CN111118185A - 检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光rpa引物和探针、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病菌检测技术领域，具体公开一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。所述引物和探针的序列为：上游引物：5′‑TGGTCATGGATTAGAATCAGTAGCAGC‑3′；下游引物：5′‑TAATACCAGCAACAGCAAGAACTAAACATACTC‑3′；所述探针的序列为：5′–CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGTTC‑THF‑ACTCTTTAGGAGAAG‑3′。本发明引物和探针的组合用于对山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA检测，兼具特异性高、敏感性好、准确性高以及耗时短的优点。
Description
技术领域
本发明涉及病菌检测技术领域，尤其涉及一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。
背景技术
山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae，Mccp)引起的以侵害山羊呼吸系统为主的高度接触性传染病。山羊传染性胸膜肺炎对非洲和亚洲山羊养殖业的危害较为严重，被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)列为法定报告传染病。该病无论在任何年龄、性别的山羊都可以感染，尤以羔羊最为易感，临床症状主要表现为高热、咳嗽、流脓性鼻液，病理变化主要是胸膜及肺脏部位发生纤维素性炎症。CCPP发病率可达80-90％，有时可高达100％，死亡率达60％-80％。该病在1873年首次在阿尔及利亚发现，于上世纪20年代传入我国，随后在内蒙、宁夏、甘肃、西藏等地区广泛流行，给我国山羊养殖业带来了很大的经济损失。
对Mccp的快速准确检测是预防和控制CCPP疫情的重要手段，其中，Mccp的分离鉴定是CCPP疫情诊断的关键，但由于Mccp对培养条件非常苛刻，培养周期需要数周，并且在培养过程中容易被其他细菌的大量生长所掩盖，因此难以满足目前的需要。目前已经建立了针对Mccp的系列分子生物学检测方法，如PCR、real-time PCR和LAMP方法等。但PCR主要应用于装备良好的实验室，需要精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，real-timePCR方法在实验室内应用广泛，能够在几小时内给出检测结果，但是该方法需要昂贵的荧光PCR设备，同时临床样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室，需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，进而影响对发生的山羊传染性胸膜肺炎疫情采取进一步的有效措施。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高的核酸等温扩增技术，可在短时间内完成扩增，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RPA结果的监测。若能建立Mccp的RPA检测方法，则对山羊传染性胸膜肺炎的早期预防和针对性治疗具有重要意义。
但是RPA检测方法对引物和探针的要求较为苛刻，且Mccp的临床症状及病变特征与绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、肺炎克雷伯氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、铜绿假单胞菌相似，仅通过临床症状和病理变化中非常容易误诊，造成较大的经济损失或者疫情的扩散等，因此快速、敏感、特异性强的检测方法对于该病防控十分重要。
发明内容
针对现有山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的检测方法存在检测方法复杂、耗时长、检测条件要求苛刻及检测效率低的问题，本发明提供一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：
上游引物：5′-TGGTCATGGATTAGAATCAGTAGCAGC-3′；
下游引物：5′-TAATACCAGCAACAGCAAGAACTAAACATACTC-3′；
所述探针的序列为：5′–CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGTTC-THF-ACTCTTTAGGAGAAG-3′。
相对于现有技术，本发明提供的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针可以特异性的结合到山羊支原体山羊肺炎亚种的DNA上，准确检测出山羊支原体山羊肺炎亚种，而与绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、肺炎克雷伯氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、铜绿假单胞菌的DNA均无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到102拷贝/μL，为普通PCR灵敏度的100倍以上，检测准确率为100％，用于实时荧光RPA检测方法中，恒温条件下仅需要15-20min即可完成反应，5-10min之内即可出现荧光信号，对反应条件和设备要求低，可以直接提取感染组织的DNA进行检测，无需对感染病菌进行进一步分离和培养，因此，上述引物和探针的组合用于对山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA检测，兼具特异性高、敏感性好以及准确性高的优点，为山羊传染性胸膜肺炎的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障。
优选的，在所述探针序列中THF的5′端一侧与其最接近的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其最接近的T碱基上标记淬灭基团；对所述探针序列的3′末端进行封闭修饰。
优选的，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为5′-CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGT/FAM-dT/C-THF-AC/BHQ1-dT/CTTTAGGAGAAG-C3-spacer-3′。
本发明还提供一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA试剂盒。该试剂盒包含上述引物和探针。
优选的，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。
本发明提供了所述试剂盒的使用方法。该使用方法的具体操作为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
上述试剂盒的使用方法，耗时短、反应结果直观，可用于山羊支原体山羊肺炎亚种的快速检测。
优选的，所述RPA扩增体系包括以下试剂及用量：
优选的，所述RPA扩增体系的扩增条件为：37-40℃，15-20min。
优选的，所述RPA扩增体系的扩增条件为：39℃，15min。
上述优选的扩增条件，可进一步缩短扩增反应时间，提高检测的灵敏度。
本发明的实时荧光RPA扩增方法能够在疫情现场进行Mccp检测操作，对于山羊传染性胸膜肺炎疫情的防控极其重要。另外，本发明建立的Mccp实时荧光RPA方法，结合具有荧光检测功能的便携式等温扩增仪，可组建Mccp快速检测平台，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖，在基层兽医部门，尤其在野外及疫情现场的山羊传染性胸膜肺炎疫情快速诊断中具有极大的应用潜力。
附图说明
图1是本发明实施例1中的实时荧光RPA方法的特异性检测图谱；其中，1为检测的Mccp的基因组DNA，2-8分别为检测的绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、肺炎克雷伯氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、铜绿假单胞菌的基因组DNA或cDNA；
图2是本发明实施例1中的实时荧光RPA方法的敏感性检测图谱；其中，1-8分别代表模板的拷贝数为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL和100拷贝/μL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.1材料与方法
1.1.1病原和临床样品
山羊支原体山羊肺炎亚种(F38株)、绵羊肺炎支原体(Y98株)、丝状支原体山羊亚种(PG3株)、山羊痘病毒(CVCC AV41株)、肺炎克雷伯氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和铜绿假单胞菌的基因组DNA；小反刍兽疫病毒(Nigeria 75/1疫苗株)的基因组cDNA；均保存于本实验室；
山羊鼻拭子50份，取自河北省不同地区羊场的具有呼吸道临床症状的山羊；
山羊肺脏样品20份，取自河北省羊屠宰场。
1.1.2主要试剂
实时荧光RPA核酸扩增检测试剂盒，购自杭州众测生物科技有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；
TransStart Probe qPCR SuperMix(2×)，购自北京自全式金生物技术有限公司。
1.1.3引物和探针的设计
参考GenBank中山羊支原体山羊肺炎亚种arcD基因的序列(AY529462.1)，设计实时荧光RPA的引物(Mccp-RPA-F、Mccp-RPA-R)和exo探针(Mccp-RPA-P)，扩增片段大小为164bp，引物和探针均由生工生物工程(上海)有限公司合成，同时根据山羊支原体山羊肺炎亚种arcD基因的序列设计出绵羊肺炎支原体的普通PCR引物(arcD-F和arcD-R)以及荧光定量PCR引物和探针(Mccp-arcD-F、Mccp-arcD-R和Mccp-arcD-p)，所述引物和探针的序列见表1。
表1引物和探针序列
1.1.4临床样品基因组提取
将山羊鼻拭子在1mL无菌PBS(pH7.4)中充分涡旋，4℃，12000g离心10min，弃上清，沉淀用于基因组提取；
取山羊肺脏样品，按照1:10比例加入无菌PBS(pH7.4)，充分研磨，制备匀浆液，4℃，12000g离心10min，弃上清，沉淀用于基因组提取；
根据基因组DNA提取试剂盒的使用说明，提取上述临床样品的基因组，并溶解于50μL无核酸酶的ddH2O中，使用ND-2000c核酸浓度测定仪(NanoDrop，Wilmington，USA)进行所提取核酸的浓度测定，并将提取的基因组DNA保存于-80℃备用。
1.1.5实时荧光RPA检测方法
使用检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA试剂盒对病原进行检测，反应体系为：
反应体系中的各组分分别加入反应管中混合，在反应开始之前在反应管盖上加入280mM的醋酸镁，盖上管盖，上下颠倒混匀5-6次，低速离心10s，放入荧光检测仪中进行扩增检测。
1.2方法考察
1.2.1引物特异性检测
以山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、羊痘病毒、肺炎克雷伯氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和铜绿假单胞菌的基因组DNA以及小反刍兽疫病毒基因组cDNA为模板，按照1.1.5中的实时荧光RPA方法进行扩增，反应重复5次。
如图1所示，所建立的实时荧光RPA方法对山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的基因组DNA呈现特异性扩增，而对绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、肺炎克雷伯氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和铜绿假单胞菌的基因组DNA/cDNA没有任何扩增，五次重复结果一致，表明所建立的实时荧光RPA方法具有良好的特异性。
1.2.2引物灵敏性检测
Mccp的arcD基因质粒的构建：以arcD-F和arcD-R作为引物，以Mccp的基因组DNA为模板进行PCR扩增Mccp的arcD基因，反应体系为：2×Taq PCR MasterMix12.5μL，arcD-F和arcD-R(20μmol/L)各0.5μL，模板2μL，ddH2O补足至25μL，反应条件：95℃5min，95℃30s、55℃30s、72℃60s，72℃10min，34个循环，将扩增产物回收，连接PMD19-T simple载体，挑菌测序，送上海生工测序验证；提取质粒，使用NanoDrop2000测定质粒浓度，并通过下列公式计算拷贝数：DNA浓度(拷贝/μL)＝[DNA浓度(g/μL)×10-9]/(DNA长度×340)×6.02×1023。
将上述构建质粒的进行10倍倍比稀释，使其浓度为1.0×107-1.0×100拷贝/μL之间，取1μL不同浓度的质粒作为模板，按照1.1.5中的实时荧光RPA方法进行实时荧光RPA扩增，每个浓度重复5次，以确认该方法的检出限。
结果如图2所示，对于浓度在1.0×107拷贝/μL到1.0×102拷贝/μL之间的模板，5次检测均可检出，浓度为1.0×101拷贝/μL和1.0×100拷贝/μL的模板，5次检测均未检出，五次重复试验结果一致。表明，所建立的实时荧光RPA方法的检出限为1.0×102拷贝/μL。
1.2.3引物的重复性和稳定性检测
以1.0×107-1.0×102拷贝/μL的质粒模板，根据1.1.5中的实时荧光RPA方法进行扩增，每个浓度进行8次重复性扩增，根据起峰时间(TT值)计算组内变异系数；
以1.0×107-1.0×102拷贝/μL的质粒模板，根据1.1.5中的实时荧光RPA方法进行扩增，将上述浓度进行3次重复扩增检测，每个浓度3天检测1次，根据TT值计算组间变异系数，以验证该方法的重复性和稳定性。
上述检测结果如表2所示：
表2实时荧光RPA的重复性试验结果
由表2可知，组内和组间变异系数均小于5％，表明建立的Mccp实时荧光RPA方法稳定，具有良好的重复性。
实施例2
一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：
上游引物：5′-TGGTCATGGATTAGAATCAGTAGCAGC-3′；
下游引物：5′-TAATACCAGCAACAGCAAGAACTAAACATACTC-3′；
所述探针的序列为：5′-CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGT/FAM-dT/C-THF-AC/BHQ1-dT/CTTTAGGAGAAG-C3-spacer-3′。
检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。
上述试剂盒的使用方法为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
其中，RPA扩增体系包括以下试剂及用量：
RPA扩增条件为：37℃，15min。
对实施例1中提取的50份山羊鼻拭子和20份山羊肺脏临床样品基因组DNA分别通过本实施例中的实时荧光RPA方法进行检测。
另外通过与常规实时荧光PCR检测方法同时进行检测，来验证本发明的实时荧光RPA方法的准确性。
其中常规实时荧光PCR方法进行检测所用的引物和探针为：
上游引物：GCGATCTTTTAGGAGTATGTTTAGTTCTT；
下游引物：TGCATACGCGTTACTTTTAATATTCA；
探针：FAM-CTGTTGCTGCTGGTATT-MGB。
实时荧光PCR反应体系和条件为：
TransStart Probe qPCR SuperMix(2×)12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，探针(10μmol/L)1.0μL，DNA模板2μL，ddH2O补足至25μL；反应条件：95℃10s；95℃5s，60℃35s(收集荧光)40cycles。
按照上述方法对70份临床样品进行检测，检测结果为：
实时荧光RPA方法检出37份鼻拭子和8份肺脏组织呈Mccp阳性，13份鼻拭子和12份肺脏组织呈Mccp阴性，该结果与实时荧光PCR方法的检测结果一致。实时荧光RPA方法反应10min即可获得阳性结果，而实时荧光PCR则需要60min才能获得阳性结果。
实施例3
一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：
上游引物：5′-TGGTCATGGATTAGAATCAGTAGCAGC-3′；
下游引物：5′-TAATACCAGCAACAGCAAGAACTAAACATACTC-3′；
所述探针的序列为：5′-CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGT/FAM-dT/C-THF-AC/BHQ1-dT/CTTTAGGAGAAG-C3-spacer-3′。
检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。
上述试剂盒的使用方法为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
其中，RPA扩增体系包括以下试剂及用量：
RPA扩增条件为：39℃，15min。
对实施例1中提取的50份山羊鼻拭子和20份山羊肺脏临床样品基因组DNA分别通过本实施例中的实时荧光RPA方法进行检测。
按照上述方法对70份临床样品进行检测，检测结果为：
实时荧光RPA方法检出37份鼻拭子和8份肺脏组织呈Mccp阳性，13份鼻拭子和12份肺脏组织呈Mccp阴性，且反应5min即可获得阳性结果。
实施例4
一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：
上游引物：5′-TGGTCATGGATTAGAATCAGTAGCAGC-3′；
下游引物：5′-TAATACCAGCAACAGCAAGAACTAAACATACTC-3′；
所述探针的序列为：5′-CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGT/FAM-dT/C-THF-AC/BHQ1-dT/CTTTAGGAGAAG-C3-spacer-3′。
检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。
上述试剂盒的使用方法为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
其中，RPA扩增体系包括以下试剂及用量：
RPA扩增条件为：40℃，15min。
对实施例1中提取的50份山羊鼻拭子和20份山羊肺脏临床样品基因组DNA分别通过本实施例中的实时荧光RPA方法进行检测。
按照上述方法对70份临床样品进行检测，检测结果为：
实时荧光RPA方法检出37份鼻拭子和8份肺脏组织呈Mccp阳性，13份鼻拭子和12份肺脏组织呈Mccp阴性，且反应8min即可获得阳性结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 石家庄海关技术中心
<120> 检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用
方法
<130> 2020
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Mccp-RPA-F
<400> 1
tggtcatgga ttagaatcag tagcagc 27
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Mccp -RPA-R
<400> 2
taataccagc aacagcaaga actaaacata ctc 33
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> Mccp -RPA-P
<400> 3
cttaatcagc tcaattttat tagcaattgt tcactcttta ggagaag 47
<210> 4
<211> 7109
<212> DNA
<213> AY529462.1
<400> 4
tatattaaaa taacaactgc ttcaaatttt ggaaattcat tatcagtttt aattggaaca 60
gtttgattac cattttcacc aatggcacct gctcaaattt tattacaaaa tttaatttat 120
gacttttcac aattcggagt ttcactagat aaagttgatg ctacattttt aacatctcct 180
cagcgatggc aatcaaaaga cctcttacca tttacaacaa ttaatggaac agtaagtaca 240
ttttttgatt taataacatt tgcaattgca ggctattatt ttggttatat tactagttat 300
aataatgcaa ttgcttctag tgatacttca ttagctaaca tatcactagc taaattccat 360
gcttgttgat ttattattgg tttattatct caaacatttg ttttccaagt attgcgtact 420
gaaagactac caataattca atctcgttca acttgacctg tttatgtaat tggagctatg 480
gctacaataa tcgcttttat gattgtttat gtaagtcaaa ttggaaattt ggttcaatta 540
acaagcccgg gattaattta tattcctatt tcaatcacaa tcatttttag ttattgtgta 600
gttgctcaac taactaaaat ggtttataaa aaaatcttta aaaaatgatt ataatcataa 660
aataaataaa ttatttaagt tcaaatacat aagtgtttga actttttatt ttgtctaaaa 720
attaaattat aattttatat tttttaaaga ttgtattatt ttttaaaaaa cctgtgacag 780
tatgtaattt tacctctagt aaaatactag aacaaaactt tgtcttctat ttaaaagtta 840
gtgtgtataa gaataaaaaa ctttgatttt aaagtcaatt taaattggca ctcactgcta 900
ttcacgcttt aaaaattatg ttaaaataaa attagattaa tggcgtttgc cttacatact 960
tgttttttgc acttttgtac ttctaattta ataaattcaa atagtcaaaa aatgatttta 1020
actaataaat tagttaaata attatgatta aatctaaatt taaataataa tactaaaata 1080
taaaaactaa acaatagtct taaaacaatt aataaacttc aaataataat actaaaacta 1140
taaaaaaaga tttataaaga cataaattga aaatttataa atcttaatat tagatctaaa 1200
aatttatttt taaatatttg atcataataa aacataagac tcacaataac aaaaatagtt 1260
gcacttgatg ctaaaaaatt aggagttagt acaaaataca aattagtaaa gtaataacct 1320
tttaaaaact aacattgttg ttctttaaaa cacttaaaat ataaactaat gataaaaaga 1380
caacaactct taaactagta taagaaaagt tagataaata ggataataaa acaccattaa 1440
agaaaattaa caacactaga gttgattata agaaggtgtg tattagatat ggaaaaaaag 1500
ataaatgttt tttctgaaat aggaacttta aaaacggttc ttgttcatag gtcgggagat 1560
gaaattgaaa atttaactcc tgaactttta gaaagattgt tatttgatga tgttcccttt 1620
aaggatgtag ctgttaaaga acatgatgct tttactaaga ttatgcgtga taatggagta 1680
gaagttttat atattgaaaa actagctgca gaaactttag atcaacaccc agacttaaga 1740
gaaaaattta ttgatcaatt tattttagaa gcaaatattg aagataaata taaagaaaaa 1800
taccgcgatt tcattagtag cttagataat tatagaatga ttaaaaaaat gattgctggg 1860
actaaaaagc ttgaattagg tattgatgaa ggatataaag catacccttt tatagcagat 1920
ccgctaccaa atgttttatc caaagagatc cattttcaag tgttggtttt ggaataacaa 1980
tgaatagaat gtgatctgta acaagaaaca gagaaacaat tttccctgat ttagtattta 2040
aacatcacaa tagatttgca aatcaagtgc cttactatta tgaaagagat tgaaaagaag 2100
aaaccattga aggtggagac attttagttt taaataaaga aactttaata attggagtta 2160
ctcaaagaac cacattaaaa gcaattgaaa aatttagtga aagactattt aatgacccag 2220
aatcaagtta tagtaaagtt attgctttag atctctcaaa atctcgtgca tttatgcatt 2280
tagatactgt atttacaaac attgattatg ataaatttat tgctcaccca ttaatttttg 2340
attgcatcga tgagtttaaa atttatgaag tttcaaaaca aggaaccaaa gaagttaaaa 2400
aaacactaat cgaattatta agtgatgcag taggaagaga agttcaaatt attcgatgtg 2460
gtggtaatga tgttgttggt gctagtagag aacaatgaaa tgatggaact aatgttgtag 2520
cattaagacc agctaaagtt attgcttatg aaagaaattg aataacaatt gacttactaa 2580
gaaaagcggg tgttgaagta ttaactattg cttcatcaga attatcgcgt ggtagaggtg 2640
acccaagatg tatgactatg ccactatgaa gagaagattt acaagaaatt aaaagataat 2700
aggtaggatt aaaattatgg ctttaaattt aaaaggtaaa agttttttaa aattattaga 2760
tttttctcca agagaaatta gatatttatt agatttatct agagatttga aaagagcaaa 2820
gtatgctggt aatgaagttc aaacaatgca aggaaaaaac gttgttttac tatttcaaaa 2880
aaattcaact agaactagat gtgcttttga agtagcaaca ttagatcaag gtgctcacgt 2940
tacttattta ggaccatcag gatctcaatt tggtaaaaaa gaatcagtag cagatactgc 3000
aaaagtttta ggtagaatgt atgatgctat tgaatttaga ggatatgagc aaagtgttgt 3060
tgaagatctt gcaaaatatt caggagttcc agtttataat ggattaacta atgaatttca 3120
cccaactcaa attcttgcag attttttaac agttgaagaa tataaaggta atctaaaagg 3180
tctaaaattt gtttttgcag gagatactag aaataacgta gcaacttcac taatggttgg 3240
ttgtgcaaaa atgggaatgc actttgtggg ggctgctcca aaagaactat gaccaagcga 3300
agatttagta aatcaatcta aagaaattgc aaaagaaaca aatgctacaa tttcatttgt 3360
tgaagacatg aaacaagcat gtagtgatgc tgatgtaatt tatactgatg tatgagtttc 3420
aatgggtgaa ccagctgaag tatgagaatc acgtattaac ttattaaaac cattccaagt 3480
taatatggat gcaattaaag ttgctaagcc tgatgtaatt tttatgcact gtttaccatc 3540
atttcatgat ttaaacactg aagttggaag acaaatttat gaaaaatttg gaattcctga 3600
aatggaagtg acaaatgaag tatttgaatc taaacactca gttgtttttg aataagctga 3660
aaatagattt catacaatta aagctgttat ggttgcaaca ataggcaaat aagtatggct 3720
attgaaagac aaaatcataa acaagtagta aaaaagaaaa aaagacaatt taaaatgctg 3780
tctgcattct caatactatt tatcacaatt gctatattag ttttaatatc ttgaatattt 3840
aaatgagcag gggttacagt acaaatttca acagataaag gagtagaaac taaaacaatt 3900
ttagctgttg gtatatttga tttatttaaa gcacctatgc aaggattcat tgatagagct 3960
gaaattatag tctttattct ttctttagga gcatttataa atgtagttgt tgcatcacaa 4020
gctttagaag gattttctca attgatagtt tctaaaatga aaggtaaaga aatttgagca 4080
attgtttcat tgatgatatt ttttggtatt tgtggaactg aagaaggtat ggctgaagaa 4140
tcattaggat tttatatgat atgtattcct ttaatgattg cagctggatt tgataaattt 4200
acaggtttat taattgtttt agttggtgct ggaacaggag ttcttgcttt aactgttaac 4260
ccattcttga ttagtattgc tgttgatagt ttaaataaag caggaaaaat aacaaacact 4320
ggtgatggat tagtttggcg tttagtatct tttatagttt taatgagcat atcaattact 4380
atggttgttc tttataaaaa taaccctgct aaatcaatag tatttaaaac tttagaagaa 4440
gacaaagaat ttttcttatc aaattctact aaaaaaatag aaatgaattt aagaagaaaa 4500
ttaacaattt caatatttgg tgctgcattt ttaataatga tattttatct agtgggatga 4560
gattcaattt taggtaataa aaactctgaa atattagcta actttgttaa agtacacatt 4620
ccatacctaa caggaactga tgatggtttt ggtcatggtg gattagaatc agtagcagct 4680
atattcttaa tcagctcaat tttattagca attgttaact ctttaggaga agaaaaattt 4740
attaaagaat ttatggctgg tgcttgcgat cttttaggag tatgtttagt tcttgctgtt 4800
gctgctggta ttacttgaat attaaaagta acgcgtatgc aagaattatt tgtagcagga 4860
ttacagtcat caataggtgc gattaaatca cctatattaa ttcttttagt aatgttttta 4920
ttatttatcc tattatcatt tttaatccct tcaagtagtg gaatttgcag gtgcagtatt 4980
tccattatta attggtgttg ttttaaaaca acaagatgta ttagcttcag gatcaattac 5040
agcattttca tttgcatcag ggttagttaa cttaattact ccaacaagtg gtgttgttat 5100
gggagttatt gcaattacaa gaatcgatta tggaaaattt gtaaaaggta ttagtccatt 5160
tgtagcagta ttatcagtaa gttcattaac cttattattg ataggtggag caattggtgg 5220
aacaattgca tatattataa ttactcatag taatgacatt caaattaaaa tgattaataa 5280
tgattttaat attggtaata aaactaaatt aaaattttga attttatact tcttttaata 5340
tagttatcaa ttagatacat attgagtatt acttacaaaa gtaattgata atgaattaaa 5400
ccaaagaaaa ttaataaaca gacactaagt gttgctattt aaactttagt aaataaaaat 5460
gaatacagca ttttaaaacc aacttgcacc aggttcaatg cttttaaaag ttcaaattgt 5520
aataatttgt taaaaaataa tggtaaacca acatatatta gttcattaga taaagtttaa 5580
aaagttttaa aaaatctaac tgcaactaaa ttttaaataa taaaaaagta gttattaact 5640
actttataag ttcaaatgtt aatacatttg aactttttta ttatatttaa cttgctttta 5700
gtgattgttc taaagcataa aaagcagtac cgatcattcc ggcatcattt tttaataaag 5760
ctaatttaaa atcaactata tctttatatg aatttgttaa tttatttctt acaccaaatt 5820
caaatagtta taataaatta tttccagcta aagaaccacc atcaataata actacatctg 5880
gatctaaagc atgtattaat aatgacatat gattgaataa ttcattataa acttctaata 5940
aactattttt taactctatt ggtttattta aattgttata gatttcaaat aaaagtttca 6000
tatctaaatt tttaatattt gaaaaatgtt tttgataaaa ttcgggatat ttgttattta 6060
aaatttttaa aagtgagttt ggtatagttg tagctgaaca tactttttca atacaattat 6120
ttaatccaca attgcatttt aaattgtatt gattacttcc accatgtcca aattctccag 6180
caaatccatg tgatcctgaa attagttttc catcagaaat tatagctcca ccaattccag 6240
cccccaatca ataaaataaa cctgatttat aaactaatcc tgatcctttt ttatattcac 6300
caagtgcagc agcattgaca tcattaatta cataaacagg ttttttgaat aaaaattcag 6360
cttcagtttt taaatcataa ttaaatcatc cattttcaat atttggagcc ataactacaa 6420
ttcctttatc atgatcaaca aatccaggag ctgttattcc aactaacata atgttttttc 6480
atctatgttt agtgtcttta aagttttttg aatttcaaaa tataagtttt ctacaatttt 6540
agtttttgaa ttagttatag aaaaactatg ttctaaatct ccgttttgtg aaataattcc 6600
aacttttgct gaagttccac caagatctat tcctaatatt tttttcattt atttccttac 6660
ttattaattt ataatttctt attatcatat tagttctttt agtttttata ttaaaataaa 6720
actaataaaa attaaaaaat taagctagat tatttaatct taaatcttga tataaagcat 6780
caaaaaactc agtttcaact agtttattat gcccagggtg agaagataac attattgtca 6840
ttgtaatttt gtttttagta tcaactaagc cagatgaacc taataatcca tctcatccat 6900
attcaccaac ttcggttagt ggatataatt gatttttaat tctaactctt ccaccaaatc 6960
catagctata atcttcattt aaatttcaat taaaaaattg ttttaagtta tgtttagtaa 7020
gttgatctga tttcatttca tttaatagat ctaatgaaat gaattgagta ttatcttcta 7080
atttaccatc aattaaaacg ttaaaaatt 7109
Claims (9)
1.一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：
上游引物：5′-TGGTCATGGATTAGAATCAGTAGCAGC-3′；
下游引物：5′-TAATACCAGCAACAGCAAGAACTAAACATACTC-3′；
所述探针的序列为：5′–CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGTTC-THF-ACTCTTTAGGAGAAG-3′。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：在所述探针序列中THF的5′端一侧与其最接近的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其最接近的T碱基上标记淬灭基团；对所述探针序列的3′末端进行封闭修饰。
3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为5′-CTTAATCAGCTCAATTTTATTAGCAATTGT/FAM-dT/C-THF-AC/BHQ1-dT/CTTTAGGAGAAG-C3-spacer-3′。
4.一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光RPA试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3任一项所述的引物和探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。
6.权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体操作为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
7.如权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系包括以下试剂及用量：
8.如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系的扩增条件为：37-40℃，15-20min。
9.如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系的扩增条件为：39℃，15min。
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| CN106967840A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-07-21 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量pcr检测引物 |
| CN107083441A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-08-22 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量pcr试剂盒 |
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| CN109666753A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-23 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量pcr引物和探针 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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