollicutes können mit dieser Sondenanordnung detektiert und identifiziert werden:
Acholeplasma laidlawii Anaeroplasma Borrelia burgdoerferi Borrelia recurrentis
Mycoplasma agalactiae
Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma buccale 38/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Chlamydia pneumoniae Mycoplasma capricolum Chlamydia trachomatis Mycoplasma faucium Chlamydophila abortus Mycoplasma fermentans Chlamydophila pecorum Mycoplasma gallisepticum Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma genitalium Chlamydophila psittaci Mycoplasma hominis Entomoplasma Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma muris Rickettsia akari Mycoplasma mycoides Rickettsia australis Mycoplasma orale Rickettsia conorii Mycoplasma pirum Rickettsia parkeri Mycoplasma pneumoniae Rickettsia prowazekii Mycoplasma primatum Rickettsia rickettsii Mycoplasma putrefaciens Rickettsia sibirica Mycoplasma salivarium Rickettsia typhi Thermoplasma acidophilum Ureaplasmarcum urealyticum [00174] Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Detektion und Bestimmung mindestens eines intrazellulären Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: [00175] a) Bereitstellen einer Probe umfassend eukaryotische oder prokaryotische Zellen, [00176] b) Isolierung von in der Probe enthaltener DNA, [00177] c) Inkontaktbringen der isolierten DNA mit mindestens einer Sonde, die an die amplifi-zierte und markierte DNA des 16S rRNA Gen der isolierten DNA bindet, und mindestens 80 % ident mit einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831 oder deren reverskomplementären Sequenzen, wobei die Sonden an einem festen Träger immobilisiert sind, [00178] d) Feststellen einer Bindung der isolierten DNA an die mindestens eine Sonde, und [00179] e) Detektieren oder Bestimmen eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle B angeführten Mikroorganismen.
[00180] Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung von intrazellulären Mikroorganismen in eukaryotischen bzw. prokaryotischen Zellen, wobei insbesondere die in Tabelle B angeführten Mikroorganismen bestimmt werden können. Mit Hilfe der in Tabelle B angeführten Sonden kann das Vorhandensein von DNA dieser Organismen spezifisch bestimmt werden. Es sei hierbei anzumerken, dass anstelle des Nukleotids U auch das Nukleotid T eingesetzt werden kann.
[00181] Tabelle B: 39/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3 ’) SEQ ID Er. E. coli Acholeplasma laidlawii ala 68 AAGCAUCUUCGGAUGCUUAGUGGCGA 691 68 ala 180 AGGAUGUGUGCAUGAAAAAAACACA 692 180 ala 588 UUAUAAAAGUUUGUGGUGUAAGUGCAG 693 588 ala 621 ACGCUGUGAGGCUAUGAAAACUAÜAU 694 621 Anaeroplasma ana 129 ACCUGUCUUUAAGACGAGGAÖAACCG 695 129 ana 310 CCACAAUGGAACUGAGAACGGUCCAU 696 310 ana 825 CUAAGÜGUUGGUGAÜAÄAUCAGUGC 697 825 ana 991 OGACAUCUAGGUGUOAGUUAUAGAG 698 991 Borrelia burg-doerferi bbu 392 AGCGACACUGCGÜGAAUGAAGAAGGÜ 699 392 bbu 631 UAUGOUGGAAACUAUAUGOCUAGAGU 700 631 bbu 660 AUAGAGGAAGUUAGAAUUOCUGGUGU 701 660 bbu 715 AOACCGGAGGCGAAGGCGAACUUCUGG 702 715 bbu 1012 GAGAUAAUUAUUCCCCGUOOGGGGUC 703 1012 bbu 1132 AUGUAAUGGÜGGGGACUCAGAUAAGA 704 1132 bbu 1284 AUAAAGCAGGUCUCAGUCCGGAUUGAA 705 1284 bbu 1448 CCGUAAGGGAGGAAGGUAUUUAAGGU 706 1448 Borrelia re-currentis bre 210 AAAGCUUUGCOUGUAGAUGAGUCUG 707 210 bre 482 CGÜUAAUOUAUGAAUAAGUCCCGG 708 482 bre 1430 CGAAGCUAUUAUUUUAACCCGCAAG 709 1430 Chlamydia pneumoniae cpn 148 AUAACGGOUGGAAACGAUCGCUAAUA 710 148 cpn 272 AAGGCGAUGACGUCUAGGCGGAUUGA 711 272 cpn 590 AGGAAAGUÜAGAUGÜUAAAÜUÜUGG 712 590 cpn 731 CGCOUOUCUAAOUUAUACCUGACGC 713 731 cpn 844 ACCCCAUCCGUGUCGGAGCUAACGUGUU 714 844 cpn 1007 CUGUAGAAAUACAGCUUUCCGCAAGG 715 1007 Chlamydia trachomatis cta 160 AACGGCCGCUAAUACCGAAUGUGGC- GAUAU 716 160 cta 294 UÜGAGAGAUUGGCCGCCAACACUGGG 717 294 cta 838 GUCOCAACCCCAUCCGUGUCGGAGCU 718 838 cta 973 AAGGACCUUACCUGGGUUUGACAUGU- AUA 719 973 cta 1121 UAGUUGCCAGCACUUAGGGUGGGAAC 720 1121 Chlamydophila abortus cab 266 CCUACCAAGGUUUUGACGUCUAGGC 721 266 40/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezias Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli cab 1542 AACAUGGGAUCUUAAGUUUUAGUCG 722 1542 Chlamydophila pecorum cpe 224 AGAGAAAGUCUGUGGGAUAUCAGCUU 723 224 cpe 648 UUCUAGAGGUUGGAUGGAGAAAAGGG 724 648 Chlamydophila pneumoniae cpn 112 GUUAGUAGUACAUAGAUAAUCUGCC 725 112 cpn 144 GGGGAUAACGGUUGGAAACGAUCGCU 726 144 cpn 267 CCACCAAGGCGAUGACGUCUAGGCGGA 727 267 cpn 648 UUCUAGAGGAUAGAUGGGGAAAAGGG 728 648 cpn 1441 ACUCAACCUAUUUAUAGGAGAGAGG 729 1441 Chlamydophila psittaci cps 834 GAUAGUCUCAACCCUAUCCGUGUCG 730 834 cps 1350 UGGCGUGUCAGCUAUAACGCCGUGA 731 1350 Entomoplasma ent 660 AGAGAGGUAAACGGAAUUCCAUGUGU 732 660 ent 721 GUGGCGAAAGCGGUUUACUGGCU 733 721 Mycoplasma agalactiae mag 180 ACUUAUUAUUUUUGCAUGAAAGUAAU 734 180 mag 425 UUGOAAACUGCUGUGGUUAGGGAAGA 735 425 mag 594 AAGUCUGGCGUUAAAUUUÜGGGGCU 736 594 mag 998 UUCUGCAAAGCUAUGGAGACAUAGUG 737 998 Mycoplasma ar-ginini mar 64 AGCGAGGUUCUUUUGAACCUAGCGG 738 64 mar 463 GAAAUGCUUCCAGGCUGACGGUACC 739 463 mar 987 CUCUUGACAUCCUUCGCAAUGCUAUA 740 987 mar 993 ACAUCCUUCGCAAUGCUAUAGAGAU 741 993 Mycoplasma ar-thritidis mat 429 AAAGU GCU GUUAUAGGGGAAGAACA 742 429 Mycoplasma buccale mbu 150 ACCCAAUGGAAACAUUGGUUAAUGCCG 743 150 mbu 158 GAAACAUUGGUUAAUGCCGGAUACGC 744 158 mbu 694 AAUGCGUAGAUAUAUAUGGAAGAACA 745 694 mbu 823 CAUUAGUCGGUGGAGAAUCACUGACG 746 823 Mycoplasma ca-pricolum mca 59 AGUCGAACGGGGGUGCUUGCACCUCA 747 59 mca 121 ACGUAUCUAACCUACCUUAUAGCGG 748 121 mca 167 GAUAAUACCGCAUGÖAGAUCUUAUU 749 167 mca 193 AUCAAAAGAACCGUUUGGUUCACUAUGA 750 193 mca 225 AGAUGGGGAUGCGGCGUAUUAGCUA 751 225 41 /218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli mca 1108 CAACCCUUGUCGUUAGUUACUAACAU 752 1108 Mycoplasma faucium mfa 150 ACCOAAUGGAAACAUUGGUUAAUGCCGG 753 150 mfa 457 GUUGAGGAAAUGCAACUAAGCÜGACG 754 457 ' mfa 464 AAAÜGCAACUAAGCUGACGGOACCUU- GUUAGA 755 464 mfa 827 AGUCGGUGGGAGCCACUGACGC 756 827 Mycoplasma fermentans mfe 57 CAÜGUCGAGCGAAGGUAGCAAUACCUUA 757 57 mfe 172 ÜUUCAAAUACUCGUAGUUÜÜCGCAUGA 758 172 mfe 215 COUCGCUGGAGGAGCGGGGUGCGUAAC 759 215 mfe 710 GAAGAACACCAAGAÜGGCGAAGGCAG 760 710 Mycoplasma gallisepticum mga 180 AACAAGOUAACUAUCGCAUGAGAAUA 761 180 mga 458 UAGAGUGGAAAGCUAUUAÄUUUGACU 762 458 mga 727 AAGGCGAGGACUUGGGCCAAUACUG 763 727 Mycoplasma ge-nitalium mge 192 AUUAAAGUUGAAAGGACCUGCAAGGGU 764 192 mge 460 CAGGCAAUGGCUGGAGUUUGACUGÜAC 765 460 mge 606 AAAGGCAGCÜGCUUAACAGUUGOAÜG 766 606 mge 834 GGAGCGAUCCCUUCGGUAGUGAAGUU 767 834 mge 1149 UAACGAGACUGCUAAUGUAAAUUGGAG 768 1149 mge 1448 CUUUAÜÜGGÄAGCGCAUGUCAAGGAUAG 769 1448 Mycoplasma hominis mho 56 GCAOGUCGAGCGAGGUUAGCAAUAACC 770 56 mho 464 AAAUGAUUGCAGACUGACGGUACCUU 771 464 mho 823 CAÜÜAGUCGGOGGAGAAUCACUGACG 772 823 mho 1013 AGAUAUAGUGGAGGUUAUCGGAGUGA 773 1013 Mycoplasma hy-orhinis mhy 179 UAUAGUUAUUUAUCGCAUGAUGAGU 774 179 mhy 223 AAAAAUGGGGGUGCGGAACAUUAGUUA 775 223 mhy 286 UAGCCGGGCCGAGAGGCUGUACGGCC 776 286 mhy 617 CUCAACUUCAGUCCGCUUUGGAUAC 777 617 mhy 834 GGAAUAAUUUCACUAACGCAGC 778 834 Mycoplasma mu-ris mmu 170 AAUACCGCAUAGGGCAUUAUUAUCG 779 170 mmu 572 AAGCGAGCGCGGGCGGAUUUGCAAG 780 572 mmu 827 AAAUGUUGGCACGGAAUGUGUCGGUG 781 827 42/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli Mycoplasma my-coides mmy 176 GCAUGÜAGAUCÜÜAUÜAUCGCAUGA 782 176 mmy 627 GUÜCGCCUUGAAAACUGUAÜUACUA 783 627 mmy 1434 GÜAGGUAGCUUAACCGUÜUGGAGAGC 784 1434 Mycoplasma orale mor 68 AAGÜAGCAAUACUUUAGCGGCGAAUGGG 785 68 mor 150 ACCOAAUGGAAACAOÜGGUOAAOGCCG 786 150 mor 452 CAGUOAGUOGAGGAAAUGCUUCUÄAOC 787 452 mor 823 CAÜUAGUCGGOGGAAAACUACUGACG 788 823 Mycoplasma pirum mpi 177 CAUAACAAAUGUACUAUCGCAUGA 789 177 mpi 279 OGACGUGOAGOÜAÜGCÜGAGAGGO 790 279 mpi 457 GCAGAGGAAAOGAOGUUAGUUUGACGG 791 457 mpi 821 GAÖGUUAGAUGUCGGGGUAAACGCCU 792 821 Mycoplasma pneumoniae mpe 192 AUCAAAGUUGAAAGGACCUGCAAGGG 793 192 mpe 448 AGAAÖGACÜUUAGCAGGUAAUGGCÖAG 794 448 mpe 606 AAAGGCAGCOGCOOAACAGUOGOAO 795 606 mpe 993 ACAUCCÖUGGCAAAGÜÜAUGGAAACA 796 993 mpe 1119 GUOAGOUACAUUGUCUAGCGAGACO 797 1119 mpe 1429 UUAÄAAACGUGUUGCUAACCAUUAGGAA 798 1429 Mycoplasma primatum mpr 183 UUAAGAUCGCAUGGUUÜÜAAUAUAA 799 183 mpr 433 UGCUGUGGUOAGGGAAGAAAAAGUAAU- AU 800 433 Mycoplasma pu-trefaciens mpu 455 UAAAGUAGGAAAUGCCUUUAUAUUGAC 801 455 mpu 724 GCGAAAGCGGCÜUACÜGGUÜUGUUA 802 724 mpu 832 UOGGGUGAACUCAGCGCCGCAGCU 803 832 Mycoplasma sa-livarium msa 450 AAAÄAGOAGUUGAGGAAAUGCUUCUAC 804 450 msa 737 ACUGGGÜÜUAUACUGACGCÜGAGGAAC 805 737 msa 821 AUCAÜUAGUCGGCAGAGÄACUGUUG 806 821 Rickettsia akari rak 69 CUGAUUGGGGOUUUCUCCAGUUAGU 807 69 rak 731 CGGOCAUCUGGGCUACGACUGACGC 808 731 rak 825 CUAGAUAUCGGAAGAGUCUCOUOCGG 809 825 Rickettsia rau 78 GGGGUUUACUCUAAUUAGOUAGÜGG 810 78 43/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Er. E. coli australis rau 829 AUAUCGGAAGAUUUUCUUUCGGUUUC 811 829 rau 989 CUUGACAUGGUGGUUGCGGAUCGCAG 812 989 Rickettsia co-norii reo 84 ÜGCUCCAGUUAGUUAGUGGCAGACG 813 84 Rickettsia parkeri rpa 68 ACUAAUUUGGGGCUUGCUCCAAUUAGUU 814 68 rpa 725 CGAÄGGCGGUCGUCUGGGCUACÄA 815 725 Rickettsia prowazekii rpr 68 AÜUAACUAGAGCUCGCUUUAGUUA 816 68 rpr 1023 UUCAGUUCGGCUGGGCCACACACAG 817 1023 Rickettsia rickettsii rri 127 GUCAUCUGGGCUACCACUGACGCUGAU 818 127 rri 984 CAACCCUUGACAUGGUGGUUGCGGA 819 984 Rickettsia si-birica rsi 68 ACUAAUUUGGGGCUUGCUCCAAUUUAG 820 68 rsi 584 GCGGUUUAGUAAGUUGGGAGUGAAAG 821 584 Rickettsia typhi rty 69 ÜUAAUUAGAGCUUGCUCUAGUUAAU 822 69 rty 993 ACAUGGUGGUUAUGGAUUGCAGAGA 823 993 rty 1029 ÜCGGCÜGGGCCACACACAGGOG 824 1029 Thermoplasma acidophilum tac 183 ACAAACUGGAAUGGUUGUAAUGAUG 825 183 tac 624 GAAGAACUUCUGAAGAGACUGUAAG 826 624 tac 866 GUGUUAAGÜGGGUCACUÜGGGGAGU 827 866 tac 1281 CUCGAAACCCGUUCGUAGUCAGGACU 828 1281 Ureaplasma urealyticum uur 602 UAUUAAAUCUAGAUGCUUAACGUCUA 829 602 uur 871 AAAUGAUGUGCCUGGGUAGUACAUUC 830 871 uur 1269 GAUGAAGCGAAACAGAAAAAGUUAGU 831 1269 [00182] Die Isolierung von DNA aus eukaryotischen und prokaryotischen Zellen erfolgt erfin-dungsgemäß nach in der Fachwelt bekannten Verfahren (siehe z.B. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von J. Sambrook and D.W. Russell (3. Auflage, 2001. CSFIL Press, Cold Spring Harbor, NY).
[00183] Nach dem Isolieren der Gesamt-DNA der Zellen wird diese mit den erfindungsgemäßen Sonden, welche auf einem festen Träger immobilisiert sind, in Kontakt gebracht. Dadurch wird der DNA der Zellen ermöglicht, sich unter stringenten Bedingungen an die immobilisierten 44/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Sonden zu binden, sofern die isolierte DNA zu den Sonden komplementär ist. Bindet ein Teil der isolierten DNA an eine Sonde gemäß Tabelle B, zeigt dies auf, dass in der Zelle der gemäß Tabelle B korrespondierende Organismus vorhanden ist.
[00184] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkultur, Biopsiematerial, Abstrichen, insbesondere Vaginal-Abstrichen, bronchoskopischen Abstrichen aus der Gruppe der Nahrungsmittel (z.B. Fleisch, Milch), der Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Speichel, Liquor oder CSF) und der Fermentationslösungen.
[00185] Prinzipiell kann erfindungsgemäß jede Probe verwendet werden, die bekannterweise intrazelluläre Erreger/Mikroorganismen aufweist (Identifizierung der intrazellulären Erreger) oder aber von welcher nicht bekannt ist, ob derartige Erreger/Mikroorganismen in einer Zelle vorhanden sind (qualitative Bestimmung von intrazellulären Erregern). Insbesondere werden jedoch Proben bevorzugt, von denen bekannt ist, dass diese intrazelluläre Erreger/Mikroorganismen aufweisen können.
[00186] Die zu analysierende Probe ist vorzugsweise menschlichen oder tierischen Ursprungs, wobei das Tier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Katze, Hund, Hase, Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel, Schwein und Pferd.
[00187] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können intrazelluläre Mikroorganismen bzw. Erreger in tierischen und menschlichen Zellen nachgewiesen werden. Aufgrund der Spezifität der erfindungsgemäßen Sonden können die Mikroorganismen spezifisch in diesen Proben bestimmt werden.
[00188] Um die Menge an DNA der intrazellulären Mikroorganismen in einer Probe zu vermehren, wird vorzugsweise nach Schritt b) und vor Schritt c) das 16S rRNA -Gen der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik amplifiziert. Derartige Verfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt und können mit jeglicher Art von Primern durchgeführt werden, sofern diese derart ausgewählt werden, dass die Amplifikation es ermöglicht, das 16S rRNA bzw. 18S rRNA-Gen zu vermehren. Primer mit diesen Eigenschaften sind in der Fachwelt ebenfalls bekannt. Vorzugsweise weisen die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 auf.
[00189] Die Detektion der Bindung der isolierten Nukleinsäure bzw. der amplifizierten DNA kann durch Markierung dieser Moleküle mit beispielsweise einem Farbstoff wesentlich erleichtert werden. Dies gilt insbesondere für Verfahren, die auf Mikroarrays basieren. Daher ist die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung (z.B. mit einem Farbstoff) markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff.
[00190] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die isolierte Nukleinsäure mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831.
[00191] Erfindungsgemäß ist es möglich, die isolierte Nukleinsäure bzw. die amplifizierte DNA mit sämtlichen immobilisierten Sonden mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831 in Kontakt zu bringen. Jedoch je nach Bedarf (z.B. Detektion bestimmter Mikroorganismen) können spezifische Sonden aus der Tabelle B ausgewählt und eingesetzt werden.
[00192] Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere gut zur Identifizierung von intrazellulären Keimen in einer Probe durch die Verwendung der in Tabelle B angeführten spezifischen Sonden.
[00193] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Bakterien durch Mustererkennung.
[00194] Die parallele Differenzialdiagnostik von Bakterien im Hochdurchsatz aus verschiedens- 45/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 ten Substraten wurde erst durch die Microarray-Technologie ermöglicht. Hierbei werden für jeden Erreger möglichst spezifische DNA-Sonden verwendet; auf Grund der hohen Sequenzhomologien zwischen Spezies oder sogar Genera ist es vielfach aber nicht in allen Fällen möglich, 100 % spezifische Sonden zu designen. Das resultierende Phänomen nennt man Kreuzhybridisierung und beschreibt ein Signal, das nicht auf Grund einer Hybridisierung des zu detek-tierenden Keims, sondern eines ähnlichen Keims zustande gekommen ist. Wegen dieser Kreuzhybridisierungen ist eine Auswertung der Daten nach einzelnen Erregern und der dazugehörigen Sonden, wie z.B. ROC-Analyse, nicht möglich, die Kreuzhybridisierungen würden hier die Spezifität negativ beeinflussen. Außerdem ist in den Kreuzhybridisierungsmustern wertvolle Information enthalten. Daher ist eine Analysenmethode vonnöten, die - statt den Signalen einzelner Sonden -Signalmuster zur differenziellen Diagnostik verwendet. Eine solche Methode sollte es auch ermöglichen, Mischinfektionen von 2 oder mehreren Erregern korrekt zu detektieren.
[00195] Erfindungsgemäß werden für jeden Erreger mehrere Sonden designt, die möglicherweise unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Nun wird erst für jeden zu detektierenden Erreger eine Anzahl an Hybridisierungen durchgeführt, die genaue Anzahl der nötigen Hybridisierungen hängt von der Ähnlichkeit der zu unterscheidenden Erreger ab. Die Daten dieser Hybridisierungen werden nach geeigneter Vorprozessierung (siehe unten) zusammengefasst und als sogenanntes Trainingsset gespeichert. Das Trainingsset dient dazu, die vorhandenen Muster wiederzuspiegeln. Jede neue Hybridisierung mit einem unbekannten Erreger wird dann anhand von Ähnlichkeiten mit bekannten Hybridisierungen im Trainingsset klassifiziert.
[00196] Die einzelnen Schritte des Verfahrens sind wie folgt: [00197] - Vorprozessierung: Einlesen der Daten, erste Qualitätskontrolle, Zusammenfassen der redundanten Informationen am Chip (z.B. Spot-replikate) [00198] - Normalisierung: Da es sich um ein technisch relativ aufwendiges Verfahren mit vielen unterschiedlichen Laborschritten handelt, und jeder dieser Schritte möglicherweise mit systematischen Fehlern behaftet ist, müssen vor der eigentlichen Klassifizierung diese Fehler korrigiert werden. Dies kann auf 2 verschiedene Arten geschehen: [00199] - Wenn es möglich ist, DNA Sequenzen zu definieren, die in jeder Probe in gleicher Menge vorhanden sein müssen, dann kann man für diese Sequenzen Sonden desi-gnen, und anhand der Signale dieser Sonden die systematischen Fehler korrigieren. Dies kann z.B. auch durch spiking entsprechender Sequenzen in das Probenmaterial erfolgen.
[00200] - Wenn es nicht möglich ist, solche Sequenzen zu definieren, und wenn spiking z.B. aus logistischen Gründen nicht möglich ist, dann kann man die Daten durch rangbasierte Verfahren, wie z.B. die Quantil-Normalisierung, normalisieren.
[00201] Erstellen und Validieren des Klassifiers: Anhand des Trainingssets muss ein geeigneter Algorithmus gefunden werden, mit dem die Ähnlichkeiten einer unbekannten Hybridisierung mit den Hybridisierungen des Trainingssets definiert werden können. Dieser Klassifikator kann dann in einem Kreuzvalidierungsverfahren validiert werden. In vorangegangenen Experimenten hat sich ein k-Nearest Neighbor Verfahren als geeignet erwiesen. Allerdings ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, Mehrfachinfektionen in einer einzelnen Probe zu identifizieren. Daher wird zur Detektion von multiplen Erregern ein anderes Verfahren, der Nearest Ceontroid Algorithmus, eingesetzt. Mit diesem Algorithmus soll es möglich sein, aus dem Hybridisierungsmuster einer mehr-Erreger-Hybridisierung und dem Wissen der Clusterzentren der zugehörigen ein-Erreger-Hybridisierung (aus dem Trainingsset) auf die Einzelerreger rückzuschliessen. (Dempster A et al. Journal of the Royal Statistical Society, Series B, 39(1):1-38,1977; Ripley, B. D. (1996) Pattern Recognition and Neural Networks, Cambridge; Boistad, B. M. (2003) Bioin-formatics 19(2), pp 185-193). Hastie, T. et al., J. (2001) The elements of Statistical Learning; Data Mining, Interference and Prediction (Springer, New York).
[00202] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Mikroarray umfassend ein Substrat und mindestens eine Sonde, die mindestens 80 % ident ist mit einer Nukleinsäure- 46/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmenten davon und deren reverskomplementären Sequenzen.
[00203] Ein Mikroarray (allgemein auch als Genchip, DNA-Chip oder Biochip bekannt) ist eine Sammlung von mikroskopischen DNA-Spots, die an einer festen Oberfläche, wie Glas, Kunststoff oder einem Siliziumchip, angebracht sind und einen Array zum Zweck der Expressionsprofilierung bilden, der die Niveaus (Levels) für eine große Anzahl von amplifizierten Nukleinsäuren gleichzeitig überwacht. Mikroarrays können unter Verwendung unterschiedlicher Technologien hergestellt werden, so unter anderem durch Drucken mittels Nadeln mit feinen Spitzen auf Glas-Trägern (Südes), Photolithographie unter Verwendung von vorgefertigten Masken, Photolithographie unter Verwendung von dynamischen Mikrospiegeleinrichtungen, Tintelstrahldrucken oder Elektrochemie auf Mikroelektroden-Arrays. Der erfindungsgemäße Mikroarray kann eine Vielzahl von verschiedenen oder aber auch identen Sonden aufweisen. Daher ist ein Mikroarray in der Lage eine Vielzahl von Nukleinsäuren an der Oberfläche eines Arrays (Substrats) zu binden.
[00204] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind am Mikroarray mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 30, noch mehr bevorzugt mindestens 50, Sonden gebunden.
[00205] Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher dargelegt, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
[00206] Fig. 1 zeigt ein Agarose Gel nach der Elektrophorese der PCR-Produkte.
[00207] Fig. 2 zeigt Hybridisierungsversuche von gelabellten PCR-Produkten.
[00208] Fig. 3 zeigt zwei Beispiele für die graphische Auswertung eines Scan-Bildes nach Fig. 2. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
[00209] Fig. 4 zeigt drei graphische Auswertung von Scan-Bildern von Versuchen zur Belegung der Funktionalität der Paralleldetektion von zwei Keimen in einer Probe. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
[00210] Fig. 5 zeigt eine Heatmap der Wiederholungen von Parallelbestimmungen von zwei Erregern aus einer Probe zur Belegung der Reproduzierbarkeit der Paralleldetektion von zwei Keimen in einer Probe. Des Weiteren werden die Muster von Einzelhybridisierungen mit jenen von,Doppelhybridisierungen verglichen.
[00211] Fig. 6 zeigt Hybridisierungsversuche von gelabellten PCR-Produkten basierend auf DNA isoliert von intrazellulären Keimen.
[00212] Fig. 7 zeigt ein Beispiel für die graphische Auswertung eines Scan-Bildes nach Fig. 6. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
BEISPIELE
[00213] Beispiel 1: Bestimmen von Mikroorganismen in Proben, insbesondere in Lebensmittelproben: [00214] 1.1. Lebensmittel [00215] 1.1.1. Milch [00216] - Isolation der Mikroorganismen und DNA-Isolation [00217] - Entnehmen einer Probe mit geeignetem Volumen (10 ml) [00218] - Zentrifugation der Vollmilch bei 5000 g für 10 min [00219] - Überstand (wässrige und fettige Schicht) abheben und verwerfen 47/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 [00220] - Resuspension des Pellets in 10 ml physiologischem Phosphat-Buffer [00221] - Filtration durch einen 5 pm Spritzenvorsatz-Filter.
[00222] - Zentrifugation des Filtrats bei 5000 g für 5 min.
[00223] - Überstand verwerfen [00224] - Pellet in 100 μΙ destilliertem Wasser resuspendieren [00225] - Zellaufschluss mittels Enzym-Mix (Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K) unter Einhaltung der Arbeitsanleitungen des Herstellers und anschließendem Koch-Protokoll (95° C, 15 min) [00226] - Zentrifugation des Zell-Lysats bei 10.000 g für 10 min [00227] - Reinigen der DNA Suspension mit einem Reinigungs.-Kit (Invisorb oder Roche DNA-Aufreinigung) [00228] 1.1.2. Milchprodukte [00229] 1.1.2.1. Joghurt, Sauermilch [00230] - Probe mit Wasser verdünnen, vortexen und Zentrifugation bei 5000 g/5 min [00231] - Überstand verwerfen, Pellet mit dest. Wasser resuspendieren., [00232] - Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade.
[00233] 1.1.2 2. Käse [00234] - Probenstücke fein zerkleinern und in 1xPBS suspendieren.
[00235] - Extraktion der Inhaltsstoffe des Rohproduktes [00236] - Mikroorganismen mittels Zentrifugation pelletieren [00237] - Überstand verwerfen, Pellet mit dest. Wasser resuspendieren.
[00238] - Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade.
[00239] 1.1.2. Fleischprodukte [00240] - Oberflächenkulturen werden durch Abstreifen der oberflächlichen, viskosen Flüssigkeit mit einer Impföse geerntet.
[00241] - Abstrich in 1xPBS suspendieren [00242] - Zentrifugation bei 5000 g/5 min [00243] - Überstand verwerfen und Pellet mit dest. Wasser resuspendieren.
[00244] - Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade.
[00245] - Ganze Gewebestücke [00246] - Proben aus innerliegendem Gewebe werden an unterschiedlichen Stellen ausgestochen, mechanisch zerkleinert (z.B. French Press), vermengt und in ein Reaktionsgefäß überführt.
[00247] - Aufschluss von Muskelzellen mittels enzymatischen Verdau (z.B. Trypsin in HCI-Buffer nach der Anweisung des Herstellers) und wenn notwendig durch den Einsatz detergen-ter/chaotroper Substanzen.
[00248] - Verdünnen des Fleischextrakts mit 10 ml physiologischem Phosphatbuffer.
[00249] - Zentrifugation 5000 g/5 min [00250] - Überstand verwerfen, [00251] - Pellet reinigen mit 10 ml TE - Buffer, pH 8 (10 mM Tris, 1 mM EDTA) 48/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [00252] - Zentrifugation 5000 g/5 min [00253] - Überstand verwerfen und Pellet in 100 μΙ destilliertem Wasser resuspendieren.
[00254] - Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade.
[00255] 1.1.3. Pflanzliche Produkte [00256] - siehe Aufbereitung von Käse [00257] - Verwendung der isolierten DNA -Suspension für die PCR.
[00258] Beispiel 2: Bestimmen von Mikroorganismen in humanmedizinischen Proben und auch in veterinärmedizinischen Proben [00259] 2.1. Mastits, veterinärmedizinische Infektionskrankheiten: [00260] - Arthritis [00261] - Pneumonie [00262] - Septikämie [00263] - Endokarditis [00264] Probengewinnung und Isolierungsprotokolle für die oben angeführten Infektionskrankheiten sind nach Verordnungen und den Vorschriften des österreichischen Veterinärgesetzes durchzuführen.
[00265] Zellaufschluss und DNA-Isolierung: Mikroorganismen-Suspension auf 95^ für 15 min erhitzen, zentrifugieren (10000 g/10 min) und Überstand in neues Eppendorf überführen. Diese DNA-Suspension dient als Vorlage für die PCR Reaktion.
[00266] Beispiel 3: Molekularbiologische Methoden zur Amplifizierung, Labelling und Hybridisierung von DNA
[00267] 3.1. DNA-Amplifizierung durch PCR-Reaktion: 25μΙ Primer FW 16S (SEQ ID Nr. 832) 0,5 Primer Rev 16S (SEQ ID Nr. 833) 0,5 Primer FW 18S (SEQ ID Nr. 834) 0,5 Primer Rev 18S (SEQ ID Nr. 835) 0,5 10x Taq Puffer 2,5 dNTP-Mix 2 MgCI2 1,5 Taq-Polymerase 0,25 Betain 1,25 Glycerin 2,5 H20 12 24 [00268] Durch Variation der Wassermenge kann auch die Menge der eingesetzten DNA- 49/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Suspension variiert werden. Durch Zusatz von markierten Nukleotiden (6 nmol Cy5-dCTP (Amersham Biosciences, UK)) oder Verwendung von markierten Primern (0,3 nM Cy3 5'end labelled Primer) kann das Labelling bereits während der ersten PCR erfolgen.
[00269] Sequenz des 16S rRNA- Primer F27: 5'-T AATACG ACT CACT A-T AG AGAGTTT GAT -CMTGGCTCAG (SEQ ID Nr. 832) [00270] Sequenz des 16S rRNA- Primer R1492: 5'- TACGGYTACCTTGTTAC-GACTT (0,3 nM in PCR mixture) (Gutenberger et al., 1991) (SEQ ID Nr. 833) [00271] 18S FW Primer: 5'- TCCGCAGGTTCACCTAC (SEQ ID Nr. 834) [00272] 18S Rev Primer: 5'- CAAGTCTGGTGC CAGCA (White et al., 1990) (SEQ ID Nr. 835).
[00273] Weitere Konzentrationen der Zusätze: 3 U Taq DNA Polymerase (Invitrogen, California), 2,5 pL 10x PCR-Puffer, 2 mM MgCI2; 10 % Glycerin and 0,5 % Betain.
[00274] PCR-Zyklen: Denaturierung bei 95° C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen auf 95°C für 30 sec, 55° C für 1 min, und 72°C für 1 min. Temperatur-Zyklen wurden mit 72° C für 10 min beendet, mit abschließender Lagerung bei 4°C.
[00275] 3.2. Markierung (Labelling): [00276] Im Falle eines 2-Schritt-Labellings wird in einer 2ten Reaktion ein markiertes Nukleotid in das PCR-Produkt eingebaut. Zu diesen Methoden zählen: Primer Extension, in vitro Transkription, Biotin-Streptavidin-Labelling, Isothermal Klenow Fragment basiertes Labelling. In diesem Protokoll wird die Primer Extension näher beschrieben: [00277] 1 Ansatz pL Primer FW16S (SEQ ID Nr. 832) 1,5 Primer Rev 18S (SEQ ID Nr. 835) 1,5 dNTP's 0,125 10x Vent-Puffer 2,5 MgS04 0,25 H20 12,335 Cy3-dCTP 0, 04 Vent-Polymerase 0,75 19 [00278] 6 μΙ PCR-Produkt wurden in den Reaktions-Mix zugegeben. Dieser bestand aus 0,9 mM Forward Primer 27, 1,5 U Vent (exo) Polymerase (New England Biolabs, Ipswich), 3 mM MgS04 und 50 μΜ von dATP, dGTP, dTTP, dCTP und 25 μΜ Cy5-dCTP. Folgende Temperatur-Zyklen wurden angewandt: 25x für jeweils 20 Sekunden auf 95°C, 60° C und 72° C erhitzen, gefolgt von einer abschließenden Vervollständigung partieller Sequenzen bei 72 °C für 5 Minuten.
[00279] 3.3. Markierungsfreie (Labelfreie) Detektion: [00280] Die hier beschriebenen Sondenkombinationen mit der dazugehörigen statistischen Auswertung mittels Pattern recognition sin prinzipiell auch mit Methoden anwendbar, welche keine markierten Nukleotide einsetzen. Diese sind z.B. Surface Plasmon Resonance (SPR) 50/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 oder Messung von Potenzial-Veränderungen an der Oberfläche von Goldbeschichtungen aufgrund von Hybridisierungs-Ereignissen.
[00281] 3.4. Hybridisierung [00282] Vor der Hybridisierung wurde die Oberfläche der bespotteten Mikroarrays mit einem Blockier-Puffer (Cyanoborhydride Puffer: 20 mM Na2HP04,10 mM NaH2P04, 200 mM NaCI, 50 mM NaBH3CN) für 30 min bei Raumtemperatur behandelt.
[00283] Die Hybridisierungs-Lösung mit den markierten DNA-Sequenzen wurde auf eine Endkonzentration von 4x SSC, 0,1% SDS in 24 μΙ Suspension eingestellt. 22 μΙ dieser Lösung wurden auf einen DNA-Chip übertragen und mit einem Glas-Plättchen abgedeckt. Die Hybridisierung wurde bei 65° C für 1 Stunde in einer wasserdampfgesättigten Kammer durchgeführt. Die Arrays wurden in 2x SSC und 0,1 % SDS für 5 min, gefolgt von 0,2 x SSC für 2 min und 0,1 x SSC für 1 Minute gewaschen. Die Arrays wurden durch eine 2-minütige Zentrifugation bei 900g getrocknet.
[00284] 3.5. Signal Erfassung und Daten-Analyse [00285] Die Arrays wurden mit einer Auflösung von 10 pm mit einem Axon Genepix 4000A microarray Scanner (Axon, Union City, California) gescannt. Signal-Intensitäten wurden mit der speziellen Microarray-Image Analysen-Software (GenePix) errechnet. Die ermittelten Werte dienen als Ausgangsdaten für weitere statistische Auswertungen.
[00286] Beispiel 4: Bakterien-Nachweis und Identifizierung aus gespikter, roher Vollmilch [00287] Material und Methoden [00288] - Bakterien ansetzen in 3 ml Caso-Bouillon und Inkubation über Nacht bei 37° C am Schüttelinkubator.
[00289] - Spezies 1: Staph. aureus [00290] - Spezies 2: E. coli [00291] - Spezies 3: Pseudomonas aeruginosa [00292] - Bakterien ernten durch Zentrifugation bei 3000 g für 5 min. Überstand verwerfen und das Pellet zweimal mit 1 ml 1x PBS waschen und Zentrifugation bei 3000 g für 5 min.
[00293] Einstellung der Bakterien-Dichte mit McFarland-Standard # 0,5: Photometrische Messung der Standardlösung (Wellenlänge = 625 nm) und Vergleich der Messwerte mit den Bakte-rien-Suspensionen. Verdünnung der Lösung, bis die gleiche Extinktion wie mit der Standardlösung gemessen wird. Dies entspricht einer Konzentration von 108 Bakterien pro mL.
[00294] Transfer von 10® Bakterien in neues Eppendorf und Zugabe von 1 mL unbehandelter Vollmilch.
[00295] Isolierung der Bakterien und deren DNA aus der gespikten Vollmilch inkl. Vergleich von 5 verschiedenen Methoden: [00296] -1. M 1: * Zentrifugation der Vollmilch bei 10000 g für 5 min
[00297] -1. Überstand verwerfen und Resuspension des Pellets in 1 ml 1xPBS
[00298] - 2. Zentrifugation 10000 g für 5 min [00299] - Zweimalige Wiederholung des Reinigungsschrittes [00300] - Überstand verwerfen und Pellet in 100 pL mQ H20 resuspendieren [00301] - Zellaufschluss: Kochprotokoll => 95° C; 15 min [00302] - 6. Zentrifugation 12000 g für 10 min
[00303] - 7. Überstand ist bereit für die PCR 51 /218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [00304] - M 2: wie Methode 1, jedoch mit einer zusätzlichen Aufreinigung nach dem Zellaufschluss [00305] - M 3: wie Methode 1, jedoch Zellaufschluss mittels Generation-Säulchen der Firma Gentra. (Elutionsvolumen: 50 μι) [00306] - M 4: wie Methode 1, jedoch mit Durchführung eines zusätzlichen Filtrationsschritts (hydrophil, Porengröße: 5 pm) der Bakterien-Suspension vor dem Zellaufschluss.
[00307] - M 5: Filtration des gespikten Vollbluts. Weitere Verfahrensschritte wie bei Methode 1.
[00308] - Ansetzen der PCR mit 1 μΙ_ des Zell-Lysats [00309] - DNA-Amplifizierung durch PCR-Reaktion: 25μ1
Primer FW 16S 0,5 Primer Rev 16S 0,5 Primer FW 18S 0,5 Primer Rev 18S 0,5 lOx Taq Puffer 2,5 dNTP-Mix 2 MgCl2 1,5 Taq-Polymerase 0,25 Betain 1,25 Glycerol 2,5 H20 12 24
LABELLING MITTELS PRIMER EXTENSION 1 Ansatz Primer FW 16S 1,5 Primer Rev 18S 1,5 dNTP's 0,125 lOx Vent-Puffer 2,5 MgS04 0,25 H20 12,335 Cy3-dCTP 0,04 Vent-Polymerase 0,75 52/218 19 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 [00310] - 6 μΙ PCR Produkt wurden in den Reaktions-Mix zugegeben.
[00311] Blockieren der Mikroarrays: Behandlung mit Blockier-Puffer (Cyanoborhydrid Puffer: 20 mM Na2H P04, 10 mM NaH2P04, 200 mM NaCI, 50 mM NaBH3CN) für 30 min bei Raumtemperatur.
[00312] Hybridisierung: markierte DNA-Sequenzen wurden auf eine Endkonzentration von 4x SSC, 0,1 % SDS in 24 μΙ Suspension eingestellt. 22 μΙ dieser Lösung wurden auf einen DNA-Chip übertragen und mit einem Glas-Plättchen abgedeckt. Die Hybridisierung wurde bei 65° C für 1 Stunde in einer Wasserdampf-gesättigten Kammer durchgeführt.
[00313] - Waschen: Die Arrays wurden in 2x SSC und 0,1 % SDS für 5 min, gefolgt von 0,2 x SSC für 2 min und 0,1 x SSC für 1 Minute gewaschen. Die Arrays wurden durch eine 2-minütige Zentrifugation bei 900g getrocknet.
[00314] - Signal-Erfassung und Daten-Analyse: Einscannen mit einer Auflösung von 10 pm (Axon Genepix 4000A microarray Scanner (Axon, Union City, California)). Signal-Intensitäten wurden mit der speziellen Microarray-Image Analyse Software (GenePix) errechnet. Die ermittelten Werte dienen als Ausgangsdaten für weitere statistische Auswertungen.
ERGEBNISSE
[00315] Zellaufschluss und DNA-Konzentration in Zell-Lysat:
Probe Keim Methode 260/280 Konz, ng/μΐ 1 LL1 rk 2,7 19,8 2 EC2 2,24 77,2 3 PAl 2,14 50,2 4 neg.Kontrolle Μ 1 0,67 19,2 5 LL1 1,25 28,1 6 EC2 1,75 24,9 7 PA1 1,25 53,8 8 LL1 M 2 1,41 3,6 9 EC2 +Invlsorb 1,28 5 10 PAl 1,52 4,6 11 LL1 M 3 1,8 41 12 EC2 + Gentra 1,83 16 13 PAl 2,01 16,5 14 neg.Kontrolle M 4 2,6 0,5 15 LL1 5um vZA 1,26 1 16 EC2 1,79 9 17 PAl 0,68 1,1 18 LL1 M 5 1,16 2,6 19 EC2 5 um vM 1,19 40,4 20 PAl 1,5 19,9 [00316] Auszählung der Agar-Platten der Kontroll-Ausstriche nach den jeweiligen Arbeitsschritten: 53/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 __Lactoc.lactis E. coli
Methode 1: fettiger Überstand nach 1. Zentri unzählbar unzählbar
Methode 5: " - 300 350
Methode 1: Überstand nach 2. Zentri 27 ~ 500 Methode 5: fl 43 49 Methode 1: Überstand nach 3. Zentri 29 400 Methode 5: fl 16 103 Methode 1: Suspension vor Zellaufschl. 1/10 ~ 1300 unzählbar Methode 5: 1« 120 unzählbar [00317] Ein Agarose Gel nach der Elektrophorese der PCR-Produkte ist in Fig. 1 dargestellt. Die Hybridisierungsversuche von gelabellten PCR-Produkten werden in Fig. 2 illustriert. Fig. 3 zeigt ein Beispiel für die graphische Auswertung eines Scan-Bildes. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
INTERPRETATION
[00318] Durch die Zugabe einer bestimmten Menge von Bakterien zu unbehandelter Vollmilch wurde das klinische Syndrom einer bovinen Mastitis simuliert. Die verschiedenen Abtrennungsmethoden zur Isolierung von Bakterien bzw. deren DNA aus der natürlichen Probenmatrix zeigten - aufgrund der Auswertung mittels Kontroll-Ausstrichen, Messung der DNA-Konzentra-tion und Evaluierung mittels PCR - verschiedene Effizienzen. Die Messung der DNA-Konzentra-tion im Zell-Lysat ergab, dass die Filtration mit einem δμιτι Filter vor dem Zellaufschluss eine effiziente Auftrennung von Bakterien und bovinen Zellen erzielen konnte. Der Zellaufschluss mittels Generation-Säulchen von Gentra führte zu einer hohen Reinheit der DNA-Suspension (gemessen am Verhältnis der Extinktionen von 260 und 280 nm). Anhand dieser Methode konnte mittels PCR die effizienteste Amplifizierung erlangt werden.
[00319] Anschließendes Labelleln und Hybridisieren sämtlicher PCR-Produkte zeigte deutlich, dass speziell erstellte Oligonukleotid-Sonden sehr gut für die Detektion von Mikroben aus Milch geeignet sind. Durch charakteristische Signale bzw. Signalmuster von spezifischen Sonden konnte eine eindeutige Identifizierung der Erreger sogar auf Spezies-Ebene erzielt werden.
[00320] Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Methode geeignet ist, Bakterien aus einer Mischung von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen zu isolieren und deren DNA in einer qualitativ hochwertigen Form zu gewinnen, um damit eine molekularbiologische Detektion durchzuführen.
[00321] Beispiel eines typischen Spotmusters eines spezifischen Mikroarrays mit einer definierten Auswahl an Sonden (hier dargestellt: Mastitis-Chip-2): 54/218 AT505 849B1 2010-01-15 österreichisches
Patentamt pK1 saul sau 2 sau 3 sxyl sxy3 sxy6 sxy8 sxy10 S12 Stl 4 stl 5 shy 1 shy 3 Stp 2 stp 5 Stp 6 sag 2 sag 3 sag4 sdy1 sdy3 sdy5 sub1 sub2 sub5 kpn2 kpn3 kpn4 kox1 kox2 ecol eco2 ecl 1 ecl 3 ecl 4 eag1 eag3 sag 5 eae1 eae 3 eae 5 psa1 psa3 psa5 psa6 esa 1 esa 3 esa 6 cm dl 4 cam 2 cam 5 lla 3 apy1 apy2 apy3 myc 5 myc 10 myc 15 mca1 mca3 mca4 mybl rnyb 2 myb 6 nas1 nas4 nas 6 cbo1 cbo3 lla 1 lla 2 Ila4 lla 5 lla 6 bce2 bce4 bce5 cpe2 cpe4 cpeT can 1 can 2 call cal 2 cal 3 cal 1 cgi 3 cgi 5 cpal cpa2 csa1 csa3 drl rgl 1 rgl 4 aftj 1 aftj 2 afti 4 pzol pzo 2 pzo 3 pzo 4 Icr 1 Icr 2 mlyl mly4 Rival Riva3 tno2 Ir» 5 km 9 pK1 [00322] Beispiel 5: Identifizierung von intrazellulären Keimen [00323] Für die Detektion und Identifizierung von intrazellulärer DNA aus einer Probe mit einem sehr hohen Anteil an Hintergrund DNA wurde eine gespikte Probe generiert. In einer wäßrigen Lösung wurden 100 ng/μΙ an eukaryotischer DNA vorgelegt und mit 1 ng/μΙ intrazellulärer DNA vermischt. In diesem Beispiel wurde DNA von den Keimen Mycoplasma bovis, M. pneumoniae und Rickettsia rickettsii verwendet.
[00324] Die Durchführung der DNA Amplifikation als auch die Markierung und Hybridisierung erfolgten wie oben angegeben. Anhand des ausgewählten Sonden-Panels war eine eindeutige Identifizierung der DNA von intrazellulären Keimen möglich. Es wurden nur äußerst schwache Kreuzhybridisierungen detektiert, sodass die Anwendung der Mustererkennung basierend auf der Nearest Centroid Methode eine automatisierte Identifizierung zuläßt.
[00325] Siehe Fig. 6 und 7 [00326] Beispiel 6: Mustererkennung zur Bakterienidentifizierung [00327] 4.1. Problematik: [00328] Die parallele Differenzialdiagnostik von Bakterien im Hochdurchsatz aus verschiedensten Substraten wurde erst durch die Microarray-Technologie ermöglicht. Hierbei werden für jeden Erreger möglichst spezifische DNA-Sonden verwendet; auf Grund der hohen Sequenzhomologien zwischen Spezies oder sogar Genera ist es vielfach aber nicht möglich, 100 % spezifische Sonden zu designen. Das resultierende Phänomen nennt man Kreuzhybridisierung, und beschreibt ein Signal, das nicht auf Grund einer Hybridisierung des zu detektierenden Keims, sondern eines ähnlichen Keims zustande gekommen ist. Wegen dieser Kreuzhybridisierungen ist eine Auswertung der Daten nach einzelnen Erregern und der dazugehörigen Sonden wie z.B. ROC-Analyse, nicht möglich, die Kreuzhybridisierungen würden hier die Spezifität negativ beeinflussen. Außerdem ist in den Kreuzhybridisierungsmustern wertvolle Information enthalten. Daher ist eine Analysenmethode vonnöten, die - statt der Signale einzelner Sonden -Signalmuster zur differenziellen Diagnostik verwendet. Eine solche Methode sollte es auch ermöglichen, Mischinfektionen von 2 oder mehreren Erregern korrekt zu detektieren.
[00329] 4.2. Lösung [00330] Im hier geoffenbarten Ansatz werden für jeden Erreger mehrere Sonden designt, die möglicherweise unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Nun wird erst für jeden zu detektierenden Erreger eine Anzahl an Hybridisierungen durchgeführt, die genaue Anzahl der nötigen Hybridisierungen hängt von der Ähnlichkeit der zu unterscheidenden Erreger ab. Die Daten dieser Hybridisierungen werden nach geeigneter Vorprozessierung (siehe unten) zusammengefasst und als sogenanntes Trainingsset gespeichert. Das Trainingsset dient dazu, die vorhandenen Muster wiederzuspiegeln. Jede neue Hybridisierung mit einem unbekannten Erreger wird dann anhand von Ähnlichkeiten mit bekannten Hybridisierungen im Trainingsset klassifiziert.
[00331] Die einzelnen Schritte des Verfahrens sind wie folgt: [00332] - Vorprozessierung: Einlesen der Daten, erste Qualitätskontrolle, Zusammenfassen der redundanten Informationen am Chip (z.B. Spot-replikate) 55/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 [00333] - Normalisierung: Da es sich um ein technisch relativ aufwendiges Verfahren mit vielen unterschiedlichen Laborschritten handelt, und jeder dieser Schritte möglicherweise mit systematischen Fehlern behaftet ist, müssen vor der eigentlichen Klassifizierung diese Fehler korrigiert werden. Dies kann auf 2 verschiedene Arten geschehen: [00334] Wenn es möglich ist, DNA Sequenzen zu definieren, die in jeder Probe in gleicher Menge vorhanden sein müssen, dann kann man für diese Sequenzen Sonden designen, und anhand der Signale dieser Sonden die systematischen Fehler korrigieren. Dies kann z.B. auch durch spiking entsprechender Sequenzen in das Probenmaterial erfolgen.
[00335] Wenn es nicht möglich ist, solche Sequnzen zu definieren, und wenn spiking z.B. aus logistischen Gründen nicht möglich ist, dann kann man die Daten durch rangbasierte Verfahren, wie z.B. die Quantil-Normalisie-rung, normalisieren.
[00336] Erstellen und Validieren des Klassifiers: Anhand des Trainingssets muss nun ein geeigneter Algorithmus gefunden werden, mit dem die Ähnlichkeiten einer unbekannten Hybridisierung mit den Hybridisierungen des Trainingssets definiert werden können. Dieser Klassifikator kann dann in einem Kreuzvalidierungsverfahren validiert werden. In vorangegangenen Experimenten hat sich ein k-Nearest Neighbor Verfahren als geeignet erwiesen. Allerdings ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, Mehrfachinfektionen in einer einzelnen Probe zu identifizieren. Daher wird zur Detektion von multiplen Erregern ein anderes Verfahren, der Nearest centroid-Algorithmus, eingesetzt. Mit diesem Algorithmus soll es möglich sein, aus dem Hybridisierungsmuster einer mehr-Erreger-Hybridisierung und dem Wissen der Clusterzentren der zugehörigen ein-Erreger-Hybridisierung (aus dem Trainingsset) auf die Einzelerreger rückzuschließen.
[00337] Beispiel 7: Identifizierung von mehreren Keimen in einer Probe basierend auf Microar-ray Ergebnissen und Nearest Centroid Classification [00338] Eine Spezies-Identifizierung durch Interpretation von komplexen Hybridisierungsmustern erlaubt die korrekte Klassifizierung von eng verwandten Spezies und Genera. Die Anwendung von kNN Klassifizierung erlaubte bereits eine 100 %ige Zuordnung von Stämmen zu einer bestimmten Gattung.
[00339] Mit der Nearest Centroid Klassifizierung ist eine automatisierte Identifizierung von zumindest 2 verschiedenen Mikroben-Spezies großteils möglich. Dies erfolgt lediglich auf Basis eines Training-Sets bestehend aus Daten von Einzel-Keim-Hybridisierungen.
[00340] Methode [00341] Datensätze [00342] Es wurden zwei Datensätze angelegt: [00343] 1., Hybridisierungs-Daten von Einzel-Spezies Nachweis (insg. 43) [00344] 2., Daten von parallelen Zwei-Spezies Nachweisen (39 Hybrid.) [00345] Die Hybridisierungen mit einer Spezies dienten als Trainings-Set und die Daten von den Hybridisierungen von 2 Spezies in einer Probe dienten als Test-Daten. Die folgende Anzahl an Hybridisierungen für jeden Keim bzw. Keimkombinationen wurde herangezogen:
Spezies Anzahl Hybridisierung Klebsiella oxytoca 4 Escherichia coli 5 Staphylococcus aureus 8 Enterococcus faecalis 6 Campylobacter coli 2 56/218 AT505 849B1 2010-01-15 österreichisches
Patentamt
Enterobacter aerogenes 5 Staphylococcus epidermidis 8 Pseudomonas aeruginosa 2 Enterococcus faecium 3
Spezies 1 Spezies 2 Anzahl Hybridisierung Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis 5 Enterococcus faecium Staphylococcus epidermidis 6 Campylobacter coli Staphylococcus aureus 4 Enterobacter aerogenes Enterococcus faecium 4 Escherichia coli Staphylococcus aureus 7 Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium 5 Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium 5 Campylobacter coli Staphylococcus aureus 2 Enterobacter aerogenes Enterococcus faecium 1 [00346] Bildung eines Classifiers von Einzel-Spezies Daten: [00347] Die Daten der Einzel-Spezies Hybridisierungen wurden in "R" als gpr-files eingelesen und mittels Quantilen-Normalisierung standardisiert. Die spezifischen Sonden wurden mittels der pamr Funktion (nearest shrunken centroid) definiert und stellten das Panel des Datensatzes dar, von denen die Schwerpunkte (Centroids) für jede Spezies kalkuliert wurden. Danach wurden die theoretischen Centroide der multiplen-Keim-Proben durch paarweise Addition der Centroide der gereihten Einzel-Spezies-Hybridisierungen kalkuliert.
[00348] Klassifizierung von Multiplen-Spezies Datensätze: [00349] Zwei-Spezies Hybridisierungen wurden gemeinsam mit dem Classifier eingelesen und eine Quantilen Normalisierung durchgeführt. Die Klassifizierung wurde durch eine Kalkulation der Distanzen in und zu den Test-Hybridisierungen und dem Auswahlen des nächst-gelegenen Centroids erreicht.
[00350] Ergebnisse: [00351] Vor der Klassifizierung der Zwei-Spezies-Hybridisierungen wurde der Classifier mit den Daten der Einzel-Hybridisierungen getestet. Alle Hybridisierungen wurden korrekt klassifiziert und somit die Spezies richtig identifiziert.
[00352] Bei den Zwei-Spezies-Hybridisierungen wurden folgende Identifizierungen erhalten: 57/218 AT505 849 B1 2010-01-15 österreichisches
Patentamt
Spezies 1 Spezies 2 Erkannt als : Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus aureus.Enterococcus faecium Campylobacter coli Staphylococcus aureus Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus. -Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium 58/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
Spezies 1 Spezies 2 Erkannt als : Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium Escherichia coli Staphyiococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphyiococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterococcus faecium Pseudomonas aerugino- Enterococcus faecium Pseudomonas 59/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
Spezies 1 Spezies 2 Bekannt als : sa aeruginosa .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis.Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis.Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis.Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis [00353] - In allen Fällen wurde zumindest eine Spezies korrekt identifiziert, sowohl auf Generaais auch auf Spezies-Ebene [00354] - In 82 % der Fälle wurden beide Genera korrekt identifiziert und 79 % der Spezies [00355] - In 92 % der Fälle wurde eine Genera richtig erkannt, während die andere Genera falsch zugeordnet wurde. (90 % auf Spezies-Ebene) [00356] - In 90 % der Fälle wurde ein Genera richtig detektiert, während die andere nicht detek-tiert wurde. (Gleiches Ergebnis auf Spezies-Ebene) [00357] Folgende Misklassifizierungen wurden erhalten: [00358]
Gattung 1 Spezies 1 Gattung 2 Spezies 2 Automatisiert erkannt als Klebsi oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faeca- 60/218 AT505 849 B1 2010-01-15 österreichisches
Patentamt ella lis.Enterobacter aeroge-nes Klebsi ella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis. Enterobacter aeroge-nes Klebsi ella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis. Enterobacter aeroge-nes Klebsi ella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Entero- coccus faecium Staphylococ- cus epidermidis Staphylococcus aureus. Enterococcus faecium Campy- lobac- ter coli Staphylococ- cus aureus Campylobacter coli Entero bacter aeroge- nes Enterococcus faecium Enterococcus faecium Esche richia coli Staphylococ- cus aureus Staphylococcus aureus.
[00359] Die meisten Fehlzuordnungen wurden durch die Kombination von K. oxytoca und E. faecalis verursacht. Der Grund konnte noch nicht geklärt werden. 61 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15
<110> wiesinger-Mayr, Herbert <120> verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen <130> R 48812 <160> 852 <170> Patentin version 3.4 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 1 aatgcctggg aaattgccca gtcgag 26 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 2 27 aattgcccag tcgaggggga taacagt <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 3 gggccttgcg cgattggata tgccca 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 4 26 tgcgcgattg gatatgccca ggtggg <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 5 gaagagcttg ctctttggtg gcgag 25 62/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pritner/Probe <400> 6
<210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 7 ttggggttta ttaaccttag tagcgc 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 8 27 tggtcgggac agagggttgc caagccg <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 9 tgctgacggt atctgcagaa taag 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 10 ttttaactgc cgagctagag tatgtca 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 63/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 11 tgggataata ctgacgctca gacac 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 12 atgtcaacta gctgttgggg ccgtta 26 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 13 aacggtaacg ggccttcggg tgccg 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 14 acgcatcgga acgtgcccag tggtgg 26 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe .i ΛΛ. Λ P J.J aaaccgcttt ttgtcaaggg aagga 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40Q> 16 aactggttgt tgggtgggtt tctac 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 64/218 <220>
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01 <223> Primer/Probe <400> 17 25 ccggatattc tgcttttgcc gcatg <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 18 agtacagaag aagcattttt gtgac 25 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 19 acactgcgat gtgccagaga tggtgca 27 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 20 cagcatgttg tggtggggac tcacgg 26 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 21 gcgatctact ggaacaatat tgacgct 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 22 tgacatagta agaatgattt agagata
<210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 27
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 23 tagtgtctgc ttgcagaaac ttgcat 26 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 24 acagaagtta ataagggaaa gatttat 27 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 25 gagacttgat cttgcagtaa tgcagt 26 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 26 taaacagact gcctacgcaa gtaggagg 28 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 27 aagtcgaacg atgatccggt gcttgc 26 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 28 acatggaccg gaccgccgca gaaatgtg 28 <210> 29 <211> 26 66/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 29 aaatgtggtt tctccttttg gggccg 26 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 30 gatcgggcgg tgtttctatg atga 24 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 31 gaatggctcg gtgaggcctt egg 23 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <22 3> Primer/Probe <400> 32 aggggagttg gcaacgactc cc 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <22 3> Primer/Probe <400> 33 caacgactcc ccagagccgg 20 <?10t> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 34 aagtcgagcg aatggattaa gagc 24 67/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 35 25 tggattaaga gcttgctctt atgaa <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 36 cttgctctta tgaagttagc ggcgga 26 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 37 aataccggat aacattttga ac 22 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 38 accaggtctt gacatcctct gaaaac 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 39 atagggcttc tccttcggga gcagag 26 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 40 acctgcccgc aagaccggga taactcc 27 68/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 41 ccggataaca ccgaagaccg catggt 26 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 27 <400> 42 gaatactaag tgttagaggg gtcacac <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 43 cctgacaacc caagagattg ggcgtt 26 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 44 gacagatggg agcttgctcc ct <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 45 ctccctgatg ttagcggcgg acggg <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 69/218 25
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 26 <400> 46 ggttgtttga accgcatggt tcaaac <210> 47 <211> 24 <212> DNA <21B> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 47 ttcaaacata aaaggtggct tcgg 24 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 48 ttcggctacc acttacagat ggacc 25 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 49 gaggttaagc caatcccaca aatct 25 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 50 gatccatcaa gcttgcttgg tggtga 26 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 51 atcgcatgtg attgtgggaa agattc 26 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 70/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 52 ggacgctgga tgtggggcac gttcca 26 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 53 ggggcacgtt ccacgtgttc cgtgt 25 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 54 gacatgttcc cgacgacgcc agaga 25 <210> 55 <21I> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 55 aacccggctc cgtgaaggcg gagtc 25 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 56 ccagttgatc gcatggtctt ctggga 26 <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 57 ctgggaaagc tttcgcggta tgggatgg
<210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 71 /218 28
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 58 27 ccaccgtggc ttcgacgggt agccggc <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 59 tacaacggga tgcgacgcgg cgacgcg 27 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 60 gacgcggcga cgcggagcgg atccc 25 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 61 ggggggcatt ccacgttctc cgcgc 25 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 62 25 tggaaacagg tcctcttctt tgaag <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 63 agagagaggc gaacccgtga gggcaa 26 <210> 64 <211> 25 72/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 64 aagccgacag cttgctgttg gtgga 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 65 25 ccctgatttc gggataagcc tggga <210> 66 <2U> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 66 acactggacc gttctggaaa cagttctt 28 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <4Q0> 67 agagagaggc gaacccgtga gggtaa 26 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 68 26 cctgatgcag cgacgcagcg tgcggg <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 69 cgtgcagtgg gtacgggctg actaga 26 73/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 70 ggcgaaggcg ggactctggg ctgtaa 26 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 71 tcatgccctt tatgtcttgg gcttca 26 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 25 <400> 72 tcgtagtctg caattcgact acgtg <210> 73 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 73 cttttgaagt tagtggcgga cgggtga 27 <210> 74 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 74 tcataagatg ttcaagtgaa agacggt 27 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 75 acatgggtga gagtaactgt tcacc 74/218 25
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 76 <213> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 76 gtcttgacat cctttgacca ttctggag 28 <210> 77 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 77 gtggagccaa tcccataaaa ttattctca 29 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 78 gtttggtaac cttcgggagc tagccgt 27 <210> 79 <211> 25' <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 79 ggaacgtacc atttgctacg gaata 25 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 80 ggaagtcttg agtatggtag aggtg <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 75/218 25 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 81 gttagccgtc ggggtgttta cacttcg 27 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 82 gtcggggtgt ttacacttcg gtggc 25 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 83 gtgtttacac ttcggtggcg cagct 25 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220>
Dr*T mar* /ΟγλΚλ niv. i / I i voc <400> 84 26 catcccggtc gcggttagtg gagaca <210> 85 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> Primer/Probe ,νΐΊ. <400> 85 ttagtggaga cactatcctt cagttag <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 86 aacgtaccat ttgctacgga ataact 26 <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 76/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 87 gttagccgtc ggggtgttta cacttc 26 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 88 gggtgtttac acttcggtgg cgcag 25 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 89 atcccggtcg cggttagtgg agacact 27 <210> 90 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 90 ttagtggaga cactatcctt cagttag 27 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 91 taacacaagt tgagtaggga aagt 24 <210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 92 ttttgtgaaa tctaatggct taaccatt 28 <210> 93 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 77/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 93 gttgttgctc tgctagtcag ggc 23 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 94 ttttagagat aagagggtgc tagctt 26 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 95 ctaatactct atactcctgc ttaaca 26 <210> 96 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 96 cttaacacaa gttgagtagg gaaagt 26 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 97 tttcttaggg aagaattctg acg 23 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 98 ctaatggctt aaccattaaa c 21 <210> 99 <211> 27 78/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 99 ctgggcttga tatcctaaga accttat 27 <210> 100 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 100 ttatagagat atgagggtgc tagctt 26 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 101 acgtatttag ttgctaacgg ttcgg 25 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 102 tggtaatcta gagtggggga gaggca 26 <-2105- 10¾ <211> 29 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 103 tatttagttg ctaacacttc gggtgagca 29 ^71 fW M. ma XV~I <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi dal <220> <223> Primer/Probe <400> 104 catgcttaaa atcccgactg tttgga 79/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 105 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 105 27 gatcggttgt tgttctttta ttgacgc <210> 106 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 106 tcttttattg acgcaatcgg cacctt 26 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 107 ttgggcttgg ctggccggtc catcttt 27 <210> 108 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 108 catctttttg atgcgtactg gacccag 27 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 109 ggtagccatt tatggcgaac caggact 27 <210> 110 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <22Q> <223> Primer/Probe <400> 110 aaatcaatgt cttcggactt tttgat 26 80/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> 27 <223> Primer/Probe <400> 111 cgattttttc gtgtactgga atgcacc <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 112 ccaagtcctt gtggcttggc ggcga 25 <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 113
Cgggtggtgt ttttttagtg accca 25 <210> 114 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 114 ggtgctagca tttgctggtt gtccac 26 <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al
<220> <223> Primer/Probe <400> 115 catctttttt gatgcgtact ggaccca <210> 116 <211> 29 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe 81 /218 27
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 116 29 gagcctttcc ttctggctag cctttttgg <210> 117 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 117 tttccttctg gctagccttt ttggcgaac 29 <210> 118 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 118 agccggtccg ccttttggtg agtact 26 <210> 119 <211> 26 <212> DNA <213> Arti f·i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 119 aacctttctt tcggggaagg cgaacc 26 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 120 ccgccttttg gtgagtactg gatcta 26 <210> 121 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 121 gattagggat cggttgttgt tctttaat 28 <210> 122 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial 82/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 122 tgttgttctt taattgacgc cattgggc 28 <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 123 ctttttggcg agtactgacc ctgcc 25 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 124 aaactcacca ggtcagggaa actca 25 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 125 actagctttt gctggtgctg acgct 25 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 126 acgaagttga aaagcttgct tttcga 26 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 127 tgaccgcatg gtcgcttgat gaaagg 26 <210> 128 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial 83/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 128 28 atggtcgctt gatgaaaggt ggcttcgg <210> 129 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 129 atggtacaac gagtcgcgaa gtcgtgag 28 <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 130 acgagtcgcg aagtcgtgag gccaagc 27 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 131 aggaagcagc ttgctgcttt gct 23 <210> 132 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 132 cttgctgctt tgctgacgag tggcgg 26 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 133 cataatgtcg caagaccaaa gaggg 25 <210> 134 <211> 30 84/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 134 aggaaggggt taaggttaat aaccttagcc 30 <210> 135 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 135 accttagcca ttgacgttac ccgcag 26 <210> 136 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 136 ttagccattg acgttacccg cagaag 26 <210> 137 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 137 tcgaaactgg caggcttgag tctcgta 27 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 138 aagtcgaacg gtagcacaga ggagct 26 <210> 139 <211> 30 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 139 gaacggtagc acagaggagc ttgctccttg 85/218 30 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 140 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 140 agaggagctt gctccttggg tgacgagt 28 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 141 atgtctggga aactgcccga tg 22 <210> 142 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 142 atgcaagtcg agcgatgaag cttcct 26 <210> 143 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 143 ttcgggaagt ggattagcgg cggacg 26 <210> 144 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 144 cgggaagtgg attagcggcg gacgggtg 28 <210> 145 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 145 ggatatctag agtgcaggag aggaaa 26 86/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 146 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 146 caattaaagg agtaatccgc tatgagatg 29 <210> 147 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 147 tgtaggggtt gtcatgacct ctgtgc 26 <210> 148 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 148 catctcctga attactctgt aatgga 26 <210> 149 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 149 cgagagtgag caaaactata aaacc 25 <210> 150 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 150 tacccaaagt tcgtgagcta accgcaa 27 <210> 151 <211> 25 <212> DNA <213> Arti ficial <220> <223> Primer/Probe 87/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 151 25 aagttgagcg atttacttcg gtaaa <210> 152 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 152 ctaccctgta cacacggata acata 25 <210> 153 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 153 atcaaaggtg agccagtaca ggatg 25 <210> 154 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 154 caatgacatc tccttaatcg gagagtt 27 <210> 155 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 155 cttgacatct cctgaattac tcgtaa 26 <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 156 gttagttgct actattaagt taagca 26 <210> 157 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial 88/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/probe <400> 157 tcgagcgatg aagtttcctt cggg 24 <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 158 gaaagatggc atcatcattc aacc 24 <210> 159 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 159 gctctgtctt tggggaagat aatga 25 <210> 160 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 160 aggcggatga ttaagtggga tgtga 25 <210> 161 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 161 cggatgatta agtgggatgt gaaatacc 28 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <223> Primer/probe <400> 162 aggtgtgggg gtttcaacac ctccg 25 <210> 163 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 89/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 163 25 acatcccttg cattactctt aatcg <210> 164 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 164 atgcccctta tgtgtagggc tacacac 27 <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 165 aaagttaagg tttcgcatga aactt 25 <210> 166 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 166 ggtgaaatgc gtagaggatt aggaag 26 <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 167 tgtaactgac gcagaggcac gaaagcgt 28 <210> 168 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 168 atgagactgc ctgggtgaac caggagg 27 <210> 169 <211> 26 90/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 169 aataccggat aggaccgtgc tttagt 26 <210> 170 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 170 cggcagggac gaagcttttg tgac 24 <210> 171 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 171 ctgggcttga catgggcagg accggc 26 <210> 172 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 172 aggaccggcg tggagacacg tcttc 25 <210> 173 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 173 ggttgcgatg ccgcgaggct cagcta 26 <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 174 ccctgcactt tgggataagc ttgg 24 91 /218 <220> <223> Primer/Probe <400> 180 ctctttcgct agggacgaag cttttgt <210> 175 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 175 tttgcggtgt gggatgagcc tgcggcct <210> 176 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 176 actcctttcg ctatcgacga agccact <210> 177 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 177 tgtagggggc ttccacgtct tctgtg <210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 178 gcttgacatg taccggattg ggcta <210> 179 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 179 aacggaaagg cctagcttgc taggta <210> 180 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 180 ctctttcgct agggacgaag cttttgt österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 181 <211> 2? <212> DNA <2B> Artificial <220> <223> Primar/Probe <400> 181 tcggcgtagt gatacgtttt cccttot 2? <210> <211> <212> <213> 182 25 DNA Artificial <22ö> <223> Pri mer/Profae <40ö> 182 tcgaacggca gcgcggggag cttgct 26 <21Ö> <211> <212> <2 U> 183 26 DNA Artificial Λ Λ {-•J· ’·-·Λ hJ· ’r^> U> O V V pri mer/Probe <40ö> .183 ggtggggaag aaattctcaa gggtaa 26 <2lö> <2ll> <212> <213> 184 26 DNA Artificial <?20> <22 3> Pri mer/Probe <400> 184 gtaatatcct xgggcgttga cgttac 26 <210> <2..11> <212> <213> 185 26 DNA Arti ficial <220> <223> Primer/Probe
<400> 18S cgtaggtgga tatttaagtie ggatgt 26 <21ö> <211> <212> <213> <22Ö> 186 25 DNA Arti fi ci äl <223> priffler/probe 93/218
österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <400> 186 25 ctgttgggaa gttcacttct tagta <210> 187 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 187 tcggaacttg tcagagatga tttggt 26 <210> 188 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 188 tgcctgtttg agtgtcatga aa 22 <210> 189 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 189 catgcctgtt tgagtgtcat gaaaa 25 <210> 190 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 190 catgcctgtt tgagtgtcat gaaa 24 <210> 191 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 191 gcttttcgga gctctttgat gatte 25 <210> 192 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 94/218 <220>
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01 <223> Primer/probe <400> 192 26 gttggccggt ccgccttttt ggcgag <210> 193 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 193 ccgccttttt ggcgagtact ggaccc 26 <210> 194 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 194 accgagcctt tccttctggc taacctttcg 30 <210> 195 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 195 tccttctggc taacctttcg ccct 24 <210> 196 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <22Q> <223> Primer/Probe <400> 196 agtactttca gcgaggagga aggcgttaa 29 <210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 197 agcgaggagg aaggcgttaa gg 22 <210> 198 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 198 aaggcgttaa ggttaataac cttggc 26 <210> 199 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 199 aataaccttg gcgattgacg ttactcg 27 <210> 200 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 200 cttggcgatt gacgttactc gcaga 25 <210> 201 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 201 cctgggaact gcattggaaa ctggca 26 <210> 202 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/Probe <400> 202 ccctaaacga tgtcgacttg gaggtt 26 <210> 203 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 203 ggccttgaca tccacggaat ttggca 26 <210> 204 <211> 22 96/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 204 acggtgaata cgggcccggg cc 22 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 205 aatacgggcc cgggccttgt aca 23 <210> 206 <2ii> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <2 2 3> Pri me r/P robe <400> 206 tgacatccac ggaatttggc agagat 26 <210> 207 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 207 ccttcgggag ggcgcttacc tctttg 26 <210> 208 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 208 cgaacggtag cacagagagc ttgctctcg 29 <210> 9AQ L.\/^ <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 209 agagagcttg ctctcgggtg acgagtgg 97/218 t> österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <21Q> 210 <211> 25 <212> DNA <21B> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 210 ctctcgggtg acgagtggcg gacgg 25 <210> 211 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 211 actgcattcg aaactggcag gctggag 27 <210> 212 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 212 taacagggag cagcttgctg ctctg 25 <210> 213 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 213 ggtgttgtgg ttaataaccg cagcaat 27 <210> 214 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 214 cacgcaggcg gttgattaag tcagat 26 <210> 215 <211> 27 c212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 215 catttgaaac tggtcagctt gagtctc 27 98/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 216 23 ggtcagcttg agtctcgtag agg <210> 217 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 217 ctggtcttga catccagaga atcctgca 28 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 218 caccggagct tgctccaccg 20 <210> 219 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 219 cgcttttgcg tcactgatgg at 22 <210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 220 gcgtcactga tggatggacc cgc 23 <210> 221 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 99/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 221 26 ccaccgaaag aaaaggagtg gcgaac <210> 222 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 222 gaaagaaaag gagtggcgaa cgggtga 27 <210> 223 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 223 atggtttcgg tttgaaaggc gcttttg 27 <210> 224 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 224 caaggatgag agtagaatgt tcatcc 26 <210> 225 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 225 aagtcgtacg cttctttttc caccg 25 <210> 226 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 226 aatcgaaacc gcatggtttt gattt 25 <210> 227 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 100/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 227 aactgttcat cccttgacgg tatcta 26 <210> 228 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 228 aaagcttctc tcagttcgga ttgta 25 <210> 229 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 229 gttgttagag aagaacaagg acgtta 26 <210> 230 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 230 gagaagaaca aggacgttag taact 25 <210> 231 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 231 cctgacggta tctaaccaga aagccacg 28 <210> 232 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 232 cttctttttc caccggagct tgctcc 26 <210> 233 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 101 /218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 233 26 ttgaaaggcg ctttcgggtg tcgctg <210> 234 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 234 ttcgggtgtc gctgatggat ggaccc 26 <210> 235 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 235 aactgttcat cccttgacgg tatcta 26 <210> 236 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 236 aatgggaagt acaacgagtt gcgaagt 27 <210> 237 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 237 agagaatgtt catcccttga cggtatcta 29 <210> 238 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 238 aatgttcatc ccttgacggt atctaacca 29 <210> 239 <211> 26 102/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Primer/Probe <400> 239 ccttcagtgc tgcagcaaac gcatta 26 <210> 240 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 240 atgggaagta caacgagttg cgaagt 26 <210> 241 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 241 ttgcgaagtc gcgaggctaa gctaat 26 <210> 242 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 242 tggcaagctt gagtctcgta gagggg 26 <210> 243 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 243 aaagtacttt cagcggggag gaagggagta aa 32 <210> 244 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 244 aggaagggag taaagttaat acctttg 27 103/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 245 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 245 28 cctttgctca ttgacgttac ccgcagaa <210> 246 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 246 gggaactgca tctgatactg gcaagcttga g 31 <210> 247 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 247 tggcaagctt gagtctcgta gagggg 26 <210> 248 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 248 aactagaata tgtagtgtag cggtga 26 <210> 249 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 249 aaatcatcac ggcccttacg ccttg 25 <210> 250 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 250 gtcgcagatg gatgagcctg cgttgg 26 104/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <210> 251 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 251 ctcaaggtta atagccttgg gggag 25 <210> 252 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 252 acggtagagg aatggggaat ttctggt 27 <210> 253 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 253 agctgttgga gtcggtgtaa aggctc 26 <210> 254 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 254 tgagactgcc gctgacaagg cggagg 26 <210> 255 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 255 gcgaaggcgg caacctggct cgatac 26 <210> 256 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 105/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 256 26 taacttagtt actcagtgtc gaagct <210> 257 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 257 gacttgcatg gggaggacgt actcaga 27 <210> 258 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 258 actcagagat gggtatttct tcggacc 27 <210> 259 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 259 ggcgacatgg tgctgatctc taaaagc 27 <210> 260 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 260 gggaggaccg gttcagagat ggacct 26 <210> 261 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 261 ggtgacatgg tgctgatctc taaaagc 27 <210> 262 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial 106/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 262 ggggtaatgg ctcacctagg cgacgatctc t 31 <210> 263 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 263 cggttgatta agtcagatgt gaaatc 26 <210> 264 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 264 tttgaaactg gtcagctaga gtcttg 26 <210> 265 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 265 atgtgcctct tagtttggga tagcc 25 <210> 266 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <22Q> <223> Primer/Probe <400> 266 ttatcgctaa gagatcagcc tatgtc 26 <210> 267 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 267 gtaggcggga tagtcagtca ggtgtga 27 <210> 268 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 107/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 268 27 agggcttagt ctctccagta atgcagc <210> 269 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 269 gcttgacatt gagagaatcc gctaga 26 <210> 270 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 270 ctaaattggc tactgcccac ggcacac 27 <210> 271 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 271 gcaagtcgag cggtagcaca gagagctt 28 <210> 272 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <4Q0> 272 gagcttgctc tcgggtgacg agcgg 25 <210> 273 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 273 tgggggacct tcgggcctca tgccatc 27 <210> 274 <211> 25 108/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 274 ctcatgccat cagatgtgcc cagat 25 <210> 275 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 275 tgctctcggg tgacgagtgg cggacggg 28 <210> 276 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 276 attcgaaact ggcaggctgg agtcttgt 28 <210> 277 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 277 caggctggag tcttgtagag gggggta 27 <210> 278 <21i> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 278 cgaaggcggc tctctggtct gcaact 26 <210> 279 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 279 ggtttccgcc tctcagtgct gc 22 109/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 280 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 280 cctaccaagg caatgatgca tagccgagt 29 <210> 281 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 281 ctggccttta tttgacggta atcaacc 27 <210> 282 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> mn μ /nmmUn π iiiici / rruuc 26 <400> 282 gcatcatgat ttagatctaa gtgagt <210> 283 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 283 aagatggttt tgctatctct tctgg 25 <210> 284 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 284 gaagtgcttc gaaaactggt gaact 25 <210> 285 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 285 gacataccat gaaaagctaa gagat 25 110/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <210> 286 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 286 cggtggggta acccttcggg gaact 25 <210> 287 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 287 cagaaggtgc ttgcactgga agttg 25 <210> 288 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 288 taccgcataa aagttgagat cacat 25 <210> 289 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 289 gaacagggac tagagtaact gttagt 26 <210> 290 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 290 gtaacctctt tgaggagcta gccgtc <210> 291 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 111 /218 26
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 291 24 aacgagcttc cgttgaatga cgtg <210> 292 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 292 cgtgggaaat ctgcccagaa gcag 24 <210> 293 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 293 cctttgagag taactgttca agggtt 26 <210> 294 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 294 cggtgagata accttcggga gtcag 25 <210> 295 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 295 gcatggttct tggctgaaag atggc 25 <210> 296 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> c223> Primer/Probe <400> 296 gttgttggag aagaatggtc ggcag 25 <210> 297 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 112/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 297 atggtcggca gagtaactgt tgtcgg 26 <210> 298 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 298 aactgttgtc ggcgtgacgg tatcca 26 <210> 299 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 299 aggtcttgac atcttttgat cacctg 26 <210> 300 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 300 gtaacccttt tagggagcga geegt 25 <210> 301 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <223> Primer/Probe <400> 301 26 aeegaagetg cttgcagtgg acgttg <210> 302 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 302 accgcataac cattcagacc acatg 25 <210> 303 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 113/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <22B> Primer/Probe <400> 303 26 actgttagtc ctttgacggt atccaa <210> 304 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 304 actctcgtta gattgaagaa gc 22 <210> 305 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 305 gattgataac atttgagtga gtggc 25 <210> 306 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 306 tttgatagta actgatcagg tagtgacg 28 <210> 307 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 307 aagtcgagcg agctgaattc aaagat 26 <210> 308 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 308 ataccggata acaacatgaa tcgcat 26 <210> 309 <211> 25 114/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 309 catgattcaa gtttgaaagg cggcg 25 y*)1Av 31Λ iv^ J XV <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 310 gttgttggtg aagaaggata gaggcagt 28 <210> 311 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 311 taaagcgagc gcaggcggaa tgataag 27 <210> 312 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 312 gagggtaagc ggatctctta aagctg 26 <210> 313 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 313 aaccatcctg aagattgaag cttgct 26 <210> 314 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 314 ctactttcac atgatcgtag cttgaa 26 115/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 315 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 315 ttgttcgcat gaacaacgct taaa 24 <210> 316 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 316 tggcttctcg ctatcacttc tggatg 26 <210> 317 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 317 gacggtattt aaccagaaag tcacgg 26 <210> 318 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 318 aataccggat aagaaagcag atcgca 26 <210> 319 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 319 aagcgagcgc aggcggaaga ataag 25 <210> 320 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 320 aactgcatcg gaaactgttt ttcttg 26 116/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 321 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 321 aagcgaatct ctgaaagctg ttctc 25 <210> 322 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 322 gcaagtcgaa cgcgtttccg ttattg 26 <210> 323 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 323 aatgatttaa cacgaaacga gtggcga 27 <210> 324 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 324 ggtaacctgc ccttgaagta ggggat 26 <210> 325 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 325 cacatggttt tggtttaaaa gatggct 27 <210> 326 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 117/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 326 29 acaggtgtca gagtaactgt tgacatctt <210> 327 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 327 catcatgatt tacatttgag tgagtg 26 <210> 328 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 328 cataacaact tggaccgcat ggtcc 25 <210> 329 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 329 atctgagagt aactgttcag gtattg 26 <210> 330 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 330 tcaggtattg acggtattta accaga 26 <21Q> 331 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 331 atgcaagtcg tacgcactgg cccaac 26 <210> 332 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 118/218 <220>
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/probe <400> 332 taccgcataa caacaaaagc cgcatg 26
<210> 333 <211> 26 <212> DNA <213> Art i fi d al <220> <223> Primer/Probe <400> 333 atggctttgg ctatcactct gggatg 26 <210> 334 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 334 agcgagcgca ggcggttgct taggte 26 <210> 335 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 335 tcttgacatc ttgegetaae ettaga 26 <210> 336 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 336 aaegagttet gattattgaa ag 22 <210> 337 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 337 attgaaaggt gettgeatet tgattt 26 <210> 338 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 119/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 338 27 agaatggtcg gcagagtaac tgttgtc <210> 339 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 339 caagtcttga catcttttga tcacctg 27 <210> 340 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 340 gagcttgctc ctcattgata aacat 25 <210> 341 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 341 gataaacatt tgagtgagtg gcggacgg 28 <210> 342 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 342 gcatggtgta gggttgaaag atggtt 26 <210> 343 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 343 gttgttggag aagaatgtat ctgata 26 <210> 344 <211> 25 120/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 344 actgatcagg tagtgacggt atcca 25 <210> 345 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 345 agttgagcga tgaagattgg tgcttgc 27 <210> 346 <2U> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 346 aataccgcat aacaacttta aacataag 28 <210> 347 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 347 aaacataagt tttaagtttg aaagatgc 28 <210> 348 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 348 tgaaggttgg tacttgtacc gactgga 27 <210> 349 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 349 gtacttgtac cgactggatg agcagcga 28 121/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 350 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> 27 <223> Primer/Probe <400> 350 cgactggatg agcagcgaac gggtgag <210> 351 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 351 aaaactctgt tggtagagaa gaacgtt 27 <210> 352 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 352 aacgttggtg agagtggaaa gctc 24 <210> 353 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 353 actacccaga aagggacggc taacta 26 <210> 354 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 354 gcgagcgcag gtggtttatt aagtct 26 <210> 355 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 355 ttgtatgcat tggaaactgg tagac 25 122/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 356 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> 27 <223> Primer/Probe <400> 356 ttqggagtac ccgaagtagg ttgccta <210> 357 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 357 tgttggaaag atttatcggt tttgga 26 <210> 358 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 358 tgtcgtgaaa gtccggggct taacc 25 <210> 359 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 359 gcttaacccc ggatctgcgg tgggt 25 <210> 360 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 360 accattccac ggtttccgcg ccgcag 26 <210> 361 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 123/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 361 25 gcttgacatg ttctcgatcg ccgta <210> 362 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 362 gagatacggt ttcccctttg gggcg 25 <210> 363 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 363 cagcatgtga tggtggggac tctaag 26 <210> 364 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 364 tacagagggc ggcgaagggg cgacct 26 <210> 365 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 365 gagtgttgta gaggtaagtg gaactc 26 <210> 366 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 366 tgttgtagag gtaagtggaa ctcca 25 <210> 367 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 124/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 367 acgagttgcc aacctgcgaa ggtgag 26 <210> 368 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 368 ctcttaaagt acgtctcagt tcggact 27 <210> 369 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 369 ataaaactta gtatcgcatg atacaaa 27 <210> 370 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 370 gtgtgtgatg aaggctttag ggtcgt 26 <210> 371 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 371 gaagaaatgc tagaataggg aatgat 26 <210> 372 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 372 ttctagagat agaagtgttc tcttcgg 27 <210> 373 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 125/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 373 25 gtgcttgcac ctttcaagtg agtgg <210> 374 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 374 gacaacctgc ctcaaggctg gggataa 27 <210> 375 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 375 taaaacttag tgtcgcatga cacaaa 26 <210> 376 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 376 taaagcactg ttgtatggga agaacagct 29 <210> 377 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 377 tttgacggta ccataccaga aagggacg 28 <210> 378 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 378 gagatagaag tgttctcttc ggagac 26 <210> 379 <211> 26 126/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 379 cgaacgaacg gaggaagagc ttgctc 26 <210> 380 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 380 gcctgtaagt tggggataac tccgg 25 <210> 381 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 381 aagtactgtt gttagagaag aacaag 26 <210> 382 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 382 ctaataccga atgataagta gtgacg 26 <210> 383 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 383 ataagtagtg acgcatgtca tcacttt 27 <210> 384 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 384 gaacgaacgg aggaagagct tgctc 25 127/218 t> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 385 <211> 26 <212> DNA <213> Arti f'i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 385 acggaggaag agcttgctct tccaaa 26 <210> 386 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 386 gcctgtaagt tggggataac tccgg 25 <210> 387 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 387 gcttttgaaa gatggtttcg gctatcgc 28 <210> 388 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 388 atggtttcgg ctatcgctta caga 24 <210> 389 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 389 tttcggctat cgcttacaga tgggcc 26 <210> 390
^111. *5C
S£.1X/ L\J <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 390 gatcgtaaag tactgttgtt agagaa 26 128/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 391 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> priiner/probe <400> 391 ctgcttgtcc cttgacggta tctaa 25 <210> 392 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 392 attggaaact ggaagactgg agtgca 26 <210> 393 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 393 cactctggag acagagcttt n-<_tt <210> 394 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 394 ctaaagtgac tgccggtgca agcc 24 <210> 395 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 395 ctaataccga atgataagga gtgacgc <210> 396 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe
Primer/Probe 129/218 27
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 396 25 gataaggagt gacgcatgtc actgc <210> 397 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 397 atggaatact gccggggtca actcgg 26 <210> 398 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 398 tcaactcgga ggaaggtgag gatgac 26 <210> 399 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 399 aatgggctgc aataccgcaa ggtgga 26 <210> 400 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 400 gtgaagcaga gcttgctctg tggatc 26 <210> 401 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 401 gaaggcatct tcagcagctg gaaag 25 <210> 402 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 130/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 402 tcttcagcag ctggaaagaa tttcgg 26 <210> 403 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 403 agaatttcgg tcagggatga gctcg 25 <210> 404 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> primer/probe <400> 404 gcccttgact ctgggataag ccttgg 26 <210> 405 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 405 cgcatggtgg gtgttggaaa gaattt 26 <210> 406 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 406 tgccgtgaaa gtccggggct taact 25 <210> 407 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 407 gcttaactcc ggatctgcgg tggg 24 <210> 408 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial 131 /218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 408 22 aaagccaagt ttcacatgga at <210> 409 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 409 cttgacatcc cctgaataac ctaga 25 <210> 410 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 410 agccaaactc aaaaactgct ctca 24 <210> 411 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 411 gtagtctaac gtaagaggac gcgg 24 <210> 412 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 412 aaggcttgac atacaccgga ccggtcc 27 <210> 413 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 413 gatcttcccc cttgtggggc tggtgtaca 29 <210> 414 <211> 27 132/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 414 tcggatcgtg gtctgcaact cgaccac 27 <210> 415 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 415 cgaccacgtg aagtcggagt cgctag 26 <210> 416 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 416 ctcttcggag gtactcgagt ggcgaac 27 <210> 417 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 417 ggcaatctgc cctgcacttc gggataa 27 <210> 418 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 418 27 gtcttctggt ggaaagcttt tgcggtg <210> 419 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 419 taaggttaag cgaatccttt ta 133/218 22 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 420 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 420 24 aacggaaagg tctcttcgga gata <210> 421 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 421 ctaataccgg ataggaccac gggatg 26 <210> 422 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 422 ggtggaaagc gctttagcgg tg 22 <210> 423 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 423 gcgctttagc ggtgtgggat gagccc 26 <210> 424 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 424 ggttaagcga atccttaaaa gccgg 25 <210> 425 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 425 cgagcgaggt tttttaaacc tage 134/218 24
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 426 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 426 agcgaggttt tttaaaccta gcgg 24 <210> 427 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 427 <210> 428 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 428 atagggaaag aaaacttggt tgag 24 <210> 429 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 429 agaaaacttg gttgaggaaa tgct 24 <210> 430 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 430 gatactggta aactagagtt ggata 25 <210> 431 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3>
Primer/Probe 135/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 431 atatagtcga ggttaacgga gtga 24 <210> 432 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 432 gatactgcct gggtaactgg gagga 25 <210> 433 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 433 aagtgattta tcacttagcg gc 22 <210> 434 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 434 cttcagtttg gcatagcggt tg 22 <210> 435 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 435 actcgtagat gccgcatggc atttacgg 28 <210> 436 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 436 agacgcctta aagcgtcgct ggag <210> 437 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial 136/218 <220> <40Ö> 442 tagattggga tagcggatgg <210> 443 <213> 23 <212> DNA <213> Artificial <4ÖÖ> 43? ccactatatt gaatgtacct tattagaaa <2Xö> 438 <2 i ·.> 2? <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pri mer/Probe <4Q0> 438 ccggtacaaa gfcgaagcaac ctggtga <210> 439 <211> 22 <212> DNA <213> Artlfi cial <220» <223> Primer/Probe <40ö> 439 agtcggttta ttaacaaact gc <21ö> 440 <211» 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40ö> 440 gcatgtcgag cgatgatage aat <210> 441 <21I> 22. <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pri mer/Probe. •;400> 441 agcaatatca tagcggcgaa tg <210> 442 <211» 20 <21?> DNA <213> Artificial <22ö> <223» Primer/Probe <4C-0> 442 tagauggga tagcggatgg <2lö> 443 <2I1> 23 <212> ONA <213> Artificial 137/218 21) <220> <22 3> Pri mer/Probe <4Ö0> 44 S ctgctgtggl: tagggaaga a <21Ö> 443 <211> 20 <4Ö0> 443 agcgga- ugga aacatccgat <2.1,ö> .444 <211> 22 _ d ·*> v N iv .i.L···* <213> DNA Artifid al <22G> <223> Primer/Probe <40Ö> 444 aaaaggaagc gtttgcttcg <210> 445 <211> <212> 24 DNA <223> Artificial <22 0> <223» Pri nie r/Probe <400> 44 5 tagcggggtt gagagattga <210> 446 <21i> 20 <212> DNA <2i3> Arti. f i ci al <220> <223> primer/probe <40O> *4o S S 9 911 q aga q att ga t c. cg <210> 447 <2I1> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Frobe <40Ö> 447 gggttgtaaa ctectgtggt <21ö> 448 <.211> 20 <21?.> DNA <213> Artificial «22Ö> <223> Pri iner/Probe <400> 448 ctgctgtggt tagggaagaa <2I0> 449 <21I> 20 20 ?? 138/218 20 <213> Art1 τιci 3 ä 2 3 Primer/Probe <4Q0> 454 ggggaactca tcgaegcagc CW 1 I V. S U > <220> <223> Primer/Probe <400> acctga 449 ttag aaagcaacgg <2iö> <211> <?!?> <213> 450 20 DNA Artificial < ά 2 \)y- <2Ti> Primer/Probe <40Ö> 450 gtctggcgtt aasttttggg <210> <211> 4SI 20 <2U> <213> DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 451 aaccccaaas cgcgttggat <21ö> <211> <212> <213> 452 20 DNA Artificial <22Q> <223> Primer/Probe <m> 452 acatcaacat ggcgaaggca <21ö> <211> <212> <213> 453 25 DNA Artificial <220> <223 > pH mar/Probe <400> 4 S 3 caftaottga tggggaactc atcgä <210> <2 ii> <?I2> 454 20 DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 454 ggggaactca tcgacgcagc 139/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <21Ü> 455 «211> 29 <212* DNA <213> Artificial <22ö> <22 3> primer/Probe <40ö> 455 29 gacoccttta aaqcgtcgct ggacgagcg <21Ö> 456 <211> 30 <212> DNA <213* Artificial <220> <223> Printer/Proba <400> 456 aggcctatgg gttgtaaact gctgtggtaa <21ö> 45? <2Ü> 22 <212> DNA <213* Artificial <220* <223> Pri mer/Probe <4öö> 45? gaaatgccac tglattgaat gt <210> 458 <21i> 27 <212> DNA <213> Artificial <22ö> <223> primer/Probe <4ö0> 458 aggagactgc ctgagtaatc gggagga <210> 459 <21I> 26 <2I2> DNA <2I3> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 459 agtgagcaaa ccacaaaaaa ctggtc 26 <2 IC» 460 <211> 22 <2.12> DNA <213 > Artificial <220> <223> Pri mer/Prohe <4ÖQ> 460 agcgaggttc ttttgaacct ag 140/218 AT505 849 B1 2010-01-15 österreichisches
Patentamt o V 4ol <211> 24 <212> DNA <2X3> Artificial <22ö> <2?.3> Prißer/Pi-obe o V 461 ggttag ctaa. cctcggagac <2IQ> 462 <21i> 25 <212> DNA . ·! ‘i *K Artificial <22Q> < 2 2 5 > Primer/Probe <4Q0> 462 a t g att ΐ c aa t gt q a a ag ga <210> 4-63 <211> 24 <212> DNA <2X3> Arti 1"i ci«i <22G> <m> PritTser/Probe <400> 463 a<itctggagt caaataccag <21Q> 464 <2ii> 22 <2.12 > DNA <2X3> Artificial <22ö> < 2 2 3 > Printer/Probe ό o V 464 ggagtcaaat aecagggctc <210> 465 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <2.2 Ö> <223 > Primer/Probe <400> 465 ctttggatac tggtaaacta gagttag 25 24 <21Q> 466 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 141 /218 AT505 849 B1 2010-01-15 österreichisches Patentamt <40ö> 466 acatcc r.tcg caatgctata <210> 46? <211> 26 <2 i.2> DNA <2X^3 Artificial <220> <223> PT 1 ffiri F / P r 0 b *3 <400> 46? cgcaatgcta taga gatata <21Ö> 468 <2ll> 26 <212> DNA <213:> Artificial <22Ö> <22 3> Pritner/Probe <4Ö0> 468 agcggaggtt aacggagtga cacar.g 22 26 26 <2.10> 469 <211> 22 <212> DNA , ·; 3.. Artificial <220> <223> Prititsr/Probe <40Ö> 469 actgcctggo taact.ogg ·>? <2iÖ:> 470 <2j.1> 26 <212> DNA <213> Artifi eia] <2 20a <223 > Primer/Probe A O O V 470 caegtgggtg &tctgcctc.g <210> 471 <:alx> 22 <212> DNA. <213> Artificial <22ö> <223> Primer/Probe <400> 471 gtgatc tgee tegtaetteg <210> .1-7-) <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <22ö> 142/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 472 atatgacctt cggatgcatg tctgag 26 <210> 473 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pritner/Probe <400> 473 ttatcggtac gagatgggcc cgcgg 25 <210> 474 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 474 cgatcgtgaa aacttggggc tcaac 25 <210> 475 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 475 gggctcaacc ccaagcttgc gggcg 25 <210> 476 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 476 cccaagcttg cgggcgatac gggc 24 <210> 477 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 477 agatggctct gctatcactt ctgga 25 <210> 478 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 143/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 478 gctctgctat cacttctgga tggacc 26 <210> 479 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 479 ctatcacttc tggatggacc cgcggcgca 29 <210> 480 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 480 aacggctcac caaggcgatg atgcgta 27 <210> 481 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 481 gaagaagtgc attggaaact gggagac 27 <210> 482 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 482 cgaggtttag ctaatctctt aaaaccat 28 <210> 483 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 483 aaggcagtga tacgtagccg acct 24 <210> 484 <211> 25 144/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 484 tctgacagtc taagagatta gaggt 25 <210> 485 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 485 acctcatgct atcggatgaa cccaggt 27 <210> 486 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 486 gttaatacct agtggcattg acgttact 28 <210> 487 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 487 acctagtggc attgacgtta ctcgcag 27 <210> 488 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 488 tgagcgaatc ccataaagta tgtcgtag 28 <210> 489 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 489 acgtgaggaa cgtgcccttg acttcg 26 145/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 490 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 490 tgacatgtac tggaagcgtt cagag 25 <210> 491 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 491 gcgtgccttt ttggctggta cacag 25 <210> 492 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 492 gcagttcggc tggggactca ttggagacc 29 <210> 493 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 493 agggcaaact aaaccccaca ccgagg 26 <210> 494 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 494 agctcgtagt tggatgtaga cggtcgc 27 <210> 495 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 495 cggcacagga ctctggcctg tcccgt 146/218 26 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 496 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 496 actagggatc ggggaggcgc tcaatc 26 <210> 497 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 497 gacgactctc ccaacccgcg ccgt 24 <210> 498 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 498 agatgagcct aggtcggatt agctag 26 <210> 499 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 499 ttcggattgt aaagcacttt aagttgg 27 <210> 500 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 500 ttcctgtgta gcggtgaaat gcgta <210> 501 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 147/218 25
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 501 22 tataggaagg aacaccagtg gc <210> 502 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 502 tggtagtggg ggataacgtc cgga 24 <210> 503 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 503 aacgtccgga aacgggcgct aatac 25 <210> 504 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 504 acgggcgcta ataccgcata cgtcctga 28 <210> 505 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 505 acgtcctgag ggagaaagtg gg 22 <210> 506 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 506 gcctaccaag gcgacgatcc gtaactgg 28 <210> 507 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 148/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 507 aaactactga gctagagtac ggtag 25 <210> 508 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 508 cagttaccta atacgtgatt gt 22 <210> 509 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 509 tacgtgattg ttttgacgtt accga 25 <210> 510 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 510 gtgattgttt tgacgttacc gacaga 26 <210> 511 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 511 aatacctagg aatctgcctg atagt 25 <210> 512 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 512 atggctcacc aaggctacga tccgtaa 27 <210> 513 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 149/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe 26 <400> 513 cattaaccta atacgttggt gtcttg <210> 514 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 514 cgttggtgtc ttgacgttac cgacag 26 <210> 515 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 515 tgtcttgacg ttaccgacag aataa 25 <210> 516 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 516 ttgaactctt agtggcgcag ctaac 25 <210> 517 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 517 cagcacggag cttgctctgg tggcga 26 <210> 518 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 518 ggtgagagct aatatctctt gctaa 25 <210> 519 <211> 27 150/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 519 gacatggctg gaatccttga gagatca 27 <210> 520 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 520 agctaatcgc agaaagtgta tcgta 25 <210> 521 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 521 atgtcaacta gccgttggaa tccttg 26 <210> 522 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 522 cctccggatt ggctattggg agctc 25 <210> 523 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 523 gattggctat tgggagctcg cgagagca 28 <210> 524 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 524 gcctccggat tggctattgg gagctcg 27 151 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 525 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 525 27 ttggctattg ggagctcgcg agagcac <210> 526 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 526 attttttcgt gtactggatt tccaac 26 <210> 527 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 527 cgtgtactgg atttccaacg gggcct 26 <210> 528 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 528 tctcagagcg gagaatttgg acaaac 26 <210> 529 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 529 ataactactg gaaacggtgg ct 22 <210> 530 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40Q> 530 atgtctactt ggaggttgtg cccttg 152/218 26 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 531 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 531 rannaanran rftnr1-nrt-t tnrtna <210> 532 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 532 ttgctgcttt gctgacgagt ggcgga 26 <210> 533 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 533 ccagatggga ttagcttgtt ggtga 25 <210> 534 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 534 tctacttgga ggttgtgccc ttgagg 26 <210> 535 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 535 cttcgctgac gactggcgga cgagtg 26 <210> 536 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 153/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 536 27 tctgaaactg gcttgcttga gtctcgt <210> 537 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 537 acatccacag aagaatccag agatcca 27 <210> 538 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 538 cagaagaatc cagagatcca tttgt 25 <210> 539 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 539 tccatttgtg ccttagggaa ctgtg 25 <210> 540 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 540 gaggtggagc taatctcaca aagctcg 27 <210> 541 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 541 aatctcacaa agctcgtcgt agtccgga 28 <21Q> 542 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 154/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 542 aagctcgtcg tagtccggat tggagt 26 <210> 543 <211> 26 <212> DNA <213> Artifici al <220> <223> Primer/Probe <400> 543 gaatgttagc cgtcggggtg tttaca <210> 544 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 544 tcggggtgtt tacacttcgg tggcg 25 <210> 545 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 545 aggaagcagc ttgctgtttc gc 22 <210> 546 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 546 cctttgctca ttgacgttat ccgca 25 <210> 547 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 547 acgttatccg cagaagaagc accggc 26 <210> 548 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 155/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 548 25 ggaagcagct tgctgctttg ctgac <210> 549 <213> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 549 ggtcttgaca tccacagaac cttgt 25 <210> 550 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 550 tacgagggtg ccttcgggaa ctgtgag 27 <210> 551 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 551 aggaagcagc ttgctgtttc gctgac 26 <210> 552 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 552 ctgtttcgct gacgagtggc ggacg 25 <210> 553 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 553 cctggacgaa gactcacgct caggtgc 27 <210> 554 <211> 28 156/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 554 acttggaggt tgtgcccttg aggtgtgg 28 <210> 555 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 555 accatgggag tgggttgtaa aagaagt 27 <2i0> 556 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 556 tgcaagtcga acggtaacag gaaaca 26 <210> 557 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 557 aggaaacagc ttgctgtttc gctgac 26 <210> 558 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 558 tggtgcgagg ttgaaagatg gtttcg 26 <210> 559 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 559 ggaaatgctg gtgctgtgac ggtat 25 157/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 560 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/probe <400> 560 cggtgtggga acctttatgg acccag 26 <210> 561 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe _ ΙΛΛ. f“ Λ -t
<HUU> DDX gaaccgcatg gttcaaaagt ga 22 <210> 562 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 562 tatagatgga tccgcgctgc at 22 <210> 563 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 563 cgctgcatta gctagttggt aa 22 <210> 564 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 564 ggggctaatg ccggataata tgcagaa 27 <210> 565 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 565 catggttctg caatgaaaga cggtt 25 158/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 566 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 566 26 aacaagtgcg taggtaacta tgcgca <210> 567 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 567 aaagacggtt ttgctgtcac tt 22 <210> 568 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 568 gttttgctgt cacttataga tggatcc 27 <210> 569 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 569 ctytcactta tagatggatc cgcgccgca 29 <210> 570 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 570 atccgcgccg cattagctag ttggtaa 27 <210> 571 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 159/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <400> 571 aaatgtgtaa gtaactatgc acgtc 25 <210> 572 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 572 atgcacgtct tgacggtacc taatca 26 <210> 573 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 573 cgaacagatg aggagcttgc tcctttg 27 <210> 574 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 574 cttgacatct tttgatcgct ct 22 <210> 575 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 575 gttttcctct tcggaggaca aaatg 25 <210> 576 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40Q> 576 agtaaccatt ttggagctag cc 22 <210> 577 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial 160/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 577 cggggctaat gccggataac at 22 <210> 578 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 578 atgccggata acatgttgaa ccgca 25 <210> 579 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 579 tgttgaaccg catggttcta ca 22 <210> 580 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 580 cgccgtatta gctagttggt gggg 24 <210> 581 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 581 cccttgaact tagttgccat cattca 26 <210> 582 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <22Ö> <223> Primer/Probe <400> 582 agtaaccatt ttggagctag cc 22 <210> 583 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 161/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <22 0> <223> Primer/Probe <400> 583 26 acagatgaga agcttgcttc tctgat <210> 584 <211> 25 <212> DNA <2i3> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 584 tcaatagtga aagacggttt egget 25 <210> 585 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 585 gaagaacaaa tttgttagta actgaa 26 <210> 586 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 586 aatttgttag taactgaaca agtett 26 <210> 587 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 587 ctgaacaagt ettgaeggta cctaa 25 <210> 588 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 588 atggtttcat gatgaaagac ggttt 25 <210> 589 <211> 26 162/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 589 tattagggaa gaacaaggat gtaagt 26 <210> 590 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 590 tgtaagtaac tatgcatccc ttgac 25 <210> 591 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 591 aggagcttgc tcctttgaag tt 22 <210> 592 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 592 tttgaagtta gcggcggacg gg 22 <210> 593 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 593 taccggataa catttagaac cg 22 <210> 594 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 594 cgcatggttc taaagtgaaa ga 22 163/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 595 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 595 ctaaagtgaa agatggtttt gctatca <210> 596 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> Primer/Probe <400> 596 tattagggaa gaacaaatgt gtaagtaact gt <210> 597 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 597 cgtaggcggt ttcttaagtc tga <210> 598 <211> 22 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 598 aaactctaga gatagagcct tc <210> 599 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 599 taagttgggc actctaggtt ga <210> 600 <211> 22 <212> DNA <213> Artifici al <220> <223> Primer/Probe <400> 600 gcgaggtcat gcaaatccca ta 27 32 23 22 22 22 164/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 601 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 601 aaccatttat ggagctagcc gt 22 <210> 602 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 602 agagaagaac gttggtagga gt 22 <210> 603 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 603 gtggaaaatc taccaagtga cg 22 <210> 604 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 604 attgtacgct ttggaaactg gaggact 27 <210> 605 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 605 acatccttct gaccggccta ga 22 <210> 606 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 165/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 606 24 ataggctttc tcttcggagc agaa <210> 607 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 607 cgtaggtaac ctgcctacta gcgggg 26 <210> 608 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 608 ctactagcgg gggataacta ttggaa 26 <210> 609 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40Q> 609 agagaagaac gtgtgtgaga gtggaaa 27 <210> 610 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <4öö> 610 ttgttcgctt tggaaactgt tagac 25 <210> 611 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe
>4ΛΛ. C~l -I
U-LX agtcggtgac ggcaagcaaa tctct 25 <210> 612 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 166/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 612 ggcaagcaaa tctcttaaag ccaat 25 <210> 613 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 613 aacgctgagg actggtgctt gcaccg 26 <210> 614 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 614 tgcatcacta tgagatggac ct 22 <210> 615 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 615 agagaagaat gatggtggga gt 22 <210> 616 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 616 tggtgggagt ggaaaatcca ccatgt 26 <210> 617 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 617 ccggggctta gtgccggagc ta 22 <210> 618 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial 167/218 > österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 618 22 ccggtctaga gataggcttt cc <210> 619 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 619 aacagctcca ctatgagatg gacct 25 <210> 620 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 620 aagaacagtg atgggagtgg aaagtc 26 <210> 621 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 621 agtggaaagt ccatcatgtg acggt 25
<210> 622 <211> 28 <212> DNA *£.±ό> MPtinciai <220> <223> Primer/Probe <400> 622 agtccatcat gtgacggtaa ctaaccag 28 <210> 623 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 623 aaccattgta tgctttggaa actgt 25 <210> 624 <211> 22 168/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 624 ttcttagaga taagaagtta ct 22 <£1U> O£D <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 625 tgcaagtaga acgctgaagg aggagc 26 <210> 626 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 626 cactaccaga tggacctgcg ttgta 25 <210> 627 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 627 cacactgtga cggtatctta ccagaa 26 <210> 628 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 628 tttaacttga gtgcaagagg ggaga 25 <210> 629 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 629 agaggggaga gtggaattcc atgtgta 27 169/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 630 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 630 gctctctggc ttgtaactga cgctga 26 <210> 631 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 631 ccggggttta gtgccgcagc taacgc 26 <210> 632 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 632 acatccctct gaccgctcta gagata 26 <210> 633 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 633 gagttttcct tcgggacaga ggtgac 26 <210> 634 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 634 gatagctaat accgcataag agtaga 26 <210> 635 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 635 gtagatgttg catgacattt gcttaa 26 170/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 636 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 636 gcacttgcat cactaccaga tggacct 27 <210> 637 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 637 acttgcatca ctaccagatg gacctg 26 <210> 638 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 638 aagagaagaa cgagtgtgag agtggaa 27 <210> 639 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 639 gagaagaacg agtgtgagag tggaaag 27 <210> 640 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 640 gcaagagggg agagtggaat tccatgt 27 <210> 641 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 171/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <40Ü> 641 accgcataag agagactaac gcatg 25 <210> 642 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 642 gttagagaag aatgatggtg ggagtg 26 <210> 643 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 643 atccaccaag tgacggtaac taaccagaa 29 <210> 644 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 644 tcggtacatc ggtgacaggt ggtgc 25 <210> 645 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 645 attgctccac tacaagatgg acctg 25 <210> 646 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 646 aggctgtggc tcaaccatag ttcgc 25 <210> 647 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 172/218 <220>
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 647 25 gatcctttcc gggattcagt gccgc <210> 648 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 648 ggttggtaca acgagttgcg agtcg 25 <210> 649 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 649 aacgagttgc gagtcggtga cggcaag 27 <210> 650 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 650 ttgacggtat cttaccagaa agggacg 27 <21Q> 651 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 651 agcgagcgca ggcggtttga taagtct 27 <210> 652 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 652 tgaagtaaaa ggctgtggct taacc 25 <210> 653 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 173/218 t> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 653 26 gtggcttaac catagtacgc tttgga <210> 654 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 654 aggtgttggg tcctttccgg gactca 26 <210> 655 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 655 gggtttctct tcggagcatc ggtgac 26
<210> 656 <211> 25 <212> DNA <220> <223> Primer/Probe <400> 656 tttgaaaggg gcaattgctc cacta 25 <210> 657 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 657 agtcaagaac gggtgtgaga gtggaa 26 <210> 658 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 658 ttcacactgt gacggtagct aacca 25 <210> 659 <211> 24 174/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 659 cggtagctaa ccagaaaggg acgg 24 <210> 660 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 660 aacgagttgc gagtcggtga cggcga 26 <210> 661 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 661 gagtcggtga cggcgagcta atctc 25 <210> 662 <211> 25 <212> DNA <213> Arti f·i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 662 cctatttaaa aggggcaaat gcttc 25 <210> 663 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 663 agagaagaac ggtaatggga gtgg 24 <210> 664 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 664 tccattacgt gacggtaact aa 22 175/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 665 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pritner/Probe <400> 665 25 gctgtggctt aaccatagtt cgctt <210> 666 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 666 gatgcccgct ctagagatag agctt 25 <210> 667 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 667 cgcgaggcgg agcgaatctc aaaa 24 <210> 668 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 668 tttcgtgtac tggtttccaa ccggg 25 <210> 669 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 669 gggtggtgtt tttttactga cccact 26 <210> 670 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 670 tgcaagtcga gcggaaacga gtta 24 176/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 671 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 671 26 aacgataacg gcgtcgagcg gcggac <210> 672 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 672 aaacgatggc taataccgca tgat 24 <210> 673 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 673 gtaatgcctg ggaaattgcc cggtagag 28 <210> 674 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 674 aaoccttoca ctaccaoata taccca 26 <210> 675 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 675 ctttcagtag ggaggaaggt ggttaag 27 <210> 676 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 177/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 676 26 taccttaatc atttgacgtt acctac <210> 677 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 677 catccagaga atctagcgga gacgct 26 <210> 678 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 678 ggaattgcat ttgaaactgg cagact 26 <210> 679 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 679 caatggcgca tacagagggc agccaa 26 <210> 680 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 680 aaacttgttt ctcgggtggc gagegg 26 <210> 681 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 681 getgtaaaeg atgtetaett ggaggtt 27 <210> 682 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 178/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 682 gtttactact ttgccggcga gcggcg 26 <210> 683 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 683 cataacgtct tcggaccaaa gtgg 24 <210> 684 <2ii> 2» <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 684 tcgggcctca cgccatcgga tgtgccca 28 <210> 685 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 685 agcactttca gcgaggagga aggc 24 <210> 686 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 686 caaagtgaag cgaactcgcg agagcaag 28 <210> 687 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40ö> 687 agcaagcgga ccacataaag tctgtc 26 <210> 688 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 179/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01 <220> <223> Primer/Probe <400> 688 27 tctggaactg cctttgagac tgttaga <210> 689 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 689 gacttactgg tctatagttg acgc 24 <210> 690 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 690 gaaagtggag acacattctt tcagttc 27 <210> 691 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 691 aagcaucuuc ggaugcuuag uggcga 26 <210> 692 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 692 aggaugugug caugaaaaaa acaca 25 <210> 693 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 693 uuauaaaagu uuguggugua agugcag 27 <210> 694 <211> 26 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 694 acgcugugag gcuaugaaaa cuauau 26 <210> 695 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 695 accugucuuu aagacgagga uaaccg <210> 696 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 696 ccacaaugga acugagaacg guccau 26 <210> 697 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 697 cuaaguguug gugauaaauc agugc 25 <210> 698 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 698 ugacaucuag guguuaguua uagag 25 <210> 699 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 699 agcgacacug cgugaaugaa gaaggu 26 181 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 700 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 700 26 uauguuggaa acuauauguc uagagu <210> 701 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 701 auagaggaag uuagaauuuc uggugu 26 <210> 702 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 702 auaccggagg cgaaggcgaa cuucugg 27 <210> 703 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 703 gagauaauua uuccccguuu gggguc 26 <210> 704 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 704 auguaauggu ggggacucag auaaga 26 <210> 705 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 705 auaaagcagg ucucaguccg gauugaa 27 182/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 706 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 706 ccguaaggga ggaagguauu uaaggu 26 <210> 707 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 707 aaagcuuugc uuguagauga gucug 25 <210> 708 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <4Q0> 708 cguuaauuua ugaauaaguc ccgg 24 <210> 709 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 709 cgaagcuauu auuuuaaccc gcaag 25 <210> 710 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 710 auaacgguug gaaacgaucg cuaaua 26 <210> 711 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 183/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 26 <400> 711 aaggcgauga cgucuaggcg gauuga <210> 712 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 712 aggaaaguua gauguuaaau uuugg 25 <210> 713 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 713 cgcuuuucua auuuauaccu gacgc 25 <210> 714 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 714 accccauccg ugucggagcu aacguguü 28 <210> 715 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 715 cuguagaaau acagcuuucc gcaagg 26 <210> 716 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 716 aacggccgcu aauaccgaau guggcgauau 30 <210> 717 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 184/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 717 uugagagauu ggccgccaac acuggg 26 <210> 718 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 718 gucucaaccc cauccguguc ggagcu 26 <210> 719 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 719 aaggaccuua ccuggguuug acauguaua 29 <210> 720 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 720 uaguugccag cacuuagggu gggaac 26 <210> 721 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 721 ccuaccaagg uuuugacguc uaggc 25 <210> 722 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 722 aacaugggau cuuaaguuuu agucg <210> 723 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 185/218 25 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 723 agagaaaguc ugugggauau cagcuu 26 <210> <211> <212> ^>1 5^ 724 26 DNA Artificial <220> <22 3> Primer/Probe <400> 724 uucuagaggu uggauggaga aaaggg 26 <210> <211> <212> 725 25 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 725 guuaguagua cauagauaau cugcc 25 <210> <211> <212> <213> 726 26 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 726 ggggauaacg guuggaaacg aucgcu 26 <210> <211> <212> <213> 727 27 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 727 ccaccaaggc gaugacgucu aggcgga 27 <210> <211> <212> <213> 728 26 DNA Artifici al <220> <223> Primer/Probe <400> 728 uucuagagga uagaugggga aaaggg 26 <210> 729 <211> 25 186/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 729
acucaaccua uuuauaggag agagg 25 <L1U> /OV <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 730 gauagucuca acccuauccg ugucg 25 <210> 731 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 731 uggcguguca gcuauaacgc cguga 25 <210> 732 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 732 agagagguaa acggaauucc augugu 26 <210> 733 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 733 guggcgaaag cgguuuacug gcu 23 <210> 734 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 734 acuuauuauu uuugcaugaa aguaau 26 187/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 735 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <40Q> 735 26 uuguaaacug cugugguuag ggaaga <210> 736 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 736 aagucuggcg uuaaauuuug gggcu 25 <210> 737 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 737 uucugcaaag cuauggagac auagug 26 <210> 738 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 738 agcgagguuc uuuugaaccu agcgg 25 <210> 739 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 739 gaaaugcuuc caggcugacg guacc 25 <210> 740 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 740 cucuugacau ccuucgcaau gcuaua 26 188/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 741 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 741 25 acauccuucg caaugcuaua gagau <210> 742 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 742 aaagugcugu uauaggggaa gaaca 25 <210> 743 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 743 acccaaugga aacauugguu aaugccg 27 <210> 744 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe .ΙΑΛ. -9 4 4 gaaacauugg uuaaugccgg auacgc 26 <210> 745 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 745 aaugcguaga uauauaugga agaaca 26 <210> 746 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 189/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 746 26 cauuagucgg uggagaauca cugacg <210> 747 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 747 agucgaacgg gggugcuugc accuca 26 <210> 748 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 748 acguaucuaa ccuaccuuau agcgg 25 <210> 749 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 749 gauaauaccg cauguagauc uuauu 25 <210> 750 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 750 aucaaaagaa ccguuugguu cacuauga 28 <210> 751 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 751 agauggggau gcggcguauu agcua 25 <210> 752 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 190/218 <220>
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 752 26 caacccuugu cguuaguuac uaacau <210> 753 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 753 accuaaugga aacauugguu aaugccgg 28 <210> 754 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 754 guugaggaaa ugcaacuaag cugacg 26 <210> 755 “ <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 755 aaaugcaacu aagcugacgg uaccuuguua ga 32 <210> 756 <211> 22 <212> DNA <2X3> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 756 agucgguggg agccacugac gc 22 <210> 757 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 757 caugucgagc gaagguagca auaccuua 28 <210> 758 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 191 /218 t> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> primer/probe <400> 758 27 uuucaaauac ucguaguuuu cgcauga <210> 759 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 759 cuucgcugga ggagcggggu gcguaac 27 <210> 760 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 760 gaagaacacc aagauggcga aggcag 26 <210> 761 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 761 aacaaguuaa cuaucgcaug agaaua 26 <210> 762 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 762 uagaguggaa agcuauuaau uugacu 26 <210> 763 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 763 aaggcgagga cuugggccaa uacug 25 <210> 764 <211> 27 192/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> <213> DNA Artificial <220> <22 3> Primer/probe <400> 764 auuaaaguug aaaggaccug caagggu 27 <210> <211> <212> <213> 765 27 DNA Artifi ci al <220> <22 3> Primer/Probe <400> 765 caggcaaugg cuggaguuug acuguac 27 <210> <211> <212> <213> 766 26 DNA Arti f ·i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 766 aaaggcagcu gcuuaacagu uguaug 26 <210> <211> <212> <213> 767 26 DNA Artificial <220> <223> primer/probe <400> 767 ggagcgaucc cuucgguagu gaaguu 26 <210> <211> <212> <213> 768 27 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 768 uaacgagacu gcuaauguaa auuggag 27 <210> <211> <212> <213> 769 28 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 769 cuuuauugga agcgcauguc aaggauag 28 193/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> <211> <212> <213> 770 27 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 770 gcaugucgag cgagguuagc aauaacc 27 <210> <211> <212> <213> 771 26 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 771 aaaugauugc agacugacgg uaccuu 26 <210> <211> <212> <213> 772 26 DNA Artifici al <220> <223> Primer/Probe <400> 772 cauuagucgg uggagaauca cugacg 26 <210> <211> <212> <213> 773 26 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 773 agauauagug gagguuaucg gaguga 26 <210> <211> <212> <213> 774 25 DNA Artificial <220> <22 3> Primer/Probe <400> 774 uauaguuauu uaucgcauga ugagu 25 <210> <211> <212> <213> 775 25 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 775 uauaguuauu uaucgcauga ugagu 25 194/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 776 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 776 26 uagccgggcc gagaggcugu acggcc <210> 777 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 777 cucaacuuca guccgcuuug gauac 25 <210> 778 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 778 ggaauaauuu cacuaacgca gc 22 <210> 779 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 779 aauaccgcau agggcauuau uaucg 25 <210> 780 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 780 aagcgagcgc gggcggauuu gcaag 25 <210> 781 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <22 3> Primer/Probe 195/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 781 26 aaauguuggc acggaaugug ucggug <210> 782 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 782 gcauguagau cuuauuaucg cauga 25 <210> 783 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 783 guucgccuug aaaacuguau uacua 25 <210> 784 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 784 guagguagcu uaaccguuug gagagc 26 <210> 785 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 785 aaguagcaau acuuuagcgg cgaauggg 28 <210> 786 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 786 accuaaugga aacauugguu aaugccg 27 <210> 787 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 196/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 787 caguuaguug aggaaaugcu ucuaauc 27 <210> 788 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 788 cauuagucgg uggaaaacua cugacg 26 <210> 789 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 789 cauaacaaau guacuaucgc auga 24 <210> 790 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 790 ugacguguag uuaugcugag aggu 24 <210> 791 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial .ΛΊΛ. <223> Primer/Probe <400> 791 gcagaggaaa ugauguuagu uugacgg <210> 792 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <22u> <223> Primer/Probe <400> 792 gauguuagau gucgggguaa acgccu 26 <210> 793 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al 197/218
österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <220> <223> primer/probe <400> 793 26 aucaaaguug aaaggaccug caaggg <210> 794 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fici al <220> <223> Primer/Probe <400> 794 agaaugacuu uagcagguaa uggcuag 27 <210> 795 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 795 aaaggcagcu gcuuaacagu uguau 25 <210> 796 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 796 acauccuugg caaaguuaug gaaaca 26 <210> 797 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 797 guuaguuaca uugucuagcg agacu 25 <210> 798 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 798 uuaaaaacgu guugcuaacc auuaggaa 28 <210> 799 <211> 25 198/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 799 uuaagaucgc augguuuuaa uauaa 25 <210> 800 <2ü> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 800 ugcugugguu agggaagaaa aaguaauau 29 <210> 801 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 801 uaaaguagga aaugccuuua uauugac 27 <210> 802 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 802 gcgaaagcgg cuuacugguu uguua 25 <210> 803 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 803 uugggugaac ucagcgccgc agcu 24 <210> 804 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 804 aaaaaguagu ugaggaaaug cuucuac 27 199/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> <211> <212> <213> 805 27 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 805 acuggguuua uacugacgcu gaggaac 27 <210> <211> <212> <213> 806 25 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 806 aucauuaguc ggcagagaac uguug 25 <210> <211> <212> <213> 807 25 DNA Arti ficial <220> <223> Primer/Probe <400> 807 cugauugggg uuuucuccag uuagu 25 <210> <211> <212> <213> 808 25 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 808 cggucaucug ggcuacgacu gacgc 25 <210> <211> <212> <213> 809 26 DNA Artificial <220> <22 3> Primer/Probe <400> 809 cuagauaucg gaagagucuc uuucgg 26 <210> <211> <212> <213> 810 25 DNA Artificial <220> <22 3> Primer/Probe <400> 810 gggguuuacu cuaauuaguu agugg 25 200/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <210> 811 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 811 26 auaucggaag auuuucuuuc gguuuc <210> 812 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 812 cuugacaugg ugguugcgga ucgcag 26 <210> 813 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 813 ugcuccaguu aguuaguggc agacg 25 <210> 814 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 814 acuaauuugg ggcuugcucc aauuaguu 28 <210> 815 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 815 cgaaggcggu cgucugggcu acaa 24 <210> 816 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 201 /218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 816 24 auuaacuaga gcucgcuuua guua <210> 817 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 817 uucaguucgg cugggccaca cacag 25 <210> 818 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 818 gucaucuggg cuaccacuga cgcugau 27 <210> 819 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 819 caacccuuga cauggugguu gcgga 25 <210> 820 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 820 acuaauuugg ggcuugcucc aauuuag 27 <210> 821 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 821 gcgguuuagu aaguugggag ugaaag 26 <210> 822 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 202/218 <220> österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <223> Primer/Probe <400> 822 uuaauuagag cuugcucuag uuaau 25 <210> 823 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 823 acaugguggu uauggauugc agaga 25 <210> 824 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 824 ucggcugggc cacacacagg ug 22 <210> 825 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 825 acaaacugga augguuguaa ugaug 25 <210> 826 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 826 gaagaacuuc ugaagagacu guaag 25 <210> 827 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> Primer/Probe <400> 827 guguuaagug ggucacuugg ggagu 25 <210> 828 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 203/218
österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <220> <223> Primer/Probe <400> 828 26 cucgaaaccc guucguaguc aggacu <210> 829 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 829 uauuaaaucu agaugcuuaa cgucua 26 <210> 830 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 830 aaaugaugug ccuggguagu acauuc 26 <210> 831 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 831 gaugaagcga aacagaaaaa guuagu 26 <210> 832 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 832 taatacgact cactatagag agtttgatcm tggctcag 38 <210> 833 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 833 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 834 <211> 17 204/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 834 tccgcaggtt cacctac <210> 835 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 835 caagtctggt gccagca <210> 836 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 836 cgctggcggc aggcctaacu acatgcaagt cgaacggtaa caggaagcag cttg 54 <210> 837 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 837 cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc atcgagatgt gcccagatgg 60 gattagctag t 71 <210> 838 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 838 gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 60 aagcggtgga gc 72 <210> 839 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 205/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 <400> 839 ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg 60 ctacaatgg 69 <210> 840 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 840 aggagccagc cgcctaaggt gggatagatg attggggtga agtcgtaaca aggta 55 <210> 841 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 841 gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 60 aacgagcgca ac 72 <210> 842 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 842 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttag 60 tccggaattt attgggcgta aag 83 <210> 843 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a, c, g, or t 206/218
österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15
<400> 84B agaaagcnan ggctaactat gtgccagcag ccgcggtaat acataggtng caagcgttat 60 74 ccggaaattt attg <210> 844 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 844 tccgcctgag tagtatgctc gcaagagtga aactctaaaa ggaattgacg gggactcccg 60 cacaag 66 <210> 845 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 845 ggcgcgaaag caaggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccttg ccgtaaacga 60 tgcatacttg atgtggat 78 <210> 846 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 846 ccttatcgtt agttgccagc acttagggtg ggaactctac gagactgcct gggttaacca 60 ggagg 65 <210> 847 <211> 65 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 847 ctgggactga gacactgccc agactcctac gggaggctgc agtcgagaat ctttcgcaat 60 ggacg 65 <210> 848 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 207/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 <400> 848 gaaggccttc gggttgtaaa gcactttcgg tggggaagaa attctcaagg gtaatatcct 60 tgggcg 66 <210> 849 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 849 tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctaccc ttgacatcct cggaacttgt cagagatgat 60 ttggtg 66 <210> 850 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 850 tagtagggga tgatggaatt cctagtgtag aggtgaaatt cttagatatt aggaggacac 60 cggtg 65 <210> 851 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 851 gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc aataccgagt 60 gagtgatgaa ggcc 74 <210> 852 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 852 catggccctt acgggttggg ctacacgcgt gctacaatgg tgtttacaga gggaagcaag 60 acgg 64 208/218

Claims (24)

  1. österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 Patentansprüche 1. Verfahren zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Isolierung von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren, c) Inkontaktbringen der isolierten Nukleinsäuren mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der Nukleinsäure des mindestens einen zu identifizierenden Mikroorganismus bindet, und mindestens 80% ident ist mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmenten davon, welche Fragmente mindestens 20 Nukleotide umfassen, und deren revers-komplementären Sequenzen, wobei die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, d) Nachweisen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde und e) Identifizieren eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den nachfolgend angeführten Mikroorganismen: Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes defragrans, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Arcanobacterium pyogenes, Arcobacter butzerli, Arcobacter cryoaerophilus, Arthrobac-ter globiformis, Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Brevibacterium casei, Brevibacterium epidermidis, Brevibacterium linens, Brochothrix thermosphacta, Brucella abortus, Brucella melitensis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candida, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida sake, Candida tropicalis, Candida utilis, Carnobacterium divergens, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium bovis, Corynebacterium casei, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, Cryptococcus, Debaryomyces hansenii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus, Enterococcus avium, Enterococ-cus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus saccharolyti-cus, Escherichia coli, Flavobacterium, Francisella tularensis, Gluconobacter, Glucono-bacter asaii, Gluconobacter oxydans, Hafnia alvei, Helicobacter pylori, Klebsialla pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus ali-mentarius, Lactobacillus bifermentas, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farmi-nis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus plantarium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lacto-coccus cremoris, Lactococcus diacetilactis, Lactococcus lactis, Lactococcus luteus, Le-gionella pneumophilia, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesente-roides, Listeria, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Microbacte-rium lacticum, Microbacterium schleifen, Micrococcus lylae, Micrococcus tyrobutyricum, Micrococcus varians, Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma bovialkalescens, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovis, Mycoplasma californi-cum, Mycoplasma canadense, Nocardia asteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococ-cus pentosaceus, Plesiomonas shigelloides, Propionibacterium freudenreichii, Pro-totheca zopfii, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mephitica, Pseudomonas putida, Rhodotorula gluti-nis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Shewanella putrefaciens, Shigella, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexne-ri, Shigella sonnei, Sporolactobacillus inulins, Staphylococcus aureus, Staphylococcus 209/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 carnosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus inter-medius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis, Streptomyces griseus, Torulaspora, Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio parahae-molyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Zymomonas mobilis, Acholeplasma laidlawii, Anaeroplasma, Borrelia burgdoerferi, Borrelia recurrentis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, Chla-mydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Entomoplasma, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma mu-ris, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma putrefaciens, Mycoplasma salivarium, Rickettsia akari, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia pro-wazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia sibirica, Rickettsia typhi, Thermoplasma acido-philum, Ureaplasma urealyticum.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lebensmitteln, Milch, Milchprodukten, insbesondere Butter, Rahm oder fermentierten Milchprodukten, Fleisch, Fleischprodukten, insbesondere Rohwürsten, Fisch, Fischprodukten, Meeresfrüchten, insbesondere Muscheln, und pflanzlichen Lebensmitteln, insbesondere Essig und Bier, Zellkultur, Biopsiematerial, Abstrichen, insbesondere Vaginal-Abstrichen, bronchoskopische Abstrichen und menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel, Liquor, Urin, Sekrete, Cerebrospinal fluid (CSF) und Waschlösung von Spülungen vorzugsweise der Lunge, der Bauchhöhle und der Mundhöhle, und Fermentationslösungen, vorzugsweise pharmazeutische oder lebensmitteltechnologische Fermentationslösungen.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine DNA-Sonde ist.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Isolieren gemäß Schritt b) eine Amplifikation des 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gens der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik umfasst.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 aufweisen.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure markiert ist, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nukleinsäure mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht wird und, dass die Sonden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, das der mindestens eine Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes defragrans, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Arcanobac-terium pyogenes, Arcobacter butzerli, Arcobacter cryoaerophilus, Arthrobacter globiformis, Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bifi- 210/218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 dobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Brevibacterium casei, Brevibacterium epi-dermidis, Brevibacterium linens, Brochothrix thermosphacta, Brucella abortus, Brucella me-litensis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candida, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida sake, Candida tropicalis, Candida utilis, Carnobacterium divergens, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium bovis, Corynebacterium casei, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, Cryptococcus, Debaryomyces hansenii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faeca-lis, Enterococcus faecium, Enterococcus saccharolyticus, Escherichia coli, Flavobacterium, Francisella tularensis, Gluconobacter, Gluconobacter asaii, Gluconobacter oxydans, Hafnia alvei, Helicobacter pylori, Klebsialla pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bifermentas, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus plantarium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus cremoris, Lactococcus diacetilactis, Lactococcus lactis, Lactococcus luteus, Legionella Pneumophilia, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Microbacterium lacticum, Microbacterium schleiferi, Micrococcus lylae, Micrococ-cus tyrobutyricum, Micrococcus varians, Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculo-sis, Mycoplasma bovialkalescens, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovis, Mycoplasma californicum, Mycoplasma canadense, Nocardia asteroides, Pediococcus acidi-lactici, Pediococcus pentosaceus, Plesiomonas shigelloides, Propionibacterium freudenrei-chii, Prototheca zopfii, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluores-cens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mephitica, Pseudomonas putida, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella, Salmonella enterica, Salmonella enteriti-dis, Shewanella putrefaciens, Shigella, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flex-neri, Shigella sonnei, Sporolactobacillus inulins, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedi-us, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis, Strep-tomyces griseus, Torulaspora, Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vul-nificus, Yersinia enterocolitica, Zymomonas mobilis.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Bestimmung von Euterinfektionen bei milchgebenden Säugetieren, wobei das milchgebende Säugetier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel, Kamel und Pferd.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Prozesskontrolle bei der Lebensmittelherstellung und zur Kontrolle von fertigen Lebensmittel für die Überprüfung des Frischezustandes und der hygienischen Bedingungen.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Überwachung von technischen Fermentationen, vorzugsweise bei der Produktion von organischen Substanzen, wie Lebensmittel-Zusatzstoffen, basierend auf Mikroorganismen und/oder zur raschen Kontrolle von sterilen und kontaminationsfreien Bedingungen.
  12. 12. Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 835 oder aus Fragmenten davon, welche Fragmente mindestens 20 Nukleotide umfassen.
  13. 13. Verfahren zur Detektion und Bestimmung mindestens eines intrazellulären Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: 211 /218 österreichisches Patentamt AT505 849 B1 2010-01-15 a) Bereitstellen einer Probe, b) Isolierung von in der Probe enthaltener Nukleinsäure, c) Inkontaktbringen der isolierten DNA mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA -Gen der isolierten Nukleinsäure bindet, und mindestens 80% ident mit einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831 oder deren revers-komplementären Sequenzen, wobei die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, d) Feststellen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde, und e) Detektieren oder Bestimmen eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den nachfolgend angeführten Mikroorganismen: Acholeplasma laidlawii, Anaeroplasma, Borrelia burgdoerferi, Borrelia recurrentis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophi-la pecorum, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Entomoplasma, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma bucca-le, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma muris, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma putrefaciens, Mycoplasma salivarium, Rickettsia akari, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia sibirica, Rickettsia typhi, Thermo-plasma acidophilum, Ureaplasma urealyticum.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Milch, Milchprodukten, insbesondere Butter, Rahm oder fermentierten Milchprodukten, Fleisch, Fleischprodukten, insbesondere Rohwürsten, Fisch, Fischprodukten, Meeresfrüchten, insbesondere Muscheln, und pflanzlichen Lebensmitteln, insbesondere Essig und Bier, Zellkultur, Biopsiematerial, Abstrichen, insbesondere Vagi-nal-Abstrichen, bronchoskopische Abstrichen und menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel, Liquor, Urin, Sekrete, Cerebrospinal fluid (CSF), Waschlösung von Spülungen vorzugsweise der Lunge, der Bauchhöhle und der Mundhöhle und Fermentationslösungen, vorzugsweise pharmazeutische oder lebensmitteltechnologische Fermentationslösungen.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe menschlichen oder tierischen Ursprungs ist, wobei das Tier vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe der Haustiere, insbesondere der Gruppe der Hausrinder, Schafe, Ziegen, Büffel, Pferde, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen und Hasen.
  16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) und vor Schritt c) das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik amplifiziert wird.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 aufweisen.
  18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure markiert ist, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff.
  19. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nukleinsäure mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht wird 212/218 österreichisches Patentamt AT505 849B1 2010-01-15 und dass die Sonden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831.
  20. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und 13 bis 19 umfassend zusätzlich die Schritte: a) Zur Verfügungsstellung einer Matrix von Signaldaten, die durch Nachweisen einer Bindung mindestens einer Nukleinsäure an mindestens einer Sonde gewonnen werden b) Quantilen-Normalisierung der Matrix c) Klassifizieren der Signaldaten mit dem Nearest centroid Algorithmus.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Hybridisierungsereignisse, bevorzugt 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 in der Matrix vorhanden sind.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die angewandte Matrix aus Signal Daten von zumindest 2, mehr zumindest 10, noch mehr zumindest 20 und am besten zumindest 50 Spezies in einer Probe besteht.
  23. 23. Mikroarray umfassend ein Substrat und mindestens eine Sonde, die mindestens 80% ident ist mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmenten davon und deren reverskomplementären Sequenzen.
  24. 24. Mikroarray nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass am Mikroarray mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 30, noch mehr bevorzugt mindestens 50, Sonden gebunden sind. Hierzu 5 Blatt Zeichnungen 213/218
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094089B (zh) * 2010-12-06 2013-09-11 北京大北农科技集团股份有限公司 用于鉴定短小乳杆菌的引物序列及其应用
DE102011118949B3 (de) * 2011-11-16 2012-10-25 Universität Rostock Kombiniertes Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis von Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und von atypischen Pneumonie-Erregern
CN102605084B (zh) * 2012-03-29 2014-07-02 昆明理工大学 荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法
US9303281B2 (en) 2012-07-23 2016-04-05 Pall Corporation Compositions for detecting foodstuff spoilage microorganisms
US11713482B2 (en) 2016-06-15 2023-08-01 Genecapture, Inc. Compositions, methods and devices comprising stem-loop captor molecules
CN107130022A (zh) * 2017-05-05 2017-09-05 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测隐秘杆菌的实时定量lamp引物、试剂盒及方法
AU2019319203A1 (en) * 2018-08-08 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting
CN109337996A (zh) * 2018-12-24 2019-02-15 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的引物和探针
CN109666753A (zh) * 2019-03-01 2019-04-23 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量pcr引物和探针
CN110172420B (zh) * 2019-05-15 2022-03-01 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一株鼠李糖乳杆菌及其应用
CN110564874B (zh) * 2019-08-08 2022-10-14 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 一种针对发酵乳中以葡萄糖杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字pcr检测方法
KR102336532B1 (ko) * 2020-08-11 2021-12-06 건국대학교 산학협력단 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
CN111793586B (zh) * 2020-08-13 2022-05-20 石河子大学 一种母乳源戊糖片球菌及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639604A (en) * 1987-09-21 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Homogeneous protection assay
US6821770B1 (en) * 1999-05-03 2004-11-23 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms
JP4422019B2 (ja) * 2002-06-14 2010-02-24 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法
US20070015151A1 (en) * 2002-10-09 2007-01-18 Hopitaux Univesitaires De Geneve Analytical chip with an array of immobilized specific recognition elements for the determination of clinically relevant bacteria and analytical method based thereon
CN1232651C (zh) * 2003-01-21 2005-12-21 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种用于临床细菌检测的生物芯片
JP2007159411A (ja) * 2005-12-09 2007-06-28 Canon Inc プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
AT503862B1 (de) * 2006-07-05 2010-11-15 Arc Austrian Res Centers Gmbh Pathogen-identifizierung anhand eines 16s oder 18s-rrna mikroarray

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