CN109666753A

CN109666753A - 一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量pcr引物和探针

Info

Publication number: CN109666753A
Application number: CN201910156459.3A
Authority: CN
Inventors: 林裕胜; 胡奇林; 江锦秀; 游伟; 张靖鹏
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-04-23

Abstract

本发明提供一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针，分别设计针对绵羊肺炎支原体特异性检测引物Mo‑F、Mo‑R及一条荧光探针Mo‑P，针对丝状支原体山羊亚种的特异性检测引物Mmc‑F、Mmc‑R及探针Mmc‑P，针对山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性检测引物Mccp‑F、Mccp‑R及荧光探针Mccp‑P。本发明提供的三重荧光定量PCR方法可以同时检测和鉴别绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种和丝状支原体山羊亚种3种支原体，具有快速、准确、特异性强、重复性好等优点，同时还可节约成本，适用于对以上3种支原体的快速检测及其所引起的羊支原体性肺炎和山羊传染性胸膜肺炎的流行病学调查。

Description

一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针

技术领域

本发明涉及一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针，属于预防兽医学技术领域。

背景技术

近年来，我国新疆、辽宁、河北、四川、重庆、广西、贵州、湖南、福建等多个省份流行羊支原体性肺炎，其病原主要是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumonia，Mo)和丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp .capri ,Mmc)。近几年有多位学者报道同一羊群中出现两种以上支原体的混合感染现象,然而这两种病原引起的临床症状相似，病理变化相近,临床上难以区别，给疾病的确诊带来了极大困难。这两种病原是我国当前养羊业的主要疫病，给我国养羊业造成了巨大的经济损失。

绵羊肺炎支原体是羊支原体性肺炎的病原之一，主要临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症, 临床上呈急性或慢性经过，病死率一般为30%～50%, 有的高达80%～100%。绵羊肺炎支原体培养困难，目前羊支原体性肺炎仍缺乏有效的生前诊断和防治措施，给养羊业造成巨大经济损失。目前, 该病广泛分布于世界各养羊地区, 尤其是亚洲和非洲国家。

丝状支原体山羊亚种是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎的病原之一。可引起山羊以高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。

山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp），也是丝状支原体簇的成员，是山羊传染性胸膜肺炎的病原。山羊传染性胸膜肺炎是山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病，以呈现纤维素性肺炎和胸外膜炎为特征。该病发病率可高达80～100%，死亡率达60～80%。Mccp最早是由Macowan于1976年在肯尼亚分离得到。随后又在苏丹、突尼斯、阿曼、土耳其、乍得、乌干达、埃塞俄比亚、尼日尔、坦桑尼亚和阿联酋分离到。我国最早于2007年从山东分离出１株Mccp。

由于Mccp和Mmc同属丝状支原体簇，丝状支原体簇成员间基因组序列高度同源（16SrRNA基因同源性为95.5%），生化性状相近，血清学存在广泛交叉反应，因此，建立鉴别Mccp和Mmc的检测方法难度很大。当前确诊山羊传染性胸膜肺炎和羊支原体性肺炎的方法主要是病原分离鉴定, 但是支原体的体外培养成本较高, 培养条件要求苛刻，生长缓慢，尤其是Mccp很难培养，临床病例确诊一般需要2-3周时间, 显然不能满足快速诊断的需要,所以，临床上迫切需要建立能够鉴别绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的诊断方法。PCR 是快速诊断疫病和进行流行病学研究的重要技术, 国外一些学者应用该技术对山羊传染性胸膜肺炎进行了诊断和流行病学研究, 国内的屈勇刚等、李媛等、储岳峰等分别建立了绵羊肺炎支原体PCR 检测方法及绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种二重PCR 检测方法, 但目前关于绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种和丝状支原体山羊亚种这3种病原的分子生物学诊断方法主要有单一PCR、双重/三重PCR和单一/双重荧光定量PCR方法,尚未见有三重荧光定量PCR同时检测这3种病原的报道。本发明提供快速、特异、灵敏的鉴别或同时检测3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法, 适用于临床快速检测和大规模流行病学调查，有广阔的应用前景，具有重大的经济和社会效益。

发明内容

由于绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种可同时感染羊，临床诊断难以区分，病原分离鉴定耗费耗力且很难分离丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种。本发明要解决的技术问题就是针对目前现有的3种病原单一PCR、双重PCR、三重PCR和单一/双重荧光定量PCR检测技术的局限性，提供一种基于应用特异性引物能够快速、准确、同时检测这3种支原体的三重荧光定量PCR方法。

本发明将按以下技术方案解决上述存在问题：

根据绵羊肺炎支原体p113基因序列设计检测绵羊肺炎支原体的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mo-F: 5’- CTTCGGGACTTATTGGAG-3’（如SEQ ID No.1所示）；

下游引物Mo-R: 5’-GATGCAAACTGATTTACTTG-3’ （如SEQ ID No.2所示）；

荧光探针Mo-P: 5’-ROX- AAGACCGATTGTCAGGCCGA –Eclipse-3’ （如SEQ ID No.3所示）；

根据丝状支原体山羊亚种MLC_1770基因设计检测丝状支原体山羊亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mmc-F: 5’- CTAGCTAGCATAGTTGTTG-3’ （如SEQ ID No.4所示）；

下游引物Mmc-R: 5’- GCTTGAACAACTATATTGTA -3’ （如SEQ ID No.5所示）；

荧光探针Mmc-P: 5’-FAM- TAACACAGTTAAAGCAGACCCACCA–BHQ-3’ （如SEQ ID No.6所示）；

根据山羊支原体山羊肺炎亚种arcA基因设计检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mccp-F: 5’- GTTCCATCATTTCATTGTTC-3’ （如SEQ ID No.7所示）；

下游引物Mccp-R: 5’- GATGCAGTAGGAAGAGAA -3’ （如SEQ ID No.8所示）；

荧光探针Mccp-P: 5’-JOE- ATGTGGTGGTAATGATGTTGTTGGTG–Eclipse-3’（如SEQ IDNo.9所示）。

进一步的，所述方法包括：

（1）设计及合成引物和探针；

（2）制备阳性质粒标准品；

（3）进行三重荧光定量PCR反应条件的优化，建立三重荧光定量PCR检测体系；

（4）采用三重荧光定量PCR检测体系对支原体进行检测。

进一步的，制备阳性质粒标准品的具体过程包括：

A．合成用于制备阳性质粒标准品的引物；

绵羊肺炎支原体引物：

上游引物P1：5’- AACCCTTTTGCTGGCGG-3’；

下游引物P2：5’- CACTTAAATTAAAGGCCAAAT-3’；

扩增目的片段为162bp；

丝状支原体山羊亚种引物：

上游引物P3：5’- ATATTAACAATGCTAGCTA-3’；

下游引物P4：5’- TTGGCATTCATTTATCATTT-3’；

扩增目的片段为118bp；

山羊支原体山羊肺炎亚种引物：

上游引物P5：5’- GGTCTTAATGCTACAACAT-3’；

下游引物P6：5’- AATCGAATTATTAAGTGATGC-3’；

扩增目的片段为123bp；

B．用商品化试剂盒分别提取绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种DNA，分装保存于-70℃备用；

C．分别以绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的DNA模板进行PCR扩增反应，然后回收纯化扩增产物；

其中绵羊肺炎支原体的PCR扩增体系含有模板、上游引物P1、下游引物P2、Premix Taq酶、DEPC水；

扩增反应条件为：95℃预变性3min ,95℃30s，55℃30s，72℃30s，37个循环，72℃延伸10min；

丝状支原体山羊亚种的PCR扩增体系含有模板、上游引物P3、下游引物P4、Premix Taq酶、DEPC水；

山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR扩增体系含有模板、上游引物P5、下游引物P6、PremixTaq 酶、DEPC水；

扩增反应条件为：95℃预变性3min ,95℃30s，50℃30s，72℃30s，37个循环，72℃延伸10min；

D．将纯化后的绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR产物分别连接到载体pMD19-T上；再将连接后载体转入大肠杆菌感受态细胞；经PCR和双酶切鉴定，最后提取阳性质粒作为标准品。

进一步的，所述三重荧光定量PCR检测体系具体包括：常规方法提取待测样品DNA，并以DNA为模板进行三重荧光定量PCR反应。

所述三重荧光定量PCR反应的体系含有模板、引物Mo-F、引物Mo-R、探针Mo-P、引物Mmc-F、引物Mmc-R、探针Mmc-P、引物Mccp-F、引物Mccp-R、探针Mccp-P、Premix Ex Taq™(Probe qPCR)和DEPC水。

所述三重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃10s；95℃5s，55℃10s，72℃20s，40个循环。

进一步的，所述三重荧光定量PCR反应条件的优化包括：

a．退火温度优化：以质粒为模板，在51℃-61℃进行梯度定量PCR，根据扩增反应Ct、扩增曲线的荧光信号强度和溶解曲线筛选最佳退火温度；

b．引物、探针浓度的优化：以质粒为模板，引物和探针的浓度为5-20μM，进行荧光定量PCR，确定引物和探针的最佳浓度。

本发明的优点在于：

本发明利用所述引物和探针建立的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法可以同时检测和鉴别绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种3种支原体，具有操作简单、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本，还可为这3种支原体所引起的羊支原体性肺炎和山羊传染性胸膜肺炎的早期快速检测和流行病学调查等研究提供有效的候选手段。

附图说明

图1为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法绵羊肺炎支原体的标准曲线。

图2为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法丝状支原体山羊亚种的标准曲线。

图3为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法山羊支原体山羊肺炎亚种的标准曲线。

图4为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法特异性分析的扩增曲线。

图5为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法绵羊肺炎支原体的敏感性分析的扩增曲线。

图6为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法丝状支原体山羊亚种的敏感性分析的扩增曲线。

图7为本发明具体实施方式的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法山羊支原体山羊肺炎亚种的敏感性分析的扩增曲线。

具体实施方式

本发明具体实施方式中所采用的仪器和试剂主要包括：

微量移液器（1000μL、200μL、20μL、2.5μL）（德国EDDENDORF公司）

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (TP600)梯度PCR仪（日本TAKARA公司）；

Gel Doc™ XR+凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；

ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；

DL2000Marker、Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) （宝生物工程有限公司）；

细菌基因组DNA 抽提试剂盒/组织 DNA 提取试剂盒（生工生物工程有限公司）。

若未特别指明，下列具体实施方式均按照常规实验条件。

实施例1

一种用于3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法，包括：

（1）引物和探针的设计与合成：

根据GenBank上公布的Mo p113基因、Mmc MLC_1770基因和Mccp arcA基因序列，利用Beacon Designer 7.9软件，结合NCBI Blast在线分析，分别设计出针对Mo、Mmc和Mccp的3对特异性引物和探针，设计检测绵羊肺炎支原体的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mo-F: 5’- CTTCGGGACTTATTGGAG-3’；

下游引物Mo-R: 5’-GATGCAAACTGATTTACTTG-3’；

荧光探针Mo-P: 5’-ROX- AAGACCGATTGTCAGGCCGA –Eclipse-3’ ；

设计检测丝状支原体山羊亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mmc-F: 5’- CTAGCTAGCATAGTTGTTG-3’；

下游引物Mmc-R: 5’- GCTTGAACAACTATATTGTA -3’；

荧光探针Mmc-P: 5’-FAM- TAACACAGTTAAAGCAGACCCACCA–BHQ-3’；

设计检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mccp-F: 5’- GTTCCATCATTTCATTGTTC-3’ ；

下游引物Mccp-R: 5’- GATGCAGTAGGAAGAGAA -3’ ；

荧光探针Mccp-P: 5’-JOE- ATGTGGTGGTAATGATGTTGTTGGTG–Eclipse-3’。

（2）制备阳性质粒标准品：

A.合成用于制备阳性质粒标准品的引物；

绵羊肺炎支原体引物：

上游引物P1：5’- AACCCTTTTGCTGGCGG-3’；

下游引物P2：5’- CACTTAAATTAAAGGCCAAAT-3’；

扩增目的片段为162bp；

丝状支原体山羊亚种引物：

上游引物P3：5’- ATATTAACAATGCTAGCTA-3’；

下游引物P4：5’- TTGGCATTCATTTATCATTT-3’；

扩增目的片段为118bp；

山羊支原体山羊肺炎亚种引物：

上游引物P5：5’- GGTCTTAATGCTACAACAT-3’；

下游引物P6：5’- AATCGAATTATTAAGTGATGC-3’；

扩增目的片段为123bp；

B.商品化试剂盒分别提取绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种DNA，分装保存于-70℃备用；

C.分别以绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的DNA模板进行PCR扩增反应，然后回收纯化扩增产物；

其中绵羊肺炎支原体的PCR扩增体系为含有模板2 μL、上游引物P1(10 μmol/μL)、下游引物P2(10 μmol/μL)、Premix Taq 酶10 μL、DEPC水补足至20 μL；

丝状支原体山羊亚种的PCR扩增体系为含有模板2 μL、上游引物P3(10 μmol/μL)、下游引物P4(10 μmol/μL)、Premix Taq 酶、DEPC水补足至20 μL；

山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR扩增体系为含有模板、上游引物P5、下游引物P6、Premix Taq 酶、DEPC水；

D.回收纯化扩增产物使用Axygen的DNA柱式回收试剂盒进行胶回收；

E．制备阳性标准品质粒，具体包括：将纯化后的绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR产物分别连接到载体pMD19-T上；再将连接后载体转入大肠杆菌感受态细胞；经PCR和双酶切鉴定，最后提取阳性质粒作为标准品；

（3）进行三重荧光定量PCR反应条件的优化，建立三重荧光定量PCR检测体系：

A1．三重荧光定量PCR检测体系标准曲线的制作

将浓度为10⁷copies/μL的绵羊肺炎支原体质粒标准品、浓度为10⁷copies/μL的丝状支原体山羊亚种质粒标准品和浓度为10⁷copies/μL的山羊支原体山羊肺炎亚种质粒标准品10倍梯度稀释后等量混合作为模板按优化后的反应体系与反应条件进行扩增，得到3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法的标准曲线（图1、图2和图3），由图可知每个反应体系中模板拷贝数在10⁷-10¹copies/μL的范围内有很好的线性关系，相关系数分别为0.998、0.995和0.999，扩增效率分别为101.79%、93.44%和104.57%；

A2．三重荧光定量PCR反应条件的优化

a．退火温度优化：以标准品质粒为模板，在51℃-61℃进行梯度PCR，根据扩增曲线Ct值、扩增曲线的荧光信号强度和熔解曲线优化最佳退火温度；

b．引物和探针浓度的优化：以标准品质粒为模板，引物和探针浓度为5-20μM，进行荧光定量PCR，确定引物和探针的最佳浓度；

最终确定绵羊肺炎支原体引物和探针浓度分别为10μM 1μL和5μM 1μL；丝状支原体山羊亚种的引物和探针浓度分别为10μM 1μL和5μM 1μL，山羊支原体山羊肺炎亚种引物和探针浓度分别为10μM 1μL和5μM 1μL，最佳退火温度为55℃；

A3.对建立的三重荧光定量PCR检测方法进行验证

a．三重荧光定量PCR检测方法特异性分析

所述三重荧光定量PCR反应的体系为含有模板(Mo、Mmc和Mccp混合共1μL)、10μM引物Mo-F 1μL、10μM引物Mo-R 1μL、5μM探针Mo-P 1μL、10μM引物Mmc-F 1μL、10μM引物Mmc-R 1μL、5μM探针Mmc-P 1μL、10μM引物Mccp-F 1μL、10μM引物Mccp-R 1μL、5μM探针Mccp-P 1μL、Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) 12.5μL和DEPC水 2.5μL。所述三重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃10s；95℃5s，55℃10s，72℃20s，40个循环。

应用本发明建立的三重荧光定量PCR检测方法，分别对1份绵羊肺炎支原体、1份丝状支原体山羊亚种、1份山羊支原体山羊肺炎亚种、1份丝状支原体丝状亚种、1份牛支原体、1份大肠杆菌、1份金黄色葡萄球菌、1份沙门氏菌、1份溶血性曼氏杆菌、1份精氨酸支原体及阴性对照进行检测，验证建立三重荧光定量PCR方法的特异性，结果表明除1份绵羊肺炎支原体、1份丝状支原体山羊亚种和1份山羊支原体山羊肺炎亚种有特异性扩增曲线外，余未见扩增信号，表明本发明所建立的三重荧光定量PCR特异性强（图4）。

b．三重荧光定量PCR检测方法敏感性分析

用Easy Dilution将分别将绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种质粒标准品按10倍梯度稀释成终浓度为1.0×10⁷--1.0×10¹copies/μL，等量混合后作为模板进行扩增，结果表明本发明建立的三重荧光定量PCR方法对绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的检测下限均为10²copies/μL（图5、图6和图7）。

c．三重荧光定量PCR检测方法的重复性分析

取10⁷ copies/μL、10⁵ copies/μL、10³copies/μL这三个浓度梯度的标准品等量混匀后作为模板进行批内重复性试验和批间重复性试验。进行批内重复性试验时每个浓度梯度设置三个重复；批间重复试验每隔3d进行一次，每次每个浓度设置三个重复，共进行三次检测。根据所得的Ct值计算均值()、标准差（SD）及变异系数（CV），分析所建立的三重荧光定量PCR检测方法的重复性（表1）。

由表可知绵羊肺炎支原体的组内变异系数为0.23%～1.49%，组间变异系数为0.93%～1.11%；丝状支原体山羊亚种的组内变异系数为0.39%～1.14%，组间变异系数为0.51%～1.32%，山羊支原体山羊肺炎亚种的组内变异系数为1.09%～1.59%，组间变异系数为0.63%～1.35%，说明该检测方法的重复性较好。

表1 三重荧光定量PCR重复性试验结果

（4）分离株检测结果

应用所建立的3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR检测方法对实验室内13份绵羊肺炎支原体分离株、3株丝状支原体山羊亚种分离株和2株山羊支原体山羊肺炎亚种标准株进行检测，结果表明，检测出Mo阳性率为100%（13/13），检测出Mmc阳性率为100%（3/3），检测出Mccp阳性率为100%（2/2）。

最后应说明的是，以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针

<130> 15

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttcgggact tattggag 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgcaaact gatttacttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaccgatt gtcaggccga 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagctagca tagttgttg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcttgaacaa ctatattgta 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taacacagtt aaagcagacc cacca 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gttccatcat ttcattgttc 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgcagtag gaagagaa 18

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgtggtggt aatgatgttg ttggtg 26

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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aacccttttg ctggcgg 17

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cacttaaatt aaaggccaaa t 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atattaacaa tgctagcta 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttggcattca tttatcattt 20

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtcttaatg ctacaacat 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aatcgaatta ttaagtgatg c 21

Claims

1.一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，

检测绵羊肺炎支原体的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mo-F: 5’- CTTCGGGACTTATTGGAG-3’；

下游引物Mo-R: 5’-GATGCAAACTGATTTACTTG-3’；

荧光探针Mo-P: 5’-ROX- AAGACCGATTGTCAGGCCGA –Eclipse-3’；

检测丝状支原体山羊亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mmc-F: 5’- CTAGCTAGCATAGTTGTTG-3’；

下游引物Mmc-R: 5’- GCTTGAACAACTATATTGTA -3’；

荧光探针Mmc-P: 5’-FAM- TAACACAGTTAAAGCAGACCCACCA–Eclipse -3’；

检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mccp-F: 5’- GTTCCATCATTTCATTGTTC-3’；

下游引物Mccp-R: 5’- GATGCAGTAGGAAGAGAA -3’；

荧光探针Mccp-P: 5’-JOE- ATGTGGTGGTAATGATGTTGTTGGTG–Eclipse -3’。

2.一种检测3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)设计及合成权利要求1所述的引物和探针；

(2)制备阳性质粒标准品；

(3)进行三重荧光定量PCR反应条件的优化，建立三重荧光定量PCR检测体系；

(4)采用三重荧光定量PCR检测体系对支原体进行检测。

3.根据权利要求2所述的检测3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR检测体系具体包括：常规方法提取待测样品的DNA，再以DNA为模板进行三重荧光定量PCR反应。

4.根据权利要求3所述的检测3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR反应的反应体系含有模板、引物Mo-F、引物Mo-R、探针Mo-P、引物Mccp-F、引物Mccp-R、探针Mccp-P、引物Mmc-F、引物Mmc-R、探针Mmc-P、Premix Ex Taq™(Probe qPCR)和DEPC水。

5.根据权利要求3所述的检测3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃ 10s， 95℃ 5s,55℃ 10s,72℃ 20s 40个循环。

6.如权利要求1所述的引物和探针在制备检测3种羊致病性支原体试剂中的应用。