JPH03501326A - 血清型分類用ｄｎａプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 型　ＤＮＡ　ローブ 本発明は、特にＤＮＡプローブとして、生きたワクチン担体細菌株中で使用され るＤＮＡ断片の同定と単離に関するものである。 グラム陰性細菌の細胞壁の外膜は、タンパク質、リン脂質、およびリポポリサッ カライド（ＬＰＳ）から成っており、これらの内ではＬＰＳが細胞表面上で群を 抜いて最も豊富な分子である。　ＬＰＳは３つの領域から構成されている：最も 内側は、外膜の脂質二重膜の外側構造を構成する脂質−Ａ部分である；中央の領 域はコアオリゴ糖であり、最も外側は１通常糖に特異的な一連の反復ユニットか ら成る〇−抗原側鎖である。糖の型の配列とその連結が、細菌の〇−血清型を決 定しているものである。医患の診断には病理学的因子の特異的な同定が必要であ り、これは通常１選択培地上での生物体の単離および、陽性の同定が行われるま でに数日かかるような一連の生化学的試験をその生物体に対して行うことを含む １次に、特に疾患の疫学的性質を調べるべき場合には、生物体の血清型が必要と なる。血清型決定は通常、生物体の型が決定された後にのみ着手可能であり、こ れも時間がかかるものである。したがって、特に、多くのエンテロバクテリウム 科細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）は生命を脅かす疾患を引き起 こすことがあり、実際にインド、バングラブシュ。 および多くの南アメリカ国などの発展途上国における幼児の死亡率の主要な原因 となっているため１診断および血清型決定の双方のより迅速な方法は非常に利益 があるものとなるであろう。 したがって、これまでの技術に関連したひとつ以上の困難が克服されること、あ るいは少なくとも軽減することが本発明の目的である。 したがって、第一の局面としては、エンテロバクテリウム科細菌の〇−抗原合成 のための遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むＤＮＡプローブを与えるものであり、該 プローブはエンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出するものであ る。 より望ましくは、ＤＮＡ断片は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の 血清型０１０１．０１５？、または０２の〇−抗原合成のための遺伝子を含んで いる。該大腸菌は腸毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｅ、　 ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）であることが望ましい。 本発明の推奨される局面では、 エンテロバクテリウム科細菌の〇−抗原の合成のための遺伝子を含むＤＮＡ断片 を含む第一のＤＮＡプローブであつて、該プローブはエンテロバクテリウム科細 菌のｒｆｂ領域の存在を検出するものであるもの；および、第一のプローブと第 二のプローブが血清型特異的となるように、該第−のプローブと異なる様式でエ ンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出するＤＮＡ断片を含む第二 のＤＮＡプローブ；を含むＤＮＡプローブキットが与えられる。 エンテロバタテリウム科の細菌のりポポリサツカライドの〇−抗原産生に必要な 遺伝子のほとんどはｒｆｂ座位と呼ばれる遺伝子群中でコードされている。この 座位には多様性があり、結果として〇−抗原の構造にも多様性がある。この直接 の結果として、細菌の血清型が異なることになる。したがって、細菌の染色体の この領域はその生物の血清型に直接に関連している一連の遺伝子を表しており、 したがって、この領域中の多様性は血清型の変化と完全に関連している。したが って、本発明によるＩ）ＨＡプローブにより、ｒｆｂ座位での多様性を直接解析 し、これを血清型と関連づけることが可能となり、それにより細菌の血清型分類 および種を区別するための迅速な手段が与えられる。 本発明のさらに別の局面では。 プラスミドクローニングベクター；および、プラスミドクローニングベクター中 の適当な部位に挿入されたエンテロバクテリウム科細菌の〇−抗原合成のための 遺伝子を含むＤＮＡ断片： を含むＤＮＡプローブが与えられる。 ＤＮＡ断片はエンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ座位全体あるいはその断片を 含む、エンテロバクテリウム科細菌は血清型０１．０１５？、または０２の大腸 菌である。エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１０１の大腸菌である場合に は、大腸菌に一１２株に導入した場合に０１０１型〇−抗原の生合成には最小的 ８．９ｋｂ、最大的１１．８ｋｂの長さの断片が必要なことを我々は見いだした 。 プラスミドクローニングベクターはあらゆる適当な型のものが使用可能である。 プラスミドクローニングベクターｐＨＣ７９は適当なものであることが見いださ れた。　ＤＮＡ断片はプラスミドｐＨＣ７９のＢａｍ旧部位に挿入することがで きる。このようにして得られたプラスミドはｐＰＭ１３０５と呼ばれた。　ｒｆ ｂ　ＤＮＡを欠失させることにより、誘導体ｐＰＭ１３０５が作成された。 したがって、望ましい態様では、プラスミドｐＰＭ１３０５あるいはその消化誘 導体を含むＤＮＡプローブが与えられる。 プラスミドクローンｐＰＭ１３０５によって産生されたタンパク質のミニセル解 析により、〇−抗原合成は少なくとも６種の関連タンパク質と遺伝学的に複合し ていることが示された。 クローンｐＰＭ１３０５の断片は以下に示すように部分消化によって産生される 。現在のところ、　ｐＰＭ１３０５の６つの断片が想定される。これらはプラス ミドｐＰＭ１３２１．　ｐＰＭ１３２２、ｐＰＭ１３２３、ｐＰＭ１３２４、ｐ ＰＭ１３２５．　ｐＰＭ１３２６．　ｐＰＭ１３３０、およびｐＰＭ２２１８と 呼ばれる。プラスミドのサンプルは、アゾレード大学カルチャー・コレクション （ノーステラス、アゾレード、南オーストラリア）に維持されているこれらは以 下の第３図に示されている。 したがって、本発明のさらなる局面では、ｒｆｂ　ＤＮＡが欠失した。プラスミ ドｐＰＭ１３０５、ｐＰＭ１３２２、ｐＰＭ１３２３、ｐＰＭ１３２４、ｐＰＭ １３２５．　ｐＰＭ１３２６、ｐＰＭ１３３０．　およびｐＰＭ２２１８から選 択されたプラスミド、あるいはその混合物を含むＤＮＡプローブを与えるもので ある。 上述のように、　ｒｆｂ、。１領域は６個の部分にサブクローニングされ、それ ぞれが異なる血清型の大腸菌およびｓｈ、フレクシネリ（Ｓｈ、　ｆｌｅｘｎｅ ｒｉ）株の選択の際のサザンＤＮＡハイブリダイゼーションのプローブとして使 用された、このことにより、異なるプローブが血清型特異性を示すような様式で 、反応する能力に多様性があることが示された０例えば、ｓｈ、フレクシネリ株 は全である一つのプローブに反応するが、別のプローブには血清型４ａ／ｙと６ のものしか反応せず、第三めプローブには血清型２ａと４のものしか反応しない 、それらが反応する断片の大きさも顕著に異なり、そのためいくつかのプローブ を用いて調べたパターンは特定の血清型として明らかに識別される。 これらのプローブの同じ組み合わせを用いて、これまでＬＰＳと外膜タンパク質 の両方と多数のアイソザイムの分析を含む広範な一連の試験を用いて決定してい たものと完全に同一の群に血清型０２と０１８の大腸菌株を非常に迅速にサブグ ループ分けすることも可能であった。ある株ではおそらく特異的なアイソザイム を産生する能力に影響を及ぼす変異のために誤って分類されていたことも分かっ た。血清型０２の株は、ニワトリの敗血症などの疾患やヒトの尿道管感染で示さ れているように、重要なものである。（遺伝子産物が作られていない場合でさえ プローブが血清型の分類に有効であることは、本発明のこの局面の特別な利点で ある。） 同じアプローチで、我々は０２　ｒｆｂ領域の遺伝子もクローニングした。プラ スミドｐＰＡ１３４３．　ｐＰＡ１３４４およびｐＰＡ１３４５は０２　ｒｆｂ 領域を含んでいるクローンの例である。したがって、望ましい態様では、プラス ミドｐＰＡ１３４３．１３４４または１３４５から選択されたプラスミドあるい はその消化誘導体を含むＤＮＡプローブが与えられる。これは、〇−抗原が保護 的抗原である、すなわち保護が血清型特異的であるようなエンテロバクテリウム 科細菌によって引き起こされる疾患に対するワクチンの発達に大きな可能性を与 えるものである。これらのクローンはさらに別のプローブを開発するための基礎 を与えるものでもある。 同様にこのアプローチは０１５７　ｒｆｂ領域の遺伝子をクローニングするため にも使用された。プラスミドｐＰＭ１３５４は、このようなりローンの一例を示 している。 したがって望ましい態様では、プラスミドｐＰＭ１３５４゜またはその消化誘導 体を含むＤＮＡプローブが与えられるこのクローンはワクチン開発と特異的プロ ーブのための双方の可能性を持つ。 血清型０１５７の大腸菌は出血性尿毒症候群の原因となるものであり、エンテロ へモラティック大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒａｔｉｃ　Ｅ、ｃｏｌｉ） およびＥＨＥＣと呼ばれる。これは重症のものであり、しばしば死に至らしめる ものであり、この疾患に対するワクチンは現在のところ存在しない。 まとめると、このようなプローブの利点には以下のことが含まれる： ｒｆｂおよびそれに密接に連鎖したＤＮＡの存在が、遺伝子発現がなされていな い場合でも検出可能なことであって、そのため〇−抗原が受容体生物のコア領域 と一致しない場合、あるいは受容体生物がそれ自身の〇−抗原を発現しており該 クローニングされたＤＮＡによってコードされた〇−抗原に対して優勢に競合し ている場合に生じる可能性がある問題が解消される； ｒｆｂクローンの同定が非常に単純化されること：クローニングされるべき領域 の制限酵素地図がサザンＤＮＡハイブリダイゼーションによりあらかじめ決定で き、それによりクローニングに先立ち染色体ＤＮＡを切断するための制限酵素を よりよく選択することができる。 さらに、該プローブにより、一つは腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）でありもう一 つは敗血症と関連している。二つの０１１５株を分類することができた。したが って、これらの結果は、０２．０１８．０１１５株と共に、これらのプローブに より明らかに同一の血清型であるが異なる疾患を引き起こす生物体を区別するこ とも可能なことを示している。 もちろん数種の大腸菌血清型は天然ヒト細菌フロラの一部であるので、これは極 めて重要なことである。 本発明によるＤＮＡプローブは適当な手段で標識することができる。放射性標識 も非放射性標識も使用可能である、放射性標識を用いる場合には例えば３２リン やｓ８イオウなどのリンまたはイオウの放射性同位体を使用する。 非放射性標識が望ましい場合には、ビオチン化光感受性標識が選択されるであろ う。 本発明のさらに別の局面では、 プラスミドクローニングベクター； 第一の制限酵素；および エンテロバクテリウム科細菌の〇−抗原の合成のための遺伝子を含むＤＮＡ断片 ； を供給すること、 制限酵素でプラスミドクローニングベクターを部分消化すること；および、 制限酵素切断部位にＤＮＡ断片を挿入することを含む。 ＤＮＡプローブ調製法が与えられる０選択した制限酵素切断部位は、用いた制限 酵素に対応するか、それと互換性のあるものである。プラスミドクローニングベ クターは適当な型のものであればよい、プラスミドクローニングベクターｐＨｃ ？９は適当であることが示されている。このプラスミドクローニングベクターは Ｂａｍ旧制限酵素部位を含んでいるので、対応するＢａｍ旧または５ａｕＳＡ制 限酵素が推奨される。 推奨される態様では、このように連結されたＤＮＡは１ｎｖｉｔｒｏでパッケー ジングされ、適当な細菌株へ形質導入される。 大腸菌株が使用可能である。大腸菌に−１２株が使用可能である。大腸菌に−１ ２株り旧が適当であることが見いだされている。 サブクローンが必要とされるような推奨される局面においては、ＤＮＡプローブ の調製法は、複数の制限酵素を供給すること； 連結したＤＮＡを制限酵素で消化して異なるサイズの断片を生じさせること； をさらに含む。 制限酵素は、Ｍｌｕｌ、　Ｋｐｎｌ、　５ａｌＩ、　ＢａｍＨＩ、　５ａｃｌ、 　Ｐｓｔｌ。 ＨｐａＩ、　Ｃ１ａＩ、　Ｈｉｎｄｌｌｌなどを含む、断片が突出末端を含む場 合には、突出末端を埋めるさらなる過程を行う、これはＤＮＡポリメラーゼｌの クレノー断片を用いて実施される。 こうして形成されたサブクローンはプラスミドｐＰＭ１３２１、　ｐＰＭ１３２ ２．　ｐＰＭ１３２３．　ｐＰＭ１３２４．　ｐＰＭ１３２５．　ｐＰＭ１３２ ６．　ｐｐＭ１３３０．およびｐＰＭ２２１８を含む、プラスミドｐＰＭ１３２ １．　ｐＰＭ１３３０およびｐＰＭ１３２６は高度に保存されていることが見い だされたので推奨される。これらのプラスミドは血清型０１０１を特徴づける領 域の一部をコードしており、　ＥＴＥＣがより効果的な病原体あるいは腸管内細 菌となることを可能にする〇−抗原鎖の共通の性質と関連しているものがｒｆｂ 遺伝子群のこの領域中にコードされているのが見いだされるであろうと言うこと が仮定される。 したがって、本発明のさらなる局面では。 テスト用試料；および ＤＮＡ断片を含む少なくとも一つのＤＮＡプローブであって、該プローブがエン テロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出するもの： を用意すること； 試料を少なくとも一つのＤＮＡプローブと接触させること；および その産物をアッセイにかけること； を含む疾患の診断法が与えられる。 本発明のこの局面の推奨される態様では、診断法はさらに、疾患の原因となる生 物体の血清型分類法を与える。この態様では、診断法は、 試験される一連の試料；および エンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出するＤＮＡ断片を含む第 一のＤＮＡプローブ；および、 該第−のプローブとは異なる様式でエンテロバクリウム科細菌のｒｆｂ領域の存 在を検出するＤＮＡ断片含む第二のプローブ（例えば、第一のプローブと第二の ローブが血清型特異的となっているもの： を含むＤＮＡプローブキット： を用意すること： その産物を一連のアッセイにかけること；を含む。 上記の試験される試料はいかなる適当な型のものでもよい。糞便資料も使用可能 である。　各々のＤＮＡプローブは、上述のように放射性標識または非放射性標 識されたＤＮＡプローブであることが望ましい。 産物のアッセイはいかなる適当な方法で行ってもよい。ウェスタンおよび／また は呈色プロット分析を使用してもよい。 あるエンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ座位全体を実質的に含むＤＮＡの制限 断片を含むプラスミド、例えばプラスミドｐＰＭ１３０５は、適当な弱毒性細菌 キャリア株に導入して生ワクチンとして機能させうる。上述のように。 エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１０１の大腸菌である場合には、大腸菌 に−１２株に導入した場合に０１０１０−抗原生合成には、最小的１３ｋｂ、最 大的１５．８ｋｂの断片が必要であることをわれわれは見いだした。 したがって１本発明のさらなる局面において。 あらかじめ選択した細菌株試料：および、エンテロバクテリウム科細菌の〇−抗 原の合成のための遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミド；を与えること：お よび、 あらかじめ選択された細菌株の染色体中にプラスミド上のクローニングされた遺 伝子を挿入すること；を含む、エンテロバクテリウム科細菌の弱毒性株の調製法 が与えられる。 プラスミドはｐＰＭ１３０５が使用可能である。 あらかじめ選択された細菌株は、サルモネラ（Ｓａ１ｍｏｎｅ１１ａ）、および シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株から選択される。サルモネラ・チフイムリウム（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、およびサルモネラ・ダブリン（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）は適当であることが見いだされた。　問題となる疾患 は、あらゆるエンテロバクテリウム科細菌株によって引き起こされるものも含む 。 上述のエンテロバクテリウム科細菌の弱毒性株は、ワクチン組成物のための基礎 を与える可能性のあるものである。 ワクチン組成物は、ヒトまたは家畜の毒素原性疾患に対する経口性生ワクチンと して使用される。 シゲラ・フレクシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の群（ｒｆｂ） −および型−抗原生合成のための遺伝子はあらかじめ選択された株に導入される 。さらなる変化として、細胞表面上に適当なシゲラ特異的な〇−抗原をその株が 発現するように、シゲラＬＰＳコア生合成遺伝子（ｒｆａ）の導入を含む、銀染 色、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、および赤血球凝集阻害によるＬＰＳの解析が、〇−抗原産 生のアッセイに用いられる。免疫原性は、マウス、ウサギ、および最後にはサル で評価される。 したがって１本発明のさらに別の局面では、細菌キャリア株；および、 細菌キャリア株の染色体中に挿入された、エンテロバクテリウム科細菌の〇−抗 原合成のための遺伝子を含むＤＮＡ断片； を含む、エンテロバクテリウム科細菌による疾患に対する免疫性を生じさせるた めに有用なワクチン組成物を与えるものである。 細菌キャリア株は、サルモネラおよびシゲラ株から選択される。 エンテロバクテリウム科細菌は、血清型０１０１の大腸菌であることが望ましく 、ＤＮＡ断片は最小的８．９ｋｂ、最大的１１．８ｋｂである。 あるいは、エンテロバクテリウム科細菌は血清型０１５７又は０２のものである 。 ワクチン組成物は、あらゆる適当な形で供給される。 ワクチン組成物は経口的または注射によって供給され得る。水性および／または アルコール性キャリアを含む適当なキャリアが含まれる。緩衝化生理食塩水が使 用可能である。必要であれば、本分野で既知の他の成分および化合物も含むこと ができる。 本発明のさらなる局面においては、ヒトを含む哺乳類におけるエンテロバクテリ ウム科細菌による疾患の予防治療法を与えるものであり、該方法は、治療される 哺乳動物；および、 細菌キャリア株；および、 細菌キャリア株の染色体中に挿入された。エンテロバクテリウム科細菌の〇−抗 原合成のための遺伝子を含むＤＮＡ断片； を含む、エンテロバクテリウム科細菌による疾患に対する免疫性を生じさせるの に有用なワクチン組成物； を用意すること：および、 予防学的に効果的な量のワクチン組成物を投与する本発明の特に望ましい局面に おいては、ヒトを含む哺乳動物における。血清型０１５７の大腸菌による疾患の 予防治療法が与えられ、該予防治療法は、 治療される哺乳動物：および、 サルモネラまたはシゲラキャリア株；および／または、 プラスミドｐＰＭ１３５４由来のＤＮＡ断片、またはその消化誘導体： を含むワクチン組成物： を与えること；および、 該哺乳動物に予防学的に効果的な量のワクチン組成物を投与すること； を含む。 血清型０１５７の大腸菌は数面尿毒症候群の原因となるものであり、エンテロへ モラテイツク大腸菌、ＥＨＥＣと呼ばれる。 これは、重度のものであり、しばしば死に至り、この疾患に対するワクチンは現 在のところ存在しない。 本発明は以下、実施例と図面を参考として、より詳細に説明される。しかしなが ら、以下の記述は例示的なものであり、上述の発明の一般性をいかなる方法でも 制限するものであると解されるべきではないことは、理解されるべきである。 図面の説明： 見り皿 Ｈ５１０ａ、　Ｂ４１．　ＤＨＩ、　Ｅ９６３　（ＤＨＩ　ｐＰＭ１３０５　） 、　ＶＡＣ１６７６、ＫＡＴＴ１７０６．およびＶＣ１７５１由来の全膜性物質 の、２０％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ電気泳動による、ウェスタンプ ロット解析による比較。 電気泳動的トランスファー後、　ＬＰＳ物質は、Ｂ４１にたいして作製された０ １０１分類用血清（１：１０００）、　それに続く、西洋ワサビペルオキシダー ゼと結合しているヤギ抗ウサギ−１ｇＧの添加およびペルオキシダーゼの基質の 添加によって視覚化された。 呈り皿 菌株ＤＨ１，Ｅ１１１７６、　Ｅ９６３．　Ｈ５１０ａ、　Ｂ４１．　ＶＡＣ１ ６７６、ＫＡＴ１１７０６、　ＶＣ１７５１，および８ＣＥ２７５／６由来の、 す／Ｌ’　：］　シ／ｌｚ抽出した膜性物質をＳＤＳ中で可溶化し、　７−２５ ％指数関数的勾配ポリアクリルアミドゲル上で（１０）に記述されているように 電気泳動した。ゲルは、　ＬＰＳまたはりボタンバク質が優先的に銀で染色され るように固定した（２８）。 ！Ｌ皿 プラスミドｐＰＭ１３０５の制限エンドヌクレアーゼ切断パターンと欠失解析、 太線の領域が残存しているｐＨＣ７９に対応する。プラスミドＤＮＡの単独消化 および二重消化産物は、ＴＢＥ緩衝液中で０．８％および１．０％アガロースゲ ルで解析した。線は、　９２Ｍ１３０５の各誘導体で残っているクローニングさ れたＤＮＡの範囲を示している。それらの０１０１０−抗原の合成を媒介する能 力も一緒に示している。９２Ｍ１３０５はまずＭｌｕＩで消化し、インサートＤ ＮＡをｐＬＧ３３９（ストーカ−（Ｓｔｏｋｅｒ）他、　１９８２）のＭ１ｕＩ 部位に連結しテｐＰＭ１３３０を形成させた。プラスミドｐＰＭ２２１８とｐＰ Ｍ２２１９は、　９２Ｍ１３０５の５ａｌＩおよびＨｐａＩ欠失を表している。 プラスミドｐＦ’Ｍ２２２０とｐＰＭ２２２１は、それぞれ、Ｂａｍ旧切断後に 突出末端を埋めること、および、　５ａｃｌで消化後に突出末端を除去すること により生成された。 ９２Ｍ１３０５のＰａｔｌ制限エンドヌクレアーゼ部位によって規定される６つ のＤＮＡ断片がｐＧＢ２　（チャーチワード（Ｃｈａｒｃｈｗａｒｄ）他、　１ ９８４）のＰａｔ１部位にサブクローニングされた。　０１０１大腸菌のｒｆｂ 領域の最小コード領域の解析により、サブクローンｐＰＭ１３２２．　ｐＰＭ１ ３２４．　ｐＰＭ１３２５、およびｐＰＭ１３２６は全てｒｆｂコードＤＮＡを 含んでおり、ｐＰＭ１３２１およびｐＰＭ１３２３は隣接したＤＮＡとｒｆｂ　 ＤＮＡの組み合わせを含んでいることが示唆された。太い線は残存しているｐＨ Ｃ７９ＤＮＡを表している。 】１」ｌ プラスミドｐＰＭ１３０５およびクローニングベクターｐＨＣ７９を有するミニ セル全体から産生された５ｓＳ−標識されたタンパク質を示している。　ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ、感光はフルオログラフィーなし で、室温で７日間行った。 】」−区一 大腸菌０１０１由来の全ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化したもの のサザンハイプリダイゼーション分析を示したオートラジオグラフで　５ａｐ− 標識したｐＰＭ１３２２（パネルＡ、　Ｐｓｉ）；パネルＢ、　ＥｃｏＲＩ）お よびｐＰＭ１３２４（パネルＣ，ＥｃｏＲＩ；パネルＤ、　Ｐａｔｌ）をプロー ブとして使用している。ニトロセルロースフィルターの最終洗浄のストリンジエ ンシーは、ｚＸＳＳＣ中で６５℃であった。感光時間は、イルフォード増感スク リーンを用いて、−７０℃で２日間であった。 見り皿 ０１８および０２の大腸菌の血清型変異体由来の染色体ＤＮＡを制限エンドヌク レアーゼＰｓｔ１．　ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌＩＩを用いて、単独および二重 消化のすべての組み合わせで消化した。　ＤＮＡ試料を０．８％アガロース上で 電気泳動し、続いてサザンの方法によってニトロセルロースフィルターにトラン スファーした。 ０１０１ｒｆｂクロ一ンｐＰＭ１３０５由来の二つのサブクローンｐＰＭ１３２ １とｐＰＭ１３２６は、　ｒｆｂ遺伝子群の中で高度に保存されているＤＮＡ領 域を示していると考えられている。これらのサブクローンは、Ｏ１８および０２ 大腸菌の制限断片長身型性（ＲＦＬＰ）を検出するための放射性標識プローブと して使用された。 サザンハイブリダイゼーション分析（Ａ、Ｂ、Ｃ）でこれらのプローブを用いて 得られた制限酵素地図（Ｄ）は、０１８と示されていない大腸菌の他のものの間 での高度な関連性を示し、おそらく進化的に密接に関連していることを血清型２ ａ、　４ａ、　６．２ａ、および４ａ／ｙにそれぞれ対応するシゲラ・フレクシ ネリ株ＰＥ５３２．　ＰＥ５２４．　ＰＥ５２５．　ＰＥ５２６、およびＰＥ５ ２７ならびに無作為に選択された、示した血清型の大腸菌株の選択株由来の染色 体ＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、断片を０．８％アガロースで電気泳動して分離し た。　ＤＮＡをニトロセルロースにトランスファーし、写したものを９２Ｍ１３ ０５の多様なサブクローン断片をプローブとしてサザンハイプリダイゼーション を行った。用いた放射性標識プローブは、　Ａ（ｐＰＭ１３２１）；　Ｂ（ｐＰ Ｍ１３２６）：　Ｃ（ｐＰＭ１３２５）、　Ｄ（ｐＰＭ１３２２）：　Ｅ（ｐＰ Ｍ１３２４）：　Ｆ（ｐＰＭ１３２３）であった。 ハイブリダイゼーションは高いストリンジエンシー。 ０．２ＸＳＳＣ，６５℃で行った。オートラジオグラフィーは、増感スクリーン を用いて一７０℃で２日間感光させた。 ス１ｊ■ 全ての株は通常、２倍の強度にして５ｇ／Ｉ　ＮａＣ１を添加した栄養培地（デ ィフコ・リサーチ・ラボラトリーズ、米国ミシガン州デトロイト）中で培養した 。栄養寒天は、血液寒天ベース（ディフコ）に血液を加えずに用いた、適当な場 合には、アンピシリン（２５μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ ｍ　１　）を添加した０通常の使用のための培養液は、１５％グリセロールとし て一２０℃で保存ウサギでＢ４１に対して調製した０１０１のための分類用血清 は、Ｃ，ムレ−（Ｈｕｒｒａｙ）、　ＩＭＶＳ、アゾレードから入手した。これ は大腸菌１１２株り旧で非常によく吸着された。 ゲノムＤＮＡの−１ ゲノムＤＮＡの調製は、実質的にマニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）他（１４）に示さ れた方法で行った。−晩振盪した培養液２０ｍ１由来の細胞をベレットにしく３ ０００　Ｘ　ｇ；　１０分）、１回洗浄し、ペレットをリゾチームで１次にサル コシル溶菌溶液で処理し、フェノールおよびエーテル抽出を行った。つぎにＤＮ Ａ溶液をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ。 ｐＨ８，０）に対して十分に透析した。 プラスミドＩ）ＮＡの （１４）に記述されているように、この方法は、実質的に、３段階のアルカリ溶 解、それに続く２段階勾配上のＣｓＣ１遠心（ガーガー（Ｇａｒｇｅｒ）他、１ ９８３）である。 ラスミドＤＮＡのン 大腸菌に一１２株の形質転換は以前に報告されているように行った（９）、コン ピテント細胞は、氷上でのＭｇＣ１，−ＣａＣ１２インキュベーションによって 調製した。細胞は氷上で６０分後にはコンピテントとなっていると仮定されるが 、通常は氷上で一晩静置した。 コンピテント細胞（０，２ｍ１）を１μｇ　ＤＮＡと混合し、氷上で３０分間イ ンキュベートし１次に２分間ヒートショック（４２℃）をかけた。次に、栄養培 地中で３７℃で６０分間振盪して発現させて、混合液を適当な抗生物質プレート Ｂ４１由来のゲノムＤＮＡを用いて、（１４）に記述されているようにニスミド ライブラリーを構築した。５ａｕ３Ａで部分消化したゲノムＤＮＡ　１〜２μｇ を、Ｂａｍ旧で消化したｐＨＣ７９ＤＮＡをアルカリホスファターゼ処理したも の６μｇの１３ａｍＨＩ部位にクローニングした。連結させたＤＮＡをｉｎ　ｖ ｉｔｒｏでパッケージングし、大腸菌に一１２株ＤＨＩに形質導入した。この方 法で通常１０００〜２０００のアンピシリン耐性コロニーが得られた。 ミニセル”　とオートラジオグラフィープラスミドをミニセル生成株ＤＳ４１０ に形質転換した。 ミニセルはショ糖密度勾配で精製し、プラスミドによってコードされる蛋白質を ５ｓＳ−メチオニンで標識し、既に報告されているように試料緩衝液で可溶化し た（１３）。 １１〜２０％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ中で電気泳動を行った後、乾 燥させたゲルを室温でコダックＸ−ｏｍａｔフィルムを用いてオートラジオグラ フィーにかけた。制澗」Ｅ素ＪＩ足 ＤＮＡの制限酵素消化は販売元が推奨するように実施した。消化したＤＮＡは、 　ＴＢＥ緩衝液（６７ｍＭ　）リス、　２２０１Ｍホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　 ｐＨ８，８）中で０．８％ｗ／ｖアガロース水平ゲル系で解析した。プラスミド ＤＮＡ断片のサイズ決定。 あるいはザザントランスファーのための制限エンドヌクレアーゼ消化したゲノム ＤＮＡのための全てのゲルは、２０Ｖで一晩電気泳動を行った。ゲルはエチジウ ムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶ先光下可視化した。制限断片のサ イズは、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ１ｉｓ）バク テリオファージ５ＰＰＩ　ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化産物に対する相対的移動度に よって決定した（２２）。 クレノー　での　フィルイン Ｂａｍ旧およびＳａｃ　Ｉでの切断によって生じた突出末端は、　ＤＮＡポリメ ラーゼ■のクレノー断片を用いて埋めるか、または除去した。典型的には、１． ６μｇの消化したＤＮＡ、各２μｍのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、および５ユニツトの クレノー断片（ファルマシア）を混合し、室温で３０分静置した、１μｍの０． ５ｍＭ　ＥＤＴＡを加えて６５℃で１５分インキュベートすることによって反応 を停止させた。取り込まれなかったｄＮＴＰおよび酵素は、セファロースＣｌ− ６Ｂカラムを通過させて遠心することによって除去した。 リポポリサッカライドのためのＳＤＳポリアクリルアミドゲル　°動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥと銀 ５ＤＳ−ＰＡＧＥでのりポボリサッカライドの解析と試料の調製は、クセツエク （Ｋｕｓｅｃｅｋ）他（１９８４）の方法と同様に行った。解析のための株は１ ００ｍ１のし培地中で培養した。 細胞膜は、外膜を豊富にするためにサルコシルで抽出した（アハトマン（Ａｃｈ ｔｍａｎ）他、１９８３）、適当な希釈後。 ７〜２５％指数関数勾配ゲルにこれらを載せ、　１０ｍＭで１６時間泳動した。 リポポリサッカライドの銀染色は、ツァイ（Ｔｓａｉ）とフラシニ（Ｆｒａｓｃ ｈ）　（１９８２）の方法にしたがって行った。 ウェスタンおよびコロニープロット” コロニーおよびウェスタンプロットは、０１０１分類用抗血清の１　：　１００ ０希釈液を一次抗血清として行った。二次抗血清は、西洋ワサビペルオキシダー ゼと結合しているヤギ抗ウサギＩｇＧ（ノルディック・イムノロジー）を最終希 釈率１：５０００として用いた。詳細な方法は既に報告されている（マニング（ Ｍａｎｎｉｎｇ）他、　１９８６）。 プロティンＡ−コロイド コロイド金粒子（約１５　２Ｏｎｔｏ）は既に報告されているクエン酸法（デメ イ（ｄｅ　Ｍｅｙ）とメオルマンス（Ｍｅｏｒｍａｎｓ）、　１９８６）によっ て調製し、プロティンＡ（ファルマシア）と結合させた。 のイムノゴールド　− ＣＦＡ寒天上で３７℃で１８時間増殖させた細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ フラクションＶ、フロラ・ラボラトリーズ、オーストラリア　ノースライド）を 含むリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，２）　（ＰＢＳ＋ＢＳＡ）に再懸濁し、 一度洗浄した。１滴（３５μｍ）の細胞懸濁液をパラフィルムの上に落とした。 ポリ−ｔ−リジン処理をしたフォルムバー電子顕微鏡グリッドをプラスチックノ 面を下にしてこの水滴の上に２分装置いた（マジア（Ｍａｚｉａ）他、１９７８ ）。 このグリッドを、同じパラフィルムの上においた次の試薬に移した：　ＰＢＳ＋ ＢＳＡ　Ｘ２：抗体（生理食塩水で１：２００希釈）で１５分；　ＰＢＳ＋ＢＳ Ａ　Ｘ３：　プロティンＡ−金（ＰＢＳ＋ＢＳＡで１：５０希釈）；蒸留水×３ ０手順が完了した後、過剰の液体をグリッドから除去し、ネガティブ染色をせず にグリッドを風乾させた。いくつかの実験では、イムノゴールド標識した調製物 は、２％ウラニル酢酸溶液でネガティブ染色を行った。グリッドは、　８０ｋＶ の加速電圧で操作されるＪＯＥＬ　ＪＥＭ　１００Ｓ透過型電子顕微鏡で観察し た。 ＰＭ１３０５のニックトランスレーションとサザンブラスミドＤＮＡは、　ＤＮ ＡポリメラーゼＩでニックトランスレーションを行い、サザンＤＮＡハイブリダ イゼーション分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、　１９７５）はマニーアティ ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他（１９８２）の修飾法によって行った。　ｐＰＭ１３ ０５とそのサブクローンの８２ｐで標識したＤＮＡを、多数の１０１０分離菌由 来のゲノムＤＮＡを適当に消化したものに対するプローブとして使用した。オー トラジオグラフィーは、増感スクリーンを用いて、コダックＸ−ｏｍａｔフィル ムで、−７０℃で行った。感光時間は３日であった。 」Ｌ敦 １０１　ＬＰＳ生合　のための（ｒｆｂヤ　の　クローニング大腸菌、サルモネ ラ、およびビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）からの遺伝的 証拠から、〇−抗原の生合成のための遺伝子はｒｆｂと呼ばれる遺伝子群によっ て決定されていることが示された（二階堂他、　１９８７：　プラムバット（Ｂ ｒａｈｍｂａｔｔ）他、　１９８６：　ｖニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）他、１９８ ６；　ワード（Ｗａｒｄ）他、　１９８７）、したがって、約１０００個のコロ ニーのニスミドゲノムライブラリーを、３４１株に対して調製し、大腸菌に−１ ２株り旧で十分に吸収させた０１０１分類用抗血清でスクリーニングした（オル スコ（Ｏｒｓｋｏｖ）他、　１９８７）、我々は、コロニープロットでさまざま な程度の反応性を示す１３のクローンを検出した。全膜性物質の最初のウェスタ ンプロット解析により、クローンの大部分はその反応性はタンパク質をコードす るクローニングされた遺伝子の発現によるものであることが示された（データは 示さない）、シかしながら、一つの株、　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３０１）はスメア様 のパターンを示し、　ＬＰＳ様物質の合成に必要な遺伝子の発現を媒介とする可 能性が示唆された、このクローは、南オーストラリア、アゾレードの医学獣医学 研究所の大腸菌参照研究室によって０１０１血清型であることが確認された。　 ｐＰＭ１３０１のサブクローンのＤＨＩ（ｐＰＭ１３０５）　（以下参照）と他 の既知の０１０１大腸菌分離株の、−Ｂ４１に対する抗血清を用いた。全膜性物 質のウェスタン分析から、　ｐＰＭ１３０５を有するＤ旧は実際に他の０１０１ 分離株と同様の反応性を示すＬＰＳ　Ｏ−抗原物質を産生ずることが示された（ データは示さない）、　０１０１分類用血清を用いたイムノゴールド電子顕微鏡 観察により、適当な特異性の〇−抗原であるだけではなく、それがＢ４１と同様 に表面に位置していることも示された（第１図）。 サルコシル抽出をした膜性物質をＳＤＳ中で７〜２５％のポリアクリルアミド指 数関数勾配ゲルで泳動すると、異なる０１０１分離株の〇−抗原パンディングパ ターンに多様性が見られる（第２図）０例えば、　Ｈ５１０ａ型株（オルスコツ 他、　１９７？）では、わずかに電気泳動度が異なる一連のダブレットとして現 れる。　ｐＰＭ１３０５およびｐＰＭ１３３０（低コピー数プラスミド；以下参 照）を有する大腸菌に−１２株は、　０１０１抗血清とウェスタンプロットでは 反応するが、Ｂ４１のパターンとは幾分異なるシングレットのバンディングパタ ーンを示す（データは示さない）、これらの違いはおそらく、リポポリサッカラ イドのコア構造の相違が、不完全な発現、あるいは大腸菌に一１２株内での修飾 を反映していると思われる。 クローニン　されたＤＮＡの　、 ２段階の手順でニスミドｐＰＭ１３０１のサイズを小さくした：　ＨｉｎｄＩ１ １部分消化でｐＰＭ１３０２を作製し、その後にＭ１ｕＩ部分消化によってｐＰ Ｍ１３０５を得た。　１６．４ｋｂのクローニングされたＤＮＡを含んでいるｐ ＰＭ１３０５の制限酵素地図を第３図に示す。 ｐＰＭ１３０５中の０１０１０−抗原生合成の最小コーディング領域のより正確 な見積もりは、一連の断片を低コピー数ベクターｐＬＧ３３９（ストーカ−（Ｓ ｔｏｋｅｒ）他、１９８２）にサブクローニングし、一連の誘導体プラスミドを 構築することによって決定した（第３図）、　ＬＰＳの銀染色から判断して、プ ラスミドｐＰＭ１３３０（ＭｌｕＩ−Ｍｌｕｌサブクローン）とｐＰＭ２２１８ （Ｓａｉｌ欠失）のみが〇−抗原を発現していた（第２図）、　ｐＰＭ１３３０ もｐＰＭ１３０５と比較して優位なプラスミド安定性を示した（データは示して いない）、他の誘導体は検出可能な程度の〇−抗原を産生じなかった（第３図） 、シたがって、　０１０１　ｒｆｂ遺伝子群のコーディング領域は、（６，０− ７，３ｋｂ）のＳａｉｌ−Ｍｌｕｌ制限エンドヌクレアーゼ部位で規定される領 域からＳａｃＩ−ＭｌｕＩの間の領域（１６，２−１７，８ｋｂ）までにわたっ ている筈である；すなわち、最小８．９ｋｂで最大１１．８ｋｂのＤＮＡが〇− 抗原生合成に必要とされる。 ミニセル　のＰＭ１３０５によってコードされている５ｓＳ−−タンパク　の ミニセル内のｐＰＭ１３０５によってコードされているタンパク質の試験から、 　８０．７９，５２，４２．３８、および２４ｋＤの大きさの６種の新しいポリ ペプチドが、さまざまな量で産生されていることが明らかになった（第４図）。 これらのタンパク質の大きさの合計は、オーバーラツプがなく、構造遺伝子間に 非コード領域がないと仮定して、約９ｋｂのＤＮＡのコード領域が必要である。 これは、抗原生合成のために必要なりＮＡ量を非常に密接な相関がある８ＢＳ− メチオニンを用いたので、メチオニンを含まないタンパク質あるいは非常に少量 しか産生されていないタンパク質も０１０１合成に関与しているが検出されなか つた可能性もある。これらのタンパク賃金てが〇−抗原生合成に関与しているか どうかを決定することはこれまで不可能だった。トランスポゾン挿入解析を用い た試みからは、欠失プラスミドの同一世代においては、どれも〇−抗原が発現さ れないという結果が常に得られた（データは示さない）。 ＰＭ１３０５のサブクローンを　ローブとして　いたＤＮＡバイブ１ダイゼーシ ヨン ８２ｐ−標識したｐＰＭ１３０５をプローブとして用いて、このプラスミドが０ １０１　ｒｆｂ領域の特異的プローブとして有用かどうかを決定するために、コ ロニーハイブリダイゼーション分析を行った。これらの実験（データは示さない ）から、ｐＰＭ１３０５は〇−血清型にかかわらず、試した全ての大腸菌分離株 に（はとんどの場合弱く）ハイブリダイズすることが明らかになった。■、コレ ラ、サルモネラあるいは大腸菌に一１２株ｒｆｂ欠失株、　ＱＥ３５（サンシャ イン（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ）とケリー（Ｋｅｌｌｙ）、　１９７１）とはハイブリ ダイズしなかった。興味深いことに、このプローブはいくつかの明らかに免疫学 的には関連のない血清型のものと強く反応し、その原因については現在間べてい る。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での〇−抗原パンディングパターンの違いがｒｆｂ座位 のＤＮＡレベルでの違いを反映しているかどうかを決定するために、ｐＰＭ１３ ０５の６つのＰａｔＩ断片をベクターｐＧＢ２（チャーチワード（Ｃｈａｒｃｈ ｗａｒｄ）他、１９８４）にサブクローニングした（第３図）０選択したサブク ローンをプローブとして用いたサザンハイプリダイゼーション分析を第５図に示 す。 〇−抗原生合成に必要であることが知られている２つの最も大きいＰｓｔＩ断片 、　ｐＰＭ１３２２およびｐＰＭ１３２４を、ほかの０１０１分離株の間でのｒ ｆｂ座位中の相同性の程度を決定するために用いた。もっとも大きいプローブｐ ＰＭ１３２２を用いた場合には、Ｂ４１と他のＥＴＥＣ分離株、さらに８ＣＥ２ ７５／Ｂ分離株（非ＥＴＥＣ）のｒｆｂ領域中の制限部位が非常によく保存され ていることが明らかになった。　Ｈ５１０ａ株（非ＥＴＥＣ）は他の分離株と同 程度のＢ４１との相同性は示さない、３４１株そのものは、他の分離株と共通の 制限断片を有するが、ＤＮＡ配列が重複している証拠も示す、　ｐＰＭ１３２４ を用いた場合には、　Ｈ５１０ａ株の例外を除き、他の０１０１分離株との密接 な関連性が明らかであり、Ｂ４１の配列重複も同様である。対照株ＱＥ３５　（ ｒｆｂ欠失）およびＤＨＩはこれらのプローブと共通の配列は持たない。 二つの最も大きい内部プローブ１）ＰＭ１３２２およびｐＰＭ１３２４と、０１ ０１分離株、大腸菌に一１２株ＱＥ３５およびＤＨＩを用いたサザンハイプリダ イゼーション分析の結果を第６図および第７図に示す、　第６図は、　ｐＰＭ１ ３２２を高いストリンジエンシーの条件下でプローブとして用いた場合に。 この断片が全ての分離株で高度に保存されていることを示している。独特のＬＰ Ｓバンディングパターンを有するＨ５１０ａ株は、ｐＰＭ１３２２上の配列とハ イブリダイズさせると顕著に異なる断片パターンを示すが、　ｒｆｂ欠失株ＱＥ ３５あるいは大腸菌に一１２株ＤＨＩとは検出可能な相同性がないが、これは驚 くべきことではない。 第７図は、　ｐＰＭ１３２４をｐＰＭ１３２２と同一の条件下でプローブとして 用いた場合に、　Ｈ５１０ａは独特のパターンを示し、８ＣＥ２７５／６．　Ｖ ＡＣ１６７６オヨびｖｃ１７６５１ハ同一ノハター同一ノナターン表している。 Ｂ４１とＫＡＴ１１７０６株は他の分離株（Ｈ５１０ａを除く）と共通の断片を 有する。Ｑ３５とＤ旧とはハイブリダイゼーションは見られない、興味深いこと に、このプローブはＢ４１の同等の断片を検出できず、ｐＰＭ１３２３とｐＰＭ １３２４中のクローニングされたＤＮＡは全てがつながっている訳ではなく、お そらくそれらが生成され我々は、０１０１血清型の腸毒素原性大腸菌由来のｒｆ ｂ領域のクローニング、および、大腸菌に一１２株内での発現を述ヘテ来り、二 つツクローン、ＤＨｌ（２２Ｍ１３ｏ５）オヨびＤＨＩ（ｐＰＭ１３３０）によ って発現されたＬＰＳは、その親株Ｂ４１のものよは電気泳動的に顕著に異なる ものである。これは、宿主の遺伝的背景が異なるためであり、おそら＜　ＬＰＳ コア構造の違いを反映しているものだと思われる。大腸菌には幾つかの異なるコ ア構造が存在することはすでに知られている（総説としては、ルデリッッ（Ｌｕ ｄｅｒｉｔｚ）他。 １９８２）、　Ｄ旧株による〇−鎖の修飾を反映するものかもしれない。 少なくとも６つのタンパク質が最小コード領域内にコードされており、これらが ０−サブユニットの合成と組み立て（アセンブリー）に関与していることが示唆 される、　ｒｆｂ欠失株ＱＥ３５におけるＬＰＳとしての０１０１０−抗原の産 生は、該クローンに含まれているｒｆｂ遺伝子のみが、大腸菌に一１２株のコア でのその発現と重合に必要であることを示している（データは示さない）、　０ １０１　ＬＰＳの構造は未知であり、正確な最小コード領域も決定されていない ので、ミニセル内で全てのタンパク質が発現されているか、あるいは０１０１０ −抗原の合成には別のさらに検出されていないタンパク質が必要なのかは断言で きない。 サブクローニングと欠失解析から、これらのタンパク質の合成に必要であると予 想される９ｋｂは、コーディングＤＮＡの最小量のよい見積もりを与えることを 支持する。 我々が試験Ｌ７た０１０１分離株は、　５ＤＳ−ＰＡＧＥから判断して、ＬＰＳ にいくらかの多様性を示している。この相違は多価抗血清では血清学的に検出さ れない、０１０１血清型は動物ＥＴＥＣ血清型に共通であるという事実にもかか わらず、０１０１血清型に多様性があるという報告はない。異なる０１０１パタ ーンの間の関連性を化学的に推測することは未だ不可能である。遺伝的関連性、 　ＤＮＡハイブリダイゼーションから、これらの相違は単に〇−鎖のマイナーな 修飾を反映しているだけであると予測することもできる。現在のデータからは、 複数の０１０１　ＬＰＳ型が存在していることが示唆されるニ一つの型はＨ５１ ０ａによって規定され、他（７）型ハＢ４１．　ＫＡＴＨ７０６，８ＣＥ２７５ ／６．　ＶＡＣ１６７６、オヨびＶＣ１７５１に見られる。　ＤＮＡハイブリダ イゼーションのデータからは、Ｈ５１０ａにおいてＬＰＳ生合成に関与している 酵素は、共通の制限断片を有する他の型のものとそれほど密接に関連していない ことを示唆している。Ｂ４１の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の異なるＬＰＳパターンは、 　この株で我々が見いだした遺伝子重複の配列を反映しており、これはＢ４１の ｒｆｂ領域のクローン、すなわちＤＨＩ　（ｐＰＭ１３０５）およびＤＨＩ（ｐ ＰＭ１３３０）が他の０１０１分離株のＬＰＳパターンとよく似ているためであ る。 ０１０１大腸菌がアハトマン（Ａｃｈｔｍａｎ）とブルスフケ（Ｐｉｓｕｃｈｋ ｅ）　（１９８６）によって提唱された“クローン性°グループ分けに属する可 能性は今後の課題である。非Ｈ５１０ａ　ｔ、ｐＳ型が、動物における特異的疾 患と関係してしばしば見いだされる、密接に関連している“クローン性゛グルー プ分けを形成し、従って疾患が株の“クローン性”特徴の一部として考えられる 可能性もある。 ｐＰＭ１３０５のサブクローンは０１０１血清型に属さない株と相同性を示し、 　０１０１以外の血清型の株間の関連性を決定するのに有用であろう、これらの プローブは、血清学的に関連のない血清型にハイブリダイズ可能なため（データ は示さない；ベーガー他、　１９８８）、これらは疾患を引き起こす細菌を同じ 血清型の共生型細菌と区別することができる。迅速な治療用プローブの開発の基 礎となり得る。慣用的な血清型分類では疾患を引き起こす細菌の同定の手段は与 えられなかった。　ＤＮＡハイブリダイゼーシシン分析による〇−血清型多様性 の検出は、病原体の同定のためのより特異的な方法を与えるであろう。 ０１０１に対する抗体はコロニー化因子またはアトへシンに９９あるいはＦ４１ 　！、：対する抗体ヨリも０１０１：９９／Ｆ４１　攻撃に対して高度に防御的 であるため（ダチェットーサチョークス（Ｄｕｃｈｅｔ−Ｓｕｃｈａｕｘ）、　 １９８６）、クローン化されたｒｆｂ　０１０１遺伝子の入手可能性は１弱毒性 サルモネラ菌のハイブリッドワクチン株の構築の基礎も与える（ステイーブンソ ン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）とマニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）、　１９８５）。 第１表 株　遺伝子条〉発現型　出所 ＤＨＩ　Ｆ−肛ｎ９６．ｒｅｃＡ１　ｅｎｄＡｌ、ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７， 且「Ｂ、バッハマンＱＥ３５　ｄｅｌ［ａｔｔ２ＰＨ−シ江］８７．ｒｅｌＡ１ ．肚奸１．ｔｈｉ−１’″　Ｂ、バッハマンＤＳ４１０　Ｆ−画Ａ１画Ｂ、Ｂ徂 Ｌ　Ｄ、シェラートＢ４１　０１０１：［９９／Ｆ４１　Ｆ、＆４．オルスコフ Ｈ５１０ａ　０１０１：８３３　Ｆ、＆ｌｌオルスコツ８ＣＥ２フ５／　０１０ １：ｌ［１０３Ｆ、＆１．オルスコフＶＡＣ１６７６０１０１：に３０：Ｈ−（ ３Ｐ−）　Ｈ，ムーンＫＡＴ１１７０６　０１０１：［３０：Ｈ−（３Ｐ−）　 Ｈ，ムーンＶＣ１’１５１　０１０１：１２７：Ｈ−（３Ｐ−＞　Ｈ，ム−＞Ｋ ９Ｓ３　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３０５）　＋ａｍｌｒ：０１０１−Ｏａｇ”　本研究 Ｅ１１７６　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３３０）　：ｔｅｔ’；０１０１−Ｏａｇ”　本 研究Ｅ１１５９　ＤＨｌ（ｐＰＭ１３２１）；Ｓｐｃ’；５ｔｒｒ本研究Ｅ１１ ６０　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３２２）；Ｓｐａ’：Ｓｔｒ’　本研究Ｅ１１６１　Ｄ ＨＩＣｐＰＭ１３２３＞：Ｓｐｃ’：Ｓｔｒ’　本研究Ｅ１１９７　ＤＨＩ（ｐ ＰＭ１３２４）；５ｐｃ−：Ｓｔｒ’　本研究Ｅ１１９Ｂ　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３ ２５）；Ｓｐｃ’；Ｓｔｒ’　本研究Ｅ１１９９　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３２Ｂ）： ５ｐｃ−；Ｓｔｒ’　本研究Ｅ１１０２　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３２９）　；ｔｅｔ ’　本研究Ｅ１２０３　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３３１）　：ｔｅｔ’　本研究Ｅ１２ ０４　ＤＨｌ（ｐＰＭ１３３２）；ｔｅｔｒ　本研究Ｅ１２０５　ＤＨＩ（ｐＰ Ｍ１３３３）；ｔｅｔ’　本研究Ｅ１２０６　ＤＨＩ（ｐＰＭ１３３４）　；ｔ ｅｔ’　本研究■」し【臥 １）　アハトマン、ホイゼンレーダー、クセシェフ、オホマン、ニーガント、セ ランドラー、フイサネンーレン、コルホネン、スチュアート、オルスコツおよび オルスコツ（Ａｃｈｔｍａｎ、　Ｍ、、　Ｍ、　Ｈｅｕｚｅｎｒｏｅｄｅｒ、　 Ｂ、　Ｋｕｓｅｃｅｋ、　Ｈ，Ｏｃｈｍａｎ、　Ｄ、　Ｃａｕｇａｎｔ、　Ｒ， に、　５ｅｌａｎｄｌｅｒ、　Ｖ、　Ｖｕｉｓａｎｅｎ−Ｒｈｅｎ、　Ｔ、に、 　Ｋｏｒｈｏｎｅｎ、　Ｓ、　５ｔｕａｒｔ、　Ｆ、　０ｒｓｋｏｖ　ａｎｄ　 １．０ｒｓｋｏｖ）、　１９８６）、病気のヒトおよび動物から単離した大腸菌 ０２　：に１のクローン分析（Ｃ１ｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０２：Ｋｌ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｄｉ ｓｅａｓｅｄ　ｈｕｍａｎｓ　ａｎｄ　ａｎｉｍａｌｓ）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　 Ｉｍｍｕｎ、　５１：　２２８−２７６２）　アハトマンおよびプルスフケ（Ａ ｃｈｔｍａｎ、　Ｍ、、　ａｎｄ　Ｇ。 Ｐｌｕｓｃｈｋｅ）、　１９８６．選択された大腸菌の系統および毒性のクロー ン分析（Ｃ１ｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｅｓｃｅｎｔ　ａｎｄ　ｖ ｉｒｕｌａｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４０：　１８５−２１０３）　アワドーマサルメ、ムー ン、ラネルズおよびシュナイダー（Ａｗａｄ−Ｍａｓｓａｌｍｅｈ、　Ｍ、、　 Ｈ，Ｗ、　Ｍｏｏｎ、　Ｐ、Ｌ、　Ｒｕｎｎｅｌｓａｎｄ　Ｒ，Ａ、　５ｃｈｎ ｅｉｄｅｒ）、　１９８２．　Ｋ８Ｂ、　Ｋ９９および９８７Ｐ抗原を欠失した 腸毒性大腸菌のブタ株のウィルス生産、血球凝集および接着（Ｒｉｌｕｓ　ｐｒ ｏｄｕｃｔｉｏｎ、　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ。 ａｎｄ　ａｄｂｅｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｅ ｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｌａｃｋ ｉｎｇ　Ｋ２Ｓ、　［９９ａｎｄ　９８７Ｐ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）、　Ｉｎｆｅ ｃｔ、　Ｉｍｒｎｕｎ、　３５．３０５−３１３４）　プランバット、クイグレ イ、およびジーブス（Ｂｒａｈｍｂａｔｔ、Ｈ，Ｎ、、　Ｎ、Ｂ、　Ｑｕｉｇｌ ｅｙ　ａｎｄ　Ｐ、Ｒ，Ｒｅｅｖｅｓ）、　１９８６．サルモネラ　チフィムリ ウムの表面抗原（〇−抗原）の生合成酵素をコードする領域のクローニング部位 ＣＣ１ｏｎｉｎｇ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ 　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｆ。 ｒ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　（０−ａｎｔｉｇｅｎ）　ｏｆ　Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ ｔ、　２０３：　１７２−１７６５）フラウン、ウニストン、サウンダーズおよ びハンフリーズ（Ｂｒｏｗｎ、　Ｍ、Ｃ，Ｍ、、　Ａ、　Ｗｅｓｔｏｎ、　Ｊ、 Ｒ，５ａｕｎｄｅｒｓ　ａｎｄＧ、Ｐ、　Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ、　１９７９）、 異なる成長段階でのプラスミドＤＮＡによる大腸菌Ｃ６００の形質転換（Ｔｒａ ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｂｙ　ｐｌａｓｍｉｄ　 ＤＮＡ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｈａｓｅｓｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ）、　Ｆ ＥＭＳ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　５：　２１９−２２２６）　チ ャーチヮルド、ベリンおよびナガミネ（Ｃｈｕｒｃｈｗａｌｄ、　Ｇ、、　Ｄ、 　Ｂｅ１ｉｎ　ａｎｄ　Ｙ、　Ｎａｇａｍｉｎｅ）、　１９８４．他の一般に用 られるクローニングベクターと配列ホモロジーを示さないｐｓｃ１０１誘導プラ スミド（Ａ　ｐｓｃｌｏｌ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄｗｈｉｃｈ　ｓｈ ｏｗｓ　ｎｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｃｏ ｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ）、　Ｇｅｎｅ、　３ １：　１６５−１７１７）ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、　Ｄ、、　１９８３． 　プラスミドにょる大腸菌の形質転換の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｒａｎ ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　。 ｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｓｍｉｄｓ）、Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６６：　５５７−５８０ ８）　ホーンおよびコリンズ（Ｈｏｈｎ、　Ｂ、、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｃｏ１１ｉ ｎｓ）１９８０、大きいＤＮＡフラグメントのクローニングのための小さいニス ミド（Ａ　ｓｍａｌｌ　ｃｏｓｍｉｄ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　１ａｒ ｇｅ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、　Ｇｅｎｅ　１１：　２９１−２９８９ ）　カウフマン（Ｋａｕｆｆｍａｎｎ）、　Ｆ、　１９４７．大腸菌群の血清学 （Ｔｈｅ　ｓｅｒｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｌｉ　ｇｒｏｕｐ）、Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ　５７二１０）クセシェフ、ウオルシュ、メルセル、ノクイサネン 、ブルスフケ、コルホネンおよびアノ）トマン（Ｋｕｓｅｃｅｋ、　Ｂ。 、　Ｈ，Ｗｏｌｃｈ、　Ａ、　Ｍｅｒｅｅｒ、　Ｖ、　Ｖａｉｓａｎｅｎ、　Ｇ 、　Ｐｌｕｓｃｈｋｅ、　Ｔ、　Ｋｏｒｈｏｎｅｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ａｃｈｔｍ ａｎ）、　１９８４．０１，０？、０１６，０１８，０７５、およびＫｌ、に５ またはに１００大腸菌間の悪性因子としてのりポポリサツカライドカプセルおよ び突起（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃａｒｉｄｅ　ｃａｐｓｕｌｅ　ａｎｄ　ｆｉｍ ｂｒｉａｅ　ａｓ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｔ。 ｏｎｇ　０１，０？、０１６，０１８，０７５．　ａｎｄ　Ｋｌ、に５　ｏｒ　 ［１００Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ 、　４３：　３６８−３７９１１）レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）、　Ｍ、Ｍ、、　１ ９８７．下痢をおこす：腸毒性、腸病原性、腸侵入性、腸出血性および腸接着性 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｔｈａｔ　ｃａｕｓｅ　Ｄｉａｒ ｒｈｅａ：　Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ、　Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅ ｎｉｃ、　Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ、　Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇ ｉｃ　ａｎｄ　Ｅｎｔｅｒｏａｄｈｅｒｅｎｔ）、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ ｓ、１５５：　３７７−３８９ １２）マニアチス、フリツクおよびサムプルツク（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、 　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、）、　１ ９８２．分子クローニング：実験室手引（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、　コールトスプリングツｘ− ／く一ラボラトリー、コールドスプリングバー、（−１３）マニング、ブラウン およびホイゼンローダー（Ｍａｎｎｉｎｇ、　Ｐ、Ａ、、　Ｍ、Ｈ，Ｂｒｏｗｎ 、　ａｎｄ　Ｍ、Ｗ、　Ｈｅｕｚｅｎｒｏｅｄｅｒ）、　１９８４．０１７株の とブリオコレラＥｌ　ｔｏｒの出血毒素の構造遺伝子（ｈ　１ｙ）のクローニン グ（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ　（ｈｌ ｙ）　ｆｏｒ　ｔｂｅ　ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌ ｅｒａｅ　Ｅｌｔｏｒ　５ｔｒａｉｎ　０１？）、　Ｇｅｎｅ、　３１：　２２ ５−２３１１４）マニング、ホイゼンローダー、イートン、リーブスレー、ジー ブスおよびローリ−（Ｍａｎｎｉｎｇ、　Ｐ、Ａ、、　Ｍ、Ｗ、　Ｈｅｕｚｅｎ ｒｏｅｄｅｒ、　Ｊ、　Ｙｅａｄｏｎ、　Ｄ、１．　Ｌｅａｖｅｓｌｅｙ、　Ｐ 、Ｒ，Ｒｅｅｖｅｓ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｒｏｗｌｅｙ）、　１９８６．　ビブリオ コレラ０１リポポリサツカライドのイナバおよびオガワ血清型の〇−抗原の大腸 菌に−１２での発現および分子クローニングならびにそのワクチン開発の可能性 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ。 ｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ｏｆ　ｔｈｅ　Ｏ−ａ ｎｔｉｇｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎａｂａ　ａｎｄ　Ｏｇａｗａ　５ｅｒｏｔ ｙｐｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｖｉｂｒｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅｏｌ　１ｉｐｏｐｏｌ ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ 　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ 、　５３：　２７２−２７７１５）モリスおよびソジカ（Ｍｏｒｒｉｓ、　Ｊ、 Ａ、、　ａｎｄ　Ｗ、Ｊ、　５ｏｊｋａ）、　１９８５．動物の病原としての大 腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｓ　ａ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｎ 　ａｎｉｍａｌｓ）、大腸菌の悪性：総説および方法（Ｔｈｅ　Ｖｉｒｕｌｅｎ ｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ａｎｄ　 Ｍｅｔｈｏｄｓ）の４７０４４頁９Ｍ、サスマン（Ｓｕｓｓｍａｎ）編。 アカデミツクプレス、（ロンドン） １６）ニカイドウ、ニカイドウおよびマケラ（Ｎｉｋａｉｄｏ、　Ｈ。 、　Ｋ、　Ｎ１ｋａｉｄｏ　ａｎｄ　Ｐ、Ｍ、　Ｍａｋｅｌａ）、１９６６、サ ルモネラのりポポリサッカライドの〇−特特異精糖合成酵素の遺伝学的決定（Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｚｉｎｇＯ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｕｇａｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ　１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、　Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　９１：　１１２６−１１３５１７）オルスコツ、オルスコツ、ジ ャン、およびジャン（Ｏｒｓｋｏｖ、１．、　Ｆ、　０ｒｓｋｏｖ、　Ｂ、　Ｊ ａｎｎ、　ａｎｄ　Ｋ、　Ｊａｎｎ、）、　１９７７゜大腸菌のＯおよびに抗原 の血清学、化学および遺伝学（Ｓｅｒｏｌｏｇｙ、　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ ｄ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｏａｎｄ　ｋ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｅｓｃ ｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４１：　 ６６７−７１１８）オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎ、　Ｍ、Ｊ、）、　１９７９．外 膜のリポポリサッカライドの生合成および組み立て（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒ ｉｄｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ）　、イノウニ（Ｍ、Ｉｎ ｏｕｙｅ）編、細菌の外膜（Ｂ４Ｃｔｅｒｉａｌ　ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎ ｅｓ）の１５−３４頁、ジョンワイジーアンドサンズ社、ニューヨーク １９）オズボーンおよびウー（Ｏｓｂｏｒｎ、　Ｍ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｈ，Ｃ， Ｐ。 Ｗｕ）、　１９８０．　グラム陰性バクテリアの外膜の蛋白質（Ｐｒ。 ｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　ｇｒａｍ　 ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ）、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏ、　３４：　３６９−４２２２０）ブルスフケ、モル、クセシェフおよび アハトマン（Ｐｌｕｓｃｈｋｅ、　Ｇ、、　Ａ、　Ｍｏ１ｌ、　Ｂ、　Ｋｕｓｅ ｃｅｋ　ａｎｄ　Ｍ、　Ａｃｈｔｍａｎ）。 １９８６　、大腸菌リポポリサッカライド０１８および０２３抗原のサブグルー プ分けの道具としてのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動およびモノクローナル抗体（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｐｈａｔ ｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　 ａｎｄ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｓ　ｔｏｏｌｓ　ｆ ｏｒ　ｔｂｅ　ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ　ｌｉｐ。 ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　０１ｇ　ａｎｄ　０２３　ａｎｔｉｇｅｎｓ） 、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５１：　２８６−２９３ ２１）ラトクリフ、ラブ、ガネサン、ベーレンス、トムソン、モンテネグロ、モ レリおよびトラウトナー（Ｒａｔｃｌｉｆｆ、Ｓ、Ｗ、、Ｊ、Ｌｕｂ、Ａ、Ｔ、 Ｇａｎｅｓａｎ、Ｂ、Ｂｅｈｒｅｎｓ、Ｒ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｍ、Ｍｏｎｔｅ ｎｅｇｒｏ、Ｇ、Ｍｏｒｅｌｌｉ　ａｎｄ　Ｔ、Ａ、Ｔｒａｕｔｎｅｒ）、　１ ９７９．枯草菌ファージ５ＰＰＩのゲノム：制限エンドヌクレアーゼにより生じ たフラグメントの配列（Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅｏｆ　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　 ｐｈａｇｅ　５ＰＰＩ：　ｔｈｅ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒ ｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅ ｎｔｓ）、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１６８：　１６５−１７２２２ ）スミス、スコツトランドおよびロウ（Ｓｍｉｔｈ、　Ｈ，Ｒ，。 Ｓ、Ｍ、　５ｃｏｔｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｒｏｗｅ）、　１９８５．大腸菌 悪性の遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　 ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）、大腸菌の悪性：総説および方法（Ｔｈｅ　Ｖｉｒｕｌｅ ｎｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ａｎｄ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ）の２２７−２６９頁１Ｍ、サスマン（Ｓｕｓｓｍａｎ）編、 アカデミツクプレス、（ロンドン）２３）ストーカ−、フェアウェザ−およびス プラット（Ｓｔｏｋｅｒ、　Ｎ、Ｇ、、　Ｎ、Ｆ、　Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　 ａｎｄ　Ｂ、Ｇ、　５ｐｒａｔｔ）、　１９８２、　大腸菌中でのクローニング のための多目的低コピー数プラスミドベクター（Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｌｏｗ　 ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎ ｉｎｇ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、　Ｇｅｎｅ　１８：　３ ３５−３４１ ２４）ストーカ−１およびマケラ（Ｓｔｏｃｋｅｒ、　Ｂ、Ａ、Ｄ、、　ａｎｄ Ｐ、Ｈ，Ｍａｋｅｌａ）、　１９７１．サルモネラリポポリサッカライドの生合 成および構造の遺伝学的観点（Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｓｐｅｃｔｓ　。 ｆ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ　１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）　、ワインバウム、カ ブイスおよびアシル（Ｇ、　Ｗｅｉｎｂａｕｍ、　Ｓ、　Ｋａｄｉｓ　ａｎｄ　 ＳＪ、　Ａｊｌ）編、微生物毒素（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｏｘｉｎｓ）第■巻 中３６９−４３８頁、アカデミツクブレス社、ロンドン ２５）サンシャイン、およびケリー（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ、　Ｍ、Ｇ、、　ａｎｄ Ｂ、　Ｋｅｌｌｙ）、　１９７１．バクテリオファージＰ−２介在培養に伴う宿 主削除の程度（Ｅｘｔｅｎｔ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ　ａｓｓｏ ｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｓｇｅ　Ｐ２−ｍｅｄｉａｔ ｅｄ　ｅｄｕｃａｔｉｏｎ）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１０８：　６９ ５−７０４２６）サスマン（Ｓｕｓｓｍａｎ）、　Ｍ、、　１９８５．　ヒトお よび動物の病気における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ｉｎ　ｈ ｕｍａｎ　ａｎｄ　ａｎｉｍａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ）、大腸菌の悪性：総説およ び方法（Ｔｈｅ　Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ：　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ｍ、サスマン（Ｓｕｓｓｍ ａｎ）編７−４５頁、アカデミツクプレス、（ロンドン） ２７）ツァイおよびフラッシュ（Ｔｓａｉ、　Ｃ，Ｍ、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｆｒａ ｓｃｈ）、　１９８２．ポリアクリルアミドゲル中のりボポリサッカライドの検 出のための感度の良い銀染色（Ａ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　５ｉ１ｖｅｒ　５ｔａ ｉｎ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　 ｉｎ　ｐ。 ｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ）、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１ １９：　１１５−１１９２８）ワード、モレリ、カムヶ、モロナ、バケットおよ びマニング（Ｗａｒｄ、　Ｈ，Ｍ、、　Ｇ、　Ｍｏｒｅｌｌｉ、　Ｍ、　Ｋａｍ ｋｅ、　Ｒ，Ｍｏｒ。 ｎａ、　Ｊ、　Ｈａｃｋｅｔｔ　ａｎｄ　Ｐ、Ａ、　Ｍａｎｎｉｎｇ）、　１９ ８７．　ビブリオコレラ０１の〇−抗原生合成を決定する染色体領域の物理地図 （Ａ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｒ ｅｇｉｏｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　０１）。 Ｇｅｎｅ　５５：　１９７−２０４ 最後に、多様な他の修飾および／または改変が、ここで述べた本発明の本質から 外れることなく行われることは理解されるであろう。 ＦＩｏ　２ シ；（ｂ；に変更なし） にＢ ＫＢ 手続補正書風　手 平成　３年　１月２日

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤ ＮＡ断片を含む、エンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出するた めのプローブ。
2. ２．該ＤＮＡ断片が、大腸菌の血清型０１０１、０１５６、または０２の０−抗 原の合成をコードする遺伝子を含む、請求の範囲第１項記載のＤＮＡプローブ。
3. ３．該ＤＮＡ断片が、腸毒素原性大腸菌の血清型０１０１の０−抗原の合成をコ ードする遺伝子を含む、請求の範囲第２項記載のＤＭプローブ。
4. ４．該ＤＮＡ断片が、最小長約８．９キロ塩基対で、最大長約１１．８キロ塩基 対を有する請求の範囲第３項記載のＤＮＡプローブ。
5. ５．エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤ ＮＡ断片を含む、エンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出するた めの第一のＤＮＡプローブ；および、 該第一のプローブとは異なる様式でエンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の 存在を検出するＤＮＡ断片を含む、該第一のプローブとは各々血清型特異的であ る第二のＤＮＡプローブ； を含んでなるＤＮＡプローブキット。
6. ６．プラスミドクローニングベクター；および該プラスミドクローニングベクタ ーの適当な部位に挿入されたエンテロバクテリウム科細菌の０−抗原の合成をコ ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片； を含むＤＮＡプローブ。
7. ７．該ＤＮＡ断片が腸毒素原性大腸菌の血清型０１０１の０−抗原の合成をコー ドする遺伝子を含むものであり、最小長が約８．９キロ塩基対で最大長が約１１ ．８キロ塩基対であり； 該プラスミドクローニングベクターがプラスミドクローニングベクターｐＨＣ７ ９である、請求の範囲第６項記載のＤＮＡプローブ。
8. ８．放射性あるいは非放射性標識を更に含む、請求の範囲第６項記載のＤＮＡプ ローブ。
9. ９．プラスミドｐＰＭ１３０５、ｐＰＭ１３２２、ｐＰＭ１３２３、ｐＰＭ１３ ２４、ｐＰＭ１３２５、ｐＰＭ１３２６、ｐＰＭ１３３０およびｐＰＭ２２１８ 、およびその混合物から選択されたｒｆｂ　ＤＮＡを欠失したプラスミド、を含 んでなるＤＮＡプローブ。
10. １０．血清型０１５７の大腸菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含み、お よびプラスミドｐＰＭ１３５４、あるいはその消化誘導体を含んでなるＤＮＡプ ローブ。
11. １１．血清型０２の大腸菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含み、および プラスミドｐＰＡ１３４３、ｐＰＡ１３４４、あるいはｐＰＡ１３４５から選択 されたプラスミド、あるいはその消化誘導体を含んでなるＤＮＡプローブ。
12. １２．エンテロバクテリウム科細菌の、ｒｆｂ領域の存在を検出するＤＮＡプロ ーブを製造するための方法であって、 プラスミドクローニングベクター； 第一の制限酵素；および、 エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡ 断片； を用意すること； 該プラスミドクローニングベクターを制限酵素で部分消化すること；および、 該ＤＮＡ断片を該プラスミドクローニングベクターの制限酵素部位に連結するこ と； を含む上記方法。
13. １３．複数の制限酵素を用意すること；および連結したＤＮＡを制限酵素で消化 して、異なるサイズの制限断片を生じさせること； をさらに含む、請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．該制限酵素が、ＭｌｕＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＳａｃＩ， ＰｓｔＩ，ＨｐａＩ，ＣｌａＩ，およびＨｉｎｄＩＩＩから選択されるものであ る、請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．疾病の診断法であって、 試験される試料；および エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含んでいる ＤＮＡ断片を含み、エンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出する 少なくとも一つのＤＮＡプローブ； を用意すること； 該少なくとも一つのＤＮＡプローブと試料を接触させること；および その産物をアッセイにかけること； を含む上記診断方法。
16. １６．試料が糞便試料であり； 少なくとも一つのＤＮＡプローブが放射性または非放射性標識されたＤＮＡプロ ーブであり；およびアッセイがそのウエスタンおよび／またはカラープロット解 析から選択されるものである、請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．疾患の原因となる生物体の血清型分類法であって、 試験される一連の試料；および エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡ 断片を含み、エンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の存在を検出する第一の ＤＮＡプローブ；および 該第一のプローブとは異なる様式でエンテロバクテリウム科細菌のｒｆｂ領域の 存在を検出するＤＮＡ断片を含む、該第一のプローブとは各々血清型特異的であ る第二のＤＮＡプローブ； を含むＤＮＡプローブキット； を用意すること； 各試料を該キットに含まれている異なるＤＮＡプローブと接触きせること；およ び、 その接触産物を一連のアッセイに付すること；を含む上記方法。
18. １８．エンテロバクテリウム科細菌の弱毒株を作成するための方法であって、 あらかじめ選択された細菌株の試料；およびエンテロバクテリウム科細菌の０− 抗原の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミド；を用意する こと；および あらかじめ選択された細菌株の染色体にプラスミド上のクローン化された遺伝子 を挿入すること；を含む上記方法。
19. １９．該あらかじめ選択された細菌株が、サルモネラおよびシゲラ株から選択さ れたものである、請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．該エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１０１の大腸菌であり、ＤＨＡ 断片が最小長約８．９キロ塩基対で、最大長約１１．８キロ塩基対である、請求 の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１５７あるいは０２である請求の 範囲第１９項記載の方法。
22. ２２．エンテロバクテリウム科細菌が起こす疾患に対する免疫性を生じさせるた めに有用なワクチン組成物であって、 細菌キャリア株；および 細菌キャリア株の染色体に挿入された、エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原 の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片； を含んでなる上記ワクチン。
23. ２３．細菌キャリア株がサルモネラおよびシゲラ株から選択されたものである、 請求の範囲第２２項記載のワクチン組成物。
24. ２４．エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１０１の大腸菌であり、ＤＮＡ断 片が最小長約８．９キロ塩基対で、最大長約１１．８キロ塩基対である、請求の 範囲第２３項記載のワクチン組成物。
25. ２５．エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１５７または０２である、請求の 範囲第２３項記載のワクチン組成物。
26. ２６．ヒトを含む哺乳動物における、エンテロバクテリウム科細菌による疾患の 予防処置のための方法であって、 処置される哺乳動物；および エンテロバクテリウム科細菌による疾患に対する免疫性を生じさせるために有用 なワクチン組成物であって、 細菌キャリア株；および 細菌キャリア株の染色体に挿入された、エンテロバクテリウム科細菌の０−抗原 の合成をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片 を含むもの； を用意すること；および、 予防治療学的に効果的な量のワクチン組成物を哺乳動物に投与すること； を含んでなる上記方法。
27. ２７．ワクチン組成物の細菌キャリア株がサルモネラおよびシゲラ株から選択さ れたものである、請求の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．エンテロバクテリウム科細菌が、血清型０１０１の大腸菌であって、ＤＮ Ａ断片の最小長が約８．９キロ塩基対で、最大長が約１１．８キロ塩基対である 、請求の範囲第２７項記載の方法。
29. ２９．エンテロバクテリウム科細菌が血清型０１５７または０２の大腸菌である 、請求の範囲第２７項記載の方法。
30. ３０．ヒトを含む哺乳動物における血清型０１５７の大腸菌による疾患の予防治 療的処置方法であって、処置されるべき哺乳動物；および サルモネラまたはシゲラのキャリア株；およびプラスミドｐＰＭ１３５４由来の ＤＮＡ断片またはその消化産物； を含むワクチン組成物；および、 予防的処置に有効量のワクチン組成物を哺乳動物に投与すること； を含んでなる上記方法。
31. ３１．疾患が出血性尿毒症候群である、請求の範囲第３０項記載の方法。