AT505849A1 - Verfahren zur bestimmung von mikroorganismen - Google Patents

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Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen.
Mikroorganismen sind in der Regel Einzeller und können einerseits Erreger verschiedenster Krankheiten bei Menschen und Tieren sein, und andererseits zur Herstellung bzw. Veredelung von beispielsweise Lebensmitteln verwendet werden. Die exakte Bestimmung von Erregern ist nicht nur für die Diagnose einer Erkrankung entscheidend, sondern auch um eine entsprechende Therapie gezielt durchzuführen. Ferner ist es auch nützlich, wenn Mikroorganismen, die zur Herstellung bzw. bei der Behandlung von Lebensmitteln eingesetzt werden, bestimmt werden können. Dadurch lassen sich beispielsweise Fermentationen besser kontrollieren, um insbesondere Fehlgärungen zu verhindern oder rechtzeitig vor Prozessende entsprechend zu korrigieren.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe eine rasche und eindeutige Bestimmung von Mikroorganismen durchgeführt werden kann. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden zur Verfügung zu stellen, die in oben genannten Verfahren verwendet werden können. Diese Sondenkombination ist in der Lage anhand der in dieser Erfindung inkludierten spezifischen Auswertung mehr als nur eine Spezies pro Probe zu identifizieren.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Isolierung von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren, c) Inkontaktbringen der isolierten Nukleinsäuren mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der Nukleinsäure des mindestens einen zu identifizierenden Mikroorganismus bindet, und mindestens 80% ident ist mit einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmente davon und deren revers-komplementären Sequenzen, wobei die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, d) Nachweisen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde und e) Identifizieren eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle A ange- - 2 • · • · • · · · · • · · « ·· ·· führten Mikroorganismen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Mikroorganismen jeglicher Art (ausgewählt aus Tabelle A und B), beispielsweise Lebensmittel-relevante Mikroorganismen, Mikroorganismen, welche für Infektionen (z.B. Euterinfektionen) verantwortlich oder an diesen beteiligt sind, in jeglicher Art von Probe bestimmt bzw. nachgewiesen werden. Die Probe kann erfindungsgemäß von verschiedensten Quellen bezogen werden, in denen das Vorhandensein von Mikroorganismen vermutet oder aber auch bestätigt werden soll. Daher können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei der Auswahl von zu bestimmenden Mikroorganismen die hierin beschriebenen, und geoffenbarten, spezifischen Sonden gemäß Tabellen A und B herangezogen werden. Der Fachmann ist in der Lage anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens die Sonden der zu bestimmenden Mikroorganismen auszuwählen. Erfindungsgemäß ist es daher möglich, die Anwesenheit von mindestens 1, vorzugsweise mindestens 2, noch mehr bevorzugt mindestens 10, (oder aber 20 oder 50), Mikroorganismen in einer Probe gleichzeitig zu bestimmen. Dabei können erfindungsgemäß alle oder 1 bis 5 oder 1 bis 3 oder 1 bis 2 Sonden pro zu bestimmenden Mikroorganismus verwendet werden. Erfindungsgemäß werden im Verfahren mindestens eine, vorzugsweise mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 80, 100 Sonden gleichzeitig verwendet. Die an einem festen Träger (z.B. Slide, Bead oder Matrix) immobilisierten Sonden sind in der Lage spezifisch DNA zu binden, die den entsprechenden Mikroorganismen gemäß Tabelle A und B zugeordnet werden können. Es ist erfindungsgemäß auch möglich Fragmente der in den Tabellen A und B angeführten Sonden einzusetzen. Um ausreichende Spezifität zu gewährleisten ist es jedoch bevorzugt, dass diese Sondenfragmente zumindest 15, noch mehr bevorzugt mindestens 20, Nukleotide umfassen.
Mit dem erfindungsgemäßen DNA-basierten Verfahren kann insbesondere mikrobielle DNA in einer manuell hergestellten DNA-Suspension bestehend aus prokaryotischer und eukaryotischer DNA detektiert werden. Diese künstlich hergestellte DNA-Suspension ist das Ergebnis einer im Grund frei wählbaren DNA-Isolierungs-methode, welche neben DNA auch noch andere Makromoleküle (z.B. Proteine, Lipide, Kohlehydrate, ...) enthalten kann.
Das Ausgangsmaterial für die Herstellung dieser DNA-Suspen-sion ist zumeist natürlichen Ursprungs (z.B. klinische Proben der Human-Medizin, insbesondere Körperflüssigkeiten (wie etwa Blut, Urin, Speichel oder Liquor), und Abstriche, Proben der Ve-terniärmedizin, insbesondere tierische Körperflüssigkeiten, wie Blut, Milch, Speichel und Liquor; Proben aus der allgemeinen Tierhaltung und Fleischproduktion; Proben aus Lebensmittelproduktion beginnend vom Rohprodukt bis zur fertigen Ware, z.B. im Zuge der Bewertung von Hygienekriterien oder der Überwachung und Bewertung von Fermentationsprozessen (z.B. alkoholische Fermentation, Milchsäuregärung oder Joghurtherstellung und der Produktion von speziellen Fleischprodukten); Lebensmittelproben insgesamt, z.B. für die Vorbeugung von Zoonosen; Proben aus der technischen Produktion, insbesondere der Fernmentation zur Herstellung Sekundär-Metaboliten (wie etwa Zitronensäure oder Buttersäure) oder Proben für die Bewertung von Fermentationsprozessen im Zuge der pharmazeutischen Produktion).
Des Weiteren kann die erfindungsgemäße Sonde bzw. Sondenkombination auch intrazelluläre Keime (z.B. Mycoplasmen, Chlamydien und Rickettsien) detektieren (konventionelle Methoden mittels Kultivierung würden bis zu vier Wochen dauern).
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals pathogene neben nicht-pathogenen Keimen und auch intrazelluläre Keime aus einer Suspension mit einer Vielfalt von differenter DNA zu detektieren. Hierbei ist es nicht nötig, dass die mikrobiellen Spezies einzeln vorliegen, sondern können auch direkt aus einer Mischung von Mikrobenpopulationen detektiert, identifiziert und erfasst werden. Dieses Verfahren ist durch die Verwendung eines Auswerteverfahrens besonders vorteilhaft, welches innerhalb einer Sondenkombination das spezifische Hybridisierungsmuster einer Einzel-Hybridisierung erkennt und bewertet und dann dieses spezifische Hybridisierungsmuster auch innerhalb von Hybridisierung mit mehreren Keimen (z.B. zwei verschiedene Bakterienspezies) erkennen und somit beide Keime eindeutig identifizieren kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher weiters ein Sonden-Panel bestehend aus Spezies-spezifischen und multispezifischen Sonden mit dem dazugehörenden Hybridisierungsmuster-Auswertever-fahren zur parallelen Identifikation von mehreren Spezies aus 4
• · · · • · · · ·#· ·· • 9t ·· · · · ·· einer Probe (z.B. Nearest centroid Algorithmus).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiters einen Verfahrensschritt umfassen, bei dem prokaryotische DNA (Gram positive und Gram negative sowie intrazelluläre Keime) von eukaryotischer DNA getrennt wird, um dadurch die mikrobielle Ziel-DNA spezifisch in der Probe anzureichern und somit die Sensitivität und Spezifität zu verbessern. Dies gilt insbesondere im Falle von intrazellulären Keimen (z.B. aus klinischen Proben der Humanmedizin, Veterinärmedizin oder auch der Lebensmittelkontrolle).
Alternativ zur Anwendung der gesamten Sondenkombination für z.B. einen Mikroarray für die Mikroben-Detektion basierend auf spezifischen DNA-Sequenzen in einer beliebigen DNA-Suspension, kann das gesamte Panel aufgeteilt werden und so kleinere Sondenkombinationen generiert werden. Diese enthält die DNA-Sonden, welche spezifisch für bestimmte Spezies einer definierten Anwendung (z.B. Mastitis, Zoonose, Sepsis, intrazelluläre Keime usw.) sind und auf technische Plattformen (z.B. Mikroarray) mit kleineren Sondenkombinationen zusammengestellt werden können.
Erfindungsgemäß können die Sonden über Spacer-Moleküle (Leiter) an dem festen Träger gebunden werden (z. B. mehrere Thymidin-Reste usw.). Alternativ dazu können die Sonden an sich chemisch derart modifiziert werden, dass die Sonden an dem festen Träger zu binden vermögen (z.B. Amino- oder Thiolmodifikatio-nen). Diese Modifikationen können auch an einem Spacer vorgesehen sein.
Der Ausdruck „Identität", wie hierin verwendet, gibt an, ob zwei (oder mehrere) Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die bis zu einem bestimmten Grad („% Identität") miteinander identisch sind. Dieser Grad kann unter Verwendung bekannter Computer-Algorithmen, wie dem „FAST A"-Programm bestimmt werden, wobei beispielsweise die Standardparameter („default parameters") wie in Pearson et al. (1988) PNAS USA 85: 2444 verwendet werden (andere Programme inkludieren das GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) Nucleic Acids Res., 12, 387-395), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J.. Bishop, Hrg., Academic Press, San Diego, 1994, und Carillo et al, (1988)SIAM J Applied Math 48 : 1073). Beispielsweise kann das BLAST-Tool der NCBI-Datenbank zur Bestimmung der Identität verwendet werden. Zu anderen im Handel oder öffentlich erhältlichen Programmen zählen das DNAStar "MegAlign"-Programm (Madison, WI) und das University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG) "Gap"-Programm (Madison, WI)). Die prozentuelle Identität von Nukleinsäure-Molekülen kann weiters beispielsweise durch Vergleich der Sequenz-Information unter Verwendung eines GAP-Compu-ter-Programms bestimmt werden (z.B. Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443, in der Neubearbeitung von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Kurz gesagt definiert das GAP-Programm die Identität als Anzahl der fluchtenden Symbole (d.h., Nukleotide oder auch Aminosäuren), die identisch sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Symbole in der kürzeren der beiden Sequenzen. Die Standard-parameter für das GAP-Programm können inkludieren: (1) eine unäre Vergleichs-Matrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und für Nicht-Identitäten) und die gewichtete Vergleichs-matrix von Gribskov et al., 14:6745, wie von Schwärtz und Dayhoff, Hrsg., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRÜCTURE, National Biomedical Research Foundation, S. 353-358 (1979) beschrieben; (2) ein Pönale von 3,0 für jede Lücke und ein zusätzliches 0,10-Pönale für jedes Symbol in jede Lücke; und (3) kein Pönale für End-Lücken.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die verwendeten Sonden zu mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, mehr bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100%, Identität mit den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 auf.
Im Lebensmittel-Bereich können beispielsweise Mikroorganismen in Milch und Milchprodukten bestimmt und identifiziert werden, die einerseits als Indikator für unzureichende Hygiene dienen und andererseits - bei fermentierten Milchprodukten - das Feststellen einer etwaigen Fehlfermentation ermöglichen.
Bei Milch, beispielsweise, kann qualitativ und semi-quantitativ die Gesamtkeimzahl bestimmt werden. Für die Evaluierung der hygienischen Bedingungen während der Milchgewinnung bzw. -Stapelung, sowie der Eignung der Milch für die Weiterverarbeitung zu Milchprodukten bzw. deren Verteilung an weiterverarbeitende Betriebe wird im Rahmen der Qualitätskontrolle eine Bestimmung der Mikroben-Population durchgeführt. 6 # · ·· • ♦ • · • · ··· ·«· ·· • · • · • · • · ··
In gesunder Milch sind Keimzahlen von 104 bis 107 Keimen pro ml zu erwarten. Daher ist eine Beurteilungs-Möglichkeit der Vitalität und Keimart sehr wichtig. Im Rahmen einer Kontrolle des Wirkungsgrades der Pasteurisierung (z.B. anlässlich einer Qualitätskontrolle) kann durch die Anwendung von DNA-Mikroarrays die Zeit der Bestimmung von mehreren Tagen (bei konventionellen Methoden mit Anzucht) auf ca. 5 Stunden, oder je nach eingesetzter Technologie noch weniger, reduziert werden und somit das Rohprodukt in einem frischeren Zustand weiterverarbeitet bzw. ausgeliefert werden.
Ziel ist die möglichst rasche Identifizierung von Mikroorganismen, das Erkennen eventuell vorhandener pathogener Keime und deren vollständige Ausschaltung bzw. eine Indikation für eine erforderliche Reduktion der Gesamtkeimzahl im Sinne einer Erhöhung der Haltbarkeit bei Kühllagerung.
In gesunder Milch können unterschiedliche Keimarten Vorkommen (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden) :
Keimgruppen in Abhängigkeit ihrer Herkunft:
Euterflora: Micrococcen, Staphylococcen, Lactococcen, Streptococcen, Corynebacterien
Luftflora: Enterobacterien, Enterococcen, Micrococcen, Pseudomonaden, Sporenbildner (Clostridien, Bacillen), Hefen, Schimmel,
Gerätschaftskontamination: aus Milchresten und der Umgebung (s.o.) Mögliche Belastung der Rohmilch von pathogenen Keimen:
Mycobacterium tuberculosis, Brucella abortus und Brucella melitensis Corynebakterien (Diphtherie);
Mastitis-Erreger (siehe Mastitis)
Enteritis-Erreger (siehe Enteritis)
Listeria monocytogenes
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosi Coxiella burnetti
Bei der Herstellung von fermentierten Milchprodukten ermöglicht die optimale Kombination der Mikroorganismen (Starterkulturen) einen optimierten Fermentationsprozess, wobei durch - 7 • ·· ··« « ·« ·· t ·♦· ·· ·· • · · • * · J · · · • · « ·* ··
Kenntnis der Stoffwechselprodukte das Endprodukt hinsichtlich Qualität, Sensorik, Beschaffenheit, Geruch und Geschmack beeinflusst werden kann. Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäße Microarray zur Unterstützung der Qualitätskontrolle, wie in Lebensmittel-Produktion üblich, dienen.
Durch die Anwendung von Hybridisierungs-Technologien kann die Zeit der Identifizierung von Keimen deutlich beschleunigt werden und die Produkte können früher ausgeliefert werden. Die Frische eines Produkts hat einen sehr großen Einfluss auf deren Qualität.
Unter fermentierten Milchprodukten werden erfindungsgemäß Joghurt, Sauermilch, Sauerrahm, Buttermilch, Kefir, Probiotika, Käse und dergleichen subsummiert.
Durch die Kontrolle der Mikroorganismen-Zusammensetzung während der Gärung soll eine möglichst rasche Kontrolle des Fermentationsprozesses möglich sein, um Fehlgärungen zu entdecken bzw. zu vermeiden. Das Überwachen der Mikroben-Kulturen soll als Steuerungs-Werkzeug für die eingestellten Fermentationsbedingungen dienen, um einen allfälligen Eingriff in den Stoffwechsel bestimmter Gruppen durch Messergebnisse zu unterstützen. Des Weiteren unterstützt die Mikroben-Populationsbestimmung des fertigen Produktes Datenmanagement, Datensammlung und Produktevaluierung auch im Rahmen eines Qualitätsmanagements. In diesem Zusammenhang entsteht auch die Informationsgewinnung über Produkteigenschaften und Fermentationsverlauf sowie über die Sicherstellung der Erfüllung vorgeschriebener Qualitätskriterien.
Um eine kontrollierte Fermentation von Milch bzw. vorbearbeiteter Milch zu erlangen werden dem Substrat (Ausgangsprodukt) verschiedene Starterkulturen zugesetzt: Lactococcus (z.B. Lc. lactis, Lc. diacetilactis, Lc. Cremoris); Streptococcus (z.B.
Sc. salivarius, Sc. thermophilus); Leuconostoc (z.B. Ln. mesen-teroides, Ln. mesenteroides subsp. cremoris, citreum); Lactobacillus (z.B. Lb. delbrueckii, Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. reuteri, Lb. Kefir); Bifidobacterium (z.B. B. bi-fidum, B. longum); Hefen (z.B. Saccharomyces, Candida); Propionibacterium freudenreichii.
Buttereikulturen werden für die biologische Rahmreifung eingesetzt und dienen der Erhaltung eines aromatischen Sauerrahms durch Milchsäure- und Diacetylbildung. Hierbei entsteht die 8 # ·· t « #· « #·· » ·· t ··· ·« «·« ♦ ·· ·· • · • · • · • · ··
Milchsäure aus der enthaltenen Lactose und das Diacetyl aus Citrat. Die Bebrütung mit Buttereikulturen erfolgt bei tiefen Temperaturen (um die physikalische Reifung nicht zu egalisieren) und längeren Bebrütungszeiten. Herkömmlicher Nachweis der Kulturen erfolgt über Kultivierung. Häufig eingesetzte Buttereikulturen sind: Lactococcus lac-tis, Lc.cremoris, Lc. diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides,
Ln. citrovorum und Lactobacillus helveticus. Für die Aufbereitung des Käsesubstrates werden verschiedene Kulturen als Milchsäurebildner, Starterkulturen bzw. Säurewecker eingesetzt. Diese bewirken eine rasche homofermentative Milchsäuregärung (aus Milchzucker), sowie eine schwache Proteolyse (von Casein) im Zuge der Reifung von Käse.
Ein Monitoring des Fermentationsverlaufs ist für die Qualität des Produkts wichtig. Traditionell eingesetzte Kulturen sind Joghurtkulturen (für Hart- und Schnittkäse), Buttereikulturen (für Schnitt- und Weichkäse) und käsereispezifische Lactobacillen: Lb. casei, Lb. lactis, helveticus. Probiotische Kulturen umfassen Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus und Bifidobakterien. Spezielle Käsereikulturen sind beispielsweise Propionibakterium freudenreichii ssp. Shermanii, etc.. Für Schimmelkäse wird häufig Penicillium roqueforti, candidum eingesetzt. Für das Schmieren der Oberfläche dienen Brevibacterium linens, Arthrobacter globiformis, Microbacterium sp., Coryneforme-Bakterien; und Hefen aus der Umgebung, wie Saccharomyces, Debaryomyces, Candida. Die Aromabildung innen wird durch Lactococcen (bei allen gereiften Käsen, eher schwach), Lactobacillus casei (+Subspecies) und Enterococcus faecium (mittelmäßig) bewirkt.
Probleme bei der Käseherstellung ergeben sich durch Entero-coccen (führt zu einer Nachgärung), Clostridium tyrobutyricum (bewirkt Spätblähung) und durch coliforme Keime, oder Lactosepositive Hefen oder heterofermentative Lactobacillen (führen zu Fehlgärungen).
Auch die mikrobielle Qualität bzw. Belastung von Fleisch und dessen Produkten kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Mikroarrays bestimmt werden.
Fleisch dient als Ausgangsprodukt für viele weitere Lebensmittelerzeugnisse. Durch seine nährstoffreiche Beschaffenheit und hohen Feuchtegehalt ist jedoch das Fleisch einer hohen Kontaminationsgefahr unterworfen. Auch die Aufarbeitung des - 9 - • · • · w ·· • • f · 4 • ·· ·· • • ·· • · • · • 4 ♦ • • # • · 4 0 ♦ • • · ·· ♦ ** ··· • ··· • ·· • • · t·
Schlachtkörpers bietet eine Reihe von Kontaminationsquellen. Umso wichtiger ist eine durchgehende Kontrolle des Ablaufs auf Vorhandensein von mikrobiellen Keimen, welche die Verwertbarkeit des Fleisches beeinflussen bzw. sogar unmöglich machen würden.
Die Einhaltung von strengen Hygienevorschriften bei der Handhabung von Fleisch ist daher von höchster Dringlichkeit. Die Verwendung von molekularbiologischen Methoden zur Detektion von Keimen bietet hier eine schnelle und zuverlässige Alternative zur zeitaufwändigen Kultivierung, um die Frische der Lebensmittel zu garantieren.
Biologische Indikatoren für den Frischezustand sind die Gesamtkeimzahl und insbesondere E.coli und andere Enterobakterien. Eine Testung auf das Vorhandensein von pathogenen Keimen ist ebenfalls unerlässlich: Salmonellen, Campylobacter, Listerien.
Ferner lässt sich erfindungsgemäß auch die Mikroorganismenflora im Zuge des mikrobiellen Reifeprozesses von Fleisch und Rohwürste verfolgen (z.B. Salami, Kantwurst, Mettwurst)
Wie bereits für fermentierte Milch diskutiert, sind diese Punkte auch für fermentierte Fleischprodukte zutreffend.
Bestimmte Fleischprodukte, aber auch rohes Fleisch werden zur Veränderung des Geschmacks oder zur Erhöhung der Haltbarkeit einem fermentativen Reifungsprozess unterzogen. Derartige Methoden sind oft auch auf traditionellen Überlieferungen bedingt. Eine Kontrolle der Mikroben-Population ist gerade bei Fleisch äußerst wichtig. Besonders während der ersten Tage der Lagerung ist aufgrund des hohen aw-Wertes die Gefahr des mikrobiellen Verderbs äußerst hoch. Milchsäurebakterien bilden Milchsäure (homofermentativ), führen so zur Senkung des pH-Wertes und hemmen weiters das Wachstum von pathogenen Keimen (insbesondere Salmonellen und Listerien). Micrococcen und Staphylococcen wachsen generell nur schwach. Hefen tragen durch Lipolyse und Proteolyse zur Aromabildung bei und verleihen ein typisches Aussehen. Hefe und Schimmel werden außen aufgetragen. Typische Mikroorganismen, die in Reifungsprozessen von Fleisch Anwendung finden, sind u.a. Milchsäurebakterien, wie Lactobacillus sake, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. farciminis, Lb. ali-mentarius (L. viridescens), Lb. carnis, Lb. casei, Lb. bulgari-cus; Pediococcus acidilactici, (ehemals cerevisiae), Pediococcus pentosaceus, P. acidilacti; Carnobacterium divergens, Lactococ-cus sp., Leuconostoc mesenteroides, Kokken, wie Staphylococcus - 10 • · · • · • · ·· · ··· ·· #·· ·* • · I • · I 9 · · • · · ·♦ *· ·· xylosus, carnosus, sciuri, simuläns, xylosus; Micrococcus va-rians; Streptococcus diacetylactis, Streptococcus lactis, Hefen, wie Debaryomyces hansenii, (D. kloeckeri, D. cantarelli, D. pfaffii), Candida utilis, Streptomyces griseus, Schimmelpilze, wie Aspergillus sp. (z.B. fumigatus) und Pseudonomaden, wie Pseudomonas fragi, P. fluorescens; P. putida, P. Mephitica.
Grün-Schimmer von fermentiertem Fleisch unter aeroben Bedingungen (bei hohem pH-Wert) wird oft verursacht von folgenden Keimen: Hafnia alvei, Serratia liquefaciens, Alteromonas putre-faciens, Aeromonas hydrophilia.
Bei der Entstehung von Schwefel-Verbindungen und Alkyl-Estern, die zu geschmacklicher Ungenießbarkeit unter aeroben Bedingungen bei Lagerung bei tiefen Temperaturen führen, sind insbesondere Mikroorganismen Hafnia alvei, Enterobacter agglomer-ans, Serratia liquefaciens, Alteromonas putrefaciens und Aeromonas hydrophilia beteiligt.
Bei Vakuum-verpackten Lebensmitteln, insbesondere Fleischprodukte, können folgende Mikroorganismen zu Verderb führen: Leuconostoc mesenteroides, Brochothrix thermosphacta. Keimzahlen bis 108 pro cm2 können dabei vorgefunden werden, wobei auch Clostridium sp. eine Rolle spielen kann.
Bei der Sterilisation von Fleischkonserven liegt das Hauptaugenmerk bei Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus.
Bei Fisch und Fischprodukten sind generell ähnliche Faktoren wie bei Fleisch relevant.
Der Frischezustand des Fisches lässt sich anhand der Gesamtkeimzahl, Enterobakterien, psychrotoleranter Keime, etc. bestimmen. Häufig auftretende pathogene Keime in Fisch sind Salmonellen.
Neben tierischen Lebensmitteln ist die Keimbelastung auch bei pflanzlichen Produkten zu beachten (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden):
Sauerteig: enthält Lactobacillen, Saccharomyceten
Bier und Wein: Saccharomyceten, Leuconostoc, und andere
Sauerkraut (& saure Gemüsesäfte): Milchsäurebakterien
Essig: Gluconobacter
Kakaobohnen: Milchsäurebakterien, Hefen, Gluconobacter, wo- - 11 - 11 w ·· ··· ·· «·· • ·· »· ·· • · • · • • · • · • • « • t • • · • t ·· ·· • ♦ • ♦ • # • · ♦ · bei die Milchsäurebakterien insbesondere Lactobacillus sake, curvatus, plantarum, brevis; Pediococcus acidilactici, (Pedio-coccus cerevisiae), Pediococcus sp., Lactococcus sp., Leucono-stoc sp., sind.
Nicht nur bei der Herstellung von Lebensmitteln spielen Mikroorganismen eine wichtige Rolle, auch beim Lebensmittelverderb ist es von Vorteil, die am Verderb beteiligten Mikroorganismen zu bestimmen.
Die Folgen des Lebensmittelverderbs sind unerwünschte aerobe und anaerobe stoffliche Umsetzungen und damit verbundene sensorische Veränderungen im Sinne der Nichterfüllung der berechtigten Verbrauchererwartung bzw. des Lebensmittelsverderbs. Die charakteristische Verderbsflora ist insbesondere abhängig vom Lebensmitteltyp (Inhaltsstoffe, pH-Wert, aw-Wert), der Umgebungstemperatur und der Gegenwart/Abwesenheit von Luft. Eine exakte Bestimmung der dominanten Keimflora eines bestimmten Produktes oder einer Produktgruppe ist für die Bestimmung und Risikoanaly-se eines allenfalls gegebenen Lebensmittelverderbs sehr wichtig (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden):
Brot, Gebäck, Getreide: Schimmelpilze Obst: Schimmelpilze, Hefen Fleisch, Ei, Fisch: Pseudomonaden, Enterobakterien, Micrococcen, Brochothrix Milch: Milchsäurebakterien, Enterobakterien, Pseudomonaden, Enterococcen Bacillen Käse: Coliforme Keime, Clostridien Fetthaltige Speisen: Schimmelpilze, Corynebakterien Für die Gärung bei Lebensmitteln sind insbesondere die folgenden Mikroorganismen verantwortlich:
Alkohol: Milchsäure: Probionsäure: Buttersäure: Ameisensäure:
Hefen, Zymomonas
Milchsäure-Bakterien, Bifidobakterien, Propionibakterien Clostridien Enterobakterien
Der Protein- und Fettabbau in Lebensmitteln erfolgt mit Pro-teolyten, die von Pseudomonaden, Enterococcen, Brevibakterien - 12 - • · ·· ·· ; · · · ·· • · · · ·· ··· ···
stammen können, bzw. von Lipolyten, die von Pseudomonaden, Cory-nebakterien, Schimmelpilz stammen können.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäße Mi-croarray kann auch dazu verwendet werden, Lebensmittelinfektionen (Lebensmittelvergiftungen) festzustellen. Infektionsquellen für Lebensmittelinfektionen sind kranke Tiere, davon stammende Lebensmittel und kranke Menschen (Kontaktkontamination, Ausscheidung) . Für eine Infektion sind relativ wenig Keime notwendig, das Lebensmittel dient hierbei oft als Transportmittel und weniger als Substrat.
Krankheitsformen und Erreger (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden):
Enteritis: Salmonella enteritidis (mit versch.
Serotypen)
Enteropathogene E. coli
Vibrionen: Vibrio parahaemolyticus, cholerae
Yersinia enterocolitica
Campylobacter jejuni
Aeromonas hydrophilia
Encephalitis: Ulcus: Tuberkulose: Brucellose: Diphtherie: Typhus: Ruhr: Cholera:
Listeria monocytogenes
Helicobacter pylori
Mycobacterium tuberculosis
Brucella abortus
Corynebacterium diphtheriae
Salmonella typhi
Shigella dysenteriae
Vibrio cholerae
Andere Mikroorganismen, die bei Lebensmittelinfektion eine Rolle spielen, sind (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): pathogene Enterobakterien, Listerien, Staphylococcen, Shigellen, Aeromonas hydrophilia, Clostridium difficile, Mycobacterium bovis, Coxiella burnetti, Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Salmonella paratyphi, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Plesiomonas shigelloides, Franciselia tularensis, Bacillus 13 • ·· • · ♦ · 9 9 Μ ·»· 9 • 9 9 ···
cereus; Campylobacter coli, Campylobacter laridis, Arcobacter cryaerophilus, A. butzleri, enterovirulente E. coli, Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei, Yersinia enterocolitica, (Y. pseudotuberculosis), Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, Enterobacter sakazakii, Legionella pneumophila, Mycobacterium avium ssp paratuberculosis, Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, Francisella tularensis, Coxiella burnetti, Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii.
Ein Charakteristikum von Lebensmittelintoxikationen ist die hohe Keimzahl der genannten Bakterienarten bzw. der toxigenen Stämme, die benötigt wird, genügend große Mengen an Toxin herzustellen (gilt auch für das Mycelwachstum von Schimmelpilzen). In diesem Fall dienen die Lebensmittel als gutes Anreicherungsmedium. Besonders wichtig ist, dass Negativbefunde bezüglich Toxinbildner nichts über eventuell schon vorher erfolgte Keimbelastungen plus Toxinanreicherungen aussagen (Notwendigkeit der Kultivierung, dies ist bei vorhergehender Inaktivierung nicht mehr möglich => die Toxine bleiben jedoch aktiv).
Bekannte Krankheitsformen und Erreger, aüf denen Lebensmittelintoxikationen beruhen, sind:
Botulismus: Clostridium botulinum
Diarrhoe/Vomitus: Staph. aureus, Bacillus cereus,
Clostridium perfringens
Unspez. LM-Vergift.: Pseudomonaden, Enterococcen
Weitere Mikroorganismen, die zu Lebensmittelintoxikationen führen sind: Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophilia, E. coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch - durch eine geeignete Auswahl an einem festen Träger gebundenen Nukleinsäuren - sowohl erwünschte als auch unerwünschte Mikroorganismen gleichzeitig zu bestimmen. Einsatzgebiet eines derartigen Mi-kroarrays ist beispielsweise die Identifizierung von bei der Fermentation erwünschten Mikroben, kombiniert mit Lebensmittel-Verderb-Mikroben für das Monitoring des Wachstums von Lebensmittel-Keimen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch Septikämie oder Sepsis und Blutvergiftung durch Bakterien oder Pilze, die - 14
·· ··· • t ··· ·· t ··· ·· • I • I A · • » ·· sich im Blut vermehren, nachgewiesen werden bzw. können genau die dafür verantwortlichen Keime indentifiziert werden, wodurch die Theraphie effektiver gestaltet werden kann.
Die Erreger können aus einer infizierten Körperstelle, durch eine Verletzung oder bei einem chirurgischen Eingriff in den Kreislauf gelangen. Typische Kennzeichen der Septikämie sind Schüttelfrost, Fieber, Erschöpfung, Thrombosen und Infektionen innerer Organe. Befinden sich die Bakterien nur kurze Zeit im Blut, spricht man von Bakteriämie; eine durch Bakterien verursachte Septikämie wird mit Antibiotika behandelt. Im Verlauf einer Septikämie kann als Komplikation ein lebensbedrohlicher septischer Schock auftreten, der durch Blutdruckabfall und Erhöhung der Herzfrequenz gekennzeichnet ist und dem durch Verabreichung von Hydrocortison begegnet werden kann.
Blutvergiftung ist die häufigste Todesursache nach schweren Unfällen, Operationen und manchen Krebstherapien. Nach Angaben von 2001 sterben allein in den USA jährlich 225 000 Menschen an Septikämie.
Herkömmliche Detektionsverfahren der Sepsis basieren auf der Kultivierung des Erregers und dauern 2 bis 4 Tage. Andere molekularbiologische Methoden können nur eine stark begrenzte Anzahl von Erregern nachweisen (z.B. FISH oder real-time PCR). Im Vergleich dazu ist es mit einem Mikroarray und der benötigten Sondenkombination möglich die Anzahl der detektierbaren Erreger beliebig zu erweitern. Andere Mikroarray-Anwendungen können nur eine Spezies automatisiert detektieren und identifizieren. Mit der hier vorgestellten Auswertungsmethode ist jedoch eine eindeutige Identifizierung von auch 2 Pathogenen möglich (10 % aller Sepsis-Fälle).
Die mit dieser Sondenkombination detektierbaren typischen Erreger der Blutvergiftung sind (die entsprechenden Sonden, die für die einzelnen Erreger oder für die Gruppe von Erregern verwendet werden können, sind in Tabelle A angeführt und können je nach Bedarf kombiniert werden): Staphylococcus aureus, St. epi-dermidis, Enterococcus faecalis, E. faecium, Vertreter der Farn. Enterobacteriaceae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, Bacillus cereus, Citrobacter freun-dii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae,· S. pyogenes, S. agalactiae, S. suis.
Lungenentzündung ist eine Sammelbezeichnung für etwa 50 Lun- - 15 - - 15 - ♦ · • « • 4# • · • • » • • • • ♦ 4 ♦ 44 • * ··· ·♦ ··· ·· ·· • ♦ · · • · · · • · · · • · · · ·♦ ·· genkrankheiten, bei denen ein zäher Auswurf abgesondert wird. Lungenentzündung kann von Bakterien, Viren, Rickettsien, Mycoplasmen, Pilzen oder Protozoen hervorgerufen werden.
Bevor es Antibiotika gab, war die Lobärpneumonie, eine akute Infektion, die häufigste Todesursache bei Erwachsenen. Der Erreger ist Streptococcus pneumoniae. Lobärpneumonie tritt häufig im Winter auf, insbesondere nach einer Virusinfektion der oberen Atemwege. Zu den Symptomen gehören ein einmaliger, starker Schüttelfrost, gefolgt von Fieber bis zu 40 °C, Brustschmerzen beim Atmen, Husten und blutiger Auswurf. Die Erreger befallen in der Regel einen ganzen Lungenlappen oder Teile davon. Bei der beidseitigen Pneumonie sind beide Lungenflügel betroffen.
Die wichtigste andere Form der bakteriellen Lungenentzündung ist die Bronchopneumonie, die im Gegensatz zur Lobärpneumonie die Lungenbereiche in der Nähe der Bronchiolen in Mitleidenschaft zieht. Die Erreger sind manchmal ebenfalls Pneumokokken, aber die Krankheit kann auch von Klebsiella pneumoniae,Haemophilus influenzae sowie verschiedenen Staphylokokken und Streptokokken hervorgerufen werden. Die Bronchopneumonie bricht weniger plötzlich aus als die Lobärpneumonie, und das Fieber steigt nicht so hoch. Eine weitere Form der bakteriellen Lungenentzündung entdeckte man 1976: Diese Krankheit, die von Legionella pneumophilia hervorgerufen wird, nennt man Legionärskrankheit.
Die meisten Formen der bakteriellen Lungenentzündung sind mit Antibiotika gut zu behandeln.
Eine häufige Form der Lungenentzündung, die man früher primäre atypische Pneumonie nannte, wird von Mycoplasma pneumoniae hervorgerufen, einem winzigen Prokaryonten. In epidemischer Form tritt eine Mycoplasmenpneumonie gelegentlich in Schulen und Kasernen auf.
Die mit dieser Sondenkombination detektierbaren typischen Erreger der Lungenentzüdung sind: Streptococcus pneumoniae, Sta-phylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Vertreter der En-terobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Candida sp.
Harnwegsinfektionen sind entzündliche Erkrankungen der har-nableitenden Wege, des Hohlsystems, das von den Nierenkelchen, den Nierenbecken (obere Harnwege) über den Harnleiter und die Harnblase zur Harnröhre reicht (untere Harnwege).
Symptome sind schmerzhaftes Wasserlassen, unter Umständen - 16 - * · · · · · ··· ··· ··· ..
Schmerzen in der Nierengegend, Fieber, Krankheitsgefühl. Über 80 Prozent der Harnwegsinfektionen werden vom Darmbakterium Escherichia coli und anderen Mitgliedern der Familie Enterobacteria-ceae verursacht. Der Nachweis des massenhaften Auftretens von Bakterien im Urin sichert die Diagnose.
Am häufigsten von Infekten der Harnwege betroffen sind Frauen, weil deren Harnröhre im Vergleich zur männlichen Harnröhre viel kürzer ist. Bei unkomplizierter Harnröhren- oder Blasenentzündung wird eine Einmal- oder Kurzzeittherapie mit einem harnwegspezifischen Antibiotikum und gute Spülung durch Vieltrinken angeordnet. Eine Langzeittherapie kann erforderlich sein.
Intrazelluläre Keime können die Ursache von vielen verschiedenen Infektionskrankheiten sein. Wie bereits erwähnt können Spezies der Gattung Mycoplasma die atypische Lungenentzündung verurschen. Wieder andere intrazelluläre Erreger sind verantwortlich für schwerwiegende Infektionen des Urogenitaltraktes sowie an Schleimhäuten. Des Weiteren können durch parasitierende Insekten (z.B. Zecken) verschiedene Spezies von intrazellulären Erregern übertragen werden, welche im menschlichen (und auch tierischen) Organismen zu Entzündungsreaktionen führen können (z.B. Borreliose verursacht durch den Erreger Borrelia burgdorferi)
Bezüglich des Nachweises von Eutererkrankungen, insbesondere von Mastitis, sind in der Literatur nur Verfahren beschrieben, die einerseits auf PCR basieren und andererseits das Anzüchten der für Mastitis charakteristischen Mikroorganismen. Diese Verfahren sind jedoch aufgrund der relativ langen Verfahrensdauer nicht geeignet um routinemäßig eingesetzt zu werden. Es ist entscheidend für eine effiziente Therapie, die für die Mastitis verantwortlichen Organismen rasch zu bestimmen.
Mastits ist die bedeutendste Rinderkrankheit mit einem Verbreitungsgrad von 20% der Kühe pro Jahr. Für die Landwirtschaft entstehen dadurch hohe Kosten in Form von Milchgeldverlust, Behandlungskosten und verringerte Nutzungsdauer der Kühe. Für den Konsumenten entsteht ein erhöhtes Risiko im Falle einer Rohmilchkonsumation. Des Weiteren ändert sich der Nährwert der Milch durch eine Änderung der Milchzusammensetzung. Für die milchverarbeitende Industrie entsteht ein hoher Schaden bei der Käseproduktion (infolge Milchqualitätseinbußen: Casein- und Cal- ciumabnahme, pH-Anstieg), Sauermilchprodukten (infolge allfälliger Antibiotika-Rückstände) und der Trinkmilch (durch Zunahme thermolabiler Molkeneiweiße).
Die konventionelle Mastitisindikation beruht auf der Bestimmung der somatischen Zellen (Leukozyten und Epithelzellen) (die so genannte „Zellzahl") durch direkte mikroskopische Zählung, Elektronische Zählverfahren und Zellmassenermittlung. Bis 10.000 bis 100.000 Zellen entspricht es dem Normbereich. 100.000 bis 500.000 kann beim Einzeltier noch im Normalbereich liegen. Über 500.000 Zellen pro ml besteht Mastitis-Gefahr und ab 1 Million Zellen pro ml liegt Mastitis vor.
Eine weitere Möglichkeit ist die kombinierte Kontrolle von Zellzahl und Bakteriologie, hierbei wird jedoch nur auf die Präsenz vom hämolytischen Keimen getestet. Eine erste Beurteilung auf Vorliegen einer Mastitis wird direkt am Produktionsbetrieb mittels des Laugentests oder Schalmtests durchgeführt. Für eine schnelle und erfolgreiche Behandlung ist jedoch die Bestimmung der Art des Erregers unerlässlich. Die Unkenntnis des Erregertyps wird als Hauptgrund für das Nichtgelingen der Tilgung von Mastitis angegeben. Hinzu kommt die Problematik der Probensammlung und Versand. Die Bestimmung von hartnäckigen Fällen der Mastits wird in zentralen Labors durchgeführt, wodurch der Versand bereits bis zu einem Tag dauert und dadurch der Großteil der Erreger ihre Viabilität verlieren und konventionelle Bestimmungsmethoden mittels Kultivierung nicht mehr anwendbar sind. Demgegenüber können molekularbiologische Verfahren auch an nicht mehr teilungsfähige Keime exakte Bestimmungen liefern.
Erreger: * Staphylococcus aureus, St. xylosus, St. intermedius, St. hyicus, St. epidermidis * Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis * Coliforme: E.coli, Klebsiella pneumoniae, K. ozeane, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, E. aerogenes, E. ag-glomerans, E. sakazakii, Citrobacter freundii, C. di-versus, C. amalonaticus; * Arcanobacterium pyogenes (früher: Actinomyces pyogenes) * Mycoplasma bovis, M. colifornicum, M. bovigenitalicum, (selten: M. canadese, M. alkalescens) * Nocardia asteroides * Pseudomonas aeruginosa * Corynebacterium pyogenes, C. bovis * Sporenbildner: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, * Hefen: Candida sp., Rodotorula sp. * Pilze: Aspergillus fumigatus, * Algen: Prototheca zopfii
Mikroarrays mit speziellen, kleineren Sondenkombinationen für die einzelnen Mikroorganismen der folgenden Erkrankungen: • Arthritis: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Vertreter der Enterobacteriaceae, Pseudomonas sp. • Pneumonie: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Vertreter der Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Candida sp. • Blutvergiftung: Staphylococcus aureus, St. epidermidis, En-terococcus faecalis, E. faecium, Vertreter der Farn. Enterobacteriaceae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. suis, • Enteritis: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus, E. coli, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Clostridium dif-ficile, Shigella sp., Salmonella enterica, Vibrio chole-reae; • Endokarditis: Streptococcus sp., Staphylococcus sp., En-terobacteriaceae, • Tuberkulose: Erreger ist Mycobacterium tuberculosis; Nachweis aus der Milch möglich; hohes Erkrankungsrisiko bei Rohmilchkonsum • Brucelose: Erreger: Brucella abortus (bei Rind), Brucella melitensis (bei Ziegen und Schafen); Nachweis des Keimes in Milch durch kulturelle Methoden (jedoch schwierig); Ansteckungsrisiko bei Rochmilchkonsum sehr hoch. • Darminfektion (Enteritis) (unterschiedlicher Genese): Erreger: Salmonella enterica / enteritidis (diverse Serotypen), Enteropathogene E.coli, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica;
Enteritis hat ein breites Infektionsspektrum und ist in
19 ·* V
• · # ♦ · · • · ··· ·# gleicher Weise für den Menschen problematisch. Nachweis der Keime in Milch mit kulturellen Methoden möglich (jedoch sehr zeit- und materialaufwändig) und direkte mikroskopische Identifizierung.
Bei der Bestimmung von Mikroorganismen bei speziellen Fermentationen sind insbesondere folgende Mikroorganismen zu bestimmen (Vorsehen der entsprechenden Sonden auf einem festen Träger, z.B. Microarray).
Milchsäure-Gärung:
Species sind Vertreter der folgenden Gattungen: Lactococcen, Enterococcen, Streptococcen, Lactobacillen, Leuconostoc; Propionsäure-Gärung: z.B. Propionibacterium freudenreichii,
Ameisensäure-Gärung:
Durch Vertreter der Familie Enterobacteriaceae: z.B.: E. coli, Enterobacter aerogenes, Eb. cloacae, Klebsiella pneumoniae;
Buttersäure-Gärung:
Vertreter der Gattung Clostridium
Erfindungsgemäß wird unter „Isolieren von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren" nicht nur das direkte Isolieren der Nukleinsäure aus einer Probe verstanden (z.B. durch Extraktionsverfahren, wie das Phenolverfahren, oder durch Säulen) bei dem u.a. die Probe, insbesondere die zu detektierenden Mikroorganismen, aufgeschlossen werden, sondern auch das Gewinnen der Mikroorganismen aus einer Probe (z.B. durch Zentrifugation) und anschließendem Aufschließen der Mikroorganismen im Zuge einer Am-plifikationsrekation (z.B. durch PCR (Hitze führt zur Lyse der Mikroorganismen)) .
Erfindungsgemäß kann die Probe eine Lebensmittel- oder humane oder veterinärmedizinische Probe sein. Selbstverständlich ist es auch möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Fermentationslösungen zu untersuchen. Unter „Fermentationslösung" wird erfindungsgemäß eine im Zuge einer Fermentation gewinnbare Lösung verstanden (z.B. umfassend Nährmedium).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Lebensmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Milch, Milchprodukten, insbesondere Butter, Rahm oder fermentierten Milchprodukten, Fleisch, Fleischprodukten, insbesondere Rohwürsten, Fisch, Fischprodukten, Meeresfrüchten, insbe- sondere Muscheln, und pflanzlichen Lebensmittel, insbesondere Essig und Bier.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das milchgebende Säugetier ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel, Pferd und Kamel.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das humanmedizinische Produkt anzuwenden für Pathogenidentifizierung bei Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutvergiftung, Lungenentzündung, Harnwegsinfektionen, Meningitis, Peritonitis und Identifizierungen von anderen Abstrichen und Körperflüssigkeiten, wie Liquor und Sputum.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das veterinärmedizinische Produkt anzuwenden für Pathogenidentifizierung bei Tierkrankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EuterentZündung, Blutvergiftung, Lungenentzündung, Harnwegsinfektionen, Meningitis und Identifizierungen von anderen Körperflüssigkeiten, wie Liquor.
Um die Menge der zu detektierenden Nukleinsäuren in der Probe zu erhöhen, wird nach Schritt b) eine Amplifikation des 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gens der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik umfasst.
Die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens weisen die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 auf.
Detektionsverfahren zur Feststellung der Bindung von DNA an immobilisierte Sonden (insbesondere in der Microarray-Technolo-gie) benötigen in den meisten Fällen Farbstoff-markierte Moleküle. Daher ist die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenz- oder Chemilumines- t zenzfarbstoff. Des Weiteren können auch Methoden ohne vorhergehende Markierung des DNA Stranges angewandt werden. Dazu zählt der Einsatz von elektronischen Sonden zur Messung von Hybridisierungs-Ereignissen z.B. basierend auf Impendanz-, Resonanzoder Potentialänderung (Albers J et al., Anal.Bioanal.Chem. (2003) 377: 521-527).
Die Anzahl der am festen Träger immobilisierten Sonden hängt - 21 ·· · • « ·· ♦ · « • * · • · · ♦ · ··· ··· ·· • Φ • Φ davon, ab welche Mikroorganismen in einer Probe bestimmt werden sollen. Die isolierte Nukleinsäure wird vorzugsweise mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Isolierung von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren, c) Inkontaktbringen der isolierten Nukleinsäuren mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der Nukleinsäure des mindestens einen zu identifizierenden Mikroorganismus bindet, wobei der mindestens eine Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aeromonas hydrophilia, Alcali-genes defragrans, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Arca-nobacterium pyogenes, Arcobacter butzerli, Arcobacter cryoaero-philus, Arthrobacter globiformis, Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bi- fidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Brevibacterium casei, Brevibacterium epidermidis, Brevibacterium linens, Bro-chothrix thermosphacta, Brucella abortus, Brucella melitensis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candida, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilo-sis, Candida sake, Candida tropicalis, Candida utilis, Carnobac-terium divergens, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freun-dii, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium bovis, Corynebacterium casei, Cory-nebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, Cryptococcus, Deba-ryomyces hansenii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglome-rans, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococ-cus, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus saccharolyticus, Escherichia coli, Flavobacterium, Franciselia tularensis, Gluco-nobacter, Gluconobacter asaii, Gluconobacter oxydans, Hafnia al-vei, Helicobacter pylori, Klebsialla pneumoniae, Klebsiella oxy-toca, Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bifermentas, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus plantarium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus cremoris, Lac-tococcus diacetilactis, Lactococcus lactis, Lactococcus luteus, Legionella pneumophilia, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Microbacterium lac-ticum, Microbacterium schleiferi, Micrococcus lylae, Micrococcus tyrobutyricum, Micrococcus varians, Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma bovialkalescens, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovis, Mycoplasma californicum, Mycoplasma canadense, Nocardia asteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Plesiomonas shigelloides, Propionibacterium freudenreichii, Prototheca zopfii, Pseudomonas, Pseudomo-nas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mephitica, Pseudomonas putida, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Shewanella putrefaciens, Shigella, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella son-nei, Sporolactobacillus inulins, Staphylococcus aureus, Staphy-lococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Streptococcus aga-lactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis, Strepto-myces griseus, Torulaspora, Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Zymomonas mobilis.und die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, d) Nachweisen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde und e) Identifizieren eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle A angeführten Mikroorganismen, mit der isolierten Sonde.
Erfindungsgemäß können mit diesem Verfahren mindestens 1, - 23 ·· • I • · • e *e ·· ee • * • · • · ··♦ *·· ·· M • · t · • I · · • · · · • · · · ·· 10, 20, 30, 50, 70, 80 oder 100 Organismen detektiert werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 835.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise als Sonden bei der Detektion von DNA auf einem festen Träger immobilisiert verwendet werden. Dieser feste Träger kann in Form eines Platte, eines Beads oder einer Matrix vorliegen. Ferner eignen sich diese Sonden aufgrund von deren Spezifität als Sonden in PCR-Techniken, wie Echtzeit-PCR („Real time PCR"). Dabei können sie als Hybridisierungs-Sonden, TaqMan-Sonden (auch Hydrolyse-Sonden) , Molecular Beacons und Scorpion-Primer eingesetzt werden. Es sei hierbei anzumerken, dass anstelle des Nukleotids U auch das Nukleotid T eingesetzt werden kann.
Tabelle Ά:
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3’) SEQ ID Nr. Σ. coli Aeromonas hy-drophilia ahy 118 AAUGCCUGGGAAAUUGCCCAGUCGAG 1 118 ahy 129 AAUUGCCCAGUCGAGGGGGAUAACAGU 2 129 ahy 210 GGGCCUUGCGCGAUUGGAOAUGCCCA 3 210 ahy 216 UGCGCGAUUGGAUAUGCCCAGGÜGGG 4 216 Alcaligenes defragrans ade 76 GAAGAGCUUGCUCUUUGGUGGCGAG 5 76 ade 450 AAACGGCGCGGGCÜAAÜAACCÜGÜG 6 450 ade 832 UUGGGGOUUAUUAACC UUAGUAGCGC 7 832 ade 1239 UGGUCGGGACAGAGGGUUGCCAAGCCG 8 1239 Alcaligenes faecalis afe 476 UGCUGACGGUAUCUGCAGAAUAAG 9 476 afe 636 UUUUAACUGCCGAGCUAGAGÜAUGUCA 10 636 afe 739 UGGGAUAAUACUGACGCUCAGACAC 11 739 afe 818 AUGUCAÄCUAGOJGUUGGGGCCGUUA 12 818 Alcaligenes latus ala 64 AACGGUAACGGGCCUUCGGGUGCCG 13 64 ala 119 ACGCAUCGGAACGUGCCCAGUGGUGG 14 119 ala 429 AAACCGCUUUUUGUCAAGGGAAGGA 15 429 ala 823 AACUGGUUGUUGGGUGGGUUUCUAC 16 823 Arcanobacteri-um pyogenes apy 174 CCGGAUAUUCUGCUUUUGCCGCAUG 17 174
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli apy 440 AGUACAGAAGAAGCAUUUUUGUGAC 18 440 apy 997 ACACUGCGAUGUGCCAGAGAUGGUGCA 19 997 apy 1128 CAGCAUGUUGUGGUGGGGACUCACGG 20 1128 Arcobacter butzerli abu 730 GCGAUCUACUGGAACAAUAUUGACGCU 21 730 abu 991 UGACAUAGUAAGAAUGAUUUAGAGAUA 22 991 abu 1021 UAGUGUCUGCUUGCAGAAACUUGCAU 23 1021 Arcobacter cryoaerophilus acr 184 ACAGAAGUUAAUAAGGGAAAGAUUUAU 24 184 acr 836 GAGACUUGAUCUUGCAGÜAAUGCAGU 25 836 acr 1149 ÜAAACAGACUGCCUACGCAAGUAGGAGG 26 1149 Arthrobacter globiformis agl 58 AAGUC GAACGAU GAUCCGGÜGCÜUGC 27 58 agl 993 ACAÜGGACCGGACCGCCGCAGAAAÜGÜG 28 993 agl 1013 AAAUGUGGUUUCUCCUUUOGGGGCCG 29 1013 Aspergillus fumigatus afu 830 GAÜCGGGCGGÜGÜÜOCÜAÜGAÜGA 30 830 afu 1420 GAAUGGCUCGGUGAGGCCUUCGG 31 1420 afu 1447 AGGGGAGUUGGCAACGACUCCC 32 1447 afu 1450 CAACGACOCCCCAGAGCCGG 33 1450 Bacillus ce-reus bce 58 AAGUCGAGCGAAÜGGAÜÜAAGAGC 34 58 bce 69 OGGAÜUAAGAGCUUGCÜCOÜAÜGAA 35 69 bce 82 CÜÜGCÜCÜÜAÜGAAGÜOAGCGGCGGA 36 82 bce 170 AAUACCGGAUAACAUUUUGAAC 37 170 bce 982 ACCAGGÜCÜÜGACAUCCOCÜGAAAAC 38 982 bce 1015 AÜAGGGCUUCÜCCÜÜCGGGAGCAGAG 39 1015 Bacillus stearothermo- philus bst 129 ACCUGCCCGCAAGACCGGGAUAACUCC 40 129 bst 174 CCGGAUAACACCGAAGACCGCAUGGU 41 174 bst 820 GAGÜGCUAAGÜGUÜAGAGGGGUCACAC 42 820 bst 999 CCUGACAACCCAAGAGAUUGGGCGUU 43 999 Bacillus sub-tilis bsu 68 GACAGAUGGGAGCÜÜGCÜCCCÜ 44 68 bsu 86 CÜCCCUGAUGUÜAGCGGCGGACGGG 45 86 bsu 180 GGUUGUUUGAACCGCAUGGUUCAAAC 46 180 bsu 192 UUCAAACAUAAAAGGUGGCUUCGG 47 192
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3’) SEQ ID Nr. E. coli bsu 207 UUCGGCUACCACUUACAGAUGGACC 48 207 bsu 1267 GAGGUUAAGCCAAUCCCACAAAUCU 49 1267 Bifidobacteri-um bifidum bbi 68 GAUCCAUCAAGCUUGCUUGGUGGUGA 50 68 bbi 183 AUCGCAUGÜGAÜÜGUGGGAAAGAUUC 51 183 bbi 820 GGACGCUGGAUGUGGGGCACGUUCCA 52 820 bbi 833 GGGGCACGUUCCACGUGUUCCGUGU 53 833 bbi 992 GACAUGUÜCCCGACGACGCCAGAGA 54 992 bbi 1317 AACCCGGCUCCGÜGAAGGCGGAGUC 55 1317 Bifidobacteri-um longum blo 183 CCAGUUGAUCGCAUGGUCUUCUGGGA 56 183 blo 193 CUGGGAAAGCÜUÜCGCGGUAUGGGAUGG 57 193 blo 267 CCACCGUGGCUUCGACGGGUAGCCGGC 58 267 blo 1246 ÜACAACGGGAUGCGACGCGGCGACGCG 59 1246 blo 1259 GACGCGGCGACGCGGAGCGGAUCCC 60 1259 Brevibacterium casei bca 833 GGGGGGCAUUCCACGUUCUCCGCGC 61 833 bca 1010 UGGAAACAGGUCCÜCÜÜCÜÜUGAAG 62 1010 bca 1249 AGAGAGAGGCGAACCCGUGAGGGCAA 63 1249 Brevibacterium epidermidis bep 72 AAGCCGACAGCUUGCÜGUUGGÜGGA 64 72 bep 135 CCCOGAÜÜÜCGGGAÜAAGCCUGGGA 65 135 bep 997 ACACUGGACCGUUCUGGAAACAGUUCUU 66 997 bep 1249 AGAGAGAGGCGAACCCGUGAGGGUAA 67 1249 Brevibacterium linens bli 384 CCUGAOGCAGCGACGCAGCGUGCGGG 68 384 bli 629 CGÜGCAGÜGGGÜACGGGCÜGACÜAGA 69 629 bli 723 GGCGAAGGCGGGACUCUGGGCUGUAA 70 723 bli 1201 UCAUGCCCUUUAUGUCUUGGGCUUCA 71 1201 bli 1306 UCGUAGUCUGCAAUUCGACUACGUG 72 1306 Brochothrix thermosphacta bth 88 CUUUUGAAGUUAGUGGCGGACGGGUGA 73 88 bth 183 ÜCAÜAAGAUGUUCAAGUGAAAGACGGU 74 183 bth 451 ACAUGGGUGAGAGUAACUGUÜCACC 75 451 bth 987 GUCUUGACAUCCUUUGACCAUUCUGGAG 76 987 bth 1270 GUGGAGCCAAUCCCAUAAAAUÜAUÜCU- CA 77 1270 bth 1438 GUUUGGUAACCUUCGGGAGCUAGCCGU 78 1438
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'~>3') SEQ ID Nr. E. coli Brucella abor-tus bab 126 GGAACGUACCAUUUGCUACGGAAUA 79 126 bab 644 GGAAGUCUUGAGUAUGGUAGAGGUG 80 644 bab 824 GUUAGCCGUCGGGGUGUUUACACUUCG 81 824 bab 831 GUCGGGGÜGÜUUACACUÜCGGUGGC 82 831 bab 837 GUGUUUACACUUCGGUGGCGCAGCU 83 837 bab 994 CAUCCCGGUCGCGGUUAGUGGAGACA 84 994 bab 1007 UUAGUGGAGACACUAUCCUUCAGUUAG 85 1007 Brucella meli-tensis bme 128 AACGUACCAUUUGCUACGGAAUAACU 86 128 bme 824 GUUAGCCGUCGGGGUGUUUACACUÜC 87 824 bme 835 GGGUGUUUACACUUCGGUGGCGCAG 88 835 bme 995 AUCCCGGUCGCGGUUAGUGGAGACACU 89 995 bme 1007 UUAGUGGAGACACUAUCCUUCAGUUAG 90 1007 Campylobacter coli cco 183 UAACACAAGUUGAGUAGGGAAAGU 91 183 cco 599 UUUUGUGAAAUCUAAUGGCUUAACCAUU 92 599 cco 828 GUUGUUGCUCUGCUAGUCAGGGC 93 828 cco 1007 UUUUAGAGAUAAGAGGGUGCUAGCUU 94 1007 Campylobacter jejuni cje 168 CUAAUACUCUAUACUCCUGCÜUAACA 95 168 cje 183 CUUAACACAAGUUGAGUAGGGAAAGU 96 183 cje 437 UUUCUUAGGGAAGAAUUCUGACG 97 437 cje 609 CUAAUGGCUUAACCAUUAAAC 98 609 cje 984 CUGGGCUUGAUAUCCUAAGAACCUUAU 99 984 cje 1007 UUAUAGAGAUAUGAGGGUGCÜAGCUU 100 1007 cje 1114 ACGUAUUUAGUUGCUAACGGUUCGG 101 1114 Campylobacter lari cla 643 UGGUAAUCUAGAGUGGGGGAGAGGCA 102 643 cla 1117 UAUUUAGUUGCUAACACUUCGGGUGAG- CA 103 1117 Candida can 174 CAUGCUUAAAAUCCCGACUGUUUGGA 104 174 can 830 GAUCGGUUGUUGUUCUUUUAUUGACGC 105 830 can 840 UCUUUUAUUGACGCAAUCGGCACCUU 106 840 Candida albicans cal 587 UUGGGCUUGGCUGGCCGGUCCAUCUUU 107 587 cal 611 CAUCUUUUUGAUGCGUACUGGACCCAG 108 611 cal 651 GGUAGCCAUUUAUGGCGAACCAGGACU 109 651
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3 ’) SEQ ID Nr. E. coli Candida gla-brata cgi 193 AAAUCAAUGUCUUCGGACUUUUUGAU 110 193 cgi 611 CGAUÜÜÜÜÜCGÜGÜACOGGAAÜGCACC 111 611 cgi 649 CCAAGÜCCÜÜGÜGGCÜOGGCGGCGA 112 649 cgi 833 CGGGÜGGÜGUÜOOÜÜÜAGÜGACCCA 113 833 cgi 1128 GGUGCUAGCAUUUGCUGGUUGÜCCAC 114 1128 Candida parap-silosis cpa 611 CAUCUUUUUUGAUGCGUACUGGACCCA 115 611 cpa 645 GAGCCUUUCCUUCUGGCUAGCCUUUU- UGG 116 645 cpa 650 UUUCCUUCUGGCUAGCCUUUUUGGC- GAAC 117 650 Candida sake csa 598 AGCCGGUCCGCCUUUUGGUGAGUACU 118 598 csa 610 CCGCCUUUUGGUGAGÜACUGGAUCUA 119 610 csa 651 AACCUUUCUUUCGGGGAAGGCGAACC 120 651 Candida tropicalis ctr 823 GAUUAGGGAUCGGUUGUUGUUCUUUAAU 121 823 ctr 837 UGUUGUUCUUUAAUUGACGCCAUUGGGC 122 837 Candida utilis ctr 613 CÜÜÜÜÜGGCGAGÜACÜGACCCÜGCC 123 613 ctr 943 AAACUCACCAGGÜCAGGGAAACÜCA 124 943 ctr 1131 ACÜAGCÜÜÜÜGCÜGGÜGCÜGACGCU 125 1131 Carnobacterium divergens cdi 68 ACGAAGUUGAAAAGCUUGCUÜUUCGA 126 68 cdi 183 UGACCGCAOGGOCGCOOGAUGAAAGG 127 183 cdi 188 AUGGÜCGCÜÜGAÜGAAAGGÜGGCÜUCGG 128 188 cdi 1242 AUGGUACAACGAGUCGCGAAGUCGUGAG 129 1242 cdi 1250 ACGAGUCGCGAAGUCGUGAGGCCAAGC 130 1250 Citrobacter amalonaticus cam 73 AGGAAGCAGCUUGCUGCUUUGCU 131 73 cam 82 CUUGCUGCUUUGCUGACGAGUGGCGG 132 82 cam 177 CAUAAUGUCGCAAGACCAAAGAGGG 133 177 cam 447 AGGAAGGGGÜÜAAGGÜÜAAÜAACCÜ- UAGCC 134 447 cam 468 ACCUUAGCCAUUGACGUUACCCGCAG 135 468 cam 471 ÜUAGCCAOUGACGUUACCCGCAGAAG 136 471 cam 636 UCGAAACÜGGCAGGCÜUGAGÜCUCGUA 137 636 Citrobacter freundii cfi 58 AAGUCGAACGGUAGCACAGAGGAGCU 138 58
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli cfi 63 GAACGGUAGCACAGAGGAGCUUGCUC- CUUG 139 63 cfi 75 AGAGGAGCUUGCUCCUUGGGUGACGAGU 140 75 cfi 119 AUGUCUGGGAAACUGCCCGAUG 141 119 Clostridium botulinum cbo 54 AÜGCAAGUCGAGCGAÜGAAGCÜÜCCÜ 142 54 cbo 82 ÜÜCGGGAAGÜGGAÜUAGCGGCGGACG 143 82 cbo 84 CGGGAAGUGGAÜÜAGCGGCGGACGGGÜG 144 84 cbo 644 GGAUAUCUAGAGUGCAGGAGAGGAAA 145 644 Clostridium butyricura cbu 193 CAAUUAAAGGAGUAAUCCGCUAUGA- GAUG 146 193 cbu 830 UGUAGGGGUUGUCAUGACCUCUGUGC 147 830 cbu 994 CAÜCUCCUGAAÜÜÄCÜCÜGÜAAÜGGA 148 994 cbu 1266 CGAGAGUGAGCAAAACUAUAAAACC 149 1266 cbu 1426 UACCCAAAGUUCGUGAGCUAACCGCAA 150 1426 Clostridium difficile cdi 58 AAGUUGAGCGAUUUACUUCGGUAAA 151 58 cdi 131 CUACCCUGUACACACGGAUAACAUA 152 131 cdi 193 AOCAAAGGUGAGCCAGUACAGGAÜG 153 193 cdi 998 CAAUGACAUCUCCUUAAUCGGAGAGUO 154 998 Clostridium novyi cno 998 CUUGACAUCUCCUGAAUUACUCGUAA 155 998 cno 1119 GUUAGUUGCUACUAUUAAGUUAAGCA 156 1119 Clostridium perfringens cpe 61 UCGAGCGAUGAAGUUUCCUUCGGG 157 61 cpe 183 GAAAGAÜGGCAUCAÜCAUUCAACC 158 183 cpe 432 GCUCUGÜCUÜÜGGGGAAGAUAAUGA 159 432 cpe 582 AGGCGGAÜGAÜOAAGÜGGGAÜGÜGA 160 582 cpe 585 CGGAÜGAÜUAAGUGGGAÜGUGAAAÜACC 161 585 cpe 827 AGGUGOGGGGGUUUCAACACCUCCG 162 827 cpe 993 ACAUCCCUOGCAUUACUCUUAAUCG 163 993 cpe 1203 AUGCCCCUUAUGUGUAGGGCUACACAC 164 1203 Clostridium tetani cte 180 AAAGUUAAGGUOUCGCAUGAAACUU 165 180 cte 689 GGÜGAAAUGCGÜAGAGGAÜUAGGAAG 166 689 cte 744 ÜGUAACUGACGCAGAGGCACGAAAGCGU 167 744 cte 1151 AUGAGACUGCCÜGGGUGAACCAGGAGG 168 1151 Corynebacteri- cbo 170 AAUACCGGAUAGGACCGUGCUUUAGU 169 170
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli um bovis cbo 439 CGGCAGGGACGAAGCÜUÜÜGÜGAC 170 439 cbo 983 CUGGGCUUGACAUGGGCAGGACCGGC 171 983 cbo 1000 AGGACCGGCGUGGAGACACGÜCÜÜC 172 1000 cbo 1250 GGUUGCGAUGCCGCGAGGCUCAGCUA 173 1250 Corynebacteri-um casei cca 134 CCCUGCACUUUGGGAUAAGCÖUGG 174 134 cca 208 UUUGCGGUGUGGGAÜGAGCCUGCGGCCU 175 208 cca 431 ACÜCCÜÜÜCGCÜAÜCGACGAAGCCACÜ 176 431 cca 830 UGÜAGGGGGCÜÜCCACGÜCUÜCÜGÜG 177 830 cca 988 GCUUGACAÜGUACCGGAÜUGGGCUA 178 988 Corynebacteri-um diphtheriae cod 64 AACGGAAAGGCCÜAGCÜÜGCÜAGGÜA 179 64 cod 433 CUCÜÜÜCGCÜAGGGACGAAGCÜÜÜÜGÜ 180 433 cod 1004 UCGGCGUAGUGAUACGUUUUCCCUUGU 181 1004 Coxiella bur-netii cob 61 UCGAACGGCAGCGCGGGGAGCUUGCU 182 61 cob 440 GGUGGGGAAGAAAUUCUCAAGGGUAA 183 440 cob 462 GUAAUAUCCUUGGGCGUUGACGUUAC 184 462 cob 579 CGUAGGUGGAUAUÜUAAGUCGGAUGU 185 579 cob 829 CUGUÜGGGAAGUUCACUUCUUAGUA 186 829 cob 990 UCGGAACUUGUCAGAGAUGAÜUUGGU 187 990 Cryptococcus cry 0 UGCCUGUUUGAGUGUCAÜGAAA 188 0 cry 1 CAÜGCCUGÜUUGAGÜGUCAÜGAAAA 189 1 cry 2 CAUGCCÜGUUUGAGUGUCAÜGAAA 190 2 Debaryomyces hansenii dha 193 GCÜOÜOCGGAGCÜCÜÜÜGAÜGAUUC 191 193 dha 595 GUUGGCCGGUCCGCCUUUUUGGCGAG 192 595 dha 610 CCGCCÜÜÜÜÜGGCGAGÜACUGGACCC 193 610 dha 642 ACCGAGCCUUUCCUUCUGGCÜAACCÜ- UUCG 194 642 dha 651 UCCUUCUGGCUAACCUUUCGCCCU 195 651 Enterobacter aerogenes eae 431 AGUACÜÜÜCAGCGAGGAGGAAGGCGÜ- UAA 196 431 eae 440 AGCGAGGAGGAAGGCGUUAAGG 197 440 eae 450 AAGGCGUUAAGGUUAAUAACCUUGGC 198 450 eae 464 ÄAUAACCUUGGCGAUUGACGUUACUCG 199 464 eae 470 CUUGGCGAUUGACGUUACUCGCAGA 200 470 - 30 ·· • • • ·· «· • · ·· •· ·· t · • · ♦ · • • • • · • · • · • • • • · • · • · • • • ♦ · • · ·· ··· • Μ ··♦ ♦ · ··
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli Enterobacter agglomerans eag 622 CCÜGGGAACÜGCAÜÜGGAAACUGGCA 201 622 eag 809 CCCUAAACGAUGUCGACÜÜGGAGGUU 202 809 eag 986 GGCCÜÜGACAOCCACGGAAÜÜÜGGCA 203 986 eag 1367 ACGGUGAAUACGGGCCCGGGCC 204 1367 eag 1373 AAÜACGGGCCCGGGCCÜUGUACA 205 1373 eag 991 UGACAUCCACGGAAUUUGGCAGAGAU 206 991 eag 1449 CCUUCGGGAGGGCGCUUACCUCUUUG 207 1449 Enterobacter CGAACGGUAGCACAGAGAGCUUGCU- cloacae ecl 62 CUCG 208 62 ecl 75 AGAGAGCUUGCUCÜCGGGÜGACGAGUGG 209 75 ecl 86 CUCUCGGGUGACGAGUGGCGGACGG 210 86 ecl 629 acugcauucgaaacuggcaggcuggag 211 629 Enterobacter sakazakii esa 69 UAACAGGGAGCAGCUUGCUGCUCUG 212 69 esa 452 GGUGUUGUGGUÜAAUAACCGCAGCAAU 213 452 esa 577 CACGCAGGCGGUUGAUUAAGUCAGAU 214 577 esa 633 CAUUUGAAACUGGUCAGCUUGAGUCUC 215 633 esa 644 GGUCAGCÜÜGAGUCUCGUAGAGG 216 644 esa 984 CUGGUCUÜGACAUCCAGAGAAÜCCÜGCA 217 984 Enterococcus enc 75 CACCGGAGCUUGCUCCACCG 218 75 enc 199 CGCUUUUGCGUCACUGAUGGAU 219 199 enc 214 GCGUCACUGAÜGGAÜGGACCCGC 220 214 Enterococcus avium eav 88 CCACCGAAAGAAAAGGAGUGGCGAAC 221 88 eav 93 GAAAGAAAAGGAGUGGCGAACGGGUGA 222 93 eav 188 AUGGÜUUCGGUUUGAAAGGCGCUUUUG 223 188 eav 452 CAAGGAUGAGAGUAGAAUGUUCAUCC 224 452 Enterococcus durans edu 58 AAGUCGUACGCUUCUUUUUCCACCG 225 58 edu 183 AAUCGAAACCGCAUGGUUUUGAUUU 226 183 edu 464 AACUGUUCAUCCCUUGACGGUAUCUA 227 464 edu 1286 AAAGCUUCUCUCAGUUCGGAUUGUA 228 1286 Enterococcus faecalis efc 437 GUUGUUAGAGAAGAACAAGGACGUUA 229 437 efc 444 GAGAAGAACAAGGACGÜUAGUAACU 230 444 efc 477 CCUGACGGÜAÜCUAACCAGAAAGCCACG 231 477 Enterococcus efm 68 CUUCUUUUUCCACCGGAGCUUGCUCC 232 68 - 31 -
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli faecium efm 193 UÜGAAAGGCGCUUUCGGGUGUCGCUG 233 193 efm 207 OÜCGGGÜGÜCGCÜGAÜGGAÜGGACCC 234 207 „ efm 464 AACUGUUCAUCCCUUGACGGUAUCUA 235 iii—— efm 1237 AAUGGGAAGUACAACGAGÜUGCGAAGU 236 1237 Enterococcus saccharolyti- cus ens 462 AGAGAAUGUUCAUCCCUUGACGGUAU- CUA 237 462 ens 466 AAUGUUCAUCCCUUGACGGUAUCUAAC” CA 238 466 ens 846 CCUUCAGUGCUGCAGCAAACGCAUUA 239 846 ens 1238 AUGGGAAGÜACAACGAGÜÜGCGAAGO 240 1238 ens 1255 UU GCGAAGOCGCGAGGCÜAAGCÜAAU 241 1255 Escherichia coli eco 64 ÜGGCAAGCOÜGAGÜCÜCGÜAGAGGGG 242 64 eco 429 AAAGUACUUUCAGCGGGGAGGAAGGGAGU IAAA 243 eco 447 AGGAAGGGAGUAAAGÜÜAAÜACCÜOÜG 244 447 eco 468 CCUÜÜGCUCAUUGACGUÜACCCGCAGAA 245 468 eco 625 GGGÄACUGCAUCUGAUACUGGCAAGCU- ÜGAG 246 625 eco 643 UGGCAAGCUÜGAGÜCÜCGÜAGAGGGG 247 643 Flavobacterium fla 688 AACUAGAAÜAUGUAGUGÜAGCGGÜGA 248 688 fla 1195 AAAÜCAUCACGGCCCUUACGCCUUG 249 1195 Franciselia tularensis ftu 216 GUCGCAGAÜGGAÜGAGCCÜGCGÜUGG 250 216 ftu 455 CUCAAGGUUAAUAGCCUUGGGGGAG 251 455 ftu 657 ACGGUAGAGGAAÜGGGGAAOÜÜCÜGGÜ 252 657 ftu 857 AGCUGUUGGAGUCGGUGUAAAGGCÜC 253 857 ftu 1152 ÜGAGACUGCCGCUGACAAGGCGGAGG 254 1152 Gluconobacter glu 724 GCGAAGGCGGCAACCUGGCUCGAUAC 255 724 glu 837 UAACUUAGUUACUCAGUGUCGAAGCU 256 837 Gluconobacter asaii gas 987 GACUUGCAUGGGGAGGACGUACUCAGA 257 987 gas 1007 ACUCAGAGAUGGGUAUUUCUUCGGACC 258 1007 gas 1268 GGCGACAUGGUGCÜGAÜCUCUAAAAGC 259 1268 Gluconobacter oxydans gox 998 GGGAGGACCGGUÜCAGAGAUGGACCU 260 998 gox 1264 GGU GACAU GGUGCU GAU CU CUAAAAGC 261 1264 32 32 • ·· ♦· ·· • · • * • • · t · • • # • · • • · • · ··· ·· ·· ·· • ♦ • · • ♦ • · ··
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli Hafnia alvei hal 256 GGGGUAAUGGCUCACCUAGGCGACGAÜ- CUCU 262 256 hal 585 CGGÜÜGAÜUAAGÜCAGAUGÜGAAAÜC 263 585 hal 635 ÜUÜGAAACÜGGÜCAGCÜAGAGOCÜÜG 264 635 Helicobacter pylori hpy 129 AUGUGCCUCUUAGUUUGGGAUAGCC 265 129 hpy 208 ÜÜAÜCGCÜAAGAGAÜCAGCCÜAÜGÜC 266 208 hpy 580 GÜAGGCGGGAÜAGÜCÄGÜCAGGÜGÜGA 267 580 hpy 836 AGGGCÜÜAGÜCÜCÜCCAGÜAAÜGCAGC 268 836 hpy 988 GCUUGACAUUGAGAGAAUCCGCÜAGA 269 988 hpy 1443 CUAAAUUGGCUACüGCCCACGGCACAC 270 1443 Klebsialla pneumoniae kpn 56 GCAAGUCGAGCGGÜAGCACAGAGAGCÜÜ 271 56 kpn 78 GAGCUUGCUCUCGGGUGACGAGCGG 272 78 kpn 198 ÜGGGGGACCÜUCGGGCCUCAÜGCCAÜC 273 198 kpn 214 CU CAU GCCAUCAGAUGUGCCCAGAU 274 214 Klebsiella oxytoca kox 84 UGCUCUCGGGUGACGAGUGGCGGACGGG 275 84 kox 634 AUUCGAAACUGGCAGGCUGGAGUCUUGU 276 634 kox 646 CAGGCUGGAGUCUUGUAGAGGGGGGUA 277 646 Lactobacillus lac 725 CGAAGGCGGCUCUCUGGUCUGCAACU 278 725 lac 838 GGUUUCCGCCUCUCAGUGCUGC 279 838 Lactobacillus acidophilus Iba 266 CCUACCAAGGCAAUGAUGCAÜAGCCGA- GU 280 266 Iba 466 CUGGCCUUUAUUUGACGGUAAUCAACC 281 466 Lactobacillus alimentarius lal 85 GCAUCAUGAUUUAGAUCUAAGUGAGU 282 85 lal 195 AAGAUGGUUUUGCUAUCUCUUCUGG 283 195 lal 627 GAAGUGCUUCGAAAACUGGUGAACU 284 627 lal 992 GACAUACCAUGAAAAGCUAAGAGAU 285 992 lal 1436 CGGUGGGGUAACCCUUCGGGGAACU 286 1436 Lactobacillus bifermentas lbi 75 CAGAAGGUGCUUGCACUGGAAGUUG 287 75 lbi 172 UACCGCÄUAAAAGUUGAGAUCACAU 288 172 lbi 449 GAACAGGGACUAGAGUAACUGUUAGU 289 449 lbi 1443 GUAACCUCUUUGAGGAGCUAGCCGUC 290 1443 Lactobacillus brevis lbr 64 AACGAGCUUCCGUUGAAUGACGUG 291 64
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli lbr 122 CGUGGGAAAUCUGCCCAGAAGCAG 292 122 lbr 453 CCUUUGAGAGUAACUGUUCAAGGGUU 293 453 lbr 1436 CGGUGAGAUAACCUUCGGGAGUCAG 294 1436 Lactobacillus casei lca 86 GCAOGGUÜCÜÜGGCUGAAAGAUGGC 295 86 lca 437 GÜÜGÜÜGGAGAAGAAÜGGÜCGGCAG 296 437 lca 451 AUGGOCGGCAGAGOAACOGUüGüCGG 297 451 lca 465 AACÜGÜUGUCGGCGUGACGGUAUCCA 298 465 lca 985 AGGÜCUUGACAUCUUUUGAUCACCUG 299 985 lca 1443 GUAACCCUUUÜAGGGAGCGAGCCGU 300 1443 Lactobacillus coryniformis lco 75 ACCGAAGCUGCUUGCAGUGGACGUUG 301 75 lco 173 ACCGCAUAACCAUUCAGACCACAUG 302 173 lco 465 ACUGÜÜAGÜCCÜÜÜGACGGÜAUCCAA 303 465 Lactobacillus curvatus lcu 68 ACUCUCGUUAGAUUGAAGAAGC 304 68 lcu 91 GAUUGAUAACAUUUGAGUGAGUGGC 305 91 lcu 455 UUUGAUAGUAACUGAUCAGGUAGUGACG 306 455 Lactobacillus delbrueckii lde 58 AAGUCGAGCGAGCUGAAUUCAAAGAU 307 58 lde 171 AÜACCGGAÜAACAACAÜGAAUCGCAÜ 308 171 lde 187 CAUGAÜUCAAGUUÜGAAAGGCGGCG 309 187 lde 437 GÜÜGÜÜGGÜGAAGAAGGAÜAGAGGCAGO 310 437 lde 570 ÜAAAGCGAGCGCAGGCGGAAOGAÜAAG 311 570 lde 1267 GAGGGÜAAGCGGAÜCÜCÜÜAAAGCUG 312 1267 Lactobacillus farminis lfa 68 aaccauccügaagaüügaagcüüGcu 313 68 lfa 183 CUACUUUCACAUGAUCGUAGCUUGAA 314 183 Lactobacillus fermentum lfe 183 UUGUUCGCAUGAACAACGCUUAAA 315 183 lfe 199 UGGCUUCUCGCUAUCACUUCUGGAUG 316 199 lfe 480 GACGGUAUUUAACCAGAAAGUCACGG 317 480 Lactobacillus helveticus lhe 170 AAUACCGGAUAAGAAAGCAGAUCGCA 318 170 lhe 572 AAGCGAGCGCAGGCGGAAGAAUAAG 319 572 lhe 628 AACUGCAUCGGAAACUGUUUUUCUUG 320 628 lhe 1273 AAGCGAAUCUCUGAAAGCUGUUCUC 321 1273 Lactobacillus lke 56 GCAAGUCGAACGCGÜUÜCCGÜÜAÜÜG 322 56
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3’) SEQ ID Nr. E. coli kefir lke 92 AAUGAUUUAACACGAAACGAGUGGCGA 323 92 lke 126 GGÜAACCÜGCCCUÜGAAGÜAGGGGAÜ 324 126 lke 185 CACAÜGGUUOUGGUUOAAAAGAÜGGCÜ 325 185 lke 451 ACAGGUGUCAGAGUAACUGUUGACAU- CUU 326 451 Lactobacillus plantarium lpl 86 CAUCAUGAÜÜÜACAÜÜUGAGÜGAGÜG 327 86 lpl 177 CAUAACAACUUGGACCGCAUGGUCC 328 177 lpl 454 AUCUGAGAGUAACUGUUCAGGUAUUG 329 454 lpl 471 UCAGGUAUüGACGGUAUUUAACCAGA 330 471 Lactobacillus reuteri Ire 54 AUGCAAGUCGUACGCACUGGCCCAAC 331 54 Ire 172 UACCGCAUAACAACAAAAGCCGCAUG 332 172 Ire 198 AÜGGCUUÜGGCÜAÜCACÜCUGGGAUG 333 198 Ire 573 AGCGAGCGCAGGCGGUUGCUUAGGUC 334 573 Ire 988 UCÜÜGACAÜCÜÜGCGCÜAACCÜÜAGA 335 988 Lactobacillus rhamnosus lrh 64 AACGAGUUCUGAUüAüüGAAAG 336 64 lrh 75 AOUGAAAGGUGCUOGCAUCUUGAUUO 337 75 lrh 448 AGAAUGGÜCGGCAGAGÜAACUGÜUGÜC 338 448 lrh 984 CAAGÜCÜÜGACAÜCÜÜÜÜGAÜCACCÜG 339 984 Lactobacillus sake lsa 79 GAGCUUGCUCCUCAUUGAUAAACAU 340 79 lsa 93 GAÜAAACAUÜUGAGÜGAGÜGGCGGACGG 341 93 lsa 186 GCAUGGÜGUAGGGÜUGAAAGAUGGÜÜ 342 186 lsa 437 GUUGUUGGAGAAGAAUGUAUCUGAUA 343 437 lsa 465 ACUGAUCAGGUAGUGACGGUAUCCA 344 465 Lactococcus cremoris lcr 59 AGUUGAGCGAUGAAGAUUGGUGCUUGC 345 59 lcr 170 AAUACCGCAUAACAACUUUAAACAUAAG 346 170 lcr 183 AAACAUAAGUUUUAAGUUÜGAAAGAUGC 347 183 Lactococcus diacetilactis ldi 68 UGAAGGUUGGUACUUGUACCGACUGGA 348 68 ldi 82 GUACUUGÜACCGACUGGAÜGAGCAGCGA 349 CM OO ldi 89 CGACUGGAUGAGCAGCGAACGGGUGAG 350 89 Lactococcus lactis 11a 429 AAAACUCUGÜÜGGUAGAGAAGAACGUU 351 429
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Er. E. coli 11a 450 AACGUUGGUGAGAGUGGAAAGCUC 352 450 11a 487 ACUACCCAGAAAGGGACGGCUAACUA 353 487 11a 574 GCGAGCGCAGGUGGUUUAUUAAGUCU 354 574 11a 625 UUGUAUGCAUUGGAAACUGGUAGAC 355 625 11a 1419 UUGGGAGUACCCGAAGUAGGUUGCCUA 356 1419 Lactococcus luteus llu 193 UGÜUGGAAAGAUUUAUCGGUUUUGGA 357 193 llu 599 OGUCGUGAAAGUCCGGGGCUÜAACC 358 599 llu 616 GCÜUAACCCCGGAOCÜGCGGÜGGGÜ 359 616 llu 837 ACCAÜUCCACGGUUUCCGCGCCGCAG 360 837 llu 988 GCUUGACAUGUUCUCGAUCGCCGUA 361 988 llu 1012 GAGAÜACGGUUUCCCCUÜÜGGGGCG 362 1012 Legionella pneumophilia lpn 1128 CAGCAÜGUGAÜGGUGGGGACÜCÜAAG 363 1128 lpn 1246 ÜACAGAGGGCGGCGAAGGGGCGACCÜ 364 1246 Leuconostoc citreum lei 653 GAGUGUüGUAGÄGGUAAGüGGAACUC 365 653 lei 656 UGÜÜGÜAGAGGÜAAGÜGGAACÜCCA 366 656 lei 1250 ACGAGÜÜGCCAACCUGCGAAGGUGAG 367 1250 lei 1281 CUCUUAAAGUACGUCU CAGUUCGGACU 368 1281 Leuconostoc lactis lei 178 AÜAAAACUÜAGÜAÜCGCAUGAÜACAAA 369 178 lei 403 GÜGUGÜGAUGAAGGCUUUAGGGUCGU 370 403 lei 446 GAAGAAAÜGCÜAGAAÜAGGGAAUGAÜ 371 446 lei 1007 ÜUCÜAGAGAÜAGAAGÜGUÜCÜCÜÜCGG 372 1007 Leuconostoc mesenteroides lme 79 GUGCUUGCACCUUUCAAGUGAGUGG 373 79 lme 126 GACAACCUGCCUCAAGGCÜGGGGAÜAA 374 126 lme 179 UAAAACUUAGUGUCGCAUGACACAAA 375 179 lme 428 ÜAAAGCACUGÜÜGÜAÜGGGAAGAA- CAGCU 376 428 lme 477 ÜÜÜGACGGUACCAUACCAGAAAGGGACG 377 477 lme 1012 GAGAÜAGAAGÜGÜÜCUCUUCGGAGAC 378 1012 Listeria lis 62 CGAACGAACGGAGGAAGAGCUUGCüC 379 62 lis 133 GCCUGÜAAGÜÜGGGGAÜAACÜCCGG 380 133 lis 430 AAGÜACÜGUUGUUAGAGAAGAACAAG 381 430 Listeria iva-novii liv 168 CUAAÜACCGAAUGAUAAGUAGUGACG 382 168
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli liv 183 AÜAAGÜAGUGACGCÄÜGÜCAÜCACÜÜÜ 383 183 Listeria mono-cytogenes lmo 63 GAACGAACGGAGGAAGAGCUUGCUC 384 63 lmo 68 ACGGAGGAAGAGCÜÜGCÜCÜÜCCAAA 385 68 lmo 133 GCCÜGÜAAGÜÜGGGGAÜAACOCCGG 386 133 lmo 193 GCUUUUGAAAGAUGGUUUCGGCUAÜCGC 387 193 lmo 198 AUGGUUUCGGCUAUCGCUUACAGA 388 198 lmo 202 ÜÜÜCGGCÜAÜCGCÜÜACAGAOGGGCC 389 202 lmo 423 GAUCGUAAAGÜACUGUUGUUAGAGAA 390 423 lmo 466 CÜGCÜÜGÜCCCÜÜGACGGÜAÜCÜAA 391 466 lmo 634 AUüGGAAACUGGAAGACUGGAGUGCA 392 634 lmo 1005 CACUCUGGAGACAGAGCÜUUCCCUU 393 1005 lmo 1148 CUAAAGOGACUGCCGGUGCAAGCC 394 1148 Listeria see-ligeri lse 168 CUAAUACCGAAUGAUAAGGAGUGACGC 395 168 lse 180 GAUAAGGAGÜGACGCAÜGÜCACÜGC 396 180 Microbacterium lacticum mla 1149 AUGGAAUACÜGCCGGGGUCAACUCGG 397 1149 mla 1166 UCAACUCGGAGGAAGGUGAGGAUGAC 398 1166 mla 1249 AAUGGGCUGCAAUACCGCAAGGUGGA 399 1249 Microbacterium schleiferi msc 68 GUGAAGCAGAGCUUGCUCUGUGGAUC 400 68 msc 183 GAAGGCAÜCUUCAGCAGCÜGGAAAG 401 183 msc 189 UCUUCAGCAGCUGGAAAGAAÜUUCGG 402 189 msc 196 AGAAUUUCGGUCAGGGAUGAGCUCG 403 196 Micrococcus lylae mly 133 GCCCUUGACUCUGGGAUAAGCCUUGG 404 133 mly 185 CGCAUGGUGGGUGUUGGAAAGAAUUU 405 185 mly 599 UGCCGUGAAAGUCCGGGGCUUAACU 406 599 mly 616 GCUUAACUCCGGAUCUGCGGUGGG 407 616 Micrococcus tyrobutyricum mty 180 AAAGCCAAGUÜUCACAÜGGAAU 408 180 mty 989 CUUGACAUCCCCUGAAUAACCUAGA 409 989 mty 1274 AGCCAAACUCAAAAACUGCUCUCA 410 1274 mty 1438 GUAGUCUAACGUAAGAGGACGCGG 411 1438 Micrococcus varians mva 985 AAGGCÜÜGACAÜACACCGGACCGGÜCC 412 985 mva 1018 GAUCUUCCCCCUUGUGGGGCUGGUGUA- 413 1018 37 #· • · • · • · • · ·· • • • ·· ·· ·| • • • • • • • • • ··· ··· ··· • I ·· • · · • Μ • « · • · · Μ ··
Spezies Sonde Sequenz {sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli CA mva 1302 UCGGAUCGUGGUCÜGCAACÜCGACCAC 414 1302 mva 1321 CGACCACGUGAAGUCGGAGUCGCUAG 415 1321 Mycobacterium avium mav 77 CUCUUCGGAGGUACUCGAGUGGCGAAC 416 77 mav 126 GGCAAUCUGCCCUGCACUUCGGGAUAA 417 126 mav 190 GUCUUCUGGUGGAAAGCUUUUGCGGUG 418 190 mav 1266 UAAGGUUAAGCGAAUCCUUUUA 419 1266 Mycobacterium tuberculosis mtu 64 AACGGAAAGGUCUCUUCGGAGAUA 420 64 mtu 168 CÜAAÜACCGGAÜAGGACCACGGGAUG 421 168 mtu 193 GGUGGAAAGCGCUUUAGCGGUG 422 193 mtu 197 GCGCUUUAGCGGUGUGGGAUGAGCCC 423 197 mtu 1269 GGUUAAGCGAAUCCUUAAAAGCCGG 424 1269 Mycoplasma bo-vialkalescens mbo 62 CGAGCGAGGUUUUUUAAACCUAGC 425 62 mbo 64 AGCGAGGUUUUUUAAACCUAGCGG 426 64 mbo 189 UGAÜÜUUGUUGUGAAAGGAGCCÜU 427 189 mbo 440 AUAGGGAAAGAAAACUUGGUUGAG 428 440 mbo 448 AGAAAACUUGGUUGAGGAAAUGCU 429 448 mbo 638 GAUACUGGÜAAACÜAGAGÜOGGAÜÄ 430 638 mbo 1015 AUAUAGUCGAGGUUAACGGAGÜGA 431 1015 mbo 1153 GAUACUGCCÜGGGUAACÜGGGAGGA 432 1153 Mycoplasma bo-vigenitalium myb 68 AAGUGAUUUAUCACUUAGCGGC 433 68 myb 136 CUUCAGUUUGGCAUAGCGGOUG 434 136 myb 180 ACUCGUAGAUGCCGCAUGGCAUUUACGG 435 180 myb 196 AGACGCCUUAAAGCGUCGCUGGAG 436 196 myb 470 CCACUAUAUUGAAUGUACCUUAUUA- GAAA 437 470 myb 1242 CCGGUACAAAGUGAAGCAACCUGGUGA 438 1242 myb 1433 AGUCGGUUUAUUAACAAACUGC 439 1433 Mycoplasma bovis myc 56 GCAUGUCGAGCGAUGAUAGCAAU 440 56 myc 81 AGCAAUAUCAUAGCGGCGAAUG 441 81 myc 139 UAGAUUGGGAUAGCGGAUGG 442 139 myc 150 AGCGGAUGGAAACACJCCGAUAAU 443 150 myc 193 AAAAGGAAGCGUUUGCUUCGCU 444 193
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli myc 286 UAGCGGGGUUGAGAGAUUGAUCCG 445 286 myc 290 GGGGUUGAGAGAUUGAUCCG 446 290 myc 422 GGGUUGUAAACUGCUGUGGUUA 447 422 myc 432 CUGCUGUGGUUAGGGAAGAA 448 432 myc 486 ACCUGAUÜAGAAAGCAACGG 449 486 myc 596 GUCUGGCGUUAAAUUUUGGG 450 596 myc 620 AACCCCAAAACGCGUUGGAU 451 620 myc 715 ACAUCAAUAUGGCGAAGGCA 452 715 myc 823 CAÜUAGUUGAUGGGGAACUCAUCGA 453 823 myc 834 GGGGAACUCAUCGACGCAGC 454 834 Mycoplasma ca-lifornicum mca 197 GACGCCUÜUAAAGCGUCGCUGGAGGAG- CG 455 197 mca 414 AGGCCUAÜGGGÜÜGÜAAACUGCUGUG- GUAA 456 414 mca 463 GAAAUGCCACUGUAUUGAAUGU 457 463 mca 1151 AGGAGACÜGCCÜGAGÜAAÜCGGGAGGA 458 1151 mca 1270 AGUGAGCAAACCACAAAAAACUGGUC 459 1270 Mycoplasma ca-nadense mpc 64 AGCGAGGUUCUOUUGAACCUAG 460 64 mpc 137 GGÜÜAGCUAACCÜCGGAGGCGACC 461 137 mpc 188 AÖGAOÜOCAAÜGUGAAAGGAGCCCÜ 462 188 mpc 595 AGÜCÜGGAGÜCAAAUACCAGGGCU 463 595 mpc 600 GGAGÖCAAAÜACCAGGGCUCAA 464 600 mpc 633 CÜÜUGGAÜACOGGUAAACOAGAGÜUAG 465 633 mpc 993 ACAÜCCÜÜCGCAAÜGCÜAÜAGA 466 993 mpc 1001 CGCAAÜGCUAÜAGAGAUAUAGCGGAG 467 1001 mpc 1019 AGCGGAGGÜÜAACGGAGUGACAGAUG 468 1019 mpc 1156 ACUGCCUGGGUAACUGGGAGGA 469 1156 Nocardia aste-roides nas 120 CACGUGGGUGAUCUGCCUCGDACUUC 470 120 nas 127 GUGAUCUGCCUCGUACUUCGGG 471 127 nas 178 AUAUGACCUUCGGAUGCAUGUCUGAG 472 178 nas 208 ÜÜAÜCGGUACGAGAUGGGCCCGCGG 473 208 nas 598 CGAÜCGUGAAAACÜUGGGGCÜCAAC 474 598 nas 614 GGGCÜCAACCCCAAGCUUGCGGGCG 475 614 nas 623 CCCAAGCUUGCGGGCGAUACGGGC 476 623 Pediococcus acidilactici pac 196 AGAUGGCUCUGCUAUCACUUCUGGA 477 196
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli pac 201 GCUCUGCUAUCACUUCUGGAUGGACC 478 201 pac 214 CUAUCACUUCUGGAUGGACCCGCGGCG- CA 479 214 pac 261 AACGGCUCACCAAGGCGAUGAUGCGUA 480 261 pac 624 GAAGAAGUGCAUUGGAAACUGGGAGAC 481 624 pac 1266 CGAGGUUUAGCUAAUCUCUUAAAACCAU 482 1266 Pediococcus pentosaceus ppe 272 AAGGCAGUGAUACGUAGCCGACCU 483 272 ppe 999 UCUGACAGUCUAAGAGAUUAGAGGU 484 999 Plesiomonas shigelloides psh 212 ACCUCAUGCUAUCGGAUGAACCCAGGU 485 212 psh 461 GUUAAUACCUAGUGGCAUUGACGUUACU 486 461 psh 467 ACCUAGÜGGCAUUGACGÜÜACÜCGCAG 487 467 psh 1272 UGAGCGAAUCCCAUAAAGUAUGUCGUAG 488 1272 Propionibacterium freuden-reichii pfr 121 ACGUGAGGAACGUGCCCUOGACUUCG 489 121 pfr 991 UGACAUGUACUGGAAGCGUUCAGAG 490 991 pfr 1019 GCGUGCCUUUUUGGCUGGUACACAG 491 1019 pfr 1130 GCAGUÜCGGCÜGGGGACÜCAÜÜGGA- GACC 492 1130 Prototheca zopfii pzo 439 AGGGCAAACUAAACCCCACACCGAGG 493 439 pzo 575 AGCUCGUAGÜUGGAUGUAGACGGÜCGC 494 575 pzo 651 CGGCACAGGACUCUGGCCUGUCCCGU 495 651 pzo 824 ACUAGGGAUCGGGGAGGCGCÜCAAÜC 496 824 pzo 1274 GACGACUCUCCCAACCCGCGCCGU 497 1274 Pseudomonas pse 225 AGAUGAGCCUAGGUCGGAUUAGCUAG 498 225 pse 419 UUCGGAUUGUAAAGCACUUUAAGUUGG 499 419 pse 677 UUCCUGUGUAGCGGUGAAAUGCGÜA 500 677 pse 704 UAÜAGGAAGGAACACCAGUGGC 501 704 Pseudomonas aeruginosa psa 136 ÜGGÜAGUGGGGGAÜAACGÜCCGGA 502 136 psa 150 AACGUCCGGAAACGGGCGCÜAAUAC 503 150 psa 161 ACGGGCGCUAAUACCGCAUACGUCCUGA 504 161 psa 180 ACGUCCUGAGGGAGAAAGUGGG 505 180 psa 265 GCCUACCAAGGCGACGAUCCGÜAACUGG 506 265 psa 639 AAACUACUGAGCUAGAGUACGGUAG 507 639 - 40 -
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID btr. E. coli Pseudomonas fluorescens pfi 455 CAGUUACCUAAUACGUGAUUGU 508 455 pfl 466 UACGUGAUUGUUUUGACGUÜACCGA 509 466 pfl 469 GUGAUUGUUUUGACGUUACCGACAGA 510 469 Pseudomonas fragi pfr 118 AAUACCUAGGAAUCUGCCUGAUAGU 511 118 pfr 262 AUGGCUCACCAAGGCUACGAUCCGUAA 512 262 pfr 455 CAÜUAACCÜAAUACGÜÜGGÜGÜCÜÜG 513 455 pfr 468 CGÜUGGÜGÜCÜÜGACGÜÜACCGACAG 514 468 pfr 474 UGÜCUUGACGUUACCGACAGAAUAA 515 474 pfr 841 ÜÜGAACÜCÜÜAGÜGGCGCAGCÜAAC 516 841 Pseudomonas mephitica pme 69 CAGCACGGAGCUÜGCUCUGGUGGCGA 517 69 pme 454 GGUGAGAGCUAAUAUCUCUUGCUAA 518 454 pme 992 GACAÜGGCUGGAAÜCCUÜGAGAGAUCA 519 992 pme 1274 AGCÜAAÜCGCAGAAAGÜGÜAÜCGÜA 520 1274 Pseudomonas putida ppu 818 AUGUCAACUAGCCGUUGGAAUCCUUG 521 818 Rhodotorula glutinis rgl 86 CCUCCGGAUUGGCUAUUGGGAGCUC 522 86 rgl 96 GAUÜGGCUAÜÜGGGAGCÜCGCGAGAGCA 523 96 rgl 106 GCCUCCGGAUUGGCUAUUGGGAGCUCG 524 106 rgl 116 UUGGCUAUUGGGAGCUCGCGAGAGCAC 525 116 Saccharomyces cerevisiae sce 613 AUUUUUUCGUGUACUGGAUUUCCAAC 526 613 sce 626 CGUGUACUGGAUUUCCAACGGGGCCU 527 626 sce 1453 UCÜCAGAGCGGAGAAUUUGGACAAAC 528 1453 Salmonella sal 148 AUAACUACUGGAAACGGUGGCU 529 148 sal 818 AUGUCUACUUGGAGGUUGUGCCCUUG 530 818 Salmonella en- terica sen 72 CAGGAAGCAGCUUGCUGCUUUGCUGA 531 72 sen 83 UUGCUGCUUUGCUGACGAGUGGCGGA 532 83 sen 233 CCAGAUGGGAUUAGCÜUGÜUGGUGA 533 233 sen 281 UCUACUUGGAGGUUGUGCCCUUGAGG 534 281 Salmonella en- teritidis sae 89 CUUCGCÜGACGACÜGGCGGACGAGÜG 535 89 sae 635 UCUGAAACÜGGCUÜGCÜÜGAGUCÜCGÜ 536 635 sae 993 ACAÜCCACAGAAGAAÜCCAGAGAUCCA 537 993 - 41 • · • · • · • · • ·· • • • • · • • Μ ·· · · • · 1 Μ • I • · • · • • · · • · • · • · · Ml • · · M# Μ • · ··
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3’) SEQ ID Nr. E. coli sae 1000 CAGAAGAAUCCAGAGAUCCAUUUGU 538 1000 sae 1016 UCCAUUUGUGCCUUAGGGAACUGUG 539 1016 Shewanella pu-trefaciens spu 1267 GAGGUGGAGCUAAUCUCACAAAGCUCG 540 1267 spu 1278 AAUCUCACAAAGCUCGUCGUAGUCCGGA 541 1278 spu 1287 AAGCUCGUCGUAGUCCGGAUUGGAGU 542 1287 Shigella shi 820 GAAUGUUAGCCGUCGGGGUGUUUACA 543 820 shi 832 UCGGGGUGUUUACACUUCGGUGGCG 544 832 Shigella boy-dii sbo 73 AGGAAGCAGCUUGCUGUUUCGC 545 73 sbo 468 CCUUUGCOCAUUGACGUUAUCCGCA 546 468 sbo 481 ACGÜUAÜCCGCAGAAGAAGCACCGGC 547 481 Shigella dys-enteriae sdy 74 GGAAGCAGCÜÜGCUGCÜÜÜGCOGAC 548 74 sdy 986 GGUCUUGACAUCCACAGAACCUUGU 549 986 sdy 1016 ÜACGAGGGÜGCCÜÜCGGGAACÜGÜGAG 550 1016 Shigella flex-neri sfl 73 AGGAAGCAGCÜÜGCÜGÜÜÜCGCUGAC 551 73 sfl 86 CUGÜÜÜCGCUGACGAGÜGGCGGACG 552 86 sfl 737 CCUGGACGAAGACUCACGCUCAGGUGC 553 737 sfl 824 ACÜÜGGAGGUÜGÜGCCCÜÜGAGGUGÜGG 554 824 sfl 1409 ACCAUGGGAGUGGGÜÜGUAAAAGAAGÜ 555 1409 Shigella son-nei sso 55 UGCAAGUCGAACGGUAACAGGAAACA 556 55 sso 73 AGGAAACAGCUUGCUGUUUCGCUGAC 557 73 Sporolactoba-cillus inulins sin 189 UGGUGCGAGGUUGAAAGAUGGUUUCG 558 189 sin 462 GGAAAUGCUGGUGCUGUGACGGUAU 559 462 sin 1436 CGGUGUGGGAACCUUUAUGGACCCAG 560 1436 Staphylococcus aureus sau 183 GAACCGCAUGGUUCAAAAGUGA 561 183 sau 222 UAUAGAUGGAUCCGCGCUGCAU 562 222 sau 236 CGCUGCAUUAGCUAGUUGGUAA 563 236 Staphylococcus carnosus sca 164 GGGGCUAAUGCCGGAUAAUAUGCAGAA 564 164 sca 187 CAUGGUUCUGCAAUGAAAGACGGUU 565 187 sca 450 AACAAGUGCGUAGGUAACUAUGCGCA 566 450 Staphylococcus stp 194 AAAGACGGUUUUGCUGUCACUU 567 194 • ·· ·· ·· · · · i • · · · , • · · · « • · · · | ··· ·· ·· - 42 - • · ·· ·· • · · · • · · t • · · · ·· ··· ···
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli epidermidis stp 201 GUUUUGCUGUCACUUAÜAGAUGGAUCC 568 201 stp 214 CUGUCACUUAUAGAUGGAÜCCGCGCCG- CA 569 214 stp 231 AÜCCGCGCCGCAÜÜAGCÜAGÜÜGGÜAA 570 231 stp 452 AAAÜGÜGÜAAGUAACÜAÜGCACGÜC 571 452 stp 469 AUGCACGUCUUGACGGUACCUAAUCA 572 469 Staphylococcus hyicus shy 66 CGAACAGAUGAGGAGCUUGCUCCUUUG 573 66 shy 989 CUUGACAUCUUÜUGAUCGCUCU 574 989 shy 1020 GUUUUCCUCUUCGGAGGACAAAAUG 575 1020 shy 1442 AGUAACCAUUUUGGAGCUAGCC 576 1442 Staphylococcus intermedius sti 163 CGGGGCUAAUGCCGGAUAACAU 577 163 sti 171 AUGCCGGAUAACAUGUUGAACCGCA 578 171 sti 183 UGUUGAACCGCAUGGUUCUACA 579 183 sti 236 CGCCGUAÜUAGCUAGUUGGUGGGG 580 236 sti 1111 CCCUUGAACUUAGUUGCCAUCAUUCA 581 1111 sti 1442 AGUAACCAUUUUGGAGCUAGCC 582 1442 Staphylococcus sciuri ssc 68 ACAGAUGAGAAGCUUGCUUCUCUGAU 583 68 ssc 193 UCAAUAGUGAAAGACGGUUUCGGCU 584 193 ssc 446 GAAGAACAAAUUUGUUAGUAACUGAA 585 446 ssc 453 AAUUUGUUAGUAACUGAACAAGUCUU 586 453 ssc 466 CUGAACAAGUCUUGACGGUACCUAA 587 466 Staphylococcus simulans ssi 188 AUGGUUUCAUGAUGAAAGACGGUUU 588 188 ssi 439 UAUUAGGGAAGAACAAGGAUGUAAGU 589 439 ssi 457 UGUAAGUAACUAUGCAUCCCUUGAC 590 457 Staphylococcus xylosus sxy 77 AGGAGCUUGCUCCUUUGAAGUU 591 77 sxy 90 UUUGAAGUUAGCGGCGGACGGG 592 90 sxy 172 UACCGGAUAACAUUUAGAACCG 593 172 sxy 185 CGCAUGGUUCUAAAGUGAAAGA 594 185 sxy 193 CUAAAGUGAAAGAUGGUUUUGCUAUCA 595 193 sxy 439 UAUUAGGGAAGAACAAAUGUGUAAGUAACUGU 596 sxy 579 CGUAGGCGGUUUCUUAAGUCUGA 597 579 sxy 1004 1AAACUCUAGAGAUAGAGCCUUC 598 1004 43
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5’->3') SEQ ID Nr. E. coli sxy 1139 ÜAAGÜÜGGGCACUCÜAGGÜÜGA 599 1139 sxy 1265 GCGAGGÜCAUGCAAAÜCCCAUA 600 1265 sxy 1445 AACCAUUUAUGGAGCUAGCCGU 601 1445 Streptococcus agalactiae sag 443 AGAGAAGAACGÜÜGGUAGGAGÜ 602 443 sag 462 GÜGGAAAAÜCÜACCAAGÜGACG 603 462 sag 624 AUUGUACGCUUUGGAAACUGGAGGACU 604 624 sag 993 ACAUCCUUCUGACCGGCCUAGA 605 993 sag 1015 AUAGGCUUUCUCUUCGGAGCAGAA 606 1015 Streptococcus bovis sbo 122 CGÜAGGUAACCUGCCÜACUAGCGGGG 607 122 sbo 135 CUACüAGCGGGGGAUAACUAUUGGAA 608 135 sbo 443 AGAGAAGAACGUGUGUGAGAGUGGAAA 609 443 sbo 625 UUGUUCGCUUUGGAAACUGUUAGAC 610 625 sbo 1260 AGUCGGUGACGGCAAGCAAAUCUCU 611 1260 sbo 1270 GGCAAGCAAAUCUCUUAAAGCCAAU 612 1270 Streptococcus dysgalactiae sdy 64 AACGCUGAGGACUGGUGCUUGCACCG 613 64 sdy 277 UGCAUCACUAUGAGAUGGACCU 614 277 sdy 443 AGAGAAGAAÜGAOGGÜGGGAGU 615 443 sdy 545 UGGUGGGAGUGGAAAAUCCACCAUGU 616 545 sdy 843 CCGGGGCÜÜAGOGCCGGAGCÜA 617 843 sdy 1004 CCGGUCUAGAGAUAGGCUUUCC 618 1004 Streptococcus equi seq 207 AACAGCUCCACUAUGAGAUGGACCU 619 207 seq 447 AAGAACAGÜGAÜGGGAGUGGAAAGUC 620 447 seq 461 AGUGGAAAGUCCAÜCAUGÜGACGGU 621 461 seq 468 AGUCCAUCAUGUGACGGÜAACÜAACCAG 622 468 seq 620 AACCAUUGUAUGCUUUGGAAACUGU 623 620 seq 1006 UUCUUAGAGAUAAGAAGUUACU 624 1006 Streptococcus mitis smi 55 ÜGCAAGUAGAACGCUGAAGGAGGAGC 625 55 smi 218 CACÜACCAGAUGGACCÜGCGÜÜGÜA 626 218 smi 472 CACACUGUGACGGUAUCUUACCAGAA 627 472 smi 645 UÜUAACUUGAGUGCAAGAGGGGAGA 628 645 smi 660 AGAGGGGAGAGUGGAAÜUCCAUGUGÜA 629 660 smi 733 GCUCUCUGGCUUGUAACUGACGCUGA 630 733 smi 843 CCGGGGUUUAGUGCCGCAGCUAACGC 631 843
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli smi 993 ACAUCCCUCUGACCGCUCUAGAGAUA 632 993 smi 1018 GAGUUUUCCUUCGGGACAGAGGUGAC 633 1018 Streptococcus pneumoniae spn 163 GAUAGCUAAUACCGCAUAAGAGUAGA 634 163 spn 183 GUAGAUGUUGCAUGACAUUUGCUUAA 635 183 spn 200 GCACUUGCAUCACUACCAGAUGGACCU 636 200 spn 207 ACUUGCAUCACUACCAGAUGGACCUG 637 207 spn 442 AAGAGAAGAACGAGUGUGAGAGUGGAA 638 442 spn 444 GAGAAGAACGAGUGUGAGAGUGGAAAG 639 444 spn 657 GCAAGAGGGGAGAGÜGGAAÜÜCCAÜGÜ 640 657 Streptococcus pyogenes spy 173 ACCGCAUAAGAGAGACUAACGCAUG 641 173 spy 440 GUUAGAGAAGAAUGAUGGUGGGAGUG 642 440 spy 469 AUCCACCAAGUGACGGUAACUAACCA- GAA 643 469 spy 1029 UCGGUACAUCGGUGACAGGUGGUGC 644 1029 Streptococcus salivarius ssa 208 AUUGCUCCACUACAAGAUGGACCUG 645 208 ssa 608 AGGCÜGÜGGCÜCAACCAÜAGÜUCGC 646 608 ssa 835 GAUCCUUUCCGGGAUUCAGUGCCGC 647 835 ssa 1240 GGUÜGGÜACAACGAGUUGCGAGUCG 648 1240 ssa 1249 AACGAGÜOGCGAGOCGGUGACGGCAAG 649 1249 Streptococcus suis ssu 478 ÜÜGACGGÜAÜCÜÜACCAGAAAGGGACG 650 478 ssu 573 AGCGAGCGCAGGCGGUOUGAÜAAGUCU 651 573 ssu 599 ÜGAAGUAAAAGGCÜGUGGCUUAACC 652 599 ssu 613 GÜGGCÜÜAACCAÜAGÜACGCÜÜÜGGA 653 613 ssu 827 AGGUGUUGGGUCCUUUCCGGGACUCA 654 827 ssu 1018 GGGUUUCUCUUCGGAGCAUCGGUGAC 655 1018 Streptococcus thermophilus sth 193 UUUGAAAGGGGCAAUUGCUCCACUA 656 193 sth 443 AGUCAAGAACGGGUGUGAGAGUGGAA 657 443 sth 470 UÜCACACÜGUGACGGÜAGCUAACCA 658 470 sth 482 CGGUAGCÜAACCAGAAAGGGACGG 659 482 sth 1249 AACGAGUUGCGAGÜCGGUGACGGCGA 660 1249 sth 1259 GAGUCGGUGACGGCGAGCUAAUCUC 661 1259 Streptococcus uberis sub 193 CCUAUUUAAAAGGGGCAAAUGCUUC 662 193
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3·) SEQ ID Nr. E. coli sub 443 AGAGAAGAACGGUAAUGGGAGUGG 663 443 sub 470 UCCAUUACGUGACGGUAACUAA 664 470 sub 610 GCUGUGGCUUAACCAUAGUUCGCUU 665 610 sub 999 GAUGCCCGCUCUAGAGAUAGAGCUU 666 999 Streptomyces griseus sgr 1264 CGCGAGGCGGAGCGAAÜCÜCAAAA 667 1264 Torulaspora tor 620 UUUCGUGUACUGGUUUCCAACCGGG 668 620 tor 834 GGGUGGUGUUUUUUUACUGACCCACU 669 834 Vibrio vib 55 UGCAAGUCGAGCGGAAACGAGUUA 670 55 vib 89 AACGAÜAACGGCGUCGAGCGGCGGAC 671 89 vib 159 AAACGAUGGCUAAUACCGCAUGAU 672 159 Vibrio chole-rae vch 116 GUAAUGCCUGGGAAAUUGCCCGGUAGAG 673 116 vch 210 GGGCCUUGCGCUACCGGAUAUGCCCA 674 210 vch 435 CUUUCAGUAGGGAGGAAGGUGGUUAAG 675 435 vch 466 UACCUUAAUCAUUUGACGUUACCOAC 676 466 vch 994 CAUCCAGAGAAUCUAGCGGAGACGCU 677 994 Vibrio parahaemolyti- cus vpa 626 GGAAUUGCAUUUGAAACUGGCAGACU 678 626 vpa 1236 CAAUGGCGCAUACAGAGGGCAGCCAA 679 1236 Vibrio vul-nificus vvu 79 AAACUUGUUUCUCGGGUGGCGAGCGG 680 79 vvu 808 GCUGUAAACGAUGUCUACUUGGAGGUU 681 808 Yersinia en-terocolitica yen 81 GUUUACUACUUUGCCGGCGAGCGGCG 682 81 yen 177 CAUAACGUCUUCGGACCAAAGUGG 683 177 yen 208 UCGGGCCUCACGCCAUCGGAUGUGCCCA 684 208 yen 431 AGCACUUUCAGCGAGGAGGAAGGC 685 431 yen 1248 CAAAGUGAAGCGAACUCGCGAGAGCAAG 686 1248 yen 1270 AGCAAGCGGACCACAUAAAGUCUGUC 687 1270 Zymomonas mo-bilis zmo 623 UCUGGAACUGCCUUUGAGACUGUUAGA 688 623 zmo 732 GACUUACUGGUCUAUAGUUGACGC 689 732 zmo 1006 GAAAGUGGAGACACAUUCUUUCAGUUC 690 1006
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder eine erfin- • · ·· ·· • · • · ··· ··· • · ·· * • · • · • · ··· · • ·· * · · • · i • · • · 9 • 91 Μ • · • · • · • · ·* - 46 - dungsgemäße Nukleinsäure zur Bestimmung von Euterinfektionen bei milchgebenden Säugetieren, wobei das milchgebende Säugetier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel und Pferd. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder einer erfindungsgemäßen Oligonukleotid/Nukleinsäure zur Prozesskontrolle bei der Lebensmittelherstellung und zur Kontrolle von fertigen Lebensmittel für die Überprüfung des Frischezustandes und der hygienischen Bedingungen Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder eines erfindungsgemäßen Oligo-nukleotids/Nukleinsäure zur Überwachung von technischen Fermentationen, vorzugsweise bei der Produktion von organischen Substanzen, wie Lebensmittel-Zusatzstoffen, basierend auf Mikroorganismen und/oder zur raschen Kontrolle von sterilen und kontaminationsfreien Bedingungen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Detektion von intrazellulären Bakterien.
Intrazelluläre Erreger spielen eine bedeutende Rolle in der Humanmedizin als auch in Tierhaltung und somit in der Lebensmittelproduktion und der menschlichen Ernährung. Über Infektionen des Atem- und Genitaltrakts von Nutz- und Haustieren können sie schwerwiegende Erkrankungen wie Lungenentzündungen verursachen.
Darüber hinaus wurden sie als kontaminierende Keime in Zellkulturen nachgewiesen. Durch deren Vermehrung in der Wirtszelle können sie deren Stoffwechsel beeinflussen. Viele biologische Produkte werden mittels Zellkulturen erzeugt. Eine Infektion der Zelllinie mit intrazellulären Keimen könnte die Produktion beeinflussen und somit die Ausbeute verringern bzw. das Produktionsgleichgewicht zu Gunsten eines anderen Metaboliten verschieben.
Herkömmliche Bestimmungsmethoden basieren auf einer Anreicherung der intrazellulären Keime bzw. auf molekularen Techniken, wie DNA Fluorochrome Färbung, Immunofluoreszenz-Methoden (z.B. ELISA) oder Polymerase chain reaction (PCR). Alle Methoden sind jedoch mit Nachteilen behaftet: die Kultivierung von intrazellulären Keimen ist, wenn überhaupt möglich, schwierig und dauert sehr lange (4 Tage bis mehrere Wochen). Andere Methoden sind schwierig zu interpretieren und können so zu falschen Ergebnissen führen (DNA Fluorochrome-Färbung). Immunofluoreszenz- - 47 - ·· • ·· · ·· • · • · • · ·· • · • · • · • · ··· ·· • · • · • · • ·
Methoden sind nur beschränkt einsetzbar, da Mycoplasmen ähnliche Antigene haben wie Streptococcus milleri und Staphylococcus aureus.
Andere molekularbiologische Methoden (z.B. PCR) können nur ein eingeschränktes Keimspektrum identifizieren, da Limitierungen durch die Anzahl an Primer gegeben sind.
Bisherige auf Mikroarrays basierende Methoden zielen lediglich auf eine kleine Gruppe von Mycoplasmen ab. Andere intrazelluläre Keime bzw. Mitglieder der Gattungen Chlamydia und Rickettsia können somit nicht erfasst werden. Allein zur Gattung Mycoplasma zählen über 100 verschiedene Spezies.
Die hier vorliegende Erfindung kann sowohl andere Gattungen der Mollicutes als auch andere intrazelluläre Keime identifizieren. Des Weiteren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein größeres Spektrum innerhalb der Gattung Mycoplasma bestimmt werden.
Die Klasse der Mollicutes enthält folgende Ordnungen: Acho-leplasmatales, Anaeroplasmatales, Entomoplasmatales, Mycoplasmatales .
Zur Ordnung Mycoplasmatales werden unter anderem folgende Gattungen gezählt: Mycoplasma und Ureaplasma (Klassifizierung nach J.P. Euzeby - Procaryotic names Standing in nomenclature).
Die relevanten Spezies und Genera der Mollicutes können mit dieser Sondenanordnung detektiert und identifiziert werden:
Acholeplasma laidlawii Anaeroplasma
Borrelia burgdoerferi Borrelia recurrentis Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis Chlamydophila abortus Chlamydophila pecorum
Chlamydophila pneumoniae
Chlamydophila psittaci Entomoplasma
Rickettsia akari Rickettsia australis Rickettsia conorii
Mycoplasma agalactiae Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma buccale Mycoplasma capricolum Mycoplasma faucium Mycoplasma fermentans Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma muris Mycoplasma mycoides Mycoplasma orale Mycoplasma pirum 48
Rickettsia parkeri Rickettsia prowazekii Rickettsia rickettsii Rickettsia sibirica Rickettsia typhi
Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma primatum Mycoplasma putrefaciens Mycoplasma salivarium
Thermoplasma acidophilum Ureaplasma urealyticum
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Detektion und Bestimmung mindestens eines intrazellulären Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe umfassend eukaryotische oder prokaryotische Zellen, b) Isolierung von in der Probe enthaltener DNA, c) Inkontaktbringen der isolierten DNA mit mindestens einer Sonde, die an die amplifizierte und markierte DNA des 16S rRNA Gen der isolierten DNA bindet, und mindestens 80% ident mit einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831 oder deren reverskomplementären Sequenzen, wobei die Sonden an einem festen Träger immobilisiert sind, d) Feststellen einer Bindung der isolierten DNA an die mindestens eine Sonde, und e) Detektieren oder Bestimmen eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle B angeführten Mikroorganismen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung von intrazellulären Mikroorganismen in eukaryotischen bzw. prokaryotischen Zellen, wobei insbesondere die in Tabelle B angeführten Mikroorganismen bestimmt werden können. Mit Hilfe der in Tabelle B angeführten Sonden kann das Vorhandensein von DNA dieser Organismen spezifisch bestimmt werden. Es sei hierbei anzumerken, dass anstelle des Nukleotids U auch das Nukleotid T eingesetzt werden kann.
Tabelle B:
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli Acholeplasma laidlawii ala 68 AAGCAUCUUCGGAUGCUUAGUGGCGA 691 68 ala 180 AGGAUGÜGUGCAUGAAAAAAACACA 692 180 ala 588 UUAUAAAAGUUUGUGGUGUAAGUGCAG 693 588 ala 621 ACGCUGUGAGGCUAUGAAAACUAUAU 694 621 Anaeroplasma ana 129 ACCÜGOCÜUÜAAGACGAGGAUAACCG 695 129 ana 310 CCACAAUGGAACÜGAGAACGGUCCAÜ 696 310 ana 825 CÜAAGÜGÜÜGGÜGAÜAAAÜCAGÜGC 697 825 ana 991 UGACAUCUAGGUGUUAGUUAUAGAG 698 991 Borrelia burg-doerferi bbu 392 AGCGACACUGCGUGAAUGAAGAAGGU 699 392 bbu 631 ÜAUGUUGGAAACÜAUAUGUCÜAGAGU 700 631 bbu 660 AÜAGAGGAAGÜÜAGAAÜÜÜCUGGÜGÜ 701 660 bbu 715 AÜACCGGAGGCGAAGGCGAACUUCUGG 702 715 bbu 1012 GAGAUAAUUAUUCCCCGUUUGGGGUC 703 1012 bbu 1132 AUGUAAUGGÜGGGGACUCAGAUAAGA 704 1132 bbu 1284 AUAAAGCAGGUCUCAGOCCGGAUUGAA 705 1284 bbu 1448 CCGÜAAGGGAGGAAGGÜAÜÜUAAGGU 706 1448 Borrelia re-currentis bre 210 AAAGCUUÜGCUÜGÜAGAUGAGÜCÜG 707 210 bre 482 CGUUAAUUUAUGAAUAAGUCCCGG 708 482 bre 1430 CGAAGCUAUUAUUUUAACCCGCAAG 709 1430 Chlamydia pneumoniae cpn 148 AUAACGGUUGGAAACGAUCGCUAAUA 710 148 cpn 272 AAGGCGAUGACGUCÜAGGCGGAUUGA 711 272 cpn 590 AGGAAAGUUAGAUGUUAAAUUUUGG 712 590 cpn 731 CGCUUUUCUAAUUUAUACCUGACGC 713 731 cpn 844 ACCCCAUCCGÜGÜCGGAGCÜAACGUGUÜ 714 844 cpn 1007 CÜGUAGAAAUACAGCUUUCCGCAAGG 715 1007 Chlamydia trachomatis cta 160 AACGGCCGCUAAUACCGAAUGUGGC- GAUAU 716 160 cta 294 UUGAGAGAUUGGCCGCCAACACUGGG 717 294 cta 838 GUCUCAACCCCAUCCGUGUCGGAGCU 718 838 cta 973 AAGGACCÜÜACCÜGGGÜÜUGACAUGÜ- AUA 719 973 cta 1121 ÜAGUUGCCAGCACÜÜAGGGUGGGAAC 720 1121 Chlamydophila abortus cab 266 CCUACCAAGGUUUUGACGUCUAGGC 721 266
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3·) SEQ ID Nr. E. coli cab 1542 AACAUGGGAÜCÜÜAAGÜUÜUAGÜCG 722 1542 Chlamydophila pecorum cpe 224 AGAGAAAGUCUGUGGGAUAUCAGCÜÜ 723 224 cpe 648 UUCUAGAGGUUGGAUGGAGAAAAGGG 724 648 Chlamydophila pneumoniae cpn 112 GUUAGUAGU ACAUAGAUAAUCU GCC 725 112 cpn 144 GGGGAUAACGGUUGGAAACGAUCGCU 726 144 cpn 267 CCACCAAGGCGAUGACGUCUAGGCGGA 727 267 cpn 648 vUUCUAGAGGAUAGAUGGGGAAAAGGG 728 648 cpn 1441 ACUCAACCUAUUÜAUAGGAGAGAGG 729 1441 Chlamydophila psittaci cps 834 GAUAGUCUCAACCCUAUCCGUGUCG 730 834 cps 1350 UGGCGÜGUCAGCOAUAACGCCGUGA 731 1350 Entomoplasma ent 660 AGAGAGGUAAACGGAAÜÜCCAÜGÜGÜ 732 660 ent 721 GUGGCGAAAGCGGUUUACUGGCU 733 721 Mycoplasma agalactiae mag 180 ACUUAUUAUUUUUGCAUGAAAGUAAU 734 180 mag 425 ÜÜGÜAAACÜGCÜGÜGGÜÜAGGGAAGA 735 425 mag 594 AAGUCUGGCGUUAAAUUUOGGGGCU 736 594 mag 998 UUCUGCAAAGCUAUGGAGACAUAGUG 737 998 Mycoplasma ar-ginini mar 64 AGCGAGGÜÜCOÜÜUGAACCÜAGCGG 738 64 mar 463 GAAAOGCUUCCAGGCUGACGGUACC 739 463 mar 987 CUCUUGACAUCCUOCGCAAUGCOAOA 740 987 mar 993 ACAUCCUOCGCAAUGCUAUAGAGAU 741 993 Mycoplasma ar-thritidis mat 429 AAAGUGCUGUUAUAGGGGAAGAACA 742 429 Mycoplasma buccale mbu 150 ACCCAAUGGAAACAUUGGUUAAUGCCG 743 150 mbu 158 GAAACAUUGGUUAAUGCCGGAUACGC 744 158 mbu 694 AAUGCGUAGAUAUAUAUGGAAGAACA 745 694 mbu 823 CAUUAGUCGGUGGAGAAUCACUGACG 746 823 Mycoplasma ca-pricolum mca 59 AGUCGAACGGGGGUGCUUGCACCUCA 747 59 mca 121 ACGUAU CUAACCUACCUUAUAGCGG 748 121 mca 167 GAUAAUACCGCAUGUAGAUCUUAUO 749 167 mca 193 AUCAAAAGAACCGÜUUGGUUCACÜAÜGA 750 193 mca 225 AGAUGGGGAUGCGGCGUAUUAGCÜA 751 225 - 51 - 51 ·· ··
M ·« • · ♦ • tt
• M
·· M • ·
Mt
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5r->3') SEQ ID Nr. E. coli mca 1108 CAACCCÜÜGÜCGÜÜAGOÜACUAACAÜ 752 1108 Mycoplasma faucium mfa 150 ACCÜAAUGGAAACAÜOGGÜÜAAÜGCCGG 753 150 mfa 457 GUÜGAGGAAAÜGCAACÜAAGCÜGACG 754 457 ' mfa 464 AAAUGCAACUAAGCUGACGGUACCUU- GÜUAGA 755 464 mfa 827 AGUCGGUGGGAGCCACUGACGC 756 827 Mycoplasma fermentans mfe 57 CAOGOCGAGCGAAGGÜAGCAAÜACCÜÜA 757 57 mfe 172 ÜÜÜCAAAÜACOCGUAGÜÜÜÜCGCAÜGA 758 172 mfe 215 CÜÜCGCUGGAGGAGCGGGGÜGCGÜAAC 759 215 mfe 710 GAAGAACACCAAGAÜGGCGAAGGCAG 760 710 Mycoplasma gallisepticum mga 180 AACAAGUUAACUAUCGCAUGAGAAUA 761 180 mga 458 UAGAGUGGAAAGCUAUUAAUUUGACU 762 458 mga 727 AAGGCGAGGACÜÜGGGCCAAÜACUG 763 727 Mycoplasma ge-nitalium mge 192 AUUAAAGUUGAAAGGACCUGCAAGGGU 764 192 mge 460 CAGGCAAÜGGCUGGAGUUUGACÜGÜAC 765 460 mge 606 AAAGGCAGCÜGCÜÜAACAGÜÜGOAOG 766 606 mge 834 GGAGCGAÜCCCÜUCGGUAGUGAAGÜÜ 767 834 mge 1149 ÜAACGAGACÜGCUAAUGUAAAUOGGAG 768 1149 mge 1448 CÜUÜAÜÜGGAAGCGCAUGUCAAGGAÜAG 769 1448 Mycoplasma hominis mho 56 GCAUGUCGAGCGAGGUUAGCAAUAACC 770 56 mho 464 AAAUGAUUGCAGACUGACGGUACCUU 771 464 mho 823 CAUUAGUCGGÜGGAGAAÜCACUGACG 772 823 mho 1013 AGAUAUAGUGGAGGUÜAUCGGAGOGA 773 1013 Mycoplasma hy-orhinis mhy 179 UAUAGUUAUUUAUCGCAUGAUGAGU 774 179 mhy 223 AAAAAUGGGGGÜGCGGAACAUUAGUUA 775 223 mhy 286 UAGCCGGGCCGAGAGGCÜGUACGGCC 776 286 mhy 617 CUCAACUUCAGUCCGCUUUGGAUAC 777 617 mhy 834 GGAAUAAÜUÜCACÜAACGCAGC 778 834 Mycoplasma mu-ris mmu 170 AAUACCGCAUAGGGCAUUAUUAÜCG 779 170 mmu 572 AAGCGAGCGCGGGCGGAUUUGCAAG 780 572 mmu 827 AAAÜGÜUGGCACGGAAUGUGUCGGUG 781 827 - 52 - 52 • · ·· · • · • · · ··· ··· 1 · · « ·· ··
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli Mycoplasma my-coides mmy 176 GCAUGUAGAUCUUAUUAUCGCAUGA 782 176 mmy 627 GUUCGCCUUGAAÄACUGUAUUACUA 783 627 mmy 1434 GUAGGUAGCUUAACCGUUUGGAGAGC 784 1434 Mycoplasma orale mor 68 AAGUAGCAAUACUUUAGCGGCGAAUGGG 785 68 mor 150 ACCUAAUGGAAACAUUGGUUAAUGCCG 786 150 mor 452 CAGUÜAGUUGAGGAAAUGCUUCUAAUC 787 452 mor 823 CAUUAGUCGGUGGAAAACUACUGACG 788 823 Mycoplasma pirum mpi 177 CAUAACAAAUGUACUAUCGCAUGA 789 177 mpi 279 UGACGÜGUAGÜÜAÜGCUGAGAGGÜ 790 279 mpi 457 GCAGAGGAAAUGAÜGUÜAGÜUÜGACGG 791 457 mpi 821 GAUGUUAGAU GUCGGGGUAAACGCCU 792 821 Mycoplasma pneumoniae mpe 192 AUCAAAGUUGAAAGGACCUGCAAGGG 793 192 mpe 448 AGAAUGACUUUAGCAGGUAAUGGCUAG 794 448 mpe 606 AAAGGCAGCUGCUUAACAGUUGUAU 795 606 mpe 993 ACAUCCUUGGCAAAGUUAUGGAAACA 796 993 mpe 1119 GUUAGUUACAUUGUCUAGCGAGACU 797 1119 mpe 1429 UÜAÄAAACGÜGÜUGCÜAACCAÜUAGGAA 798 1429 Mycoplasma primatum mpr 183 UUAAGAUCGCAUGGUUUUAAUAUAA 799 183 mpr 433 UGCUGUGGUUAGGGAAGAAAAAGUAAU- Aü 800 433 Mycoplasma pu-trefaciens mpu 455 UAAAGUAGGAAAUGCCUUUAUAUUGAC 801 455 mpu 724 GCGAAAGCGGCUUACUGGUUUGUUA 802 724 mpu 832 UUGGGUGAACUCAGCGCCGCAGCU 803 832 Mycoplasma sa-livarium msa 450 AAAAAGUAGUUGAGGAAAUGCUUCUAC 804 450 msa 737 ACUGGGUUUAUACUGACGCUGAGGAAC 805 737 msa 821 AUCAUUAGUCGGCAGAGAACUGUUG 806 821 Rickettsia akari rak 69 CUGAUUGGGGUUUUCUCCAGUUAGU 807 69 rak 731 CGGUCAUCUGGGCUACGACUGACGC 808 731 rak 825 CUAGAUAUCGGAAGAGUCUCUUUCGG 809 825 Rickettsia rau 78 GGGGUUUACUCUAAUUAGUUAGUGG 810 78 ·· • · • · • · • · ♦ · - 53 -
Spezies Sonde Sequenz (sense) (5'->3') SEQ ID Nr. E. coli australis rau 829 AUAUCGGAAGAUUUUCUUUCGGUUUC 811 829 rau 989 CUUGACAUGGUGGUUGCGGAUCGCAG 812 989 Rickettsia co-norii reo 84 UGCUCCAGUUAGUUAGUGGCAGACG 813 84 Rickettsia parkeri rpa 68 ACUAAUUUGGGGCUUGCUCCAAUUAGUU 814 68 rpa 725 CGAAGGCGGUCGUCUGGGCUACAA 815 725 Rickettsia prowazekii rpr 68 AUUAACUAGAGCUCGCUUUAGUUA 816 68 rpr 1023 UUCAGUUCGGCUGGGCCACACACAG 817 1023 Rickettsia rickettsii rri 127 GUCAUCUGGGCOACCACUGACGCUGAU 818 127 rri 984 CAACCCUUGACAUGGUGGUUGCGGA 819 984 Rickettsia si-birica rsi 68 ACUAAUUÜGGGGCUUGCUCCAAUUUAG 820 68 rsi 584 GCGGUUUAGUAAGUUGGGAGUGAAAG 821 584 Rickettsia typhi rty 69 UUAAUUAGAGCUUGCUCUAGUUAAU 822 69 rty 993 ACAUGGUGGUUAUGGAUUGCAGAGA 823 993 rty 1029 UCGGCUGGGCCACACACAGGUG 824 1029 Thermoplasma acidophilum tac 183 ACAAACUGGAAUGGUUGUAAUGAUG 825 183 tac 624 GAAGAACUUCUGAAGAGACUGUAAG 826 624 tac 866 GUGUUAAGUGGGUCACUUGGGGAGU 827 866 tac 1281 CUCGAAACCCGUUCGUAGUCAGGACU 828 1281 Ureaplasma urealyticum uur 602 UAUUAAAUCUAGAUGCUUAACGUCUA 829 602 uur 871 AAAUGAUGUGCCUGGGUAGUACAUUC 830 871 uur 1269 GAUGAAGCGAAACAGAAAAAGUUAGU 831 1269
Die Isolierung von DNA aus eukaryotischen und prokaryoti-schen Zellen erfolgt erfindungsgemäß nach in der Fachwelt bekannten Verfahren (siehe z.B. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von J. Sambrook and D.W. Russell (3. Auflage, 2001. CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY).
Nach dem Isolieren der Gesamt-DNA der Zellen wird diese mit den erfindungsgemäßen Sonden, welche auf einem festen Träger im- - 54 • t Ψ * · · • • · ·· ·· • · • · • • · • · • • · • · • • · t · ··· • · ·· mobilisiert sind, in Kontakt gebracht. Dadurch wird der DNA der Zellen ermöglicht, sich unter stringenten Bedingungen an die immobilisierten Sonden zu binden, sofern die isolierte DNA zu den Sonden komplementär ist. Bindet ein Teil der isolierten DNA an eine Sonde gemäß Tabelle B, zeigt dies auf, dass in der Zelle der gemäß Tabelle B korrespondierende Organismus vorhanden ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkultur, Biopsiematerial, Abstrichen, insbesondere Vaginal-Abstrichen, bronchoskopischen Abstrichen aus der Gruppe der Nahrungsmittel (z.B. Fleisch, Milch), der Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Speiche-l, Liquor oder CSF) und der Fermentationslösungen.
Prinzipiell kann erfindungsgemäß jede Probe verwendet werden, die bekannterweise intrazelluläre Erreger/Mikroorganismen aufweist (Identifizierung der intrazellulären Erreger) oder aber von welcher nicht bekannt ist, ob derartige Erreger/Mikroorganismen in einer Zelle vorhanden sind (qualitative Bestimmung von intrazellulären Erregern). Insbesondere werden jedoch Proben bevorzugt, von denen bekannt ist, dass diese intrazelluläre Erreger/Mikroorganismen aufweisen können.
Die zu analysierende Probe ist vorzugsweise menschlichen oder tierischen Ursprungs, wobei das Tier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Katze, Hund, Hase, Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel, Schwein und Pferd.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können intrazelluläre Mikroorganismen bzw. Erreger in tierischen und menschlichen Zellen nachgewiesen werden. Aufgrund der Spezifität der erfindungsgemäßen Sonden können die Mikroorganismen spezifisch in diesen Proben bestimmt werden.
Um die Menge an DNA der intrazellulären Mikroorganismen in einer Probe zu vermehren, wird vorzugsweise nach Schritt b) und vor Schritt c) das 16S rRNA -Gen der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik amplifiziert. Derartige Verfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt und können mit jeglicher Art von Primern durchgeführt werden, sofern diese derart ausgewählt werden, dass die Amplifikation es ermöglicht, das 16S rRNA bzw. 18S rRNA-Gen zu vermehren. Primer mit diesen Eigenschaften sind in der Fachwelt ebenfalls bekannt. Vorzugsweise weisen die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. • ·· ·· ·· · • • · • · • • • • · • • · • · • ♦ ··♦ ·· ·· ·· · · • · ·· ·· • · · · • ♦ · · • ♦ · · - 55 - ....... 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 auf.
Die Detektion der Bindung der isolierten Nukleinsäure bzw. der amplifizierten DNA kann durch Markierung dieser Moleküle mit beispielsweise einem Farbstoff wesentlich erleichtert werden.
Dies gilt insbesondere für Verfahren, die auf Mikroarrays basieren. Daher ist die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung (z.B. mit einem Farbstoff) markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die isolierte Nukleinsäure mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831.
Erfindungsgemäß ist es möglich, die isolierte Nukleinsäure bzw. die amplifizierte DNA mit sämtlichen immobilisierten Sonden mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831 in Kontakt zu bringen. Jedoch je nach Bedarf (z.B. Detektion bestimmter Mikroorganismen) können spezifische Sonden aus der Tabelle B ausgewählt und eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere gut zur Identifizierung von intrazellulären Keimen in einer Probe durch die Verwendung der in Tabelle B angeführten spezifischen Sonden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Bakterien durch Mustererkennung.
Die parallele Differenzialdiagnostik von Bakterien im Hochdurchsatz aus verschiedensten Substraten wurde erst durch die Microarray-Technologie ermöglicht. Hierbei werden für jeden Erreger möglichst spezifische DNA-Sonden verwendet; auf Grund der hohen Sequenzhomologien zwischen Spezies oder sogar Genera ist es vielfach aber nicht in allen Fällen möglich, 100% spezifische Sonden zu designen. Das resultierende Phänomen nennt man Kreuzhybridisierung und beschreibt ein Signal, das nicht auf Grund einer Hybridisierung des zu detektierenden Keims, sondern eines ähnlichen Keims zustande gekommen ist. Wegen dieser Kreuzhybridisierungen ist eine Auswertung der Daten nach einzelnen Erre- gern und der dazugehörigen Sonden, wie zB ROC-Analyse, nicht möglich, die Kreuzhybridisierungen würden hier die Spezifität negativ beeinflussen. Außerdem ist in den Kreuzhybridisierungsmustern wertvolle Information enthalten. Daher ist eine Analysenmethode vonnöten, die - statt den Signalen einzelner Sonden -Signalmuster zur differenziellen Diagnostik verwendet. Eine solche Methode sollte es auch ermöglichen, Mischinfektionen von 2 oder mehreren Erregern korrekt zu detektieren.
Erfindungsgemäß werden für jeden Erreger mehrere Sonden de-signt, die möglicherweise unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Nun wird erst für jeden zu detektierenden Erreger eine Anzahl an Hybridisierungen durchgeführt, die genaue Anzahl der nötigen Hybridisierungen hängt von der Ähnlichkeit der zu unterscheidenden Erreger ab. Die Daten dieser Hybridisierungen werden nach geeigneter Vorprozessierung (siehe unten) zusammengefasst und als sogenanntes Trainingsset gespeichert. Das Trainingsset dient dazu, die vorhandenen Muster wiederzuspiegeln. Jede neue Hybridisierung mit einem unbekannten Erreger wird dann anhand von Ähnlichkeiten mit bekannten Hybridisierungen im Trainingsset klassifiziert.
Die einzelnen Schritte des Verfahrens sind wie folgt: • Vorprozessierung: Einlesen der Daten, erste Qualitätskontrolle, Zusammenfassen der redundanten Informationen am Chip (z.B. Spot-replikate) • Normalisierung: Da es sich um ein technisch relativ aufwendiges Verfahren mit vielen unterschiedlichen Laborschritten handelt, und jeder dieser Schritte möglicherweise mit systematischen Fehlern behaftet ist, müssen vor der eigentlichen Klassifizierung diese Fehler korrigiert werden. Dies kann auf 2 verschiedene Arten geschehen: o Wenn es möglich ist, DNA Sequenzen zu definieren, die in jeder Probe in gleicher Menge vorhanden sein müssen, dann kann man für diese Sequenzen Sonden desi-gnen, und anhand der Signale dieser Sonden die systematischen Fehler korrigieren. Dies kann z.B. auch durch spiking entsprechender Sequenzen in das Probenmaterial erfolgen. o Wenn es nicht möglich ist, solche Sequnzen zu definieren, und wenn spiking z.B. aus logistischen Gründen nicht möglich ist, dann kann man die Daten durch rang- - 57 - 57 i.» --------------r*ä basierte Verfahren, wie z.B. die Quantil-Normalisierung, normalisieren.
Erstellen und Validieren des Klassifiers: Anhand des Trainingssets muss ein geeigneter Algorithmus gefunden werden, mit dem die Ähnlichkeiten einer unbekannten Hybridisierung mit den Hybridisierungen des Trainingssets definiert werden können. Dieser Klassifikator kann dann in einem Kreuzvalidierungsverfahren validiert werden. In vorangegangenen Experimenten hat sich ein k-Nearest Neighbor Verfahren als geeignet erwiesen. Allerdings ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, Mehrfachinfektionen in einer einzelnen Probe zu identifizieren. Daher wird zur Detektion von multiplen Erregern ein anderes Verfahren, der Nearest Ceontroid Algorithmus, eingesetzt. Mit diesem Algorithmus soll es möglich sein, aus dem Hybridisierungsmuster einer mehr-Erreger-Hybridisierung und dem Wissen der Clusterzentren der zugehörigen ein-Erreger-Hybridisierung (aus dem Trainingsset) auf die Einzelerreger rückzuschliessen. (Dempster A et al. Journal of the Royal Statistical Society, Series B, 39(1):1-38, 1977; Ripley, B. D. (1996) Pattern Recognition and Neural Networks, Cambridge; Boistad, B. M. (2003) Bioinformatics 19(2) ,pp 185-193). Hastie, T. et al., J. (2001) The elements of Statistical Learning; Data Mining, Interference and Prediction (Springer, New York) Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen festen Träger zur Abtrennung mikrobieller DNA aus einer Probe, wobei am Träger mindestens eine Nukleinsäure immobilisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 836 bis 851.
Der erfindungsgemäße Träger eignet sich insbesondere zum Isolieren bzw. Binden von Nukleinsäuren (DNA und RNA), die von Gram-negativen, Gram-positiven, Mycoplasmen, Chlamydien, Coxiel-la burnetti und Rickettsien stammt. Dadurch ist es beispielsweise beim Bestimmen von Mikroorganismen oder beim Bestimmen der Art von Zellen in einer Probe möglich, pathogene von nicht pathogenen, Gram-negative von Gram-positiven Mikroorganismen, bzw. eukaryotische von prokaryotischer DNA durch deren unterschiedliche Bindung an den erfindungsgemäßen Träger zu trennen.
Die Oberfläche des festen Trägers wird zur Immobilisierung der Sonden mit reaktiven Gruppen (z.B. Aldehyd oder Epoxy) versehen. Diese reaktiven Gruppen binden kovalent an aktive Gruppen ·· • * • e • · • · ··- 58 - ee# ··· ·· ·· ·♦ • · ♦ « • · · i • · « ··· ·· ·· (z.B. Amino-Gruppe) am 5'- oder 3'- Ende einer spezifischen DNA Sequenz. Siehe folgende Tabelle:
Targets Position Sequenz (5’ - 3') SEQ ID No. Gram neg. 33 CGCTGGCGGCAGGCCTAA-CU-ACATGCAAGTC- GAACGGTAACAGGAAGCAGCTTG 836 182 CGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG- CCTCTTGCCATC-GA-GATGTGCCCAGATGGGAT- TAGCTAGT 837 876 GACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT- CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG- CGGTGGAGC 838 1173 GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC- CCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGG 839 Gram pos. 1475 AGGAGCCAGCCGCCT AAGGT GGGAT AGAT -GATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA 840 1040 GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT- CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG- CAAC 841 500 AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG- CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-AG-TCCGGA- AT-TTATTGGGCGTAAAG 842 Mycoplasma 494 AGAAAGCNANGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCG- CGGTAATACATAGGTNGCAAGCGTTATCCG-GA-A- AT-TTATTG 843 TCCGCCTGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACT- CT-AAAAGGAATTGACGGGGA-CT-CCCGCACAAG 844 Chlamydia 759 GGCGCGAAAGCAAGGGGAGCAAACAGGATTAGATA- CCCTGGTAGTCCTTGCCGTAAACGATGCATACTT- GATGTGGAT 845 1112 CCTTATCGTTAGTTGCCAGCACTTAGGGTGG- GAACTCTACGAGACTGCCTGGGTTAACCAGGAGG 846 324 CTGGGACTGAGACACTGCCCAGACTCCTACGGGAG- GCTGCAGTCGAGAATCTTTCGCAATGGACG 847 Coxiella burnetti 412 GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCGGTGGG- GAAGAAATTCTCAAGGGTAATATCCTTGGGCG 848 960 TCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGA- CATCCTCGGAACTTGTCAGAGATGATTTGGTG 849 Rickettsia 658 TAGTAGGGGATGATGGAATTCCTAGTGTAGAGGT- GAAATTCTTAGATATTAGGAGGACACCGGTG 850
Targets Position Sequenz <5' - 3') SEQ ID Mo. 345 GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGC- GAAAGCCTGATCCAGCAATACCGAGTGAGTGAT- GAAGGCC 851 1202 CATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACGCGTGCTA- CAATGGTGTTTACAGAGGGAAGCAAGACGG 852
Die Sonden-Sequenzen sind komplementär zu den Mikroben-Se-quenzen und dienen der Abtrennung von mikrobieller DNA und RNA von der DNA / RNA mit eukaryotischem Ursprung oder auch Mikro-ben-DNA mit nicht komplementärer Sequenz. Die Sonden haben eine Länge von 20 bis 80 Basen, wobei auch längere Stücke möglich sind. Durch längere DNA Sequenzen wird die Spezifität herabgesetzt, wodurch auch DNA mit einem oder mehreren Mismatches binden würde.
Durch Erhöhung der Spezifität können ähnliche DNA Sequenzen z.B. von verschiedenen Bakterien-Sezies bzw. Gruppen (z.B. zur Auftrennung der DNA von pathogenen und nicht-pathogenen Keimen) voneinander getrennt werden. Dies verhindert die Störung weiterer Analysen durch unerwünschte DNA bei molekularbiologischem Pathogen-Identifizierungen aus Matrizen mit einem starken Hintergrund verschiedener Bakterien (z.B. Lebensmittelbereich, Veterinärbereich) .
Die Auftrennung von eukaryotischer RNA von jener prokaryoti-schen Ursprungs kann durch Immobilisierung von poly-T Sequenzen an der Bead-Oberfläche vorgenommen werden.
Diese Beads bzw. dieses Säulchen dienen der selektiven Auftrennung von DNA bzw. RNA mit unterschiedlichem Ursprung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Träger ein Material, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Agarose, Metall, Polymer, vorzugsweise Polystyrol, Kieselgel (Silicagel) und Kombinationen davon.
Der erfindungsgemäße Träger kann aus jeglichem Material bestehen, sofern dieses die Immobilisierung von Nukleinsäuren an dessen Oberfläche ermöglicht. Derartige Träger sind in der Fachwelt hinreichend bekannt
Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß Träger, welche aus gleichförmigen und monodispersen Kugeln (z.B. Dynabeads) bestehen, die vorzugsweise einen magnetischen Kern aus Fe203 und
Fe304 mit daraus resultierenden paramagnetischen oder magnetischen Eigenschaften enthalten. Diese symmetrischen Kugeln können mit einer dünnen Polystyrolschicht umgeben sein und einen Durchmesser zwischen 0,5-100 μπι haben. Besonders bevorzugt werden Träger mit paramagnetischen Eigenschaften. So kann gewährleistet werden, daß es außerhalb des Magnetfeldes zu keinen Effekten aufgrund des Magnetismus zwischen den Kugeln und den Zielmolekülen kommen kann.
Die Oberfläche dieser im Wesentlichen kugeligen festen Träger wird vorzugsweise mit spezifischen Liganden beladen. Es handelt sich vorzugsweise um solche, die über 10 oder 25 Nukleotid lange dT (Desoxythymidin)-Ketten verfügen, sowie auch um Kugeln, an deren Oberfläche Streptavidin-Moleküle gebunden sind.
Zunächst werden die Liganden der Kugeln (Streptavidin oder Oligo dT) mit der spezifischen Sonde (Biotin oder Oligo dA) gekoppelt. Anschließend werden die Versuchsbedingungen so gewählt, daß eine Hybridisierung zwischen der gesuchten Nukleinsäure und dem dazu komplementären Abschnitt der Sonden-Liganden-Kopplung möglich ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Abtrennung mikrobieller DNA aus einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Träger gemäß der vorliegenden Erfindung, c) Trennen der Probe vom festen Träger.
Der feste Träger, an dessen Oberfläche sich die DNA-Sonden befinden, kann zur Trennung von prokaryotischer DNA von eukaryo-tischer DNA verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel, Liquor, Urin, Sekrete, Cerebrospinal fluid (CSF) und Waschlösung von Spülungen z.B. der Lunge, Bauchhöhle und Mundhöhle, flüssigen und festen Lebensmitteln im Rahmen der Lebensmittelherstellung zur prozess-kontrolle und zur Kontrolle von fertigen Lebensmittel für die Überprüfung des Frischezustandes und der hygienischen Bedingungen. Des Weiteren kann die Erfindung eingesetzt werden zur Überwachung von technischen Fermentationen basierend auf Mikroorga- nismen bzw. zur raschen Kontrolle der sterilen (kontaminationsfreien) Bedingungen.
Die DNA Gram-negativer Bakterien wird vorzugsweise mit einem festen Träger abgetrennt, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 836 bis 839 und Fragmente davon, immobilisiert ist.
Die DNA Gram-positiver Bakterien wird vorzugsweise mit einem festen Träger abgetrennt, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 840 bis 842 und Fragmente davon, immobilisiert ist.
Die DNA von Mykoplasmen wird vorzugsweise mit einem festen Träger abgetrennt, an dem die Nukleinsäure SEQ ID Nr. 843 oder Fragmente davon immobilisiert sind.
Die DNA von Chlamydien wird vorzugsweise mit einem festen Träger abgetrennt, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 844 bis 846 und Fragmenten davon, immobilisiert ist.
Die DNA von Coxiella burnetti wird vorzugsweise mit einem festen Träger abgetrennt, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 847 und 848 und Fragmenten davon, immobilisiert ist.
Die DNA von Rickettsien wird vorzugsweise mit einem festen Träger abgetrennt, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 849 bis 851 und Fragmenten davon, immobilisiert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Mikroarray umfassend ein Substrat und mindestens eine Sonde, die mindestens 80% ident ist mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmenten davon und deren reverskomplementären Sequenzen.
Ein Mikroarray (allgemein auch als Genchip, DNA-Chip oder Biochip bekannt) ist eine Sammlung von mikroskopischen DNA-Spots, die an einer festen Oberfläche, wie Glas, Kunststoff oder einem Siliziumchip, angebracht sind und einen Array zum Zweck der Expressionsprofilierung bilden, der die Niveaus (Levels) für eine große Anzahl von amplifizierten Nukleinsäuren gleichzeitig überwacht. Mikroarrays können unter Verwendung unterschiedlicher Technologien hergestellt werden, so unter anderem durch Drucken mittels Nadeln mit feinen Spitzen auf Glas-Trägern (Südes), 62 • I · • * *· • · · • · · • · · ·· ··♦
Photolithographie unter Verwendung von vorgefertigten Masken, Photolithographie unter Verwendung von dynamischen Mikrospiegeleinrichtungen, Tintelstrahldrucken oder Elektrochemie auf Mi-kroelektroden-Arrays. Der erfindungsgemäße Mikroarray kann eine Vielzahl von verschiedenen oder aber auch identen Sonden aufweisen. Daher ist ein Mikroarray in der Lage eine Vielzahl von Nukleinsäuren an der Oberfläche eines Arrays (Substrats) zu binden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind am Mikroarray mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 30, noch mehr bevorzugt mindestens 50, Sonden gebunden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher dargelegt, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt ein Agarose Gel nach der Elektrophorese der PCR-Produkte.
Fig. 2 zeigt Hybridisierungsversuche von gelabellten PCR-Produkten.
Fig. 3 zeigt zwei Beispiele für die graphische Auswertung eines Scan-Bildes nach Fig. 2. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
Fig. 4 zeigt drei graphische Auswertung von Scan-Bildern von Versuchen zur Belegung der Funktionalität der Paralleldetektion von zwei Keimen in einer Probe. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
Fig. 5 zeigt eine Heatmap der Wiederholungen von Parallelbestimmungen von zwei Erregern aus einer Probe zur Belegung der Reproduzierbarkeit der Paralleldetektion von zwei Keimen in einer Probe. Des Weiteren werden die Muster von Einzelhybridisierungen mit jenen von Doppelhybridisierungen verglichen.
Fig. 6 zeigt Hybridisierungsversuche von gelabellten PCR-Produkten basierend auf DNA isoliert von intrazellulären Keimen.
Fig. 7 zeigt ein Beispiel für die graphische Auswertung eines Scan-Bildes nach Fig. 6. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen. - 63 - Μ · • · ··
• · • • • · • t • · • • #♦ • M • ·· • S ·» · • • · • · ♦ • • • · • • * • · · • » ·· ·· BEISPIELE:
Beispiel 1: Bestimmen von Mikroorganismen in Proben, insbesondere in Lebensmittelproben: 1.1. Lebensmittel 1.1.1. Milch
Isolation der Mikroorganismen und DNA-Isolation • Entnehmen einer Probe mit geeignetem Volumen (10 ml) • Zentrifugation der Vollmilch bei 5000 g für 10 min • Überstand (wässrige und fettige Schicht) abheben und verwerfen • Resuspension des Pellets in 10 ml physiologischem Phosphat-Buffer • Filtration durch einen 5 pm Spritzenvorsatz-Filter. • Zentrifugation des Filtrats bei 5000 g für 5 min. • Überstand verwerfen • Pellet in 100 μΐ destilliertem Wasser resuspendieren • Zellaufschluss mittels Enzym-Mix (Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K) unter Einhaltung der Arbeitsanleitungen des Herstellers und anschließendem Koch-Protokoll (95°C, 15 min) • Zentrifugation des Zell-Lysats bei 10.000 g für 10 min • Reinigen der DNA Suspension mit einem Reinigungs.-Kit (In-visorb oder Roche DNA-Aufreinigung) 1.1.2. Milchprodukte 1.1.2.1. Joghurt, Sauermilch • Probe mit Wasser verdünnen, vortexen und Zentrifugation bei 5000 g / 5 min • Überstand verwerfen, Pellet mit dest. Wasser resuspendieren . , • Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade. 1.1.2.2. Käse • Probenstücke fein zerkleinern und in lxPBS suspendieren. • Extraktion der Inhaltsstoffe des Rohproduktes • Mikroorganismen mittels Zentrifugation pelletieren • Überstand verwerfen, Pellet mit dest. Wasser resuspendieren. • Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade. 1.1.2. Fleischprodukte • Oberflächenkulturen werden durch Abstreifen der oberflächlichen, viskosen Flüssigkeit mit einer Impföse geerntet. • Abstrich in lxPBS suspendieren • Zentrifugation bei 5000 g / 5 min • Überstand verwerfen und Pellet mit dest. Wasser resuspen-dieren. • Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade.
Ganze Gewebestücke • Proben aus innerliegendem Gewebe werden an unterschiedlichen Stellen ausgestochen, mechanisch zerkleinert (z.B. French Press) , vermengt und in ein Reaktionsgefäß überführt. • Aufschluss von Muskelzellen mittels enzymatischen Verdau (z.B. Trypsin in HCl-Buffer nach der Anweisung des Herstellers) und wenn notwendig durch den Einsatz detergenter/chaotroper Substanzen. • Verdünnen des Fleischextrakts mit 10 ml physiologischem Phosphatbuffer. • Zentrifugation 5000 g / 5 min • Überstand verwerfen, • Pellet reinigen mit 10 ml TE - Buffer, pH 8 (10 mM Tris, 1 mM EDTA) • Zentrifugation 5000 g / 5 min • Überstand verwerfen und Pellet in 100 μΐ destilliertem Wasser resuspendieren. • Zellaufschluss und DNA Isolation mittels Roche DNA Isolation Kit for PCR Grade. 1.1.3. Pflanzliche Produkte • siehe Aufbereitung von Käse • Verwendung der isolierten DNA -Suspension für die PCR.
Beispiel 2: Bestimmen von Mikroorganismen in humanmedizinischen Proben und auch in veterinärmedizinischen Proben 2.1. Mastits, veterinärmedizinische Infektionskrankheiten: • Arthritis - 65 99 9 • • t 99 ·· • · 9 # • · 9 • · • • 99 • M 999 9 ·* ·· 99 • • • • 9 • • • 9 • • · • « • • • • 9 ··· ·· 99 • Pneumonie • Septikämie • Endokarditis
Probengewinnung und Isolierungsprotokolle für die oben angeführten Infektionskrankheiten sind nach Verordnungen und den Vorschriften des österreichischen Veterinärgesetzes durchzuführen.
Zellaufschluss und DNA-Isolierung: Mikroorganismen-Suspensi-on auf 95°C für 15 min erhitzen, zentrifugieren (10000 g / 10 min) und Überstand in neues Eppendorf überführen. Diese DNA-Sus-pension dient als Vorlage für die PCR Reaktion.
Beispiel 3: Molekularbioloaische Methoden zur Mplifizie-rung, Labellina und Hybridisierung von DNA 3.1. DNÄ-Amplifizierung durch PCR-Reaktion: 25μ1 Primer FW 16S (SEQ ID Nr. 832) 0,5 Primer Rev 16S (SEQ ID Nr. 833) 0,5 Primer FW 18S (SEQ ID Nr. 834) 0,5 Primer Rev 18S (SEQ ID Nr. 835) 0,5 lOx Taq Puffer 2,5 dNTP-Mix 2 MgCl2 1,5 Taq-Polymerase 0,25 Betain 1,25 Glycerin 2,5 H20 12 24
Durch Variation der Wassermenge kann auch die Menge der eingesetzten DNA-Suspension variiert werden. Durch Zusatz von markierten Nukleotiden (6 nmol Cy5-dCTP (Amersham Biosciences, UK) ) oder Verwendung von markierten Primern (0,3 nM Cy3 5'end label-led Primer) kann das Labelling bereits während der ersten PCR erfolgen.
Sequenz des 16S rRNA- Primer F27: 5'-TAATACGACTCACTA-TAGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID Nr. 832) - 66 - - 66 - 1« • • • »· • • « • • • • • • »· ··· • • ·· ·· ·· ♦ · * • • • · • • • • # • • • • · * »·« ··· ··
Sequenz des 16S rRNA- Primer R1492: 5'- TACGGYTACCTTGTTAC-GACTT (0,3 nM in PCR mixture) (Gutenberger et al., 1991) (SEQ ID Nr. 833) 18S FW Primer: 5'- TCCGCAGGTTCACCTAC (SEQ ID Nr. 834) 18S Rev Primer: 5'- CAAGTCTGGTGC CAGCA (White et al., 1990) (SEQ ID Nr. 835).
Weitere Konzentrationen der Zusätze: 3 ü Taq DNA Polymerase (Invitrogen, California), 2,5 pL lOx PCR-Puffer, 2 mM MgCl2; 10 % Glycerin and 0,5 % Betain. PCR-Zyklen: Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen auf 95°C für 30 sec, 55°C für 1 min, und 72°C für 1 min. Temperatur-Zyklen wurden mit 72°C für 10 min beendet, mit abschließender Lagerung bei 4 °C. 3.2. Markierung (Labelling):
Im Falle eines 2-Schritt-Labellings wird in einer 2ten Reaktion ein markiertes Nukleotid in das PCR-Produkt eingebaut. Zu diesen Methoden zählen: Primer Extension, in vitro Transkription, Biotin-Streptavidin-Labelling, Isothermal Klenow Fragment basiertes Labelling. In diesem Protokoll wird die Primer Extension näher beschrieben: 1 Ansatz pL Primer FW 16S (SEQ ID Nr. 832) 1,5 Primer Rev 18S (SEQ ID Nr. 835) 1,5 dNTP's 0,125 lOx Vent-Puffer 2,5 MgS04 0,25 H20 12,335 Cy3-dCTP 0,04 Vent-Polymerase 0,75 19 6 μΐ PCR-Produkt wurden in den Reaktions-Mix zugegeben. Dieser bestand aus 0,9 mM Forward Primer 27, 1,5 LJ Vent (exo) Polymerase (New England Biolabs, Ipswich), 3 mM MgS04 und 50 μΜ von dATP, dGTP, dTTP, dCTP und 25 μΜ Cy5-dCTP. Folgende Temperatur-Zyklen wurden angewandt: 25x für jeweils 20 Sekunden auf 95°C, 60°C und 72°C erhitzen, gefolgt von einer abschließenden Vervollständigung partieller Sequenzen bei 72 °C für 5 Minuten. 3.3. Markierungsfreie (Labelfreie) Detektion: • · 9 99 • ft 99 9 9 • • 9 9 9 • • 9 9 ft • • 9 9 • • · 999 • ft ·· • t • · • · • · • · 67 • ft
Die hier beschriebenen Sondenkombinationen mit der dazugehörigen statistischen Auswertung mittels Pattern recognition sin prinzipiell auch mit Methoden anwendbar, welche keine markierten Nukleotide einsetzen. Diese sind z.B. Surface Plasmon Resonance (SPR) oder Messung von Potenzial-Veränderungen an der Oberfläche von Goldbeschichtungen aufgrund von Hybridisierungs-Ereignissen. 3.4. Hybridisierung
Vor der Hybridisierung wurde die Oberfläche der bespotteten Mikroarrays mit einem Blockier-Puffer (Cyanoborhydride Puffer: 20 mM Na2HP04, 10 mM NaH2P04, 2 0 0 mM NaCl, 50 mM NaBH3CN) für 30 min bei Raumtemperatur behandelt.
Die Hybridisierungs-Lösung mit den markierten DNA-Sequenzen wurde auf eine Endkonzentration von 4x SSC, 0,1% SDS in 24 pl Suspension eingestellt. 22 μΐ dieser Lösung wurden auf einen DNA-Chip übertragen und mit einem Glas-Plättchen abgedeckt. Die Hybridisierung wurde bei 65°C für 1 Stunde in einer wasserdampfgesättigten Kammer durchgeführt. Die Arrays wurden in 2x SSC und 0,1 % SDS für 5 min, gefolgt von 0,2 x SSC für 2 min und 0,lx SSC für 1 Minute gewaschen. Die Arrays wurden durch eine 2-minütige Zentrifugation bei 900g getrocknet. 3.5. Signal Erfassung und Daten-Analyse
Die Arrays wurden mit einer Auflösung von 10 pm mit einem Axon Genepix 4000A microarray Scanner (Axon, Union City, California) gescannt. Signal-Intensitäten wurden mit der speziellen Microarray-Image Analysen-Software (GenePix) errechnet. Die ermittelten Werte dienen als Ausgangsdaten für weitere statistische Auswertungen.
Beispiel 4: Bakterien-Nachweis und Identifizierung aus ge-spikter, roher Vollmilch
Material und Methoden • Bakterien ansetzen in 3 ml Caso-Bouillon und Inkubation über Nacht bei 37°C am Schüttelinkubator.
Spezies 1: Staph. aureus 1. Spezies 2: E. coli 2. Spezies 3: Pseudomonas aeruginosa • Bakterien ernten durch Zentrifugation bei 3000 g für 5 min. Überstand verwerfen und das Pellet zweimal mit 1 ml lx PBS waschen und Zentrifugation bei 3000 g für 5 min. 68 ·· ·
• Einstellung der Bakterien-Dichte mit McFarland-Standard # 0,5: Photometrische Messung der Standardlösung (Wellenlänge = 625 nm) und Vergleich der Messwerte mit den Bak-terien-Suspensionen. Verdünnung der Lösung, bis die gleiche Extinktion wie mit der Standardlösung gemessen wird. Dies entspricht einer Konzentration von 108 Bakterien pro mL. • Transfer von 106 Bakterien in neues Eppendorf und Zugabe von 1 mL unbehandelter Vollmilch. • Isolierung der Bakterien und deren DNA aus der gespikten Vollmilch inkl. Vergleich von 5 verschiedenen Methoden: 1. Μ 1: * Zentrifugation, der Vollmilch bei 10000 g für 5 min
1. Überstand verwerfen und Resuspension des Pellets in 1 ml lxPBS 2. Zentrifugation 10000 g für 5 min 3. Zweimalige Wiederholung des Reinigungsschrittes 4. Überstand verwerfen und Pellet in 100 pL mQ H20 resuspendieren 5. Zellaufschluss: Kochprotokoll => 95°C; 15 min 6. Zentrifugation 12000 g für 10 min
7. Überstand ist bereit für die PCR 2. M 2: wie Methode 1, jedoch mit einer zusätzlichen Aufreinigung nach dem Zellaufschluss 3. M 3: wie Methode 1, jedoch Zellaufschluss mittels Generation-Säulchen der Firma Gentra. (Elutionsvolumen: 50 pL) 4. M 4: wie Methode 1, jedoch mit Durchführung eines zusätzlichen Filtrationsschritts (hydrophil, Porengröße: 5 pm) der Bakterien-Suspension vor dem Zellaufschluss. 5. M 5: Filtration des gespikten Vollbluts. Weitere Verfahrensschritte wie bei Methode 1. • Ansetzen der PCR mit 1 pL des Zell-Lysats DNA-Amplifizierung durch PCR-Reaktion: 25pl 0,5 0,5
Primer FW 16S Primer Rev 16S - 69 - • · • · • · • · • · ··· • · ··· ♦ · · • · • · ♦ · « • · 1 « i M ·· • ·
Primer FW 18S 0,5 Primer Rev 18S 0,5 lOx Taq Puffer 2,5 dNTP-Mix 2 MgCl2 1,5 Taq-Polymerase 0,25 Betain 1,25 Glycerol 2,5 H20 12 24 • Labelling mittels Primer Extension: 1 Ansatz Primer FW 16S 1,5 Primer Rev 18S 1,5 dNTP's 0,125 lOx Vent-Puffer 2,5 MgS04 0,25 H20 12,335 Cy3-dCTP 0,04 Vent-Polymerase 0,75 19 6 μΐ PCR Produkt wurden in den Reaktions-Mix zugegeben. 1
Blockieren der Mikroarrays: Behandlung mit Blockier-Puf-fer (Cyanoborhydrid Puffer: 20 mM Na2H P04, 10 mM NaH2P04, 200 mM NaCl, 50 mM NaBH3CN) für 30 min bei Raumtemperatur. • Hybridisierung: markierte DNA-Sequenzen wurden auf eine Endkonzentration von 4x SSC, 0,1% SDS in 24 μΐ Suspension eingestellt. 22 μΐ dieser Lösung wurden auf einen DNA-Chip übertragen und mit einem Glas-Plättchen abgedeckt. Die Hybridisierung wurde bei 65°C für 1 Stunde in einer Wasserdampf-gesättigten Kammer durchgeführt. • Waschen: Die Arrays wurden in 2x SSC und 0,1 % SDS für 5 min, gefolgt von 0,2 x SSC für 2 min und 0,lx SSC für 1 Minute gewaschen. Die Arrays wurden durch eine 2-minütige Zentrifugation bei 900g getrocknet. • t • · ♦ · • · • · • φ • · • · ·# - 70 - • Signal-Erfassung und Daten-Analyse: Einscannen mit einer Auflösung von 10 pm (Axon Genepix 4000A microarray Scanner (Axon, Union City, California)). Signal-Intensitäten wurden mit der speziellen Microarray-Image Analyse Software (GenePix) errechnet. Die ermittelten Werte dienen als Ausgangsdaten· für weitere statistische Auswertungen.
Ergebnisse
Zellaufschluss und DNA-Konzentration in Zell-Lysat:
Probe Keim Methode 260/280 Konz, ng/pl 1 LL1 rk 2,7 19,8 2 EC2 2,24 77,2 3 PA1 2,14 50,2 4 neg.Kontrolle Μ 1 0,67 19,2 5 LL1 1,25 28,1 6 EC2 1,75 24,9 7 PA1 1,25 53,8 8 LL1 M 2 1,41 3,6 9 EC2 +Invisorb 1,28 5 10 PA1 1,52 4,6 11 LL1 M 3 1,8 41 12 EC2 + Gentra 1,83 16 13 PA1 2,01 16,5 14 neg.Kontrolle M 4 2,6 0,5 15 LL1 5um vZA 1,26 1 16 EC2 1,79 9 17 PA1 0,68 1,1 18 LL1 M 5 1,16 2,6 19 EC2 5 um vM 1,19 40,4 20 PA1 1,5 19,9
Auszählung der Agar-Platten der Kontroll-Ausstriche nach den jeweiligen Arbeitsschritten:
Lactoc.lactis E. coli
Methode 1: fettiger Überstand nach 1. Zentri Methode 5: " unzählbar ~ 300 unzählbar ~ 350 • 9 99 99 99 • 9 9 9 • • • 9 9 9 • • • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Ml 999 99 99 - 71 - • 9 99 • t · • I · • · ♦ 99 ···
Methode 1: Oberstand nach 2. Zentri 27 ~ 500 Methode 5: If 43 49 Methode 1: Überstand nach 3. Zentri 29 400 Methode 5: IV 16 103 Methode 1: Suspension vor Zellaufschl. 1/10 ~ 1300 unzählbar Methode 5: II 120 unzählbar
Ein Agarose Gel nach der Elektrophorese der PCR-Produkte ist in Fig. 1 dargestellt. Die Hybridisierungsversuche von gelabell-ten PCR-Produkten werden in Fig. 2 illustriert. Fig. 3 zeigt ein Beispiel für die graphische Auswertung eines Scan-Bildes. Für die bessere Visualisierung wurden nur positive Signale erfasst und auf der Abszisse aufgetragen.
Interpretation
Durch die Zugabe einer bestimmten Menge von Bakterien zu unbehandelter Vollmilch wurde das klinische Syndrom einer bovinen Mastitis simuliert. Die verschiedenen Abtrennungsmethoden zur Isolierung von Bakterien bzw. deren DNA aus der natürlichen Probenmatrix zeigten - aufgrund der Auswertung mittels Kontroll-Ausstrichen, Messung der DNA-Konzentration und Evaluierung mittels PCR - verschiedene Effizienzen. Die Messung der DNA-Konzen-tration im Zell-Lysat ergab, dass die Filtration mit einem 5pm Filter vor dem Zellaufschluss eine effiziente Auftrennung von Bakterien und bovinen Zellen erzielen konnte. Der Zellaufschluss mittels Generation-Säulchen von Gentra führte zu einer hohen Reinheit der DNA-Suspension (gemessen am Verhältnis der Extinktionen von 260 und 280 nm) . Anhand dieser Methode konnte mittels PCR die effizienteste Amplifizierung erlangt werden.
Anschließendes Labelleln und Hybridisieren sämtlicher PCR-Produkte zeigte deutlich, dass speziell erstellte Oligonukleo-tid-Sonden sehr gut für die Detektion von Mikroben aus Milch geeignet sind. Durch charakteristische Signale bzw. Signalmuster von spezifischen Sonden konnte eine eindeutige Identifizierung der Erreger sogar auf Spezies-Ebene erzielt werden.
Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Methode geeignet ist, Bakterien aus einer Mischung von eukaryotischen und proka-ryotischen Zellen zu isolieren und deren DNA in einer qualitativ - 72 hochwertigen Form zu gewinnen, um damit eine molekularbiologische Detektion durchzuführen.
Beispiel eines typischen Spotmusters eines spezifischen Mi-kroarrays mit einer definierten Auswahl an Sonden (hier dargestellt: Mastitis-Chip-2): pK 1 sau1 sau 2 sau 3 sxy1 sxy3 sxy6 sxy8 sxy10 sti 2 stl 4 sb 5 sby1 shy3 stp2 stp5 stp 6 sag 2 sag 3 sag4 sdy 1 sdy 3 sdy 5 subl sub2 sub5 kpn2 kpn3 kpn4 kox1 kox2 eco 1 eco 2 ecl 1 ecl 3 ecl 4 eagl eag3 eag5 eae1 eae3 eae 5 psa1 psa3 psaS psa6 asa1 asa3 ssa8 cf) 1 cfl 4 cam2 cam 5 lla 3 apy 1 apy 3 myc 5 myc 10 myc 15 mca1 mca3 mca4 myb1 myb 2 myb 6 nas1 nas4 nas6 cbo1 cbo3 lla 1 lla 2 Ila4 lla 5 lla 6 bce2 bcs4 bcs5 o <D to cpe4 cps7 can 1 can 2 cal 1 cal 2 cal 3 cgi 1 cgi 3 cgi 5 cpa1 cpa2 csa1 csa3 Ctrl rgl 1 rgl 4 aftj 1 atü 2 atu 4 pzo1 pzo 2 pzo 3 pzo 4 Icr 1 Icr 2 mly1 mly4 mva1 mva 3 lmo2 imoS lmo9 pK1
Beispiel 5: Identifizierung von intrazellulären Keimen Für die Detektion und Identifizierung von intrazellulärer DNA aus einer Probe mit einem sehr hohen Anteil an Hintergrund DNA wurde eine gespikte Probe generiert. In einer wäßrigen Lösung wurden 100 ng/μΐ an eukaryotischer DNA vorgelegt und mit 1 ng/μΐ intrazellulärer DNA vermischt. In diesem Beispiel wurde DNA von den Keimen Mycoplasma bovis, M. pneumoniae und Rickettsia rickettsii verwendet.
Die Durchführung der DNA Amplifikation als auch die Markierung und Hybridisierung erfolgten wie oben angegeben.
Anhand des ausgewählten Sonden-Panels war eine eindeutige Identifizierung der DNA von intrazellulären Keimen möglich. Es wurden nur äußerst schwache Kreuzhybridisierungen detektiert, so-dass die Anwendung der Mustererkennung basierend auf der Nearest Centroid Methode eine automatisierte Identifizierung zuläßt. Siehe Fig. 6 und 7
Beispiel 6: Mustererkennung zur Bakterienidentifizierung 4.1. Problematik:
Die parallele Differenzialdiagnostik von Bakterien im Hochdurchsatz aus verschiedensten Substraten wurde erst durch die Microarray-Technologie ermöglicht. Hierbei werden für jeden Erreger möglichst spezifische DNA-Sonden verwendet; auf Grund der hohen Sequenzhomologien zwischen Spezies oder sogar Genera ist es vielfach aber nicht möglich, 100% spezifische Sonden zu desi-gnen. Das resultierende Phänomen nennt man Kreuzhybridisierung, und beschreibt ein Signal, das nicht auf Grund einer Hybridisierung des zu detektierenden Keims, sondern eines ähnlichen Keims zustande gekommen ist. Wegen dieser Kreuzhybridisierungen ist eine Auswertung der Daten nach einzelnen Erregern und der dazugehörigen Sonden wie z.B. ROC-Analyse, nicht möglich, die Kreuzhybridisierungen würden hier die Spezifität negativ beeinflussen. Außerdem ist in den Kreuzhybridisierungsmustern wertvolle Information enthalten. Daher ist eine Analysenmethode vonnöten, die - statt der Signale einzelner Sonden - Signalmuster zur dif-ferenziellen Diagnostik verwendet. Eine solche Methode sollte es auch ermöglichen, Mischinfektionen von 2 oder mehreren Erregern korrekt zu detektieren. 4.2. Lösung
Im hier geoffenbarten Ansatz werden für jeden Erreger mehrere Sonden designt, die möglicherweise unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Nun wird erst für jeden zu detektierenden Erreger eine Anzahl an Hybridisierungen durchgeführt, die genaue Anzahl der nötigen Hybridisierungen hängt von der Ähnlichkeit der zu unterscheidenden Erreger ab. Die Daten dieser Hybridisierungen werden nach geeigneter Vorprozessierung (siehe unten) zusammengefasst und als sogenanntes Trainingsset gespeichert. Das Trainingsset dient dazu, die vorhandenen Muster wiederzuspiegeln. Jede neue Hybridisierung mit einem unbekannten Erreger wird dann anhand von Ähnlichkeiten mit bekannten Hybridisierungen im Trainingsset klassifiziert.
Die einzelnen Schritte des Verfahrens sind wie folgt: • Vorprozessierung: Einlesen der Daten, erste Qualitätskontrolle, Zusammenfassen der redundanten Informationen am Chip (zB Spot-replikate) • Normalisierung: Da es sich um ein technisch relativ aufwendiges Verfahren mit vielen unterschiedlichen Laborschritten handelt, und jeder dieser Schritte möglicherweise mit systematischen Fehlern behaftet ist, müssen vor der eigentlichen Klassifizierung diese Fehler korrigiert werden. Dies kann auf 2 verschiedene Arten geschehen: o Wenn es möglich ist, DNA Sequenzen zu definieren, die in jeder Probe in gleicher Menge vorhanden sein müssen, dann kann man für diese Sequenzen Sonden desi-gnen, und anhand der Signale dieser Sonden die systematischen Fehler korrigieren. Dies kann zB auch durch - 74 - • · • · ·· ··· ·· ·· ·· ··· • · • · • · • · »· spiking entsprechender Sequenzen in das Probenmaterial erfolgen. o Wenn es nicht möglich ist, solche Sequnzen zu definieren, und wenn spiking zB aus logistischen Gründen nicht möglich ist, dann kann man die Daten durch rangbasierte Verfahren, wie z.B. die Quantil-Normalisierung, normalisieren. • Erstellen und Validieren des Klassifiers: Anhand des Trainingssets muss nun ein geeigneter Algorithmus gefunden werden, mit dem die Ähnlichkeiten einer unbekannten Hybridisierung mit den Hybridisierungen des Trainingssets definiert werden können. Dieser Klassifikator kann dann in einem Kreuzvalidierungsverfahren validiert werden. In vorangegangenen Experimenten hat sich ein k-Nearest Neighbor Verfahren als geeignet erwiesen. Allerdings ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, Mehrfachinfektionen in einer einzelnen Probe zu identifizieren. Daher wird zur Detektion von multiplen Erregern ein anderes Verfahren, der Nearest centroid-Algorithmus, eingesetzt. Mit diesem Algorithmus soll es möglich sein, aus dem Hybridisierungsmuster einer mehr-Erreger-Hybridisierung und dem Wissen der Clusterzentren der zugehörigen ein-Erreger-Hybridisierung (aus dem Trainingsset) auf die Einzelerreger rückzuschließen.
Beispiel 7; Identifizierung von mehreren Keimen in einer Probe basierend auf Microarray Ergebnissen und Nearest Centroid Classification
Eine Spezies-Identifizierung durch Interpretation von komplexen Hybridisierungsmustern erlaubt die korrekte Klassifizierung von eng verwandten Spezies und Genera. Die Anwendung von kNN Klassifizierung erlaubte bereits eine 100 %ige Zuordnung von Stämmen zu einer bestimmten Gattung.
Mit der Nearest Centroid Klassifizierung ist eine automatisierte Identifizierung von zumindest 2 verschiedenen Mikroben-Spezies großteils möglich. Dies erfolgt lediglich auf Basis eines Training-Sets bestehend aus Daten von Einzel-Keim-Hybridi-sierungen.
Methode:
Datensätze
Es wurden zwei Datensätze angelegt: 1., Hybridisierungs-Daten von Einzel-Spezies Nachweis (insg. 43) 2., Daten von parallelen Zwei-Spezies Nachweisen (39 Hybrid. )
Die Hybridisierungen mit einer Spezies dienten als Trainings-Set und die Daten von den Hybridisierungen von 2 Spezies in einer Probe dienten als Test-Daten. Die folgende Anzahl an Hybridisierungen für jeden Keim bzw. Keimkombinationen wurde herangezogen:
Spezies Anzahl Hybridisierung Klebsiella oxytoca 4 Escherichia coli 5 Staphylococcus aureus 8 Enterococcus faecalis 6 Campylobacter coli 2 Enterobacter aerogenes 5 Staphylococcus epidermidis 8 Pseudomonas aeruginosa 2 Enterococcus faecium 3
Spezies 1 Spezies 2 Anzahl Hybridisierung Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis 5 Enterococcus faecium Staphylococcus epidermidis 6 Campylobacter coli Staphylococcus aureus 4 Enterobacter aerogenes Enterococcus faecium 4 Escherichia coli Staphylococcus aureus 7 Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium 5 Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium 5 Campylobacter coli Staphylococcus aureus 2 Enterobacter aerogenes Enterococcus faecium 1
Bildung eines Classifiers von Einzel-Spezies Daten:
Die Daten der Einzel-Spezies Hybridisierungen wurden in "R" als gpr-files eingelesen und mittels Quantilen-Normalisierung standardisiert. Die spezifischen Sonden wurden mittels der pamr • M ·« ·· · · « | • · I f · • · t · t • · · · · tt« * * • ·· • · « i · · • · · ·* ♦·· · - 76 -
Funktion (neärest shrunken centroid) definiert und stellten das Panel des Datensatzes dar, von denen die Schwerpunkte (Centro-ids) für jede Spezies kalkuliert wurden. Danach wurden die theoretischen Centroide der multiplen-Keim-Proben durch paarweise Addition der Centroide der gereihten Einzel-Spezies-Hybridisie-rungen kalkuliert.
Klassifizierung von Multiplen-Spezies Datensätze:
Zwei-Spezies Hybridisierungen wurden gemeinsam mit dem Clas-sifier eingelesen und eine Quantilen Normalisierung durchgeführt. Die Klassifizierung wurde durch eine Kalkulation der Distanzen in und zu den Test-Hybridisierungen und dem Auswahlen des nächst-gelegenen Centroids erreicht.
Ergebnisse:
Vor der Klassifizierung der Zwei-Spezies-Hybridisierungen wurde der Classifier mit den Daten der Einzel-Hybridisierungen getestet. Alle Hybridisierungen wurden korrekt klassifiziert und somit die Spezies richtig identifiziert.
Bei den Zwei-Spezies-Hybridisierungen wurden folgende Identifizierungen erhalten:
Spezies 1 Spezies 2 Erkannt als : Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus aureus.Enterococcus faecium Campylobacter coli Staphylococcus aureus Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium - 77 - • · ♦ · · • · ·· ·· • · · • · · • ·· · • · · · ·· ·· • · · I · I • · · ♦· ··· · ··· Spezies 1 Spezies 2 Erkannt als : Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterobacter aeroge-nes.Enterococcus faecium Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Campylobacter coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus.-Campylobacter coli Enterobacter aeroge-nes Enterococcus faecium Enterococcus faecium Pseudomonas aerugino- Enterococcus faecium Pseudomonas ·· ·· ► · · · » · · m • · · · » · · ♦ ·· ·· - 78 - ♦ · ·· ·· • · · · • · I · • · · t ·· ··· ···
Spezies 1 Spezies 2 Erkannt als : sa aeruginosa .Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca Enterococcus faecium Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecium Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Klebsiella oxytoca .Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Enterococcus faecium Staphylococcus epi-dermidis Staphylococcus epidermi-dis.Enterococcus faecium Escherichia coli Staphylococcus aureus Escherichia coli.Staphylococcus aureus Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis.Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis.Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis.Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis • In allen Fällen wurde zumindest eine Spezies korrekt identifiziert, sowohl auf Genera- als auch auf Spezies-Ebene • In 82 % der Fälle wurden beide Genera korrekt identifiziert und 79 % der Spezies • In 92 % der Fälle wurde eine Genera richtig erkannt, während die andere Genera falsch zugeordnet wurde. (90 % auf Spezies-Ebene) • In 90 % der Fälle wurde ein Genera richtig detektiert, während die andere nicht detektiert wurde. (Gleiches Ergebnis auf Spezies-Ebene)
Folgende Misklassifizierungen wurden erhalten:
Gattung 1 Spezies 1 Gattung 2 Spezies 2 Automatisiert erkannt als Klebsi oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faeca- ella lis.Enterobacter aeroge-nes Klebsi ella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis. Enterobacter aeroge-nes Klebsi ella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis .Enterobacter aeroge-nes Klebsi ella oxytoca Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Entero- coccus faecium Staphylococ- cus epidermidis Staphylococcus aureus .Enterococcus faecium Campy- lobac- ter coli Staphylococ- cus aureus Campylobacter coli Entero bacter aeroge- nes Enterococcus faecium Enterococcus faecium Esche richia coli Staphylococ- cus aureus Staphylococcus aureus
Die meisten Fehlzuordnungen wurden durch die Kombination von K. oxytoca und E. faecalis verursacht. Der Grund konnte noch nicht geklärt werden. 1
• · · · I *·· ·· ·· SEQUENCE LISTING <110> Wiesinger-Mayr, Herbert <120> verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen <130> R 48812 <160> 852 <170> Patentin Version 3.4 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 1 aatgcctggg aaattgccca gtcgag 26 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 2 aattgcccag tcgaggggga taacagt 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 3 gggccttgcg cgattggata tgccca 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 4 tgcgcgattg gatatgccca ggtggg 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 5 gaagagcttg ctctttggtg gcgag 25
I <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 6 aaacggcgcg ggctaataac ctgtg <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 7 ttggggttta ttaaccttag tagcgc <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 8 tggtcgggac agagggttgc caagccg <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 9 tgctgacggt atctgcagaa taag <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 10 ttttaactgc cgagctagag tatgtca <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 11 tgggataata ctgacgctca gacac <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 12 atgtcaacta gctgttgggg ccgtta <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 13 aacggtaacg ggccttcggg tgccg <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 14 acgcatcgga acgtgcccag tggtgg <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 15 aaaccgcttt ttgtcaaggg aagga <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 16 aactggttgt tgggtgggtt tctac <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 17 ccggatattc tgcttttgcc gcatg <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 18 agtacagaag aagcattttt gtgac <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 19 acactgcgat gtgccagaga tggtgca <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 20 cagcatgttg tggtggggac tcacgg <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 21 gcgatctact ggaacaatat tgacgct <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 22 tgacatagta agaatgattt agagata <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 23 tagtgtctgc ttgcagaaac ttgcat <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 24 acagaagtta ataagggaaa gatttat <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 25 gagacttgat cttgcagtaa tgcagt <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 26 taaacagact gcctacgcaa gtaggagg <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 27 aagtcgaacg atgatccggt gcttgc <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 28 acatggaccg gaccgccgca gaaatgtg <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 29 aaatgtggtt tctccttttg gggccg <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 30 gatcgggcgg tgtttctatg atga <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 31 gaatggctcg gtgaggcctt egg <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 32 aggggagttg gcaacgactc cc <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 33 caacgactcc ccagagccgg <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 34 aagtcgagcg aatggattaa gagc «· ·· 7
<210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 35 25 26 tggattaaga gcttgctctt atgaa <210> 36 <21I> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 36 cttgctctta tgaagttagc ggcgga <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 37 aataccggat aacattttga ac 22 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/probe <400> 38 accaggtctt gacatcctct gaaaac 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 39 atagggcttc tccttcggga gcagag 26 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 40 acctgcccgc aagaccggga taactcc 27 <210> <211> <212> <213> 41 26 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 41 ccggataaca ccgaagaccg catggt <210> <211> <212> <213> 42 27 DNA Artifi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 42 gagtgctaag tgttagaggg gtcacac <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 43 cctgacaacc caagagattg ggcgtt <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 44 gacagatggg agcttgctcc ct <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 45 ctccctgatg ttagcggcgg acggg <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 26 9 <400> 46 ggttgtttga accgcatggt tcaaac <210> 47 <211> 24 <212> DNA <21B> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 47 ttcaaacata aaaggtggct tcgg 24 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223>
Primer/Probe <400> 48 ttcggctacc acttacagat ggacc 25 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 49 gaggttaagc caatcccaca aatct 25 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223>
Primer/Probe <400> 50 gatccatcaa gcttgcttgg tggtga 26 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 51 atcgcatgtg attgtgggaa agattc 26 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 52 ggacgctgga tgtggggcac gttcca <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 53 ggggcacgtt ccacgtgttc cgtgt <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 54 gacatgttcc cgacgacgcc agaga <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 55 aacccggctc cgtgaaggcg gagtc <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 56 ccagttgatc gcatggtctt ctggga <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 57 ctgggaaagc tttcgcggta tgggatgg <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 58 ccaccgtggc ttcgacgggt agccggc <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 59 tacaacggga tgcgacgcgg cgacgcg <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 60 gacgcggcga cgcggagcgg atccc <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 61 ggggggcatt ccacgttctc cgcgc <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 62 tggaaacagg tcctcttctt tgaag <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 63 agagagaggc gaacccgtga gggcaa <210> 64 <211> 25 12 ·· • • • · ·· ♦ · • • t · • • * · • • «« ··· ··· • 99 99 ·· 9 9 9 9 • 9 9 9 9 • 9 9 9 · 9 9 9 • · 999 99 ·· <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 64 aagccgacag cttgctgttg gtgga 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 65 ccctgatttc gggataagcc tggga 25 <210> <211> <212> <213> 66 28 DNA Artifi cial <220> <223> Primer/Probe <400> 66 acactggacc gttctggaaa cagttctt 28 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 67 agagagaggc gaacccgtga gggtaa 26 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 68 cctgatgcag cgacgcagcg tgcggg 26 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 69 cgtgcagtgg gtacgggctg actaga 26 13 • ♦ » · • * *· • · ·♦ 9 9 ··· • 99 99 ·· 9 9 9 9 • 9 9 9 « 9 9 9 9 · 9 9 9 • • 999 99 ·· <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 70 ggcgaaggcg ggactctggg ctgtaa 26 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 71 tcatgccctt tatgtcttgg gcttca 26 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 72 tcgtagtctg caattcgact acgtg 25 <210> 73 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 73 cttttgaagt tagtggcgga cgggtga 27 <210> 74 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 74 tcataagatg ttcaagtgaa agacggt 27 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 75 acatgggtga gagtaactgt tcacc 25 14 ·« • · • · * · • · ·« ·· # ··· • ·· ·· • · • · • • * • · • • · • · • • · • · tu t · ·· <210> 76 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 76 gtcttgacat cctttgacca ttctggag 28 <210> 77 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 77 gtggagccaa tcccataaaa ttattctca 29 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 78 gtttggtaac cttcgggagc tagccgt 27 <210> 79 <211> 25' <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 79 ggaacgtacc atttgctacg gaata 25 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 80 ggaagtcttg agtatggtag aggtg 25 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223>
Primer/Probe <400> 81 gttagccgtc ggggtgttta cacttcg <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 82 gtcggggtgt ttacacttcg gtggc <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 83 gtgtttacac ttcggtggcg cagct <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 84 catcccggtc gcggttagtg gagaca <210> 85 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 85 ttagtggaga cactatcctt cagttag <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 86 aacgtaccat ttgctacgga ataact <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 87 gttagccgtc ggggtgttta cacttc <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 88 gggtgtttac acttcggtgg cgcag <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 89 atcccggtcg cggttagtgg agacact <210> 90 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 90 ttagtggaga cactatcctt cagttag <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 91 taacacaagt tgagtaggga aagt <210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 92 ttttgtgaaa tctaatggct taaccatt <210> 93 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 93 gttgttgctc tgctagtcag ggc <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 94 ttttagagat aagagggtgc tagctt <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 95 ctaatactct atactcctgc ttaaca <210> 96 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 96 cttaacacaa gttgagtagg gaaagt <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 97 tttcttaggg aagaattctg acg <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 98 ctaatggctt aaccattaaa c <210> 99 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 99 ctgggcttga tatcctaaga accttat <210> 100 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 100 ttatagagat atgagggtgc tagctt <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 101 acgtatttag ttgctaacgg ttcgg <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 102 tggtaatcta gagtggggga gaggca <210> 103 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 103 tatttagttg ctaacacttc gggtgagca <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 104 catgcttaaa atcccgactg tttgga 19 19 • · φ φ » • · • · ·· φ ·· ··· ·· ·# • · · · • · · · • · · · • · · · • ·· ·· <210> 105 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 105 gatcggttgt tgttctttta ttgacgc 27 <210> 106 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 106 tcttttattg acgcaatcgg cacctt 26 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 107 ttgggcttgg ctggccggtc catcttt 27 <210> 108 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 108 catctttttg atgcgtactg gacccag 27 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 109 ggtagccatt tatggcgaac caggact 27 <210> 110 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 110 aaatcaatgt cttcggactt tttgat 26 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 111 cgattttttc gtgtactgga atgcacc <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 112 ccaagtcctt gtggcttggc ggcga <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 113 cgggtggtgt ttttttagtg accca <210> 114 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 114 ggtgctagca tttgctggtt gtccac <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 115 catctttttt gatgcgtact ggaccca <210> 116 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 116 gagcctttcc ttctggctag cctttttgg <210> 117 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 117 tttccttctg gctagccttt ttggcgaac <210> 118 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 118 agccggtccg ccttttggtg agtact <210> 119 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 119 aacctttctt tcggggaagg cgaacc <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 120 ccgccttttg gtgagtactg gatcta <210> 121 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 121 gattagggat cggttgttgt tctttaat <210> 122 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 122 tgttgttctt taattgacgc cattgggc <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 123 ctttttggcg agtactgacc ctgcc <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 124 aaactcacca ggtcagggaa actca <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 125 actagctttt gctggtgctg acgct <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 126 acgaagttga aaagcttgct tttcga <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 127 tgaccgcatg gtcgcttgat gaaagg <210> 128 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 128 atggtcgctt gatgaaaggt ggcttcgg <210> 129 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 129 atggtacaac gagtcgcgaa gtcgtgag <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 130 acgagtcgcg aagtcgtgag gccaagc <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 131 aggaagcagc ttgctgcttt gct <210> 132 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 132 cttgctgctt tgctgacgag tggcgg <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 133 cataatgtcg caagaccaaa gaggg <210> 134 <211> 30 24 • · · • · · • » · <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 134 aggaaggggt taaggttaat aaccttagcc 30 <210> 135 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 135 accttagcca ttgacgttac ccgcag 26 <210> <211> <212> <213> 136 26 DNA Artifici al <220> <223> Primer/Probe <400> 136 ttagccattg acgttacccg cagaag 26 <210> 137 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 137 tcgaaactgg caggcttgag tctcgta 27 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 138 aagtcgaacg gtagcacaga ggagct 26 <210> 139 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 139 gaacggtagc acagaggagc ttgctccttg 30 25 <210> 140 <211> 28 <212> DNA <215> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 140 agaggagctt gctccttggg tgacgagt <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 141 atgtctggga aactgcccga tg <210> 142 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 142 atgcaagtcg agcgatgaag cttcct <210> 143 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 143 ttcgggaagt ggattagcgg cggacg <210> 144 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 144 cgggaagtgg attagcggcg gacgggtg <210> 145 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 145 ggatatctag agtgcaggag aggaaa <210> 146 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 146 caattaaagg agtaatccgc tatgagatg <210> 147 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 147 tgtaggggtt gtcatgacct ctgtgc <210> 148 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 148 catctcctga attactctgt aatgga <210> 149 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 149 cgagagtgag caaaactata aaacc <210> 150 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 150 tacccaaagt tcgtgagcta accgcaa <210> 151 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 151 aagttgagcg atttacttcg gtaaa <210> 152 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 152 ctaccctgta cacacggata acata <210> 153 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 153 atcaaaggtg agccagtaca ggatg <210> 154 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 154 caatgacatc tccttaatcg gagagtt <210> 155 <211> 26 <212> DNA <213> Arti f i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 155 cttgacatct cctgaattac tcgtaa <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 156 gttagttgct actattaagt taagca <210> 157 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 157 tcgagcgatg aagtttcctt cggg <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 158 gaaagatggc atcatcattc aacc <210> 159 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 159 gctctgtctt tggggaagat aatga <210> 160 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 160 aggcggatga ttaagtggga tgtga <210> 161 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 161 cggatgatta agtgggatgt gaaatacc <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 162 aggtgtgggg gtttcaacac ctccg <210> 163 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 163 acatcccttg cattactctt aatcg <210> 164 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 164 atgcccctta tgtgtagggc tacacac <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 165 aaagttaagg tttcgcatga aactt <210> 166 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 166 ggtgaaatgc gtagaggatt aggaag <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 167 tgtaactgac gcagaggcac gaaagcgt <210> 168 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 168 atgagactgc ctgggtgaac caggagg <210> 169 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 169 aataccggat aggaccgtgc tttagt <210> 170 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 170 cggcagggac gaagcttttg tgac <210> 171 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 171 ctgggcttga catgggcagg accggc <210> 172 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 172 aggaccggcg tggagacacg tcttc <210> 173 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 173 ggttgcgatg ccgcgaggct cagcta <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 174 ccctgcactt tgggataagc ttgg 31 ·· ·· « <210> 175 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 175 tttgcggtgt gggatgagcc tgcggcct 28 <210> 176 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 176 actcctttcg ctatcgacga agccact 27 • · * · <210> 177 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 177 tgtagggggc ttccacgtct tctgtg 26 <210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 178 gcttgacatg taccggattg ggcta 25 <210> 179 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 179 aacggaaagg cctagcttgc taggta 26 <210> 180 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 180 ctctttcgct agggacgaag cttttgt 27 32 <210> 181 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 181 tcggcgtagt gatacgtttt cccttgt <210> 182 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 182 tcgaacggca gcgcggggag cttgct <210> 183 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 183 ggtggggaag aaattctcaa gggtaa <210> 184 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 184 gtaatatcct tgggcgttga cgttac <210> 185 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 185 cgtaggtgga tatttaagtc ggatgt <210> 186 <211> 25 <212> DNA <213> Arti f i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 186 ctgttgggaa gttcacttct tagta <210> 187 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 187 tcggaacttg tcagagatga tttggt <210> 188 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 188 tgcctgtttg agtgtcatga aa <210> 189 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 189 catgcctgtt tgagtgtcat gaaaa <210> 190 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 190 catgcctgtt tgagtgtcat gaaa <210> 191 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 191 gcttttcgga gctctttgat gatte <210> 192 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 192 gttggccggt ccgccttttt ggcgag <210> 193 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 193 ccgccttttt ggcgagtact ggaccc <210> 194 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 194 accgagcctt tccttctggc taacctttcg <210> 195 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 195 tccttctggc taacctttcg ccct <210> 196 <211> 29 <212> DNA <213> Arti fici al <220> <223> Primer/Probe <400> 196 agtactttca gcgaggagga aggcgttaa <210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 197 agcgaggagg aaggcgttaa gg <210> 198 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 198 aaggcgttaa ggttaataac cttggc <210> 199 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 199 aataaccttg gcgattgacg ttactcg <210> 200 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 200 cttggcgatt gacgttactc gcaga <210> 201 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 201 cctgggaact gcattggaaa ctggca <210> 202 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 202 ccctaaacga tgtcgacttg gaggtt <210> 203 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/probe <400> 203 ggccttgaca tccacggaat ttggca <210> 204 <211> 22 36 ·· ·· • · ♦ • # · • I · <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 204 acggtgaata cgggcccggg cc 22 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 205 aatacgggcc cgggccttgt aca 23 <210> <211> <212> <213> 206 26
DNA
Arti f i ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 206 26 tgacatccac ggaatttggc agagat <210> 207 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 207 ccttcgggag ggcgcttacc tctttg 26 <210> 208 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 208 29 cgaacggtag cacagagagc ttgctctcg <210> 209 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 209 agagagcttg ctctcgggtg acgagtgg 28 37 37
<210> 210 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 210 ctctcgggtg acgagtggcg gacgg <210> 211 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 211 actgcattcg aaactggcag gctggag <210> 212 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 212 taacagggag cagcttgctg ctctg <210> 213 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 213 ggtgttgtgg ttaataaccg cagcaat <210> 214 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 214 cacgcaggcg gttgattaag tcagat <210> 215 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 215 catttgaaac tggtcagctt gagtctc
38 ·· 38 ·· # <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 216 ggtcagcttg agtctcgtag agg <210> 217 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 217 ctggtcttga catccagaga atcctgca <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 218 caccggagct tgctccaccg <210> 219 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 219 cgcttttgcg tcactgatgg at <210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 220 gcgtcactga tggatggacc cgc <210> 221 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 221 ccaccgaaag aaaaggagtg gcgaac <210> 222 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 222 gaaagaaaag gagtggcgaa cgggtga <210> 223 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 223 atggtttcgg tttgaaaggc gcttttg <210> 224 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 224 caaggatgag agtagaatgt tcatcc <210> 225 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 225 aagtcgtacg cttctttttc caccg <210> 226 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 226 aatcgaaacc gcatggtttt gattt <210> 227 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 227 aactgttcat cccttgacgg tatcta <210> 228 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 228 aaagcttctc tcagttcgga ttgta <210> 229 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 229 gttgttagag aagaacaagg acgtta <210> 230 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 230 gagaagaaca aggacgttag taact <210> 231 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 231 cctgacggta tctaaccaga aagccacg <210> 232 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 232 cttctttttc caccggagct tgctcc <210> 233 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 233 ttgaaaggcg ctttcgggtg tcgctg <210> 234 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 234 ttcgggtgtc gctgatggat ggaccc <210> 235 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 235 aactgttcat cccttgacgg tatcta <210> 236 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 236 aatgggaagt acaacgagtt gcgaagt <210> 237 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 237 agagaatgtt catcccttga cggtatcta <210> 238 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 238 aatgttcatc ccttgacggt atctaacca <210> 239 <211> 26 42 • « · · ···· * « · ♦ · ♦ ^ · ·· · · ···· <212> DNA <21Β> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 239 ccttcagtgc tgcagcaaac gcatta 26 <210> 240 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 240 atgggaagta caacgagttg cgaagt 26
<210> 241 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 241 26 ttgcgaagtc gcgaggctaa gctaat <210> 242 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 242 tggcaagctt gagtctcgta gagggg 26 <210> 243 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 243 32 aaagtacttt cagcggggag gaagggagta aa <210> 244 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 244 aggaagggag taaagttaat acctttg 27 43
V» · * · Μ «I • · #· ·· ····#· • « · · ····* • · · 9 t · ' · • · · · ····· <210> 245 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 245 cctttgctca ttgacgttac ccgcagaa 28 <210> 246 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 246 gggaactgca tctgatactg gcaagcttga g <210> 247 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 247 tggcaagctt gagtctcgta gagggg <210> 248 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 248 aactagaata tgtagtgtag cggtga 31 26 26 <210> 249 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 249 aaatcatcac ggcccttacg ccttg 25 <210> 250 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 250 gtcgcagatg gatgagcctg cgttgg 26 44 <210> 251 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 251 ctcaaggtta atagccttgg gggag <210> 252 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 252 acggtagagg aatggggaat ttctggt <210> 253 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 253 agctgttgga gtcggtgtaa aggctc <210> 254 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 254 tgagactgcc gctgacaagg cggagg <210> 255 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 255 gcgaaggcgg caacctggct cgatac <210> 256 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 45 <400> 256 taacttagtt actcagtgtc gaagct <210> 257 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 257 gacttgcatg gggaggacgt actcaga <210> 258 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 258 actcagagat gggtatttct tcggacc <210> 259 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 259 ggcgacatgg tgctgatctc taaaagc <210> 260 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 260 gggaggaccg gttcagagat ggacct <210> 261 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 261 ggtgacatgg tgctgatctc taaaagc <210> 262 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223>
Primer/Probe <400> 262 ggggtaatgg ctcacctagg cgacgatctc t <210> 263 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 263 cggttgatta agtcagatgt gaaatc <210> 264 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 264 tttgaaactg gtcagctaga gtcttg <210> 265 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 265 atgtgcctct tagtttggga tagcc <210> 266 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 266 ttatcgctaa gagatcagcc tatgtc <210> 267 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 267 gtaggcggga tagtcagtca ggtgtga <210> 268 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 268 agggcttagt ctctccagta atgcagc <210> 269 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 269 gcttgacatt gagagaatcc gctaga <210> 270 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 270 ctaaattggc tactgcccac ggcacac <210> 271 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 271 gcaagtcgag cggtagcaca gagagctt <210> 272 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 272 gagcttgctc tcgggtgacg agcgg <210> 273 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 273 tgggggacct tcgggcctca tgccatc <210> 274 <211> 25 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 274 ctcatgccat cagatgtgcc cagat <210> 275 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 275 tgctctcggg tgacgagtgg cggacggg <210> 276 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 276 attcgaaact ggcaggctgg agtcttgt <210> 277 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 277 caggctggag tcttgtagag gggggta <210> 278 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 278 cgaaggcggc tctctggtct gcaact <210> 279 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 279 ggtttccgcc tctcagtgct gc 29 49 <210> 280 <211> 29 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 280 cctaccaagg caatgatgca tagccgagt <210> 281 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 281 ctggccttta tttgacggta atcaacc 27 <210> 282 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 282 gcatcatgat ttagatctaa gtgagt 26 <210> 283 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 283 aagatggttt tgctatctct tctgg 25 <210> 284 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 284 gaagtgcttc gaaaactggt gaact 25 <210> 285 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 285 gacataccat gaaaagctaa gagat 25 50 ·· # » · ·· ·# • · · · · · · · · • f · · · I · » · ·· · · ····· <210> 286 <211> 25 <212> DNA <21B> Artificial <220> <22B> Primer/Probe <400> 286 cggtggggta acccttcggg gaact 25
<210> 287 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 287 cagaaggtgc ttgcactgga agttg 25 <210> 288 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 288 taccgcataa aagttgagat cacat
25
<210> 289 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 289 gaacagggac tagagtaact gttagt
26 <210> 290 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 290 gtaacctctt tgaggagcta gccgtc 26 <210> 291 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 291 aacgagcttc cgttgaatga cgtg <210> 292 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 292 cgtgggaaat ctgcccagaa gcag <210> 293 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 293 cctttgagag taactgttca agggtt <210> 294 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 294 cggtgagata accttcggga gtcag <210> 295 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 295 gcatggttct tggctgaaag atggc <210> 296 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 296 gttgttggag aagaatggtc ggcag <210> 297 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 297 atggtcggca gagtaactgt tgtcgg <210> 298 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 298 aactgttgtc ggcgtgacgg tatcca <210> 299 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 299 aggtcttgac atcttttgat cacctg <210> 300 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 300 gtaacccttt tagggagcga geegt <210> 301 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 301 aeegaagetg cttgcagtgg acgttg <210> 302 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 302 accgcataac cattcagacc acatg <210> 303 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 303 actgttagtc ctttgacggt atccaa <210> 304 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 304 actctcgtta gattgaagaa gc <210> 305 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 305 gattgataac atttgagtga gtggc <210> 306 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 306 tttgatagta actgatcagg tagtgacg <210> 307 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 307 aagtcgagcg agctgaattc aaagat <210> 308 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 308 ataccggata acaacatgaa tcgcat <210> 309 <211> 25 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 309 catgattcaa gtttgaaagg cggcg <210> 310 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 310 gttgttggtg aagaaggata gaggcagt <210> 311 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 311 taaagcgagc gcaggcggaa tgataag <210> 312 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 312 gagggtaagc ggatctctta aagctg <210> 313 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 313 aaccatcctg aagattgaag cttgct <210> 314 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 314 ctactttcac atgatcgtag cttgaa 55 55 ·* • • • #· • » • • • • · • • • • • • • • • * · • • • • • • <210> 315 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 315 ttgttcgcat gaacaacgct taaa 24 <210> 316 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 316 26 tggcttctcg ctatcacttc tggatg <210> 317 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 317 gacggtattt aaccagaaag tcacgg 26 <210> 318 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 318 26 aataccggat aagaaagcag atcgca <210> 319 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 319 aagcgagcgc aggcggaaga ataag 25 <210> 320 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 320 aactgcatcg gaaactgttt ttcttg 26 56 <210> 321 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 321 aagcgaatct ctgaaagctg ttctc <210> 322 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 322 gcaagtcgaa cgcgtttccg ttattg <210> 323 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 323 aatgatttaa cacgaaacga gtggcga <210> 324 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 324 ggtaacctgc ccttgaagta ggggat <210> 325 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 325 cacatggttt tggtttaaaa gatggct <210> 326 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 326 acaggtgtca gagtaactgt tgacatctt <210> 327 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 327 catcatgatt tacatttgag tgagtg <210> 328 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 328 cataacaact tggaccgcat ggtcc <210> 329 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 329 atctgagagt aactgttcag gtattg <210> 330 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 330 tcaggtattg acggtattta accaga <210> 331 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 331 atgcaagtcg tacgcactgg cccaac <210> 332 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 332 taccgcataa caacaaaagc cgcatg <210> 333 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 333 atggctttgg ctatcactct gggatg <210> 334 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 334 agcgagcgca ggcggttgct taggte <210> 335 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 335 tcttgacatc ttgegetaae ettaga <210> 336 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 336 aaegagttet gattattgaa ag <210> 337 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 337 attgaaaggt gettgeatet tgattt <210> 338 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 338 agaatggtcg gcagagtaac tgttgtc <210> 339 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 339 caagtcttga catcttttga tcacctg <210> 340 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 340 gagcttgctc ctcattgata aacat <210> 341 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 341 gataaacatt tgagtgagtg gcggacgg <210> 342 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 342 gcatggtgta gggttgaaag atggtt <210> 343 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 343 gttgttggag aagaatgtat ctgata <210> 344 <211> 25 60 ·· · ♦ · ·· ·· ·· · · ····· • « I « · · ♦ · « • · · · ····· <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 344 actgatcagg tagtgacggt atcca 25 <210> 345 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 345 agttgagcga tgaagattgg tgcttgc 27 <210> <211> <212> <213> 346 28 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 346 aataccgcat aacaacttta aacataag 28 <210> 347 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 347 aaacataagt tttaagtttg aaagatgc 28 <210> 348 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 348 tgaaggttgg tacttgtacc gactgga 27 <210> 349 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 349 gtacttgtac cgactggatg agcagcga 28 61 ·· · · · ·· ·· • · ·· ·· ······ # · · · #···· ·· I · · · ♦ · · • ♦ · · I « · · · <210> 350 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 350 cgactggatg agcagcgaac gggtgag 27 <210> 351 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 351 aaaactctgt tggtagagaa gaacgtt 27 <210> 352 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 352 aacgttggtg agagtggaaa gctc 24 <210> 353 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 353 26 26 actacccaga aagggacggc taacta <210> 354 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 354 gcgagcgcag gtggtttatt aagtct <210> 355 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 355 ttgtatgcat tggaaactgg tagac 25 62 t· · · · #· ·· I · · · · I · I · I « · · *·*·<* • # I · · · · · · <210> 356 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 356 ttgggagtac ccgaagtagg ttgccta 27 <210> 357 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 357 tgttggaaag atttatcggt tttgga 26 <210> 358 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 358 tgtcgtgaaa gtccggggct taacc 25 <210> 359 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 359 gcttaacccc ggatctgcgg tgggt 25 <210> 360 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 360 accattccac ggtttccgcg ccgcag 26 <210> 361 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 63 <400> 361 gcttgacatg ttctcgatcg ccgta <210> 362 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 362 gagatacggt ttcccctttg gggcg <210> 363 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 363 cagcatgtga tggtggggac tctaag <210> 364 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 364 tacagagggc ggcgaagggg cgacct <210> 365 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 365 gagtgttgta gaggtaagtg gaactc <210> 366 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 366 tgttgtagag gtaagtggaa ctcca <210> 367 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 367 acgagttgcc aacctgcgaa ggtgag <210> 368 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 368 ctcttaaagt acgtctcagt tcggact <210> 369 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 369 ataaaactta gtatcgcatg atacaaa <210> 370 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 370 gtgtgtgatg aaggctttag ggtcgt <210> 371 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 371 gaagaaatgc tagaataggg aatgat <210> 372 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 372 ttctagagat agaagtgttc tcttcgg <210> 373 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 373 gtgcttgcac ctttcaagtg agtgg <210> 374 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 374 gacaacctgc ctcaaggctg gggataa <210> 375 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 375 taaaacttag tgtcgcatga cacaaa <210> 376 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 376 taaagcactg ttgtatggga agaacagct <210> 377 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 377 tttgacggta ccataccaga aagggacg <210> 378 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 378 gagatagaag tgttctcttc ggagac <210> 379 <211> 26
·· • · · • · · • t · • · · 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 379 cgaacgaacg gaggaagagc ttgctc 26 <210> 380 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 380 gcctgtaagt tggggataac tccgg 25 <210> 381 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 381 26 aagtactgtt gttagagaag aacaag <210> 382 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 382 ctaataccga atgataagta gtgacg 26 <210> 383 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 383 27 ataagtagtg acgcatgtca tcacttt <210> 384 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 384 gaacgaacgg aggaagagct tgctc 25 <210> 385 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 385 acggaggaag agcttgctct tccaaa <210> 386 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 386 gcctgtaagt tggggataac tccgg <210> 387 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 387 gcttttgaaa gatggtttcg gctatcgc <210> 388 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 388 atggtttcgg ctatcgctta caga <210> 389 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 389 tttcggctat cgcttacaga tgggcc <210> 390 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 390 gatcgtaaag tactgttgtt agagaa <210> 391 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 391 ctgcttgtcc cttgacggta tctaa <210> 392 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 392 attggaaact ggaagactgg agtgca <210> 393 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 393 cactctggag acagagcttt ccctt <210> 394 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 394 ctaaagtgac tgccggtgca agcc <210> 395 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 395 ctaataccga atgataagga gtgacgc <210> 396 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 396 gataaggagt gacgcatgtc actgc <210> 397 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 397 atggaatact gccggggtca actcgg <210> 398 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 398 tcaactcgga ggaaggtgag gatgac <210> 399 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 399 aatgggctgc aataccgcaa ggtgga <210> 400 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 400 gtgaagcaga gcttgctctg tggatc <210> 401 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 401 gaaggcatct tcagcagctg gaaag <210> 402 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 402 tcttcagcag ctggaaagaa tttcgg <210> 403 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 403 agaatttcgg tcagggatga gctcg <210> 404 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 404 gcccttgact ctgggataag ccttgg <210> 405 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 405 cgcatggtgg gtgttggaaa gaattt <210> 406 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 406 tgccgtgaaa gtccggggct taact <210> 407 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 407 gcttaactcc ggatctgcgg tggg <210> 408 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <22B> Primer/Probe <400> 408 aaagccaagt ttcacatgga at <210> 409 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 409 cttgacatcc cctgaataac ctaga <210> 410 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 410 agccaaactc aaaaactgct ctca <210> 411 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 411 gtagtctaac gtaagaggac gcgg <210> 412 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 412 aaggcttgac atacaccgga ccggtcc <210> 413 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 413 gatcttcccc cttgtggggc tggtgtaca <210> 414 <211> 27 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 414 tcggatcgtg gtctgcaact cgaccac <210> 415 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 415 cgaccacgtg aagtcggagt cgctag <210> 416 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 416 ctcttcggag gtactcgagt ggcgaac <210> 417 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 417 ggcaatctgc cctgcacttc gggataa <210> 418 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 418 gtcttctggt ggaaagcttt tgcggtg <210> 419 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 419 taaggttaag cgaatccttt ta 73 <210> 420 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 420 aacggaaagg tctcttcgga gata 24 <210> 421 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 421 ctaataccgg ataggaccac gggatg 26 ♦ <210> 422 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 422 ggtggaaagc gctttagcgg tg 22 <210> 423 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 423 26 25 • » · # V «f • · · *· ··· · ·· • · · • · • · t t · • · · • « ··· *1 ·· gcgctttagc ggtgtgggat gagccc <210> 424 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 424 ggttaagcga atccttaaaa gccgg <210> 425 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 425 cgagcgaggt tttttaaacc tage 24
74 ·» « · » ·· »9 * I « « · * · · t · * · · · I • · · 9 9 9 9 · · <210> 426 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 426 agcgaggttt tttaaaccta gcgg 24
<210> 427 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 427 tgattttgtt gtgaaaggag cctt 24 <210> 428 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 428 atagggaaag aaaacttggt tgag 24
<210> 429 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 429 agaaaacttg gttgaggaaa tgct 24 <210> 430 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 430 gatactggta aactagagtt ggata 1 <210> 431 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 25 <400> 4B1 atatagtcga ggttaacgga gtga <210> 432 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 432 gatactgcct gggtaactgg gagga <210> 433 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 433 aagtgattta tcacttagcg gc <210> 434 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 434 cttcagtttg gcatagcggt tg <210> 435 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 435 actcgtagat gccgcatggc atttacgg <210> 436 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 436 agacgcctta aagcgtcgct ggag <210> 437 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 437 ccactatatt gaatgtacct tattagaaa <210> 438 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 438 ccggtacaaa gtgaagcaac ctggtga <210> 439 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 439 agtcggttta ttaacaaact gc <210> 440 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 440 gcatgtcgag cgatgatagc aat <210> 441 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 441 agcaatatca tagcggcgaa tg <210> 442 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 442 tagattggga tagcggatgg <210> 443 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 443 agcggatgga aacatccgat aat <210> 444 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 444 aaaaggaagc gtttgcttcg ct <210> 445 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 445 tagcggggtt gagagattga tccg <210> 446 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 446 ggggttgaga gattgatccg <210> 447 <211> 22 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 447 gggttgtaaa ctgctgtggt ta <210> 448 <211> 20 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 448 ctgctgtggt tagggaagaa <210> 449 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 449 acctgattag aaagcaacgg <210> 450 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 450 gtctggcgtt aaattttggg <210> 451 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 451 aaccccaaaa cgcgttggat <210> 452 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 452 acatcaatat ggcgaaggca <210> 453 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 453 cattagttga tggggaactc atcga <210> 454 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 454 ggggaactca tcgacgcagc 79 ♦ φ # * t ·# ♦· • · · · • · · · • · · 4 • ·· * <210> 455 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 455 gacgccttta aagcgtcgct ggaggagcg 29 <210> 456 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 456 aggcctatgg gttgtaaact gctgtggtaa 30
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<220> <223> Primer/Probe <400> 547 acgttatccg cagaagaagc accggc <210> 548 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 548 ggaagcagct tgctgctttg ctgac <210> 549 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 549 ggtcttgaca tccacagaac cttgt <210> 550 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <2 2 3> Pri me r/P robe <400> 550 tacgagggtg ccttcgggaa ctgtgag <210> 551 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 551 aggaagcagc ttgctgtttc gctgac <210> 552 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 552 ctgtttcgct gacgagtggc ggacg <210> 553 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 553 cctggacgaa gactcacgct caggtgc <210> 554 <211> 28 96 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 554 acttggaggt tgtgcccttg aggtgtgg <210> 555 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 555 accatgggag tgggttgtaa aagaagt <210> 556 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 556 tgcaagtcga acggtaacag gaaaca <210> 557 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 557 aggaaacagc ttgctgtttc gctgac <210> 558 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 558 tggtgcgagg ttgaaagatg gtttcg <210> 559 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 559 ggaaatgctg gtgctgtgac ggtat 97 <210> 560 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 560 cggtgtggga acctttatgg acccag <210> 561 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 561 gaaccgcatg gttcaaaagt ga <210> 562 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 562 tatagatgga tccgcgctgc at <210> 563 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 563 cgctgcatta gctagttggt aa <210> 564 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 564 ggggctaatg ccggataata tgcagaa <210> 565 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 565 catggttctg caatgaaaga cggtt 98 • · • · • · * · · · • · · « • · · # <210> 566 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 566 26 aacaagtgcg taggtaacta tgcgca <210> 567 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 567 aaagacggtt ttgctgtcac tt 22 <210> 568 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 568 27 29 gttttgctgt cacttataga tggatcc <210> 569 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Primer/Probe <400> 569 ctgtcactta tagatggatc cgcgccgca <210> 570 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 570 atccgcgccg cattagctag ttggtaa 27 <210> 571 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 571 aaatgtgtaa gtaactatgc acgtc <210> 572 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 572 atgcacgtct tgacggtacc taatca <210> 573 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 573 cgaacagatg aggagcttgc tcctttg <210> 574 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 574 cttgacatct tttgatcgct ct <210> 575 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 575 gttttcctct tcggaggaca aaatg <210> 576 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 576 agtaaccatt ttggagctag cc <210> 577 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 577 cggggctaat gccggataac at <210> 578 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 578 atgccggata acatgttgaa ccgca <210> 579 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 579 tgttgaaccg catggttcta ca <210> 580 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 580 cgccgtatta gctagttggt gggg <210> 581 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 581 cccttgaact tagttgccat cattca <210> 582 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 582 agtaaccatt ttggagctag cc <210> 583 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <22B> Primer/Probe <400> 583 acagatgaga agcttgcttc tctgat <210> 584 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 584 tcaatagtga aagacggttt egget <210> 585 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 585 gaagaacaaa tttgttagta actgaa <210> 586 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 586 aatttgttag taactgaaca agtett <210> 587 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 587 ctgaacaagt ettgaeggta cctaa <210> 588 <2U> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 588 atggtttcat gatgaaagac ggttt <210> 589 <211> 26 102 ·* ♦« • t · · • · · · • · · 9 • · · · <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 589 tattagggaa gaacaaggat gtaagt 26 <210> 590 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 590 tgtaagtaac tatgcatccc ttgac 25 <210> <211> <212> <213> 591 22
DNA
Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 591 22 aggagcttgc tcctttgaag tt <210> 592 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 592 tttgaagtta gcggcggacg gg 22 <210> 593 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 593 taccggataa catttagaac cg 22 <210> 594 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 594 cgcatggttc taaagtgaaa ga 22 <210> 595 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 595 ctaaagtgaa agatggtttt gctatca <210> 596 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 596 tattagggaa gaacaaatgt gtaagtaact gt <210> 597 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 597 cgtaggcggt ttcttaagtc tga <210> 598 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 598 aaactctaga gatagagcct tc <210> 599 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 599 taagttgggc actctaggtt ga <210> 600 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 600 gcgaggtcat gcaaatccca ta 104
·· ·· • I ♦ · » ♦ · ο • · · · • · · · <210> 601 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 601 aaccatttat ggagctagcc gt 22 <210> 602 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 602 agagaagaac gttggtagga gt 22 <210> 603 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 603 gtggaaaatc taccaagtga cg 22 <210> 604 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 604 attgtacgct ttggaaactg gaggact 27 <210> 605 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 605 acatccttct gaccggccta ga 22 <210> 606 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223>
Primer/Probe <400> 606 ataggctttc tcttcggagc agaa <210> 607 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 607 cgtaggtaac ctgcctacta gcgggg <210> 608 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 608 ctactagcgg gggataacta ttggaa <210> 609 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 609 agagaagaac gtgtgtgaga gtggaaa <210> 610 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 610 ttgttcgctt tggaaactgt tagac <210> 611 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 611 agtcggtgac ggcaagcaaa tctct <210> 612 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 612 ggcaagcaaa tctcttaaag ccaat <210> 613 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 613 aacgctgagg actggtgctt gcaccg <210> 614 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 614 tgcatcacta tgagatggac ct <210> 615 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 615 agagaagaat gatggtggga gt <210> 616 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 616 tggtgggagt ggaaaatcca ccatgt <210> 617 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 617 ccggggctta gtgccggagc ta <210> 618 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <22B> Primer/Probe <400> 618 ccggtctaga gataggcttt cc <210> 619 <211> 25 <212> DNA <21B> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 619 aacagctcca ctatgagatg gacct <210> 620 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 620 aagaacagtg atgggagtgg aaagtc <210> 621 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 621 agtggaaagt ccatcatgtg acggt <210> 622 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 622 agtccatcat gtgacggtaa ctaaccag <210> 623 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 623 aaccattgta tgctttggaa actgt <210> 624 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 624 ttcttagaga taagaagtta ct <210> 625 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 625 tgcaagtaga acgctgaagg aggagc <210> 626 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 626 cactaccaga tggacctgcg ttgta <210> 627 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 627 cacactgtga cggtatctta ccagaa <210> 628 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 628 tttaacttga gtgcaagagg ggaga <210> 629 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 629 agaggggaga gtggaattcc atgtgta 109 • • • ·· • t • · • • • • · • · • · • • • • · • « • · • • • • · • · <210> 630 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 630 gctctctggc ttgtaactga cgctga 26
<210> 631 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 631 ccggggttta gtgccgcagc taacgc 26 <210> 632 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 632 acatccctct gaccgctcta gagata 26 <210> 633 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 633 gagttttcct tcgggacaga ggtgac 26 <210> 634 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 634 gatagctaat accgcataag agtaga 26 <210> 635 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 635 gtagatgttg catgacattt gcttaa 26 110 • t φ • · · • » · • · · ♦ <210> 636 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 636 gcacttgcat cactaccaga tggacct 27 <210> 637 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 637 26 acttgcatca ctaccagatg gacctg <210> 638 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 638 aagagaagaa cgagtgtgag agtggaa 27 <210> 639 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Primer/Probe <400> 639 27 gagaagaacg agtgtgagag tggaaag <210> 640 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 640 gcaagagggg agagtggaat tccatgt 27 <210> 641 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 641 accgcataag agagactaac gcatg <210> 642 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 642 gttagagaag aatgatggtg ggagtg <210> 643 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 643 atccaccaag tgacggtaac taaccagaa <210> 644 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 644 tcggtacatc ggtgacaggt ggtgc <210> 645 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 645 attgctccac tacaagatgg acctg <210> 646 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 646 aggctgtggc tcaaccatag ttcgc <210> 647 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 647 gatcctttcc gggattcagt gccgc <210> 648 <211> 25 <212> DNA <21B> Artificial <220> <22B> Primer/Probe <400> 648 ggttggtaca acgagttgcg agtcg <210> 649 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 649 aacgagttgc gagtcggtga cggcaag <210> 650 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 650 ttgacggtat cttaccagaa agggacg <210> 651 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 651 agcgagcgca ggcggtttga taagtct <210> 652 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 652 tgaagtaaaa ggctgtggct taacc <210> 653 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 653 gtggcttaac catagtacgc tttgga <210> 654 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 654 aggtgttggg tcctttccgg gactca <210> 655 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 655 gggtttctct tcggagcatc ggtgac <210> 656 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 656 tttgaaaggg gcaattgctc cacta <210> 657 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 657 agtcaagaac gggtgtgaga gtggaa <210> 658 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 658 ttcacactgt gacggtagct aacca <210> 659 <211> 24 tt 114 ¥ * <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 659 cggtagctaa ccagaaaggg acgg 24 <210> 660 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 660 aacgagttgc gagtcggtga cggcga 26
<210> 661 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 661 gagtcggtga cggcgagcta atctc 25 <210> 662 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 662 cctatttaaa aggggcaaat gcttc 25 <210> 663 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 663 agagaagaac ggtaatggga gtgg 24 <210> 664 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 664 tccattacgt gacggtaact aa 22 115 <210> 665 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 665 gctgtggctt aaccatagtt cgctt <210> 666 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 666 gatgcccgct ctagagatag agctt <210> 667 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 667 cgcgaggcgg agcgaatctc aaaa <210> 668 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 668 tttcgtgtac tggtttccaa ccggg <210> 669 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 669 gggtggtgtt tttttactga cccact <210> 670 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 670 tgcaagtcga gcggaaacga gtta 116 <210> 671 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 671 aacgataacg gcgtcgagcg gcggac <210> 672 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 672 aaacgatggc taataccgca tgat <210> 673 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 673 gtaatgcctg ggaaattgcc cggtagag <210> 674 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 674 gggccttgcg ctaccggata tgccca <210> 675 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 675 ctttcagtag ggaggaaggt ggttaag <210> 676 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 117 117 <400> 676 taccttaatc atttgacgtt acctac <210> 677 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 677 catccagaga atctagcgga gacgct <210> 678 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 678 ggaattgcat ttgaaactgg cagact <210> 679 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 679 caatggcgca tacagagggc agccaa <210> 680 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 680 aaacttgttt ctcgggtggc gagegg <210> 681 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 681 getgtaaaeg atgtetaett ggaggtt <210> 682 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 682 gtttactact ttgccggcga gcggcg <210> 683 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 683 cataacgtct tcggaccaaa gtgg <210> 684 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 684 tcgggcctca cgccatcgga tgtgccca <210> 685 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 685 agcactttca gcgaggagga aggc <210> 686 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 686 caaagtgaag cgaactcgcg agagcaag <210> 687 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 687 agcaagcgga ccacataaag tctgtc <210> 688 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 688 tctggaactg cctttgagac tgttaga <210> 689 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 689 gacttactgg tctatagttg acgc <210> 690 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 690 gaaagtggag acacattctt tcagttc <210> 691 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 691 aagcaucuuc ggaugcuuag uggcga <210> 692 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 692 aggaugugug caugaaaaaa acaca <210> 693 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 693 uuauaaaagu uuguggugua agugcag <210> 694 <211> 26 120
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26 26 26 25 25 26
121 <210> 700 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 700 uauguuggaa acuauauguc uagagu <210> 701 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 701 auagaggaag uuagaauuuc uggugu <210> 702 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 702 auaccggagg cgaaggcgaa cuucugg <210> 703 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 703 gagauaauua uuccccguuu gggguc <210> 704 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 704 auguaauggu ggggacucag auaaga <210> 705 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 705 auaaagcagg ucucaguccg gauugaa <210> 706 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 706 ccguaaggga ggaagguauu uaaggu <210> 707 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 707 aaagcuuugc uuguagauga gucug <210> 708 <211> 24 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 708 cguuaauuua ugaauaaguc ccgg <210> 709 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 709 cgaagcuauu auuuuaaccc gcaag <210> 710 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 710 auaacgguug gaaacgaucg cuaaua <210> 711 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 711 aaggcgauga cgucuaggcg gauuga <210> 712 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 712 aggaaaguua gauguuaaau uuugg <210> 713 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 713 cgcuuuucua auuuauaccu gacgc <210> 714 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 714 accccauccg ugucggagcu aacguguu <210> 715 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 715 cuguagaaau acagcuuucc gcaagg <210> 716 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 716 aacggccgcu aauaccgaau guggcgauau <210> 717 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> 124 <223> Primer/Probe <400> 717 uugagagauu ggccgccaac acuggg <210> 718 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 718 gucucaaccc cauccguguc ggagcu <210> 719 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 719 aaggaccuua ccuggguuug acauguaua <210> 720 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 720 uaguugccag cacuuagggu gggaac
Q <210> 721 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 721 ccuaccaagg uuuugacguc uaggc <210> 722 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 722 aacaugggau cuuaaguuuu agucg <210> 723 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial ·· * » · ·· • · ·· ·· ·ι · I ι · • I · 5 ·«·«· • 9 · I # · · « * • ♦ · · · · « t « ·· ·♦· 999 ··« Μ ·« 125 <220> <223> primer/probe <400> 723 agagaaaguc ugugggauau cagcuu 26 <210> 724 <211> <212> <213> 26 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 724 uucuagaggu uggauggaga aaaggg 26 <210> 725 Ä <211> m <212> <213> 25 DNA Artifi ci al <220> <223> Primer/probe <400> 725 guuaguagua cauagauaau cugcc 25 <210> 726 <211> <212> <213> 26 DNA Arti fi ci al <220> <223> Primer/probe <400> 726 ggggauaacg guuggaaacg aucgcu 26 ^ <210> Q <211> <212> <213> 727 27 DNA Artificial <220> <223> primer/probe <400> 727 ccaccaaggc gaugacgucu aggcgga 27 <210> 728 <211> <212> <213> 26 DNA Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 728 uucuagagga uagaugggga aaaggg 26 <210> 729 <211> 25 126 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 729 acucaaccua uuuauaggag agagg <210> 730 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 730 gauagucuca acccuauccg ugucg <210> 731 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 731 uggcguguca gcuauaacgc cguga <210> 732 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 732 agagagguaa acggaauucc augugu <210> 733 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 733 guggcgaaag cgguuuacug gcu <210> 734 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 734 acuuauuauu uuugcaugaa aguaau 127 <210> 735 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 735 uuguaaacug cugugguuag ggaaga <210> 736 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 736 aagucuggcg uuaaauuuug gggcu <210> 737 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 737 uucugcaaag cuauggagac auagug <210> 738 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 738 agcgagguuc uuuugaaccu agcgg <210> 739 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 739 gaaaugcuuc caggcugacg guacc <210> 740 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 740 cucuugacau ccuucgcaau gcuaua 128 ·· t · · • V · ♦ * · «· Η» · • *· «· • * • • » • • • • 4 • · • • · ··· *# ·· <210> 741 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 741 acauccuucg caaugcuaua gagau 25 <210> 742 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 742 aaagugcugu uauaggggaa gaaca 25 <210> 743 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 743 acccaaugga aacauugguu aaugccg 27
<210> 744 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 744 gaaacauugg uuaaugccgg auacgc 26 <210> 745 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 745 aaugcguaga uauauaugga agaaca 26 <210> 746 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 129 129
<400> 746 cauuagucgg uggagaauca cugacg <210> 747 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 747 agucgaacgg gggugcuugc accuca <210> 748 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 748 acguaucuaa ccuaccuuau agcgg <210> 749 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 749 gauaauaccg cauguagauc uuauu <210> 750 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 750 aucaaaagaa ccguuugguu cacuauga <210> 751 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 751 agauggggau gcggcguauu agcua <210> 752 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> Primer/Probe <400> 752 caacccuugu cguuaguuac uaacau <210> 753 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 753 accuaaugga aacauugguu aaugccgg <210> 754 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 754 guugaggaaa ugcaacuaag cugacg <210> 755 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 755 aaaugcaacu aagcugacgg uaccuuguua ga <210> 756 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 756 agucgguggg agccacugac gc <210> 757 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 757 caugucgagc gaagguagca auaccuua <210> 758 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 758 uuucaaauac ucguaguuuu cgcauga <210> 759 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 759 cuucgcugga ggagcggggu gcguaac <210> 760 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 760 gaagaacacc aagauggcga aggcag <210> 761 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 761 aacaaguuaa cuaucgcaug agaaua <210> 762 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 762 uagaguggaa agcuauuaau uugacu <210> 763 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 763 aaggcgagga cuugggccaa uacug <210> 764 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 764 auuaaaguug aaaggaccug caagggu <210> 765 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 765 caggcaaugg cuggaguuug acuguac <210> 766 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 766 aaaggcagcu gcuuaacagu uguaug <210> 767 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 767 ggagcgaucc cuucgguagu gaaguu <210> 768 <211> 27 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 768 uaacgagacu gcuaauguaa auuggag <210> 769 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 769 cuuuauugga agcgcauguc aaggauag 133 ·· · · * ·· ·· • · ·· ·· ·· · · · 1 ·· · * t I · t i • » * · ···>·; • · · · ····· <210> 770 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 770 gcaugucgag cgagguuagc aauaacc 27 <210> 771 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 771 26 aaaugauugc agacugacgg uaccuu <210> 772 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 772 cauuagucgg uggagaauca cugacg 26 <210> 773 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 773 26 agauauagug gagguuaucg gaguga <210> 774 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 774 uauaguuauu uaucgcauga ugagu 25 <210> 775 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 775 uauaguuauu uaucgcauga ugagu 25
134 • · #· ·· • · · · I » • · t I · β • · · · I I ♦ <210> 776 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 776 uagccgggcc gagaggcugu acggcc 26 <210> 777 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 777 cucaacuuca guccgcuuug gauac 25 <210> 778 <211> 22 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 778 ggaauaauuu cacuaacgca gc 22 <210> 779 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 779 aauaccgcau agggcauuau uaucg 25 <210> 780 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 780 aagcgagcgc gggcggauuu gcaag 25 <210> 781 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 781 aaauguuggc acggaaugug ucggug <210> 782 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 782 gcauguagau cuuauuaucg cauga <210> 783 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 783 guucgccuug aaaacuguau uacua <210> 784 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 784 guagguagcu uaaccguuug gagagc <210> 785 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 785 aaguagcaau acuuuagcgg cgaauggg <210> 786 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 786 accuaaugga aacauugguu aaugccg <210> 787 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 787 caguuaguug aggaaaugcu ucuaauc <210> 788 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 788 cauuagucgg uggaaaacua cugacg <210> 789 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 789 cauaacaaau guacuaucgc auga <210> 790 <211> 24 <212> DNA . <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 790 ugacguguag uuaugcugag aggu <210> 791 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 791 gcagaggaaa ugauguuagu uugacgg <210> 792 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 792 gauguuagau gucgggguaa acgccu <210> 793 <211> 26 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 793 aucaaaguug aaaggaccug caaggg <210> 794 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 794 agaaugacuu uagcagguaa uggcuag <210> 795 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 795 aaaggcagcu gcuuaacagu uguau <210> 796 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 796 acauccuugg caaaguuaug gaaaca <210> 797 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 797 guuaguuaca uugucuagcg agacu <210> 798 <21X> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 798 uuaaaaacgu guugcuaacc auuaggaa <210> 799 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 799 uuaagaucgc augguuuuaa uauaa <210> 800 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 800 ugcugugguu agggaagaaa aaguaauau <210> 801 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 801 uaaaguagga aaugccuuua uauugac <210> 802 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 802 gcgaaagcgg cuuacugguu uguua <210> 803 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 803 uugggugaac ucagcgccgc agcu <210> 804 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 804 aaaaaguagu ugaggaaaug cuucuac 139 w w w w ·#· ·
• · · · • · · · • · · · •Μ ·· M <210> 805 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 805 acuggguuua uacugacgcu gaggaac 27 <210> 806 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 806 25 aucauuaguc ggcagagaac uguug <210> 807 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 807 cugauugggg uuuucuccag uuagu 25 <210> 808 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 808 25 cggucaucug ggcuacgacu gacgc <210> 809 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 809 cuagauaucg gaagagucuc uuucgg 26 <210> 810 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 810 gggguuuacu cuaauuaguu agugg 25 140 • · • · • · • · ·· ··· ··· • ·· ·· ·· · · · · • · * · « • · · · · • · · · · ··· ·* ·· <210> 811 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 811 auaucggaag auuuucuuuc gguuuc 26 <210> 812 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 812 cuugacaugg ugguugcgga ucgcag 26 <210> 813 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 813 ugcuccaguu aguuaguggc agacg 25 <210> 814 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 814 acuaauuugg ggcuugcucc aauuaguu 28 <210> 815 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 815 cgaaggcggu cgucugggcu acaa 24 <210> 816 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 816 auuaacuaga gcucgcuuua guua <210> 817 <211> 25 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> Primer/Probe <400> 817 uucaguucgg cugggccaca cacag <210> 818 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 818 gucaucuggg cuaccacuga cgcugau <210> 819 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 819 caacccuuga cauggugguu gcgga <210> 820 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 820 acuaauuugg ggcuugcucc aauuuag <210> 821 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 821 gcgguuuagu aaguugggag ugaaag <210> 822 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 822 uuaauuagag cuugcucuag uuaau <210> 823 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 823 acaugguggu uauggauugc agaga <210> 824 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 824 ucggcugggc cacacacagg ug <210> 825 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 825 acaaacugga augguuguaa ugaug <210> 826 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 826 gaagaacuuc ugaagagacu guaag <210> 827 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 827 guguuaagug ggucacuugg ggagu <210> 828 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 143 99 • · • · • · • · ·· ··· # ·· ··· • 99 ·· ·· · · · φ 9 · ♦ · · • · 9 9 9 9 · « · ··· Μ ·· <220> <223> Primer/Probe <400> 828 cucgaaaccc guucguaguc aggacu 26 <210> 829 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 829 uauuaaaucu agaugcuuaa cgucua 26 <210> 830 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 830 aaaugaugug ccuggguagu acauuc 26 <210> 831 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 831 gaugaagcga aacagaaaaa guuagu 26 <210> 832 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 38 <400> 832 Γ λ taatacgact cactatagag agtttgatcm/tggctcag <210> 833 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 833 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 834 <211> 17 144 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 834 tccgcaggtt cacctac <210> 835 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 835 caagtctggt gccagca <210> 836 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 836 cgctggcggc aggcctaacu acatgcaagt cgaacggtaa caggaagcag cttg <210> 837 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 837 cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc atcgagatgt gcccagatgg gattagctag t <210> 838 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 838 gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gc <210> 839 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 145 <400> 839 ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg 60 ctacaatgg 69 <210> 840 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 840 aggagccagc cgcctaaggt gggatagatg attggggtga agtcgtaaca aggta 55 <210> 841 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial ® <220> <223> Primer/Probe <400> 841 gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 60 aacgagcgca ac 72 <210> 842 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 842 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttag 60 tccggaattt attgggcgta aag 83
·· • • · ·· • ' · • • · • • · • ·· ··· * ·· ··· • ·· 00 ·· • · • · • • · • · • • • • · 0 t • • 0 ·· 00 <210> 843 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <220> <221> mi sc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> mi sc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> mi sc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a, c, g, or t 146 <400> 843 agaaagcnan ggctaactat gtgccagcag ccgcggtaat acataggtng caagcgttat ccggaaattt attg <210> 844 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 844 tccgcctgag tagtatgctc gcaagagtga aactctaaaa ggaattgacg gggactcccg cacaag <210> 845 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 845 ggcgcgaaag caaggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccttg ccgtaaacga tgcatacttg atgtggat <210> 846 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 846 ccttatcgtt agttgccagc acttagggtg ggaactctac gagactgcct gggttaacca ggagg <210> 847 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 847 ctgggactga gacactgccc agactcctac gggaggctgc agtcgagaat ctttcgcaat ggacg <210> 848 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe 147
·· ·· • · * ♦ · · > ♦ f • · · <400> 848 gaaggccttc gggttgtaaa gcactttcgg tggggaagaa attctcaagg gtaatatcct 60 66 tgggcg <210> 849 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 849 tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctaccc ttgacatcct cggaacttgt cagagatgat 60 ttggtg 66
<210> 850 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 850 tagtagggga tgatggaatt cctagtgtag aggtgaaatt cttagatatt aggaggacac 60 cggtg 65 <210> 851 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 851
gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc aataccgagt 60 gagtgatgaa ggcc 74 <210> 852 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer/Probe <400> 852 catggccctt acgggttggg ctacacgcgt gctacaatgg tgtttacaga gggaagcaag 60 64 acgg

Claims (36)

  1. - 80 - - 80 - * w w • · ·· • · • t · • • · • ♦ · ··· • ·· ♦· • · ·♦ • * • • · • t • • ♦ • • • • • • • ··· »* Patentansprüche: 1. Verfahren zur Identifizierung mindestens eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Isolierung von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren, c) Inkontaktbringen der isolierten Nukleinsäuren mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der Nukleinsäure des mindestens einen zu identifizierenden Mikroorganismus bindet, und mindestens 80% ident ist mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmenten davon und deren revers-komplementären Sequenzen, wobei die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, d) Nachweisen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde und e) Identifizieren eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle A und Tabelle B angeführten Mikroorganismen.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Lebensmittel, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Milch, Milchprodukten, insbesondere Butter, Rahm oder fermentierten Milchprodukten, Fleisch, Fleischprodukten, insbesondere Rohwürsten, Fisch, Fischprodukten, Meeresfrüchten, insbesondere Muscheln, und pflanzlichen Lebensmitteln, insbesondere Essig und Bier, Zellkultur, Biopsiematerial, Abstrichen, insbesondere Vaginal-Abstrichen, bronchoskopische Abstrichen und menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel, Liquor, Urin, Sekrete, Cerebrospinal fluid (CSF) und Waschlösung von Spülungen vorzugsweise der Lunge, der Bauchhöhle und der Mundhöhle, und Fermentationslösungen, vorzugsweise pharmazeutische oder lebensmitteltechnologische Fermentationslösungen.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine RNA- und/oder DNA-Sonde ist. - 81 - * • • ·· ·· ·· M ·· • · • · • • • • « t 1 • • • • · • · • • • • 1 • « ··· ··· ··· ·· ··
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Isolieren gemäß Schritt b) eine Amplifikation des 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gens der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik umfasst.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 aufweisen.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte oder amplifizierte Nukleinsäure markiert ist, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nukleinsäure mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht wird und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, das der mindestens eine Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes defragrans, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Arcanobac-terium pyogenes, Arcobacter butzerli, Arcobacter cryoaerophilus, Arthrobacter globiformis, Aspergillus fumigatus, Bacillus ce-reus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bifidobac-terium bifidum, Bifidobacterium longum, Brevibacterium casei, Brevibacterium epidermidis, Brevibacterium linens, Brochothrix thermosphacta, Brucella abortus, Brucella melitensis, Campylob-acter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candida, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida sake, Candida tropicalis, Candida utilis, Carnobacterium di-vergens, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium diffi- - 82 - #· ·· ··· f ·· ·· ·· • ·· · • ♦ · · # · · « • · · · ·· ·· eile, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium bovis, Corynebacterium casei, Corynebac-terium diphtheriae, Coxiella burnetii, Cryptococcus, Debaryomy-ces hansenii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus, En-terococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus saccharolyticus, Escherichia coli, Flavobacterium, Francisella tularensis, Gluconobacter, Gluconobacter asaii, Gluconobacter oxydans, Hafnia alvei, Helicobacter pylori, Klebsialla pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentari-us, Lactobacillus bifermentas, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus plantarium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus cremoris, Lactococcus diacetilactis, Lactococcus lactis, Lactococcus luteus, Legionel-la pneumophilia, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuco-nostoc mesenteroides, Listeria, Listeria ivanovii, Listeria mo-nocytogenes, Listeria seeligeri, Microbacterium lacticum, Micro-bacterium schleiferi, Micrococcus lylae, Micrococcus tyrobutyri-cum, Micrococcus varians, Mycobacterium avium, Mycobacterium tu-berculosis, Mycoplasma bovialkalescens, Mycoplasma bovigenitali-um, Mycoplasma bovis, Mycoplasma californicum, Mycoplasma cana-dense, Nocardia asteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococ-cus pentosaceus, Plesiomonas shigelloides, Propionibacterium freudenreichii, Prototheca zopfii, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas mephitica, Pseudomonas putida, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Shewanella putrefaciens, Shigella, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Sporo-lactobacillus inulins, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyieus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, * • ·· ·· •1 t » • · • % » * · • φ • 9 • · · 9 m • 9 • · · 9 » ··· «·· ··· It ·· t · • * • · • · ·· - 83 - Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis, Streptomyces griseus, Torulaspora, Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemo-lyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Zymomonas mobilis.
  9. 9. Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend, aus SEQ ID Nr. 1 bis 835 oder aus Fragmenten von einzelnen Sonden aus SEQ ID Nr. 1 bis 835.
  10. 10. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 zur Bestimmung von EuterInfektionen bei milchgebenden Säugetieren, wobei das milchgebende Säugetier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hausrind, Schaf, Ziege, Büffel, Kamel und Pferd.
  11. 11. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 zur Prozesskontrolle bei der Lebensmittelherstellung und zur Kontrolle von fertigen Lebensmittel für die Überprüfung des Frischezustandes und der hygienischen Bedingungen.
  12. 12. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 zur Überwachung von technischen Fermentationen, vorzugsweise bei der Produktion von organischen Substanzen, wie Lebensmittel-Zusatzstoffen, basierend auf Mikroorganismen und/oder zur raschen Kontrolle von sterilen und kontaminationsfreien Bedingungen.
  13. 13. Verfahren zur Detektion und Bestimmung mindestens eines intrazellulären Mikroorganismus in einer Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Isolierung von in der Probe enthaltener Nukleinsäure, c) Inkontaktbringen der isolierten DNA mit mindestens einer Sonde, die an das 16S rRNA -Gen der isolierten Nukleinsäure bindet, und mindestens 80% ident mit einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 691 bis 831 oder deren revers-komplementären Sequenzen, wobei die mindestens eine Sonde an einem festen Träger immobilisiert ist, - 84 - - 84 - ·· • · *· ·· • · ♦ · • · ♦ · t · · · « • ♦ · · # ··· «t d) Feststellen einer Bindung der isolierten Nukleinsäure an die mindestens eine Sonde, und e) Detektieren oder Bestimmen eines Mikroorganismus in der Probe durch Korrelieren der nachgewiesenen Bindung der isolierten Nukleinsäuren mit den immobilisierten Sonden mit den in Tabelle B angeführten Mikroorganismen.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Milch, Milchprodukten, insbesondere Butter, Rahm oder fermentierten Milchprodukten, Fleisch, Fleischprodukten, insbesondere Rohwürsten, Fisch, Fischprodukten, Meeresfrüchten, insbesondere Muscheln, und pflanzlichen Lebensmitteln, insbesondere Essig und Bier, Zellkultur, Biopsiematerial, Abstrichen, insbesondere Vaginal-Abstrichen, bronchoskopische Abstrichen und menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel, Liquor, Urin, Sekrete, Cerebrospinal fluid (CSF), Waschlösung von Spülungen vorzugsweise der Lunge, der Bauchhöhle und der Mundhöhle und Fermentationslösungen, vorzugsweise pharmazeutische oder lebensmitteltechnologische Fermentat ionslösüngen .
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe menschlichen oder tierischen Ursprungs ist, wobei das Tier vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe der Haustiere, insbesondere der Gruppe der Hausrinder, Schafe, Ziegen, Büffel, Pferde, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen und Hasen.
  16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) und vor Schritt c) das 16S rRNA- und/oder 18S rRNA-Gen der isolierten Nukleinsäure teilweise oder zur Gänze mittels einer DNA-Amplifikationstechnik ampli-fiziert wird.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 832 und SEQ ID Nr. 833, und die Primer zur Amplifikation des 18S rRNA-Gens die Sequenzen SEQ ID Nr. 834 und SEQ ID Nr. 835 aufweisen. - 85 - - 85 -
    • · · · • · · · ·· ··· ··· • ·· ·· ·· · • • · • · Ψ + • • · • • ♦ • « • ♦ • »·» ·♦ ♦ ·
  18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte odpr amplifizierte Nukleinsäure markiert ist, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff.
  19. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nukleinsäure mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100, Sonden in Kontakt gebracht wird und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr."691 bis 831.
  20. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass in der Probe vorhandene eukaryoti-sche oder prokaryotische Nukleinsäuren abgetrennt werden. t
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung mit einem Verfahren umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, b) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Träger umfassend ein Material bestehend aus Glas, Agarose, Metall, Polymer, vorzugsweise Polystyrol, Kieselgel und Kombinationen davon, an dem mindestens eine Nukleinsäure immobilisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 836 bis 851. c) Trennen der Probe vom festen Träger.
  22. 22. Fester Träger zur Abtrennung mikrobieller DNA aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass am Träger mindestens eine Nukleinsäure immobilisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 836 bis 851.
  23. 23. Träger nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Material umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Agarose, Metall, Polymer, vorzugsweise Polystyrol, Kieselgel und Kombinationen davon.
  24. 24. Verfahren zur Abtrennung mikrobieller DNA aus einer Probe umfassend die Schritte: * * • ·· «« ·· · · I I • · · · « • · r * · • · · · · ·♦· ·· ·« • · · t • · · I ·· ··· ··» - 86 - a) Bereitstellen einer Probe, b) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Träger umfassend ein Material bestehend aus Glas, Agarose, Metall, Polymer, vorzugsweise Polystyrol, Kieselgel und Kombinationen davon, an dem mindestens eine Nukleinsäure immobilisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 836 bis 851. c) Trennen der Probe vom festen Träger.
  25. 25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel und flüssige Lebensmittel oder diverse Fermentationsmedien.
  26. 26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA Gram-negativen Bakterien mit einem festen Träger abgetrennt werden, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 836 bis 839 und Fragmenten, davon immobilisiert ist.
  27. 27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA Gram-positiver Bakterien mit einem festen Träger abgetrennt werden, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 840 bis 842 und Fragmenten, davon immobilisiert ist.
  28. 28. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA von Mykoplasmen mit einem festen Träger abgetrennt werden, an dem die Nukleinsäure SEQ ID Nr. 843 oder Fragmente davon immobilisiert sind.
  29. 29. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA von Chlamydien mit einem festen Träger abgetrennt werden, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 844 bis 846 und Fragmenten davon, immobilisiert ist.
  30. 30. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, 87 Ψ9 · • · ♦· · * · · • · · • · ·
    dass die DNA von Coxiella burnetti mit einem festen Träger abgetrennt werden, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 847 und 848 und Fragmenten davon, immobilisiert ist.
  31. 31. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA von Rickettsien mit einem festen Träger abgetrennt werden, an dem mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 849 bis 851 und Fragmenten davon, immobilisiert ist.
  32. 32. Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen umfassend die Schritte: a) Zur Verfügungsstellung einer Matrix von Signaldaten, die durch Nachweisen einer Bindung mindestens einer Nukleinsäure an mindestens einer Sonde gewonnen werden b) Quantilen-Normalisierung der Matrix c) Klassifizieren der Signaldaten mit dem Nearest centroid Algorithmus.
  33. 33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Hybridisierungsereignisse, bevorzugt 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 in der Matrix vorhanden sind.
  34. 34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die angewandte Matrix aus Signal Daten von zumindest 2, mehr zumindest 10, noch mehr zumindest 20 und am besten zumindest 50 Spezies in einer Probe besteht.
  35. 35. Mikroarray umfassend ein Substrat und mindestens eine Sonde, die mindestens 80% ident ist mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 831 und Fragmenten davon und deren revers-komplementären Sequenzen.
  36. 36. Mikroarray nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass am Mikroarray mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 30, noch mehr bevorzugt mindestens 50, Sonden gebunden sind. AP/R
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