DE69934847T2

DE69934847T2 - Diagnosesystem und verfahren zur bestimmung des vorhandenseins einer genotoxischen verbindung in einer probe

Info

Publication number: DE69934847T2
Application number: DE69934847T
Authority: DE
Inventors: Daniil Van Der Lelie; Agnes Luc REGNIERS; Safiyh Taghavi; Gilbert Philippe CORBISIER; Philippine Luc VERSCHAEVE
Original assignee: Vlaamse Instelling Voor Technologish Onderzoek NV VITO
Current assignee: Vlaamse Instelling Voor Technologish Onderzoek NV VITO
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-12
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2019-04-13
Also published as: DK0977896T3; AU3694499A; CA2290354C; EP0977896A1; EP0950717A1; BR9906356A; JP4272265B2; ES2281173T3; ATE351922T1; CN1227367C; PT977896E; WO1999053092A1; EP0977896B1; US6472152B1; CA2290354A1; CN1263561A; JP2002509446A; DE69934847D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnosesystem und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins einer genotoxischen Komponente in einer Probe.
Allgemeiner Stand der Technik und Stand der Technik
Die internationale Patentanmeldung WO9741251 beschreibt eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, einen Wirtsorganismus, der diese Nukleinsäuresequenz umfasst und die Verwendung dieses Wirtsorganismus zum Nachweis des Vorhandenseins genotoxischer Komponenten in einer Probe. Dieser bakterielle Genotoxizitätstest beruht auf der Biolumineszenz und ermöglicht den einfachen, sehr schnellen und kostengünstigen Nachweis genotoxischer Komponenten. Es wurde gezeigt, dass der Test zumindest so empfindlich wie der Ames-Test und der SOS-Chromotest ist und sowohl Messungen der Kinetik der Genotoxizität als auch die gleichzeitige Beurteilung der Toxizität der Testkomponente oder des Testmaterials ermöglicht (van der Lelie et al., 1997). Dieser neue Test mit der Bezeichnung VITOTOX^®-Test wurde daher als wertvoller Schnelltest auf Genotoxizität und Toxizität für viele verschiedene Zwecke erachtet.
Der Test stützt sich auf Bakterien, die das lux-Operon von Vibrio fischeri unter der Transkriptionskontrolle des recN-Gens enthalten, das Bestandteil des SOS-Systems ist. Nach Inkubation der Bakterien in Gegenwart einer genotoxischen Komponente wird der recN-Promoter dereprimiert, was die Expression des lux-Operons zur Folge hat. Diese Expression führt zur Lichterzeugung in Abhängigkeit von der Genotoxizität. Ursprünglich wurde der Test mit verschiedenen modifizierten Escherichia coli- und Salmonella typhimurium-Stämmen durchgeführt. Salmonella typhimurium-Stämme (TA98, TA100 und TA104) wurden weiter verwendet, da die Bakterien bei der Mutagenitätsprüfung bekannt sind und da dieselben Bakterien auch für einen herkömmlichen Ames-Test verwendet werden könnten, wenn diese erforderlich sein sollte. Das Konstrukt unter Verwendung einer recN-Promoter-up-Mutation (rech 2-4) ergab bei allen Stämmen die besten Ergebnisse. Da alle Salmonella-Stämme sehr vergleichbare Ergebnisse aufwiesen, wurde vorgeschlagen, weiterhin lediglich die TA104-Konstrukte [TA104 (recN2-4) genannt] zu verwenden, da festgestellt wurde, dass er manchmal etwas empfindlicher als die anderen Hybridstämme war (van der Lelie et al., 1997).
Einige Komponenten jedoch beeinflussen die Lichterzeugung unmittelbar (z.B. Aldehyde, organische Lösungsmittel) oder steigern den Bakterienstoffwechsel, was zu falsch positiven Ergebnisse führt.
Aufgaben der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Diagnosesystem und Verfahren zum Nachweis von Umweltschadstoffen, beispielsweise des Vorhandenseins einer gentoxischen Komponente in einer Probe, zu schaffen, die nicht die Nachteile nach dem Stand der Technik mit sich bringen.
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Diagnosesystem und Verfahren zu schaffen, mit denen falsch positive und falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Diagnosesystem und Verfahren bereitzustellen, die für das Screening genotoxischer Komponenten verwendet werden können, die im Bereich der chemischen, der Kosmetik- und der pharmazeutischen Industrie gewonnen werden, als Prävalidierungsuntersuchung von chemischen, kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zwischen- oder aktiven Komponenten.
Es ist eine letzte Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Diagnosesystem und Verfahren bereitzustellen, mit denen ein automatisches Screening mit einem sehr geringen Probenvolumen möglich ist.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnosesystem bestehend aus

– einem transformierten Mikroorganismus, der, wenn dieser einem Umweltschadstoff ausgesetzt ist, vorzugsweise einer genotoxischen Komponente ausgesetzt ist, zu einer angestiegenen Reporter-Aktivität befähigt ist, wobei der Mikroorganismus eine durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz hat, vorzugsweise eine Promoter-Sequenz, die durch eine genotoxische Komponente induzierbar ist, wobei die Promoter-Sequenz operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die den Reporter verschlüsselt, wobei ein Reporter-Molekül verschlüsselt wird, was in einem Signal resultiert, das analysiert werden kann, und aus
– einem transformiertem Mikroorganismus, der eine konstitutive und nicht durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz hat, vorzugsweise eine konstitutive Promoter-Sequenz, die nicht durch die genotoxische Komponente induzierbar ist, wobei die Promoter-Sequenz operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die den Reporter verschlüsselt, wobei ein Reporter-Molekül verschlüsselt wird, was in einem Signal resultiert, das analysiert werden kann.

Vorzugsweise sind beide transformierte Mikroorganismen biolumineszente Mikroorganismen und das Signal kann als Lichterzeugung analysiert werden. Weitere Möglichkeiten sind die genetischen Sequenzen der Peroxidase, der alkalischen Phosphatase, von β-gal und gus, wobei das Signal als kolorimetrische Änderung oder chemilumineszente Lichterzeugung unter Verwendung eines kolorimetrischen Analysegeräts oder einer Photomultipliervorrichtung analysiert wird.
Vorteilhafterweise besteht das erfindungsgemäße Diagnosesystem aus zwei transformierten biolumineszenten Mikroorganismen, wobei der erste biolumineszente Mikroorganismus in Gegenwart einer genotoxischen Komponente „aktiviert" wird und ein Signal zur Folge hat, das als Lichterzeugung analysiert werden kann, wohingegen die Lichterzeugung des zweiten biolumineszenten Mikroorganismus nicht durch die Gegenwart einer genotoxischen Komponente in der Probe beeinflusst wird.
Eine Nukleinsäuresequenz, die einen Reporter verschlüsselt, was in einem Signal resultiert, das als Lichterzeugung analysiert werden kann, ist bereits im Stand der Technik beschrieben worden. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transformierten biolumineszenten Mikroorganismen die Luziferasegene A und B, die auch als expressiver lux-Genkomplex bezeichnet werden, der die luxA- und luxB-Gene oder ein luxAB Übersetzungsfusionsgen umfasst. Die transformierten biolumineszenten Mikroorganismen können auch die Luziferasegene C, D und E umfassen, die für die Herstellung des begrenzenden Fettsäuresubstrates benötigt werden, das beim Aufarbeiten verwendet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Diagnosesystem einen transformierten biolumineszenten Mikroorganismus mit einer konstitutiven (richtunggebend) und nicht durch Stress induzierbaren Promoter-Sequenz mit einer Sigma 70 Konsensussequenz (TTGACA (–35) 17/18 bp TATAAT (–10)) und deren Transkription nicht positiv oder negativ auf dem Promoter- Niveau reguliert wird. Dieser Promoterkonsensus ist beschrieben in Hoopes BC and McClure WR (1987): Strategies in Regulation of Transcriptional Initiation; in "Escherichia Coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, FC Neidhart, JL Ingraham, KB Low, B Maganasik, M Schaechter, HE Umbaeger (eds.), American Society for Microbiology, Washington D.C., S. 1231-1240.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die transformierten biolumineszenten Mikroorganismen aus der Gruppe ausgewählt, die aus E. coli oder Salmonella typhimurium besteht und sind vorteilhafterweise (ein) für den Ames-Test geeignete(r) Mikroorganismen (Mikroorganismus), der bzw. die vorteilhafterweise aus der Gruppe ausgewählt ist bzw. sind, die aus TA98, TA100, TA102, TA104, TA1535, TA1538, TA7001 bis TA7006 und TA7041 bis TA7046 besteht oder die Hinterlegungsnummer für Mikroorganismen LMG P-18318 hat. Der Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer LMG P-18318 ist nachfolgend als Stamm „pr1" angegeben.
Vorteilhafterweise ist die durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz des transformierten biolumineszenten Mikroorganismus des erfindungsgemäßen Diagnosesystems aus der Gruppe ausgewählt, die aus groEL, dnaK, grpE, phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, micF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi-28, recA, xthA, narG, recF, recJ, rech, recO, recQ, ruv, uvrD, ars, cad, mer, pco und sfiA besteht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz rech, vorteilhafterweise recN2-4. Dieser Mikroorganismus ist nachfolgend als Stamm „recN2-4" angegeben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Diagnosesystem einen transformierten biolumi neszenten Mikroorganismus mit einer durch Stress induzierbaren Promoter-Sequenz, die eine SOS-Regulator-Promoter-Sequenz ist, die vorzugsweise einen Induktionsfaktor von über 40 aufweist, und vorteilhafterweise eine Mutation umfasst, die die Stärke oder Regulation des Promoters verbessert, wobei die Mutation nicht die SOS-Regulation zerstört.
Ein konkretes Beispiel für eine mutierte recN-Promoter-Sequenz ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01745 beschrieben, die nachfolgend durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Diese durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz umfasst auch eine up-Mutation des Promoters, vorzugsweise eine up-Mutation des Promoters im –35-Bereich dieses Promoters, beschrieben in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01745, die nachfolgend durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Diagnoseausrüstung, die die Bestandteile des erfindungsgemäßen Diagnosesystems umfasst und möglicherweise die notwendigen zusätzlichen Recktanten, Verdünnungsmittel und/oder festen Träger für die Diagnose umfasst, beispielsweise eine Pufferlösung, eine Lösung, die einen bestimmten Marker wie X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid) für eine Diagnose auf Basis der Verwendung einer genetischen Sequenz von β-gal umfasst, Luminol für eine Diagnose auf Basis der Verwendung einer genetischen Sequenz von Peroxidase usw.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein allgemeines Verfahren zur Diagnose eines Umweltstressfaktors oder Umweltschadstoffs, vorzugsweise zur Bestimmung der Gegenwart einer genotoxischen Komponente in einer Probe. Dieses Verfahren umfasst folgende Schritte: Aussetzen des erfindungsgemäßen Diagnosesystems dieses Umweltschadstoffs (vorzugsweise umfassend die Schritte des Einwirkens der in der Probe vorhandenen genotoxischen Komponente auf das Diagnosesystem) und Messen eines Signals, vorzugsweise einer Lumineszenzänderung des Diagnosesystems.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung der Kinetik der Genotoxizität einer Komponente in einer Probe auf der Grundlage des zuvor angegebenen Verfahrens, wobei das Messen der Lumineszenz sowohl der induzierbaren als auch der konstitutiven transformierten Mikroorganismen zu mehreren Zeitpunkten vorzugsweise stetig stattfindet, und ferner der Schritt der Bestimmung des Signal-zu-Untergrund(S/U)-Verhältnisses für die transformierten Mikroorganismen an diesem Ort und zu dieser Zeit ausgeführt wird, wobei das S/U-Verhältnis des induzierbaren Mikroorganismus durch das der konstitutiven Mikroorganismen geteilt wird, und grafisches Darstellen dieser Daten, wobei diese grafische Darstellung die korrigierte Kinetik der Genotoxizität (Genotoxidität) der genotoxischen Komponente in der Probe darstellt.
Vorteilhafterweise können das erfindungsgemäße Diagnosesystem und Verfahren wie nachfolgend beschrieben mit dem Ames-Test und/oder SOS-Chromotest und -Verfahren kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Analyseverfahren eines Umweltschadstoffs, das diese Schritte umfasst:

– Ausführung der wie zuvor beschriebenen Diagnose des Umweltschadstoffs (Beschädigung der Umgebung),
– Berechnung des Signal-zu-Untergrund-Verhältnisses beider transformierter Mikroorganismen,
– Klassifizierung des Umweltschadstoffs als toxisch, wenn wenigstens eines der berechneten Signal-zu-Untergrund-Verhältnisse niedriger als 0,8 ist,
– Klassifizierung des Umweltschadstoffs als wirkungslos, wenn das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis des Mikroorganismus, der die durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz umfasst, zwischen 0,8 und 1,2 liegt, und
– Klassifizierung des Umweltschadstoffs als induzierend und genotoxisch, wenn das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis des Mikroorganismus, der die durch Stress induzierbare Promoter-Sequenz umfasst, höher ist als 1,2 und wenigstens 50 % höher ist als das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis des Mikroorganismus, der die konstitutive Promoter-Sequenz umfasst.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren ausführlich in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen beschrieben.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis für Epichlorhydrin bei den Stämmen recN2-4 und pr1.
2 zeigt das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis für ZnCl₂ bei den Stämmen recN2-4 und pr1.
3 zeigt das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis für Natriumazid bei den Stämmen recN2-4 und pr1.
4 zeigt das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis für Nifuroxazid bei den Stämmen recN2-4 und pr1.
5 zeigt eine Übersicht zur Unterscheidung der möglichen Ergebnisse eines erfindungsgemäßen Diagnosetests.
6 zeigt eine erfindungsgemäße Einrichtung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
MATERIALIEN UND METHODEN
Ames-Test und SOS-Chromotest
Der SOS-Chromotest und der Ames-Test sind bekannte und weitverbreitete bakterielle Genotoxizitätstests (z.B. Quillardet & Hofnung, 1993; Mersch-Sundermann et al., 1994; Mortelmans et al., 1986). Der „klassische" Ames-Test wurde routinemäßig mit den Salmonella typhimurium-Stämmen TA98 und TA100 unter Verwendung des Standardprotokolls durchgeführt, das von Maron und Ames (1983) beschrieben wurde. Der SOS-Chromotest wurde als Testkit von Orgenics Ltd (Jawne, Israel) gekauft. Der Test wurde wie in den Herstellerangaben dargelegt durchgeführt.
Der VITOTOX^®-Test
Salmonella typhimurium-Stämme
Die recN-Promoterregion, die Bestandteil des recN-Gens von E. coli war (Rostas et al., 1987), enthält zwei LexA-Bindungsstellen. Eine LexA-Bindungsstelle überschneidet sich mit der –35-Region, während sich die zweite mit der –10-Region und dem Transkriptionsstartpunkt des recN-Promoters überschneidet. Der recN-Promoter von E. coli wurde vor dem luxCDABE-Operon des Expressionsvektors pMOL877 kloniert (van der Lelie et al., 1997). Dies ergab pMOL1066. Da der recN-Promoter vom SOS-System der Bakterien kontrolliert wird, wurde die Expression des lux-Operons SOS-reguliert. Dies führt in Gegenwart von Genotoxinen zur Lichterzeugung. Es wurden auch einige Abkömmlinge des recN-Promoters in pMOL877 kloniert. Ein Abkömmling ohne die LexA2-Stelle führte zu pMOL1067, einer wies eine Promoter-up-Mutation (pMOL1068) auf und einer war eine Kombination aus beiden (pMOL1069). Alle Konstrukte wurden in die Ames-Teststämme TA98, TA100 und TA104 eingebracht und konnten genotoxische Komponenten nachweisen. Da die besten Ergebnisse jedoch mit dem Stamm TA104 (pMOL1068) gewonnen wurden, wurde im so genannten VITOTOX^®-Test dieser Stamm weiter verwendet. Er wurde zuvor eingehend beschrieben und als TA104 recN2-4 bezeichnet, da er das PCR-Fragment recN2-4 enthält (van der Lelie et al., 1997). Neben TA104 recN2-4 (dem Teststamm) wird nun der so genannte Stamm TA104 pr1 als „Kontrollstamm" zugegeben. Das Plasmid pMOL1046 wurde hergestellt, indem wahllos mit EcoRI verdaute DNA-Fragmente von Alcaligenes eutrophus CH34 in den luxCDABE-Expressionsvektor (pMOL877) kloniert wurden. A. eutrophus CH34 (ATCC 43123) ist ein gramnegatives, nicht pathogenes Bodenbakterium, gewonnen aus einem Scheidebehälter einer Zinkfabrik (Mergeay et al., 1985, J. Bact) . Nach der Transformation zu E. coli 1106 (Murray et al., 1977, Mol. Gen. Genet.) wurden Klone für die Lichterzeugung ausgewählt. Anschließend wurde der beste konstitutive Licht aussendende Klon, der nach Quantifizierung in einem Luminometer die höchste Lichterzeugung lieferte, aus den verschiedenen Plasmid-Transformanten (=Plasmid pMOL1046) ausgewählt und in den S. typhimurium-Stamm TA104 eingebracht. Dieser wurde als Stamm „pr1" bezeichnet. Er enthält luxCDABE-Gene unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters, sodass die Lichterzeugung nicht von genotoxischen Komponenten beeinflusst wird. Der Stamm pr1 wird parallel zum Stamm recN2-4 verwendet und auf genau dieselbe Weise kultiviert und behandelt.
Testverfahren
1. Kulturen
Die Bakterien wurden über Nacht bei 37°C im Medium 869 in einem Rotationsschüttler inkubiert; dies ist ein übliches Nährmedium, das dem Luria-Nährmedium entspricht, dem zusätzlich CaCl₂ zugegeben wird, um ein optimales Bakterienwachstum zu ermöglichen, und ist in van der Lelie et al. beschrieben (1997, Mutation Res.). Am nächsten Morgen wurde die Bakteriensuspension 10-fach im Medium 869 verdünnt und anschließend wurden 2,5 ml Medium 869 mit 50 μl der verdünnten Lösung beimpft und eine weitere Stunde bei 37°C in einem Rotationsschüttler inkubiert (170 U/min).
2. Vorbereitung der 96-well-Mikrotiterplatten
In der Zwischenzeit wurden 96-well-Mikrotiterplatten so präpariert, dass sie 10 μl entweder des Lösungsmittels, verschiedener Konzentrationen der Testkomponente oder der positiven Kontrolle für die Genotoxizitätsprüfung mit (2-AF) oder ohne (4-NQO) S9-Mix enthielten. Der S9-Mix, hergestellt nach Maron und Ames (1983, Mutation Res.), wird für den Nachweis des Vorhandenseins von Komponenten verwendet, die erst nach Stoffwechselaktivierung genotoxisch werden. Der S9-Mix wurde vor Gebrauch frisch hergestellt. Für Tests mit dem S9-Mix wurden 140 μl der Bakterien (recN2-4 oder pr1) zu 860 μl nährstoffarmem Medium 869 und 400 μl S9-Mix zugegeben. Von diesem Gemisch wurden anschließend 90 μl zu den bereits in den Vertiefungen vorhandenen 10 μl Lösung gegeben. Für Tests ohne S9-Mix wurden 1260 μl nährstoffarmes Medium 869 zu 140 μl der Bakteriensuspension gegeben und anschließend wurden 90 μl des Gemischs in Vertiefungen überführt, die 10 μl der Testkomponente oder der Kontrollen enthielten.
3. Messungen der Genotoxizität und Toxizität
Für die Messungen der Lichterzeugung nach Einwirkung der Testkomponenten wurde ein 96-well-Mikrotiterplatten-Luminometer (Luminoscan von Berthold) verwendet. Die Lichtaussendung aus jeder der Vertiefungen wurde aller 5 Minuten über 5 Stunden gemessen (30°C, 1 s/Vertiefung, 60 Zyklen von je 300 s). Nach Beendigung der Messungen wurden die Daten in ein MS-Excel-Makroblatt übertragen und für jede Messung wurde das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis (S/U) als die Lichterzeugung belasteter Zellen geteilt durch die Lichterzeugung nicht belasteter Zellen berechnet. Eine Komponente wurde als genotoxisch angesehen, wenn S/U bei mindestens zwei Konzentrationen über 2 lag und wenn eine eindeutige Dosis-Wirkungsbeziehung beobachtet wurde. Beim zweiten Versuch, bei dem der Stamm TA104 pr1 eingebracht wurde, wurde getrennt S/U für die Stämme RecN2-4 und pr1 sowie das Verhältnis zwischen den höchsten und mittleren S/U-Werten der Stämme recN2-4 und pr1 berechnet (rec/pr1). Alle Berechnungen erfolgten zwischen 60 und 240 Minuten Inkubation. Hier gilt eine Komponente als genotoxisch, wenn S/U beim Stamm recN2-4 größer als der 1,5fache Kontrollwert des Lösungsmittels ist (und nicht „2", wie es ursprünglich erfolgte), jedoch nur, wenn dieser Anstieg nicht von einem vergleichbaren Anstieg beim Stamm pr1 begeleitet wird (dies würde auf einen nicht genotoxischen Induktionsmechanismus hinweisen). Eine Komponente ist genotoxisch, wenn das S/U-Verhältnis von Stamm recN2-4 zu Stamm pr1 gleich oder größer als 1,5 ist (Grenzwert auf Grundlage von Versuchen bestimmt). Auf diese Weise können „falsch positive" Ergebnisse vermieden werden.
„Falsch negative" Ergebnisse können ermittelt werden, wenn das S/U-Verhältnis des Stamms recN2-4 zwischen 0,8 und 1,2 bleibt, während das S/U-Verhältnis des Sensors pr1 unter 0,8 sinkt. Dies ist üblicherweise der Fall bei Proben, die gleichzeitig sowohl genotoxisch als auch toxisch sind.
Der Stamm pr1 ist des Weiteren auch sehr nützlich bei der Beurteilung der Toxizität. Bakterientoxizität wird angenommen, wenn die Lichtaussendung auf dosisabhängige Weise beträchtlich abnimmt und innerhalb der ersten 30 Testminuten S/U-Werte von unter 0,8 erreicht.
Eine Automatisierung des Systems ist unter Verwendung einer Einrichtung möglich, wie sie in 6 beschrieben ist. Ein Nachweisgerät (2), das zumindest einen Detektor für das Signal umfasst, das von einem wie zuvor beschriebenen Diagnosesystem ausgesendet wird, ist mit einem Computer (1) verbunden, der die Detektordaten gemäß dem Analyseverfahren, das zuvor beschrieben wurde und in 5 verdeutlicht ist, empfängt und verarbeitet. Auf diese Weise ist die automatisierte Probenanalyse und Klassifizierung als toxisch und/oder genotoxisch möglich.
Testkomponenten
In der vorliegenden Arbeit wurden unter Verwendung der Stämme TA104 recN2-4 und TA104 pr1 mehrere im Handel erhältliche, bekannte Komponenten erneut bewertet, die vorher mit dem Stamm TA104 recN2-4 allein bewertet wurden (siehe van der Lelie et al., 1997). Sie sind in Tabelle 1 aufgeführt.
ERGEBNISSE
Frühere Ergebnisse mit dem VITOTOX^®-Test wurden mit dem Salmonella typhimurium-Stamm TA104 RecN2-4 gewonnen (van der Lelie et al., 1997). Um den Test weiter zu verbessern, setzten wir den Stamm pr1 ein. Die Ergebnisse, die mit dem Stamm RecN2-4 gewonnen wurden, sollten im Vergleich zu den Ergebnissen beurteilt werden, die mit dem Stamm pr1 gewonnen wurden, bei dem eine stärkere Lichterzeugung nicht auf ein genotoxisches Ereignis zurückzuführen sein kann. Eine stärkere Lichterzeugung beim Stamm recN2-4 kann daher nur als Hinweis auf Genotoxizität ausgelegt werden, wenn sie nicht von einer vergleichbaren Verstärkung der Lichterzeugung beim Stamm pr1 begleitet wird.
Unter Verwendung beider Bakterienstämme haben wir mehrere der früher untersuchten Chemikalien erneut beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. In der Tabelle ist die Konzentration angegeben, bei der der S/U-Höchstwert beim Teststamm recN2-4 ≥ 2 wird, sowie die Konzentration, bei der das Verhältnis zwischen dem höchsten und mittleren S/U von recN2-4 und pr1 1,5 oder mehr ergibt (rec/pr1). In der Tabelle ist schließlich auch das Vorhandensein von Toxizität im getesteten Dosisbereich angegeben, wie sie anhand der S/U-Kurven von pr1 beurteilt wurde. Es ist zu erkennen, dass bekannte genotoxische Komponenten tatsächlich als genotoxisch beurteilt wurden, wohingegen nicht genotoxische Komponenten in den angegebenen Dosisbereichen nicht das erforderliche S/U-Verhältnis aufwiesen. Einige Beispiele für die Ergebnisse wurden in 1 bis 4 grafisch dargestellt (Beispiele für Tests ohne S9-Mix). 1 zeigt die S/U-Kurven für Epichlorhydrin bei den Stämmen recN2-4 und pr1. Beim Stamm recN2-4 wurden die S/U-Werte bei der Dosis 256 ppm (nicht dargestellt) größer als 2, wohingegen die S/U-Werte beim Stamm pr1 nicht stark von 1 abwichen. 2 zeigt die Ergebnisse für ZnCl₂, das nicht genotoxisch ist, jedoch bei Konzentrationen von über 7,4 μM (nicht dargestellt) toxisch für Salmonella typhimurium TA104 ist. Als drittes Beispiel ist in 3 Natriumazid dargestellt. Hier war das S/U-Verhältnis sowohl beim Stamm recN2-4 als auch beim Stamm pr1 erheblich größer als 2 und mit der Zeit werden Hinweise auf die Toxizität erlangt (S/U < 0,8). 4 zeigt die Ergebnisse, die für Nifuroxazid gewonnen wurden. Mit Bezug auf den Stamm recN2-4 waren geringere Dosen offensichtlich genotoxischer als höhere Dosen, jedoch zeigte der Stamm pr1 einen dosisabhängigen Rückgang der Lichterzeugung, was auf Toxizität schließen ließ.
DISKUSSION
Der VITOTOX^®-Test ist ein empfindliches und schnelles Verfahren zum Nachweis genotoxischer Komponenten (van der Lelie et al., 1997). Wenn jedoch nur der Stamm recN2-4 verwendet wird (wie es ursprünglich erfolgte), waren einige Fehldeutungen möglich. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Verwendung des Stamms pr1. Der Mehrwert des Stamms pr1 wurde an einigen Beispielen veranschaulicht. In 1 ist ein Beispiel für eine genotoxische Komponente (Epichlorhydrin) dargelegt, die im angegebenen Dosisbereich nicht toxisch war. Anhand der Ergebnisse, die mit dem Stamm recN2-4 allein gewonnen wurden, kann geschlussfolgert werden, dass die Komponente genotoxisch ist, da eine dosisabhängige Zunahme der Lichterzeugung beobachtet wurde, die den „Untergrundwert" um mehr als einen Faktor von Zwei überstieg (S/U > 2). Die Einbeziehung des Stamms pr1 bestätigte diese Beurteilung nur. Würde beim Stamm pr1 eine stärkere Lichterzeugung festgestellt werden, sollten wir tatsächlich daraus schließen, dass dies auf einen anderen Induktionsmechanismus als Genotoxizität zurückzuführen ist (z.B. stärkere Zellproliferation, die den „Rauschpegel" im Vergleich zu dem von nicht belasteten Kulturen fördern würde usw.). Dies war jedoch nicht der Fall. Es gab ebenso kein Anzeichen für Toxizität, da keine geringere Lichterzeugung vorlag. Dies war eindeutig der Fall bei ZnCl₂, wie die Kurven von 2 anzeigen. Die Figur für den Stamm recN2-4 zeigt, dass die Dosis von 3,7 μM weder genotoxisch noch toxisch ist, jedoch wird bei höheren Dosen eine geringere Lichtaussendung beobachtet, die auf eine toxische Wirkung hinweist, gefolgt von einer gewissen Erholung bei den geringeren Dosen. Dies wird durch den Stamm pr1 bestätigt, bei dem die Erholung bei Dosen von bis zu 58,8 μM ZnCl₂ (nicht dargestellt) noch deutlicher ist. Ab 117,5 μM ZnCl₂ ist keine Erholung mehr möglich. Es wurde somit gezeigt, dass ZnCl₂ nicht genotoxisch ist und nur die geringste Dosis schien frei von jeglicher Toxizität zu sein.
Wie in der Einleitung und im Abschnitt „Materialien und Methoden" dargelegt wurde, beruht der VITOTOX^®-Test im Wesentlichen auf der Erfassung eines SOS-Signals. Er sollte daher theoretisch zu Ergebnissen führen, die eher mit dem SOS-Chromotest als mit dem Ames-Test übereinstimmen. Dennoch wurden früher einige Unterschiede festgestellt. Die Erfinder haben beispielsweise von einer „positiven" Antwort für Natriumazid berichtet, obwohl diese Komponente beim SOS-Chromotest normalerweise „negativ" ergibt (van der Lelie et al., 1997). Ein Grund für diese Abweichung könnte sein, dass beim VITOTOX^®-Test der Salmonella typhimurium-Stamm TA104 vom Ames-Test verwendet wird und er daher über dieselben Eigenschaften verfügt, z.B. geringere Fähigkeit zur DNA-Reparatur und höhere Durchlässigkeit für komplexe Moleküle (wie die meisten pharmazeutischen Komponenten). Dies ist sicher in vielen Fällen eine stichhaltige Erklärung, jedoch wahrscheinlich nicht bei einem kleinen Molekül wie Natriumazid (N₃Na). Hier könnte ein anderer Grund für den Unterschied zu den Ergebnissen des SOS-Chromotests erwartet werden. Es könnte beispielsweise sein, dass die stärkere Lichterzeugung, wie sie beim Stamm recN2-4 festgestellt wurde, auf einen anderen Induktionsmechanismus als Genotoxizität zurückzuführen ist. Mit dem Einsatz des Stamms pr1 kann diese Vermutung überprüft werden. Wie in 3 ersichtlich ist, ist die beobachtete Lichterzeugung beim Stamm recN2-4 nicht auf Genotoxizität zurückzuführen, da auch beim Stamm pr1 eine verstärkte Lichtaussendung beobachtet wird und dies nicht auf eine SOS-Antwort zurückzuführen sein kann. Natriumazid sollte daher bei unserem Test als nicht genotoxisch angesehen werden. Es ist ein gutes Beispiel für eine „Komponente", die „falsch positiv" wäre, wenn nur der Stamm recN2-4 verwendet werden würde.
Die Erfinder haben viele weitere pharmazeutische Komponenten mit den anderen Bakterientests getestet und verglichen. Die Ergebnisse, die mit den verschiedenen Tests erhalten wurden, stimmten meist vollständig miteinander überein. Der VITOTOX^®-Test ist gewöhnlich auch viel empfindlicher als der Ames- oder der SOS-Chromotest, da die minimal nachweisbaren Konzentrationen beim VITOTOX^®-Test 1- bis 100-mal niedriger sind.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung des Stamms pr1 besteht darin, dass neben der Genotoxizität die Toxizität besser beurteilt werden kann als mit dem Stamm recN2-4 allein. Eine genotoxische Komponente, die bei Dosisbereichen um die Toxizitätsschwelle herum untersucht wird, kann beim Stamm recN2-4 zu S/U-Verhältnissen führen, die „zwischen" Genotoxizität und Toxizität liegen, da die stärkere Lichterzeugung (aufgrund der Genotoxizität) mit einem Rückgang (aufgrund der Toxizität) konkurriert, was zu einem S/U von ≅1 führt. Die Komponente würde daher als weder genotoxisch noch toxisch ausgelegt werden (falsch negatives Ergebnis). Der Stamm pr1 zeigt eindeutig einen Rückgang der Lichtaussendung, was darauf hinweist, dass die Komponente bei der angegebenen Dosis bereits toxisch ist. Dies ist zumindest für einige Dosen in 4 dargestellt, bei der Nifuroxazid als Beispiel verwendet wurde. Es kann festgestellt werden, dass die geringeren Dosen aufgrund der dosisabhän gigen Toxizität die stärkste genotoxische Antwort ergaben. Die S/U-Kurven für den Stamm pr1 zeigen deutlich, dass nur die geringsten Dosen von bis zu 0,16 ppm nicht toxisch waren. Höhere Dosen können Toxizität verbunden mit Genotoxizität aufweisen (z.B. 0,32 ppm) oder können zu toxisch sein, um Genotoxizität aufzuweisen (höchste Dosen).
Es wurde festgestellt, dass sowohl der Stamm recN2-4 als auch der Stamm pr1 toxische Konzentrationen einer Komponente nachweisen konnten. Der Stamm pr1 ist jedoch nützlicher bei der Toxizitätsprüfung, da die S/U-Kurven nicht von Genotoxizität beeinflusst werden können und somit nur die Toxizität (oder ihr Fehlen) anzeigen. Der Stamm pr1 stellt offensichtlich ein perfektes Hilfsmittel für diejenigen dar, die lediglich an der Beurteilung der Toxizität interessiert sind. Wir vergleichen derzeit die Beurteilung der Toxizität von Chemikalien und komplexen Gemischen mit dem Stamm pr1 und mit dem Microtox^®-Test. Letzterer ist einer der am häufigsten verwendeten und international akzeptierten Toxizitätstests mit Mikroorganismen, der ebenfalls auf Biolumineszenz beruht (Hasting, 1978; Férard et al., 1983). Gemäß der begrenzten Daten, die uns bereits zur Verfügung stehen, liefert der VITOTOX^®-Test dieselben Ergebnisse wie der Microtox^®-Test, jedoch ist der erstgenannte leichter durchzuführen und häufig viel empfindlicher. Der VITOTOX^®-Test, oder lediglich sein Bestandteil pr1, kann daher, zumindest wenn diese vorläufigen Ergebnisse bestätigt werden können, als ein äußerst wertvoller Toxizitätstest erachtet werden.
Zusammenfassend kann betont werden, dass die Salmonella typhimurium-Stämme TA104 recN2-4 und TA104 pr1 sehr nützliche Genotoxizitäts- und/oder Toxizitätstestsysteme bereitstellen. Für die Genotoxizitätsprüfung sollten beide Stämme gleichzeitig verwendet werden, während der Stamm pr1 lediglich für die Toxizitätsprüfung erforderlich ist. Es wurde gezeigt, dass der VITOTOX^®-Test eine sehr schnelle (innerhalb von 2 bis 4 Stunden) und sehr empfindliche Antwort hinsichtlich der (Geno)Toxizität von Chemikalien liefert und dass er aus diesem Grund sehr nützlich sein kann für das Screening und Prescreening neuer Chemikalien und Zwischenprodukte. Da der Test in 96-well-Mikrotiterplatten durchgeführt wird, ist es mindestens möglich, 8 Chemikalien (mit und ohne Zugabe der Stoffwechselenzymfraktion S9) täglich oder 40 Chemikalien pro Woche zu untersuchen. Die Messungen finden automatisch statt und die Datenerfassung und Datenverwaltung können des Weiteren ebenso beinahe vollständig automatisiert werden. Durch die Mikrotiterplatten-Vollautomatisierung sollte dieses Verhältnis mit dem Faktor 10 multipliziert werden können. Eine Steigerung z.B. durch Erhöhung der Anzahl der Vertiefungen je Platte ist nahe liegend. Die Arbeitskosten werden deshalb maximal gesenkt.
Ein zusätzlicher und sehr wichtiger Vorteil ist schließlich, dass lediglich sehr geringe Volumina der Testkomponente erforderlich sind (unter 20 mg). Dies ist besonders wichtig in der pharmazeutischen Industrie, wo in der Forschungsphase lediglich ein paar hundert Milligramm einer Komponente zur Verfügung stehen. Es ist mit (den meisten) anderen Testsystemen unmöglich, derartige neue Chemikalien zu überprüfen.
Der Stamm „pr1" wurde mit der Hinterlegungsnummer LMG P-18318 gemäß dem Budapester Vertrag am BCCM/LMG, Laboratorium voor Microbiologie – Bacterienverzameling, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgien hinterlegt.

Claims

Diagnosesystem bestehend aus: – transformiertem Mikroorganismus, der, wenn dieser einer Beschädigung der Umgebung ausgesetzt ist, zu einer angestiegenen Reporter-Aktivität befähigt ist, wobei der Mikroorganismus eine unter Druck induzierbare Promoter-Sequenz hat, die operativ mit einem Reporter verknüpft ist, der die Nuklidsäuresequenz entschlüsselt, wobei ein Reporter-Molekül entschlüsselt wird, was in einem Signal resultiert, das analysiert werden kann, und – transformiertem Mikroorganismus, der eine richtunggebende und nicht durch Druck induzierbar Promoter-Sequenz hat, die operativ mit einem Reporter verknüpft ist, der die Nukleidsäuresequenz entschlüsselt, wobei ein Reporter-Molekül entschlüsselt wird, was in einem Signal resultiert, das analysiert werden kann, der Mikroorganismus ist geeignet, unter Eliminierung falscher positiver und falscher negativer Ergebnisse, die Beschädigung der Umgebung zusammenwirkend nachzuweisen.
System gemäß Anspruch 1, wobei das Signal als Lichterzeugung und/oder kalorimetrischer Änderung analysiert wird.
System gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der transformierte bioluminiszente Mikroorganismus eine E. Coli-Bakterie ist.
System gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der transformierte bioluminiszente Mikroorganismus eine Salmonella thyphimurium – Bakterie ist, ein bestens für den Ames-Test geeigneter Mikroorganismus, der vorteilhafterweise aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus TA98, TA100, TA102, TA104, TA1535, TA1538, TA7001 bis TA7006 und TA7041 bis TA7046 besteht oder die die Hinterlegungsnummer für Mikroorganismen LMG P-18318 hat.
System gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 4, wobei die durch Druck induzierbare Promoter-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus groEL, dnaK, grpE, phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, micF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi-28, recA, xthA, narG, recF, recJ, rech, recO, recQ, ruv, uvrD, ars, cad, mer, pco und sfiA besteht.
System gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 5, wobei die richtunggebende und nicht durch Druck induzierbare Promoter-Sequenz eine Sequenz mit einer Sigma 70 Konsenssequenz (TTGACA (–35) 17/18 bp TATAAT (–10)) ist und deren Umschrift nicht positiv oder negativ auf dem Promoter-Niveau reguliert wird.
System gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 6, wobei der Reporter, der die Nukleidsäuresequenz entschlüsselt, die Luziferasegene A und B oder ein luxAB Übersetzungsfusionsgen umfasst.
System gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 7, wobei der Reporter, der die Nukleidsäuresequenz entschlüsselt, die Luziferasegene A und B sowie die Luziferasegene C, D und E umfasst, die zur Herstellung des begrenzenden Fettsäuresubstrates benötigt werden, das beim Aufarbeiten verwandt wird.
System gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 8, wobei die Beschädigung der Umgebung die Gegenwart einer genotoxischen und/oder toxischen Komponente in einer Probe ist.
Diagnoseausrüstung, die die Bestandteile des Diagnosesystems umfasst, gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9 und möglicherweise die notwendigen zusätzlichen Recktanten, Verdünnungsmittel und/oder festen Träger umfasst.
Verfahren zur Diagnose einer Beschädigung der Umgebung, vorzugsweise zur Bestimmung der Gegenwart einer genotoxischen und/oder einer toxischen Komponente in einer Probe, das diese Schritte umfasst: – Aussetzen des Diagnosesystems dieser Beschädigung der Umgebung gemäß irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 8, und – Messen des Diagnosesystems eines Signals vom transformierten bioluminiszenten Mikroorganismus.
Verfahren zur Bestimmung der Kinetik der Genotoxidität einer Komponent in einer Probe mittels eines diagnosesystems irgeneiner der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Messen von Luminiszenz beider induzierbarer und richtunggebender transformierter Mikroorganismen zu multiplen Zeitpunkten vorzugsweise stetig stattfindet, und ferner der Schritt der Bestimmung des Signal-zu-Untergrund(S/U)-Verhältnisses für den transformierten Mikroorganismus an diesem Ort und zu dieser Zeit ausführt wird, wobei das S/U-Verhältnis des induzierbaren Mikroorganismus durch das der richtunggebenden Mikroorganismen geteilt wird, und Ausdrucken dieser Daten, wobei dieser Ausdruck die korrigierte Kinetik der Genotoxidität der genotoxischen Komponente in der Probe darstellt.
Analyseverfahren einer Beschädigung der Umgebung, das diese Schritte umfasst: – Ausführung der wie in Anspruch 11 beschriebenen Diagnose der Beschädigung der Umgebung, – Berechnung des Signal-zu-Untergrund-Verhältnisses beider transformierter Mikroorganismen, – Klassifizierung der Beschädigung der Umgebung als toxisch, wenn wenigstens eines der berechneten Signal-zu-Untergrund-Verhältnisse niedriger als 0,8 ist, – Klassifizierung der Beschädigung der Umgebung als hätte es keine Wirkung, wenn das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis des Mikroorganismus, das die durch Druck induzierbare Promoter-Sequenz umfasst, zwischen 0,8 und 1,2 liegt, und – Klassifizierung der Beschädigung der Umgebung als induzierend und genotoxisch, wenn das Signal zu-Untergrund-Verhältnis des Mikroorganismus, das die durch Druck induzierbare Promoter-Sequenz umfasst, höher ist als 1,2 und wenigstens 50 höher ist als das Signal-zu-Untergrund-Verhältnis des Mikroorganismus, der die richtunggebende Promoter-Sequenz umfasst.