DE60118392T2

DE60118392T2 - Verfahren zum nachweis von mikroorganismen

Info

Publication number: DE60118392T2
Application number: DE60118392T
Authority: DE
Inventors: Pierre-Charles Romond; Michel Renaud; Monique Alric; Olivier Meiniel; Lionel Ballut
Original assignee: Gervais Danone SA
Current assignee: Gervais Danone SA
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2021-07-21
Also published as: AU2001278551A1; EP1373563B1; CA2416873C; ATE321889T1; WO2002008459A3; CA2416873A1; DE60118392D1; ES2259330T3; WO2002008459A2; EP1373563A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion der Bestandteile einer bakteriellen Flora, von welchen wenigstens ein Teil der Bestandteile ein gemeinsames Operon aufweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Bestandteile der Flora durch die Untersuchung der intergenischen Sequenz des Operons identifiziert.
Das menschliche Verdauungssystem beherbergt eine beträchtliche Anzahl von Mikroorganismen, die eine mikrobielle Flora von extremer Komplexität bilden. Obgleich diese Bakterien innerhalb des gesamten Verdauungstrakts verteilt sind, umfasst das Kolon die Hauptmenge dieser Flora sowohl in quantitativer als auch in qualitativer Hinsicht. Man schätzt, dass die Kolonflora eines Individuums aus 10¹³ bis 10¹⁵ Bakterien, im Wesentlichen Anaerobiern, gebildet wird, die durch wenigstens 400 Spezies, die zu ungefähr 30 unterschiedlichen Gattungen gehören, repräsentiert werden. Diese Bakterien besiedeln die unterschiedlichen Abschnitte des Kolons auf relativ heterogene Weise. Es wird klassischerweise eine sogenannte Fermentationsflora auf der Höhe des Caecums wie auch eine sogenannte Fäulnisflora im Bereich des linken Kolons beschrieben. Außerdem unterscheidet man eine residente Flora von einer Passageflora. Diese residente Flora wird ihrerseits in eine dominante Flora und eine subdominante Flora aufgeteilt. Die dominanten Bakterien, im Wesentlichen Anaerobier, werden hauptsächlich durch die Gattung Bacteroides, gramnegative Bakterien, aber auch durch die Gattungen Bifidobacterium, Lactobacillus oder Clostridium, grampositive Bakterien, repräsentiert. Die subdominante Flora umfasst aerob-anaerobe Bakterien und Mikroaerophile. Man stellt vor allem die Anwesenheit von Enterobakterien und von Streptokokken fest. Die Nahrungsmitteldiät, Infektionen, der Verzehr von Prä- und Probiotika ebenso wie Antibiotikabehandlungen können drastische Modifikationen der Zusammensetzung der Kolonflora hervorrufen. Da diese Variationen einen direkten Einfluss auf die Gesundheit haben, ist es wichtig, diese zu kennen und zu verstehen, sowohl um diese zu vermeiden als auch um diese mit einem therapeutischen Ziel auszulösen. Bis heute hat die Untersuchung der das Kolon besiedelnden Bakterien erlaubt, ungefähr 200 Spezies zu charakterisieren. Gleichwohl stößt diese Art von Untersuchung auf zahlreiche Probleme, die im Wesentlichen mit der Schwerfälligkeit der Techniken verbunden sind. Die so erhaltenen Ergebnisse wie auch die Schlussfolgerungen, die daraus herrühren, sind noch fragmentarisch.
Die Identifizierung der Bakterien erfolgt gemäß verschiedenen Verfahren, die entweder den Nachweis von spezifischen phänotypischen oder biochemischen Merkmalen oder die Verwendung und die Erkennung von spezifischen heterologen Zonen, die auf dem Genom vorhanden sind, einsetzen.
Ein Beginn der Identifizierung könnte erfolgen, indem die Morphologie des untersuchten Organismus beschrieben und beispielsweise auf das Vorhandensein von Endosporen, von Hüllen, von Zysten, von Knospen, von Fruchtkörpern... untersucht wird. Die Form der Kolonien, die Pigmentierung, die Herkunft der Probe sind gleichfalls nützliche Informationen. Man könnte gleichfalls vorläufige Untersuchungen ausführen, indem spezifische Färbemittel für die Kapsel, die Geißeln, die Granula, die Wand... eingesetzt werden. Gleichwohl läuft eine verfeinerte und genauere Identifizierung notwendigerweise über Isolierungstechniken auf selektiven Medien. Solche Medien werden entwickelt oder verbessert, um die Spezifität dieser Selektion zu erhöhen. Indessen ist es schwierig, das Vorhandensein von etwaigen Verunreinigungen, die dann in den später eingesetzten Erkennungstests interferieren könnten, vollständig auszuschließen.
Diese Tests nutzen die spezifischen biochemischen Merkmale einer Spezies aus. Es existieren Multitestsysteme. Dies sind Identifizierungsgalerien, die in Form von Kits, von Mikroplatten, von Streifen, deren Verwendung manchmal automatisiert erfolgt, vorliegen. Es existiert gleichwohl innerhalb von zahlreichen Spezies ein bestimmtes Ausmaß an Heterogenität chromosomaler oder plasmidischer Herkunft. Beispielsweise fehlen während der Identifizierung ein oder mehrere Merkmale. Auch gibt sie zumeist lediglich die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Spezies an. Eine Ähnlichkeit von 80% oder mehr mit einem Referenzbakterium wird als akzeptabel angesehen. Es sind gleichfalls Monotestsysteme entwickelt worden. Sie setzen fluoreszierende synthetische Substrate ein, die erlauben, das Vorhandensein eines für einen Mikroorganismus spezifischen Enzyms nachzuweisen. Sie erlauben eine schnelle Analyse, sind aber in ihrer Anwendung beschränkt. Tatsächlich muss für jede Spezies ein spezifischer Test entwickelt werden.
Es sind gleichfalls immunologische Tests ausgehend von poly- oder monoklonalen Antikörpern entwickelt worden. Abgesehen von den evidenten Einschränkungen, die den polyklonalen Antikörpern eigentümlich sind, werden diese Tests hauptsächlich für die Charakterisierung von Serotypen, aber selten für die Identifizierung von Spezies eingesetzt. Obgleich üblicherweise im Rahmen der Krankenhausdiagnostik verwendet, werden sie im Bereich der Bakteriologie weiterhin nur wenig eingesetzt. Was die Herstellung von monoklonalen Antikörpern angeht, bleibt sie eine lange, arbeitsaufwändige und kostspielige Arbeit. Sie sind beispielsweise gegen Lipopolysaccharide, die Membran, die Pili... gerichtet, sind aber indessen selten für eine Spezies spezifisch.
Die Entwicklung der molekularbiologischen Techniken hat erlaubt, neue Identifizierungstests zu entwickeln. Diese Techniken basieren auf Hybridisierungsreaktionen oder Polymerase-Kettenamplifizierungs (PCR)-Reaktionen.
Die Genom/Genom-Hybridisierung muss über oder gleich 70% betragen, um eine unbekannte Bakterienspezies als das bekannte Referenzbakterium, dessen genomische DNA eingesetzt wird, um die Diagnostik auszuführen, zu identifizieren. Andere Tests nutzen heterologe Zonen auf der für eine Spezies spezifischen DNA aus. Man kann beispielsweise die Hybridisierungstechnik einsetzen, die darin besteht, auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran das zu analysierende Produkt aufzutragen, dann dieses mit einer spezifischen markierten Sonde (kalte Sonde oder radioaktive Sonde) zu inkubieren {1}.
Man kann gleichfalls spezifische Primer einsetzen, welche erlauben, ein Fragment von bestimmter Größe durch die PCR-Technik zu amplifizieren {2}. In diesem Falle können die durch PCR erhaltenen Amplifikationsprodukte ihrerseits durch andere Techniken, wie den RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) {4} oder die TGGE (Temperaturgradient-Gelelektrophorese) {5}, welche die Diagnostik verfeinern, analysiert werden.
Trotz ihres großen Unterscheidungsvermögens bleiben diese Techniken in dem Maße beschränkt, als sie lediglich erlauben, eine Spezies zu einem Zeitpunkt zu analysieren, oder ebenso darin bestehen, eine Mischung von Spezies zu isolieren, die man dann nicht identifizieren kann, ohne genau das Analysenmuster der Amplifikationsprodukte durch eine gegebene Technik an einem gegebenen Biotop zu kennen.
Die Entwicklung von DNA-Chips (Biochips) erlaubt, eine schnelle Diagnostik ins Auge zu fassen, welche auf mehrere Hundert Spezies abzielt. Diese Technik besteht darin, auf einer Oberfläche von einigen Quadratmillimetern mehrere Hundert für einen gegebenen Organismus spezifische DNA-Sequenzen aufzutragen. Diese Sonden werden mit DNA-Fragmenten, die im Allgemeinen durch RT-PCR erhalten werden, hybridisiert. Die etwaige Hybridisierung der Fragmente wird dann beobachtet und zeigt das Vorhandensein oder das Fehlen des exprimierten Gens oder des untersuchten Organismus an.
Die in diesen letzten Jahren untersuchten Ziel-Nukleinsäuren sind im Wesentlichen die ribosomale 16S-RNA (mit mehr als 7000 verfügbaren Sequenzen) {1, 2, 4, 5}, die Region, welche die genetischen Loci 16S und 23S trennt {3} und die Elongationsfaktoren {6, 7}. So konnten, indem man die 16S-RNAs heranzog, mehrere neue Spezies detektiert werden, die zu den Gruppen Bacteroides und Clostridium, nicht aber Bifidobacferium gehörten {8}. Außerdem, und obgleich die 16S-RNAs erlauben, zahlreiche Bakterien hinsichtlich der Spezies zu detektieren und zu identifizieren, sind sie nicht in der Lage, die verschiedenen Spezies von Staphylokokken zu un terscheiden {2, 3}. So wurde für die Untersuchung der Mikroorganismen der Darmflora eine variable Region des HSP 60 kodierenden Gens vorgeschlagen {9}.
Es ist auch bekannt {11}, dass die Amplifizierung einer variablen Nukleotidsequenz des das konservierte Protein HSP60 kodierenden Gens mit Hilfe von Primern, die in den sehr konservierten flankierenden Regionen entworfen worden sind, den Nachweis von Bakterien, insbesondere von Staphylokokken, auf der Ebene der Spezies erlaubt.
Andererseits ist gleichfalls bekannt {12}, das Vorhandensein von drei Gattungen von Spirochäten durch PCR-Amplifizierung des die β-Untereinheit der RNA-Polymerase kodierenden Gens (rpoB-Gen) mit Hilfe von Primern, die in den konservierten Sequenzen entworfen worden sind, nachzuweisen. Die Amplifizierung des rpoB kodierenden Gens erlaubt gleichwohl nicht, Sequenzen von Bakterien, die zu anderen Gattungen, wie Escherichia coli und Staphylococcus aureus, gehören, zu amplifizieren.
Die Erfindung hat ein Verfahren zur Detektion und zur Identifizierung der Bestandteile einer bakteriellen Flora, insbesondere der Darmflora, zum Gegenstand, gemäß welchem man ein noch unterscheidungskräftigeres und universelleres Ziel als jene, die bereits untersucht worden sind, detektiert und untersucht.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Charakterisierung der Sequenzen dieses Ziels für die in der untersuchten bakteriellen Flora vorhandenen Organismen und erlaubt so, einen Diagnosetest zu konzipieren.
So weist das in dem Verfahren der Erfindung untersuchte Ziel eine hohe Heterogenität zwischen den Spezies auf, was die Unterscheidung zwischen den Mikroorganismen erlaubt.
Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Detektion der Bestandteile einer bakteriellen Flora, bei welchen wenigstens ein Teil der Bestandteile ein gemeinsames Operon aufweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass:

a) man die genomische DNA der Flora oder die mRNAs präpariert,
b) man wenigstens einen Teil der intergenischen, nicht-kodierenden Sequenzen, die in dem bei wenigstens einem Teil der Bestandteile der Flora konservierten Operon gelegen sind, amplifiziert und
c) man die unterschiedlichen amplifizierten intergenischen Sequenzen identifiziert, um die Bestandteile der Flora zu bestimmen,

Tatsächlich wurde überraschenderweise festgestellt, dass die intergenischen Regionen in dem rpoBC-Operon zwischen unterschiedlichen Spezies eine bestimmte Heterogenität aufweisen, wohingegen die kodierenden Zonen, die diese Regionen 5' und/oder 3' flankieren, im Allgemeinen sehr stark konserviert sind. Es ist möglich, dass dieses Tatsache auf einen wenig starken Selektionsdruck auf die nicht-kodierenden Regionen während der Entwicklung zurückzuführen ist {10}.
Die Amplifizierung erfolgt bevorzugt durch Polymerase-Kettenamplifizierung (PCR), es können aber andere (PCR-artige) Methoden eingesetzt werden, welche ein Primerpaar mit Nukleotidsequenzen, welche die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erlauben, einsetzen.
Mit PCR-artig sollen alle Verfahren bezeichnet werden, die direkte oder indirekte Reproduktionen der Nukleinsäuresequenzen einsetzen, oder ebenso, bei welchen die Markierungssysteme amplifiziert worden sind; diese Techniken sind selbstverständlich bekannt. Es handelt sich im Allgemeinen um die Amplifizierung der DNA durch eine Polymerase; wenn die Ausgangsprobe eine RNA ist, empfiehlt es sich, vorab eine Umkehrtranskription auszuführen. Es gibt gegenwärtig sehr zahlreiche Verfahren, die diese Amplifizierung erlauben, wie beispielsweise die SDA (Strand Displacement Amplification)-Technik oder Strangverdrängungs-Amplifizierungstechnik, die TAS (Transcription-based Amplification System)-Technik, die 3SR (Self-Sustained Sequence Replication)-Technik, die NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)-Technik, die TMA (Transcription-Mediated Amplification)-Technik, die LCR (Ligase Chain Reaction)-Technik, die RCR (Repair Chain Reaction)-Technik, die CPR (Cycling Probe Reaction)-Technik, die Q-β-Replikase-Amplifizierungstechnik. Bestimmte von diesen Techniken sind seither perfektioniert worden.
Die Analyse der amplifizierten Sequenzen erfolgt vorteilhafterweise auf einem DNA-Chip, welcher Sequenzen umfasst, die zu den Sequenzen, die möglicherweise ausgehend von den Bestandteilen der Flora amplifiziert werden, komplementär sind. Die Kenntnis der Mikroorganismen, die in der untersuchten biologischen Probe vorhanden sein können, ist folglich wichtig, um den einzusetzenden DNA-Chip auszuwählen. So ist es erforderlich, dass der DNA-Chip auf seiner Oberfläche spezifische Sonden für jeden der Organismen, die man untersuchen möchte, aufweist. Ein solcher DNA-Chip ist gleichfalls ein Gegenstand der Erfindung.
So betrifft die Erfindung insbesondere einen DNA-Chip, welcher auf seiner Oberfläche Sequenzen aufweist, welche komplementär sind zu den intergenischen, nicht-kodierenden Sequenzen, die in einem zwischen unterschiedlichen Spezies konservierten Operon gelegen sind, wobei das Operon ein rpoBC-Operon ist. Unter DNA-Chip versteht man einen festen Träger, auf welchem man Nukleinsäurefragmente fixiert unter Bedingungen, die deren Hybridisierung mit den komplementären Oligonukleotiden und die Detektion der so gebildeten Hybride erlauben. So betrifft ein erfindungsgemäßer DNA-Chip gleichfalls die Membranen, wie sie eingesetzt werden, um Southern-Blots auszuführen.
Die auf dem DNA-Chip gemäß der Erfindung fixierten Oligonukleotide werden dies durch eine jegliche klassische Methode, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, und weisen eine Länge von ungefähr 50 Basen auf. Es versteht sich, dass die betreffenden Oligonukleotide gleichfalls kürzer oder länger sein können. So liegt es im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet, die Länge der auf dem erfindungsgemäßen Chip fixierten Oligonukleotide für jede Sequenz festzulegen.
Bevorzugt werden die auf dem DNA-Chip fixierten Oligonukleotide derart ausgewählt, dass deren Sequenz einen Teil der hypervariablen Region, die gemäß der Erfindung identifiziert wird, aufweist. Die auf dem erfindungsgemäßen Chip fixierten Oligonukleotide können gleichfalls Sequenzen enthalten, die den in einem geringeren Ausmaß variablen Sequenzen, die an oder nahe dem Ende der Gene des Operons gelegen sind, entsprechen.
In einem besonderen und bevorzugten Fall der Ausführung der Erfindung weist der DNA-Chip gemäß der Erfindung eine Mehrzahl (eine Zahl größer oder gleich 2, vorzugsweise 3, mehr bevorzugt 5, am meisten bevorzugt 10) von Oligonukleotiden mit einer Größe über 30 Basen auf. Die Oligonukleotide umfassen vorzugsweise ein Fragment von wenigstens 40 oder 50, mehr bevorzugt 75, am meisten bevorzugt 100 aufeinanderfolgenden Basen mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138, welche den intergenischen Sequenzen von verschiedenen Spezies (rpoBC für SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138) entsprechen.
So erlaubt der Nachweis der etwaigen Hybridisierungen der amplifizierten Sequenzen, die in der untersuchten mikrobiellen Flora vorhandenen Bestandteile zu identifizieren.
Das Operon, welches für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angepasst ist, ist das Operon rpoBC der Bakterien. Dieses bakterielle Operon enthält kodierende Sequenzen, die zwischen den Gattungen relativ homolog sind. Es ist folglich möglich, degenerierte Primer für die Amplifikation einer zwischen den Spezies heterologen Zone, welche der transkribierten intergenischen Zone (ZIG) entspricht, zu bestimmen. Das rpoBC-Operon kodiert bei den Bakterien die Untereinheiten p und p' der "DNA-directed RNA polymerase" (RNA-Polymerase), ebenso wie die konservierten oder nicht-konservierten homologen Gene in Operon-Form bei den Mito chondrien und anderen eukaryotischen Organellen (Chloroplasten) und ebenso wie die eukaryotische nukleäre RNA-Polymerase II (die die mRNAs synthetisiert). Die Untersuchung dieses Operons erlaubt nicht nur, Bakterien zu detektieren, sondern auch, andere eukaryotische Mikroorganismen (Hefen, Protozoen oder andere) zu detektieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird so ausgeführt unter Verwendung von degenerierten Primern, die in den kodierenden Sequenzen des Operons rpoBC gelegen sind, wobei insbesondere wenigstens ein Primer unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 31 und SEQ ID Nr. 53 bis SEQ ID Nr. 61, die ihrerseits Gegenstand der Erfindung sind, ausgewählt wird. Die RNA-Polymerase-Proteine sind tatsächlich unter den Spezies extrem konserviert, was erlaubt, Aminosäuresequenzen zu finden, die gegeneinander ausrichtbar sind, und so degenerierte Oligonukleotide auszuwählen, um die Amplifizierung der intergenischen Sequenzen auszuführen.
Man setzt die Primerpaare ein, die durch die Sequenzen: (eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8)/(eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 9 bis SEQ ID Nr. 11) beschrieben werden, um erstmals die intergenische ZIG-Region der Bakterien zu amplifizieren. Eine zweite spezifischere Amplifizierung kann dann ausgeführt werden unter Verwendung von Primerpaaren, die im Inneren der ersten amplifizierten Region hybridisieren und durch die Sequenzen: (eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 12 bis SEQ ID Nr. 15)/(eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 31) beschrieben werden.
Man setzt die Primerpaare ein, die durch die Sequenzen: eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 53 und SEQ ID Nr. 54, beschrieben werden, um die intergenische ZIG-Region der Bakterien zu amplifizieren.
Diese Primer wurden ausgehend von der Untersuchung der Degeneration von konservierten Protein-Motiven, welche rpoB entsprechen und/oder durch das Gen rpoB kodiert werden, gestaltet:
Für die inversen Sequenzen, bestimmt ausgehend von der Degeneration von konservierten Protein-Motiven, welche rpoC entsprechen und/oder durch das Gen rpoC kodiert werden:
Diese Primer gehören ebenfalls zu der Erfindung.
Die Erfindung hat gleichfalls die genomischen Sequenzen von Mikroorganismen zum Gegenstand, die durch die erfindungsgemäßen Primer, insbesondere die Primerpaare: (eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8)/(eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 9 bis SEQ ID Nr. 11) und die Primerpaare: (eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 12 bis SEQ ID Nr. 15)/(eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 31), amplifiziert werden können. Es wird auch die Amplifizierung mit Primerpaaren: (eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 53, SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58)/(eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 59 bis SEQ ID Nr. 61) ins Auge gefasst.
So hat die Erfindung gleichfalls eine Sequenz unter SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138 zum Gegenstand, die den intergenischen hypervariablen Regionen des rpoB-Operons von verschiedenen Organismen entsprechen. Die Erfindung hat gleichfalls ein jegliches Fragment von wenigs tens 30 Basen, mehr bevorzugt 50 Basen, noch mehr bevorzugt 75 Basen, am meisten bevorzugt 100 Basen mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138 oder deren komplementären Sequenzen zum Gegenstand, wobei das Fragment eingesetzt werden kann, um für die Organismen spezifische Primer zu definieren, oder für die Identifizierung von Organismen insbesondere durch Hybridisierung.
So weist der erfindungsgemäße DNA-Chip auf seiner Oberfläche vorzugsweise eine Mehrzahl von Oligonukleotiden (wenigstens zwei) auf, welche Fragmente, ausgewählt unter den Fragmenten der Sequenzen SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138, die oben definiert worden sind, umfassen, welche so die Identifizierung von Mikroorganismen erlauben. Die Größe dieser Oligonukleotide kann durch den Fachmann auf diesem Gebiet bestimmt werden abhängig von den Hybridisierungsbedingungen, welche er vorhat, einzusetzen. Es werden beispielsweise Oligonukleotide mit einer Größe von ungefähr 50 Basen ins Auge gefasst.
Die Erfindung hat gleichfalls diagnostische Kits für das Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Gegenstand. Diese diagnostischen Kits enthalten degenerierte Primer, welche die Amplifizierung von einer oder mehreren intergenischen Regionen des rpoBC-Operons, welches unter den Spezies konserviert ist, erlauben. Sie können gleichfalls die Reagenzien enthalten, die für die Amplifizierungsreaktion erforderlich sind. Außerdem kann DNA, welche Positiv- oder Negativkontrollen darstellt, in die erfindungsgemäßen diagnostischen Kits mit aufgenommen werden.
Ein diagnostischer Kit gemäß der Erfindung enthält auch vorteilhafterweise die Elemente, die für die Analyse der amplifizierten Produkte erforderlich sind. Insbesondere enthält ein erfindungsgemäßer diagnostischer Kit einen erfindungsgemäßen DNA-Chip, der auf seiner Oberfläche die Sequenzen, die den verschiedenen Mikroorganismen entsprechen, aufweist.
Je nach der Spezies, die man zu detektieren wünscht, enthält der diagnostische Kit gemäß der Erfindung das geeignete Paar von Primern und die geeigneten Analysenelemente. Außerdem kann ein erfindungsgemäßer Kit gleichfalls Anweisungen für das Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen.
Ein erfindungsgemäßer diagnostischer Kit kann auch lediglich einen erfindungsgemäßen DNA-Chip sowie gegebenenfalls Anweisungen, welche die Ausführung der Analyse von Fragmenten, die in der intergenischen Region des zwischen den Spezies konservierten rpoBC-Operons gelegen sind, erlauben.
Die Kombination von Primern und von spezifischen Sonden erlaubt so eine schnelle und genaue Identifizierung der Flora eines gegebenen Individuums. Man kann folglich das oder die Profile von Populationen, die für gesunde Individuen charakteristisch sind, ermitteln. Man kann auch die Profile, die für verschiedene Pathologien typisch sind, ermitteln.
Das Erfindungsgemäße Verfahren bietet gleichfalls die Möglichkeit einer leichten Verfolgung der Entwicklung der Flora abhängig von der Ernährung. Spezieller kann man die Auswirkungen, auf der Ebene des Kolons, eines speziellen Nahrungsmittels, wie eines Prä- oder Probiotikums, oder einer Arzneimittelbehandlung, wie einer Antibiotikatherapie, verfolgen.
Man kann folglich die Entwicklung von Nahrungsmitteln oder Arzneimitteln mit der Absicht "Wirkung auf die Flora" ins Auge fassen, welche eine erneute Etablierung eines normalen Profils oder eine Rückkehr zu einem normalen Profil nach einem Ungleichgewicht im Anschluss an eine Pathologie oder irgendeine aggressive Einwirkung erlauben. Man kann gleichfalls Primer und Sonden einsetzen, welche pathogenen Stämmen entsprechen, um gegebenenfalls kritische Schwellenwerte von Populationen, welche einer Pathologie vorangehen, zu ermitteln. Man kann dann bestimmen, welche die anderen Populationen sind, welche eine Barrierewirkung auf diese Pathogene ausüben können.
Die Werkzeuge (Tools) für die Diagnostik der Darmflora, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens entwickelt worden sind und auf diesem basieren, (die gleichfalls Gegenstände der Erfindung sind), sind zunächst für die Gewebetreibenden auf den Gebieten der Agrarwirtschaft und der Pharmazie von Interesse, um deren Produkte zu entwickeln und den Einfluss von diesen auf die Darmflora festzustellen. Tatsächlich sind besondere Diäten langfristig in der Lage, die Zusammensetzung der Flora bedeutend zu modifizieren und folglich schädliche oder günstige Auswirkungen je nach den Arten von Populationen, die auftreten oder verschwinden, zu haben. Ebenso haben Arzneimittelbehandlungen und insbesondere die Antibiotikabehandlungen Ungleichgewichtszustände innerhalb der Mikroflora zur Folge. Die Charakterisierung der je nach Arzneimittelart betroffenen Populationen würde erlauben, eine parallele oder spätere Behandlung einzusetzen, welche in der Lage ist, diese Modifikationen zu verhindern oder schnellstmöglich eine korrekte Flora erneut zu etablieren.
Diese Werkzeuge (Tools)' sind auch für die auf dem Gebiet der Gesundheit professionell tätigen Personen von Interesse für die Charakterisierung der Darmflora von Patienten, was beispielsweise erlauben kann, eine Behandlung zielgerichtet auszurichten. Tatsächlich schätzen die Gastroenterologen den Teil der Bevölkerung der industralisierten Länder, der über diverse Verdauungsbeschwerden, die man als funktionelle Kolopathien bezeichnet, wobei diese von einfa chen Verdauungsstörungen, wie Blähungen, Flatulenzen, bis zu bedeutenderen Störungen, wie Verstopfung oder Diarrhöe ...., gehen, klagt, auf 70%. Der Hauptanteil von deren Konsultationen betrifft diese funktionellen Kolopathien.
Es wurden nur wenige Lösungen beigetragen, um diese Störungen oder Beschwerden zu behandeln, denn für bestimmte Kolopathien ist über deren Ursache noch zu wenig bekannt und für andere verfügt man über keine wirksame Behandlung. Hinzu kommt das Problem der medizinischen Diagnostik, denn die Patienten, die diese Symptome von funktionellen Kolopathien aufweisen, weisen im Allgemeinen keinerlei physische Läsion im Bereich des Kolons auf. Einzig ein Fragebogen erlaubt es dem Gastroenterologen, sich in Richtung einer Behandlungsart zu orientieren, die sich in der Hauptzahl der Fälle als wenig wirksam erweist. Der Markt an Produkten, die diese Störungen oder Beschwerden lindern können, ist folglich bedeutend, ganz wie jener der Diagnostik. Tatsächlich könnte eine Diagnostik des Zustands der Flora der Patienten dem Arzt Auskunft geben über die Ursachen von deren Beschwerden und die auszuführende Behandlung.
Um ein genomisches Ziel von Interesse auszuwählen, nämlich ein Ziel, das in allen Genomen konserviert ist, wurde das Konservierungsausmaß der während der Evolution am stärksten konservierten Operons ausgehend von den vollständig sequenzierten und auf dem NCBI-Server verfügbaren Genomen von 51 Bakterien untersucht. Diese Sequenzen wurden bezogen auf jene von rpoB/C (beta-Operon) positioniert.
Aus dieser ersten Analyse ist hervorgegangen, dass die längsten und am stärksten konservierten Ziele tatsächlich die Operons groESL (welche Hsp10 (groES) und IIsp60 (groEL) kodieren) und ein Teil des beta-Operons, welcher den Genen rpoB und rpoC (welche die β- und β'-Untereinheiten der "DNA-directed RNA polymerase" kodieren) entspricht, sind. Außerdem war es möglich gewesen, ausreichend lange konservierte Proteinmotive zu identifizieren, um die Definition, dann die Synthese von universellen (ubiquitären) oder nahezu universellen degenerierten Primern zu erlauben.
So wurde das Operon rpoBC ausgewählt, um das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens zu exemplifizieren.
Schließlich ist die interessierende Zone des β-Operons amplifiziert worden, d.h. die durch PCR amplifizierbare Region, unter Verwendung der beiden entsprechenden degenerierten Primer (FO und RP: SEQ ID Nr. 53 und SEQ ID Nr. 54) für eine Auswahl von Bakterien, um deren Sequenz zu ermitteln und diese durch Hybridisierung auf einer Nylonmembran zu testen, um de ren Spezifität zu validieren. Diese Sequenzen sind gleichfalls einem Alignment mit deren in GenBank verfügbaren Homologen unterzogen worden, um diese Spezifität durch Bioinformatik zu beobachten.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen, und dürfen nicht als Einschränkung der Erfindung angesehen werden.
In der Anmeldung sind die Abkürzungen für die Bakterien, wie folgt:
Bacillus subtilis (BS) CIP 52-65T; Bacteroides vulgatus (BV) DSM 1447; Bifidobacterium longum. (BL) DSM 20219; Clostridium leptom (CL) DSM 753; Clostridium nexile (CN) ASM 1787; Clostridium spiroforme (CS) DSM 1552; Clostridium glycolycum (CG) DSM 1288; Lactobacillus gaseri (LG) DSM 20077; Lactobacillus helveticus (LH) CIP 103146; Lactobacillus paracasei (LP) DSM 8741; Lactobacillus reuteri (LR) DSM 20053; Pseudomonas aeroginosa (PA) CIP 100720; Ruminococons hydrogonotrophicus (RH) DSM 10507; Citrobacter freundii (CF); Serratia liquefaciens (SL); Serratia marcescens (SM); Enterobacter cloacae (EnC); Escherichia coli (EsC); Morganella morganii (MM); Profeus mirabilis (PM); Klebsiella oxytoca (KO); Klebsiella pneumoniae (KP)
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Schema des Operons rpoBC von E. coli. Die universellen (ubiquitären) Primer werden für die Amplifizierung der intergenischen Sequenz eingesetzt.
2: Schema des Operons groESL von E. coli. Die universellen (ubiquitären) Primer werden für die Amplifizierung der intergenischen Sequenz eingesetzt.
3: Prinzip eines DNA-Chips. Spezifische Sequenzen werden auf einem festen Träger fixiert. Die etwaige Hybridisierung der komplementären Sequenzen erlaubt, deren Vorhandensein in einer Probe zu bestimmen.
4: Hybridisierung von Auftragungen von 10 ng durch PCR mit rpoBC-Primern amplifizierter DNA (i) und von genomischer DNA (ii) mit einer Serratia marcescens-Sonde, ~0,25 ng/ml, (A) oder Klebsiella oxytoca-Sonde, ~1 ng/ml, (B) während 18 h bei 60°C und Sichtbarmachung für 30 min bei 37°C. Man kann eine Kreuzhybridisierung von CF, SM, SL, EC und KP mit der KO-DIG-Sonde (~1 ng/ml) und von SL mit der SM-DIG-Sonde (~0,25 ng/ml) beobachten.
5: Hybridisierung von Auftragungen i (genomische DNA, a: 10 bis 20 μg; b: 5 bis 10 μg, c: 0,5 bis 1 μg; d: 50 bis 100 ng, e: 5 bis 10 ng, f: 0,5 bis 1 ng) und ii (durch PCR mit GroESL-Primern amplifizierte DNA: a: 50 bis 100 ng, b: 5 bis 10 ng, c: 0,5 bis 1 ng, d: 50 bis 100 pg, e: 5 bis 10 pg, f: 0,5 bis 1 pg) mit einer PA-DIG-Sonde (~10 ng/ml) während 18 h bei 42°C und Sichtbarmachung für 30 min bei 37°C.
6: Hybridisierung von Auftragungen i (durch PCR mit rpoBC-Primern amplifizierte DNA: 10 ng/1 ng/100 pg) und ii(genomische DNA: 1 μg/100 ng/10 ng) mit einer LR-DIG-Sonde (~1 ng/ml) während 18 h bei 50, 55, 60 und 65°C und Sichtbarmachung für 30 min bei 37°C.
BEISPIELE:
Beispiel 1: Isolierung von Stämmen
Um über eine große und für die menschliche Kolonflora repräsentative Probe zu verfügen, ist es erforderlich, neue Bakterienstämme, die noch als nicht kultivierbar bezeichnet werden (und folglich unbekannt sind), die einen hohen Prozentsatz der Bakterien der menschlichen Kolonflora bilden, zu isolieren.
Im diese Isolierungen auszuführen, wird eine große Menge von menschlichen Stühlen gesammelt und mittels Strahlung vom gamma-Typ oder durch Wärme sterilisiert in Hinblick darauf, davon Proben eben dieser menschlichen Stühle auszusäen und diese in Aerobiose und Anaerobiose, in flüssigen und festen Medien zu kultivieren.
Abhängig von den eingesetzten Kulturbedingungen kann man so neue Gattungen, Spezies oder Stämme von das Kolon besiedelnden Bakterien oder andere eukaryotische Mikroorganismen isolieren.
Beispiel 2: Charakterisierung der Sequenzen der isolierten Stämme (rpoB)
Es handelt sich darum, die molekulare Charakterisierung von Sequenzen, Idealerweise von mRNA, auszuführen, um eine Quantifizierung, und wenn nicht von genomischer DNA, der Isolate von bakteriellen oder eukaryotischen Mikroorganismen vorzunehmen.
Man führt die Untersuchung der Sequenzen, welche Abschnitten des bakteriellen Operons rpoBC entsprechen, aus. Die Gene dieses Operons sind tatsächlich zwischen den Gattungen relativ homolog.
Eine Informatik-Analyse (Alignment der Sequenzen) erlaubt so, degenerierte Primer für die Amplifizierung der zwischen den Spezies heterologen Zone, welche der transkribierten intergenischen Zone entspricht, zu definieren.
So wurden die Primer SEQ 1D Nr. 1 und SEQ 1D Nr. 31 wie auch die anderen Primer nach Alignment der mehr als 50 Spezies von lebenden Organismen (Prokaryoten und Eukaryoten, nicht gezeigt) entsprechenden Sequenzen unter Verwendung der Redundanz des genetischen Codes definiert. Man bevorzugt insbesondere die Sequenzen SEQ 1D Nr. 53 und SEQ 1D Nr. 54.
Die mit den vorerwähnten Primern durch PCR oder RT-PCR amplifizierten Regionen können selbstverständlich in verschiedene Vektoren kloniert werden, um dazu verwendet zu werden, die Analyse zu verfeinern (insbesondere, um sie zu sequenzieren).
Beispiel 3: Charakterisierung der Sequenzen der isolierten Stämme (GroESL)
Man führt die Untersuchung der Sequenzen, welche Abschnitten des bicistronischen bakteriellen Operons GroESL entsprechen, aus. Die Gene dieses Operons sind tatsächlich zwischen den Gattungen relativ homolog.
Die Informatik-Analyse (Alignment der Sequenzen) erlaubt so, degenerierte Primer für die Amplifizierung der zwischen den Spezies heterologen Zone, welche der transkribierten intergenischen Zone entspricht, zu definieren.
So wurden die Primer SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 35 nach Alignment der mehr als 100 Spezies von lebenden Organismen (Prokaryoten und Eukaryoten, nicht gezeigt) entsprechenden Sequenzen definiert.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 52 und insbesondere SEQ ID Nr. 139 entsprechen komplementären Sequenzen, die für die Amplifizierung von Mikroorganismen aus verschiedenen Gattungen und/oder Familien eingesetzt werden können.
Die Primer SEQ ID Nr. 32 und SEQ ID Nr. 33 wurden ihrerseits ausgehend von konservierten Sequenzen der Gene GroES und GroEL von E. coli unter Verwendung der Degeneration des genetischen Codes definiert.
Beispiel 4: Amplifizierungsreaktionen (GroESL)
Die PCR-Reaktionen wurden gemäß dem folgenden Protokoll ausgeführt: 2 ml 18 h bei 37°C bewegte Kulturbrühe werden durch Zentrifugation und Resuspendierung des bakteriellen Bodensatzes in 30 μl destilliertem Wasser aufkonzentriert, dann wird eine 1/10-Verdünnung dieses 10 min bei 100°C behandelten Konzentrats als Matrize für die PCR-Reaktionen eingesetzt. Die Reaktionsbedingungen sind 94°C/5 min, dann 25 Zyklen von (94°C/30 s, 60°C/45 s, 72°C/30 s), gefolgt von einem Verlängerungsschritt bei 72°C während 7 min.
Die Analyse der Amplifikationsprodukte erlaubt, zu zeigen, dass man unter Verwendung der Primer SEQ ID Nr. 32 und SEQ ID Nr. 33 die intergenische Zone von verschiedenen Enterobakterien, wie Escherichia coli, Enterobacter clocae, Morganella morganii, Serratia licquefasciens, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, amplifizieren kann. Die amplifizierte Region variiert in der Länge je nach den Spezies von 400 bis 500 Basenpaaren (bp). Die Verwendung des Paares SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 36 liefert Amplifikationsprodukte mit einer Größe zwischen 550 und 650 bp.
Die Verwendung der Paare (SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 39)/(eine Sequenz, ausgewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 38 oder SEQ ID Nr. 40 bis SEQ ID Nr. 52 oder SEQ ID Nr. 139) erlaubt die Amplifizierung von Sequenzen, die für bestimmte Familien und Spezies spezifisch sind, und die Identifizierung der Organismen dieser Familien oder Spezies.
Für die Amplifizierungsreaktionen setzt man vorzugsweise einen als "A" bezeichneten Primer mit einem als "B" bezeichneten Primer ein.
Die mit den vorerwähnten Primern durch PCR oder RT-PCR amplifizierten Regionen können natürlich in verschiedene Vektoren kloniert werden, um dazu verwendet zu werden, die Analyse zu verfeinern (insbesondere, um sie zu sequenzieren).
PCR-PROTOKOLL
Um zu zeigen, dass die Verwendung der intergenischen Zone der beiden Operons von Interesse als Nukleinsäuresonde erlauben kann, mehrere Bakterienspezies zu unterscheiden, amplifizierte man durch direkte PCR an Bakteriensuspensionen die ZIG für jedes Ziel. Für die Amplifizierungsreaktionen setzt man vorzugsweise einen als "A" bezeichneten Primer mit einem als "B" bezeichneten Primer ein.
2 ml 18 h bei 37°C bewegte Kulturbrühe werden durch Zentrifugation und Resuspendierung des bakteriellen Bodensatzes in 30 μl destilliertem Wasser aufkonzentriert, dann wird eine 1/10-Verdünnung dieses 10 min bei 100°C behandelten Konzentrats als Matrize für die PCR-Reaktionen eingesetzt.
OPERON groESL:
Die PCR-Reaktionen werden für dieses Ziel bei einer zwischen 59°C und 60°C variierenden Tm ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen sind 94°C/5 min, dann 25 Zyklen von (94°C/30 s, 60°C/45 s, 72°C/30 s), gefolgt von einem Verlängerungsschritt bei 72°C während 7 min. Die amplifizierten intergenischen Regionen werden dann durch eine Elektrophorese auf einem Agarosegel unter Verwendung einer "1 Kb +"-Skalierung (Gibco BRL) studiert.
Die Analyse der Amplifikationsprodukte erlaubt, zu zeigen, dass man unter Verwendung der Primer SEQ ID Nr. 32 und SEQ ID Nr. 33 die intergenische Zone von verschiedenen Enterobakterien, wie Escherichia coli, Enterobacter clocae, Morganella morganii, Serratia licquefasciens, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, amplifizieren kann. Die amplifizierte Region variiert in der Länge je nach den Spezies von 400 bis 500 Basenpaaren (bp). Die Verwendung des Paares SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 36 liefert Amplifikationsprodukte mit einer Größe zwischen 550 und 650 bp.
OPERON rpoB/C:
Die PCR-Reaktionen werden für dieses Ziel bei einer zwischen 63°C und 64°C variierenden Tm ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen sind 94°C/4 min, dann 30 Zyklen von (94°C/30 s, 64°C/30 s, 72°C/3 min), gefolgt von einem Verlängerungsschritt bei 72°C während 12 min. Die amplifizierten intergenischen Regionen werden dann durch eine Elektrophorese auf einem Agarosegel unter Verwendung einer "DNA molecular weight marker III"-Skalierung (Ref. Nr.: 528552; Boehringer Mannheim) studiert.
Die Analyse der Amplifikationsprodukte erlaubt, zu zeigen, dass man unter Verwendung des Primerpaares SEQ ID Nr. 53 und SEQ ID Nr. 54 die intergenische Zone von verschiedenen Bakterien, wie Escherichia coli, Clostridium leptum, Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Serratia liquefaciens, Morganella morganii, Enterobacter cloacae, Ruminococcus hydrogenotrophicus, amplifizieren kann.
Die den intergenischen Regionen des Operons rpoB/C bei verschiedenen Spezies entsprechenden DNA-Fragmente wurden ausgehend von aus einer Agarosegel-Präparation extrahierten Banden reamplifiziert und analysiert. Diese Fragmente wurden vorab mit einem Qiagen-Extraktionskit gereinigt.
Die mit den vorerwähnten Primern durch PCR oder RT-PCR amplifizierten Regionen können natürlich in verschiedene Vektoren kloniert werden, um eingesetzt zu werden, um die Analyse zu verfeinern (insbesondere, um sie zu sequenzieren).
HYBRIDISIERUNGSPROTOKOLL
Um die Spezifität der PCR-Produkte für die für unsere Untersuchung ausgewählten Spezies zu testen, wurden Auftragungen dieser DNAs auf einer Nylonmembran vorgenommen, indem dem Natronlauge (NaOH)-Fixierungsprotokoll gefolgt wurde. Für diese Auftragungen sind die DNA-Konzentrationen auf den entsprechenden Figuren angegeben. Diese Membranen wurden hybridisiert, indem dem Protokoll des PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche), Katalog-Nr. 1636090, gefolgt wurde. Die Konzentration der eingesetzten Sonde, welche gemäß demselben Protokoll synthetisiert wurde, ist ebenfalls auf den Figuren wie auch die Temperatur der "over night" (18 h) ausgeführten Hybridisierung angegeben. Die Vorhybridisierungstemperatur beträgt 65°C für jedes Experiment und jene dauert 45 min.
Die Detektion dieser Hybridisierungsart mit dieser Markierungsart (DIG) wird als kolorimetrisch ("kalte" Markierung, unterschiedlich von radioaktiv) bezeichnet.
Die 4 bis 6 zeigen eine Detektionsspezifität abhängig von den Organismen, obgleich einige Kreuzhybridisierungsreaktionen vorhanden sein können. Diese Reaktionen können verringert werden, indem Sonden, die kürzer sind und sich unter den hypervariablen intergenischen Sequenzen, wie sie durch SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138 (rpoN) definiert werden, befinden, gewählt werden.
So wird ein DNA-Chip mit verschiedenen Sonden, die in der intergenischen Zone gelegen sind, erlauben, ohne Unschlüssigkeit das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Mikroorganismus zu erkennen, sogar in dem Falle, wo es eine Kreuzhybridisierung gibt. Tatsächlich wird sich das Vorhandensein eines Mikroorganismus von der Hybridisierung für jede der Sonden ableiten.
Es kann folglich vorteilhaft sein, DNA-Chips mit spezifischen Sonden, welche der intergenischen Region von jedem Mikroorganismus entsprechen, zu definieren, aber gleichfalls, mehrere unterschiedliche Sonden für jeden Mikroorganismus zu nehmen.
Referenzen

{1} – Welling, et al., Applied Environmental Microbiology 64:3336-45, 1998: Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotideprobes.
{2} – Greisen, et al., Journal of Clinical Microbiology, 32:335-351, 1994: Staphylococcal identifacation using PCR amplification of 16S rDNA genes.
{3} – Jensen, et al., Applied Environmental Microbiology 59:945-952, 1994: Staphylococcal identifacation using PCR amplification of spacer regions between 16S and 23S genetic loci.
{4} – Plikaytis, et al., a.a.O.; Telenti, et al., a.a.O.; PCR strategies for Mycobacterial speciation requiring the detection of restriction site polymorphisms (RFLP) within amplified products.
{5} – Zoetendal, Akkermans und De Vos, Applied Environmental Microbiology 64:3854-9 (1998): Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal sampies reveals stable and host-specific communities of active bacteria.
{6} – Vaitilinggorn, Gendre und Brignon, Applied Environmental Microbiology 64:1157-60, 1998: Direct Detaction of viable bacteria, molds, and yeast by reverse transcriptase PCR in contaminated milk samples after heat treatment.
{7} – Gendre und Brignon, Compagnie Gervais Danone, Patent Nr. PCT/FR97/01918, WO98/18958 (1998): Method for detecting live microbiological contaminants in a food product sample.
{8} – Doré, et al., Applied Environmental Microbiology, 65:4799-807,1999: Direct analysis of genes encoding 16S RNA from complex commanities reveals many novel molecular species within human gut.
{9} – Goh, Chow und Hemmingsen, U.S.-Patente 5,108,160 (1948) & 5,989,821 (1999).
{10} – Emelyanov und Sinitsyn, Russian Journal of Genetics, 35:618-627, 1999: A GroE-based phylogenetic analysis shows very close evolutionary relationship between mitochondria and rickettsia.
{11} US-Patent 5,989,821, erteilt am 23. November 1999
{12} "rpoB Gene Analysis as a Novel Strategy for Identification of Spirochetes from the General Borrelia, Trepona and Leptospira", P. Renesto et al., CNRS UPRES-A 6020, Faculté de Medecine, 27. Januar 2000.

Claims

Verfahren zur Detektion der Bestandteile, aus welchen eine bakterielle Flora besteht, bei welchen wenigstens ein Teil der Bestandteile ein gemeinsames Operon aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass: a) man die genomische DNA der Flora oder die mRNAs präpariert, b) man wenigstens einen Teil der intergenischen, nicht-kodierenden Sequenzen, die in dem bei wenigstens einem Teil der Bestandteile der Flora konservierten Operon gelegen sind, amplifiziert und c) man die unterschiedlichen amplifizierten intergenischen Sequenzen identifiziert, um die Bestandteile der Flora zu bestimmen, wobei das Operon ein rpoBC-Operon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der amplifizierten Sequenzen auf einem DNA-Chip erfolgt, welcher Sequenzen umfasst, die zu Sequenzen komplementär sind, die ausgehend von bekannten Bestandteilen der Flora amplifiziert werden können, und wobei der Nachweis von gegebenenfalls erfolgenden Hybridisierungen erlaubt, die in der Flora vorhandenen Bestandteile zu identifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer, welche dazu bestimmt sind, die intergenische Sequenz zu amplifizieren, in den die flankierenden Gene kodierenden Sequenzen gelegen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens teilweise amplifizierten intergenischen Sequenzen die transkribierte intergenische Zone zwischen den Genen rpoB und rpoC (oder homologen Genen) sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Primer unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 31 ausgewählt wird.
DNA-Chip, dadurch gekennzeichnet, dass er auf seiner Oberfläche Sequenzen aufweist, welche komplementär sind zu den intergenischen, nicht-kodierenden Sequenzen, die in einem zwischen unterschiedlichen Spezies konservierten Operon gelegen sind, wobei das Operon ein rpoBC-Operon ist.
DNA-Chip nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen von mehreren Organismen, die komplementär sind zu den intergenischen, nicht-kodierenden Sequenzen, die in dem konservierten Operon gelegen sind, auf der Oberfläche des Chips vorhanden sind.
Diagnostischer Kit für das Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er degenerierte Primer, welche die Amplifizierung von einer oder mehreren intergenischen Regionen eines zwischen den Spezies konservierten Operons erlauben, und gegebenenfalls einen DNA-Chip nach einem der Ansprüche 6 oder 7 umfasst.
Primer für das Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt wird unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 31 und SEQ ID Nr. 53 bis SEQ ID Nr. 61.
DNA-Chip nach Anspruch 6 oder 7, welcher auf seiner Oberfläche eine Mehrzahl von Oligonukleotiden, umfassend Fragmente mit einer Größe über 30 Basen, welche unter den Fragmenten mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 138 ausgewählt werden, aufweist.