DE69023544T2

DE69023544T2 - Teicoresistenz verleihende Sequenz.

Info

Publication number: DE69023544T2
Application number: DE69023544T
Authority: DE
Inventors: Maurizio Denaro; Rolando Lorenzetti; Mariacristina Anna Moroni; Margherita Amalia Sosio
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-05-14
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2010-05-15
Also published as: IE901837L; IE71221B1; GR3018489T3; JPH0319688A; EP0399328B1; DK0399328T3; KR900018381A; ES2079394T3; CA2017234A1; DE69023544D1; ATE130367T1; EP0399328A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues DNA-Fragment oder ein Subfragment davon, das nach Transfektion in einen geeigneten mikrobiellen Wirt mittels eines geeigneten Vektors eine Resistenz gegen ein Dalbaheptid- Antibiotikum verleihen kann.
Dalbaheptid-Antibiotika sind eine Klasse antibakterieller Mittel, die manchmal als Glycopeptid-Antibiotika definiert werden und hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam sind. Sie umfassen eine zunehmende Zahl von Mitteln, wie z.B. Vancomycin (US-Patent 5067099), Ristocetin (US- Patent 4085964), Avoparcin (US-Patente 3338786 und 4522545), Teicoplanin (US- Patente 4259751 und 4542018), Actaplanin (US-Patente 5816618 und 4537715), AAD-216 oder Ardacin (US-Patent 4543974), AM 374 (US-Patent 5805306), A 477 (US-Patent 5928571), A 40926 (EP-A 177882), A 41030 (US-Patent 4537770), AAD-609 (EP-A 218416) und A 33512 B (US-Patent 4029769).
Der Begriff Dalbaheptid-Antibiotikum soll in der vorliegenden Beschreibung durchweg Glycopeptid-Antibiotikum bedeuten. Vom strukturellen Gesichtspunkt sind diese Antibiotika durch das Vorhandensein einer Heptapeptid-Kernstruktur mit sieben Aminosäuren gekennzeichnet, wobei fünf Aminosäuren immer Aryl- oder Arylmethylaminosäuren sind. Diese Struktur ist der ausschlaggebende Faktor für einen gemeinsamen Wirkungsmechanismus, d.h. die spezifische Komplexbildung mit dem D-Alanyl- D-alanin-Terminus eines oder mehrer Zwischenprodukte der Zellwandsynthese. Die Aryl- oder Arylmethylanteile tragen in den meisten Fällen mehrere Zuckereinheiten, die durch O-Glycosidbindungen gebunden sind. Häufig sind diese Zucker für ein bestimmtes Dalbaheptid typisch (vgl. F. Parenti and B. Cavalleri: "Proposal to name the vancomycin-ristocetin like glycopeptides as dalbaheptides", The Journal of Antibiotics, Bd 42 Nr. 12 (Dezember 1989), S. 1882-1883).
Der gemeinsame "Wirkungsmechanismus" von Dalbaheptiden umfaßt ihre Bindung an den UDP-N-acetylmuramylpentapeptid-Präkursor der wachsenden Bakterienzellwand, wodurch die Peptidoaglykon-Polymerisierung negativ beeinflußt wird. Wie andere Zellwandinhibitoren besitzen Dalbaheptid- Antibiotika nur gegen aktiv wachsende Pathogene bakterizide Wirkung.
Diese Antibiotikaklasse umfaßt auch Derivate der vorstehend erwähnten Stoffe, die durch selektive teilweise Hydrolyse oder andere chemische Modifizierungsverfahren erhalten werden. Teicoplan in-Aglycon und Pseudoaglycone sind beispielsweise von A. Malabarba et al. in J. Antibiotics, 37 (1984), 988, 39 (1986), 1430, und in der EP-A 301247 beschrieben. Carboxyester- Derivate von Teicoplanin-Verbindungen sind von A. Malabara et al., in J. Antib., 40 (1987), 1572, beschrieben, während Carboxamide in EP-A 218099, WO88/06600 oder in EP-A 352538 bzw. EP-A 89122874.4 beschrieben sind.
Alle Antibiotika, die die vorstehend angegebene Bedeutung haben, sind ebenso wie ihre Derivate in der vorliegenden Anmeldung als "Dalbapeptid- Antibiotika" bezeichnet. Diese Definition umfaßt selbstverständlich die Stoffe, die künftig zu dieser expandierenden Klasse antimikrobieller Stoffe hinzukommen und die die gleichen, vorstehend erwähnten Eigenschaften besitzen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika verleihen kann, wenn sie zur Transformation eines sensitiven Wirts mit Hilfe eines geeigneten Vektors verwendet wird.
Wie erwähnt, ist die durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz verliehene Resistenz nicht für ein einziges Antibiotikum spezifisch, sondern ist gegen jedes beliebige Dalbaheptid-Antibiotikum gerichtet, wenn auch möglicherweise mit einem unterschiedlichen Wirkungsgrad. Selbst wenn ein Mechanismus für eine solche Resistenz bisher noch nicht bewiesen worden ist, werden nachstehend einige Experimente vorgestellt, die zeigen, wie in einem transformierten Wirt die durch die erfindungsgemäße Sequenz verliehene Resistenzwirkung möglicherweise zum Ausdruck kommt.
Die vorliegende Offenbarung soll jedenfalls nicht auf einen Wirkungsmechanismus oder eine diesbezügliche Theorie beschränkt sein.
Aus praktischen Gründen wird eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz mit der vorstehend angegebenen Bedeutung als "Teico-R verleihende Sequenz " bezeichnet.
Ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer "Teico-R verleihenden Sequenz", deren Ursprung ein Mikroorganismus ist, der ein Dalbaheptid-Antibiotikum produziert.
Ein Beispiel für eine solche Teico-R verleihende Sequenz ist eine Sequenz, die in einem 2614 bp großen Bam HI-Fragment enthalten ist, das als DNA- Restriktionsfragment aus dem Genom von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 erhalten werden kann.
Obwohl dieses Fragment aus dem Genom eines Mikroorganismus stammt, der ein bestimmtes Dalbaheptid-Antibiotikum produziert (nämlich Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, der Teicoplanin erzeugt), kann es auch Resistenz gegen andere Dalbaheptid-Antibiotika verleihen.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment ist daher ein 2614 bp großes DNA- Fragment, welches erhalten werden kann durch BamHI-Behandlung des Genoms von A. teichomyceticus ATCC 31121, einer dieses Fragment enthaltenden DNA-Sequenz, einem Subfragment davon oder einer DNA- Sequenz, die unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen in hohem Maße mit dem vorstehenden BamHI-Fragment oder einer davon abstammenden Sonde hybridisiert, und welches nach Transfektion in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Dalbaheptid-Antibiotikum verleihen kann.
Daher umfaßt die vorliegende Erfindung auch DNA-Sequenzen, die unter hohen Stringenzbedingungen mit dem vorstehend erwähnten Restriktionsfragment oder einem Subfragment davon hybridisieren und nach Transformation eines sensitiven Wirts die Fähigkeit beibehalten, Resistenz gegen ein Dalbaheptid-Antibiotikum zu verleihen.
Die vorliegende Definition einer Teico-R verleihenden Sequenz umfaßt alle vorstehend erwähnten DNA-Sequenzen. Eine Teico-R verleihende Sequenz umfaßt daher:
a) ein DNA-Fragment mit 2614 bp, das erhalten werden kann durch BAMHI-Behandlung des Genoms von A. teichomyceticus ATCC 31121 einem Subfragment davon oder einer dieses enthaltenden DNA- Sequenz, die nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Dalbaheptid-Antibiotikum verleihen kann;
b) eine Nucleinsäuresequenz, die nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Dalbaheptid- Antibiotikum verleihen kann und mit einem vorstehend unter a) erwähnten DNA-Fragment hybridisieren kann;
c) Teile von DNA-Insertionen, die mit den unter a) erwähnten Fragmenten hybridisieren und nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Dalbaheptid- Antibiotikum verleihen können;
d) DNA-Sequenzen, die als Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes zu DNA-Sequenzen gemäß der Definition unter a) oder b) degeneriert sind und fähig sind, nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Dalbaheptid- Antibiotikum zu verleihen.
Eine Teico-R verleihende Sequenz kann zur Konstruktion eines Vektors verwendet werden, der nach Transformation eines sensitiven mikrobiellen Wirts die Teico-R vermittelte Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika verleiht.
Die folgenden Definitionen betreffen Ausdrücke, die auf dem Fachgebiet allgemein verstanden und verwendet werden, aus praktischen Gründen jedoch in der vorliegenden Erfindung aufgeführt werden:
Ein "rekombinanter DNA-Clonierungsvektor" oder "Vektor" (Kurzbezeichnung) ist ein beliebiges, sich autonom replizierendes oder integrierendes Vehikel, das Plasmide, Cosmide, Phagen usw. umfaßt, aber nicht darauf beschränkt ist.
Ein "Restriktionsfragment" ist eine beliebige lineare DNA-Sequenz, die durch Spaltung einer DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzym(en) erhalten wird.
Eine "Nucleinsäuresequenz" ist eine beliebig lange Polynucleotidsequenz natürlichen, synthetischen oder gemischten Ursprungs, die entweder aus DNA oder RNA besteht. Diese Definition umfaßt daher ausdrücklich eine cDNA.
Eine "sensitive Wirtszelle" oder ein "sensitiver mikrobieller Wirt" ist eine Wirtszelle, die in Gegenwart eines bestimmten Antibiotikums nicht wachsen kann, falls sie nicht mit einer Resistenz verleihenden Sequenz transformiert ist.
Eine "Transformante" ist eine Rezipienten-Wirtszelle, die einer Transformation unterzogen wurde, während "Transformation" die Einführung von DNA in eine Rezipienten-Wirtszelle bedeutet, die den Genotyp verändert und zu einer Anderung der Rezipientenzelle führt.
Die "Wirtszelle" kann ein beliebiger bekannter prokaryontischer oder eukaryontischer Mikroorganismus sein, für den ein transformierender Vektor bekannt ist oder aufgrund der Kenntnisse auf dem Fachgebiet konstruiert werden kann. Sie umfaßt daher Säuger-, Vogel-, Amphibien- und Hefezellen sowie Zellen bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs. Eine bevorzugte Wirtsgruppe stellen bakterielle Stämme dar, die zur Ordnung Actinomycetales und zu den Gattungen Streptomyces, Actinoplanes, Amycolatopsis, Nocardia, Actinomadura oder Kibdelosporangium gehören.
Eine der am meisten bevorzugten Gruppen mikrobieller Wirte stellen die Mikroorganismen dar, die beliebige Dalbaheptid-Antibiotika produzieren, wie z.B. die Mikroorganismen, die die vorstehend erwähnten Dalbaheptid- Antibiotika produzieren.
Mit dem Begriff "Hybridisierung" ist die Hybridisierung von Nucleinsäuren gemeint, d.h. das Verfahren, bei dem zwei einzelsträngige Polynucleotide ein doppelsträngiges Molekül mit Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen in den zwei Strängen bilden. Eine Hybridisierung kann zwischen komplementären Strängen stattfinden, die sowohl aus DNA als auch RNA bestehen, wobei doppelsträngige DNA-, doppelsträngige RNA- oder doppelsträngige DNA-RNA-Hybridmoleküle erzeugt werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen durch Hybridisierung mit markierten DNA- oder RNA-Sonden. Die Hybridisierungsbedingungen werden manchmal als Bedingungen "niedriger", "hoher" oder "mittlerer" Stringenz charakterisiert, je nach Konzentration der eingesetzten gepufferten Kochsalzlösung, die im allgemeinen eine Natriumchlorid/Natriumcitrat-Lösung darstellt (üblicherweise als SSC bezeichnet).
"Mittlere bis niedrige Stringenz" bezieht sich insbesondere auf Konzentrationen dieser Lösung im Bereich von 1 x SSC (d.h. auf eine Lösung von 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriumcitrat) oder mehr, während "hohe Stringenz" sich auf Konzentrationen im Bereich von etwa 0,1 - 0,5 x SSC bezieht, wobei zumindest in einigen Fällen etwa 0,2 x SSC (d.h. 0,03 M Natriumchlorid und 0,003 M Natriumcitrat) bevorzugt sind.
Eine erfindungsgemäße Teico-R verleihende Sequenz kann dazu verwendet werden, nach Transformation eines sensitiven mikrobiellen Wirts mit einem geeigneten, Teico-R enthaltenden Vektor eine selektierbare Resistenz gegen ein Dalbaheptid-Antibiotikum zu verleihen. Bin Plasmidvektor für Streptomyces lividans (wie z.B. der Vektor, der im Stamm S. lividans, John Innes-Sammlung Nr. 3131, enthalten ist), der einen Selektionsmarker wie beispielsweise das Thiostrepton-Resistenzgen trägt, kann z.B. zur Insertion einer Teico-R verleihenden Sequenz in eine geeignete Restriktionsstelle verwendet werden, wobei ein Plasmid mit zwei Resistenz-Markern erhalten wird: Thiostreptonresistenz (thioR) und Resistenz gegen Teicoplanin oder ein anderes Dalbaheptid-Antibiotikum (teicoR). Das neue Plasmid kann danach durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym linearisiert werden, das mindestens eine Erkennungsstelle im Teicoplanin-Resistenzgen (Teico-R) besitzt, so daß der Replikationsstartpunkt und die Resistenz gegen Thiostreptin unverändert bleiben. Dies ermöglicht die Insertion einer Fremd-DNA, die die Teico-R vermittelte Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika zerstört, wodurch die mit dem chimären Plasmid transformierten Organismen gleichzeitig auf Sensitivität gegen ein Dalbaheptid-Antibiotikum, wie z.B. Teicoplanin, und Resistenz gegen den anderen Marker (z.B. Thiostrepton) selektiert werden können. Wenn die Teico-R verieihende Sequenz ein vorstehend beschriebenes Bam HI-Restriktionsfragment ist, stellt die SstI-Restriktionsstelle eine interne Restriktionsstelle dar, die in diesem Fall vorteilhafterweise verwendet werden kann (vgl. Figur 1).
Entsprechend einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann eine Teico-R codierende Sequenz über einen geeigneten Vektor in einen A. teichomyceticus-Stamm oder einen anderen Dalbaheptid-Antibiotika produzierenden Stamm eingeführt werden, wie z.B. einen Stamm, der eines der vorstehend aufgezählten Antibiotika produziert. Die Transformation eines Antibiotika produzierenden Stamms kann die Ausbeuten der Antibiotikaproduktion verbessern, indem dem Stamm Resistenz gegen sein antimikrobielles Frodukt verliehen wird oder, was wahrscheinlicher ist, indem das Ausmaß der Resistenz erhöht wird. In vielen Fällen ist die Effizienz eines mikrobiologischen Verfahrens zur Produktion eines Antibiotikums tatsächlich durch die Sensitivität des das Antibiotikum produzierenden Stamms gegen hohe Konzentrationen seines eigenen Produkts beschränkt (vgl. K. Katagiri, J. Antibiotics. 7 (1954), 45-52). Das ist insbesondere der Fall, wenn der Resistenzmechanismus keine enzymvermittelte Inaktivierung des Antibiotikums umfaßt. Für die Teico-R vermittelte Resistenz scheint das zuzutreffen.
Antibiotika produzierende Niikroorganismen haben vielfältige Mechanismen der Resistenz gegen ihre eigenen Produkte entwickelt; viele dieser Mechanismen sind untersucht und vollständig charakterisiert worden (vgl. z.B. E. Cundliffe, Brit. Med. Bull., 40 (1984), 61-67). Für Dalbaheptid- Antibiotika produzierende Stämme sind jedoch bisher noch keine spezifischen Resistenzmechanismen beschrieben worden. Immer mehr klinische Isolate treten auf, die gegen diese Antibiotika resistent sind (K. L. Rouff, Clin. Microbiol. Newslett., 11 (1989), 1-4). Eine übertragbare Resistenz ist bereits beschrieben worden (D. M. Shlaes et al., Antimicrob. Agents Chemother., 33 (1989), 198-203, und R. Leclercq et al., Antimicrob. Agents Chemother., 33 (1989), 10-15), obwohl ihr Wirkungsmechanismus bisher noch nicht aufgeklärt worden ist. Da sich der Angriffspunkt der Antibiotika auf der bakteriellen Zellwand befindet, halten einige Autoren Resistenz durch einen Ausschlußmechanismus für "schwer vorstellbar" (vgl. R. Leclercq et al., Antimicrob. Agents Chemother., 33 (1989), 10-15, und D. Greenwood, J. Antimicrob. Chemother 21 Ergänzungsband A (1988), 1-13).
Eine erfindungsgemäße Teico-R verleihende Sequenz, wie z.B. das vorstehend erwähnte Bam HI-Restriktionsfragment oder ein Subfragment davon, kann weiterhin als Sonde verwendet werden, um unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen die entsprechenden Genombereiche aus Dalbaheptid-Antibiotika produzierenden Stämmen zu isolieren, die nicht Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 sind.
Wenn diese DNA-Sequenzen einmal isoliert sind, können sie zur Transformation eines sensitiven mikrobiellen Wirts verwendet werden, um diesem Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika zu verleihen. Dem Fachmann ist klar, daß die vorliegende Definition für Teico-R verleihende Sequenzen auch diese DNA-Sequenzen wegen ihrer Eigenschaften umfaßt. Eine Genbank eines Dalbaheptid-Antibiotika produzierenden Stamms mit vorstehend angegebener Bedeutung kann beispielsweise so hergestellt werden, wie per se auf dem Fachgebiet bekannt ist. Unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Teico-R verleihenden Sequenz kann die Genbank nach jedem geeigneten Verfahren untersucht werden, wie z.B. Southern-Blot-, Dot-Blot-Verfahren oder anderen geeigneten Verfahren. Alle Clone, die mit der Sonde unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen (z.B. 1 x SSC oder mehr) hybridisieren, können auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, einem sensitiven Wirt Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika zu verleihen. Die in positiven Clonen vorhandene DNA-Insertion, die Resistenz gegen Dalbaheptid- Antibiotika verleiht, kann dann so verwendet werden, wie für Teico-R verleihende Sequenzen beschrieben. Die Definition für Teico-R verleihende Sequenzen umfaßt daher auch diese DNA-lnsertion.
Eine weitere Anwendung einer erfindungsgemäßen Sequenz stellt deren Vervendung als Sonde zum Nachweis ähnlicher DNA-Sequenzen in klinischen Isolaten unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen dar. Ein positives Ergebnis dieses Tests könnte darauf hinweisen, daß diese Resistenzart in den Isolaten vorhanden ist, was auf die Möglichkeit hindeutet, daß die getesteten Stämme einen Teico-R-Resistenztyp gegen diese Antibiotikaklasse entwickeln können oder bereits entwickelt haben.
Eine erfindungsgemäße Teico-R verleihende Sequenz kann hergestellt werden, indem man einen DNA-Extrakt von A. teichomyceticus ATCC 31121 mit einem spezifischen Restriktionsenzym (z.B. Bam HI) teilweise spaltet, dann mit einem bekannten Vektor für eine bestimmte Wirtszelle ligiert, die natürlicherweise gegen Dalbaheptid-Antibiotika sensitiv ist, die transformierten Zellen, die Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika erworben haben, selektiert und die für die erworbene Resistenz verantwortliche DNA- Sequenz isoliert. Die einzelnen Verfahrensschritte werden nach Verfahren durchgeführt, die per se auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die Verfahren müssen in der vorliegenden Erfindung nicht genauer diskutiert werden, da sie vom Fachmann aufgrund der in der vorliegenden Offenbarung enthaltenen Information ohne weiteres wiederholt werden können.
Andere Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Teico-R verleihenden Sequenz sind dem Fachmann auch angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt. Sie umfassen die Verwendung einer Sequenz, wie z.B. des vorstehend erwähnten Bam HI-Fragments von A. teichomyceticus oder eines Subfragments davon, wie des inneren SstI-KpnI-Fragments, zur Isolierung von DNA-Fragmenten, die mit der Sequenz unter mittleren bis niedrigen (oder hohen) Stringenzbedingungen hybridisieren und die Fähigkeit zur Verleihung von Teico-R besitzen. Gegebenenfalls können nach Sequenzierung einer Teico-R-verleihenden Sequenz oder eines Teils davon auch synthetische Sonden mit Hilfe herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Weitere Verfahren zur Herstellung einer Teico-R verleihenden Sequenz umfassen das Umschreiben einer RNA-Sequenz in eine cDNA, die entsprechend den üblichen Transformationsverfahren oder ähnlich bekannten Verfahren zur Übertragung der Teico-R-vermittelten Resistenz verwendet wird.
Dadurch, daß man bei Wirten, die mit einer erfindungsgemäßen Teico-R verleihenden Sequenz transformiert wurden, die Sensitivität gegen verschiedene Antibiotika auswertet und mit der Sensitivität nichttransformierter Wirte vergleicht, läßt sich feststellen, daß die Transformanten eine Kreuzresistenz gegen andere Dalbaheptid-Antibiotika zeigen. Gegen andere Antibiotika besitzen sie jedoch im wesentlichen das gleiche Sensitivitätsniveau. Nach den üblichen Verfahren können diese Experimente sowohl in flüssigen als auch auffesten Wachstumsmedien durchgeführt werden.
Mit Hilfe herkömmlicher Verfahren, wie z.B. durch HPLC-Analyse, läßt sich außerdem beweisen, daß die Wirte, die mit einer erfindungsgemäßen Teico-R verleihenden Sequenz transformiert sind, ein Dalbaheptid-Antibiotikum chemisch nicht modifizieren, zumindest nicht nachweisbar, wenn sie diesem ausgesetzt sind.
Mit Hilfe von Bindungsuntersuchungen von Dalbaheptid-Antibiotika an Transformanten unter den üblichen Bindungsbedingungen können Daten erhalten werden, die eine verringerte Bindung der Zielantibiotika durch unbeschädigte Zellen zeigen.

Kurze Beschreibung der Figuren

In Figur 1 der zugehörigen Zeichnungen ist die Restriktionskarte des 2614 bp großen Bam HI-Fragments der genomischen DNA von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 dargestellt.
Sie zeigt eine Insertion, die an ihren Enden zwei XhoI-Restriktionsstellen enthält, die durch die Verbindung überhähgender Bgl II- und Bam HI-Enden entstanden sind. In der graphischen Darstellung der Restriktionskarte sind nur die relevanten Restriktionsstellen gezeigt.
Die schwarz markierte Linie zwischen den internen Sst I- und Kpn I- Erkennungsstellen zeigt das als Sonde zur Southern-Hybridisierung verwendete Fragment (vgl. Beispiel 2).

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und der Art und Weise, wie diese genutzt werden kann, sollen aber den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.
Viele molekularbiologische Methoden und Protokolle, die in den folgenden Abschnitten erwähnt werden oder auf die Bezug genommen wird, sind per se auf dem Fachgebiet bekannt und stellen einen Teil des Hintergrundwissens eines Fachmanns dar. Sie sind in vielen Nachschlagewerken und Handbüchern dargelegt, wie z.B. in D. A. Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, a Laboratory Manual, (1985) The John Innes Foundation, Norwich, Großbritannien; T. Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (1982) C. S. H. Laboratory, Cold Spring Harbour, N. Y., und Current Protocols in Molecular Biology, (1987) Greene Publishing Associates and Wiley- Interscience, N. Y.
Zur Vermeidung langer Wiederholungen, die für den Fachmann langweilig, zeitraubend und überflüssig sind, werden sowohl hinsichtlich bekannter Protokolle als auch Methoden weitgehend bestimmte Nachschlagewerke oder Handbücher zitiert. Die vorstehend erwähnten Handbücher werden als "Hopwood", "Maniatis" bzw. "Current Protocols" abgekürzt.

Beispiel 1: Isolierung einer Teico-R verleihenden DNA-Sequenz

1.1 Genomische Gesamt-DNA von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 wurde isoliert, mit der Restriktionsendonuclease Bam HI teilweise gespalten und nach den in Hopwood (vgl. Seiten 79-80 und insbesondere 152-153) und Current Protocols (vgl. insbesondere Abschnitt I, 3.1 und speziell 3.1.1 bis 3.1.4) beschriebenen Verfahren mit Hilfe einer Saccharosegradienten-Zentrifugation einer Größenfraktionierung unterworfen. Die einzigen Veränderungen gegenüber den Protokollen betreffen die im Isolierungsschritt verwendete Lysozymlösung, deren Konzentration 5 mg/ml statt 2 mg/ml betrug, sowie die Inkubationszeit des mit Lysozym behandelten Myzels, die 2 h statt 30 min betrug.
1.2 Die fraktionierten, 2,5 bis 10 Kb großen Fragmente wurden dann mit dem Plasmid pIJ702 (allgemein erhältlich und enthalten in S. lividans,
John Innes Collection 3131; die Restriktionskarte davon ist in Hopwood, Seiten 292-293, enthalten) ligiert, das vorher mit Bgl II linearisiert und mit Phosphatase behandelt worden war. Dieser Ligierungsschritt wurde im wesentlichen nach Hopwood (Seiten 154-157) durchgeführt, wobei das Verhältnis Vektor:Insertion etwa 1:5 betrug; die Linearisierung und die Phosphatase-Behandlung von pIJ702 wurde nach den üblichen Verfahren durchgeführt, vgl. Hopwood, Seiten 158-159, 164 sowie 284-285.
1.3 Das erhaltene Ligierungsgemisch wurde dann zur Transformation von S. lividans 66-Protoplasten verwendet (weitere technische oder methodische Einzelheiten findet man z.B. in Hopwood, Seiten 12-14,110-111 und 236). Nach Selektion mit Thiostrepton (25 mg/l) wurden etwa 11000 rekombinante Plasmide enthaltende Transformanten gewonnen. S. lividans 66 ist in John Innes Collection unter der Eingangsnummer 1326 hinterlegt.
1.4 Zur Selektion auf Teicoplanin-Resistenz wurden Sporensuspensionen dieser Transformanten in geringer Dichte ausplattiert; ein Clon wurde aufgrund seiner Fähigkeit, in Gegenwart von 20 mg/l Antibiotikum zu wachsen, selektiert. Das in diesem Clon vorhandene Plasmid wurde als pTR168 bezeichnet.

Beispiel 2: Bestätigung, daß das selektierte Plasmid die Teico-R verleihende Sequenz enthält

2.1 Aus den vorstehend erhaltenen Zellen wurde Plasmid pTR168 extrahiert (Hopwood, S. 85-91) und danach zur erneuten Transformation von S. lividans 66-Protoplasten verwendet (nach den in Beispiel 1.3 beschriebenen Methoden). Mehr als 95% der Thiostrepton-resistenten Transformanten zeigten sich auch gegen Teicoplanin resistent, was bewies, daß die Teicoplanin-Resistenz pTR168 eigen war.
2.2 Die Restriktionskarte des Plasmids zeigte eine 2614 bp große Insertion (vgl. Figur 1), die an ihren Enden zwei durch Verbindung von überhängenden Bgl II- und Bam HI-Enden entstandene Xho II- Restriktionsstellen sowie Restriktionsstellen für Sst I, Apa I, Sma I, Pvu II und Kpn I enthielt, aber offensichtlich keine Erkennungsstellen für Bam HI, Bcl I, Bgl II, Cla I, Eco RI, Eco RV, Pst I, Sph I, und Xho I.
2.3 Aus dem vorstehend erwähnten Teico-R verleihenden Fragment wurden die internen, etwa 1,5 Kb großen Sst I- und Kpn I-Fragmente isoliert, radioaktiv markiert und zur Southern-Blot-Hybridisierung mit genomischer DNA von A. teichomyceticus ATCC 31121 verwendet, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen (Kpn I - Sst I; Bam HI; Pst I; Pvu II; Bgl II) nach bekannten Verfahren (wie in Beispiel 1.1 berichtet) gespalten worden war. Die Hybridisierung wurde in herkömmlicher Weise, wie in den Gebrauchsanweisungen der Membranhersteller beschrieben, durchgeführt.
Die radioaktive Markierung der Sonde wurde mit ³²P nach dem Syntheseverfahren mit Oligodesoxyribonucleotid- Zufallsprimern (Current Protocols, 3.5.8, 3.5.9) durchgeführt. Nach Restriktionsspaltung gemäß dem bereits vorstehend erwähnten Verfahren wurde die genomische DNA auf einem 1%-igen Agarosegel in TRlS-Acetat-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Zur DNA- Denaturierung wurde das die getrennten DNA-Banden enthaltende Gel 30 min bei Raumtemperatur in 0,4 N NaOH - 0,6 M NaCl inkubiert. Zur Neutralisierung wurde das Gel dann 30 min in 1,5 M NaCl - 0,5 M TRIS-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 inkubiert und danach auf eine Nylonmembran (Gene Screen Plus, NEN) übertragen, die vorher mit 10 x SSC (1,5 M NaCl - 0,15 M Natriumcitrat) behandelt worden war. Die DNA-Übertragung erfolgte über Nacht in 10 x SSC. Danach wurde die Membran an der Luft getrocknet und mit UV-Licht behandelt. Die Hybridisierung mit der markierten Probe wurde bei 65ºC nach bekannten Verfahren durchgeführt, umfassend eine Vorhybridisierung der Membran durch Behandlung in 10 ml einer Lösung von 1% Natriumdodecylsulfat, 1 M NaCl, 1% Denhardt-Lösung und 10% Dextransulfat in einem verschweißbaren Plastikbeutel, der dann verschweißt und mindestens 15 min bei 65ºC unter konstantem Schütteln inkubiert wurde. Danach wurden 0,5 - 1 ml einer Lösung, enthaltend denaturierte Lachssperma-DNA (≥ 100 Mikrogramm/ml) und denaturierte markierte Sonde (Endkonzentration ≤ 10 ng/ml oder 1-4 x 10&sup5; dpm/ml) zugegeben. Unter konstantem Schütteln wurde der erneut verschweißte Beutei etwa 16 h bei 65ºC inkubiert. Überschüssige Sonde wurde durch Waschen mit 0,2 x SSC bei 65ºC entfernt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Sonde jeweils nur mit einem DNA- Restriktionsfragment pro DNA-Spaltansatz hybridisierte, abgesehen von der mit Pvu II gespaltenen DNA, wo zwei Banden nachgewiesen wurden. Wenn man bedenkt, daß Pvu II das einzige verwendete Restriktionsenzym mit einer Spaltstelle innerhalb der Sonde ist, stimmen diese Ergebnisse mit der Hypothese überein, daß die pTR168-Insertion eine im Genom von A. teichomyceticus ATCC 31121 nur einmal vorkommende Sequenz darstellt.

Beispiel 3: Nucleotidsequenz der Teicoplanin-Resistenz verleihenden Insertion des Plasmids pTR 168

Der gesamte DNA-Abschnitt wurde mit Hilfe des Didesoxy- Kettenabbruchverfahrens sequenziert, wobei nach den in "Current Protocols" (Kapitel 7 von 1.1 bis 6.5) beschriebenen Verfahren gearbeitet wurde. Für diesen Zweck wurde der Taq-Polymerase-Sequenzierungskit (von United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, USA) verwendet (TAQuence ; Taq DNA Polymerase Sequencing System; Step-by-step Protocols for DNA Sequencing with TAQuence, 1. Ausgabe, 1989).
In Figur 2 zeigen die Pfeile die DNA-Restriktionsfragmente, die zur Sequenzanalyse in die Phagen M13mp18 und M13mp19 (R. M. Dale, B. A. McClure and J. P. Houchins Plasmid 13 (1985), 31-41) cloniert wurden, sowie die Sequenzierungsrichtung und den Umfang der sequenzierten DNA- Bereiche.
Mehrere Pfeile zeigen die DNA-Fragmente, die unter Verwendung geeigneter Oligodesoxyribonucleotide als Primer sequenziert wurden. Die Sequenzanalyse zeigt einen G + C-Gehalt von 75,4%. Der G + C-Gehalt liegt im gleichen Bereich wie bei anderen Actinomyceten. Die Sequenz ist unter "Sequenzverzeichnis" erwähnt und als SEQ ID-Nr. 1 gekennzeichnet.

Beispiel 4: Sensitivität transformierter und nichttransformierter Wirte gegen verschiedene Antibiotika

4.1 S. lividans 66, enthaltend entweder pIJ702 oder das Teico-R verleihende Plasmid pTR168, wurden mit Hilfe des Antibiogramm- Scheibchentests auf ihre Sensitivität gegen verschiedene Antibiotika untersucht. Standard-Antibiogrammscheibchen mit einem Durchmesser von 6 mm (BBL, Cockeysville, MD, USA) wurden auf eine konzentrierte Sporensuspension der untersuchten Stämme gelegt. Die Hemmzonen wurden nach zwei Tagen Inkubation bei 28ºC gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I wiedergegeben.
Wie erwartet, wurde zwischen beiden Stämmen nur ein Unterschied bei Teicoplanin festgestellt. Teicoplanin hemmte nicht das Wachstum der Zellen, die das Teico-R verleihende Plasmid pTR168 enthielten. TABELLE I Vergleich der Wirksamkeit bekannter Antibiotika gegen S. lividans 66, enthaltend das Elternplasmid pIJ702 oder das Teico-R verleihende rekombinante Plasmid pTR168. ANTIBIOTIKUM ug oder (IE)* pro Scheibchen Hemmzone (mm) pTR168 NEOMYCIN PAROMOMYCIN KANAMYCIN GENTAMYCIN TOBRAMYCIN AMIKACIN ERYTHROMYCIN NOVOBIOCIN RIFAMPICIN BACITRACIN TEICOPLANIN * = Internationale Einheit
4.2 Auf Agarplatten wurden beide Stämme auch auf ihre Resistenz gegen Dalbaheptid-Antibiotika untersucht.
Bei diesem Test wurden Vancomycin, Teicoplanin und das Antibiotikum A 40926 verwendet.
S. lividans scheint an sich gegen Vancomycin resistent zu sein, da es selbst auf 100 mg/l Antibiotikum enthaltenden Platten wachsen konnte. In Gegenwart von 100 mg/l Teicoplanin oder 50 mg/l A/40926 wuchsen pTR168 enthaltende Zellen mit einer 100%-igen Plattierungseffizienz, während der pIJ702 enthaltende Stamm durch beide Antibiotika bei einer Konzentration von jeweils 3,2 mg/l gehemmt wurde.
Diese Daten zeigen, daß die durch pTR168 verliehene Resistenz spezifisch für Dalbaheptid-Antibiotika ist und sich nicht nur auf Teicoplanin allein beschränkt.

Beispiel 5: Teicoplanin-Bindungsuntersuchungen an S. lividans, der entweder das Elternplasmid oder das rekombinante Plasmid pTR168 trägt.

5.1 Mittels HPLC-Analyse (vgl. das von Riva, E., et al., Chromatographia 24 (1987), 295-301, beschriebene Verfahren) von Überständen resistenter (pTR168) oder sensitiver (pIJ702) S. lividans-Kulturen, die bis zu 18 Stunden in Kontäkt mit dem Antibiotikum waren, konnte keine chemische Modifizierung von Teicoplanin nachgewiesen werden. Aus der Kultur sensitiver Zellen wurde jedoch weniger Teicoplanin gewonnen. Die sensitiven Zellen hatten scheinbar mehr Antibiotikum gebunden als die resistenten Zellen.
5.2 Streptomyces lividans, der das Plasmid pIJ702 trägt (nachstehend als S. lividans pIJ702 bezeichnet), oder S. lividans, der das rekombinante Plasmid pTR168 trägt (nachstehend als S. lividans-R pTR168 bezeichnet), wurden bei 30ºC bis zur späten log-Phase gezüchtet. Von jeder Kultur wurden zwei Aliquots abzentrifugiert; die Überstände und die resuspendierten Pellets wurden zur Herstellung der folgenden Gemische verwendet:
-A) S. lividans (pIJ702) + sein eigener Überstand
-B) S. lividans (pIJ702) + der Überstand von S. lividans-R (pTR168)
-C) S. lividans-R (pTR168) + sein eigener Überstand
-D) S. lividans-R (pTR168) + der Überstand von S. lividans (pIJ702)
Jedem Gemisch wurden 10 mg/l ³H-markiertes Teicoplanin (37 kBq) zugesetzt. Danach wurden die Gemische 20 min bei 30ºC unter Rühren inkubiert. Zum Zeitpunkt der Zugabe des Antibiotikums wurde die zugegebene Gesamtradioaktivität bestimmt. Die inkubierten Kulturen wurden danach zentrifugiert und die Radioaktivität der Überstände wurde bestimmt. Die Pellets wurden mit dem gleichen Volumen einer 0,9%-igen NaCl-Lösung gewaschen. Die Radioaktivität der Waschlösung wurde zusammen mit der an die Zellen gebundenen restlichen Radioaktivität bestimmt.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde die Hälfte der im Medium vorhandenen Teicoplanin-Menge durch die sensitiven Zellen gebunden. Unabhängig von der Herkunft der Überstände wurde durch das Waschverfahren nur eine kleine Antibiotikummenge entfernt. In beiden Überständen wurden keine nennenswerten Antibiotikamengen durch die resistenten Zellen gebunden. TABELLE 2 Teicoplanin- Bindungstest Die Werte sind in Prozent der zugegebenen Gesamtradioaktivität angegeben; aufgrund von Schwankungen bei Probennahme und Bestimmung der radioaktiven Zählimpulse beträgt die Summe jeder Spalte nicht exakt 100%. Myzel-Überstand Nährlösung Waschlösung Zellen
5.3 Nach dem bekannten Rezeptorbindungs-Immuntest (RASA; Corti et al., Clin. Chem., 39/9 (1987), 1615-1618) wurde ein weiteres Teicoplanin- Bindungsexperiment durchgeführt. Kulturen von S. lividans, enthaltend entweder pIJ702 oder pTR168, oder nichtbeimpfte Nährlösung wurden 1 Stunde bei 30ºC in Gegenwart von Teicoplanin in einem Konzentrationsbereich von 0,15 bis 4,8 mg/l bebrütet. Nach Zentrifugation wurde die restliche Teicoplanin-Menge im Überstand durch RASA ermittelt. Aus praktischen Gründen ist dieses Verfahren hier nachstehend kurz beschrieben. (Vgl. auch EP-A 2212829).
Das Verfahren basiert auf der selektiven Adsorption von Teicoplanin auf Mikrotiterplatten, die mit Albumin-Epsilon-aminocaproyl-D-alanyl-D- alanin beschichtet sind, und der Umsetzung mit gegen Teicoplanin gerichteten Antikörpern. Die Komplexe werden dann durch Inkubation mit Antikörpern, die gegen die Anti-Teicoplanin-Antikörper gerichtet sind, und eine Farbstoffbildungsreaktion mit o-Phenylendiamin nachgewiesen. Zur Untersuchung auf Teicoplanin wurden die Proben 1:5 in 20%-igem Serum, 20%-iger S/bis-Nährlösung und 40%-igem RASA-Puffer verdünnt (PBS-BTS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung plus 0,5 ml Tween 20 pro Liter, 3 g BSA/Liter und 20% Serum). In jede Vertiefung der Mikrotiterplatten, die vorher mit Albumin-epsilon-aminocaproyl-D-alanyl- D-alanin beschichtet worden waren (vgl. Corti et al., vorstehend), wurden 0,1 ml der verdünnten Probe gegeben. Die Platten wurden dann 2 Stunden bei 30ºC in einem geschlossenen feuchten Kasten inkubiert. Die Platten wurden dann 8mal mit PBS-T (PBS, dem 0,5 ml Tween 20 zugesetzt wurden) gewaschen. Die Vertiefungen der Platten wurden danach mit 0,1 ml gegen Teicoplanin gerichtetem Kaninchen-Antiserum gefüllt, das 1:250 in PBS-BT (wie das vorstehend erwähnte PBS-BTS, aber ohne 20% Serum) verdünnt worden war. Die Umsetzung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen wurden in den Vertiefungen der Platten 0,1 ml spezifische Peroxidase-conjugierte Ziegen-Antikörper verteilt, die gegen Kaninchen-IgGs gerichtet waren (1:500 verdünnt). Die Umsetzung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Waschen der Platten wurden 0,15 ml farbstoffbildende Peroxidase-Lösung (1 g o- Phenylendiamin und 3,5 mM Sauerstoffperoxidase pro Liter in 0,1 M Natriumcitrat-Puffer, pH 5) zugesetzt. Nach 30minütiger Inkubation bei 30ºC wurde die Umsetzung durch Zugabe von 0,05 ml Schwefelsäure beendet. In einem Titertek-Multiskan-Fotometer (Flow Laboratories) wurde die Extinktion bei 492 nm bestimmt. In gleicher Weise wurden Standards mit Teicoplanin-Konzentrationen von 10, 40 bzw. 160 ng/ml hergestellt. Gesamtbindung bzw. spezifische Bindung wurden mit 10 mg/ml Teicoplanin in Verdunnungspuffer und Verdunnungspuffer allein bestimmt. Erneut wurde das Antibiotikum wirksamer durch sensitive Zellen gebunden als durch resistente Zellen. In den Überständen von pTR168 enthaltenden Zellen wurden mehr als 85% der eingesetzten Teicoplanin-Menge bei allen untersuchten Konzentrationen nachgewiesen. Bei Verwendung von pIJ702 enthaltenden Zellen wurden dagegen nur 25% der eingesetzten Teicoplanin-Menge in den Überständen gefunden.
Die Daten zeigen, daß die von pTR168 herbeigeführte Resistenz im Einklang mit einer verringerten Teicoplanin-Bindung an die Zellen steht.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQID-Nr.: 1
Sequenztyp : Nucleotide
Sequenzlänge : 2614 Basenpaare
Strang : doppelsträngig
Topologie : linear
Molekültyp : genomische DNA
Ursprungsorganismus: Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121
Direkte experimentelle Herkunft: S. lividans-Plasmid pTR168
Eigenschaften : enthält ein Teicoplanin-Resistenz verleihendes Gen

Claims

1. Teico-Resistenz (Teico-R) verleihende Sequenz, die eine Nucleotidsequenz ist, die Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum verleihen kann und ausgewählt ist aus;

a) einem DNA-Fragment mit 2614 Easenpaaren, das erhalten werden kann durch BamHI-Behandlung des Genoms von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, einem Subfragment davon, oder einer dieses enthaltenden DNA-Sequenz, die fähig ist, nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegenüber dem Glycopeptid-Antibiotikum zu verleihen;

b) eine Nucleinsäuresequenz, die fähig ist, nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum zu verleihen und unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen mit einem vorstehend unter a) erwähnten DNA-Fragment zu hybridisieren,

c) DNA-Sequenzen, die als Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes zu DNA-Sequenzen gemäß der Definition unter a) oder b) degeneriert sind und fähig sind, nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum zu verleihen.

2. Teico-R verleihende Sequenz nach Anspruch 1, die ein DNA-Fragment mit 2614 Easenpaaren ist, das erhalten werden kann durch BamHI-Behandlung des Genoms von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, einem Subfragment davon oder einer dieses enthaltenden DNA-Sequenz, die nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum verleihen kann.

3. Teico-R verleihende Sequenz nach Anspruch 1, die eine Nucleinsäuresequenz ist, die nach Transformation in einen sensitiven mikrobiellen Wirr Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum verleihen kann, und unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen mit einem DNA- Fragment mit 2614 Basenpaaren hybridisieren kann, das erhalten werden kann durch BamHI-Behandlung des Genoms von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, einem Subfragment davon oder einer dieses enthaltenden DNA-Sequenz.

4. Teico-R verleihende Sequenz nach Anspruch 1, die ein Teil einer DNA-Insertion ist, die unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen mit einem DNA-Fragment mit 2614 Basenpaaren hybridisiert, das erhalten werden kann durch BamHI-Behandlung des Genoms von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, einem Subfragment davon oder einer dieses enthaltenden DNA-Sequenz, die nach Transformation in einem sensitiven mikrobiellen Wirt Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum verleihen kann.

5. Teico-R verleihende Sequenz nach Anspruch 1 b) oder c), deren Ursprung ein ein Glycopeptid-Antibiotikum produzierender Mikroorganismus ist, der nicht Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 ist.

6. Teico-R verleihende Sequenz nach Anspruch 1, die ein DNA-Isolat mit der folgenden Sequenz ist: oder ein Fragment davon, das Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum codieren kann.

7. Rekombinantes Plasmid, das für die Transformation eines mikrobiellen Wirts geeignet ist, umfassend eine Teico-R verleihende Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 und 6.

8. Mikrobielle Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Plasmid nach Anspruch 2, transformiert ist.

9. Mikrobielle Zelle nach Anspruch 8, die ein Glycopeptid- Antibiotikum produziert.

10. Verfahren zur Herstellung einer Teico-R verleihenden Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 und 6, umfassend das Züchten einer transformierten Wirtszelle nach Anspruch 8 in einem geeigneten Medium, Gewinnung und Isolierung der Teico-R verleihenden Sequenz daraus.

11. Verfahren zur Herstellung einer Teico-R verleihenden Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 und 6, umfassend:

a) Extraktion der DNA-Fraktion aus dem Genom eines Mikroorganismus, der ein Glycopeptid-Antibiotikum produziert, teilweise Spaltung mit spezifischen Restriktionsenzymen,

b) Ligierung der Restriktionsfragmente zu einem linearisierten Vektor für eine sensitive Wirtszelle,

c) Auswahl der transformierten Zellen mit Hilfe der erworbenen Resistenz und Isolierung der Teico-R verleihenden Sequenz daraus.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Mikroorganismus A. teichomyceticus ATCC 31121 ist und das Spaltenzym BamHI ist.

13. Verwendung einer Teico-R verleihenden Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zum Nachweis, Isolierung oder Reinigung der entsprechenden Bereiche oder diese enthaltender Insertionen aus dem Genom einer mikrobiellen Zelle.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die mikrobielle Zelle ein Glycopeptid-Antibiotikum produziert.

15. Verwendung einer Teico-R verleihenden Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zur Einführung oder Steigerung der Resistenz eines mikrobiellen Wirts gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die mikrobielle Zelle ein Glycopeptid-Antibiotikum produziert.

17. Verwendung einer Teico-R verleihenden Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zur Isolierung, Identifizierung oder Reinigung einer Nucleinsäuresequenz, die Resistenz gegen ein Glycopeptid-Antibiotikum verleihen kann, oder einer diese enthaltenden Insertion, umpassend die Hybridisierung einer Sonde, die eine markierte Teico-R-Sequenz nach einem der Ansprüch 1, 2, 3, 4, 5 und 6 aufweist, mit einer Nucleinsäurefraktion und gegebenenfalls Isolierung der Nucleinsäurefragmente, die mit der Sonde unter mittleren bis niedrigen Stringenzbedingungen hybridisieren.