JP2023522072A - クロストリディオイデス・ディフィシル菌のコロニー形成を低減または予防する方法 - Google Patents
クロストリディオイデス・ディフィシル菌のコロニー形成を低減または予防する方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明の態様は、表面のC. difficileコロニー形成を防止および/または低減する方法に関する。特定の態様において、アプタマーは、C. difficile芽胞を致死および/または不活性化させるために使用できる。特定の態様において、アプタマーは、殺胞子剤の殺胞子活性を高めるために使用できる。本発明の態様は、C. difficile表面タンパク質、例えばC. difficile芽胞の表面上に位置するタンパク質に特異的に結合するアプタマーの使用に関する。
Description
関連出願
本出願は、2020年4月17日出願の米国仮特許出願番号63/011,850の利益およびそれに基づく優先権を主張し、その開示内容全体を引用により本明細書中に包含させる。
本出願は、2020年4月17日出願の米国仮特許出願番号63/011,850の利益およびそれに基づく優先権を主張し、その開示内容全体を引用により本明細書中に包含させる。
配列表
本出願は、2021年4月16日に作成されたサイズ33,824バイトを有するファイル193519-010108_ST25.txtを含む、本明細書と共に提出された配列表を含み、その内容は引用により本明細書中に包含される。
本出願は、2021年4月16日に作成されたサイズ33,824バイトを有するファイル193519-010108_ST25.txtを含む、本明細書と共に提出された配列表を含み、その内容は引用により本明細書中に包含される。
技術分野
本発明の態様は、表面のクロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficile)のコロニー形成を予防および/または低減させる方法に関する。本発明の態様は、C. difficile表面タンパク質、例えばC. difficile芽胞(胞子)の表面上に位置するタンパク質に特異的に結合するアプタマーの使用に関する。特定の態様において、アプタマーは、C. difficile芽胞を致死および/または不活性化させるために用いられ得る。特定の態様において、アプタマーは、殺胞子剤、例えば殺胞子性溶液の殺胞子活性を増加させるために用いられ得る。
本発明の態様は、表面のクロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficile)のコロニー形成を予防および/または低減させる方法に関する。本発明の態様は、C. difficile表面タンパク質、例えばC. difficile芽胞(胞子)の表面上に位置するタンパク質に特異的に結合するアプタマーの使用に関する。特定の態様において、アプタマーは、C. difficile芽胞を致死および/または不活性化させるために用いられ得る。特定の態様において、アプタマーは、殺胞子剤、例えば殺胞子性溶液の殺胞子活性を増加させるために用いられ得る。
背景
クロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficileとも呼ばれ、以前はクロストリジウム・ディフィシルと呼ばれていた)は、グラム陽性の嫌気性芽胞菌であり、重要な院内感染性および市中感染性病原菌である。C. difficile感染症(CDI)は、罹患率および死亡率の上昇を伴う世界的な感染症の主要原因となっている。2つの主要な病原因子である腸管毒素TcdAおよび細胞毒素TcdBがCDIの発症に不可欠であるにもかかわらず、C. difficile芽胞はCDIの感染、持続および伝播の主要なビークルであり、CDI再発事象および水平伝播事象に不可欠な役割を果たすと考えられている。
クロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficileとも呼ばれ、以前はクロストリジウム・ディフィシルと呼ばれていた)は、グラム陽性の嫌気性芽胞菌であり、重要な院内感染性および市中感染性病原菌である。C. difficile感染症(CDI)は、罹患率および死亡率の上昇を伴う世界的な感染症の主要原因となっている。2つの主要な病原因子である腸管毒素TcdAおよび細胞毒素TcdBがCDIの発症に不可欠であるにもかかわらず、C. difficile芽胞はCDIの感染、持続および伝播の主要なビークルであり、CDI再発事象および水平伝播事象に不可欠な役割を果たすと考えられている。
概要
本開示の側面は、クロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficile)汚染を低減および/または予防する方法、ならびに該方法で用いるための製品およびキットに関する。ある態様において、C. difficile芽胞を、C. difficileに対して特異的結合性を有するアプタマー、ならびに殺胞子剤(sporicidal agent)および静胞子剤(sporostatic agent)からなる群より選択される薬剤と接触させることを含む、C. difficile芽胞の殺胞子および/または不活性化のための方法を提供する。ある態様において、C. difficileに対して特異的結合性を有するアプタマー、ならびに殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤と芽胞を接触させることを含む、殺胞子剤のC. difficile芽胞に対する殺胞子活性を高める方法を提供する。ある態様において、薬剤は、殺胞子剤である。
本開示の側面は、クロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficile)汚染を低減および/または予防する方法、ならびに該方法で用いるための製品およびキットに関する。ある態様において、C. difficile芽胞を、C. difficileに対して特異的結合性を有するアプタマー、ならびに殺胞子剤(sporicidal agent)および静胞子剤(sporostatic agent)からなる群より選択される薬剤と接触させることを含む、C. difficile芽胞の殺胞子および/または不活性化のための方法を提供する。ある態様において、C. difficileに対して特異的結合性を有するアプタマー、ならびに殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤と芽胞を接触させることを含む、殺胞子剤のC. difficile芽胞に対する殺胞子活性を高める方法を提供する。ある態様において、薬剤は、殺胞子剤である。
ある態様において、C. difficile芽胞を殺胞子および/または不活性化するためのキットを提供する。ある態様において、キットは、C. difficileに対して特異的結合性を有するアプタマー、ならびに殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤を含む。ある態様において、C. difficile芽胞に対する殺胞子活性を増強するためのキットを提供する。ある態様において、キットは、C. difficileに対して特異的結合性を有するアプタマー、ならびに殺胞子剤および静胞子剤を含む。ある態様において、キットは、殺胞子剤および/または静胞子剤をその場所に接触させる前に、該場所におけるC. difficileの存在、不存在および/または濃度を決定するための光源および観察用ゴーグルを含む。
本発明の態様は、表面上に位置するC. difficile芽胞を致死および/または不活性化させる方法に関する。表面は、病院または介護施設のような他のヘルスケア施設における表面であってよい。表面は、例えば、シート、病院の手術着、床材、壁、手術台、家具などであってもよい。本発明の態様は、本明細書に記載のアプタマーを使用することを含む1以上の殺胞子剤の殺胞子活性を増強する方法に関する。本発明の態様は、C. difficileによる場所、例えば表面のコロニー化の低減または予防に関する
ある態様において、99.9%の芽胞は、植物細胞中に形質転換する能力がない。ある態様において、99.99%または99.999%の芽胞は、植物細胞中に形質転換する能力がない。ある態様において、芽胞の少なくとも85%が、植物細胞中に形質転換する能力がない。
特定の態様において、本発明は、C. difficile芽胞を殺胞子および/または不活性化するのを促進するために、1以上のアプタマー、例えばC. difficile芽胞に結合できる1つ、2つ、3つまたはそれ以上のアプタマーの使用に関する。アプタマー(複数可)は、単独で、および/または殺胞子剤と組み合わせて用いるためのものであってもよい。本発明の態様は、殺胞子剤の殺胞子活性を高めるために、本明細書に記載されるような1以上のアプタマーの使用を含み得る。本発明の態様による使用のための殺胞子性液体の更なる詳細は、本明細書に提供される。
C. difficileのコロニー形成は、単一の菌株で構成されてもよいか、または菌株の混合物であってもよい。
本発明の一面では、C. difficile芽胞を殺胞子または不活性化する方法であって、該芽胞を、殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤と、C. difficileに特異的に結合できる1以上のアプタマーを接触させることを含む方法を提供する。
本発明の一面では、(i)ある場所におけるC. difficileの存在を検出し、(ii)C. difficile芽胞を殺胞子または不活性化する方法であって、該芽胞を、殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤ならびにC. difficileと特異的に結合し得る1以上のアプタマーに接触させることを含む方法が提供される。ある態様において、1以上のアプタマーは、本明細書に記載されるような検出分子を含む。
本発明の一面において、C. difficile芽胞を殺胞子または不活性化する方法であって、該芽胞を、殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤ならびにC. difficileに特異的に結合し得る1以上のアプタマーに接触させることを含む方法を提供する。ある態様において、1以上のアプタマーは、本明細書に記載されるような検出分子を含む。
本発明の一面において、殺胞子剤のC. difficileに対する殺胞子効果を増強する方法が提供され、この方法は、C. difficile芽胞を、C. difficileと特異的に結合できる1以上のアプタマーならびに殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される剤と接触させることを含む。
本発明の一面において、(i)ある場所におけるC. difficileの存在を検出し、(ii)C. difficileに対する殺胞子または静胞子効果を増強する方法であって、C. difficile芽胞を、C. difficileと特異的に結合することのできる1以上のアプタマーと、殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤を接触させることを含む方法が提供される。ある態様において、1以上のアプタマーは、本明細書に記載の検出分子を含む。
ある態様において、薬剤は、殺胞子剤である。
ある態様において、本方法は、C. difficile芽胞を含むと予期される場所に、1以上のアプタマーおよび殺胞子剤を配置することを含む。
ある態様において、該場所は表面を含み、本方法は、1以上のアプタマーに先立ち、本質的に同時に、または後続して、該表面を殺胞子剤と接触させることを含む。
ある態様において、本方法は、1以上のアプタマーがC. difficile芽胞に結合して1以上のアプタマー-芽胞複合体を形成できるように構成された所定の期間、1以上のアプタマーと表面を接触させる工程、および1以上のアプタマー-芽胞複合体を含む表面を殺胞子剤と接触させる工程を含む。
ある態様において、本方法は、表面を殺胞子剤と接触させる前に、C. difficile芽胞に結合した1以上のアプタマーを決定することを含む。
ある態様において、本方法は、表面をGH中和剤と接触させる工程をさらに含む。
ある態様において、表面は、物体上に位置する表面、例えば病院のベッド、手術台、衣類、院内全体の表面(例えば、床、壁、天井、家具の外装)、特定の装置の表面(例えば、硬質表面、製造装置、加工装置など)、織物(例えば、綿、羊毛、絹、ポリエステル、ポリオレフィン、アクリルなどの合成繊維、綿ポリエステルなどの繊維混合物)、木材およびセルロースベース系(例えば、紙)、土壌、動物の死骸(例えば、皮、肉、毛、羽毛など)である。ある態様において、対象物は、食品(例えば、果物、野菜、ナッツ、肉など)であり得る。
ある態様において、本方法は、1以上のアプタマーがC. difficile芽胞に結合してアプタマー-芽胞複合体を形成できるように構成された所定の期間、培地を1以上のアプタマーと接触させる工程、およびアプタマー-芽胞複合体を含む培地を殺胞子剤と接触させる工程を含む。ある態様において、培地は水である。
ある態様において、本方法は、1以上のアプタマーを含む組成物で芽胞を浸漬すること、および/または薬剤中に芽胞を浸漬することを含む。
ある態様において、本方法は、C. difficile芽胞にアプタマーを含む組成物を噴霧すること、および/またはC. difficile芽胞に薬剤を噴霧することを含む。
ある態様において、本方法は、アプタマーを含む組成物を布によって塗布すること、および/または薬剤を布および/または拭き取りワイプによって塗布することを含む。
ある態様において、本方法は、約5℃~約90℃、例えば5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃または90℃の温度で実施される。ある態様において、本方法は、約5℃~約90℃の範囲の温度で実施されてもよい。ある態様において、本方法は、約5℃~10℃、10℃~15℃、15℃~20℃、20℃~25℃、25℃~30℃、30℃~35℃、35℃~40℃、40℃~45℃、45℃~50℃、50℃~55℃、55℃~60℃、60℃~65℃、65℃~70℃、70℃~75℃、75℃~80℃、80℃~85℃、85℃~90℃、またはこれらの温度範囲間の何れかの間の範囲内の温度で実施されてもよい。ある態様において、加熱温度は、5℃~90℃の範囲から選択される1℃刻みから選択される。
ある態様において、C. difficile芽胞はタンパク質を含み、ここで、タンパク質は、胞子膜表面タンパク質または外胞子層タンパク質である。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、CdeC、CdeM、CotA、CotEおよびCotEキチナーゼから選択される。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するCdeCタンパク質である。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するCdeMタンパク質である。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するCotAタンパク質である。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するCotEタンパク質である。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、配列番号17に記載のアミノ酸配列を有するCotEキチナーゼタンパク質である。
ある態様において、C.difficileタンパク質は、配列番号20に記載のアミノ酸配列を有するrCotEタンパク質である。
ある態様において、アプタマーは、一本鎖DNAアプタマーである。
ある態様において、アプタマーは、
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続したヌクレオチドを有する核酸配列
を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続したヌクレオチドを有する核酸配列
を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ある態様において、本方法は、場所を複数のアプタマーと接触させることを含み、ここで、各アプタマーは、C. difficile芽胞に特異的に結合することができる。ある態様において、複数のアプタマーは、C. difficile胞子の同じエピトープに特異的に結合することができる少なくとも2つのアプタマーを含む。ある態様において、複数のアプタマーは、少なくとも2つのアプタマーを含み、各アプタマーは、C. difficile胞子の異なるエピトープに特異的に結合することができる。
ある態様において、複数のアプタマーは、
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(e) (a)から(d)の何れかの組合せ
を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマーからなる群より選択される少なくとも2つのアプタマーを含む。
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(e) (a)から(d)の何れかの組合せ
を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマーからなる群より選択される少なくとも2つのアプタマーを含む。
ある態様において、複数のアプタマーは、
a) CdeCに特異的に結合するアプタマー;
b) CdeMに特異的に結合するアプタマー,
c) CotAに特異的に結合するアプタマー;
d) CotEに特異的に結合するアプタマー;
e) CotEキチナーゼに特異的に結合するアプタマー;および
f) (a)から(e)の何れかの組合せ
からなる群より選択される少なくとも2つのアプタマーを含む
a) CdeCに特異的に結合するアプタマー;
b) CdeMに特異的に結合するアプタマー,
c) CotAに特異的に結合するアプタマー;
d) CotEに特異的に結合するアプタマー;
e) CotEキチナーゼに特異的に結合するアプタマー;および
f) (a)から(e)の何れかの組合せ
からなる群より選択される少なくとも2つのアプタマーを含む
ある態様において、複数のアプタマーは、配列番号1に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;配列番号5に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;および、配列番号6に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー、を含む。
ある態様において、アプタマーは、検出可能な標識を含む。ある態様において、検出可能な標識は、フルオロフォア、ナノ粒子、量子ドット、酵素、放射性同位体、予め規定された配列部分、ビオチン、デスチオビオチン、チオール基、アミン基、アジド基、アミノアリル基、ジゴキシゲニン、抗体、触媒、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、デンドリマー、タンパク質またはリポソームである。
ある態様において、アプタマーは、FRETペアの一方または両方の分子を含む。
ある態様において、薬剤は、グルコン酸クロルヘキシジンおよび要すればイソプロピルアルコールを含む殺胞子性溶液である。
ある態様において、薬剤は、過酢酸を含む殺胞子剤である。
ある態様において、薬剤は過酢酸発生剤であり、ここで本発明の方法は、ある場所を接触させる前に、過炭酸ナトリウムを含む拭き取りワイプを水溶液で湿らせることをさらに含む。
ある態様において、殺胞子性水溶液は、過酸化水素を含み、要すれば銀安定化過酸化水素を含む。
ある態様において、殺胞子性溶液は、グルコン酸クロルヘキシジンおよび約70%イソプロピルアルコールの複合体を含む。
本発明の一面において、C. difficileに特異的に結合できるアプタマーと、殺胞子剤および/または静胞子剤との組合せを提供する。この組合せは、C. difficileの致死および/または不活性化において使用するためのものであり得る。
ある態様において、組合せは、複数のアプタマーを含み、該複数のアプタマーは、本明細書で規定される2以上のアプタマーを含む。
ある態様において、複数のアプタマーは、配列番号1に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;配列番号5に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;および、配列番号6に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー、を含む。
ある態様において、組合せは、過酢酸および/または過酢酸を生成することができる薬剤を含む殺胞子剤を含む。
本発明の一面において、本明細書で規定される1以上のアプタマーと、殺胞子剤および/または静胞子剤とを含む、組成物を提供する。
ある態様において、組成物は、C. difficileに特異的に結合できるアプタマーを含む。ある態様において、組成物は、複数のアプタマーを含み、各アプタマーは、C. difficile胞子の同じエピトープに特異的に結合することができる。ある態様において、複数のアプタマーは、C. difficile胞子の異なるエピトープに結合できるアプタマーを含む。
ある態様において、複数のアプタマーは、配列番号1に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;配列番号5に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;および、配列番号6に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー、を含む。
ある態様において、殺胞子剤は、過酢酸および/または過酢酸を生成することができる薬剤を含む。
詳細な説明
本発明の態様のさらなる特徴を以下に記載する。本発明の態様の実施は、特記しない限り、当業者に公知の分子生物学、微生物学、組換えDNA技術および免疫学の従来技術を用い得る。
本発明の態様のさらなる特徴を以下に記載する。本発明の態様の実施は、特記しない限り、当業者に公知の分子生物学、微生物学、組換えDNA技術および免疫学の従来技術を用い得る。
ほとんどの一般的な分子生物学、微生物学、組換えDNA技術および免疫学的技術は、Sambrookらの、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. またはAusubelらの、Current protocols in molecular biology (1990) John Wiley and Sons, N.Y.に見出され得る。本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、別途定義しない限り、当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., Academic Press; および、Oxford University Pressは、本明細書で用いる多くの用語の一般辞書を当業者に提供するものである。
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(Systeme International de Unitese:SI)で認められた形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。特記しない限り、アミノ酸配列は、アミノ側からカルボキシ側の方向で左から右に列記し、核酸配列は5’から3’の方向で左から右に列記する。
本明細書で用いる、冠詞“a”および“an”は、冠詞の文法的対象物の1つまたは2以上、例えば、少なくとも1つを意味する。本明細書中、用語“~を含む”と共に用いられるとき、単語“a”または“an”の使用は、“1つ”、“1以上”、“少なくとも1つ”、“1つまたは2以上”の意味を有し得る。
本明細書で用いる、“約”および“およそ”は、一般的に、測定の性質または精度が所定の測定量に対する許容可能な誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所定の範囲の値の20パーセント(%)以内、一般的には、10%以内、より一般的には、5%以内である。用語“実質的に”は、50%以上、好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上または95%以上を意味する。
本明細書で用いる用語“~を含む”または“含む”は、所定の態様において存在する、組成物、方法、キットおよびそのそれぞれの成分(複数可)に関して用いられ、かつ不特定の要素を含むことを容認する。
本明細書で用いる用語“~から本質的になる”は、所定の態様に必要とされるこれらの要素を意味する。この用語は、本明細書のその態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特性(複数可)に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を許容する。
用語“~からなる”とは、本明細書に記載の組成物、方法およびその各成分を意味し、その態様の説明に記載されていない如何なる要素も排除している。
クロストリジウム・ディフィシル菌は、例えば土壌、空気、水、食品ならびにヒトおよび動物の糞便など、環境全体に見出される。少数のヒトが、何の症状も示さずにC. difficileを腸管内に保有している。しかし、他の対象では、C. difficile菌に感染すると、下痢から生命を脅かす大腸の炎症に至るまで、様々な症状を引き起こす可能性がある。C. difficile感染症の合併症には、脱水、腎不全、中毒性巨大結腸症、腸穿孔が含まれ、感染が迅速に制御されない場合には死に至ることもある。
病院または長期介護施設にいる高齢者ならびに抗生物質を服用した対象および免疫系が低下している対象は、腹部または消化器系の外科手術を受けた者と同様に、C. difficile に感染するリスクがより高い。例えば、C. difficile感染症の死亡率は、病院内の虚弱な高齢者では最大25%になることがある。C. difficileはもともと他の感染症の処置に用いられる多くの薬剤に対して耐性があるため、抗生物質療法によって正常な腸内細菌叢が破壊され、C. difficileのコロニー形成および増殖が可能になり、それによってその毒素の生産が可能になると考えられている。
以前はリスクが低いと考えられていた対象、例えば、医療施設に接触していない若年層およびその他の健康な個体におけるC. difficile感染症の増加も、近年見られるようになってきた。C. difficileの新しい株である027型が最近同定されている。027型は他のほとんどの型のC. difficileよりも多くの毒素を産生し、重症化する割合が高く、死亡率が高いことが明らかにされている。
英国では、メトロニダゾール(400mgまたは500mg、1日3回、10~14日間)は、軽度から中等度のC. difficile感染症の初回エピソードの処置のための第一選択薬とみなされている。バンコマイシン(125mg、1日4回、10~14日間)は、2回目のエピソードまたは感染が重度の場合に検討される。感染症は、体温または白血球数の上昇、クレアチニンの上昇、または重症の大腸炎の徴候もしくは症状があるとき、重症と定義される。バンコマイシンはまた、027型株によって引き起こされる感染症にも用いられ得る。感染が再発した場合は、バンコマイシンまたはフィダキソマイシン(200mg、1日2回、10日間)が用いられ得る。重症の場合は、手術で腸の感染部分を切除しなければならないこともある。
C. difficileからの芽胞は、糞便中に排出され、洗っていない手を介して食物、表面および物に伝播し得る。芽胞は表面上に数週間または数ヶ月間存在し得て、かかる表面との接触を介して伝播し得る。
抗生物質耐性の上昇およびC. difficile感染症に関連する潜在的死亡率を考慮すると、管理対策が最も重要である。現在の対策には、看護師および医師のような医療提供者が以下のようなプロトコルに従うことが含まれる:
・ C. difficile細菌およびその他の細菌が患者の手から他の患者に移るのを防ぐため、すべての患者の世話をする前後に石鹸および水またはアルコールベースの手指消毒剤で手をきれい洗浄すること。
・C. difficile感染症の患者に用いた病室および医療器具を丁寧に洗浄すること。
・必要な場合にのみ、患者に抗生物質を投与すること。
・ C. difficile が他の患者に拡がるのを防ぐために、接触予防策を用いること。接触予防策とは、以下を意味する:
-可能な限り、C. difficile細菌を有する患者を個室または他のC. difficile細菌を有する患者と同室にする。
-C. difficile細菌を有する患者の世話をしている間、医療従事者は手袋をし、かつ衣服の上にガウンを着用する。
-見舞い客は手袋およびガウンを着用する。
-C. difficile細菌を有する患者の部屋を出るときは、手袋およびガウンを外し、手を洗浄する。
-接触予防策をとっている患者には、できる限り病室で過ごすよう求める。処置および検査のために病院内の他の場所に行くことは可能である。
・ C. difficile細菌およびその他の細菌が患者の手から他の患者に移るのを防ぐため、すべての患者の世話をする前後に石鹸および水またはアルコールベースの手指消毒剤で手をきれい洗浄すること。
・C. difficile感染症の患者に用いた病室および医療器具を丁寧に洗浄すること。
・必要な場合にのみ、患者に抗生物質を投与すること。
・ C. difficile が他の患者に拡がるのを防ぐために、接触予防策を用いること。接触予防策とは、以下を意味する:
-可能な限り、C. difficile細菌を有する患者を個室または他のC. difficile細菌を有する患者と同室にする。
-C. difficile細菌を有する患者の世話をしている間、医療従事者は手袋をし、かつ衣服の上にガウンを着用する。
-見舞い客は手袋およびガウンを着用する。
-C. difficile細菌を有する患者の部屋を出るときは、手袋およびガウンを外し、手を洗浄する。
-接触予防策をとっている患者には、できる限り病室で過ごすよう求める。処置および検査のために病院内の他の場所に行くことは可能である。
これらの予防措置にもかかわらず、C. difficileは依然として重大な医療問題であり、したがって、環境中のC. difficileの存在を迅速に特定する必要がある。
本明細書に記載の態様は、先行技術において特定された問題のいくつかを少なくとも部分的に軽減することができる。
本明細書に記載の態様は、C. difficileの検出において有用性を有する方法および製品を提供し得る。
クロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシルと呼ばれた)
本明細書中のある面は、クロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシルと呼ばれた)に特異的に結合できるアプタマーを利用する。
本明細書中のある面は、クロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシルと呼ばれた)に特異的に結合できるアプタマーを利用する。
ある態様において、アプタマーは、本明細書に記載の標的に特異的に結合する。本明細書で用いる用語“標的”は、C. difficile表面タンパク質の少なくとも1つから選択される分子に関して用いられる。ある態様において、標的分子は、標的タンパク質である。ある態様において、本明細書で用いる用語“標的”は、C. difficile CotAタンパク質、C. difficile CotEタンパク質、C. difficile CdeCタンパク質、C. difficile CdeMタンパク質、C. difficile CotECキチナーゼタンパク質およびC. difficile芽胞の少なくとも1つから選択される分子に関して用いられる。本明細書で用いる用語“標的タンパク質”および“標的ペプチド”は互換的に用いられる。
本明細書中の特定の態様は、C. difficile 芽胞に結合するアプタマーに関する。ある態様において、アプタマーは、C. difficileの全胞子に対して選択される。従って、ある態様において、アプタマーは、C. difficile芽胞に選択的に結合する。
特定の態様は、C. difficileスポアコートタンパク質に結合するアプタマーを提供する。本発明の態様は、複数のアプタマーを使用可能であり、各アプタマーは、C. difficile芽胞の表面上のユニークな(特定の)部位に結合できる。ある態様において、アプタマーは、C. difficile 胞子のエキソスポリウム層の表面タンパク質(例えば、CdeC、CdeM)に特異的に結合する。ある態様において、アプタマーは、C. difficile 胞子のコートタンパク質(例えば、CotA、CotE、CotEC)に特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、以下の表3に列記されたタンパク質に特異的に結合する。ある態様において、本発明は、複数のアプタマーの使用を含み、各アプタマーは、表3に列記されたタンパク質に特異的に結合できる。
標的タンパク質
C. difficileは代謝的に休眠状態の芽胞を産生する。芽胞(胞子)は、多数の表面タンパク質から構成され得る最外層の外胞子層を含む。ある態様において、外胞子層は、BclA1、BclA2、BclA3、CdeA、CdeB、CdeCおよびCdeMから選択される1以上のタンパク質を含む。
C. difficileは代謝的に休眠状態の芽胞を産生する。芽胞(胞子)は、多数の表面タンパク質から構成され得る最外層の外胞子層を含む。ある態様において、外胞子層は、BclA1、BclA2、BclA3、CdeA、CdeB、CdeCおよびCdeMから選択される1以上のタンパク質を含む。
CdeCタンパク質
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CdeCタンパク質に特異的に結合する。CdeCのアミノ酸配列は、UniProtKB-Q18AS2 (Q18AS2_PEPD6) バージョン1で公開されており、配列番号18に記載されているとおりである。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CdeCタンパク質に特異的に結合する。CdeCのアミノ酸配列は、UniProtKB-Q18AS2 (Q18AS2_PEPD6) バージョン1で公開されており、配列番号18に記載されているとおりである。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile 細菌株間で保存されているCdeCタンパク質のエピトープに結合する。したがって、特定の態様において、アプタマーは、サンプル中の複数のC. difficile株を検出するために用いられる。
CdeMタンパク質
ある態様において、アプタマーは、C. difficile表面結合型CdeMタンパク質のアミノ酸配列に選択的に結合する。CdeMは、芽胞(胞子)の被膜(コート)およびエキソスポリウム層の形態形成に必要とされることが理解されているシステインリッチタンパク質である。C. difficileタンパク質のアミノ酸配列は、UniProtKB-A0A3T1GTU1(A0A3T1GTU1_CLODI)(バージョン1)で公開されており、配列番号19に示されている。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile表面結合型CdeMタンパク質のアミノ酸配列に選択的に結合する。CdeMは、芽胞(胞子)の被膜(コート)およびエキソスポリウム層の形態形成に必要とされることが理解されているシステインリッチタンパク質である。C. difficileタンパク質のアミノ酸配列は、UniProtKB-A0A3T1GTU1(A0A3T1GTU1_CLODI)(バージョン1)で公開されており、配列番号19に示されている。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile細菌株間で保存されているCdeMタンパク質のエピトープに結合する。したがって、特定の態様において、アプタマーは、サンプル中の複数のC. difficile株を検出するために用いられる。
ある態様において、芽胞はスポアコートを含む。スポアコートは、例えばCotAおよびCotBを含む複数のタンパク質を含み得る。
CotA
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotA遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する。このタンパク質は、本明細書において、CotAまたは“スポアコートアセンブリタンパク質”の何れかとして言及され得る。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotA遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する。このタンパク質は、本明細書において、CotAまたは“スポアコートアセンブリタンパク質”の何れかとして言及され得る。
CotAのアミノ酸配列は、UniProtKB受託番号No.Q186G8(Q186G8_PEPD6)バージョン1で公開されており、配列番号15に示されている。
CotE
ある態様において、アプタマーは、CotE遺伝子によってコードされるC. difficileタンパク質に特異的に結合する。CotEタンパク質(ペルオキシレドキシンとも呼ばれる)のアミノ酸配列は、受託番号UniProtKB-Q18BV5 (Q18BV5_PEPD6) に記載されており、配列番号16に示されている。
ある態様において、アプタマーは、CotE遺伝子によってコードされるC. difficileタンパク質に特異的に結合する。CotEタンパク質(ペルオキシレドキシンとも呼ばれる)のアミノ酸配列は、受託番号UniProtKB-Q18BV5 (Q18BV5_PEPD6) に記載されており、配列番号16に示されている。
CotEC キチナーゼ
ある態様において、アプタマーは、“CotEC”または“rCotE”と称される組換えC. difficileタンパク質に特異的に結合する。CotECのアミノ酸配列は、アミノ酸残基N281-F712(配列番号20)からなる。この組換えタンパク質は、キチナーゼドメインおよびCotEに特有の配列を含む。ある態様において、アプタマーは、“rCotEC”(AB45とも呼ばれる)と称される組換えC. difficileタンパク質に特異的に結合する。rCotECのアミノ酸配列は、アミノ酸残基N381-F712(配列番号17)からなる。
ある態様において、アプタマーは、“CotEC”または“rCotE”と称される組換えC. difficileタンパク質に特異的に結合する。CotECのアミノ酸配列は、アミノ酸残基N281-F712(配列番号20)からなる。この組換えタンパク質は、キチナーゼドメインおよびCotEに特有の配列を含む。ある態様において、アプタマーは、“rCotEC”(AB45とも呼ばれる)と称される組換えC. difficileタンパク質に特異的に結合する。rCotECのアミノ酸配列は、アミノ酸残基N381-F712(配列番号17)からなる。
ある態様において、アプタマーは、Hisタグ付きCotECタンパク質に対して選択される。ある態様において、アプタマーは、Hisタグ付きrCotECタンパク質を含むがこれに限定されない、タグ付きrCotECタンパク質に対して選択される。
C. difficile芽胞
ある態様において、アプタマーは、C. difficileの全胞子に対して選択される。従って、特定の態様において、アプタマーは、C. difficile胞子に選択的に結合する。C. difficile芽胞は、SH11、PCRリボタイプ027型、PCRリボタイプ010型、PCRリボタイプ014型およびATCC(登録商標) 43598(商標)から選択される株由来であり得る。ある態様において、C. difficileは、クレード(Clade)1、2、3、4および5から選択されるクレードの株であってよい。特定の態様において、菌株は、SH7(クレード1)、SH8(クレード2)、R20291(クレード2)、SH9(クレード3)、SH10(クレード4)、ATCC 43598(クレード4)およびSH11(クレード5)から選択される。ある態様において、菌株は、R20291、ATCC 43598およびSH11から選択される。
ある態様において、アプタマーは、C. difficileの全胞子に対して選択される。従って、特定の態様において、アプタマーは、C. difficile胞子に選択的に結合する。C. difficile芽胞は、SH11、PCRリボタイプ027型、PCRリボタイプ010型、PCRリボタイプ014型およびATCC(登録商標) 43598(商標)から選択される株由来であり得る。ある態様において、C. difficileは、クレード(Clade)1、2、3、4および5から選択されるクレードの株であってよい。特定の態様において、菌株は、SH7(クレード1)、SH8(クレード2)、R20291(クレード2)、SH9(クレード3)、SH10(クレード4)、ATCC 43598(クレード4)およびSH11(クレード5)から選択される。ある態様において、菌株は、R20291、ATCC 43598およびSH11から選択される。
ある態様において、アプタマーは、本明細書に記載の標的に特異的に結合する。本明細書で用いる用語“標的”は、C. difficile CotAタンパク質、C. difficile CotEタンパク質、C. difficile CdeCタンパク質、C. difficile CdeMタンパク質、C. difficile CotECキチナーゼタンパク質、およびC. difficile 胞子から選択された分子に関して用いられる。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotAタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotEタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CdeCタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CdeMタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotECキチナーゼタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotEタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CdeCタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CdeMタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile CotECキチナーゼタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。
ある態様において、アプタマーは、C. difficile 芽胞の表面上のエピトープに特異的に結合する。
アプタマーは、それが標的タンパク質に優先的または高い親和性で結合するが、他の構造的に関連する分子(例えば、枯草菌胞子)には結合しないかまたは低い親和性のみで結合する場合、本明細書に規定のように標的に“特異的に”結合する。ある態様において、標的タンパク質に対する解離定数は、ナノモル(nM)範囲にある。ある態様において、標的タンパク質に対する解離定数は、ピコモル(pM)範囲にある。ある態様において、解離定数は、約0.1nM以下である。ある態様において、解離定数は、約0.1nM~約1nMである。ある態様において、解離定数は、約1nM~約10nMである。ある態様において、解離定数は、約10nM~約100nMである。ある態様において、解離定数は、約100nM~約1000nMである。低親和性結合は、標的タンパク質に対するよりも低い親和性で生じる結合を意味し得る。低親和性結合は、標的タンパク質に対する結合の1倍未満~2倍、2倍未満~5倍、5倍未満~10倍、10倍未満~50倍、100倍未満~1000倍、1000倍未満~10000倍、または10000倍未満~100000倍の範囲から選択されてもよい。
アプタマー
本明細書に記載されたアプタマーは、高い親和性および特異性を有して本明細書に規定される標的に特異的に結合できるDNA、RNAまたはその修飾物を含む、小さな人工リガンドである。
本明細書に記載されたアプタマーは、高い親和性および特異性を有して本明細書に規定される標的に特異的に結合できるDNA、RNAまたはその修飾物を含む、小さな人工リガンドである。
本明細書で用いる“アプタマー”、“核酸分子”または“オリゴヌクレオチド”は、本明細書で規定される標的に対して望ましい作用を有する非天然核酸分子を意味するために互換的に用いられる。
本発明のアプタマーは、DNAアプタマーであってもよい。例えば、アプタマーは、一本鎖DNA(ssDNA)から形成されてもよい。あるいは、本発明のアプタマーは、RNAアプタマーであってもよい。例えば、アプタマーは、一本鎖RNA(ssRNA)から形成され得る。
特定の態様において、アプタマーは、RNAアプタマーであり、配列番号1から14、23から39、42から55に記載の配列の何れかにおけるデオキシリボヌクレオチドの1つまたは一部または全部がそれらの同等のリボヌクレオチド残基AMP、GMP、UMPまたはCMPに置換されている配列を含む。
本発明のアプタマーは、本明細書に記載の修飾核酸を含み得る。
特定の態様において、本発明のアプタマーは、標的結合、分割(partitioning)および標的結合配列の優先的増幅の反復サイクルを含む、当技術分野で既知のインビトロ選択の原理を用いて調製される。選択は、固定化された標的タンパク質を用いて実施することができる。固定化には、固体表面への固定化が含まれるが、これに限定されない。限定されない例において、固体表面はビーズであってもよい。限定されない例において、固体表面は、磁気ビーズであってもよい。
増幅方法の限定されない例としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライゲーション増幅(または、リガーゼ連鎖反応、LCR)、鎖置換増幅、核酸配列ベースの増幅およびQ-βレプリカーゼの使用に基づく増幅方法などが挙げられる。限定されない態様において、少なくとも1種類のアプタマーは、増幅中に固体表面上に固定化されてもよい。これらの例示的な方法の各々は、当技術分野において周知である。
ある態様において、アプタマーは、一本鎖DNAまたはRNA核酸分子ライブラリーのような核酸分子ライブラリーから選択される。一般的に、アプタマーは、選択された何れかのアプタマーが、列記されたアッセイ形式の何れかに変換するためにほとんどまたは全く改変を必要としないように設計されている“ユニバーサルアプタマー選択ライブラリー”から選択される。
一旦選択されると、アプタマーは、例えば、標的結合に必要でないプライマー配列および/またはランダム化配列の部分の一方または両方を除去するために、使用前にさらに修飾されてもよい。
一般的には、本発明の使用のためのアプタマーは、第1のプライマー領域(例えば、5’末端)、第2のプライマー領域(例えば、3’末端)、またはその両方を含む。プライマー領域は、ライブラリーおよび選択されたアプタマーのPCR増幅のためのプライマー結合部位として機能し得る。
当業者は、例えば、出発ライブラリーおよび/またはアプタマー選択プロトコルに依存して、異なるプライマー配列が選択され得ることを理解し得る。ある態様において、プライマーは、配列番号21および/または22の核酸配列を含むか、またはそれからなる。一態様において、アプタマーは、配列番号21および/または22を含む。他の態様において、配列番号21または22に記載されるヌクレオチドの1つから全ての何れかが修飾されていてもよい。プライマー領域の長さもまた、変化させてもよい。
第1のプライマー領域および/または第2の領域は、本明細書に記載の検出可能な標識を含んでいてもよい。ある態様において、第1のプライマー領域および/または第2のプライマー領域は、蛍光標識されていてもよい。蛍光標識の限定されない例としては、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、およびその他が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、フルオレセイン標識が用いられる。ある態様において、ホスフェート(PO4)標識、同位体標識、電気化学センサー、比色バイオセンサーおよびその他を含むがこれらに限定されない、プライマーを検出する他の形態が用いられ得る。
ある態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つから選択される核酸配列を含む、またはそれらから構成される。
特定の態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14および配列番号23~39および43~55の何れか1つのヌクレオチド配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれから構成される。
本明細書で用いる“配列同一性”とは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後に、該配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセント(割合)を意味する。核酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、CLUSTALWまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の範囲内にある種々の方法で達成することができる。例えば、核酸配列同一性%値は、欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイト(http://www.ebi.ac.uk)にある配列比較コンピュータプログラムを用いて算出することができる。
本明細書で用いる、アプタマーなどの、その配列が参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば約90%同一である核酸のパーセント同一性を記載するとき、核酸配列が、参照核酸配列の各100ヌクレオチド当たり最大10個の変異(例えば、置換、欠損、挿入)を含み得ること以外は参照配列と同一であることを意図するものである。これらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端位置、またはそれらの5’もしくは3’末端位置間の任意の場所で、参照配列内のヌクレオチド間で個別に、または参照配列内の1つまたは複数の連続したグループで散在して生じ得る。
ある態様において、アプタマーは、配列番号1~14、配列番号23~39または配列番号43~55の最小有効フラグメントを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。ここで、“最小有効フラグメント”は、全長アプタマーと比較して、同じまたは改善された親和性で本明細書に規定される標的に結合することができる全長アプタマーのフラグメント(例えば、部分)を意味すると理解される。最小有効フラグメントは、全長アプタマーと本明細書で規定される標的への結合について競合し得る。
ある態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14、配列番号23~39および配列番号43~55の何れか1つに記載の配列の何れかの少なくとも10個の連続した核酸残基を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなり、標的分子に対する同等または改善された結合性を示す。ある態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14、配列番号23~39および配列番号43~55の何れか1つに記載の配列の何れかの少なくとも10個の連続した核酸残基を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなり、標的分子への十分な(adequate)結合を示す。適切な結合は、本明細書に記載の親和性および特異性で生じる標的分子への結合、または上記の完全長アプタマー配列の結合よりも低い親和性および/もしくは特異性であるが、それぞれの標的の存在の報告を送達することができる結合を含む。
ある態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14、配列番号23~39および配列番号43~55の何れか1つに記載の配列の何れかの少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなり、標的分子に対する同等または改善された結合性を示す。ある態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14、配列番号23~39および配列番号43~55の何れか1つに記載の配列の何れかの少なくとも20個の連続した核酸残基を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなり、標的分子への十分な(adequate)結合を示す。適切な結合は、本明細書に記載の親和性および特異性で生じる標的分子への結合、または上記の完全長アプタマー配列の結合よりも低い親和性および/もしくは特異性であるが、それぞれの標的の存在の報告を送達することができる結合を含む。
ある態様において、本発明のアプタマーは、配列番号1~14、配列番号23~39および配列番号43~55の何れか1つに記載の配列の何れかの少なくとも24個の連続したヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
ある態様において、アプタマーは、配列番号1の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号1からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号2の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号2からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号3の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号3からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号3からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号4の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号4からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号4からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号5の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号5からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号5からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号6の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号6からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号6からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号7の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号7からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号7からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号8の核酸配列における、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個または40個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号8からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号8からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号9の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号9からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号9からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号10の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号10からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号10からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号11の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号11からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号11からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号12の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個または76個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号12からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号12からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号13の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個または82個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号13からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号13からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号14の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号14からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、14ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号14からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号23の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個または36個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号23からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号23からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号24の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個または33個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号24からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号24からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号25の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個または41個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号25からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号25からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号26の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個または38個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号26からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号26からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号27の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個または50個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号27からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、14ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号27からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号28の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個または24個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号28からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、15ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号29の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個または51個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号29からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号29からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号30の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個または46個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号30からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号30からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号31の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個または57個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号31からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号31からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号32の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個または58個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号32からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、32ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号32からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号33の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個または48個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号33からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号33からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号34の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個または31個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号34からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号34からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号35の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個または25個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号35からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号36の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個または62個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号36からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号36からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号37の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個または41個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号37からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号37からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号38の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個または56個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号38からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号38からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号39の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個または57個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号39からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号39からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号43の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個または35個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号43からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号43からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号44の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個または48個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号44からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号44からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号45の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個または48個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号45からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号45からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号46の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個または77個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号46からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号46からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号47の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個または50個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号47からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号47からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号48の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個または61個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号48からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号48からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号49の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個または63個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号49からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、14ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号49からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号50の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個または76個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号50からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号50からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号51の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個または32個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号51からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号51からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号52の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個または37個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号52からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号52からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号53の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個または84個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号53からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号53からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号54の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個または81個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号54からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号54からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号55の核酸配列における、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個または53個の連続ヌクレオチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。アプタマーは、配列番号55からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、25ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。アプタマーは、配列番号55からの連続ヌクレオチドの任意のスパンを含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成されてもよく、ここでスパンは、10ヌクレオチドから全長まで1ヌクレオチド増分で選択された長さを有する。
これらの配列は、全長アプタマーと比較して、本明細書に記載の標的タンパク質への等価な、好適なまたは改善された結合を有するアプタマーフラグメントに関する。
ある態様において、アプタマーは、配列番号1~11、13~14および53~54の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、60個、65個、70個、75個、80個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号12、46および50の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、60個、65個、70個、75個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号36、48および49の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、60個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号29、31、32、38、39、47および55の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、60個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号27、29、31、32、38、39、47および55の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号25、30、37、44および45の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号23、24、26、34、43、51および52の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個、25個、30個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。ある態様において、アプタマーは、配列番号28および35の何れかと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上の同一性を有する配列の少なくとも約10個、15個、20個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれから構成される。本明細書中、用語“約”は、一般的には、参照されたヌクレオチド配列長にその参照された長さの10%を加えたものまたは引いたものを意味する。本発明のある面は、2以上のアプタマーを含む組成物または2以上のアプタマーを含む組合せに関する。態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーの各々は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;および、配列番号55からなる群より選択される核酸配列を含むか、または本質的にそれからなるアプタマー、または配列番号1~14、23~39および42~55の何れかと少なくとも90%、例えば95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有する核酸配列を含むか、または本質的にそれからなるアプタマー、から独立して選択される。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうちの一方は、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、該組成物または組合せは、配列番号1~14、23~39および43~54に記載の何れかの核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる1以上のアプタマーをさらに含む。
本発明の態様は、3以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、各アプタマーは、配列番号1~14、23~39および43~55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなるアプタマーから独立して選択される。
本発明の態様は、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる組成物または組合せに関し、該組成物または組合せは、配列番号1~14、23~39および43~54に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなるアプタマーから独立して選択される2以上のアプタマーをさらに含む。
本発明の態様は、3以上のアプタマーの組成物または組合せに関し、ここで、各アプタマーは、配列番号1~14、23~39および43~55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなるアプタマーであるか、あるいは配列番号1~14、23~39および43~55の何れかと少なくとも90%、例えば95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有する核酸配列を含むか、または本質的にそれからなるアプタマーである。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうちの一方は、配列番号1に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば2以上のアプタマーの第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号2に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば2以上のアプタマーの第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号3に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば2以上のアプタマーの第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号4に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば2以上のアプタマーの第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号5に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーの第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号6に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーの第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうちの一方は、配列番号7に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的それからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号8に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号9に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号10に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号11に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号12に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号13に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号14に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号23に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号24に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号25に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号26に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号27に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号28に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号29に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号30に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号31に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号32に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号33に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号34に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号35に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号36に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号37に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号38に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号39に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号43に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号44に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号45に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号46に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号47に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号48に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号49に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号50に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号51に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号52に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号53に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、2以上のアプタマーを含む組成物または組合せに関し、ここで、2以上のアプタマーのうち一方は、配列番号54に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなり、要すれば、2以上のアプタマーのうち第2のアプタマーは、配列番号55に記載の核酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の態様は、以下のアプタマーを含む組成物または組合せに関する:CotE H2.1.2(配列番号30);CotE D2.1(配列番号31);CotA C1.1(配列番号33);および、CotEC キチナーゼ(配列番号36)。アプタマーは、天然または非天然のヌクレオチドおよび/または塩基誘導体(または、それらの組合せ)を含み得る。ある態様において、アプタマーは、デオキシリボース、リボース、リン酸、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)またはウラシル(U)以外の化学構造を含むように1つまたは複数の修飾を含む。アプタマーは、核酸塩基で、糖で、またはリン酸骨格で修飾されてもよい。
ある態様において、アプタマーは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾としては、例えば、アルキル化、アリール化またはアセチル化、アルコキシル化、ハロゲン化、アミノ基、あるいは別の官能基を含むヌクレオチドが含まれる。修飾ヌクレオチドの例としては、RNAアプタマーに用いられる2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-NH2-、2’-OCH3-および2’-O-メトキシエチルリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
アプタマーは、その全部または一部がホスホロチオエートまたはDNA、ホスホロジチオエートまたはDNA、ホスホロセレノエートまたはDNA、ホスホロジセレノエートまたはDNA、ロック核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、N3’-P5’ ホスホロアミダイトRNA/DNA、シクロヘキセン核酸(CeNA)、トリシクロDNA(tcDNA)またはスピーゲルマー、あるいはホスホロアミダイトモルホリン(PMO)成分または当業者に知られているその他の修飾(Chan et al. , Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33, 533-540参照)であってよい。
修飾の中には、アプタマーを核酸切断酵素に対して安定化させることができるものがある。アプタマーの安定化において、アプタマーのその後の修飾と、既に修飾されたRNA/DNAの選択とは、一般に区別され得る。安定化は、修飾されたRNA/DNAアプタマーの親和性には影響しないが、生物、生体溶液または溶液中で、RNase/DNaseによってアプタマーが急速に分解されるのを防ぐことができる。アプタマーは、サンプル(例えば、生物学的媒体、生物、溶液)中のアプタマーの半減期が1分以上、1時間以上または1日以上である場合、安定化したと言われる。アプタマーは、レポーター分子で修飾されていてもよく、これにより標識されたアプタマーの検出が可能になる。レポーター分子はまた、アプタマーの安定性を高めることに寄与し得る。
アプタマーは、その核酸配列に依存する三次元構造を形成する。アプタマーの三次元構造は、ワトソンとクリックの分子内塩基対形成、フーグスティーン塩基対形成(四重鎖)、ウォブル対形成、または他の非標準的な塩基対相互作用(non-canonical base interactions)に起因して生じ得る。この構造は、抗原抗体結合に類似するアプタマーが、標的構造を正確に結合することを可能にする。アプタマーの核酸配列は、定義された条件下で、定義された標的構造に特異的な三次元構造を有し得る。
態様は、本明細書に定義の標的への結合を、本明細書に記載のアプタマーと競合させる競合アプタマーを含む。態様は、配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つに記載のアプタマー、または配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つのヌクレオチド配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性がある核酸配列を有するアプタマーを用いて本明細書に定義の標的への結合について競合する競合アプタマーを含む。態様は、本明細書で定義の標的への結合を、上記のアプタマーのうちの1以上と競合する、競合的な1以上のアプタマーを含む。ある態様において、競合アッセイは、本明細書で規定される標的への結合について競合する競合アプタマーを同定するために用いられ得る。例示的な、限定されない、競争アッセイでは、本明細書で規定される固定化標的は、本明細書で規定される標的タンパク質に結合する第1の標識アプタマーと、本明細書で規定される標的への結合について第1のアプタマーと競合するその能力について試験されている第2の非標識アプタマーとを含む溶液中でインキュベートされる。対照として、本明細書で規定される固定化標的は、第1の標識アプタマーを含み、第2の非標識アプタマーを含まない溶液中でインキュベートされ得る。本明細書で規定される標的への第1のアプタマーの結合に許容される条件下でインキュベートした後、過剰の未結合アプタマーを除去し、本明細書で規定される固定化標的に関連する標識の量を測定することができる。本明細書で規定される固定化された標的に関連する標識の量が、対照サンプルと比較して試験サンプルで大幅に減少している場合、第2のアプタマーが、本明細書で規定される標的への結合に関して第1のアプタマーと競合していることを示す。
方法
本発明の態様は、difficile芽胞を致死または不活性化させるための方法であって、該芽胞を殺胞子性溶液おびアプタマーと接触させることを含む、方法に関する。
本発明の態様は、difficile芽胞を致死または不活性化させるための方法であって、該芽胞を殺胞子性溶液おびアプタマーと接触させることを含む、方法に関する。
ある態様において、本方法は、殺胞子性溶液の殺胞子効果を高めるためのものであり、C. difficile芽胞を、殺胞子性溶液の前、それと同時、またはそれに続いて、本明細書に記載のアプタマーと接触させることを含む。本発明の態様は、C.difficileがある場所、例えば表面上に位置するかどうかを決定する第1の工程を含む方法に関する。
本明細書中、用語“芽胞を致死または不活性化させる”とは、該芽胞の少なくとも85%、例えば86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも99%が植物細胞に変化(発芽)できないことを意味すると意図される。
ある態様において、胞子の99.9%が植物細胞に形質転換できない。ある態様において、胞子の99.99%または99.999%は、植物細胞に形質転換できない。ある態様において、胞子の少なくとも85%が、植物細胞に形質転換できない。
C. difficileのコロニー形成は、単一の菌株で構成されるか、または菌株の混合物であってもよい。例えば、C. difficileは、クレード1、2、3、4および5から選択されるクレードの株であってよい。特定の態様において、菌株は、SH7(クレード1)、SH8(クレード2)、R20291(クレード2)、SH9(クレード3)、SH10(クレード4)、ATCC 43598(クレード4)およびSH11(クレード5)から選択される。特定の態様において、菌株は、R20291、ATCC 43598およびSH11から選択される。
芽胞は、0℃~90℃の間の温度、例えば5℃~80℃の間の温度、例えば10℃~70℃の間の温度、15℃~60℃の間の温度、18℃~50℃の間の温度、または20℃~40℃の間の温度、例えば20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃もしくは40℃の温度で接触させることもできる。
ある態様において、本方法は、約5℃~約90℃の間の温度、例えば5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃または90℃の温度で実施される。ある態様において、方法は、約5℃~約90℃の範囲の温度で実施されてもよい。ある態様において、方法は、約5℃~10℃の範囲内の温度、10℃~15℃の範囲内の温度、15℃~20℃の範囲内の温度、20℃~25℃の範囲内の温度、25℃~30℃の範囲内の温度、30℃~35℃の範囲内の温度、35℃~40℃の範囲内の温度、40℃~45℃の範囲内の温度、45℃~50℃の範囲内の温度、50℃~55℃の範囲内の温度、55℃~60℃の範囲内の温度、60℃~65℃の範囲内の温度、65℃~70℃の範囲内の温度、70℃~75℃の範囲内の温度、75℃~80℃の範囲内の温度、80℃~85℃の範囲内の温度、85℃~90℃の範囲内の温度、またはこれらの温度範囲の何れか内の温度で実施されてもよい。ある態様において、加熱温度は、5℃~90℃の範囲から選択される1℃刻みから選択される。
本発明の特定の態様は、様々な環境において芽胞を致死または不活性化させるために好適な方法およびキットを提供する。本発明の特定の態様は、様々な環境において殺胞子性溶液のC. difficile芽胞に対する殺胞子効果を高めるのに適する方法およびキットを提供する。特定の態様の方法および製品は、何れかの環境、例えば、ヘルスケア産業(例えば、動物病院、病院、動物診療所、診療所、老人ホーム、子供または高齢者向けのデイケア施設など)、食品業界(例えば、レストラン、食品加工工場、食品貯蔵工場、食料品店など)、接客業種(例えば、ホテル、モーテル、リゾート、クルーズ船など)、教育業界(例えば、学校および大学など)で、胞子(芽胞)汚染を低減するために用いられ得る。
本発明の組成物は、望ましくは、何れかの環境、例えば、一般的-建物表面(例えば、床、壁、天井、家具の外装など)、特定-設備表面(例えば、硬表面、製造設備、加工設備など)、繊維(例えば、綿、ウール、シルク、ポリエステル、ポリオレフィン、アクリルなどの合成繊維、綿ポリエステルなどの繊維ブレンドなど)、木材およびセルロースベースの系(紙など)、土壌、動物の死体(皮、肉、毛、羽など)、食品(果物、野菜、ナッツ、肉など)および水において、胞子汚染を低減するために用いられ得る。
一態様において、本発明の方法は、織物の殺胞子処理に関する。本発明の組成物で処理できる織物の限定されない例としては、個人的用品(例えば、シャツ、パンツ、ストッキング、下着など)、施設用品(例えば、タオル、白衣、ガウン、エプロンなど)、接客用品(例えば、タオル、ナプキン、テーブルクロスなど)が挙げられるが、これらに限定されない。
表面は、非生物表面であってもよい。表面は、例えば、ヘルスケア環境、例えば、病院、薬局、外科手術室および/またはケアホーム施設に位置する表面であってもよい。アプタマーは、学校、刑務所、ホステル、寮、電車、バスおよび飛行機からなる群より選択される環境中の物体の表面に存在するC. difficile芽胞を致死および/または不活化させるため(および要すれば最初に検出するため)に用いられ得る。
表面は、病院または他のヘルスケア環境などの場所にある物体に位置していてもよい。例えば、物体は、手術台、病院のベッド、手術器具、テーブル、手術用スクラブ、ごみ箱、食器類、椅子、ドアハンドルおよびドアノブからなる群より選択されてもよい。あるいは、またはさらに、表面は、例えば病院の病室、手術室、介護施設の部屋などにおける壁、天井および/または床などの場所に配置されていてもよい。
ある態様において、表面は、例えば店、バーおよび/またはレストランなどの地域社会の環境における物体の表面であってもよい。限定されない例において、表面は、壁、床、家具の一品、カトラリー、包装、飲料容器などに位置していてもよい。
ある態様において、表面は、家庭環境にある。
ある態様において、表面は食品生産施設にある。
特定の態様において、表面は、ステンレス鋼で構成される。特定の態様において、表面は、段ボールで構成される。ある態様において、表面はプラスチックで構成される。
特定の態様において、本方法は、本発明のアプタマーを含む組成物を、表面に直接接触させることを含む。すなわち、特定の態様において、本方法は、アプタマーを含む組成物を表面に塗布することを含む。ある態様において、本方法は、本発明のアプタマーを含む組成物を表面に間接的に接触させることを含む。
アプタマーを表面に直接接触させる態様において、方法は、アプタマーを、表面全体に分散させることが可能な組成物中に提供することを含み得る。特定の態様において、表面との即時接触は、最大の表面積被覆のために組成物を均一に分散させ、湿潤性は、C. difficile芽胞上の標的分子へのアプタマーの接近を容易にする。
ほとんどの環境表面領域は、中性(非帯電)であるか、または負の静電エネルギーを有する。特定の態様において、アプタマーは、静電気的な吸引力を用いて標的表面領域に適用される。静電的に塗布された液体は、複雑な物体および視線から隠れた領域が液体でコーティングされるため、ラッピング効果を有すると考えられている。
静電塗布方式は、クーロンの法則に基づき、アプタマー/バッファー溶液をより均一に全ての表面に塗布することができる。クーロンの法則とは、2点間の電荷の相互作用による静電気力の大きさが、該2点間の距離の2乗に反比例するという法則である。この力は、両者を結ぶ直線に沿ったものである。帯電したスプレー液滴は表面に引き寄せられ、対象物の周囲を包み込むような効果があると考えられている。
クーロンの法則を用いて、これらのシステムは、スプレーノズルから出る薬液にプラスまたはマイナスの電荷を掛ける。ほとんどの表面領域は中性または陰性であるため、正に帯電した静電スプレー塗布システムは、最適な付着力および吸引力を有する。分散された液滴は、より均等に広がり、負(-)または中性に帯電した表面を見出し得る。したがって、特定の態様において、本明細書に記載のアプタマーを含む組成物は、より標的化され、かつより少ない廃棄でより一貫した被覆を提供する。
ある態様において、この方法は、アプタマーを含む組成物を、電極で改変されたスプレー銃によって表面に塗布することを含む。電極は、アプタマーを含む液滴を帯電させ、次いで、アプタマーは、アプタマーに対して通常反対電荷に帯電している表面へと誘導される。
ある態様において、この方法は、アプタマーを含む組成物を製造することを含む。ある態様において、本発明のアプタマーは、乾燥形態で提供され、緩衝液またはdH2Oで所望のストック濃度に完全に溶解される。これは、例えば、所定時間、例えば20分、25分、30分またはそれ以上、例えば35分、40分、45分またはそれ以上、組成物を振盪することによって達成され得る。組成物は、有機溶媒、例えば、DMSO、エタノールおよび/またはメタノールを含み得る。さらに、組成物は、例えばナトリウムイオンのような塩を含んでいてもよい。
ある態様において、方法は、アプタマーを緩衝液に溶解させることを含む。緩衝液は、例えば、PBS、HEPES、Tris等から選択され得る。一般的には、アプタマーは、中性pH範囲(7.0~8.0)で安定である。アプタマー構造を緩衝液中で適切に折り畳むために、加熱および冷却工程を実施してもよい(例えば、95℃で5分間加熱し、その後、室温まで除去に冷却する)。特定の態様において、この方法は、緩衝液中にマグネシウムなどの2価(2+)イオンを供給することを含む。マグネシウムのような2価のイオンは、アプタマーの適切な構造を維持するために、特定の態様において有利であり得る。
結合緩衝液の状態(pH7.4)における核酸アプタマーは負に帯電しており、静電的相互作用によりアプタマーは正に帯電した領域へ結合され得る。このアプタマー/バッファーと容器との相互作用を避けるために、帯電防止処理された材料(例えば、プラスチックやガラス容器)を用いることが重要である。一般的には、噴霧器はプラスチック製であり得る。
ある態様において、本方法は、アプタマーを含む組成物を、表面に噴霧することによって表面に適用することを含む。
ある態様において、アプタマーは、表面に噴霧される前に凍結乾燥されてもよい。したがって、特定の態様において、この方法は、本明細書に記載のアプタマーを含む凍結乾燥組成物と表面を接触させる工程を含む。
噴霧凍結工程の間、液体中に溶解または懸濁されたアプタマーは、低温流体、通常は液体窒素によって瞬間的に凍結される微細な液滴に噴霧化される。その後、凍結された粒子は、低温高圧下で溶媒を昇華させる凍結乾燥に付され、乾燥多孔質粒子が形成される。物理的なサイズが大きく、かつ密度が低い多孔質粒子は、空気力学的なサイズが小さいため、高い流動性を付与し得る。また、体積に対する接触面積が小さいため、粒子間の凝集力が低く、故に空気中での分散が容易である。さらに、多孔質粒子は、高い比表面積を有し、それによって溶解速度を早めることができる。
ある態様において、この方法は、表面を液体溶液と接触させる前に、凍結乾燥させたアプタマーを溶液に溶解させることを含む。
ある態様において、場所、例えば表面で、C. difficileを致死および/または不活性化させる方法は、C. difficile芽胞を含むと予期される場所に本発明のアプタマーの1以上を適用することを含み得る。C. difficile芽胞にアプタマーが結合するのに十分な所定時間の後、表面は、結合していないアプタマーを除去するために1回以上洗浄されてもよい。ある態様において、例えば、本明細書に記載のFRETペアまたはビーコンが用いられるとき、洗浄工程は不要である。
特定の態様において、ステンレス鋼、ポリスチレンなどの環境表面での使用のために、アプタマーは、標的、すなわちC. difficile芽胞に付着し、蛍光を発するように設計されている。アプタマーは、無機物表面に付着するだけでは蛍光を発することはない。
殺胞子剤
本発明の態様は、殺胞子剤、例えば殺胞子性溶液の使用を含む。細菌の芽胞は、化学的および物理的な薬剤に対して高い耐性を有すると考えられている。本発明の態様は、胞子の殺胞子剤に対する感度を高めることを目的とする。
本発明の態様は、殺胞子剤、例えば殺胞子性溶液の使用を含む。細菌の芽胞は、化学的および物理的な薬剤に対して高い耐性を有すると考えられている。本発明の態様は、胞子の殺胞子剤に対する感度を高めることを目的とする。
本明細書で用いる用語“殺胞子剤(sporicidal agent)”とは、C. difficile芽胞を致死させることが可能な薬剤を意味する。特定の態様において、本明細書に記載の方法は、殺胞子剤を静胞子剤、すなわち、芽胞の発芽または増殖またはその両方を阻害する薬剤で置き換えてもよい。特定の薬剤は、特定の濃度および/または温度で静胞子性であり、より高い濃度および/または温度で殺胞子性であり得る。
殺胞子剤の例としては、グルタルアルデヒド、次亜塩素酸ナトリウム、ヨウ素、過酸化水素および過酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の態様で用いるための殺胞子性溶液は、アルキル化剤および酸化剤、および/または塩素放出剤であってもよい。
ある態様において、殺胞子剤は溶液である。ある態様において、殺胞子剤は、水の添加により過酢酸を生成する薬剤を含む。ある態様において、殺胞子剤は、過酢酸を含む溶液である。溶液は、乾燥したワイプ(Clinellの商品名で販売されているワイプなど)を濡らし、濡らしたワイプから溶液を絞り出すことによって形成されてもよい。
特定の態様において、殺胞子剤は、濃度≦50(%wt)の過炭酸ナトリウム(Cas No.239-707-6 15630-89-4)およびクエン酸(濃度≦20(%wt))(Cas No.77-92-9 201-069-1)を含むワイプから形成されている。拭き取りワイプはまた、テトラアセチルエチレンジアミン(濃度≦25%wt)を含んでいてもよい。
ある態様において、殺胞子剤は、過酢酸を含む溶液である。ある態様において、殺胞子剤は、過酢酸を生成することができる薬剤を含む。ある態様において、殺胞子剤は、過炭酸ナトリウムを含む。
ある態様において、殺胞子剤は、mikrozid(登録商標)の商品名で販売されている拭き取り剤であってもよい。
ある態様において、殺胞子剤は、過酢酸(例えば、100gの薬剤溶液中に約0.05%~0.10%の濃度)および過酸化水素を含む。殺胞子剤は、酢酸をさらに含んでいてもよい。特定の態様において、薬剤は、約0.06%の過酢酸を含む。
ある態様において、殺胞子性溶液は、次亜塩素酸ナトリウムを含む。溶液は、約0.3%~約0.7%v.v.の間の濃度の次亜塩素酸ナトリウムを含んでいてよい。溶液は、本発明の態様の方法において用いるための殺胞子性溶液を形成するために予め希釈され得る。
ある態様において、殺胞子性溶液は、過酸化水素を、例えば約1.5%含んでいてもよい(Aseptix Sterimax Sporicide wipes)。ある態様において、溶液は、銀安定化過酸化水素、例えば商標EndoSan(登録商標)下で販売されている溶液を含む。
ある態様において、殺胞子性溶液は、ジグルコン酸クロルヘキシジンを含む。好適には、殺胞子性溶液は、Chemgene(商標)というブランド名で販売されている溶液である。
ある態様において、殺胞子性溶液は、有効成分として、グルコプロタミン(glucoprotamin)1.5%(Incidin plus wipes);エタノール、プロパンおよびN-アルキルアミノプロピルグリシンの混合物(Bacillol 30 tissues);および、最後に、塩化ジデシルジモニウム、塩化ベンザルコニウム、ポリアミノプロピル、ビグアニドおよびジメチコンの混合物(Formula 429 spray)を含む。
検出可能な標識
ある態様において、本発明のアプタマーは、ある場所におけるC. difficileの量を検出および/または定量化するために用いられる。ある態様において、この方法は、ある場所を殺胞子剤(すなわち、芽胞を致死させる薬剤)および/または静胞子剤(例えば、芽胞の発芽または伸長を阻害する薬剤)と接触させる前に、表面におけるC. difficileの存在、不存在および/または濃度を決定する工程を含む。存在、不存在および/または濃度を決定する工程は、アプタマー-芽胞複合体が形成されるのを可能にするために、ある期間の間、本明細書で規定される1以上のアプタマーとその場所を接触させることを含む。
ある態様において、本発明のアプタマーは、ある場所におけるC. difficileの量を検出および/または定量化するために用いられる。ある態様において、この方法は、ある場所を殺胞子剤(すなわち、芽胞を致死させる薬剤)および/または静胞子剤(例えば、芽胞の発芽または伸長を阻害する薬剤)と接触させる前に、表面におけるC. difficileの存在、不存在および/または濃度を決定する工程を含む。存在、不存在および/または濃度を決定する工程は、アプタマー-芽胞複合体が形成されるのを可能にするために、ある期間の間、本明細書で規定される1以上のアプタマーとその場所を接触させることを含む。
ある態様において、アプタマーは、検出分子を含む。アプタマーの検出および/または定量を容易にすることができる何れかの標識が、本明細書で用いられ得る。
ある態様において、検出可能な標識は、蛍光部分、例えば、蛍光/クエンチャー化合物である。蛍光/クエンチャー化合物は、当該技術分野において既知である。例えば、Mary Katherine Johansson, Methods in Molecular Biol.335を参照のこと。Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols, 2006, Didenko, ed., Humana Press, Totowa, NJ、およびMarrasら, 2002, Nucl. Acids Res. 30, el22 (引用により本明細書中に包含させる)。
ある態様において、検出可能な標識はFAMである。ある態様において、FAM-標識は、アプタマーの第1および/または第2のプライマー領域に位置する。当業者であれば、標識がアプタマー内の何れかの適切な位置に配置され得ることを理解し得る。
互いに近接したときに検出可能なシグナルの増加をもたらす部位も、例えば、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)(Fluorescence Resoance Energy Transfer)の結果として、本明細書中で用いられ得る;適切な対(ペア)としては、いくつか例を挙げると、フルオレセインおよびテトラメチルローダミン;ローダミン6Gおよびマラカイトグリーン、ならびにFITCおよびチオセミカルバゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様において、検出可能な標識は、以下の限定されない例のうちの少なくとも1つから選択される:フルオロフォア、ナノ粒子、量子ドット、酵素、放射性同位体、予め規定された配列部分、ビオチン、デスチオビオチン、チオール基、アミン基、アジド基、アミノアリル基、ジゴキシゲニン、抗体、触媒、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、デンドリマー、タンパク質およびリポソーム。
ある態様において、検出可能な標識は、緑色蛍光タンパク質(GFP)または当業者に知られている他の何れかの蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質である。
ある態様において、検出の性質は、用いられる検出可能な標識によって変わる。例えば、標識は、その色、例えば金ナノ粒子によって検出可能であってもよい。色は、光学読取装置またはカメラ、例えば画像処理ソフトウェアを備えたカメラによって定量的に検出することができる。
ある態様において、検出可能な標識は、蛍光標識、例えば量子ドットである。そのような態様において、検出手段は、蛍光プレートリーダー、ストリップリーダー(strip reader)または類似のものであってよく、蛍光強度を記録するように構成されている。
検出可能な標識が酵素標識である態様において、検出手段は、例えば、比色、化学発光および/または電気化学(電気化学検出器を用いることを含む)であってもよい。電気化学的検出は、アプタマーの一端に酸化還元レポーター(メチレンブルーまたはフェロセンを含むが、これらに限定されない)を結合させ、他端にセンサー表面を結合させることによるものであってもよい。一般的に、標的との結合に伴うアプタマーの立体構造の変化により、レポーターとセンサーとの間の距離が変化し、読み出しが行われる。
ある態様において、検出可能標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(APP)または類似物等の酵素をさらに含み、触媒的に基質を回転させて増幅したシグナルを与えてもよい。
ある態様において、本発明は、本発明のアプタマーおよび検出可能な分子を含む複合体(例えば、コンジュゲート)を提供する。一般的には、本発明のアプタマーは、検出可能な分子に共有結合または物理的に複合体化されている。
ある態様において、検出可能な分子は、視覚的、光学的、フォトニック、電子的、音響的、光音響的、質量的、電気化学的、電気光学的、分光的、酵素的またはその他の物理的、化学的もしくは生化学的に検出可能な標識である。
ある態様において、検出可能な分子は、ルミネセンス、UV/VIS分光法、酵素的、電気化学的または放射活性的に検出される。ルミネセンスは、光の放射を意味する。標識の検出には、例えば、フォトルミネッセンス、ケミルミネッセンスおよびバイオルミネッセンスが用いられる。フォトルミネッセンスまたは蛍光では、光子(フォトン)の吸収によって励起が起こる。例示的なフルオロフォアとしては、ビスベンズイミダゾール、フルオレセイン、アクリジンオレンジ、Cy5、Cy3またはヨウ化プロピジウム(アプタマーに共有結合することができる)、テトラメチル-6-カルボキシホーダミン(TAMRA)、テキサスレッド(TR)、ローダミン、アレクサフルール色素等(異なる会社からの異なる波長の蛍光性色素)が挙げられるが、それらに限定されない。
特定の態様において、検出可能な分子は、FRETペアのうちの一方である。特定の態様において、アプタマーは、検出可能な分子としてFRETペアを含み得る。C. difficile胞子へのアプタマーの結合は、検出可能である消光の喪失をもたらし得る。
ある態様において、検出可能な分子は、コロイド状金属粒子、例えば金ナノ粒子、コロイド状非金属粒子、量子ドット、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー(例えば、カーボンナノファイバー)、ナノチューブ(例えば、カーボンナノチューブ)、デンドリマー、タンパク質またはシグナル生成物質を有するリポソームである。コロイド粒子は、比色的に検出され得る。
ある態様において、検出可能な分子は酵素である。特定の態様において、酵素は、基質を着色生成物に変換してもよく、例えば、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼであり得る。例えば、無色の基質X-galは、β-ガラクトシダーゼの活性によって、その色が視覚的に検出される青色の生成物に変換される。
ある態様において、検出分子は放射性同位体である。検出はまた、アプタマーが標識された放射性同位体(3H、14C、32P、33P、35Sまたは125Iを含むがこれらに限定されない。好ましくは、32P、33Pまたは125Iである)によって実施され得る。シンチレーション計数において、放射性標識されたアプタマー標的複合体によって放出される放射性放射線が間接的に測定される。シンチレーター物質は、同位体の放射性放出によって励起される。シンチレーター物質が基底状態に戻る際に、励起エネルギーが光の閃光として再び放出され、光電子増倍管によって増幅され計数される。
ある態様において、検出可能な分子は、ジゴキシゲニンおよびビオチンから選択される。従って、アプタマーはまた、ジゴキシゲニンまたはビオチンで標識されてもよく、これは、例えば抗体またはストレプトアビジンによって結合され、次に酵素複合体などの標識が担持されてもよい。アプタマーと酵素との事前の共有結合(コンジュゲーション)は、いくつかの既知の方法で達成することができる。アプタマー結合の検出はまた、RIA(ラジオイムノアッセイ)における放射性同位元素によるアプタマーの標識により達成され得る。ある態様において、放射性同位元素は125Iである。アプタマー結合の検出はまた、フルオロフォアによるFIA(フルオロイムノアッセイ)における蛍光によるアプタマーの標識によっても達成され得る。ある態様において、フルオロフォアはフルオレセインまたはFITCである。
ある態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アプタマー(例えば、H2.1.2-配列番号40~41として)の5’末端、3’末端、5’末端および3’末端または何れかの関連配列に相補的であるハイブリダイゼーション用に設計され得る。ある態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはフルオロフォアを含む。
ある態様は、場所、例えば表面における本明細書で規定される標的の存在、不存在または量を検出するための方法を含む。該方法において、表面は、本明細書に記載のアプタマーと相互作用させる(すなわち、接触させる)ことができる。例えば、表面および本明細書に記載のアプタマーは、アプタマーの少なくとも一部がサンプル中の本明細書に規定されるような標的に結合するために十分な条件下でインキュベートされてもよい。
当業者であれば、本明細書に記載のアプタマーと本明細書に規定された標的との間で結合が起こるために必要な条件を理解し得る。ある態様において、サンプル、例えばC. difficile芽胞を含むと予期される場所における標的表面およびアプタマーは、約4℃~約40℃の間の温度でインキュベートされてもよい。ある態様において、サンプルおよびアプタマーは、約20℃~約37℃の間の温度でインキュベートされてもよい。ある態様において、サンプルおよびアプタマーは、22℃の温度でインキュベートされてもよい。インキュベーション温度は、4℃~20℃未満、20℃~22℃未満、22℃~24℃未満、24℃~26℃未満、26℃~28℃未満、28℃~30℃未満、30℃~32℃未満、32℃~34℃未満、34℃~36℃未満、36℃~37℃未満、および37℃~40℃未満の範囲から選択することができる。ある態様において、サンプルおよびアプタマーは、緩衝液(例示的な緩衝液としてはPBSが挙げられるが、これに限定されない)で異なる濃度(例えば、少なくとも約1%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%v/v以上)に希釈され得る。希釈濃度は、1%~5%未満、5%~10%未満、10%~20%未満、20%~30%未満、30%~40%未満、40%~50%未満、50%~60%未満、60%~70%未満、70%~80%未満または80%~90%未満の範囲から選択されてもよい。ある態様において、希釈前のアプタマー濃度は、100nM~50μMであり得る。ある態様において、希釈前のアプタマー濃度は、100nM~500nM、500nM~1μM、1μM~2μM、2μM~5μM、5μM~10μM、10μM~15μM、15μM~20μM、20μM~30μM、30μM~40μM、40μM~50μM、50μM~60μM、60μM~70μM、70μM~80μM、80μM~90μM、90μM~100μMの範囲から選択されてよい。ある態様において、希釈前のアプタマー濃度は、本明細書に記載される範囲から選択される濃度であってよい。選択された値は、本明細書に記載の範囲内の0.1μM増大濃度から選択されてもよい。ある態様において、希釈前のアプタマー濃度は、2μMであってもよい。ある態様において、結合に用いられるアプタマー濃度は、10μM~40μMの範囲から選択され得る。ある態様において、結合に用いられるアプタマー濃度は、10μM~15μM、15μM~20μM、20μM~25μM、25μM~30μM、30μM~35μM、35μM~40μMまたは10μM~40μMの範囲から選択される1μM増分より選択されるこれらの濃度範囲の何れかの間の濃度から選択されてもよい。ある態様において、結合のために用いられるアプタマー濃度は、20μMであってよい。ある態様において、結合のために用いられるアプタマー濃度は、25μMであってよい。ある態様において、結合のために用いられるアプタマー濃度は、30μMであってもよい。ある態様において、サンプルおよびアプタマーは、振盪および/または混合しながらインキュベートされてもよい。ある態様において、サンプルおよびアプタマーは、少なくとも1分間、少なくとも5分間、少なくとも15分間、少なくとも1時間またはそれ以上、インキュベートされる。サンプルおよびアプタマーは、1分~5分未満、5分~15分未満、15分~1時間未満、1時間~24時間未満、24時間~48時間未満、インキュベートされてもよい。
ある態様において、アプタマーと規定された標的との結合は、アプタマー-標的複合体の形成をもたらす。結合または結合イベントは、例えば、視覚的に、光学的に、光電的に、電子的に、音響的に、光音響的に、質量的に、電気化学的に、電気光学的に、分光学的に、酵素的にまたはその他化学的、生化学的もしくは物理的に、本明細書に記載するように検出され得る。
アプタマーと標的の結合は、何らかの好適な方法(technique)を用いて検出することができる。上記のように、例えば、アプタマーおよび標的の結合は、バイオセンサーを用いて検出されてもよい。ある態様において、アプタマーおよび標的の結合は、本明細書に記載のSPR、RlfS、BLI、LFDまたはELONAを用いて検出される。
ある態様において、この方法は、アプタマーのC. difficile芽胞への結合を決定する工程、およびその後に、C. difficile芽胞の致死および/または不活性化を決定する工程を含む。ある態様において、この方法は、C. difficile芽胞の致死および/または不活性化を可視化することを含む。かかる可視化は、検出可能なシグナルの消失、例えば視覚的シグナル、光学的シグナル、光電的シグナル、電子的シグナル、音響的シグナル、光音響的シグナル、質量的シグナル、電気化学的シグナル、電気光学的シグナル、分光学的シグナルまたは酵素的シグナルの減少または消失の形態であり得る。
ある態様において、この方法は、レーザーなどの光源;レンズなどの集光可能な光学器(focusable optics);励起または蛍光発光のスペクトルの変化をもたらすフィルターまたはモノクロメーター;および、アプタマーのC.difficile芽胞への結合および/またはC.difficile芽胞の致死および/または不活化を視覚化するために蛍光を測定するCCDカメラまたはシングルフォトンカウント検出器を用いることを含む。
この方法は、光源を用いてその場所を照らすための一連の条件を含んでいてもよい。ある態様において、光源は、フォレンジックライト(forensic light source)の形態であってよい。ある態様において、光源は、Polilight(登録商標) Flareの形態であってもよい。
ある態様において、光源は、異なる波長間で切り替えることが可能であってもよく、各波長は、特定の交換可能なフィルターに適している。フォレンジックライトは、LED、レーザー、Polilight(登録商標)などの形態であってもよい。ある態様において、光源は手持ち光源(handheld light source)である。ある態様において、手持ち光源は、例えばRofin Forensicから入手可能な電池式の手持ちLED光源であるPolilight Flare+2であってよい。
ある態様において、各Polilight Flare“トーチ”は、指定された波長範囲内の光を発生させ得る。例えば、ある態様において、光源は、約360nm-385nmの間の波長で光を発生してもよい(UV光)。ある態様において、光源は、約405nm-420nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約435nm-465nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約485nm-515nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約510nm-545nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約530nm-560nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約585nm-605nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約615nm-635nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約400nm-700nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約835nm-約865nmの間の波長で光を発生してもよい。ある態様において、光源は、約935nm-965nmの間の波長で光を発生してもよい。
ある態様において、用いられる光源は、アプタマーに結合された検出可能な分子と適合し得る。ある態様において、アプタマーは、検出分子に複合体化されている。ある態様において、検出分子は、光源の出力に対応するスペクトル範囲で発光するフルオロフォアであってもよい。ある態様において、アプタマーは、約505nmの波長で発光するフルオロフォアと共役していてもよい。ある態様において、光源は、約505nmの波長を有する光を発生させる。
ある態様において、本方法は、光源と組み合わせてバンドパスフィルターを使用することを含んでいてもよい。バンドパスフィルターは、特定の波長帯域の光を透過させ、所定の波長帯域外の迷光を排除するように構成されてもよい。ある態様において、光源は、365nm、415nm、450nm、505nm、530nm、545nm、620nmおよび850nmの中心波長を有する狭い帯域の光を発生するように構成されている。ある態様において、光源は、白色光波長に加えて、505nmの中心波長を有する狭い帯域の光を生成するように構成される。ある態様において、バンドパスフィルターは、590nmのバンドパスフィルターである。
ある態様において、本方法は、観察用ゴーグル、眼鏡または同様のものを用いて表面のある場所を視覚化することをさらに含んでいてもよい。ある態様において、観察用ゴーグルは、光源によって発生され、アプタマーに結合した検出分子によって放出される光の色に対応する色のものである。ある態様において、ゴーグルはオレンジ色であり、したがって、約485nm-515nmの間の波長、例えば505nmの波長を有する光を発生する光源、および約505nmの波長で放出する検出分子を含むアプタマーと組み合わせて用いるのに好適である。
組成物
本発明の特定の面において、本明細書に記載される1以上のアプタマー、および本明細書に規定される殺胞子剤および/または静胞子剤の組合せを提供する。この組合せは、表面などの場所でC. difficile、例えばC. difficile芽胞を致死および/または不活性化させる方法において使用するためのものであり得る。この組合せはまた、殺胞子剤の殺胞子活性の増強に使用するためのものであり得る。この組合せはまた、致死または不活性化の前にC. difficile芽胞を検出するために使用するためのものであってもよい。
本発明の特定の面において、本明細書に記載される1以上のアプタマー、および本明細書に規定される殺胞子剤および/または静胞子剤の組合せを提供する。この組合せは、表面などの場所でC. difficile、例えばC. difficile芽胞を致死および/または不活性化させる方法において使用するためのものであり得る。この組合せはまた、殺胞子剤の殺胞子活性の増強に使用するためのものであり得る。この組合せはまた、致死または不活性化の前にC. difficile芽胞を検出するために使用するためのものであってもよい。
本明細書で規定されるアプタマーおよび殺胞子剤は、単一の組成物中に提供されてもよい。組成物は、これらに限定されない、緩衝液、安定化剤、着色剤などのような他の成分をさらに含んでいてもよい。
あるいは、アプタマーおよび殺胞子剤は、別個の組成物において提供されてもよい。ある態様において、アプタマーおよび殺胞子剤は、その場所に逐次適用するためのものであってもよい。
本発明はまた、C. difficileの致死および/または不活性化のためのキットを提供し、ここで、キットは、本明細書に記載の1以上のアプタマーを含む。ある態様において、キットはまた、殺胞子剤も含む。ある態様において、殺胞子剤は、本明細書に記載されるような溶液である。ある態様において、キットはまた、本明細書に記載されるような検出可能な分子も含む。
ある態様において、キットは、本明細書に記載の方法の何れかの使用のための指示書をさらに含む。
一般的には、キットは、該キットまたは実施される方法が意図する反応、例えば濃縮、分離および/または単離手順の意図する検出のための成分をさらに含んでいてもよい。例としては、緩衝液、発色反応のための基質、色素または酵素基質が挙げられる。キットにおいて、アプタマーは、種々の形態、例えば、支持体(例えば、固体支持体)上に予め固定化されている形態、凍結乾燥されている形態、または液体培地中にある形態で提供され得る。
本発明のキットは、本明細書に記載の何れかの方法を実施するために用いられ得る。キットの部分は、バイアルに個別に包装されてもよいし、容器またはマルチ容器ユニットに組み合わせて包装されてもよいことが理解され得る。一般的には、キットの製造は、当業者に既知の標準的な方法に従う。
実施例
以下では、具体的な態様の限定されない例によって、本発明をより詳細に説明する。なお、実験例では、汚染(contamination)のない標準的な試薬および緩衝液を用いた。
以下では、具体的な態様の限定されない例によって、本発明をより詳細に説明する。なお、実験例では、汚染(contamination)のない標準的な試薬および緩衝液を用いた。
実施例1
クロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシル)SH11芽胞を用い、CotE_H2アプタマー存在下および不存在下で、5種の濃度で3種の殺胞子生成物の殺胞子活性を調べた。
クロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシル)SH11芽胞を用い、CotE_H2アプタマー存在下および不存在下で、5種の濃度で3種の殺胞子生成物の殺胞子活性を調べた。
C. difficile芽胞の2つの菌株を用いて、3種のアプタマー存在下および不存在下で、5種の濃度で3種の殺胞子製品の殺胞子活性を試験した。
材料および方法
試験微生物
この試験で用いたClostridium difficile芽胞の懸濁液は、表5に示す。
材料および方法
試験微生物
この試験で用いたClostridium difficile芽胞の懸濁液は、表5に示す。
C. difficile SH11懸濁液は、SporeGen(登録商標)により提供され、入手後4℃で保存した。Clostridioides difficile R20291懸濁液は、Sporegen(登録商標)により提供され、入手後4℃で保存した。
試験薬剤
用いた試験薬を表6および表7に示す。アプタマーおよび緩衝液は、Aptamer Group Limited から提供された。
殺胞子剤は、以下のように入手できる:
Chemgene(商標) (活性成分分子とミセル洗浄技術、生分解性、非腐食性を組み合わせた高レベル実験室用表面殺菌剤- https://www.starlabgroup.com/GB-en/gloves-safety/laboratory-disinfectant_WebPSub-159946/chemgene-hld4h-rtu-spray-blue-eucalyptus-1:20-750ml_SLXTM302-C.htmlを参照)
Endosan(登録商標)(硬質表面銀安定化過酸化水素- http://www.clinipathequipment.com/product/endosan-3-trigger-spray 参照)
Clinell(登録商標) (過カボン酸ナトリウム(≦50wt%)、クエン酸(≦20wt%)およびテトラアセチルエチレンジアミン(≦25wt%)を含む、過酢酸発生ワイプ - https://gamahealthcare.com/products/sporicidal-wipes を参照)。
用いた試験薬を表6および表7に示す。アプタマーおよび緩衝液は、Aptamer Group Limited から提供された。
殺胞子剤は、以下のように入手できる:
Chemgene(商標) (活性成分分子とミセル洗浄技術、生分解性、非腐食性を組み合わせた高レベル実験室用表面殺菌剤- https://www.starlabgroup.com/GB-en/gloves-safety/laboratory-disinfectant_WebPSub-159946/chemgene-hld4h-rtu-spray-blue-eucalyptus-1:20-750ml_SLXTM302-C.htmlを参照)
Endosan(登録商標)(硬質表面銀安定化過酸化水素- http://www.clinipathequipment.com/product/endosan-3-trigger-spray 参照)
Clinell(登録商標) (過カボン酸ナトリウム(≦50wt%)、クエン酸(≦20wt%)およびテトラアセチルエチレンジアミン(≦25wt%)を含む、過酢酸発生ワイプ - https://gamahealthcare.com/products/sporicidal-wipes を参照)。
装置および培地
UKAS校正済みピペット (0.5-1000μL レンジ), Proline (登録商標) Plus - Sartorius UK
UKAS校正済みマルチチャネルピペット (P300-P20) - Gilson UK
エッペンドルフ 5452 ミニスピン遠心分離機 - Eppendorf, DE
校正済み天秤, Ohaus NV212 -Scientific Laboratories Supplies (SLS) UK
嫌気性キャビネット, Whitley MG500-Don Whitley Scientific Limited, UK
デジタルドライバス - SLS, UK
滅菌済み万能チューブ - SLS, UK
96ウェルプレート, SLS, UK
培地
ヌクレアーゼ不含有水 - Aptamer Group
TbKat 緩衝液 - Aptamer Group
TbKst 緩衝液- Aptamer Group
馬の血液および酵母を添加したブレインハートインフュージョン寒天培地 (BHI-YHT)。成分については表8を参照。
強化クロストリジウム培地 (RCM) Acumedia(登録商標) - SLS, UK
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) - SLS, UK
GH中和剤 (成分については表9を参照)。
UKAS校正済みピペット (0.5-1000μL レンジ), Proline (登録商標) Plus - Sartorius UK
UKAS校正済みマルチチャネルピペット (P300-P20) - Gilson UK
エッペンドルフ 5452 ミニスピン遠心分離機 - Eppendorf, DE
校正済み天秤, Ohaus NV212 -Scientific Laboratories Supplies (SLS) UK
嫌気性キャビネット, Whitley MG500-Don Whitley Scientific Limited, UK
デジタルドライバス - SLS, UK
滅菌済み万能チューブ - SLS, UK
96ウェルプレート, SLS, UK
培地
ヌクレアーゼ不含有水 - Aptamer Group
TbKat 緩衝液 - Aptamer Group
TbKst 緩衝液- Aptamer Group
馬の血液および酵母を添加したブレインハートインフュージョン寒天培地 (BHI-YHT)。成分については表8を参照。
強化クロストリジウム培地 (RCM) Acumedia(登録商標) - SLS, UK
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) - SLS, UK
GH中和剤 (成分については表9を参照)。
方法
試験の前に、CotE_H2アプタマーをヌクレアーゼ不含有水で希釈し、4倍のストック濃度80μMとした。アプタマーをデジタルドライバスで95℃にて5分間加熱して折り畳んだ(folded)後、直ちに氷中に入れて2℃まで冷却した。CotE_H2は使用中、2-4℃で保存した。Clostridium difficile SH11細菌胞子接種液を試験手順(internal procedures)に従い、1x108 ± 5x107 CFUmL-1に調製した。接種を、連続希釈し、得られた懸濁液を馬の血液および酵母を添加したブレインハートインフュージョン寒天培地(BHI-YHT)上に播種して確認した。各4倍濃度のCotE-H2(80μM)をTbKst緩衝液で希釈し、2倍濃度の試験濃度を得た(40μM)。10μLのC. difficile芽胞を10μLの2x試験濃度(in-test concentration)のCotE-H2に添加した。胞子懸濁液をピペットで混合し、CotE-H2と共に室温にて1時間インキュベートした。その後、13,400RPMで10分間遠心分離し、胞子を3回洗浄した。各洗浄で上清を除去し、ペレットを100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁させた。3回目の洗浄後、胞子を100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁させ、ボルテックスして均質な溶液を得た。
試験の前に、CotE_H2アプタマーをヌクレアーゼ不含有水で希釈し、4倍のストック濃度80μMとした。アプタマーをデジタルドライバスで95℃にて5分間加熱して折り畳んだ(folded)後、直ちに氷中に入れて2℃まで冷却した。CotE_H2は使用中、2-4℃で保存した。Clostridium difficile SH11細菌胞子接種液を試験手順(internal procedures)に従い、1x108 ± 5x107 CFUmL-1に調製した。接種を、連続希釈し、得られた懸濁液を馬の血液および酵母を添加したブレインハートインフュージョン寒天培地(BHI-YHT)上に播種して確認した。各4倍濃度のCotE-H2(80μM)をTbKst緩衝液で希釈し、2倍濃度の試験濃度を得た(40μM)。10μLのC. difficile芽胞を10μLの2x試験濃度(in-test concentration)のCotE-H2に添加した。胞子懸濁液をピペットで混合し、CotE-H2と共に室温にて1時間インキュベートした。その後、13,400RPMで10分間遠心分離し、胞子を3回洗浄した。各洗浄で上清を除去し、ペレットを100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁させた。3回目の洗浄後、胞子を100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁させ、ボルテックスして均質な溶液を得た。
各殺胞子試験薬の2倍試験濃度(1:2希釈)をストック液から合計5種調製した(100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%)。Clinell溶液を、ワイプに100mLの水を加えて、次いで溶液を絞り出すことにより調製した。
陰性対照および陽性対照の溶液も調製した。96ウェルプレートのウェルに、各殺胞子試験薬濃度または対照溶液の25μLのアリコートを添加した。アプタマー-胞子懸濁液の25μLアリコートを各試験薬または対照溶液に添加し、ピペットで混合した。各殺胞子試験薬の最終試験濃度は、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5625%であった。その後、プレートを37℃±2℃の嫌気性環境下で15分間インキュベートした。インキュベーション後、50μLのGH中和剤を各ウェルに添加し、ピペットで混合した。各ウェルから中和した懸濁液を10μL採取し、寒天プレートに移し、37℃±2℃の嫌気環境で48時間培養した。増殖は“+”、増殖なしは“-”で記録した。各濃度の最小殺胞子濃度(MSC)は、すべての複製について、増殖が認められなかった最低濃度とした。最低濃度で増殖が見られなかった場合、“<”と表示した。最高濃度で増殖が観察された場合、“>”と表示した。その後、アプタマーが存在しない状態でテストを繰り返した。テストはトリプリケートで行った。
実施例2
Clostridium difficile芽胞の2つの株を用いて、3つのアプタマーの存在下および不存在下で、5種の濃度で3つの殺胞子性製品の最小殺胞子濃度の評価
C. difficile SH11芽胞に対してCDec_D1アプタマーおよびCDem_D2アプタマーを用いて、C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対してCotE_H2アプタマー、CDec_D1アプタマーおよびCDem_D2アプタマーを用いて、実施例1で概要を示した方法を繰り返した。
Clostridium difficile芽胞の2つの株を用いて、3つのアプタマーの存在下および不存在下で、5種の濃度で3つの殺胞子性製品の最小殺胞子濃度の評価
C. difficile SH11芽胞に対してCDec_D1アプタマーおよびCDem_D2アプタマーを用いて、C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対してCotE_H2アプタマー、CDec_D1アプタマーおよびCDem_D2アプタマーを用いて、実施例1で概要を示した方法を繰り返した。
結果
Clostridium difficile SH11芽胞を用いて、CotE_H2アプタマー存在下および不存在下で、3つの殺胞子性製品の5種の濃度における最小殺胞子濃度を評価した。
Clostridium difficile SH11芽胞を用いて、CotE_H2アプタマー存在下および不存在下で、3つの殺胞子性製品の5種の濃度における最小殺胞子濃度を評価した。
CotE_H2アプタマーが存在しない場合のC. difficile SH11芽胞に対する試験薬を評価したとき、最も低い最小殺胞子濃度(25%)がClinell(登録商標) 殺胞子性溶液で報告された(表10および表11)。EndoSan(登録商標) およびChemgene(商標) の最小殺胞子濃度では、50%を超える濃度が報告された。C. difficile SH11芽胞をCotE_H2アプタマーの存在下で試験したところ、最小殺胞子濃度は Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液で2倍以上増加したことが報告された。他の2つの試験製品については、変化がなかった。特に、EndoSan(登録商標)、Chemgene(商標) の最小殺胞子濃度は同定されなかったという結果であった。そのため、アプタマーの存在がC. difficile芽胞に影響を与えるかどうかを判断することはできなかったことが示された。
考察
アプタマーが存在しない状態でC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して試験薬を評価したところ、すべての試験項目で50%を超える濃度が報告された。C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞をCote_H2アプタマーおよびCDec_D1アプタマーの存在下で試験したとき、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は減少した。C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞をCDem_D2アプタマーの存在下で試験したとき、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は2倍以上減少したことが観察された。EndoSan(登録商標) および Chemgene(商標)では、いずれのアプタマー存在下でも最小殺胞子濃度に変化は見られなかった。
アプタマーが存在しない状態でC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して試験薬を評価したところ、すべての試験項目で50%を超える濃度が報告された。C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞をCote_H2アプタマーおよびCDec_D1アプタマーの存在下で試験したとき、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は減少した。C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞をCDem_D2アプタマーの存在下で試験したとき、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は2倍以上減少したことが観察された。EndoSan(登録商標) および Chemgene(商標)では、いずれのアプタマー存在下でも最小殺胞子濃度に変化は見られなかった。
アプタマーが存在しない状態で、C. difficile SH11芽胞に対して試験薬を評価したところ、最も低い最小殺胞子濃度(25%)はClinell(登録商標) 殺胞子性溶液で観察された。EndoSan(登録商標) およびChemgene(商標)の最小殺胞子濃度では、50%を超える濃度が観察された。C. difficile SH11芽胞をCDec_D1アプタマーの存在下で試験したとき、どの試験項目においても最小殺胞子濃度に変化は認められなかった。C. difficile SH11芽胞をCDem_D2アプタマーの存在下で試験したとき、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液で最小殺胞子濃度が2倍以上増加したことが報告された(表19)。EndoSan(登録商標) およびChemgene(商標)では、最小殺胞子濃度に変化は見られなかった。
考察
クロストリジウム・ディフィシルは芽胞を形成するグラム陽性偏性嫌気性細菌である。C. difficile感染症は、関連する高い死亡率および罹患率を伴う世界的な感染症の主要原因と考えられている。C. difficile菌が表面上に形成した芽胞は数週間生存し続け、C. difficile菌感染症の拡大および発症を促進させる。殺胞子性溶液は、回復力のある(resilient)芽胞を撲滅するために設計されており、臨床環境において表面の除染に定期的に使用されている。アプタマーは、DNAおよび/またはRNAを含む短い人工の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、高い選択性および感受性で標的に結合することができる。
クロストリジウム・ディフィシルは芽胞を形成するグラム陽性偏性嫌気性細菌である。C. difficile感染症は、関連する高い死亡率および罹患率を伴う世界的な感染症の主要原因と考えられている。C. difficile菌が表面上に形成した芽胞は数週間生存し続け、C. difficile菌感染症の拡大および発症を促進させる。殺胞子性溶液は、回復力のある(resilient)芽胞を撲滅するために設計されており、臨床環境において表面の除染に定期的に使用されている。アプタマーは、DNAおよび/またはRNAを含む短い人工の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、高い選択性および感受性で標的に結合することができる。
アプタマー不存在下で15分間処理した後、いずれの試験液もC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して≦50%の濃度で殺胞子活性を示さなかったが、25%のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液はC. difficile SH11芽胞に対して殺胞子活性を示した。アプタマー存在下では、C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対してClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は減少した。しかしながら、C. difficile SH11芽胞に対しては、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は2倍以上増加した。EndoSan(登録商標) およびChemgene(商標) 殺胞子性溶液は、いずれのC. difficile芽胞株に対しても変化が見られなかった。この結果は、アプタマーがC. difficile芽胞の異なる株に対して異なる結合親和性を有している可能性を示唆している。
実施例3
この試験で用いたクロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシル)胞子懸濁液を以下の表20に示す。クロストリディオイデス・ディフィシル(Clostridioides difficile)R20291懸濁液は、2020年1月23日にSporeGen(登録商標)から提供され、到着後4℃で保存された。Clostridioides difficile SH11 懸濁液は、2020年2月17日にSporeGen(登録商標)から提供され、到着後4℃で保存された。
この試験で用いたクロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシル)胞子懸濁液を以下の表20に示す。クロストリディオイデス・ディフィシル(Clostridioides difficile)R20291懸濁液は、2020年1月23日にSporeGen(登録商標)から提供され、到着後4℃で保存された。Clostridioides difficile SH11 懸濁液は、2020年2月17日にSporeGen(登録商標)から提供され、到着後4℃で保存された。
使用装置
UKAS校正済みピペット(0.5-1000μL範囲)、Proline(登録商標) Plus - Sartorius, UK
UKAS校正済みマルチチャンネルピペット(P300およびP20) - Gilson(登録商標), UK
エッペンドルフ 5452 ミニピン遠心分離機 - Eppendorf、DE
校正済み天秤、Ohaus NV212 - Scientific Laboratory Supplies Ltd (SLS), UK
嫌気性キャビネット, Whitley MG500 - Don Whitley Scientific Limited, UK
デジタルドライバス - SLS, UK
滅菌済みユニバーサルチューブ - SLS, UK
96ウェルプレート - SLS, UK
培地
ヌクレアーゼ不含有水 - Aptamer Group, UK
BB+Mg2+ 緩衝液 - Aptamer Group, UK
ブレインハートインフュージョン寒天 - SLS, UK
タウロコール酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
酵母抽出物 - Sigma-Aldrich, UK
馬の血液 - TCS Biosciences, UK
強化クロストリジウム培地(RCM)、Acumedia(登録商標) - SLS、UK
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) - SLS社, UK
サポニン - Sigma-Aldrich, UK
チオ硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
ドデシル硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
レシチン-Sigma-Aldrich, UK
L-ヒスチジン - Sigma-Aldrich, UK
Tween 80 - Sigma-Aldrich, UK
UKAS校正済みピペット(0.5-1000μL範囲)、Proline(登録商標) Plus - Sartorius, UK
UKAS校正済みマルチチャンネルピペット(P300およびP20) - Gilson(登録商標), UK
エッペンドルフ 5452 ミニピン遠心分離機 - Eppendorf、DE
校正済み天秤、Ohaus NV212 - Scientific Laboratory Supplies Ltd (SLS), UK
嫌気性キャビネット, Whitley MG500 - Don Whitley Scientific Limited, UK
デジタルドライバス - SLS, UK
滅菌済みユニバーサルチューブ - SLS, UK
96ウェルプレート - SLS, UK
培地
ヌクレアーゼ不含有水 - Aptamer Group, UK
BB+Mg2+ 緩衝液 - Aptamer Group, UK
ブレインハートインフュージョン寒天 - SLS, UK
タウロコール酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
酵母抽出物 - Sigma-Aldrich, UK
馬の血液 - TCS Biosciences, UK
強化クロストリジウム培地(RCM)、Acumedia(登録商標) - SLS、UK
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) - SLS社, UK
サポニン - Sigma-Aldrich, UK
チオ硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
ドデシル硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
レシチン-Sigma-Aldrich, UK
L-ヒスチジン - Sigma-Aldrich, UK
Tween 80 - Sigma-Aldrich, UK
方法
クロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対するCDiff_F1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液との組合せによる殺胞子能の向上に関する評価
試験に先立ち、CDiff_F1アプタマーをヌクレアーゼ不含有水で80μMの濃度に希釈した。アプタマーをデジタルドライバスで95℃にて5分間加熱して折り畳み、その後すぐに氷上に置いて2℃に冷却した。アプタマーは使用中、2-4℃にて保存した。C. difficile SH11菌胞子接種液を社内手順に従い、1 x 108 ± 5 x 107 CFUmL-1に調製した。接種物を連続希釈し、得られた懸濁液を馬の血液および酵母を添加した脳心筋梗塞寒天培地(BHI-YHT)上に播種することにより確認した。CDiff_F1アプタマーをさらに“BB+Mg2+”緩衝液で希釈し、2倍の試験中濃度(40、20、10および5μM)を得た。10マイクロリットルのC. difficile芽胞を、各2倍試験濃度のCDiff_F1アプタマー10μLに添加した。胞子懸濁液をピペットで混合し、CDiff_F1アプタマーと共に室温にて1時間インキュベートした。その後、胞子を13,400RPMで10分間遠心分離することにより、3回洗浄した。各洗浄で上清を除去し、ペレットを100μLの“BB + Mg2+”緩衝液に再懸濁させた。3回目の洗浄の後、胞子を100μLの“BB + Mg2+”緩衝液に再懸濁させ、ボルテックスして均質な溶液を得た。
クロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対するCDiff_F1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液との組合せによる殺胞子能の向上に関する評価
試験に先立ち、CDiff_F1アプタマーをヌクレアーゼ不含有水で80μMの濃度に希釈した。アプタマーをデジタルドライバスで95℃にて5分間加熱して折り畳み、その後すぐに氷上に置いて2℃に冷却した。アプタマーは使用中、2-4℃にて保存した。C. difficile SH11菌胞子接種液を社内手順に従い、1 x 108 ± 5 x 107 CFUmL-1に調製した。接種物を連続希釈し、得られた懸濁液を馬の血液および酵母を添加した脳心筋梗塞寒天培地(BHI-YHT)上に播種することにより確認した。CDiff_F1アプタマーをさらに“BB+Mg2+”緩衝液で希釈し、2倍の試験中濃度(40、20、10および5μM)を得た。10マイクロリットルのC. difficile芽胞を、各2倍試験濃度のCDiff_F1アプタマー10μLに添加した。胞子懸濁液をピペットで混合し、CDiff_F1アプタマーと共に室温にて1時間インキュベートした。その後、胞子を13,400RPMで10分間遠心分離することにより、3回洗浄した。各洗浄で上清を除去し、ペレットを100μLの“BB + Mg2+”緩衝液に再懸濁させた。3回目の洗浄の後、胞子を100μLの“BB + Mg2+”緩衝液に再懸濁させ、ボルテックスして均質な溶液を得た。
このストック液から、各殺菌試験薬の2倍濃度の溶液を計6種調製した(100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%)。また、陰性対照液および陽性対照液も調製した。96ウェルプレートのウェルに各殺菌性試験剤濃度液または対照溶液を10μLずつ添加した。アプタマー-胞子懸濁液の10μLアリコートを各試験剤または対照溶液に添加し、ピペットで混合した。各試験薬の最終試験中濃度は、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5625%であった。その後、プレートを37℃±2℃の嫌気環境下で15分間インキュベートした。インキュベーション後、50μLのGH中和剤を各ウェルに添加し、ピペットで混合した。中和した懸濁液の10μLのアリコートを各ウェルから取り、寒天プレートに移し、37℃±2℃の嫌気環境下で48時間インキュベートした。増殖は“+”、増殖なしは“-”と記録した。各濃度における最小殺胞子濃度は、すべての複製で増殖が認められなかった最低濃度として同定された。最高濃度で増殖が見られた場合は“>”と表示した。アプタマーが存在せず、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液も存在しない状態で、試験を繰り返した。C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標) およびC. difficile R20291芽胞の芽胞を用いた試験を繰り返した。試験はトリプリケートで実施した。
結果
CDiff_F1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液との組合せによるクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する殺胞子能の向上に関する評価
3.1.1 クロストリジウム・ディフィシル SH11芽胞
C. difficile SH11芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、どの濃度のCDiff_F1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDiff_F1アプタマーの存在なしに、6つの濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液をC. difficile SH11芽胞に対して評価したところ、最小殺胞子濃度は50%以上となった。2.5μM、5μMおよび10μMのCDiff_F1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は25%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍以上減少したことを意味する。20μMのCDiff_F1アプタマーの存在下では、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が4倍以上減少していることを意味する。
CDiff_F1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液との組合せによるクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する殺胞子能の向上に関する評価
3.1.1 クロストリジウム・ディフィシル SH11芽胞
C. difficile SH11芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、どの濃度のCDiff_F1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDiff_F1アプタマーの存在なしに、6つの濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液をC. difficile SH11芽胞に対して評価したところ、最小殺胞子濃度は50%以上となった。2.5μM、5μMおよび10μMのCDiff_F1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は25%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍以上減少したことを意味する。20μMのCDiff_F1アプタマーの存在下では、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が4倍以上減少していることを意味する。
C. difficile ATCC(登録商標)43598(商標)芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCDiff_F1アプタマーの存在にも影響を受けなかった(表24)。CDiff_F1アプタマーを含まないC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は50%以上となった。すべての濃度のCDiff_F1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は25%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍以上減少したことを意味する。
考察
C. difficileは嫌気性芽胞形成細菌であり、世界中で院内感染の原因として認識されている。C. difficile芽胞は、洗浄法に対する耐性があるため、さまざまな環境に存在する。殺胞子性溶液は、回復力のある(resilient)芽胞を根絶するために設計されており、臨床環境において表面の除染に定期的に使用されている。CDiff_F1アプタマーを加えることで、C. difficile 芽胞の3株すべてに対してClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の殺胞子能力が強化された。Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の殺胞子能力の向上は3つの菌株間で異なり、20μM CDiff_F1 アプタマーと組み合わせたC. difficile SH11芽胞から観察されたClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が最も減少することが確認された。CDiff_F1アプタマーのみを添加しても、C. difficile芽胞のどの菌株の増殖にも影響を与えなかった。これは、一度芽胞に結合したアプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の間の相互作用を示唆しているのかもしれない。この結果は、CDiff_F1アプタマーがC. difficile SH11芽胞に対して最大の結合親和性を有し得ることを示唆する。
C. difficileは嫌気性芽胞形成細菌であり、世界中で院内感染の原因として認識されている。C. difficile芽胞は、洗浄法に対する耐性があるため、さまざまな環境に存在する。殺胞子性溶液は、回復力のある(resilient)芽胞を根絶するために設計されており、臨床環境において表面の除染に定期的に使用されている。CDiff_F1アプタマーを加えることで、C. difficile 芽胞の3株すべてに対してClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の殺胞子能力が強化された。Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の殺胞子能力の向上は3つの菌株間で異なり、20μM CDiff_F1 アプタマーと組み合わせたC. difficile SH11芽胞から観察されたClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が最も減少することが確認された。CDiff_F1アプタマーのみを添加しても、C. difficile芽胞のどの菌株の増殖にも影響を与えなかった。これは、一度芽胞に結合したアプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の間の相互作用を示唆しているのかもしれない。この結果は、CDiff_F1アプタマーがC. difficile SH11芽胞に対して最大の結合親和性を有し得ることを示唆する。
実施例4
試験微生物
この試験で用いたクロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシル)芽胞の懸濁液を表1に示す。Clostridioides difficile R20291懸濁液は、2020年1月23日にSporeGen(登録商標) から提供され、到着後4℃で保存した。Clostridioides difficile SH11 懸濁液は、2020年2月17日にSporeGen(登録商標)から提供され、到着後4℃で保存した。
試験微生物
この試験で用いたクロストリディオイデス・ディフィシル(以前は、クロストリジウム・ディフィシル)芽胞の懸濁液を表1に示す。Clostridioides difficile R20291懸濁液は、2020年1月23日にSporeGen(登録商標) から提供され、到着後4℃で保存した。Clostridioides difficile SH11 懸濁液は、2020年2月17日にSporeGen(登録商標)から提供され、到着後4℃で保存した。
装置および培地
培地
ヌクレアーゼ不含有水 - Aptamer Group, UK より提供
“TbKst”緩衝液 - Aptamer group, UK より提供。“TbKat”緩衝液 - Aptamer group, UKより提供。タウロコール酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
酵母エキス - Sigma-Aldrich, UK。馬の血液 - TCS Biosciences Ltd, UK
強化クロストリジウム培地(RCM)、Acumedia(登録商標) - SLS, UK。リン酸緩衝生理食塩水(PBS) - SLS, UK
サポニン - Sigma-Aldrich, UK
チオ硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK。ドデシル硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK。レシチン - Sigma-Aldrich, UK
L-ヒスチジン - Sigma-Aldrich, UK。Tween 80 - Sigma-Aldrich, UK。
培地
ヌクレアーゼ不含有水 - Aptamer Group, UK より提供
“TbKst”緩衝液 - Aptamer group, UK より提供。“TbKat”緩衝液 - Aptamer group, UKより提供。タウロコール酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK
酵母エキス - Sigma-Aldrich, UK。馬の血液 - TCS Biosciences Ltd, UK
強化クロストリジウム培地(RCM)、Acumedia(登録商標) - SLS, UK。リン酸緩衝生理食塩水(PBS) - SLS, UK
サポニン - Sigma-Aldrich, UK
チオ硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK。ドデシル硫酸ナトリウム - Sigma-Aldrich, UK。レシチン - Sigma-Aldrich, UK
L-ヒスチジン - Sigma-Aldrich, UK。Tween 80 - Sigma-Aldrich, UK。
方法
CotE_H2およびCDec_D1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の組み合わせによる、クロストリジウム・ディフィシル芽胞に対する殺胞子能力の向上に関する評価。
試験前に、CotE H2アプタマーを、ヌクレアーゼ不含有水で80μMの濃度に希釈した。アプタマーをデジタルドライバスで95℃にて5分間加熱して折り畳んだ(folded)後、すぐに氷上に置いて2℃まで冷却した。アプタマーは使用中、2-4℃で保存した。C. difficile SH11細菌芽胞の接種液を社内手順に従い、1 x 107± 5 x 106 CFUmL-1に調製した。この接種液を連続希釈し、得られた懸濁液を馬の血液および酵母を添加した脳心筋梗塞寒天培地(BHI-YHT)上に播種して確認した。CotE_H2アプタマーを“TbKst”緩衝液でさらに希釈し、2倍の試験濃度(40、20、10、5μM)を得た。10μLのC. difficile胞子を、各2倍濃度のCotE_H2アプタマー10μLに添加した。胞子懸濁液をピペットで混合し、CotE_H2アプタマーとともに室温で1時間インキュベートした。その後、胞子を13,400RPMで10分間遠心分離することにより3回洗浄した。各洗浄で上清を除去し、ペレットを100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁させた。3回目の洗浄後、胞子を100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁し、ボルテックスして均質な溶液を得た。
CotE_H2およびCDec_D1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の組み合わせによる、クロストリジウム・ディフィシル芽胞に対する殺胞子能力の向上に関する評価。
試験前に、CotE H2アプタマーを、ヌクレアーゼ不含有水で80μMの濃度に希釈した。アプタマーをデジタルドライバスで95℃にて5分間加熱して折り畳んだ(folded)後、すぐに氷上に置いて2℃まで冷却した。アプタマーは使用中、2-4℃で保存した。C. difficile SH11細菌芽胞の接種液を社内手順に従い、1 x 107± 5 x 106 CFUmL-1に調製した。この接種液を連続希釈し、得られた懸濁液を馬の血液および酵母を添加した脳心筋梗塞寒天培地(BHI-YHT)上に播種して確認した。CotE_H2アプタマーを“TbKst”緩衝液でさらに希釈し、2倍の試験濃度(40、20、10、5μM)を得た。10μLのC. difficile胞子を、各2倍濃度のCotE_H2アプタマー10μLに添加した。胞子懸濁液をピペットで混合し、CotE_H2アプタマーとともに室温で1時間インキュベートした。その後、胞子を13,400RPMで10分間遠心分離することにより3回洗浄した。各洗浄で上清を除去し、ペレットを100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁させた。3回目の洗浄後、胞子を100μLの“TbKst”緩衝液に再懸濁し、ボルテックスして均質な溶液を得た。
このストックから6類の2倍濃度(1:2希釈)の殺胞子性試験薬を調製した(100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%)。陰性対照液および陽性対照液も調製した。96ウェルプレートの各ウェルに殺胞子性試験薬濃度または対照溶液を10μLずつ添加した。アプタマー胞子懸濁液の10μLアリコートを各試験剤または対照溶液に添加し、ピペットで混合した。殺胞子性試験薬の最終試験濃度は、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5625%であった。その後、プレートを37℃±2℃の嫌気環境下で15分間インキュベートした。インキュベーション後、50μLのGH中和剤を各ウェルに添加し、ピペットで混合した。各ウェルから中和した懸濁液を10μLずつ採取し、寒天プレートに移し、37℃±2℃の嫌気環境で48時間培養した。増殖は“+”、増殖なしは“-”で記録した。各胞子およびアプタマー濃度の最小殺胞子濃度は、すべての複製について増殖が見られない最低濃度として同定された。最高濃度で増殖が見られた場合は、“>”と表示した。アプタマーが存在せず、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液が存在しない状態で試験を繰り返した。C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)およびC. difficile R20291芽胞を用いた試験も繰り返した。試験はトリプリケートで実施した。この方法は、CDec_D1アプタマーを用いて、C. difficileの3つの株すべての芽胞について繰り返した。
結果
CotE_H2アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の組み合わせによるクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する殺胞子能力の増強の評価。
クロストリディオイデス・ディフィシル菌SH11芽胞
C. difficile SH11芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、どの濃度のCotE_H2アプタマーの存在によっても影響を受けなかった。CotE_H2アプタマーの存在なしに、C. difficile SH11芽胞に対して6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は25%であった。20μM、10μM、5μMおよび2.5μM のCotE_H2アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%となった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを意味する。
CotE_H2アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の組み合わせによるクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する殺胞子能力の増強の評価。
クロストリディオイデス・ディフィシル菌SH11芽胞
C. difficile SH11芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、どの濃度のCotE_H2アプタマーの存在によっても影響を受けなかった。CotE_H2アプタマーの存在なしに、C. difficile SH11芽胞に対して6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は25%であった。20μM、10μM、5μMおよび2.5μM のCotE_H2アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%となった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを意味する。
クロストリディオイデス・ディフィシル ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞
C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCotE_H2アプタマーの存在にも影響されなかった。CotE_H2 アプタマーを含まないC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は12.5%となった。20μM、10μM、5μMおよび2.5μMのCotE_H2アプタマーが存在しても、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度には影響しなかった。
C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCotE_H2アプタマーの存在にも影響されなかった。CotE_H2 アプタマーを含まないC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は12.5%となった。20μM、10μM、5μMおよび2.5μMのCotE_H2アプタマーが存在しても、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度には影響しなかった。
クロストリジョイデス ディフィシル R20291 芽胞
C. difficile R20291芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCotE_H2アプタマーの存在にも影響されなかった。CotE_H2アプタマーの存在なしに、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液をC. difficile R20291芽胞に対して評価した場合、最小殺胞子濃度は25%であった。20μM CotE_H2 アプタマーの存在下では、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%となった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを意味する。C. difficile R20291芽胞に対して評価した場合、10μM、5μMおよび2.5μMのCotE_H2アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
C. difficile R20291芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCotE_H2アプタマーの存在にも影響されなかった。CotE_H2アプタマーの存在なしに、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液をC. difficile R20291芽胞に対して評価した場合、最小殺胞子濃度は25%であった。20μM CotE_H2 アプタマーの存在下では、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%となった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを意味する。C. difficile R20291芽胞に対して評価した場合、10μM、5μMおよび2.5μMのCotE_H2アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
実施例6
CDec_D1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の組み合わせによるクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する殺傷力増強能の評価
Clostridioides difficile SH11芽胞
C. difficile SH11芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCDec_D1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDec_D1アプタマーが存在しないC. difficile SH11芽胞に対して、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は50%であった。20μM、10μMおよび5μMのCDec_D1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は25%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを示した。2.5μM CDec_D1アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
CDec_D1アプタマーとClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の組み合わせによるクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する殺傷力増強能の評価
Clostridioides difficile SH11芽胞
C. difficile SH11芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCDec_D1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDec_D1アプタマーが存在しないC. difficile SH11芽胞に対して、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は50%であった。20μM、10μMおよび5μMのCDec_D1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は25%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを示した。2.5μM CDec_D1アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
クロストリディオイデス・ディフィシル ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞
C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCDec_D1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDec_D1アプタマーを含まないC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は25%であった。20μM、10μM、5μMのCDec_D1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを意味する。2.5μM CDec_D1アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
C. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞の増殖は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の存在なしに、何れの濃度のCDec_D1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDec_D1アプタマーを含まないC. difficile ATCC(登録商標) 43598(商標)芽胞に対して、6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は25%であった。20μM、10μM、5μMのCDec_D1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が2倍低下したことを意味する。2.5μM CDec_D1アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
クロストリディオイデス・ディフィシル R20291芽胞
C. difficile R20291芽胞の増殖は、Clinell(登録商標)殺胞子液の存在なしに、何れの濃度のCDec_D1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDec_D1アプタマーが存在しない状態で、C. difficile R20291芽胞に対して6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は50%であった。20μMおよび10μMのCDec_D1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が4倍低下したことを意味する。C. Difficile R20291芽胞に対して評価した場合、5μMおよび2.5μMのCDec_D1アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
C. difficile R20291芽胞の増殖は、Clinell(登録商標)殺胞子液の存在なしに、何れの濃度のCDec_D1アプタマーの存在にも影響されなかった。CDec_D1アプタマーが存在しない状態で、C. difficile R20291芽胞に対して6種の濃度のClinell(登録商標) 殺胞子性溶液を評価したところ、最小殺胞子濃度は50%であった。20μMおよび10μMのCDec_D1アプタマーが存在する場合、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度は12.5%であった。これは、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が4倍低下したことを意味する。C. Difficile R20291芽胞に対して評価した場合、5μMおよび2.5μMのCDec_D1アプタマーの存在は、Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度に影響を与えなかった。
考察
クロストリディオイデス・ディフィシルは嫌気性芽胞形成細菌であり、世界中で院内感染を引き起こすことが知られている。クロストリディオイデス・ディフィシル芽胞は、洗浄レジメンに対する耐性を有するため、幅広い環境に存在する。殺胞子性溶液は、回復力のある(resilient)芽胞を根絶するために設計されており、臨床環境において表面の除染に定期的に使用されている。C. difficile芽胞は外胞子層が存在するため、他の芽胞株と比較して殺胞子剤に対する耐性が高く、殺胞子剤がこの層に浸透するのに苦労する可能性があるからである。アプタマーは、短い人工的な一本鎖DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドであり、高い選択性および感受性で標的に結合することができる。
クロストリディオイデス・ディフィシルは嫌気性芽胞形成細菌であり、世界中で院内感染を引き起こすことが知られている。クロストリディオイデス・ディフィシル芽胞は、洗浄レジメンに対する耐性を有するため、幅広い環境に存在する。殺胞子性溶液は、回復力のある(resilient)芽胞を根絶するために設計されており、臨床環境において表面の除染に定期的に使用されている。C. difficile芽胞は外胞子層が存在するため、他の芽胞株と比較して殺胞子剤に対する耐性が高く、殺胞子剤がこの層に浸透するのに苦労する可能性があるからである。アプタマーは、短い人工的な一本鎖DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドであり、高い選択性および感受性で標的に結合することができる。
CotE_H2アプタマーを添加すると、C. difficile SH11 および R20291 芽胞に対する Clinell(登録商標) 殺胞子性溶液の殺胞子能が向上した。すべての濃度のCotE_H2アプタマーを添加すると、C. difficile SH11芽胞に対するClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が減少したが、20μMのCotE_H2アプタマーを添加すると、C. difficile R20291芽胞に対するClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度が減少するだけであった。
CDec_D1アプタマーを添加すると、C. difficile芽胞の3種の株すべてに対してClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の殺胞子能が向上した。殺胞子能の向上は3種の菌株間で異なり、10μMおよび20μMのCDec_D1アプタマーと組み合わせたC. difficile R20291芽胞に対するClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度で最大倍率の減少が観察された。アプタマーは、結合時にC. difficile芽胞の外胞子層の生化学的または生物物理学的特性に影響を与え、殺胞子剤に対する感受性を高め得る。
その結果、CotE_H2アプタマーはC. difficile SH11胞子に対して最大の親和性を有し、一方、CDec_D1アプタマーはC. difficile R20291胞子に対して最大の親和性を有していることが示唆された。また、2.5μMのCDec_D1アプタマーを添加しても、C. difficile芽胞の3株すべてに対するClinell(登録商標) 殺胞子性溶液の最小殺胞子濃度には影響がなかったため、この結果は、殺胞子性の増強がアプタマーの存在濃度に依存していることを示唆している。
考察
本明細書に記載のアプタマーは、過酢酸のような殺胞子剤の殺胞子活性を増強するのに有用であると考えられる。異なるアプタマー(C. difficile芽胞の異なる標的に対して生成した)は、異なる芽胞株に対する過酢酸の殺胞子活性に異なる効果を有し得る。例えば、20μMのCDiff_F1アプタマーは、SH11株の芽胞に対する殺胞子活性に必要な過酢酸の濃度を最大4倍まで低下させ得る。さらに、CDiff_F1アプタマーは、ATCC 43598株の胞子に対する殺胞子活性に必要な過酢酸の濃度を15分後に最大2倍まで減少させ得る。アプタマーキチナーゼ_D11およびアプタマーCdeC_D1は、それぞれ、R20291株の胞子に対する殺胞子活性に必要な過酢酸の濃度の最大4倍までの減少をもたらし得る。
本明細書に記載のアプタマーは、過酢酸のような殺胞子剤の殺胞子活性を増強するのに有用であると考えられる。異なるアプタマー(C. difficile芽胞の異なる標的に対して生成した)は、異なる芽胞株に対する過酢酸の殺胞子活性に異なる効果を有し得る。例えば、20μMのCDiff_F1アプタマーは、SH11株の芽胞に対する殺胞子活性に必要な過酢酸の濃度を最大4倍まで低下させ得る。さらに、CDiff_F1アプタマーは、ATCC 43598株の胞子に対する殺胞子活性に必要な過酢酸の濃度を15分後に最大2倍まで減少させ得る。アプタマーキチナーゼ_D11およびアプタマーCdeC_D1は、それぞれ、R20291株の胞子に対する殺胞子活性に必要な過酢酸の濃度の最大4倍までの減少をもたらし得る。
本明細書中に引用された文献は、本明細書で明らかなすべての目的のために、その内容全体が、かつ各文献が完全に記載されているかのように文献自体が、本明細書に包含される。提示のために、これらの文献の特定のものが、本明細書の特定の位置で引用されている。特定の位置での文献の引用は、その文献の教示が組み込まれる態様(複数可)を示す。しかしながら、特定の位置での文献の引用は、引用された文献の全ての教示が全ての目的のために組み込まれる態様を制限するものではない。
したがって、本発明は、記載された特定の態様に限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲および/または上記の説明に示されるように、本発明の精神および範囲内にあるすべての改変を包含することが意図されることが理解される。
Claims (48)
- クロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficile)芽胞を致死または不活性化させる方法であって、該芽胞を、殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤ならびにC. difficileに対して特異的結合能を有するアプタマーと接触させることを含む、方法。
- 殺胞子剤のC. difficileに対する殺胞子効果を増強させる方法であって、C. difficile芽胞を該芽胞に対して特異的結合能を有するアプタマーならびに殺胞子剤および静胞子剤からなる群より選択される薬剤と接触させることを含む、方法。
- 薬剤が殺胞子剤である、請求項1または2に記載の方法。
- C. difficile芽胞を含むと疑われる場所にアプタマーおよび殺胞子剤を配置することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 配置場所が表面を含み、該方法が、該表面をアプタマーと接触させる前、該表面をアプタマーと接触させるのと実質的に同時に、または該表面をアプタマーと接触させた後に、該表面を殺胞子剤と接触させることを含む、請求項4に記載の方法。
- アプタマーがC. difficile芽胞に結合してアプタマー-胞子複合体を形成するのを可能にするように構成された所定の期間、該アプタマーを表面に接触させること、および
アプタマー-胞子複合体を形成する表面を殺胞子剤と接触させること
を含む、請求項5に記載の方法。 - 表面をGH中和剤と接触させることをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- C. difficile芽胞をアプタマーを含む組成物に浸漬すること、および/または該芽胞を薬剤に浸漬することを含む、請求項5または6に記載の方法。
- C. difficile芽胞にアプタマーを含む組成物を噴霧すること、および/またはC. difficile芽胞に殺胞子剤を噴霧することを含む、請求項5または6に記載の方法。
- アプタマーを含む組成物を布によって塗布すること、および/または、布および/または拭き取りワイプによって殺胞子剤を塗布することを含む、請求項5または6に記載の方法。
- 約5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃または90℃の温度で実施される、請求項1または2に記載の方法。
- C. difficile 芽胞膜表面タンパク質または外胞子層タンパク質である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- C. difficileタンパク質が、CdeC、CdeM、CotA、CotEまたはCotEキチナーゼを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- C. difficileタンパク質が、配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するCdeCタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- C. difficileタンパク質が、配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するCdeMタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- C. difficileタンパク質が、配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するCotAタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- C. difficileタンパク質が、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するCotEタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- C. difficileタンパク質が、配列番号17に記載のアミノ酸配列を有するCotEキチナーゼタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- アプタマーが、
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続したヌクレオチドを有する核酸配列
を含むか、またはそれからなるアプタマーを含む、請求項12に記載の方法。 - アプタマーが一本鎖DNAアプタマーである、請求項12に記載の方法。
- アプタマーが、
a) CdeCに特異的に結合するアプタマー;
b) CdeMに特異的に結合するアプタマー;
c) CotAに特異的に結合するアプタマー;
d) CotEに特異的に結合するアプタマー;
e) CotEキチナーゼに特異的に結合するアプタマー;および
f) (a)から(e)の何れかの組合せ
から選択されるアプタマーを含む、請求項12に記載の方法。 - ある場所に複数のアプタマーを接触させることを含み、ここで各アプタマーが、C. difficile芽胞に特異的に結合することができ、複数のアプタマーが、C. difficile芽胞の同じエピトープに特異的に結合できる少なくとも2つのアプタマーおよび/または各アプタマーがC. difficile芽胞の異なるエピトープに特異的に結合できる少なくとも2つのアプタマーを含む、請求項4に記載の方法。
- 複数のアプタマーが、
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(e) (a)から(d)の何れかの組合せ
を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマーからなる群より選択される少なくとも2つのアプタマーを含む、請求項22に記載の方法。 - 複数のアプタマーが、
a) CdeCに特異的に結合するアプタマー;
b) CdeMに特異的に結合するアプタマー,
c) CotAに特異的に結合するアプタマー;
d) CotEに特異的に結合するアプタマー;
e) CotEキチナーゼに特異的に結合するアプタマー;および
f) (a)から(e)の何れかの組合せ
からなる群より選択される少なくとも2つのアプタマーを含む、請求項22または23に記載の方法。 - 複数のアプタマーが、
配列番号1に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;
配列番号5に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;および
配列番号6に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー
を含む、請求項22に記載の方法。 - ある場所と殺胞子剤および/または静胞子剤を接触させる前に、該場所におけるC. difficileの存在、不存在および/または濃度を決定することを含み、該決定工程が、該場所を、アプタマーおよび検出分子と、アプタマー-胞子複合体が形成されるのに十分な時間接触させることを含む、
請求項1または2に記載の方法。 - アプタマーが検出可能な標識を含む、請求項26に記載の方法。
- 検出可能な標識が、フルオロフォア、ナノ粒子、量子ドット、酵素、放射性同位体、予め規定された配列部分、ビオチン、デスチオビオチン、チオール基、アミン基、アジド基、アミノアリル基、ジゴキシゲニン、抗体、触媒、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、有機ポリマー、ラテックス粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、デンドリマー、タンパク質、およびリポソームから選択される、請求項27に記載の方法。
- 薬剤が、グルコン酸クロルヘキシジンおよび要すればイソプロピルアルコールを含む殺胞子性溶液である、請求項1または2に記載の方法。
- 薬剤が、過酢酸を含む殺胞子剤である、請求項1または2に記載の方法。
- 薬剤が過酢酸発生剤であり、ここで該方法が、ある場所に接触させる前に過炭酸ナトリウムを含む拭き取りワイプを水溶液で湿らせることをさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 殺胞子性溶液が過酸化水素を含み、要すれば銀安定化過酸化水素を含む、請求項31に記載の方法。
- 殺胞子性溶液がグルコン酸クロルヘキシジンおよび70%イソプロピルアルコールの複合体を含む、請求項31に記載の方法。
- 殺胞子剤および/または静胞子剤の組合せを配置することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 該組合せが、過酢酸および過酸化水素を含む、請求項34に記載の方法。
- C. difficileに特異的に結合することができるアプタマー、ならびに殺胞子剤および/または静胞子剤を含む、組成物。
- C. difficileの致死および/または不活性化に使用するためのものである、請求項36に記載の組成物。
- アプタマーが、
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列
を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマーからなる群より選択される、請求項36または37に記載の組成物。 - アプタマーが、
a) CdeCに特異的に結合するアプタマー;
b) CdeMに特異的に結合するアプタマー,
c) CotAに特異的に結合するアプタマー;
d) CotEに特異的に結合するアプタマー;
e) CotEキチナーゼに特異的に結合するアプタマー;または
f) (a)から(e)の何れかの組合せ
の少なくとも1つを含む、請求項36または37に記載の組成物。 - 該組合せが複数のアプタマーを含み、該複数のアプタマーが、
(a)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;
(d) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;または
(e) (a)から(d)のいずれかの組合せ
を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマーを含む、請求項39に記載の組成物。 - 複数のアプタマーが、
配列番号1に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;
配列番号5に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;および
配列番号6に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー
を含む、請求項40に記載の組成物。 - 殺胞子剤が、過酢酸および/または過酢酸を生成することができる薬剤を含む、請求項36または37に記載の組成物。
- (1) (a) 配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つから選択される核酸配列;
(b)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つと少なくとも85%の同一性、例えば90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する核酸配列;
(c)配列番号1~14、23~39および43~55の何れかに記載の核酸配列の何れか1つの少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;
(d)配列番号1~14、23~39および43~55の何れか1つと少なくとも85%の同一性を有する配列の少なくとも約20個の連続ヌクレオチドを有する核酸配列;
(e)(a)から(d)のいずれかの組合せ
を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる1以上のアプタマー;および
(2) 殺胞子剤および/または静胞子剤
を含む、組成物。 - 複数のアプタマーを含み、ここで、要すれば該複数のアプタマーが、
配列番号1に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;
配列番号5に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー;および
配列番号6に記載の核酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるアプタマー
を含む、請求項43に記載の組成物。 - 殺胞子剤が過酢酸および/または過酢酸を生成することができる薬剤を含む、請求項43または44に記載の組成物。
- 請求項36から45のいずれか一項に記載のアプタマー;および
請求項36から45のいずれか一項に記載の殺胞子剤および/または静胞子剤
を含む、C. difficile芽胞を致死または不活性化させるためのキット。 - 請求項36から45のいずれか一項に記載のアプタマー;および
請求項36から45のいずれか一項に記載の殺胞子剤および/または静胞子剤
を含む、C. difficile芽胞に対する殺胞子効果を増強するためのキット。 - ある場所を殺胞子剤および/または静胞子剤と接触させる前に、その場所でのC. difficile の存在、不存在および/または濃度を決定するための光源および観察用ゴーグルをさらに含む、請求項46または47に記載のキット。
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