CN109790565A - 包含茎-环捕获分子的组合物、方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于检测靶核酸的方法、装置和组合物，其包含具有茎区域和环区域的核酸捕获分子。

Description

包含茎-环捕获分子的组合物、方法和装置
相关申请
本申请要求2016年6月15日提交的美国临时专利申请No.62/350,689和2016年9月1日提交的美国临时专利申请No.62/382,754的优先权，所述专利申请的每一个全文以引用方式并入本文。
参考提交的序列列表
以2017年6月15日创建的名称为“31933_113823_2P1_SeqListing.txt”的文本文件形式于2017年6月15日提交，并且大小为62,305字节的序列表根据37C.F.R.§1.52(e)(5)以引用方式并入本文。
政府许可权利
本发明是根据由化学生物防御局授予并通过国防威胁降低局签订的合同HDTRA1-16-C-0061在政府支持下进行。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
检测特异性核酸的方法在分子生物学、诊断学和医学领域中具有日益增加的重要性。目前存在多种用于检测和鉴定生物样品内的核酸的方法。选择一种方法而不是另一种方法的原因有所不同，并且其中包括试剂或设备的成本或可用性、试剂或设备的可运输性、期望使花费的时间或步骤数最小化、某些应用的精确度或灵敏度、容易分析、自动化该过程的能力、以及待同时靶向的核酸数。
本领域中存在用于检测核酸的多种应用，并且一直在开发新的应用。检测和定量核酸的能力可用于检测和鉴定生物体或病毒，确定生物体中的基因表达水平，或确定小RNA(诸如小干扰RNA(siRNA))的水平，并且因此影响许多领域，包括人类医学和兽医学、食品加工和环境测试。
许多当前可用的核酸检测技术取决于靶序列的扩增，以便实现期望的灵敏度和速度。目前，这些扩增方法中的大多数需要使用需要实验室环境的特定扩增仪器。此外，这些方法通常使用温度敏感性试剂，所述温度敏感性试剂需要适当的储存设备诸如冷藏机或冷冻机，以维持扩增测定中所用的试剂的完整性。因此，生物样品通常远程收集并装运或运输到使用此类核酸扩增方法进行分析的设施中。
遗憾的是，由于前述限制，当前用于核酸检测的扩增方法不可用于需要立即和/或在样品收集位点处对核酸进行灵敏检测的多种环境中。例如，在传染病或流行病爆发期间，能够快速且灵敏地检测不具有可用的适当实验室设施的野外环境中的环境样品或组织、痰、尿液、血液、精液或唾液的生物样品内的传染性细菌、病毒或真菌试剂可能是至关重要的。在另一个示例中，群众和战士都可在接触不到实验室设施的战场环境中暴露于天然存在的或人造的感染剂中。适当的诊断和治疗可能需要在收集样品的此类战场环境中快速且灵敏的检测核酸。当前的扩增方法不容易适用这些类型的环境。
尽管在核酸检测研究方面具有进展，但在实验室外的环境中，诸如在野外环境或冲突环境中，仍然缺乏快速且灵敏地检测核酸的组合物、方法和装置。这些需要和其他需要由本公开满足。
发明内容
根据本公开的目的，如本文所体现和广泛描述的，在一个方面，本公开涉及用于使用包含核酸的捕获分子和标记探针快速且灵敏地检测环境样品或生物样品内的一种或多种靶核酸序列的存在的装置、组合物、试剂盒、方法和系统。
本文公开了包含所公开的捕获分子的组合物。
本文公开了标记核酸探针，其包含标签，所述标签连接到包含所公开的探针序列核酸的核酸。
本文公开了组合物，所述组合物包含本文所公开的捕获分子和本文所公开的标记探针。
本文公开了装置，所述装置包括共价连接到所述装置的表面的至少一种捕获分子。
本文公开了用于检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括使捕获分子与样品的靶核酸结合。
本文公开了试剂盒，所述试剂盒包括下列中的至少一种：(a)核酸捕获分子，该核酸捕获分子包括环区域和茎区域，其中所述核酸捕获分子具有闭合式茎-环结构；并且其中当所述核酸捕获分子接触靶核酸时，所述闭合式茎-环结构被开放式茎-环结构代替；或者(b)标记探针；其中所述标记探针包含连接到所公开的标签的所公开的探针序列；并且其中所述标记探针结合到所述开放式茎-环结构的茎区域；并且任选地包括下列中的一种或多种：(c)温育缓冲液；(d)漂洗缓冲液；(e)最终漂洗缓冲液；以及(f)对下列中一个或多个的说明：将所述核酸捕获分子与样品温育并漂洗所述核酸捕获分子，在添加标记核酸探针之后温育并漂洗，以及最终漂洗然后检测所述标记核酸探针的存在。
虽然本公开的各方面可以特定的法定类别(诸如系统法定类别)进行描述和受权利要求书保护，但这仅是为了方便并且本领域技术人员将理解本公开的每个方面可以任何法定类别进行描述和受权利要求书保护。除非另有明确说明，否则绝无意于将本文所陈述的任何方法或方面理解为要求其步骤以特定顺序执行。因此，在方法权利要求在权利要求或说明书中不具体地说明该步骤被限制为特定顺序的情况下，绝无意于在任何方面推断出一种顺序。这适用于任何可能的非明确的解读基础，包括：关于步骤或操作流程的安排的逻辑问题，从语法组织或标点符号推导的普通意义，或者在说明书中描述的各方面的数量或类型。
附图说明
本发明关于其具体方面进行描述。本公开参考附图进行描述。在附图中，相同的附图数字指示相同或功能上相似的元件。
图1(A)为示出根据本公开的各个方面，附接到基底的闭合式茎-环捕获分子的代表性示意图。
图1(B)为示出根据本公开的各个方面，茎环捕获分子与靶核酸相互作用以形成靶-捕获分子双链体导致茎-环捕获分子改变成开放式构象的代表性示意图。
图1(C)为示出根据本公开的各个方面，开放式茎环捕获分子的代表性示意图，其中结合的靶核酸与标记探针相互作用以形成核酸检测剂。
图1(D)为示出根据本公开的各个方面，在不存在靶核酸的情况下的闭合式茎环捕获分子的代表性示意图。
图2为示出根据本公开的各个方面，来自致肾盂肾炎大肠杆菌(uropathogenicEscherichia coli)总RNA的相对信号随着总RNA微克数(μg)增加(如图所示，从0μg到246μg)而增加的数据的代表性图表(总RNA的浓度如下：A:0μg RNA，B:50μg RNA，C:133μg RNA至D:246μg RNA)。
图3(A)为示出根据本公开的各个方面，基底上的两个捕获分子的可能间距的代表性示意图。
图3(B)为示出根据本公开的各个方面，基底上的两个相邻捕获分子之间可能形成捕获分子二聚体的代表性示意图。
图3(C)为示出根据本公开的各个方面，基底上的两个相邻捕获分子之间的间距增加可防止可能形成捕获分子二聚体的代表性示意图。
图4为示出根据本公开的各个方面，来自多个靶的捕获分子的相对信号的代表性图示，所述靶包括完全互补的靶和两种不同的双错配靶。
图5为示出根据本公开的各个方面，来自多个靶的捕获分子的相对信号的图，所述靶包括完全互补的靶、单错配靶和靶的两个不同截短。
图6为示出根据本公开的各个方面，杂交缓冲液之间的相对信号的改善的图表，其示出添加乙醇的影响。
图7为示出根据本公开的各个方面，当将恒定浓度为100皮摩尔(pM)的核酸靶用于多种杂交缓冲液中时的相对信号的图表。
图8为示出根据本公开的各个方面，在第一杂交期间在存在或不存在添加的靶的情况下的相对信号的图表。
图9为示出根据本公开的各个方面，仅来自缓冲液或来自带具有相同标签的两种不同探针的靶的非特异性信号的图表。
图10为示出根据本公开的各个方面，仅来自缓冲液或来自带两种不同的标记探针的靶的非特异性信号的图表。
图11为示出根据本公开的各个方面，在高度匹配的熔融温度下，来自单独的缓冲液或两种捕获分子的靶的非特异性信号的图表。
图12为示出根据本公开的各个方面，当捕获分子以逐渐减小的捕获分子浓度与基底结合时，两种捕获分子的相对靶-结合信号的图表。
图13为示出根据本公开的各个方面，当捕获分子在不同摩尔比的结合竞争剂的存在下与基底结合时，一个捕获分子的相对非特异性信号和靶-结合信号的图表。
图14示出代表性自身互补双链捕获分子，其命名为结构(I)。
图15示出代表性自身互补双链捕获分子，其命名为结构(II)。
图16示出代表性自身互补双链捕获分子，其命名为结构(III)。
图17示出代表性自身互补双链捕获分子，其命名为结构(IV)。
图18示出代表性自身互补双链捕获分子，其命名为结构(V)。
图19为示出细菌抗生素敏感性的示例性测量的图。
图20为示出细菌抗生素敏感性的示例性测量的图。
本公开的附加优点将部分地在以下说明中阐述，并且将部分地由该说明显而易见，或者可通过实践本公开习得。本公开的优点将通过所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，上述一般性说明和以下具体实施方式仅仅是示例性和说明性的，并不限制所要求保护的本公开。
具体实施方式
通过参考本公开的以下具体实施方式和其中包括的实施例，可更容易地理解本公开。
定义
如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“捕获分子”、“靶核酸”或“标记探针”包括两种或更多种此类捕获分子、靶核酸或标记探针等的混合物。
过渡术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含性的或开放式末端，并且不排除附加、未列举的元素或方法步骤。另外应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。如说明书和权利要求中所用的，术语“包括”可包括“由…组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开组合物和方法所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和随后的权利要求书中，将提及多个术语，所述术语应当如本文所定义的。过渡短语“由…组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分，但不排除与本公开无关附加组分或步骤，诸如通常与组合物相关联的杂质。
过渡短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及不实质上影响权利要求保护的发明的基本和新型特征的那些材料和步骤。
除非另有明确说明，否则绝无意于将本文所陈述的任何方法理解为要求其步骤以特定顺序执行。因此，在方法权利要求实际上未叙述其步骤所遵循的顺序或者在权利要求或具体实施方式中没有另外具体说明步骤被限制为特定顺序的情况下，绝无意于在任何方面推断出一种顺序。这适用于任何可能的不明确的解释，其包括：关于步骤或操作流程的布置的逻辑问题；由语法组织或标点符号得出的普通含义；以及说明书中所述的实施方案的数量或类型。
在本文中，范围可被表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，其他方面包括从一个特定值和/或到其他特定值。相似地，当采用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成了其他方面。还应当理解，每个范围的端值相对于另一个端值以及独立于另一个端值都是有意义的。还应当理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，还公开了在两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
如本文所用，术语“约”、“近似”和“为或约”意指所考虑的量或值可以是指定的确切值或提供与权利要求中列举的或本文所教导的等同结果或效果的值。即，应当理解，量、大小、制剂、参数和其他量和特征不是且不必是精确的，但根据需要可以为近似和/或更大或更小，从而反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等、以及本领域技术人员已知的其他因素，使得获得等同的结果或效果。在一些环境下，不能合理地确定提供等同结果或效果的值。在这种情况下，一般应当理解，除非另外指明或推断，如本文所用，“约”和“为或约”意指指示±10％变化的标称值。一般来讲，量、大小、制剂、参数或其他量或特征为“约”、“近似”、或“为或约”，无论是否对此类量或特征进行了明确说明。应当理解，除非另外特别说明，在定量值之前使用“约”、“近似”或“为或约”的情况下，所述参数还包括其具体数值本身。
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。
如本文所用，术语“试剂”是指感兴趣的生物试剂，其包括病毒、细菌、真菌、原生动物、动物、癌细胞、血细胞或其他细胞或颗粒实体，诸如小RNA复合物或其他核酸，其具有或不具有蛋白质或其他分子。
如本文所用，术语“改变互补性”是指在其他互补序列中产生一个或多个凸起或错配的碱基。
如本文所用，术语“施加磁场”是指使磁体靠近样品或接通电磁体使得样品经受磁场的力。
如本文所用，术语“附接”意指偶联在一起，或在两个化学或大分子实体之间形成化学键。
如本文所用，术语“结合的”是指在两个核酸之间形成双链复合物，并且可被称为“杂交的”，如分子生物学技术人员所理解的。例如，当双链复合物在捕获分子和探针之间形成时，核酸捕获分子“结合”到核酸探针。在另一个示例中，当双链复合物在捕获分子和靶之间形成时，核酸捕获分子“结合”到核酸靶。
如本文所用，术语“捕获分子”、“捕获分子核酸”、“核酸捕获分子”、“茎-环捕获分子”可互换使用，并且是指可附接到基底的核酸。捕获分子由三个主要区域组成：第一茎区域、环区域、和第二茎区域。
如本文所用，术语“闭合茎-环结构”和“闭合茎-环”可互换使用，并且是指第一茎区域(例如5'茎区域序列)与第二茎区域(例如3'茎区域序列)结合以将捕获分子折叠成发夹形式。基本上闭合式茎环结构意指大于百分之五十(50％)的茎环分子在两个茎环区域之间(即5'茎区域序列和3'茎区域序列之间)具有双链体形成。
如本文所用，“互补核酸”或“核酸互补”是指一个核酸链中的碱基序列，所述碱基序列由于其官能团的取向，与相对链中的碱基序列结合，例如通过氢在A和T或U碱基之间，以及C和G碱基之间键合。完全互补意指可与第二序列形成双螺旋的序列，其中所得的双螺旋不包含错配。基本上互补意指一条链中的碱基序列与相对链中的碱基序列不完全或完全互补，但是在两条链的碱基之间发生足够的键合以在一组条件下(例如，水溶液中的盐浓度或温度)形成稳定的杂交复合物此类条件可通过以下方法来预测：使用本领域技术人员已知的碱基序列和标准数学计算以确定50％杂交链变性的熔融温度(Tm)，或通过使用常规方法通过对Tm进行经验确定(例如，参见，Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，在9.50-51、11.46-49、11.55-57处)。
如本文所用，术语“产生颜色的缀合蛋白质”是指蛋白质，诸如辣根过氧化物酶，其可催化生色化合物转化为有色产物或在作用于化学发光化合物时产生光。
如本文所用，术语“荧光团”是指在暴露于具有激发波长的光时，分子可发射具有限定波长的荧光。
如本文所用，术语“平均闭合式捕获分子长度的一半”是指施用于基底的多个捕获分子的分子长度的算术平均值。
如本文所用，“杂交条件”是指其中一条核酸链通过互补链相互作用与第二核酸链结合以产生杂交复合物的累积环境。此类条件包括，例如，温度、包含核酸的水性和/或有机溶液中的化学组成和化合物(例如，盐、缓冲液、螯合剂、有机化合物)的浓度。
如本文所用，术语“抑制核酸酶活性”是指使能够裂解核酸中的磷酸二酯酶键的酶失活。被抑制的核酸酶可以为外切核酸酶或内切核酸酶。
如本文所用，“标签”是指可检测或直接或间接地产生可检测响应(例如通过催化产生信号的反应)的分子部分。标签包括发光部分(例如荧光、生物发光或化学发光化合物)、放射性同位素、结合对的成员(例如，生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)、酶或酶底物、活性基团或发色团，例如，产生可检测颜色的染料或颗粒。可检测响应或信号是指示标签存在的任何可感知或可测量的输出，例如，光、颜色、放射性衰变发射、电信号、磁场或诸如由于淬灭或浊度的信号遮挡。
如本文所用，术语“标记探针”和“核酸探针”可互换使用，并是指与捕获分子的第一茎区域(例如，5'茎区域序列)或第二茎区域(例如，3'茎区域序列)的序列的一部分互补的核酸，所述部分仅在靶核酸与捕获分子结合时暴露。
如本文所用，术语“锁定核酸”或“LNA”是指其中核糖体环以理想构象锁定以形成双螺旋的核苷酸类似物。
如本文所用，术语“环区域”是指核酸捕获分子的序列，其在茎区域(5'茎区域序列和3'茎区域序列)之间并且与靶核酸的至少一部分互补。
如本文所用，术语“核酸的熔融温度”、“熔融核酸”或“熔融双链体”可互换使用，并且是指其中一半核酸将结合到其互补序列，并且相反，双链核酸分子的一半核酸处于单链状态的温度。例如，“靶核酸的熔融温度”是指可将靶核酸群的一半结合到捕获分子的温度。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有小于约100纳米的平均粒度的颗粒。纳米颗粒可用核酸、蛋白质或其他分子官能化。
如本文所用，术语“核酸”是指如本文所述的分子，诸如DNA、RNA、LNA或PNA分子，或包含DNA、RNA、LNA和/或PNA的组合的分子。此外，应当理解“核酸”包括其他类型的DNA类似物，RNA类似物，以及技术人员已知的混合的DNA-RNA聚合物或低聚物，其由至少两个核酸碱基组成，或通过主链结构连接的十个或更多个碱基。DNA和RNA可由常见碱基或核苷酸组成(就DNA而言，A、T、G和C，并且就RNA而言，A、G、C和U)，但碱基类似物(例如肌苷)和无碱基位置(即，在一个或多个位置处缺乏核苷酸的磷酸二酯主链，参见美国专利5,585,481)也包括在这些术语中。本文所公开的核酸或核苷酸包括用作核苷酸或在核酸聚合物中起作用的分子，其包括但不限于，核酸，诸如DNA和RNA的已知形式，以及多种核酸类似物，诸如PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-木糖-LNA、α-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、二环-DNA、6-氨基-二环-DNA、5-ε-二环-DNA、α-二环-DNA、三环-DNA、二环[4.3.0]-DNA、二环[3.2.1]-DNA、二环[4.3.0]酰胺基-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-来苏吡喃糖基-NA、2'-R.亚.1-RNA、2'-OR1-RNA(R1为任何取代基)、α-L-RNA、α-D-RNA、β-D-RNA等，诸如能够与互补核酸链特异性杂交的那些。例如，美国专利公布20100068704或WO/2017/045689中教导的核酸结构诸如核苷酸类似物可存在于本发明所公开的核酸聚合物中。(参见Pentabase，500 Odense，Denmark)。
如本文所用，“核酸主链”是指本领域中已知的基团或键(Eschenmoser，1999，Science 284:2118-2124)，例如，糖-磷酸二酯键、2'-O-甲基键、DNA中的胍接头(“DNG”)、S-甲基硫脲接头、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、酰胺主链修饰如以聚酰胺或肽核酸(PNA)形式、硫代磷酸酯键、膦酸酯核酸键、吡喃糖基寡核苷酸键、双环和三环核酸键、甲缩醛和3'-硫代甲缩醛键、吗啉代键、或天然磷酸二酯核苷间键的其他修饰、或它们的组合，如本领域中所熟知的。例如，参见Majlessi等人，1998，Nucl.Acids Res.26(9):2224-2229；Dempcy等人，1995，核酸主链可包括相同低聚物或聚合物中的键的混合物(例如，链中的一个或多个糖-磷酸二酯键和一个或多个2'-O-甲基键)，或可在整个链中具有相同键(例如，全部均为2'-O甲基或全部均为酰胺修饰键)。
如本文所用，术语“核酸检测剂”是指如本文所公开的可检测部分。此类可检测部分或标签可与捕获分子、探针分子或两者缔合。可检测部分或标签用于但不限于：(a)系统，该系统用于指示靶核酸存在，例如使用捕获分子和标记探针，其中如果捕获分子已经与靶核酸杂交，则所述标记探针与捕获分子结合；(b)方法，该方法确定靶核酸的存在，例如使用捕获分子和标记探针，其中如果捕获分子已经与靶核酸杂交，则所述标记探针与捕获分子结合；(c)包含捕获分子的组合物或一个或多个捕获分子，其可在本文所公开的方法、装置和/或系统中用于检测核酸，诸如靶核酸，或(d)装置，该装置包括至少一种附接到基底的捕获分子，以及任选地探针，例如标记探针，如果捕获分子已经与靶核酸杂交，则所述探针与捕获分子结合。
如本文所用，术语“开放式茎-环结构”和“开放式构象”可互换使用，并且是指在靶核酸结合到捕获分子之后，所述捕获分子的构象，其通过释放茎区域彼此之间的结合并使捕获分子在一定程度上直链化而破坏捕获分子的发夹形成。由捕获剂结合靶核酸导致捕获剂的茎区域可用于探针分子的结合。
如本文所用，术语“顺磁性微珠”是指直径为1×10-1至1×103μm的小珠，其包括顺磁性芯和可用核苷酸或蛋白质官能化的外涂层。顺磁性微珠具有通过与施加的磁场对准而响应，并且当移除施加的磁场时丧失其对准的能力。顺磁性微珠既不经历滞后也不经历残余磁化(对准)。当移除场时，顺磁性微珠消磁并再分散于介质中。这允许快速且高效的漂洗，从而导致低背景和良好的再现性。无论先前的磁化循环如何，顺磁性微珠的行为都是相同的。
如本文所用，术语“肽核酸”和“PNA”可互换使用，并且是指其中天然糖-磷酸酯主链已被合成肽主链代替的核苷酸类似物。
如本文所用，术语“探针互补区域”指是与探针互补的捕获分子上的序列。
如本文所用，术语“量子点”是指包含直径为数纳米级的半导体材料的晶体的组合物。量子点具有将入射光转换成特定波长的发射光的特征性能力。
如本文所用，术语“漂洗”以其一般理解的定义使用。诸如，在捕获分子与不包含其他反应元素(诸如核酸靶或核酸探针)的介质接触的步骤中。
如本文所用，术语“样品”是指潜在地包含至少一种靶核酸的混合物。混合物可以为同质或异质的，并且可以呈固体或液体形式。为固体(例如粉末)的样品可在用于所公开的方法之前增溶或提取。所述样品可包含含有靶核酸的试剂、在取样时不位于试剂内的靶核酸、或上述两者的组合。样品的来源可以为，但不限于，环境、人、植物、微生物或动物，并且例如，可包括体液、组织或人、植物、微生物或动物的其他部分。
如本文所用，术语“自身互补双链结构”是指可形成双链结构的核酸序列的长度。
如本文所用，术语“小有机分子”是指一般被理解为具有小于约5,000道尔顿的分子量的含碳化合物。
如本文所用，术语“茎区域”是指核酸捕获分子的5'序列和/或3'序列，例如5'茎区域序列可与3'茎区域序列互补并且可与3'茎区域序列形成双链复合物。
如本文所用，术语“基底”或“载体”是指捕获分子可附接于其上的装置上或内的表面，例如，显微镜载玻片、板孔、微流体室、纤维、金属丝、颗粒、小珠、基质等。基底可由多种材料制成，例如，玻璃、硝化纤维、尼龙、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯、顺磁性材料和磁性材料。
如本文所用，术语“靶-捕获分子双链体”是指其环节段的至少一部分结合到靶核酸的互补部分的捕获分子。
如本文所用，术语“靶核酸”和“靶分子”可互换使用，并且是指包含靶序列的核酸，所述靶序列可结合到捕获分子的互补序列，并且因此使用所公开的核酸和方法检测到。靶序列可以为所公开的靶序列。
组合物
在一个方面，本公开涉及可用于快速且灵敏地检测环境样品或生物样品内的一个或多个靶核酸序列的存在的组合物。
在一个方面，本公开涉及组合物，所述组合物包含一种或多种探针，例如标记探针，所述标记探针包含连接到核酸探针的已知或公开的标签，例如，包含所公开的探针序列。使用具有茎区域的多个捕获分子(其中其茎区域的至少一部分具有相同序列)允许使用具有可结合到所有可用茎区域的互补序列的标记探针，例如不考虑捕获分子的环区域的序列，结合到捕获分子的暴露的茎区域的“通用标记探针”。因此，通用标记探针与测定一起使用，其中所有标记探针均具有相同序列。使用通用标记探针通过仅需要制备单个标记探针序列而简化了检测过程。如本文所用，“通用探针”意指无论其是否标记，均能够结合到多个捕获分子的茎区域序列的探针。
在一个方面，可检测标签可连接到包含探针序列的核酸的5'端、3'端、或5'端和3'端两者。在一个方面，可检测标签为但不限于放射性核素、荧光团、量子点、标记纳米颗粒或产生颜色的缀合蛋白质。核酸序列的可检测标签是本领域技术人员已知的。可使用适用于所用标签类型的测量装置或测定来检测可检测标签的存在。在一个方面，可使用在两个或更多个频率下吸收激发和/或发射荧光的两种或更多种放射性核素或两种或更多种荧光团来检测多个靶核酸。
在一个方面，本公开涉及包含捕获分子的组合物。在一个方面，捕获分子为具有环片段序列的核酸结构，所述环片段序列与靶核酸的至少一部分互补，并且所述环片段序列可在测定条件下与靶核酸序列的至少一部分杂交。在一个方面，捕获分子与靶核酸的杂交将捕获分子保持在开放式构象，所述开放式构象使捕获分子的末端部分暴露于标记探针。在一个方面，仅在捕获分子已经与靶核酸杂交时，标记探针能够与茎区域中的捕获分子的暴露末端部分杂交。在一个方面，标记探针结合到可通过外部检测方法检测的标签。
在一个方面，除了核酸环片段之外，捕获分子包括两个茎区域，5'茎区域和3'茎区域，其彼此互补并且一般来讲，一个茎区域附接到环序列的一端，使得捕获分子以从5'到3'的顺序包括茎区域-环区域-茎区域。茎-环结构是本领域技术人员已知的。两个茎区域可杂交以形成茎，从而使捕获分子形成为发夹形状。在一个方面，捕获分子通过连接分子附接到基底，所述连接分子在未连接到环部分的第一茎区域的末端处连接到第一茎区域。在一个方面，捕获分子的第二茎区域(其不结合到连接分子)包括具有与标记探针互补的核酸序列的区域。在一个方面，捕获分子包括核酸结构，所述核酸结构具有以下区域，例如在5'至3'方向上包含连接分子-第一茎区域-环区域-具有与标记探针互补的序列的第二茎区域。
在一个方面，通用阴性对照捕获分子是具有环区域序列的捕获分子，所述环区域序列不与任何已知的天然存在的靶核酸，例如SEQ ID NO.160互补。如可以理解的，在特定测定中，通用阴性对照捕获分子的序列可被设计成不与特定测定的预期靶核酸结合。在测定中，阴性对照捕获分子将不与靶分子结合，因此标记探针将不特异性结合到捕获分子的茎区域。阴性对照捕获分子用于示出通过靶分子的随机结合不发生。在一个测定和一系列测定中，在测量标记探针的背景随机结合时，通用阴性对照捕获分子还用作阳性对照。因为靶分子不结合到通用阴性对照捕获分子，所以例如在结合的通用阴性对照捕获分子的位置处检测到的任何标签均为背景、低水平、由标记探针结合。该低水平背景检测标签用作测定内的对照点，使得标签的这种差别量可与针对特异性结合观察到的标签量区分开来，另外如果未观察到标签，则该测定可能未按要求起作用。此外，通用阴性对照捕获分子用作对所执行的测定的特异性和精确性的对照，以获得测定的均一反应测量。例如，各自使用相同通用阴性对照捕获分子的一系列测定应当记录通用阴性对照捕获分子的非特异性结合的相似水平，从而确保测定的可重复且可靠的测量。
在一个方面，对于每种类型的捕获分子，存在特异性阴性对照捕获分子，因为该阴性对照不结合靶分子。例如，参见SEQ ID NO.167和168。特异性阴性对照捕获分子具有与其捕获分子相同热力学特征(就此而言，特异性阴性对照捕获分子是阴性对照)，但阴性对照捕获分子不与靶核酸序列结合或杂交。因此，当存在靶序列时，阴性捕获分子不被标记探针结合。
所谓“一种类型的捕获分子”，意指与该类型中的每一个其他捕获分子一样具有靶结合序列中(在捕获分子的环节段中)的相同核酸序列的一类捕获分子的集合。如本文所用，相关类型的捕获分子意指相关类型的捕获分子不具有相同靶结合核酸序列，但捕获分子的相关之处在于该类型可结合到来自相同病原体或生物体的靶序列的不同序列，或可结合到相关不同病原体或生物体的不同序列。例如，一组三种类型的相关捕获分子可结合到特定病原体的靶序列使得第一类型的相关捕获分子(捕获分子环中的靶序列结合序列)更靠近靶序列的5'端结合，第三类型的相关捕获分子(捕获分子环中的靶序列结合序列)更靠近靶序列的3'端结合，并且第二类型的相关捕获分子(捕获分子环中的靶序列结合序列)在第一和第三相关类型之间结合。另选地，一组三个相关捕获分子可各自结合到相同病原体，但每一个结合到病原体的不同亚型或者菌株。
在一个方面，可标记捕获分子。例如，捕获分子可具有作为一对起作用的两个荧光分子或发色团分子，其中一个为荧光体，并且另一个分子为淬灭剂。该对用于荧光共振能量转移(FRET)，其为描述两个光敏分子(发色团)之间的能量转移的机制。最初呈其电子激发态的供体发色团(荧光体)可将能量转移到受体发色团(淬灭剂)。这种能量转移的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比，从而使FRET对距离的微小变化非常敏感。FRET效率的测量可用于确定两个荧光团是否在彼此的特定距离内。测量受激发荧光体分子的存在指示淬灭剂分子足够远，使得淬灭剂不能吸收转移的能量。
在一个方面，标记捕获分子包含FRET对，其中荧光体附接到一个茎序列，并且淬灭剂分子附接到互补茎序列。当茎序列彼此结合时，荧光体靠近淬灭剂分子，并且未检测到荧光。当捕获分子结合靶核酸时，茎序列彼此分开，并且因为淬灭剂分子不再靠近所以可检测到荧光体的荧光。这可称为捕获分子呈开放式构象。在一个方面，可将检测增强分子或标记检测分子添加到呈开放式构象的捕获分子。在此类检测增强分子结合到捕获分子的情况下，荧光体的荧光可更容易地并且在更低水平下检测到。
在一个方面，为了起到快速测定的作用，捕获剂可被设计成使得闭合式发夹结构的稳定性与靶-捕获剂双链体的稳定性平衡。在一个方面，单独捕获剂彼此间隔开捕获分子的闭合式发夹长度的至少一半。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但理论上认为此类间距允许每个捕获剂独立于其相邻者作用并防止形成捕获剂二聚体(如图3(C)所示)。
在一个方面，一般参见图1A-1D，核酸检测剂和方法包括捕获分子10和标记探针20以确定样品内靶核酸30的存在。如图1A所示，捕获分子10可通过接头11附接到基底18，并且可具有第一茎区域12、环区域14和第二茎区域16。如图1C所示，标记探针20可用一个或多个标签22标记。如图1C所示，靶核酸30可具有与捕获分子10的环区域14的互补区域32。
在一个方面，如图1A所示，捕获分子10可在其茎区域中一者的末端结合到基底18时形成茎-环结构。捕获分子10由三个主要区域，第一茎区域12、环区域14和第二茎区域16构成。
在一个方面，如图1B所示，如果靶核酸30存在于样品内，则靶核酸30与捕获分子10的环区域14杂交。如果靶核酸30在互补区域32中包含与存在于捕获分子10的环区域14内的序列互补的核酸序列，则靶核酸30与捕获剂10的环区域14杂交。当捕获分子10结合到靶核酸30时，则捕获分子10变成其开放式构象并且不再处于闭合式茎-环(发夹)构象。如图1D所示，不结合到其靶核酸的捕获分子10保持其闭合式茎-环构象。如图1C所示，靶核酸30的互补区域32与捕获分子10的环区域14的互补序列的结合打开茎区域并且标记探针20结合到捕获分子10的茎区域16。当靶核酸30结合到捕获分子10时，茎区域16的结合部分暴露并且能够结合标记探针20。
在一个方面，使用特定测定条件，捕获分子10中的环区域14中的核酸序列中的一部分特异性结合靶核酸30的核酸序列中的一部分，其中互补区域32的序列和环区域14的序列的互补性为100％，并且不存在不具有100％序列互补性的靶核酸30与核酸的结合。在一个方面，捕获分子10可区分靶核酸30中的单核苷酸多态性(SNP)。在一个方面，发现为了实现SNP区分，捕获分子10可在低于捕获分子10的茎-环发夹结构的熔点和低于靶-捕获剂双链体的熔融温度的条件下与靶核酸30接触。在一个方面，在第一杂交步骤期间保持捕获剂的茎-环结构导致捕获剂的茎-环结构被靶-捕获剂双链体代替。结构形式的交换(从茎区域结合到靶序列与环序列的结合)增加了捕获分子10对其完全(100％)互补靶核酸的特异性，从而确保了SNP区分。
在一个方面，捕获分子10的环区域14的核酸序列中的一部分特异性结合到靶核酸30的互补区域32的核酸序列的一部分，其中互补区域32的序列和环区域14的序列的互补性为50-99％、或50％至100％、或50％、或55％、或60％、或65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或86％、或87％、或88％、或89％或90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或100％，以及其间的百分比。
在一方面，预料不到地发现通过在靶序列与环序列的初始杂交步骤中使用包含干扰稳定核酸双链体形成的缓冲液的条件，可缩短执行本文所公开的方法所需的时间。该结果是预料不到的，这至少是因为预期不到缓冲液干扰双链体形成的能力允许时间减少，而是预期可能需要较长的时间。在一方面，预料不到地发现通过引入干扰稳定核酸双链体形成的缓冲液的茎-环捕获剂方法，可增加由特定量的靶产生的信号。该结果是预料不到的，这至少是因为预期不到缓冲液干扰双链体形成的能力允许信号增加，而是预期将观察到更少的信号。在一个方面，此类缓冲液允许靶核酸和捕获剂快速地对预期结合的配偶体进行取样，并且有利于优先仅在序列完全互补时建立稳定的靶-捕获剂双链体，因此还有助于结合的特异性。在一个方面，选择合适的缓冲液允许在少至十(10)分钟内发生结合。
在一个方面，包含非离子表面活性剂的缓冲液需要较长的时间用于双链体形成，并且使本文所公开的方法较不起作用。例如，在相同量的时间内更少的靶分子结合到捕获剂，或需要更多时间将相同量的靶分子结合到捕获剂。
发现特定缓冲液缩短了检测与标记探针结合的捕获分子所需的时间，并增加测定的特异性和可重复性，特别地讲用于杂交步骤中的缓冲液，例如，在靶序列结合到互补环序列的情况下，和/或在探针结合到捕获分子的茎区域的情况下。在一个方面，包含浓度为0.005体积/体积％至0.2体积/体积％的离子表面活性剂(诸如十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液需要更短的时间用于双链体形成。在一个方面，包含浓度为5体积/体积％至30体积/体积％的乙醇、浓度为0.10M至1.0M的二甲基亚砜(DMSO)的缓冲液需要更短的时间用于双链体形成。在一个方面，第一温育缓冲液需要约10分钟用于双链体形成。用于更快速检测与标记探针结合的捕获分子的缓冲液包括但不限于包含离子表面活性剂的缓冲液、包含浓度为0.005体积/体积％至0.2体积/体积％的十二烷基硫酸钠的缓冲液；包含浓度为5体积/体积％至30体积/体积％的乙醇的缓冲液；包含浓度为0.10M至1.0M的二甲基亚砜(DMSO)的缓冲液；以及它们的组合。
在一个方面中，已经确定了有助于快速且特异性SNP区分的捕获分子10的结构参数。已经研究了环序列与相似茎序列的超过50种实验组合。在一个方面，可在环区域14内形成自身互补双链结构的具有环区域14的某些部分，长度下限为2个核苷酸的捕获分子10在大约室温(大约23℃或74℉)下形成稳定的茎-环结构。大约在该范围内意指加或减5℃。在一个方面，SamecA1捕获分子表现出在室温下对标记探针的低背景结合。预测SamecA1捕获分子(SEQ ID NO：19)，表I中所示序列，具有如图14所示的折叠结构，其中图14的5’左侧上的16个碱基对形成茎区域，并且剩余的核苷酸形成该捕获剂的环区域。括号中的核苷酸是可形成图14中所示的自身互补双链结构(I)的环序列。
相比之下，发现在环内具有该自身互补双链结构的一些捕获剂示出对标记探针的高非特异性结合，这是由于由捕获剂形成的交替结构允许茎区域中的游离端即使在没有结合靶序列时也被标记探针结合。发现此类捕获剂能够错误折叠并留下悬挂末端，标记探针可在不存在靶核酸的情况下结合到所述悬挂末端。例如，预期捕获剂Sau71(SEQ ID NO:21)(序列在表I中列出)具有折叠结构，其中括号中的核苷酸为环序列，所述环序列可形成图15中所示的自身互补双链结构(II)，但还形成图16中所示的结构。图16中带下划线的序列示出能够在不存在结合到环区域的靶序列的情况下非特异性结合互补标记探针的序列。
在一个方面，捕获分子10中的核苷酸可选自Watson-Crick核酸、锁定核酸或肽核酸的组。在一个方面，捕获分子的茎可被设计成包含两个LNA C核苷酸(表示为+C)。例如，可将诸如捕获剂Pos1-C2(SEQ ID NO：3)设计成包含两个LNA C核苷酸(表示为+C)。
在一个方面，第一茎区域12包含一个或多个互补序列，所述互补序列可与第二茎区域16形成双链茎区域，由此形成呈大体发夹形状的茎-环结构。远离环区域14或在环区域远端的第一茎区域12的末端可被认为是对基底18的附接位点，并且可以为捕获分子10的5'或3'端。在一个方面，第一茎区域12和第二茎区域16的长度一般介于大约8个和大约20个核苷酸之间。在该范围内大约意指加或减百分之二十(20％)。在一个方面，第一茎区域12和第二茎区域16不必要为相同长度或数目的核苷酸。在一个方面，如果第一茎区域12和第二茎区域16不是相同长度或数目的核苷酸，则可以在远离环的末端上形成一个或多个单链核苷酸的悬垂部分。在一个方面，此类悬垂部分可用于使捕获分子10的茎-环结构稳定或不稳定。
在一个方面，环区域14包含与靶核酸30互补的序列。在一个方面，与靶核酸30互补的捕获分子10中的区域可延伸超过环区域14进入第一茎区域12或第二茎区域16，或者两者中，这提供较长的靶-结合区域但不增加环区域14的长度，因此增加捕获分子10对其靶核酸30的特异性。
在一个方面，方法、系统或装置可包括数种类型的捕获剂，其中每种类型的捕获分子包括多个捕获分子，使得每种类型的捕获分子具有与靶核酸互补的环区域序列，所述环区域序列不同于与另一捕获分子靶核酸互补的环区域序列。在一个方面，可将每种类型的捕获分子施用并结合到其自身在基底上(诸如在微阵列上)的地理位置。可对一种或多种类型的捕获剂执行检测方法以检测相同样品中的多个靶核酸。一种或多种类型的捕获剂中的每种捕获剂在捕获分子10的第二茎区域16的序列中具有相同部分，所述部分仅在靶核酸30与捕获剂结合时暴露，并且所述部分与标记探针20互补。以这种方式，可使用一个标记探针，其具有与捕获分子中的每一个互补的序列，例如通用检测剂或探针。
在一个方面，包括捕获分子的方法使用标记探针来进行，所述标记探针具有与其互补的第二茎区域相同长度。然而，据发现，在一些情况下，具有与该茎相同长度的标记探针即使在不存在靶核酸的情况下也可结合到捕获剂。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但据信第一茎区域结合到第二茎区域的能量与第二茎区域对标记探针的结合几乎相同。提出如果标记探针对其在捕获剂上的结合位点的结合能等于或高于第一茎区域对第二茎区域的结合能，则在不存在靶核酸的情况下，标记探针可结合到捕获剂。此外，已认识到可通过改变其长度或标签来修饰标记探针以减小其与第二茎区域的结合能，使得其可优先仅与第二茎区域由于靶核酸的结合已经暴露的捕获剂结合。已发现就本文所公开的方法而言，探针中的互补区域和茎区域的热力学稳定性比两个茎区域彼此之间的热力学稳定性更低。该稳定性的一个方面在于与茎区域的序列互补的探针序列的数目小于茎区域的互补序列数，不考虑探针的总长度或茎区域的长度。
在一个方面，标记13个核苷酸的核酸探针，和具有与13个核苷酸探针互补的十六个互补核苷酸的第一茎区域和第二茎区域的捕获剂导致在不存在捕获剂互补靶核酸的情况下，标记13个核苷酸探针不有效结合到捕获分子的茎区域，而是快速结合到已经结合其靶核酸的捕获剂的茎区域。在一个方面，本文公开了捕获分子，所述捕获分子具有茎区域，所述茎区域与标记探针互补，但包含比探针分子多1-6个的核苷酸、或多一个的核苷酸、或多两个的核苷酸、或多三个的核苷酸、或多四个的核苷酸、或多五个的核苷酸、或多六个的核苷酸、或多更多个的核苷酸。例如，捕获分子的茎区域可包括15个核苷酸长度的茎区域和与茎区域的一部分互补的12个核苷酸长度探针。取决于测定，探针可以或可以不标记，并且一个或多个标签的位置(例如，在捕获剂或探针上)可由本领域的技术人员确定。
在一个方面，捕获分子的茎区域可各自包含核酸，所述核酸包含约10至约20个核苷酸。在一个方面，本文所公开的探针分子可包含核酸聚合物，所述核酸聚合物包含约8至约18个核苷酸。在一个方面，探针分子可以比捕获分子的茎区域更长或更短，即包含更多或更少的核苷酸。茎区域可具有少于10个核苷酸，并且可具有超过20个核苷酸，并且茎区域的设计在本领域技术人员的技能内。
在一个方面，可检测标签为荧光标签。在一个方面，标签可基于疏水性程度和荧光部分上的电荷来选择以便抑制非特异性复合物。在一个方面，标签不具有净正电荷。在一个方面，标签不具有净+1、+2或+3电荷。在一个方面，标签具有净负电荷。在一个方面，标签具有净-1、-2或-3电荷。在一个方面，标签具有小于Alexa 647或与Alexa 647约相同的疏水性。虽然不希望受特定理论的束缚，但据信具有大于Alexa 647或与Alexa 647约相同的疏水性的带净正电荷的标签可沿捕获剂结合于其上的疏水性基底接近带负电荷的核酸捕获剂，从而即使在不存在靶核酸结合的情况下也与所有捕获剂结合。
在一个方面，本发明所公开的标签为Alexa 647(Alexa647,Invitrogen，Thermo Fischer Scientific Inc.，Waltham，MA)。在一个方面，标签为Alexa 647。在一个方面，标签为荧光分子ATTO 647N(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。在一个方面，标签为ATTO647N。在一个方面，标签不是ATTO 647N。在一个方面，标签可基于疏水性程度和荧光部分上的电荷来选择以便抑制非特异性复合物。
在一个方面，将标记探针的长度缩短至小于第一茎区域和第二茎区域的全长的一个结果是其使环附近的茎末端处的核苷酸游离从而不再被约束成通用标记探针结合序列的一部分，这意指那些序列可成为靶-结合序列的一部分。然后可将捕获剂设计成使靶核酸结合到第一茎区域或第二茎区域或两者中，从而在相同大小环的情况下形成较长的互补靶结合序列。
在一个方面，所述捕获剂为具有表I中列出的序列的Ec632(SEQ ID NO:1)。在一个方面，靶-结合区域是结构(IV)的整个括号内区域，如图17所示。然而，结构(IV)中的带下划线的区域为该捕获剂形成环区域的序列。其序列在表I中列出的该捕获剂Ec632S(SEQ IDNO:23)的靶核酸将一个核苷酸结合到第一茎区域中。通过靶向与茎区域具有同源性的序列，可增加该捕获剂的净结合强度。
在本发明的另一个方面，还可改变邻近环的茎的序列以有利于增加靶结合的强度。在一个方面，所述捕获剂为具有表I中列出的序列的CHIKV-1(SEQ ID NO:25)。在一个方面，环区域是结构(V)的带下划线的区域，如图18所示。
邻近环的括号内的核苷酸已经从常见茎序列改变，以允许该捕获剂的靶，CV1S(SEQ ID NO:26)(序列在表I中列出)与环的5'侧上的C核苷酸结合。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但认为在不需要较大环的情况下，较长的互补序列允许捕获剂具有更均匀的熔融温度。
在一个方面，基底上的捕获剂的间距可影响在快速测定中包括捕获剂的方法的灵敏度，其中使用本文所公开的方法的快速测定可在约0.2至约2小时内执行。这是在不使用本文所公开的快速方法的参数的长期测定，诸如12小时测定中未发现的预料不到的结果，所述参数包括但不限于，互补序列少于茎区域的那些序列的探针、间隔开的捕获分子、一定程度变性的杂交缓冲液、以及用于中断捕获剂的初始结合以允许与靶分子杂交的较低温度。
基底可包括微阵列载玻片、微珠、光纤电缆、微量滴定板的表面、导电表面诸如金属丝或其他表面。当多个捕获分子以推荐的核酸浓度(通常为2×101μM)印刷到(附接到)微阵列载玻片上时，即使在不存在靶核酸的情况下，标记探针也在快速测定期间与捕获剂结合。在印刷(附接捕获剂)之前，将捕获剂稀释至大约1×10-1μM至1×101μM的水平导致标记探针仅在靶核酸的存在下特异性结合到捕获剂。
在一个方面，如果捕获剂以小于平均闭合式捕获分子长度的一半的距离与基底结合，如图3(A)中所示，则假设捕获剂-二聚体复合物形成，如图3(B)所示，其中左边捕获剂的第一茎区域可结合到右边捕获剂的第二茎区域，并且右边捕获剂的第一茎区域可结合到左边捕获剂的第二茎区域，从而留下两个环区域14以桥接错误折叠的茎对之间的距离。在一个方面，在此类错误折叠状态之间转换可允许捕获剂在正确的茎-环构象方面花费更少的时间，从而使得标记探针的非特异性结合在不存在靶标的情况下更容易发生。如图3(C)所示，使捕获剂间隔得更远通过防止相邻捕获剂茎区域相互作用而减少了标记探针在不存在靶的情况下的非特异性结合。
在一个方面，如果捕获剂距离下一个相邻捕获剂的闭合式茎-环捕获剂结构的平均长度的至少一半，则捕获剂不能形成捕获剂二聚体复合物。对于总共50至60个核苷酸的捕获剂而言，发夹结构的长度为大约4×10-1nm，其中大约意指在该范围内加或减百分之三十(30％)。
在一个方面，可通过以下方法实现基底上捕获剂的期望间距：1)稀释提供给基底的捕获分子的浓度使得捕获分子仅填充基底上可用结合位点的一部分，2)在基底上提供间隔开闭合式茎-环捕获剂结构的长度的至少一半的结合位点，或3)添加对基底上可用位点的结合竞争剂。竞争性结合抑制剂可以为核酸、小有机分子、纳米颗粒、或能够结合到基底表面的其他部分。有效的竞争剂是与捕获剂一样附接到相同化学接头的10个核苷酸polyADNA，参见SEQ ID NO：30。
在一个方面，本公开属于可用于本发明所公开的方法中的竞争性结合抑制剂。例如，本发明所公开的方法还包括向捕获分子的组合物提供竞争性抑制剂或在本文所公开的方法的步骤中提供竞争性抑制剂的步骤。所公开的竞争性抑制剂可有助于防止随机结合事件。所公开的竞争性抑制剂可以是小的胺化合物，诸如叔丁胺或二乙胺或其他胺官能化结合竞争剂。
在一个方面，所公开的竞争性抑制剂可以为由接头部分和肽核酸部分构成的肽核酸竞争性抑制剂。在一个方面，接头为六碳序列聚合物，并且氨基团可用于将接头的一端附接到基底，并且可将碳序列聚合物的另一端附接到另一分子，例如捕获分子或竞争性抑制剂。在一个方面，本公开的肽核酸可具有的长度基本上为捕获分子的茎部分的长度。在一个方面，竞争抑制剂模拟接头(共价键合到捕获分子的一端以将捕获分子锚定到基底表面的组分)和捕获分子的茎区域。例如，捕获分子可通过共价附接到捕获分子的第一茎序列的5'端的C6分子的末端碳上的氨基基团附接到表面。在一个方面，肽核酸竞争性抑制剂可包含共价键合到肽核酸碱基的序列的C6分子的末端碳上的氨基基团，使得肽核酸竞争性抑制剂具有氨基-C6分子+第一茎序列核酸的长度。肽核酸竞争抑制剂的核酸部分可以为5至15个核酸或更长。在一个方面，所述核酸部分仅包含核酸碱基。在一个方面，核酸部分包含核酸碱基和其他组分，诸如有助于肽核酸竞争性抑制剂的亲水性或疏水性的组分。例如，核酸部分可包含以其中穿插甘油基-O-接头的序列中共价连接的核酸碱基。例如，肽核酸竞争性抑制剂可包含共价连接到核酸部分的接头部分，所述核酸部分包含5'A-A-(甘油基-O-接头)-A-A-A--(甘油基-O-接头)-A-A-A 3'。设想到其他核酸碱基(CTGU)作为其他接头基团，和此类聚合物的其他布置。例如，肽核酸竞争性抑制剂可包含共价连接到核酸部分的接头部分，所述核酸部分包含5'U-A-(甘油基-O-接头)-A-U-A--(甘油基-O-接头)-A-U 3’。
肽核酸竞争性抑制剂的接头部分可包含任何接头。例如，接头部分可以是C6分子。在一个方面，接头部分可以为C12分子。接头部分和核酸部分可以组合在多种组分中以制备肽核酸竞争性抑制剂，所述肽核酸竞争性抑制剂具有期望长度的茎部分及其捕获分子的接头。另选地，肽核酸竞争性抑制剂可比该长度更长或更短。
本文所公开的组合物可包含辅助寡核苷酸，其是结合到靶核酸的小核酸聚合物。在一个方面，靶核酸可由被称为“辅助寡核苷酸”的核酸结合，所述辅助寡核苷酸可具有与靶核酸序列之外的靶核酸区域互补的序列，所述靶核酸序列与存在于捕获分子的环区域内的序列互补。辅助寡核苷酸可结合到与捕获剂环区域互补的靶核酸序列的5’侧或3’侧上的靶核酸。辅助寡核苷酸可具有介于10和40个核苷酸之间的长度，并且可与靶核酸的区域互补，所述区域为靶核酸的捕获剂结合序列的5’端的至少3个核苷酸5’或靶核酸的捕获剂结合序列的3'端的至少3个核苷酸3'。一个或多个辅助寡核苷酸可在靶核酸结合到捕获剂环区域之前或期间结合到靶核酸。虽然不希望受特定理论的束缚，据信辅助寡核苷酸对靶核酸的结合可展开捕获剂结合序列周围的靶核酸中的潜在二级结构，从而使靶核酸的捕获剂结合序列游离以更加可用于结合到捕获剂环区域。
方法
抗生素敏感性筛选
在一个方面，在使用茎环捕获剂方法、系统或装置测定生物体或细胞之前，使生物体或细胞暴露于诸如药物或抗生素的化合物可用于快速确定生物体或细胞是否通过改变靶核酸的水平来响应化合物。
在一个方面，本文所公开的检测方法可在试剂已经暴露于化合物(诸如癌症药物或抗生素)之后对该试剂执行，以确定对化合物的暴露是否已改变靶核酸在试剂中的水平。捕获分子可被设计成与靶核酸杂交，所述靶核酸可响应于暴露于化合物的试剂而在存在或数量方面发生改变。在试剂暴露于化合物之后，例如在37摄氏度下将可能包含细菌的样品与抗生素温育30分钟，可将核酸处理并用于所公开的用于检测靶核酸的方法。对靶核酸的存在或丰度变化的分析可用于确定样品中的试剂是否响应化合物。本公开的方法包括使用本文所公开方法中的捕获分子检测一种或多种试剂中的靶核酸，其中在检测靶核酸之前，使一种或多种试剂暴露于诸如治疗或化疗化合物或分子的条件下，导致通过合成一种或多种靶核酸或通过改变由该试剂合成的靶核酸的量，使得试剂响应。
本公开包括用于快速且灵敏地检测环境或生物样品内一种或多种靶核酸序列的存在的方法，所述方法使用捕获分子和标记探针，上述两者均由核酸构成。
在一个方面，所公开的方法包括通过在不需要使用高热条件诸如65℃来熔融捕获分子核酸的情况下，使靶核酸与捕获分子杂交，并且随后使探针，诸如标记(可检测)探针与靶-捕获分子杂交来检测靶核酸序列。
在一个方面，所公开的方法提供了对生物样品内的靶核酸序列的可靠检测，但在检测之前或期间不需要扩增靶核酸。
在一个方面，所公开的方法可灵敏且准确地检测靶核酸。例如，公开的方法可检测并区分差别少至一个核苷酸的靶核酸序列，诸如SNP检测。如果捕获分子已结合靶核酸序列，则所公开的方法检测已结合到捕获分子的标记探针，这提供改善的选择性、特异性和检测一种或多种(不同)靶核酸的能力。因此，所公开的方法以对由于背景噪音的不精确性、选择性和特异性的最小关注，提供对样品中的特定核酸序列的可靠检测。
在一个方面，所公开的方法可用于同时检测样品，例如环境样品或生物样品内多个靶核酸的存在。在一个方面，所公开的方法可用于确定存在于样品中的一种或多种试剂对治疗剂或其他化合物或分子的易感性。在一个方面，所公开的方法可用于确定基因表达或样品中存在的一种或多种试剂的核酸合成方面的改变。
在一个方面，所公开的方法利用结合探针一起其作用的基底结合的茎-环捕获分子，所述探针可以为检测试剂的靶核酸的标记探针，从而指示样品内试剂的存在。在一个方面，所公开的方法提供当捕获剂作为独立的簇附接在常用基底的表面上时，检测多个靶核酸的容易性，从而允许同时检测常用样品内的多个靶核酸。
在一个方面，如果靶核酸存在于样品内，则靶核酸与捕获分子的环序列杂交(如图1(B)所示)。如果靶核酸包含与存在于捕获分子的环内的序列互补的序列，则靶核酸仅与捕获分子的环区域杂交。当捕获分子结合到靶核酸时，则捕获分子的闭合式茎打开。未结合的靶核酸的捕获分子保持闭合式茎-环构象(如图1(D)所示)。
在一个方面，在暴露于包含可能的靶核酸的样品之后，将捕获分子暴露于标记探针。如前所述，可检测方面或部分存在于探针上或捕获分子上。为了便于讨论，本文可提及标记探针，其中设想标签可位于探针、捕获分子或两者上。术语“可检测”和“标记”在本文中可互换使用，例如，可检测或标记探针是指具有可被装置检测以便指示核酸的存在的方面的核酸序列。标签可为结合到核酸的部分，诸如荧光体分子，或核酸聚合物中的核苷酸本身是可检测的，诸如放射性标记核苷酸。标记探针的序列与捕获分子的茎区域中的一个区域互补，因此如果捕获分子处于开放式构象，则可结合到茎区域。如果靶核酸已与捕获分子杂交，则捕获分子可具有开放式构象，并且捕获分子的未结合的茎区域可游离以与标记探针杂交(如图1(C)所示)。如果靶核酸还未与捕获分子杂交并且捕获分子保持在闭合式茎-环构象，则标记探针不能结合到闭合式发夹(如图1(D)所示)，并且可在漂洗步骤中被洗掉。
在一个方面，所公开的方法以较少的来自背景噪音的干扰提供对靶核酸的检测，这是因为当靶核酸不存在时，标记探针从捕获剂洗去。这种移除/漂洗步骤克服了依赖于标记探针的构象而不是探针存在或不存在的先前检测方法中的许多并发症。
在一个方面，所公开的方法提供了当捕获剂结合到基底诸如微珠上时，检测多种靶核酸的容易性，其中每种类型的捕获剂位于单独的孔或其他限制区域中，因此允许同时检测常见样品内的多个靶核酸。
在一个方面，一种方法可用于检测靶核酸的存在，其中所述方法包括使捕获剂结合到基底，使捕获剂与潜在包含靶核酸的介质接触，使捕获剂与标记探针接触，漂洗捕获剂并且确定标记探针是否对捕获剂退火。
在一个方面，方法包括在将靶核酸与捕获分子混合的步骤之前的浓缩步骤。可使用固定的浓缩探针来浓缩靶核酸，所述固定的浓缩探针与靶核酸的一部分互补并且通过结合到表面来固定。例如，浓缩可包括使包含一个或多个靶核酸序列的样品暴露于包含顺磁性微珠的组合物，与靶核酸互补的核酸序列已经结合到所述顺磁性微珠。在一个方面，顺磁性微珠上的浓缩核酸序列(“浓缩探针”)可与本文所公开的方法中使用的捕获分子的一个或多个环区域相同或相似。在本公开的一个方面，将第一缓冲液(例如裂解缓冲液)中的样品核苷酸与包含浓缩探针的顺磁性微珠混合，可将靶核酸结合到包含浓缩探针的顺磁性微珠。在允许足够的结合之后，可通过施加磁场将包含浓缩探针和任何结合的靶核酸的顺磁性微珠从混合物中拉出，然后可将第一缓冲液从包含浓缩探针和任何结合的靶核酸的顺磁性微珠中漂洗/移除。磁场可以或可以不被移除。可将第二缓冲液(例如用于杂交的缓冲液)添加到包含浓缩探针和任何结合的靶核酸的顺磁性微珠。在本公开的一个另选的方面，可将包含浓缩探针和任何结合的靶核酸的顺磁性微珠混合到第二缓冲液中。在一个方面，可将包含浓缩探针和任何结合的靶核酸混合物的第二缓冲液/顺磁性微珠加热至高于靶核酸的熔融温度的温度，以从顺磁性微珠释放靶核酸。在一个方面，然后可通过施加磁场将顺磁性微珠从溶液拉出，并且可将包含靶核酸的第二缓冲液从顺磁性微珠移除。在本公开的另外的另选的方面中，可在本文所公开的方法或其他已知的核酸测定中分析释放的靶核酸。
在一个方面，在使用茎环捕获剂方法、系统或装置测定生物体或细胞之前，使生物体或细胞暴露于诸如药物或抗生素的化合物可用于快速确定生物体或细胞是否通过调节靶核酸的水平来响应化合物或分子。如本文所用，调节意指从预定或已知的基线水平增加或减小分子水平。例如，用于测定对一种或多种抗生素的细菌敏感性的方法包括使细菌暴露于抗生素，并在预定时间后裂解细菌并测量在细菌的核酸测定中检测到的标签量，如本文所公开。将检测到的标签量与未暴露于抗生素的细菌测定中检测到的标签量进行比较。
在一个方面中，在捕获分子与样品接触之前或期间，可抑制细菌或环境样品中的核酸酶活性。在一个方面，核酸酶抑制可通过在其与捕获分子接触之前对样品施加强热来实现。在一个方面，可通过使用包括SDS在内的一种或多种表面活性剂化合物来抑制核酸酶活性。在一个方面，可通过使用包括乙二胺四乙酸(EDTA)在内的一种或多种螯合剂抑制，或选自DMSO、二硫苏糖醇(DTT)和尿素的小分子有机分子来抑制核酸酶活性。在一个方面，核酸酶活性可通过使用蛋白酶K抑制。
在一个方面，如果在样品中，感兴趣的核酸(靶核酸)存在于包封结构(诸如生物体，例如细菌)内，则样品中的核酸可从该结构中释放并且可制成可用于结合到捕获分子。在一个方面，将样品快速加热至高温(诸如使样品穿过热金属丝)，添加裂解化合物诸如0.2％SDS，和/或将样品与玻璃氧化锆小珠剧烈缓和的组合可释放核酸。
在一个方面，释放的核酸可通过在样品裂解成长度大约为50至500个核苷酸的序列期间或之后与二价金属离子温育来温和降解，其中大约意指在该范围内加减50％。在一个方面，在热裂解期间，以大约0.1毫摩尔(mM)浓度下限至大约10mM浓度上限添加的锌离子可用于导致靶核酸的随机水解。在该范围内，大约意指加或减百分之二十。在一个方面，可通过添加金属螯合剂，包括但不限于EDTA或二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)来阻止水解。另外，释放的核酸(RNA和DNA)可例如通过穿过小孔机械剪切，其中沿变窄通道的压力变化导致直链核酸断裂(点沉剪切)。本领域的技术人员熟悉剪切核酸的方法。
在一个方面，所公开的方法可用一种或多种类型的捕获分子执行，以检测相同样品中的多个靶核酸。多个靶核酸可来自相同试剂(例如，病原体诸如细菌、真菌、病毒、原生动物、其他微生物)，来自不同试剂，或两者。如本文所用，“试剂”包括含有或具有释放的核酸的一种或多种活细胞或死细胞、组织、生物体或细胞内细胞器或其碎片。如果仅使用单一类型的捕获分子来鉴定靶核酸或试剂，则改变与捕获分子互补的靶核酸的试剂中的突变可能混淆靶核酸的检测，因此，混淆试剂的鉴定。已发现，即使靶核酸中的一种或多种具有突变，将几种类型的捕获分子用于结合来自相同试剂的多个靶核酸也可构建靶的同一性。因此，捕获分子可以两(2)个或更多个捕获分子(即，两种类型的捕获分子)的组的形式来设计，所述捕获分子与来自相同试剂的两(2)种或更多种靶核酸互补。然后，可执行统计聚类方法以观察捕获分子是否已与足够的可用靶核酸子集结合以鉴定试剂。
在一个方面，本文所公开的检测方法可在试剂暴露于化合物或分子(诸如癌症药物或抗生素)之后对该试剂执行，以确定对化合物或分子的暴露是否已改变靶核酸在试剂中的水平。捕获分子可被设计成与靶核酸杂交，所述靶核酸可响应于暴露于化合物的试剂而在存在或数量方面发生改变。在试剂暴露于化合物之后，例如在37℃下将可包含细菌和抗生素的样品温育30分钟，可将核酸处理并用于公开的方法中以检测靶核酸。对靶核酸丰度的存在或变化的分析可用于确定样品中的试剂响应于化合物。本公开的方法包括使用本文所公开方法中的捕获分子检测一种或多种试剂中的靶核酸，其中在检测靶核酸之前，使一种或多种试剂暴露于诸如治疗或化疗化合物或分子的条件下，从而通过合成一种或多种靶核酸或通过改变由该试剂合成的靶核酸的量，导致试剂响应。
在一个方面，本公开的漂洗溶液或缓冲液可包含在使用捕获分子检测样品中的靶核酸的测定中增强标记探针的检测的化合物或分子。例如，在一个方面，用于移除未结合的标记探针的漂洗溶液或缓冲液可包含抗坏血酸。此类包含抗坏血酸的漂洗液或缓冲液可有助于保持荧光标记并防止或抑制荧光的淬灭。可使用约0.01至约10.0mM的抗坏血酸量，以及其间的全部范围。例如，包含0.1mM抗坏血酸的漂洗液可用于缓冲液或溶液中以改善标记探针的可检测性。
在一个方面，鉴于捕获分子中的构象变化，本文所公开的方法可通过检测电流的变化来检测捕获分子对靶核酸的结合。用于测量由于构象变化的此类电流变化的装置是本领域技术人员已知的。在结合靶核酸分子后，捕获剂处于开放式构型，并且捕获剂从闭合式(发夹)结构到开放式结构的变化可通过施加在整个测定结构上的电流的变化来测量。这种构象变化还可通过其他方法测量，所述其他方法可检测分子构象或围绕经历构象变化的此类分子的液体的变化。
用于检测靶核酸的方法包括向装置提供靶核酸，所述装置包括捕获分子附接于其上并且彼此间隔开的基底，并且添加潜在地包含靶核酸的样品，在略变性的杂交缓冲液和任选地热的存在下，使靶核酸(如果存在)与互补环序列杂交；添加探针，所述探针具有与捕获分子的茎区域的至少一部分互补，并且长度比整个互补茎区域短的序列，添加漂洗缓冲液以移除未结合的核酸，并且检测结合的标签。任选地，基底可在附接捕获分子之前或之后被竞争性结合抑制剂接触。任选地，在待添加到捕获分子之前，靶核酸可与辅助寡核苷酸杂交。任选地，靶核酸可在添加辅助寡核苷酸或被添加到捕获分子之前进行浓缩。
加热步骤可包括从室温(例如24℃)至约50℃、至约51℃、至约52℃、至约53℃、至约54℃、至约55℃、至约56℃、至约57℃、至约58℃、至约59℃、至约60℃、至约61℃、至约62℃的温度，以帮助杂交，以便产生核酸的单链部分。本文所公开的方法不设想约65℃和更高的温度。
装置
本文公开了一种装置，其包捕获分子，如本文所公开的。一种或多种类型的捕获分子附接到基底。可将捕获分子直接附接到基底或可附接到接头。捕获分子可以以任何期望的图案附接在基底上，例如以用于固体平面基底的特定测定设计形式，或者捕获剂可以附着到颗粒或小珠上，所述颗粒或小珠例如在特定容器诸如板内的孔中离析。在一个方面，在平面基底上，捕获分子可彼此间隔开所述捕获分子的闭合发夹长度的至少一半。可设想其他间隔距离，其减轻一个捕获分子对另一个的交叉结合。
在一个方面，装置可使用基底诸如NSB27载玻片(NSB USA Inc.，Los Alamitos，CA)来制备，其制造有分离反应性表面连接位点的树状涂层。反应性表面连接位点彼此分开约0.8纳米的距离至约14(14)纳米的距离，约2nm至约10nm，约4nm至约8nm，以及其间的范围。NSB27载片上的反应性表面附接位点可以为例如醛部分，其可在附接到捕获分子的接头的末端处与伯氨基基团形成共价键。在一个方面，捕获分子可具有5’接头，其由六(6)个碳链上组成，其中伯氨基基团在捕获剂序列的相对端处的碳上。在一个方面，可将具有此类接头的捕获分子在具有最终浓度为2.5％甘油与200mM的磷酸一钠和磷酸二钠的混合物的附接缓冲液中稀释，以达到pH 8.5。可将捕获剂稀释到低至1×10-1μM；或在3μM结合竞争剂的存在下稀释至1μM，所述结合竞争剂诸如具有与捕获剂相同化学接头的10个核苷酸polyADNA，参见SEQ ID NO：30。可通过此类稀释制备一种或多种类型的捕获分子。每种类型的捕获分子可通过例如接触微阵列印刷技术或通过压电-液滴微阵列印刷技术或通过本领域技术人员熟悉的其他印刷技术沉积在基底上的特定位置。
在一个方面，本公开涉及可用于快速且灵敏地检测环境样品或生物样品内的一个或多个靶核酸序列的存在的装置。
在一个方面，所公开的装置包括附接到装置表面的至少一个捕获分子。在一个方面，所公开的装置的表面为外表面，例如，显微镜载玻片、测定板、小珠或颗粒的表面。在一个方面，所公开的装置的表面为内表面，例如，室(诸如微流体室)内的表面。捕获分子与表面的附接可包含已知类型的结合，其包括但不限于共价结合、离子结合、范徳华结合、抗体-抗原结合和底物-受体结合。
在一个方面，所公开的装置包括一个或多个茎环捕获分子核酸分子。此类捕获分子通过结合核酸分子捕获分子的5'端附接到装置的表面。在一个方面，装置是用于检测样品中的靶核酸的阵列。阵列由包含多个捕获分子的多个位点组成，其中多个位点中的一个或多个包含多个捕获分子，所述捕获分子具有能够结合特异性靶核酸的靶结合序列(在捕获分子的环部分中)。在一个方面，阵列还包含对照核酸茎-环捕获分子，其为样品中特定靶序列的存在提供阳性对照，其与靶序列互补使得结合在位于对照捕获分子的环部分中的对照核酸序列与靶序列之间发生。
在一个方面，阵列还包含对照核酸茎-环捕获分子，其为样品中特定靶序列的存在提供阴性对照，其不与靶序列互补使得结合不在位于对照捕获分子的环部分中的对照核酸序列与靶序列之间发生。在一个方面，阴性对照捕获分子具有与捕获分子非常相似，但与捕获分子不同的序列，从而使得对照捕获分子是特异性捕获分子的特异性阴性对照。例如，捕获分子序列可以为Rt16-788(SEQ ID NO：167)，并且Rt16-788的特异性阴性对照序列可以为Rt16-788X(SEQ ID NO：168)。特异性阴性捕获分子为包含捕获分子和阴性对照捕获分子的阵列提供高度可区分的阴性对照测量。在一个方面，阵列可包括捕获分子或者结合与靶序列无关的核酸分子的其他核酸结构，其用作阵列的结合条件的内部对照。
在一个方面，本文所公开的装置包括多个位点，其中在每个位点处，执行检测靶核酸的方法中的步骤。例如，装置可以为其中具有非分散性凝胶的管。该凝胶可具有多个层或部分中，每个层或部分提供用于执行检测靶核酸的方法中的步骤的位点。例如，装置可以为具有多个位点的微流体装置，所述多个位点由以特定图案微流体连接的室组成，使得检测靶核酸的方法的步骤可以特定序列执行。例如，装置可为一系列容器，诸如以特定图案连接的微量离心管，使得检测靶核酸的方法的步骤可以特定序列执行。例如，用于检测靶核酸的方法中的步骤的位点包括a)接触并可能将样品靶核酸与捕获分子结合的位点，b)移除未结合的样品核酸的洗涤或漂洗位点，c)用于标记检测分子与具有结合的靶核酸的捕获分子相互作用的位点，d)用于移除未结合的检测分子的洗涤或漂洗位点，以及其中检测标记检测剂-捕获分子-靶核酸构建体出现的收集位点。装置可包括用于预处理步骤，诸如处理样品以从样品中暴露和/或使核酸碎裂的位点。
在一个方面，用于样品核酸和捕获分子的相互作用的位点可以与具有多个位点的装置分开。例如，可将样品(诸如唾液)与附接到顺磁珠表面的捕获分子混合。可设想一种类型的捕获分子的集合，具有同样、相同的用于结合靶核酸的序列的每个捕获分子与顺磁珠结合，并且将多个捕获分子-结合的顺磁珠(其可包含一种类型或超过一种类型的捕获分子)用于测定中。捕获分子-结合的小珠和样品的混合物可包含用于裂解样品中的病原体或微生物和/或使病原体或微生物的核酸碎裂的缓冲液。然后可将包含退火核酸的混合物添加到装置。另选地，用于样品核酸和捕获分子-结合的顺磁珠的相互作用的位点可位于装置中。
例如，其中所述装置是具有用于在诸如层状结构或凝胶中相互作用的多个位点的管，其具有闭合端和开放端，下文从管的开放端描述用于所述方法的步骤的位点或层。第一层可以是用于样品核酸分子和结合到顺磁珠的捕获分子的相互作用步骤，以及如上所述的裂解、碎裂、加热、裂解和冷却的处理的位点，或者可以为将其中包含靶核酸的退火核酸和结合到顺磁珠的捕获分子的混合物引入到管中的位点。第二层提供漂洗和移除任何未结合的核酸的缓冲液或溶液。另选地，漂洗可作为将靶核酸的退火核酸和结合到顺磁珠的捕获分子添加到管之前的步骤进行。所述第三层包含标记检测分子，所述标记检测分子结合到已结合的靶核酸的捕获分子的单链部分。第四层包含用于移除未结合的检测分子的缓冲液或溶液，并且第五层，一般来讲为底层，包含标记结合的捕获分子的收集位点。检测剂检测收集位点中的标记分子并来自该测量的标记分子，所述测定确定样品中靶序列的存在或不存在。通过磁体从管顶部到管底部移动施加磁力，使顺磁珠向下移动通过所述管。例如，可使用围绕管的环形磁铁或螺线管(圆形电磁体)。
另选地，装置可以为具有室的微流体装置，所述室具有针对上述管形式的层所述的功能。可将样品添加到微流体装置，并且第一室可用于样品核酸分子和结合到顺磁珠的捕获分子的相互作用步骤，以及如上所述的裂解、碎裂、加热、裂解和冷却的处理，或者可以为将其中包含靶核酸的退火核酸和结合到顺磁珠的捕获分子的混合物引入到所述装置中的位点。第二室提供用于漂洗并移除任何未结合的核酸的缓冲液或溶液，或者此类缓冲液或溶液可引入到第一室中。另选地，漂洗可作为将靶核酸的退火核酸和结合到顺磁珠的捕获分子添加到微流体装置中之前的步骤进行。经漂洗的顺磁珠可移动到下一个室，例如第三室，并且添加包含标记检测分子的溶液，所述标记检测分子结合到具有结合的靶核酸的捕获分子的单链部分。在捕获分子-结合的顺磁珠和检测分子之间相互作用之后，可在室中漂洗小珠或将其移动到下一个室，例如第四室，其中提供用于移除未结合的检测分子的缓冲液或溶液。检测可在该室发生或者捕获分子-结合的标记小珠移动到下一室例如第五室，所述室包括标记结合的捕获分子的收集位点。检测剂检测收集位点中的标记分子并来自该测量的标记分子，所述测定确定样品中靶序列的存在或不存在。通过由从第一室移动穿过装置的下一个室的磁体施加的磁力将顺磁性珠移动穿过微流体装置。
在一个方面，所公开的装置可为纤维，诸如玻璃或塑料光纤纤维或电缆。光纤纤维可包括两个末端，分开所述纤维的长度的第一末端和第二末端。在一个方面，多个捕获分子结合到第一末端上。一个纤维上的捕获分子可以为是相同类型或相关类型。在所公开的方法中可使用多种纤维，其中每种纤维具有结合到第一末端的特定捕获分子。使用本文所述的步骤执行检测结合的标记探针的方法，并且来自标记捕获分子的辐射或光(光子)从第一端通过光纤纤维传输到所述光纤纤维的第二端。检测剂邻近光纤纤维的第二端或接触光纤纤维的第二端，从而使得辐射或光被检测。
在一个方面，使用纤维(诸如光纤纤维)传输附接到、接触、或邻近纤维的可检测标签的辐射，所述纤维可用于结合此类可检测标签的任何测定中。包含此类纤维的测定不限于本文所述的测定，并且不限于包含捕获分子和检测分子的测定，但包括包含合适的可检测标签的任何测定，包括但不限于ELISA、抗体测定、代谢测定、酶促测定等。
在一个方面，所公开的装置可用于检测系统，所述检测系统包括渡越时间传感器与滤波器，其可检测标记探针中的标签的辐射波长。渡越时间(ToF)是用于测量传感器和物体(在这种情况下为捕获分子上的标记检测剂)之间的距离的方法，其基于信号发射和其被物体反射之后返回到传感器之间的时间差。各种类型的信号(也称为载体)可与ToF(例如，光)一起使用。光是生物测定的特别良好的载体，因为只有其能够将速度、范围、低重和眼睛安全性结合。基于渡越时间(ToF)的范围查找技术在与光一起使用时非常强大。光渡越时间传感器可与激光扫描仪或其他成像荧光的方法一样执行良好。包括此类渡越时间传感器的测定不限于本文所述的测定，并且不限于包含捕获分子和检测分子的测定，但包括包含合适的可检测标签的任何测定，包括但不限于ELISA、抗体测定、代谢测定、酶促测定等。
由所公开的装置获得的数据可经由无线或有线传输从检测器发送，从而由所公开的装置中的交互作用来确定结果并上传到存储数据库或其他数据接收者。数据可从本文所公开的装置获得并且用于多种目的。例如，数据可用定位和时间坐标标记，提供数据的时间/空间位置以及任何所得的诊断或预测。可操纵(例如分类和记录)编译数据用于许多目的，其包括但不限于对公共健康警告的近实时感染监测、质量控制、旅行建议、流行性疾病管理和药品库存。
试剂盒
在一个方面，本公开涉及可用于快速且灵敏地检测环境样品或生物样品内的一个或多个靶核酸序列的存在的试剂盒。
在一个方面，本公开涉及试剂盒，所述试剂盒包括下列中的至少一个：(a)核酸捕获分子，所述核酸捕获分子包括环区域和茎区域，其中所述核酸捕获分子具有闭合式茎-环结构；并且其中当所述核酸捕获分子接触靶核酸时，所述闭合式茎-环结构被开放式茎-环结构代替；或者(b)标记探针；其中所述标记探针包含连接到所公开标签的所公开的探针序列；并且其中所述标记探针结合到所述开放式茎-环结构的茎区域；并且任选地包括下列中的一个或多个：(c)温育缓冲液；(d)漂洗缓冲液；(e)最终漂洗缓冲液；以及(f)对下列中一个或多个的说明：将所述核酸捕获分子与样品温育并漂洗所述核酸捕获分子，在添加标记核酸探针之后温育并漂洗，以及最终漂洗然后检测所述标记核酸探针的存在。
在一个方面，所公开的试剂盒包括：(a)核酸捕获分子，该核酸捕获分子包括环区域和茎区域，其中所述核酸捕获分子具有闭合式茎-环结构；并且其中当所述核酸捕获分子接触靶核酸时，所述闭合式茎-环结构被开放式茎-环结构代替；(b)标记探针；其中所述标记探针包含连接到所公开标签的所公开的探针序列；并且其中所述标记探针结合到所述开放式茎-环结构的茎区域；并且任选地包括下列中的一个或多个：(c)温育缓冲液；(d)漂洗缓冲液；(e)最终漂洗缓冲液；以及(f)对下列中一个或多个的说明：将所述核酸捕获分子与样品温育并漂洗所述核酸捕获分子，在添加标记核酸探针之后温育并漂洗，以及最终漂洗然后检测所述标记核酸探针的存在。
在一个方面，所公开的试剂盒包括本文所公开的组分和方法，其使用核酸检测剂来指示靶核酸的存在，其中如果捕获分子与靶核酸杂交，则标记探针结合捕获分子，从而减少背景噪音。在一个方面，所公开的试剂盒包括标记探针和捕获分子，其中如果捕获分子与靶核酸杂交，则标记探针与捕获分子结合。在一个方面，所公开的试剂盒可用于执行用于筛选基因表达水平的方法。在一个方面，所公开的试剂盒可用于确定响应于药物或其他刺激的基因表达水平变化。在一个方面，所公开的试剂盒可用于确定响应于刺激细胞的化合物的基因表达水平变化。
在一个方面，所公开的试剂盒包括连接到测定板(例如12孔、24孔、48孔、96孔或384孔)的孔中的表面的一个或多个捕获分子。在一个方面，板中的每个孔可包括每个孔中的捕获分子的簇，其中仅捕获分子的环序列在簇与簇之间不同，并且其中簇的环序列中的每一个均与感兴趣的试剂的核酸的一部分互补。以这种方式，可通过在相同基底上使用各种捕获分子同时检测多种靶核酸的存在。在一个方面，靶核酸的存在可以例如通过基底区域上的荧光来指示，所述荧光对应于已经与该靶核酸杂交并随后与标记探针杂交的捕获分子簇。
在一个方面，所公开的试剂盒包括载玻片，所述载玻片包含在基底的相应区域上的捕获分子簇，其中仅捕获分子的环序列在簇与簇之间不同，并且其中簇的环序列中的每一个均与感兴趣的试剂的核酸的一部分互补。以这种方式，可通过在相同基底上使用各种捕获分子同时检测多种靶核酸的存在。在一个方面，靶核酸的存在可以例如通过基底区域上的荧光来指示，所述荧光对应于已经与该靶核酸杂交并随后与标记探针杂交的捕获分子簇。
在一个方面，每个簇的捕获分子被设计成具有不同的环序列，但具有包括与标记探针互补的序列的茎区域。使用具有茎区域的多个捕获分子(其中茎区域中的至少一部分相同)允许使用通用标记探针，不考虑捕获分子的环区域，所述通用标记探针结合到捕获分子的任何暴露的茎区域。因此，可将通用标记探针与测定一起使用，其中所有标记探针均具有相同序列。使用通用标记探针通过仅要求制备单个标记探针序列极大地简化了检测过程。
在一个方面，所公开的试剂盒包括连接到捕获分子的微珠。在一个方面，包括微珠的试剂盒还包括用于将微珠置于单独的孔或管中的说明。通过将单独的生物样品置于每个孔或管中，可同时测定多个样品。靶核酸的存在可例如通过孔或管中的荧光来指示，所述荧光对应于已经与靶核酸杂交并随后与标记探针杂交的捕获分子。
在一个方面，试剂盒包括核酸捕获剂、一个或多个核酸探针和制备一种或多种温育缓冲液的说明。在一个方面，试剂盒包括核酸捕获剂、一个或多个核酸探针、使用试剂盒的说明和制备一种或多种温育缓冲液的说明。在一个方面，试剂盒包括核酸捕获剂、一个或多个核酸探针、使用试剂盒的说明和制备一种或多种温育缓冲液的说明、一种或多种结合缓冲液和一种或多种检测缓冲液。在一个方面，试剂盒包括核酸捕获剂和一种或多种核酸探针。在一个方面，试剂盒包括核酸捕获剂、一种或多种核酸探针和一种或多种缓冲溶液。
在一个方面，用执行通用标记探针和基底结合的捕获剂的方法的包含本文所述组分的试剂盒可用于检测样品中多个靶核酸的存在。
在一个方面，试剂盒需要其中所选的捕获剂可与其靶核酸快速并选择性杂交的条件，和其中标记探针可快速且选择性结合到暴露捕获剂区域的条件。
在一个方面，本文公开了系统，所述系统包括所公开的装置，所述装置包括捕获分子、探针分子、以及任选地竞争性抑制分子和特定缓冲液。
所公开的核酸序列
在一个方面，所公开的核酸序列是表I中列出的序列。表I中的序列包括靶分子、捕获分子和捕获分子的特异性对照序列的核酸序列。表I中提供了与每个序列相关联的SEQID NO。
表I：具有以下SEQ ID NO的核酸序列的列表。
实施例
提出以下实施例以向本领域的普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的化合物、组合物、装置、装置和/或方法的完整公开内容和描述，并且预期仅仅是本发明的示例，并非旨在限制本公开的范围。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一定的误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度是℃或为环境温度，且压力是大气压或接近大气压。
实施例1：
在以下实施例中，使用以下缓冲液。
第一杂交缓冲液：第一杂交缓冲液是300mM氯化钠(NaCl)、20mM磷酸一钠(NaH2PO4)、2mM EDTA、10体积/体积(v/v)％乙醇(EtOH)和0.1％SDS，pH用6N HCl调节至7.4。
第二杂交缓冲液：第二杂交缓冲液是300mM NaCl、20mM NaH2PO4、2mM EDTA和0.1％SDS，pH用6N HCl调节至7.4。
第一漂洗缓冲液：第一漂洗缓冲液是300mM NaCl、20mM NaH2PO4、2mM EDTA、2体积/体积％EtOH和0.05％SDS，pH用6N HCl调节至7.4。
第二漂洗缓冲液：第二漂洗缓冲液是300mM NaCl、20mM NaH2PO4、2mM EDTA和0.1％SDS，pH用6N HCl调节至7.4。在以下实验中，第一最终漂洗缓冲液由750mM NaCl和75mM柠檬酸钠组成。
第一检测缓冲液：第一检测缓冲液是300mM NaCl、20mM NaH2PO4、2mM EDTA、0.1％SDS，pH用6N HCl调节至7.4。
第一裂解缓冲液：第一裂解缓冲液为20mM三(羟甲基)氨基甲烷、2mM EDTA,、320mMNaCl和0.2％SDS。
实施例2
在95℃下，将大肠杆菌(E.coli)细菌的样品置于750微升(μL)第一裂解缓冲液中，所述第一裂解缓冲液具有250μL的0.1毫米直径玻璃-氧化锆珠，具有或不具有4mM氯化锌(ZnCl2)。将溶液涡旋两次持续三十(30)秒间隔，然后在95℃下进行两(2)分钟温育以完全裂解细菌。裂解通过平板接种最终裂解物的一部分来确认，并且完全裂解所需的时间间隔是导致没有观察到细菌生长的时间间隔。
每种裂解物的一部分还由基因组服务实验室(Huntsville，AL)通过Qubit荧光浓度确定(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和Agilent生物分析仪(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)来进行分析并且比较经提取RNA的大小。在不存在ZnCl2的情况下，裂解物被确定具有4.9至7.2的RNA完整性数(RIN)(如由Agilent生物分析仪所确定)，并且被确定具有完整的16S和23S RNA峰。在存在ZnCl2的情况下，裂解物被确定具有降解的16S和23S RNA峰，其中大部分RNA的大小在50至500个核苷酸的范围内。
经ZnCl2消化的RNA用于利用捕获分子Ec632(SEQ ID NO:1)的所公开的测定中，所述捕获分子的序列示于表I中，其靶向大肠杆菌的16S RNA。使用第一杂交缓冲液使RNA与捕获分子杂交二十(20)分钟。利用第一漂洗缓冲液执行漂洗步骤以移除非特异性RNA。标记探针13D(SEQ ID NO:2)(参见表I)以2nM的浓度添加到第一检测缓冲液中持续3.5分钟。在用第一漂洗缓冲液和第一最终漂洗缓冲液进一步漂洗以稳定任何双链区域之后，使用荧光检测器，诸如GenePix 4200b扫描仪(Molecular Devices，LLC，Sunnyvale，CA)来分析荧光分布。如图3所示，观察到每个条上方指示的浓度依赖性相对荧光信号，其中总RNA浓度在A:0μg RNA，B:50μg RNA，C:133μg RNA至D:246μg RNA的范围内。当足够的材料可用于多个实验时，误差条表示相对信号的标准偏差。
实施例3
在一个方面，捕获分子Ecoli476由长度为16(SEQ ID NO:4)、14(SEQ ID NO:5)和12(SEQ ID NO:6)个核苷酸(参见表I)的茎产生。使用不包含靶分子的第二杂交缓冲液将每个捕获分子杂交三十(30)分钟。利用第二漂洗缓冲液执行漂洗步骤。然后在第一检测缓冲液中以将20nM的浓度添加标记探针16D(SEQ ID NO:7)持续十分钟。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用第一最终漂洗缓冲液进行最终漂洗以稳定任何双链区域之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。如表II中所示，在不存在靶的情况下测量的相对背景信号随茎缩短而大大减少。
表II：相对背景的比较
三种不同茎长度的信号
<u>名称</u> <u>SEQ ID NO</u> <u>相对无靶信号</u>
Ecoli476 4 52
Ecoli476-14 5 3
Ecoli476-12 6 1
实施例4
在以下实验中，使用捕获分子Sau453mA(SEQ ID NO:8)、其完全互补的DNA靶Sau453T(SEQ ID NO:9)、其错配的DNA靶Sau453TC2(SEQ.ID 10)、Sau453TG2(SEQ.ID 11)和Sau453T14C(SEQ.ID 12)或其截短的DNA靶Sau453T6-27(SEQ.ID 13)和Sau453T1-22(SEQID NO:14)。使用第一杂交缓冲液，在52℃下，将每个DNA靶以250pM或50pM的浓度与捕获分子杂交20分钟。利用第二漂洗缓冲液执行漂洗步骤以移除非特异性结合。然后在第一检测缓冲液中，以2nM的浓度添加标记探针13D(SEQ ID NO：2)持续3.5分钟。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用包含112.5mM NaCl和11mM柠檬酸钠的缓冲液进行最终漂洗以稳定任何双链区域之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。测定在52℃下利用250pM的下列物质来执行：(A)完全互补靶Sau453T(SEQ ID NO:9)，或(B)双突变体Sau453TC2(SEQ ID NO:10)(其形成非常不利的C-T对)，或(C)双突变体Sau453TG2(SEQ IDNO:11)(其形成较不利的G-T对)。如图4所示，来自两个板B和C的相对信号等同于无靶。如图5所示，测定也在52℃下仅用50pM的以下物质来执行：(A)完全互补的靶Sau453T(SEQ IDNO:9)、或(D)单一错配靶Sau453T14C(SEQ ID NO:12)、或(E)截短Sau453T6-27(SEQ ID NO:13)、或(F)截短Sau453T1-22(SEQ ID NO:14)。结果还示出板D、E或F没有高于背景的显著相对信号。在图4和5中，误差条表示在每种条件下多次运行的标准偏差。虽然预期不利的双错配B和截短E和F将不良好地结合到捕获分子，但预料不到的是，较不利的双错配C和单错配D可不产生高于背景的显著信号。
通过在47℃、52℃、57℃、62℃、67℃和72℃的杂交温度下利用250pM Sau453T(SEQID NO:9)执行上述杂交方案，测定完全互补的Sau453T(SEQ ID NO:9)的相对靶结合信号的温度曲线。Sau453mA捕获分子(SEQ ID NO：8)结合到其完全互补靶的最大信号测定为52℃。在杂交条件下，捕获分子-靶双链体溶液中的熔融温度被计算为60.2℃，并且Sau453mA(SEQID NO:8)捕获分子本身的发夹结构的熔融温度计算为79.9℃。计算基于J SantaLucia Jr和D Hicks，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24.33:415-40中的模型。最大结合在52℃下实现，这远低于计算的值。不受特定理论的束缚，在这些条件下，据信捕获分子在杂交期间中保持闭合式茎-环结构，从而增强了茎-环捕获分子方法对单一错配区分的能力。不受特定理论的束缚，据信使用具有变性性质的缓冲液的快速方案(其中捕获分子的茎-环结构必须被靶-捕获分子双链体代替)可增加对仅完全互补靶核酸的结合的特异性。
实施例5
以5μM的浓度将捕获分子Sau453n(SEQ ID NO:15)印刷到NSB-27载玻片(NSB USAInc.，Los Alamitos，CA)上，并在37℃下使用第一杂交缓冲液(图6中的柱B)或第二杂交缓冲液(图6中的柱A)与其浓度为10nM的靶Sau453T(SEQ ID NO:9)杂交持续二十分钟。用第二漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，以0.5nM的浓度添加标记探针11Dn(SEQID NO:16)持续两分钟。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用包含9mM NaCl和0.9mM柠檬酸钠的缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。如图6所示，与在不具有添加剂的情况下(参见柱A)实现的信号相比，包含10％EtOH的第一杂交缓冲液(参见柱B)由相同量的靶产生更强的信号。在图6中，误差条表示在每个条件下来自多次运行的标准偏差。
以0.2μM的浓度将捕获分子Pos1(SEQ ID NO:17)印刷到NSB-27载玻片上，并在52℃下使用具有不同量的DMSO和/或SDS的第二杂交缓冲液(如表III中所列)与其浓度为100pM的靶Pos1T(SEQ ID NO:18)杂交持续20分钟。
表III：第二杂交缓冲液的组成变化
用第二漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，以5nM添加标记探针13D(SEQ ID NO:2)持续30秒，所述标记探针的序列在表I中列出。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用包含112.5mM NaCl和11mM柠檬酸钠的缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。如图7所示，在20分钟内产生的相对信号随变性DMSO的量减小而增加，但在添加SDS时改善。每个条上方的数字表示在每种条件下的相对信号。本领域技术人员可以理解，这些结果是非常预料不到的，即包含乙醇或离子洗涤剂的变性缓冲液可在较短的时间内改善相对信号。
实施例6
以0.2μM的浓度将捕获分子SamecA1(SEQ ID NO:19)印刷到NSB-27载玻片上，并在以下条件下，在第一杂交缓冲液中在52℃下，与其靶SamecA1T(SEQ ID NO:20)杂交持续20分钟：(A)仅与缓冲液；或(B)100pM浓度。用第二漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，在23℃下添加标记探针13D(SEQ ID NO：2)持续30秒。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用包含112.5mM NaCl和11mM柠檬酸钠的缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。如图8所示，仅缓冲液中的低相对背景(柱A，图8)提供来自仅25pM的SamecA1靶(SEQ ID NO:19；参见柱B，图8)的独特信号。在图8中，误差条表示在每个条件下来自多次运行的标准偏差。
实施例7
以20μM的浓度将捕获分子Sau453(SEQ ID NO:22)印刷到NSB-27载玻片上，并使用第二杂交缓冲液在37℃下仅与缓冲液或与其浓度为100nM的靶杂交持续十分钟。用第二漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中以1.0nM的浓度添加标记探针，(A)16D(SEQID NO:7)或(B)13D(SEQ ID NO:2)持续十分钟。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用包含9mM NaCl和0.9mM柠檬酸钠的缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix4200b扫描仪上分析荧光分布。如图9所示，在仅具有13D标记探针(SEQ ID NO:2；参见柱B，图9)的缓冲液的相对信号相对于具有16D标记探针(SEQ ID NO:7；参见柱A，图9)的减小展示出较短的标记探针不像较长标记探针那样容易地结合到闭合式靶-无捕获分子。
实施例8
例如，以0.18μM的浓度将捕获分子Ec632(SEQ ID NO:1)印刷到NSB-27载玻片上，并使用第一杂交缓冲液在52℃下仅与缓冲液或与其浓度为100pM的靶Ec632S(SEQ ID NO:23)杂交持续10分钟。用第一漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，在23℃下，添加标记探针，(A)具有ATTO 647N的13Dn(SEQ ID NO:24)或(B)具有Alexa-647的13D(SEQID NO:2)持续2.5分钟。在用第一漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用第一最终漂洗缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。如图10所示，来自具有ATTO 647N标记探针(SEQ ID NO:24；参见柱A，图10)的100pM靶的相对信号略高于具有Alexa-647标记探针(SEQ ID NO：2；参见柱B，图10)的信号。
本领域的技术人员可以理解，与ATTO 647N标记探针(SEQ ID NO：24)的显著非特异性结合是预料不到的。数据示出标记13个核苷酸探针(SEQ ID NO：2)上的荧光分子Alexa647(Alexa647，Invitrogen，Thermo Fischer Scientific Inc.，Waltham，MA)产生仅结合到已经与其靶核酸结合的捕获剂的标记探针。与之相比，在标记13个核苷酸探针(SEQ ID NO：24)上使用荧光分子ATTO 647N(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)导致在不存在靶核酸的情况下，标记探针与捕获剂的高水平非特异性结合。
比较两个荧光体的结构，并且确定ATTO-647N更疏水且带正电。确定ATTO 647N荧光体具有净+1电荷并且比具有净-3电荷的Alexa 647荧光体更疏水。
不希望受特定理论的束缚，据信用ATTO-647N标记探针可能能够在捕获分子附接于其上的疏水基底附近花费更多时间并且更容易接近带负电荷的捕获分子，从而，在不存在靶结合的情况下，将捕获分子的闭合式茎-环非特异性地打开成开放式构象。不希望受特定理论的束缚，据信用亲水性且带负电荷的荧光体标记检测剂，诸如Alexa647标记13D(SEQID NO：2)，可能能够在所公开的方法中更稳健地执行。
实施例9
靶Ec632S(SEQ ID NO:23)的计算的熔融温度为64.3℃并且靶CV1S(SEQ ID NO:26)的计算的熔融温度为64.6C。计算基于J SantaLucia Jr和D Hicks，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24.33:415-40中的模型。以0.4μM的浓度将捕获分子(A)Ec632(SEQ IDNO:1)和(B)CHIKV-1(SEQ ID NO:25)印刷到NSB-27载玻片上，并使用第一杂交缓冲液在54℃下仅与缓冲液或与其浓度为1nM的相应靶杂交持续20分钟。用第一漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，在23℃下添加标记探针13D(SEQ ID NO：2)持续2.5分钟。在用第一漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用第一最终漂洗缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。使用其茎序列已经改变的这两种捕获分子获得的相对信号示于图11中。在其靶不存在或存在的情况下，由两个捕获分子，Ec632(SEQ ID NO:1；柱A，图11)和CHIKV-1(SEQ ID NO:25；柱B，图11)产生的相对信号非常相似。
实施例10
以0.5μM、1μM和5μM的浓度将捕获分子(A)Pos1(SEQ ID NO:17)和(B)SapurK1(SEQID NO:27)印刷到相同组NSB-27载玻片上，并且在52℃下，使用300mM NaCl、20mM NaH2PO4、2mM EDTA、0.25M DMSO和0.05％SDS，pH 7.4的杂交缓冲液，仅与缓冲液或与浓度为100pM的靶Pos1T(SEQ ID NO:18)和SapurK1T(SEQ ID NO:28)杂交20分钟。用第二漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，以5nM添加标记探针13D(SEQ ID NO：2)持续30秒。在用第二漂洗缓冲液进行进一步漂洗，并且利用包含112.5mM NaCl和11mM柠檬酸钠的缓冲液进行最终漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。图12中的图示出两个捕获分子的高于背景增加的相对信号(参见柱A和B，图12，分别使用捕获分子Pos1(SEQID NO:17)和SapurK1(SEQ ID NO:27)获得的数据)随着印刷在载玻片上的捕获分子的浓度减小而增加并且看起来与仅缓冲液信号的减小相关联。
实施例11
在竞争性抑制剂(SEQ ID NO:30)的比率增加的情况下，以1μM的浓度，将捕获分子Ec3(SEQ ID NO:29)印刷到NSB-27载玻片上。捕获分子和抑制剂以以下摩尔比混合：(A)1:3；(B)1:4；和(C)1:5。使用第一杂交缓冲液，在52℃下，将载玻片与仅缓冲液，或浓度为2nM的靶Ec3S(SEQ ID NO:31)杂交10分钟。用第一漂洗缓冲液漂洗载玻片。然后在第一检测缓冲液中，在23℃下添加标记探针13D(SEQ ID NO：2)持续2.5分钟。在用第一漂洗缓冲液和第一最终漂洗缓冲液进行进一步漂洗之后，在可商购获得的GenePix 4200b扫描仪上分析荧光分布。数据示于图13中，其中柱A表示在捕获分子与抑制剂摩尔比为1:3时获得的数据；柱B表示在捕获分子与抑制剂摩尔比为1:4时获得的数据；并且柱C表示在捕获分子与抑制剂摩尔比为1:5时获得的数据。所述数据示出随着竞争性抑制剂的比率(比较柱A与B与C，图11)增加，在存在或不存在Ec3S(SEQ ID NO:31)靶的情况下，相对信号减小，这表明较少Ec3捕获分子(SEQ ID NO:29)结合到基底。
实施例12在实施例12中使用以下缓冲液。
杂交缓冲液：第三杂交缓冲液是2x TE缓冲液，pH 7.4(20mM三(羟甲基)氨基甲烷-HCl，2mM EDTA)，其中添加320mM NaCl、250mM DMSO和0.005％SDS。
漂洗缓冲液：第三漂洗缓冲液由2x TE缓冲液，pH 7.4组成，其中添加320mM NaCl，2体积/体积％EtOH和0.05％SDS。
检测缓冲液：第二检测缓冲液由2x TE缓冲液，pH 7.4组成，其中添加320mM NaCl和0.1％SDS。
最终漂洗缓冲液：第二最终漂洗缓冲液由2x磷酸盐缓冲盐水(40mM磷酸盐，300mMNaCl)组成，其中添加1mM抗坏血酸和975mM NaCl。
大肠杆菌的各种菌株已在胰蛋白酶大豆肉汤培养基中生长，稀释至5e7个菌落形成单位/毫升的浓度，并在存在或不存在100微克/毫升(μg/mL)四环素或50μg/mL氨苄青霉素的条件下于37C下生长90分钟。如[0184]中所述，将培养物离心并处理，以裂解细菌并使RNA碎裂。将碎裂的RNA与表I中所示的捕获分子Ec23S-511(SEQ ID NO:232)、Ec16S-514(SEQ ID NO:283)、Ec16S-932(SEQ ID NO:285)、Ec23S-2490(SEQ ID NO:287)和Ec23S-1930(SEQ ID NO:286)一起用于所公开的测定中。使用第三杂交缓冲液将RNA与捕获分子杂交一小时。使用第三漂洗缓冲液执行用于移除非特异性RNA的漂洗步骤。在第二检测缓冲液中，以2nM的浓度添加标记探针13D(SEQ ID NO:2)(参见表I)持续四分钟。在用第三漂洗缓冲液和第二最终漂洗缓冲液进行进一步漂洗之后，使用可商购获得的GenePix 4200b扫描仪分析荧光分布。
如图19所示，在存在或不存在四环素的情况下，使已知对抗生素四环素敏感的大肠杆菌菌株ATCC 25922生长并如上所述进行处理。当这种菌株在四环素的存在下生长时，高于背景的相对信号(图19，B)显著低于不具有抗生素的情况(图19，A)。四环素抑制该菌株的生长，并且所公开的方法由此确认菌株25922对四环素的敏感性。图19中的误差条表示测定中的相对信号的标准误差。
如图20所示，在存在或不存在氨苄青霉素的情况下，使菌株UAH202，来自尿路感染的临床分离物生长，并如上所述进行处理。当该菌株在氨苄青霉素存在下生长时，高于背景的相对信号(图20，B)在统计学上类似于在不具有抗生素的情况下生长的样品的信号(图20，A)。这些结果指示菌株UAH202不经历由抗生素的生长抑制，并且可预期将是氨苄青霉素抗性的。独立实验室培养结果证实，该菌株是氨苄青霉素抗性的。图20中的误差条表示测定中的相对信号的标准误差。
本文所公开的方法包括用于检测靶核酸分子的方法，包括：a)使靶核酸与附接到测定装置的基底的捕获分子接触，在允许靶核酸与捕获分子杂交的缓冲条件下进行，所述测定装置包括：i)一种或多种类型的捕获分子，其通过接头附接到所述基底，其中单独捕获剂以一定距离彼此间隔开以防止捕获分子二聚体；以及ii)一种或多种通用阴性对照捕获分子，其附接到基底；b)添加能够与捕获分子结合的可检测探针；以及c)检测可检测探针的量、在基底上的位置、或两者。在本文所公开的方法中，捕获分子可各自间隔开所述捕获分子的闭合式发夹长度的至少一半。在本文所公开的方法中，通用阴性对照捕获分子包括SEQID NO：160。在本文所公开的方法中，在步骤a)之前，将靶核酸浓缩。在本文所公开的方法中，在步骤a)之前，将辅助寡核苷酸添加到靶核酸。本文所公开的方法中，在步骤a)之前，将靶核酸浓缩并将辅助寡核苷酸添加到浓缩的靶核酸。在本文所公开的方法中，在b)之后并在c)之前，移除未结合的探针。在本文所公开的方法中，添加包含抗坏血酸的溶液。本文所公开的方法中，在b之后并在c)之前，添加包含抗坏血酸的溶液并移除未结合的探针。
本文所公开的方法包括缓冲条件，所述缓冲条件包括一种或多种缓冲液，所述一种或多种缓冲液包含下列中的一种或多种：离子表面活性剂、浓度为0.005体积/体积％至0.2体积/体积％的十二烷基硫酸钠；浓度为5体积/体积％至30体积/体积％的乙醇、浓度为0.10M至1.0M的二甲基亚砜(DMSO)；或它们的组合。在本文所公开的方法中，基底可包括微阵列载玻片、微珠、顺磁珠、光纤电缆、微量滴定板的表面、导电表面诸如金属丝、或其他表面。在本文所公开的方法中，可检测探针包含比捕获分子的茎区域中的核苷酸总数更少的与捕获剂的茎区域互补的核苷酸。在本文所公开的方法中，可检测探针包含标签，所述标签包括下列中的一种或多种：荧光化合物或分子、生物发光化合物或分子、化学发光化合物或分子、放射性同位素、结合对的成员、酶、酶底物、活性基团或发色团。
在本文所公开的方法中，测定装置具有附接到基底的竞争性结合抑制剂。竞争性结合抑制剂可包含附接到SEQ ID NO：30的接头。可通过接头将捕获分子附接到基底。接头分子可包括6-碳聚合物。
在本文所公开的方法中，捕获分子在5’-3’方向上包括第一茎区域、环区域、和与所述第一茎区域互补的第二茎区域。
一种或多种捕获分子选自：SEQ ID NO：1、3-6、8、15、17、19、21-22、25、27、29、32-323和339。一种或多种探针选自：SEQ ID NO:2、7、16、24和336-338。一种或多种辅助寡核苷酸选自：SEQ ID NO:324-335。
可用于本文所公开的方法、系统和装置中的组合物可包含选自下列的一种或多种可检测探针：SEQ ID NO:2、7、16、24和336-338。可用于本文所公开的方法、系统和装置中的组合物可包含选自下列的一种或多种辅助寡核苷酸：SEQ ID NO:324-335。可用于本文所公开的方法、系统和装置中的组合物可包含选自下列的一种或多种捕获分子：SEQ ID NO：1、3-6、8、15、17、19、21-22、25、27、29、32-323和339。
用于检测本文所公开的靶核酸的测定装置可包括：a)基底，b)一种或多种类型的捕获分子，其经由接头分子附接到所述基底，并且以一定距离彼此间隔开以防止捕获分子二聚体，以及c)附接到所述基底的一种或多种通用阴性对照捕获分子。本文所公开的测定装置可包括基底，所述基底包括微阵列载玻片、微珠、顺磁珠、光纤电缆、微量滴定板的表面、导电表面诸如金属丝、或其他表面。本文所公开的测定装置可包括附接到基底的竞争性结合抑制剂。此类竞争性结合抑制剂可包含附接到附接到核酸聚合物的接头，例如SEQ IDNO:30。本文所公开的测定装置可包括附接在基底上的特定位置处的一个或多个捕获分子。本文所公开的测定装置可包括附接在基底上的一个或多个特定位置处的一个或多个捕获分子。例如，一种类型的捕获分子(多个捕获分子)可见于基底上的特定位置中，并且不同类型的捕获分子(多个捕获分子)可附接到基底上的不同位置中。或者，在微珠或其他颗粒的情况下，附接到颗粒基底的一种类型的捕获分子可处于与附接到颗粒基底的另一种类型的捕获分子不同位置中，诸如微量滴定孔。对于阴性对照，无论是一般性还是特异性的，都是相同的。本文所公开的测定装置可包括附接在基底上的一个或多个特定位置处的一种或多种通用阴性对照捕获分子。本文所公开的测定装置可包括特异性阴性对照捕获分子，其可附接到基底上的特定位置。
用于检测本文所公开的靶核酸的系统可包括：a)测定装置，该测定装置用于检测靶核酸，包括i)基底；ii)一种或多种类型的捕获分子，其经由接头分子附接到所述基底，并且以一定距离彼此间隔开以防止捕获分子二聚体；以及iii)一个或多个通用阴性对照捕获分子，其附接到所述基底；b)溶液，该溶液包括缓冲液或漂洗剂；以及c)一种或多种可检测核酸探针。用于检测本文所公开的靶核酸的系统可包括辅助寡核苷酸。用于检测本文所公开的靶核酸的系统可包括基底，所述基底还包含附接的竞争性结合抑制剂。
用于检测靶核酸的试剂盒可包括下列中的至少一个：(a)核酸捕获分子，该核酸捕获分子包括环区域和茎区域，其中所述核酸捕获分子具有闭合式茎-环结构；并且其中当所述核酸捕获分子接触靶核酸时，所述闭合式茎-环结构被开放式茎-环结构代替；或者(b)标记探针；其中所述标记探针包含连接到所公开标签的所公开的探针序列；并且其中所述标记探针结合到所述开放式茎-环结构的茎区域；并且任选地包括下列中的一个或多个：(c)温育或杂交缓冲液；(d)漂洗缓冲液；(e)最终漂洗缓冲液；以及(f)对下列中一个或多个的说明：将所述核酸捕获分子与样品温育/混合并漂洗所述核酸捕获分子，在添加标记核酸探针之后温育并漂洗，以及最终漂洗然后检测所述标记核酸探针的存在。用于检测靶核酸的试剂盒可包括用于附接捕获分子的基底。
已经出于说明和描述的目的提供了本公开的方法、系统和组件的各方面的前述描述。其并不旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。许多修改和变型对于相关领域的普通技术人员而言将是显而易见的。例如，在所公开的本公开的方面中执行的步骤可替换顺序，可省略某些步骤，并且可添加附加步骤。选择并描述这些方面以便最好地解释本公开的原理及其实际应用，从而使得本领域其他技术人员能够理解本公开的各个方面并且具有适于设想的特定用途的各种修改。其他方面是可能的并且由本公开涵盖。基于本文所包含的教导内容，这些方面对于相关领域的技术人员将是显而易见的。本公开的广度和范围不应当受上述示例性方面中任一个限制，而应当仅根据所附权利要求及其等同物来限定。本文引用的所有参考文献均全文以引用方式并入本文。
序列表
<110> 基因捕获公司
<120> 包含茎-环捕获分子的组合物、方法和装置
<130> 31933.112823.2P1
<140> PCT/US2017/
<141> 2017-06-15
<150> 62/350,689
<151> 2016-06-15
<150> 62/382,754
<151> 2016-09-01
<160> 339
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 1
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<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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gacagacaga cag 13
<210> 3
<211> 106
<212> DNA
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<223> 未知
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<221> 尚未归类的特征
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<221> 尚未归类的特征
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<223> n 为 a, c, g, 或 t
<400> 3
ganagacaga nagacataga tctcctccgt ccaatatcct tgtctgtctg ganagacaga 60
nagacataga tctcctccgt ccaatatcct tgtctgtctg tctgtc 106
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gacagacaga cagacactgc gggtaacgtc aatgagcaaa gaaaatgtct gtctgtctgt 60
c 61
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<223> 未知
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gacagacaga cagactgcgg gtaacgtcaa tgagcaaaga aaatctgtct gtctgtc 57
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<223> 未知
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gggaagaaca tatctgtaag taactgt 27
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<212> DNA
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<223> 未知
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gaacatatgt gtaagtaact gt 22
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gggaagaaca tatgtgtaag ta 22
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aggatattgg acggaggaga tctatg 26
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<223> 未知
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attggcaaat ccggtactgc agaact 26
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<223> 未知
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<223> 未知
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<223> 未知
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gcatctgata ctggcaagct tgagt 25
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<212> DNA
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<223> 未知
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gacagacaga cag 13
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<212> DNA
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<223> 未知
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gacagacaga cagacccata ccagtttacc ttccgtacgc ggtctgtctg tctgtc 56
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gcgtacggaa ggtaaactgg tatgg 25
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<223> 未知
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tgaagaacat ttcaccggtg ttgttg 26
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<212> DNA
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acacaggaag agacaccact cgttgtcaga cagcatcctt gtctcttcct gtgt 54
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<223> 未知
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acacaggaag agacaccact cgttgtgtga caacatcctt gtctcttcct gtgt 54
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<223> 未知
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acacaggaag agacatgcag ggtcttggaa atgggcttct gtctcttcct gtgt 54
<210> 57
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 57
acacaggaag agacattcta gcccaagggt tccatattct gtctcttcct gtgt 54
<210> 58
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 58
acacaggaag agacattcta gcccttgggt tccattatct gtctcttcct gtgt 54
<210> 59
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 59
acacaggaag agacatcttt ggcttctgtt ctatccactt gtctcttcct gtgt 54
<210> 60
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 60
acacaggaag agacatctta ggcttctgat ctatcctctt gtctcttcct gtgt 54
<210> 61
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 61
acacaggaag agacaagatg tcctgcaaac atgtgatttc tgtctcttcc tgtgt 55
<210> 62
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 62
acacaggaag agacaagatg tcctgctttc atgtgatttc tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 63
acacaggaag agacaagcat gagtgtttcc agtgactccg tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 64
acacaggaag agacagcatg tgagtttcca gtgtcaccgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 65
acacaggaag agacactgtt cttcctgaaa gactgcgcct tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 66
acacaggaag agacactgtt caacctgatt gactgcgcct tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 67
acacaggaag agacacgggt aacgtcaatg agcaaaggtt gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 68
acacaggaag agacacagcc tacacgctta aaccgggact gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 69
acacaggaag agacacatct cggggcaagt ttcgtgcttt gtctcttcct gtgt 54
<210> 70
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 70
acacaggaag agacactcaa gcttgccagt atcagatgct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 71
acacaggaag agacatgagc atcgttaaag tatgccggtt gtctcttcct gtgt 54
<210> 72
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 72
acacaggaag agacaacaac accggtgaaa tgttcttcat gtctcttcct gtgt 54
<210> 73
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 73
acacaggaag agacataacc cagaacaact acggaaccgt gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 74
acacaggaag agacatagct ttgcactgtt tcagacccat gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 75
acacaggaag agacacaatt ttcggaccgt agaaagcgct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 76
acacaggaag agacaactgt tatgcggtat tagcacctgt tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaacat ttcacaacac gagctgacgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaacat tctacaaacc gagctgacgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacttgc gacgttatgc ggtattagct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacatca ggcttgcgcc cattgtgtct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacggct gctggcacgg agttagtgtc tcttcctgtg t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaccagg gtatctaatc ctgtttgctc ctgtctcttc ctgtgt 56
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaccagg gtttctacta ctgtttgctc ctgtctcttc ctgtgt 56
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacataaaa ctcaaatgaa ttgacgggtg tctcttcctg tgt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacataaaa ctcttaggaa aagacgggtg tctcttcctg tgt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 94
acacaggaag agacaaatcc atggcctatc ctcttcctgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatcttc aatggtggaa cagatcttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatcttc aatcctgcta cagatcttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaaagc aaaacccagg gatcatttct gtctcttcct gtgt 54
<210> 98
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacggac gaacgaaatg aatcccactt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 99
acacaggaag agacacggac tgacgaaagg aatcccactg tctcttcctg tgt 53
<210> 100
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 100
acacaggaag agacacggac gaacgaaatg aatcccactt gtctcttcct gtgt 54
<210> 101
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 101
acacaggaag agacagggag actttggtcg gcaagcgggt gtctcttcct gtgt 54
<210> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 102
acacaggaag agacagggag actaaggtcg tcaagcgggt gtctcttcct gtgt 54
<210> 103
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 103
acacaggaag agacatctgc attgtctccg aagaaataag tgtctcttcc tgtgt 55
<210> 104
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 104
acacaggaag agacatctgc attctctcgc aagaaataag tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 105
acacaggaag agacatacgt ttcgacctcg gttagaagtg tctcttcctg tgt 53
<210> 106
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 106
acacaggaag agacacggac gaacgaaatg aatcccactt gtctcttcct gtgt 54
<210> 107
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 107
acacaggaag agacatctgg gcacatctga tggcatgagt gtctcttcct gtgt 54
<210> 108
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 108
acacaggaag agacaaccct gtaccgtcgg actttccagt gtctcttcct gtgt 54
<210> 109
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 109
acacaggaag agacaacacg cacagtggat cctaggcaat gtctcttcct gtgt 54
<210> 110
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 110
acacaggaag agacaactcg cactgtggat cctaggcaat gtctcttcct gtgt 54
<210> 111
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 111
acacaggaag agacatgtca caaaattctt catcatgttt gtctcttcct gtgt 54
<210> 112
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 112
acacaggaag agacatgtca caaaattctt catcaagatt gtctcttcct gtgt 54
<210> 113
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 113
acacaggaag agacacacct cttccatctg acaggcacat gtctcttcct gtgt 54
<210> 114
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 114
acacaggaag agacactcga ttgtgggaag agcatgggat gtctcttcct gtgt 54
<210> 115
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 115
acacaggaag agacaaaggg tcagacaacc atcacgacat gtctcttcct gtgt 54
<210> 116
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 116
acacaggaag agacacacct catcctactg acaggcacat gtctcttcct gtgt 54
<210> 117
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 117
acacaggaag agacactcga tagtggagag agcatgggat gtctcttcct gtgt 54
<210> 118
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 118
acacaggaag agacaatggg tctgacaacc atctcgacat gtctcttcct gtgt 54
<210> 119
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 119
acacaggaag agacaactag tgatgctgtt gacaatttca ttgtctcttc ctgtgt 56
<210> 120
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 120
acacaggaag agacaggaag ggcctgggaa aacactcaat gtctcttcct gtgt 54
<210> 121
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 121
acacaggaag agacagagtc tgaccttgag tattcttggt gtctcttcct gtgt 54
<210> 122
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 122
acacaggaag agacagatga catggtctac aatgcaaaaa tgtctcttcc tgtgt 55
<210> 123
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 123
acacaggaag agacacatgt gatgctgttg acgaattcat gtctcttcct gtgt 54
<210> 124
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 124
acacaggaag agacagatga ctaggtctac atagcaataa tgtctcttcc tgtgt 55
<210> 125
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 125
acacaggaag agacaagaca gtcaaaatgc ctaggatcct gtctcttcct gtgt 54
<210> 126
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 126
acacaggaag agacactcca tttgcaactg attgatcaat gtctcttcct gtgt 54
<210> 127
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 127
acacaggaag agacaagaca gtacaatagc ctaggatcct gtctcttcct gtgt 54
<210> 128
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 128
acacaggaag agacactcca atgcaactga ttgtacattg tctcttcctg tgt 53
<210> 129
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 129
acacaggaag agacaaacct aggttccaca gtgcgcgaat gtctcttcct gtgt 54
<210> 130
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 130
acacaggaag agacaatcct aggatccact gtgcgcgaat gtctcttcct gtgt 54
<210> 131
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 131
acacaggaag agacaaacta tacaacctac tacctcatgt ctcttcctgt gt 52
<210> 132
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 132
acacaggaag agacaacaga ttcgattcta ggggaattgt ctcttcctgt gt 52
<210> 133
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 133
acacaggaag agacaagctc ccaagagcct aacccgttgt ctcttcctgt gt 52
<210> 134
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 134
acacaggaag agacatcaca agttagggtc tcagggatgt ctcttcctgt gt 52
<210> 135
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 135
acacaggaag agacacgcat tattactcac ggtacgatgt ctcttcctgt gt 52
<210> 136
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 136
acacaggaag agacacgcgt accaaaagta ataatgtgtc tcttcctgtg t 51
<210> 137
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 137
acacaggaag agacaggata tcatcatata ctgtaagtgt ctcttcctgt gt 52
<210> 138
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 138
acacaggaag agacatgtta atgctaatat gtaggagtgt ctcttcctgt gt 52
<210> 139
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 139
acacaggaag agacaacccc tatcacgatt agcattaatg tctcttcctg tgt 53
<210> 140
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 140
acacaggaag agacaccagt attaactgtg ctgctgatgt ctcttcctgt gt 52
<210> 141
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatagca gcacgtaaat attggcgtgt ctcttcctgt gt 52
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<220>
<223> 未知
<400> 142
acacaggaag agacacaaag tgcttacagt gcaggtagtg tctcttcctg tgt 53
<210> 143
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 143
acacaggaag agacattatg gcccttcggt aattcactgt ctcttcctgt gt 52
<210> 144
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 144
acacaggaag agacaagtga attctaccag tgccatatgt ctcttcctgt gt 52
<210> 145
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 145
acacaggaag agacacaacg gaatcccaaa agcagctgtg tctcttcctg tgt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 146
acacaggaag agacacaacg gaatcccaaa agcagctgtg tctcttcctg tgt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 147
acacaggaag agacaacagc ccatcgactg gtgttgtgtc tcttcctgtg t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatcaac atcagtctga taagctatgt ctcttcctgt gt 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatgcct actgagctga tatcagttgt ctcttcctgt gt 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatggct cagttcagca ggaacagtgt ctcttcctgt gt 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacctgt tctccattac ttggctctgt ctcttcctgt gt 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagagc ttagctgatt ggtgaactgt ctcttcctgt gt 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaggca agatgctggc atagcttgtc tcttcctgtg t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaaggg aggaggagcg gaggggccct tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaaggc agggcccccg ctcccctgtc tcttcctgtg t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacatat tggcactgca catgatttgt ctcttcctgt gt 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagcaa aaatgtgcta gtgccaaatg tctcttcctg tgt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatcgct tccctttgta tacgccattt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacgtcg cccggatgat ttagctttct tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagggat ttcacatcca acttgctgat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagctac cacgtctttc atcgcctctt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatgact taattgaccg cctgcgtgct gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacatgc ttagccaacc ttcgtgctct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaacttt ccagaccgtt ctcctgacat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatagta caccacgcac caattacatt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaagag aatcctccga tatctagcac tgtctcttcc tgtgt 55
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaagac aatccctcga tatctagcac tgtctcttcc tgtgt 55
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaatcc ataaccacca tgtcaagggt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaatcc ataaccacca tggcaacggt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactcca gcaaacctta cagtttacct gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactcca gcttacctat cagtaaacct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacacct gcacatggtt gcccacacgt gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacacca gcactaggtt gcccacacgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatatca ccctctatgg tcaatctttt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatatct ccctcaatgg acaatctttt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaaggt acgccgtcac aagacataat gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaaggt acgccgacac tagtcataat gtctcttcct gtgt 54
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<220>
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acacaggaag agacacagcg gattttactc cactttcaat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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acacaggaag agacacagcg gttttatcac cactttcaat gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaccatt cgccacggtc acgaaccatt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatggaa gaaacgattc atgtgccagt tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagttct gcagtaccgg atttgccaat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagctg accaccacca ataatgccat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagtga agcacgaacc gttcgaccat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacataaat gctgccaccc cgccattact gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaactag ctaatgcagc gcggatccat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagttac ttacacatat gttcttccct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacactt tagcatctct gccaaattct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacacaa tagcatctct gccattttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacattcgc ttcactttgt atctgccatt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacattcgc ttctctctgt ttctgccatt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatacga cagactttat gtggtccgct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatacga cagtcttaat gaggtccgct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacgtca atgattgagc gtattaaact gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacgtca atgattgagc gaatataact gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaggtat cgtcggttat aacgcttcat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaggtat cgacggtaat atcgcttcat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 201
acacaggaag agacaaagca accggattta cctggtcact gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaaagca accggtatat cctggtcact gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaatcaa ctgcttctgc accgtggtgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<223> 未知
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acacaggaag agacaatcta ctgctcttgc accgaggtgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagcta gtcctttcac ctaacgccat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagcta gtctcttaac ctaacgccat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactgga ttgctcaatt catcgctgct gtctcttcct gtgt 54
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacatca gccgttggat ttgctaagct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagatga caggtggagc agcatcttgt gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagcctt gccgaaatgg gtgatagtat gtctcttcct gtgt 54
<210> 212
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 212
acacaggaag agacagtgca cttgaaccat tgcagaggat gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaccact agatactgct ggcagcaatt gtctcttcct gtgt 54
<210> 214
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 214
acacaggaag agacacatat tgacaatccg gaatcctcct gtctcttcct gtgt 54
<210> 215
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacatat tgacaatccg gtactcacct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
<400> 216
acacaggaag agacatgtgc cagtggtggg tgatcttctt gtctcttcct gtgt 54
<210> 217
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 217
acacaggaag agacatgtgc cagtggtggg tatgcttctt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactgat ccaaagtccc aggctgtgtt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
<400> 219
acacaggaag agacaaggct agaatcgcca agaccatcct gtctcttcct gtgt 54
<210> 220
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagcct agatacggca agaccatcct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactcag catggcagcc agatctttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacacag catgggaccc agatctttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
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acacaggaag agacacagcc aggattgcca aggtgatgtt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactgcc aggatagcca aggtgaagtt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagtgtt gcaccaacaa tcgacgtcat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 227
acacaggaag agacagctct tctagatctc cgtgcttcat gtctcttcct gtgt 54
<210> 228
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 228
acacaggaag agacagctct tcatgatctc cctgctctat gtctcttcct gtgt 54
<210> 229
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 229
acacaggaag agacaatccg gactacgacg cactttatgt gtctcttcct gtgt 54
<210> 230
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 230
acacaggaag agacacatct cggggcaagt ttcgtgcttt gtctcttcct gtgt 54
<210> 231
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 231
acacaggaag agacattgat gttacctgat gcttagaggc tgtctcttcc tgtgt 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatgtac gtacacggtt tcaggttctt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagtta gccggtgctt attctgttgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagctac cacgtctttc atcgcctctt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagcag cttcggtgtg tggtttgagt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatgact taattgaccg cctgcgtgct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaggatt cgctggatgt caagagtagt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacacgg tccccgaccc agtttatgat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaacttt ccagaccgtt ctcctgacat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagggac tttacctacc gccagcgtat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacattcgg tgttgtcagg ttaagcctct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacactggt atcttcgact ggtctcagct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaccacg ctcgcagtca agctagcttt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatatgg gttcatctga tggcgcgagt gtctcttcct gtgt 54
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<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaatggt gtagtccaca gcttcggtat gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacacttct gctccgaaga gaaagcctat gtctcttcct gtgt 54
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<223> 未知
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<223> 未知
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<223> 未知
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<212> DNA
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acacaggaag agacaaaccg tattaccgcg gctgctgaat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<223> 未知
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<223> 未知
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<223> 未知
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<212> DNA
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<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 297
acacaggaag agacaacttc taacaccagt gcaaagctat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<212> DNA
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<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 302
acacaggaag agacagtgcg cattttgcct tcgtaatgat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacaagtcc tcggcagaca tgtcaaacat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacattagc cctgttcgtt gccatctcct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 未知
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acacaggaag agacaagagt cttatacggt actcccacct gtctcttcct gtgt 54
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acacaggaag agacaaattg tcctggtctt cctgcgccgt gtctcttcct gtgt 54
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<223> 未知
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acacaggaag agacacgctg tgtcacctaa aatggccaat gtctcttcct gtgt 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacatctgt cattgccatc tgtgtcacct gtctcttcct gtgt 54
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagtctc tcctgtggaa gtacatcagt gtctcttcct gtgt 54
<210> 312
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acacaggaag agacaactac aggcagcacg gtttgctcat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 未知
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acacaggaag agacagaact gtgttaagca agcttccgat gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 未知
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acacaggaag agacactgct accccatgcg tacagcttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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acacaggaag agacagcatt ccaagtgaga atctctttgt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acacaggaag agacaaacta ttgttccatg ttgtgtttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acacaggaag agacaacctg gacttcttct ccttccttct gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
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acacaggaag agacatttct ccttcctttg tccagatttt gtctcttcct gtgt 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acacaggaag agacaggtgt gagtgctctc ttgcctttgt gtctcttcct gtgt 54
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acacaggaag agacatctac gtccttctca taagtgggtt gtctcttcct gtgt 54
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acacaggaag agacaagacg atctactaat cctggccgct gtctcttcct gtgt 54
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acacaggaag agacatctgt cagtctatct ggtgtctctt gtctcttcct gtgt 54
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acacaggaag agacacttga ctatgtgcga cacaagagat gtctcttcct gtgt 54
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tggaagcagg gcatttgtyg cttcagcacc 30
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tctacctgac cacctgtgtc ggtttggg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggaagcagg gcatttgtyg cttca 25
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<212> DNA
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ctgaccacct gtgtcggttt ggg 23
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<212> DNA
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gtcaaaacag caaggtatta acttactgcc 30
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<212> DNA
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cttgcaccct tcgtattacc gcggctgctg 30
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<212> DNA
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gtcaaaacag caaggtatta actta 25
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<212> DNA
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acccttcgta ttaccgcggc tgctg 25
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agaaccataa cgtcctattc tattattcca 30
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<212> DNA
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ctgaatactg atacctccga ccgtccctat 30
<210> 334
<211> 25
<212> DNA
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agaaccataa cgtcctattc tatta 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tactgatacc tccgaccgtc cctat 25
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<212> DNA
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tttacacagg aagag 15
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tacacaggaa gag 13
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ctcttcctgt gta 13
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<212> DNA
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acacaggaag agacacatca ctcattaacg agctttgact gtctcttcct gtgt 54

Claims (33)

1.一种用于检测靶核酸分子的方法，所述方法包括：
a)使靶核酸与附接到测定装置的基底的捕获分子接触，在允许所述靶核酸与捕获分子杂交的缓冲条件下进行，所述测定装置包括：
i)一种或多种类型的捕获分子，其通过接头附接到所述基底，其中单独捕获剂以一定距离彼此间隔开以防止捕获分子二聚体；以及
ii)一个或多个通用阴性对照捕获分子，其附接到所述基底；
b)添加能够与捕获分子结合的可检测探针；以及
c)检测所述可检测探针的量、在基底上的位置、或两者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获分子各自间隔开所述捕获分子的闭合式发夹长度的至少一半。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用阴性对照捕获分子包括SEQ ID NO：160。
4.根据权利要求1所述的方法，其中捕获分子在5’-3’方向上包括第一茎区域、环区域、和与所述第一茎区域互补的第二茎区域。
5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤a)之前，浓缩所述靶核酸。
6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤a)之前向所述靶核酸添加辅助寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括，在b)之后和c)之前，添加包含抗坏血酸的溶液并且移除未结合的探针。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲条件包括一种或多种缓冲液，所述缓冲液包含下列中的一种或多种：离子表面活性剂、浓度为0.005体积/体积％至0.2体积/体积％的十二烷基硫酸钠；浓度为5体积/体积％至30体积/体积％的乙醇、浓度为0.10M至1.0M的二甲基亚砜(DMSO)；以及它们的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述基底包括微阵列载玻片、微珠、顺磁珠、光纤电缆、微量滴定板的表面、导电表面诸如金属丝、或其他表面。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测探针包含比捕获分子的茎区域中的核苷酸总数更少的与捕获剂的茎区域互补的核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定装置具有附接到所述基底的竞争性结合抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述竞争性结合抑制剂包含附接到SEQ ID NO：30的接头。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测探针包含标签，所述标签包括下列中的一种或多种：荧光化合物或分子、生物发光化合物或分子、化学发光化合物或分子、放射性同位素、结合对的成员、酶、酶底物、活性基团或发色团。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获分子通过接头附接到所述基底。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述接头分子包括6-碳聚合物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种捕获分子选自：SEQ ID NO：1、3-6、8、15、17、19、21-22、25、27、29、32-323和339。
17.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种探针选自：SEQ ID NO：2、7、16、24和336-338。
18.根据权利要求6所述的方法，其中一种或多种辅助寡核苷酸选自：SEQ ID NO：324-335。
19.一种组合物，所述组合物用于根据权利要求1所述的方法，所述组合物包含选自下列的一种或多种可检测探针：SEQ ID NO：2、7、16、24和336-338。
20.一种组合物，所述组合物用于根据权利要求1所述的方法，所述组合物包含选自下列的一种或多种辅助寡核苷酸：SEQ ID NO：324-335。
21.一种组合物，所述组合物用于根据权利要求1所述的方法，所述组合物包含选自下列的一种或多种捕获分子：SEQ ID NO：1、3-6、8、15、17、19、21-22、25、27、29、32-323和339。
22.一种测定装置，所述测定装置用于检测靶核酸，所述测定装置包括：
a)基底
b)一种或多种类型的捕获分子，其经由接头分子附接到所述基底并以一定距离彼此间隔开以防止捕获分子二聚体；以及
c)一个或多个通用阴性对照捕获分子，其附接到所述基底。
23.根据权利要求22所述的装置，其中所述基底包括微阵列载玻片、微珠、顺磁珠、光纤电缆、微量滴定板的表面、导电表面诸如金属丝、或其他表面。
24.根据权利要求22所述的装置，其中所述测定装置具有附接到所述基底的竞争性结合抑制剂。
25.根据权利要求22所述的装置，其中所述竞争性结合抑制剂包含附接到SEQ ID NO：30的接头。
26.根据权利要求22所述的装置，其中所述一个或多个捕获分子附接到所述基底上的一个或多个特定位置处。
27.根据权利要求22所述的装置，其中所述一个或多个通用阴性对照捕获分子附接到所述基底上的一个或多个特定位置处。
28.根据权利要求22的装置，所述装置还包括特异性阴性对照捕获分子。
29.一种系统，所述系统用于检测靶核酸，所述系统包括：
a)测定装置，所述测定装置用于检测靶核酸，所述测定装置包括：
i)基底；
ii)一种或多种类型的捕获分子，其经由接头分子附接到所述基底并以一定距离彼此间隔开以防止捕获分子二聚体；以及
iii)一个或多个通用阴性对照捕获分子，其附接到所述基底；
b)溶液，所述溶液包括缓冲液或漂洗剂；
c)一种或多种可检测核酸探针。
30.根据权利要求29所述的系统，所述系统还包括辅助寡核苷酸。
31.根据权利要求29所述的系统，其中所述基底还包含附接的竞争性结合抑制剂。
32.一种试剂盒，所述试剂盒包括下列中的至少一种：
(a)核酸捕获分子，所述核酸捕获分子包括环区域和茎区域，其中所述核酸捕获分子具有闭合式茎-环结构；并且其中当所述核酸捕获分子接触靶核酸时，所述闭合式茎-环结构被开放式茎-环结构代替；或者
(b)标记探针；其中所述标记探针包含连接到所公开的标签的所公开的探针序列；并且其中所述标记探针结合到所述开放式茎-环结构的茎区域；
并且任选地包括下列中的一种或多种：
(c)温育缓冲液；
(d)漂洗缓冲液；
(e)最终漂洗缓冲液；以及
(f)对下列中一种或多种的说明：将所述核酸捕获分子与样品温育并漂洗所述核酸捕获分子，在添加标记核酸探针之后温育并漂洗，以及最终漂洗然后检测所述标记核酸探针的存在。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于附接捕获分子的基底。
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