DE69120272T2 - Salmonella genom nükleinsäure, ihre verwendung, besonders bei der in vitro diagnose der anwesenheit von bakterien der gattung salmonella in lebensmitteln - Google Patents
Salmonella genom nükleinsäure, ihre verwendung, besonders bei der in vitro diagnose der anwesenheit von bakterien der gattung salmonella in lebensmittelnInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft aus dem Genom von Salmonella typhi stammende Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung insbesondere zur in vitro-Diagnose der Anwesenheit von Bakterien der Gattung Salmonella in einer biologischen Probe, die diese möglicherweise enthält, und insbesondere in Lebensmittelerzeugnissen.
- Lebensmittelerzeugnisse erlangen gegenwärtig eine zunehmende Bedeutung. Aus gesellschaftlichen Gründen besteht für verarbeitete, verbrauchsfertige Lebensmittel nach wie vor eine verstärkte Nachfrage von Seiten der Käufer. Dies führt dazu, daß sich die Produktionsquellen und die Darbietung dieser Erzeugnisse während der letzten 15 Jahre bedeutend verändert haben (Massenfertigung in spezialisierten Betrieben; In-den- Handel-Bringen in abgepackten Einheiten, im allgemeinen unter Kunststoffolie).
- Aus Gründen der öffentlichen Gesundheit werden die Fabrikationstechnologie und die Produkte selbst einer zunehmend strengeren hygienischen überwachung unterworfen. Im Rahmen der bakteriologischen Kontrollen wird auf die Bakterien, die für Lebensmitteltoxinschädigungen verantwortlich sind, systematisch untersucht und unter diesen sind die Salmonella an vorderster Stelle betroffen. Die Gesundheitsnormen sind überdies für diese Bakteriengattung sehr deutlich: Abwesenheit von Salmonella in 25 g Erzeugnis.
- Vom Gesichtspunkt der Taxonomie aus stammt die Gattung Salmonella aus der Familie der Enterobacteriaceae. Diese Gattung umfaßt eine einzige und einzigartige Art, S. enterica, die in sieben Unterarten unterteilt werden kann. Innerhalb jeder dieser Unterarten können eine große Anzahl von Serotypen mittels gegen die O-Polysaccharid-Antigene und die H-Flagellenantigene gerichteter Seren identifiziert werden. 1989 waren 2267 Serotypen von Salmonella bekannt.
- Die Salmonella sind enteroinvasive Bakterien, die für Mensch und Tier pathogen sind. Ihre Pathogenität hängt mit ihrer Fähigkeit zusammen, in das Darmepithel einzudringen. Dieser Schritt kann sich auf die Schleimhaut im Falle einer Toxinschädigung beispielsweise beschränken oder kann von einer systemi schen Verbreitung gefolgt sein (im Falle von Typhus). Die Kontamination des Wirts durch Salmonella findet in der überaus großen Mehrzahl der Fälle auf oralem weg statt. Dies erklärt, warum auf Salmonella systematisch im Rahmen bakteriologischer Kontrollen biologischer Proben untersucht wird.
- Das Referenzverfahren einer systematischen Untersuchung auf Salmonella, das von der Association Française de Normalisation (AFNOR) empfohlen wird, umfaßt: das In-Kultur-Nehmen des zu analysierenden Erzeugnisses in zwei unterschiedlichen Anreicherungsmedien, die bei zwei unterschiedlichen Temperaturen in kubiert und über zwei unterschiedliche Selektionsmedien isoliert werden (diesem Schritt geht oftmals ein Schritt einer "Wiederbelebung" in einer Nährlösung voraus); Versetzen von mindestens 6 Kolonien in Schnellidentifizierungsmedien; zuletzt eine serologische Typisierung des Stamms. Wenn das AFNOR- Protokoll anläßlich eines offiziellen Gutachtens genau befolgt werden muß, stellt man fest, daß es anläßlich systematischer Kontrollen aufgrund der für das Ausführen der Prüfung erforderlichen Zeit (mindestens eine Woche) und dessen Selbstkostenpreis schwierig anwendbar ist.
- Neue Verfahren zur Untersuchung auf Salmonella beruhen entweder auf enzymatischen Untersuchungen oder auf der Verwendung von Nukleinsäuresonden. Es muß unterstrichen werden, daß in diesen beiden Fällen ein Schritt einer Kultur in Vollmedium und eine Subkultur in einem Anreicherungsmedium empfohlen werden, ja sogar unabdingbar sind.
- Die immunenzymatischen Untersuchungen, die monoklonale Antikörper einsetzen, sind leicht auszuführen, liefern Ergebnisse in 4-6 h und haben einen erschwinglichen Selbstkostenpreis. Ihr großer Nachteil besteht in der Tatsache, daß sie häufig falsche Positivreaktionen und manchmal falsche Negativreaktionen liefern. Die Konsequenzen dieser falschen Reaktionen sind in beiden Fällen bedeutend: wenn es sich um eine falsche Positivreaktion handelt, wird eine Beschlagnahme des Produkts erfolgen und durch das Analysenlabor ein Prozeß in Gang gesetzt werden, um ein Salmonella-Bakterium zu isolieren, das nicht existiert; wenn es sich um eine falsche Negativreaktion handelt, wird das Erzeugnis mit den Risiken, die dies für die öffentliche Gesund heit mit sich bringt, in den Handel gebracht werden.
- Eine neue Studie an 250 Stämmen von Salmonella und 75 Bakterienstämmen, die nicht aus der Gattung Salmonella stammen, hat zu 17 falschen Positivreaktionen und 2 falschen Negativreaktionen geführt (D'AOUST, J.Y., (1987):"Efficacité de la trousse immunoenzymatique BIOENZABEAD pour le dépistage de Salmonella spp. dans les aliments", Microorganismes et Aliments: Technique Rapide, Contrôle industriel; colloque de la Societé Française de Microbiologie, Paris). Da diese Untersuchung an Reinkulturen ausgeführt wurde, kann man sich vorstellen, daß die Anzahl von Falschreaktionen bedeutender sein wird bei polymikrobiellen Erzeugnissen (durch Mikroben verursachte Kompetition; Risiko antigener Kreuzreaktionen).
- Die Nukleinsäuresonden werden aus einem Fragment genomischer DNA (FITTS, R. et al. (1983), "DNA-DNA Hybridization Assay For Detection Of Salmonella spp."; Foods, Applied and Environmental Microbiology, 46, 1146-1151) gebildet. Sie werden als spezifisch angesehen. Es existieren mehrere im Handel vertriebene Testzusammenstellungen (oder Kits). Tatsächlich scheinen diese Sonden zwei hauptsächliche Nachteile aufzuweisen: ihr Mangel an Spezifität gemäß den durch einzelne Verwender mitgeteilten Ergebnissen (Kreuzreaktion mit den Bakterien der Gattung Citrobacter, beispielsweise) und ihr Mangel an Empfindlichkeit (untere Nachweisgrenze: 10&sup5; Salmonella; oder gemäß bestimmten Autoren 2,5 µg DNA, was ungefähr 10&sup7; Bakterien entspricht).
- Die Erfindung hat genau zum Gegenstand Nukleinsäuresequenzen, die als Nukleinsäuresonden für den Nachweis von Salmonella verwendet werden können, wobei diese Sonden eine perfekte Spezifität für die Gattung Salmonella aufweisen (keine Kreuzreaktion mit anderen Bakterien, insbesondere mit den Bakterien der Gattung Citrobacter).
- Die Erfindung hat gleichfalls zum Gegenstand die Verwendung dieser Nukleinsäuresonden in in vitro-Verfahren zum Nachweis oder zur mengenmäßigen Bestimmung von Salmonella, wobei diese die folgenden Vorteile aufweist:
- - hohe Empfindlichkeit;
- - schnelle Antwort: das Analysenergebnis kann in 48 h, ja sogar 24 h erhalten werden;
- - leichtes Ausführen, insbesondere ohne Einsatz eines radioaktiven Erzeugnisses;
- - angemessener Selbstkostenpreis.
- Der Serotyp typhi der Salmonella-Unterart enterica (ein Bakterium, das im Folgenden als "Typhi" bezeichnet wird) ist der Verursacher von Typhus beim Menschen. Dieses Bakterium ist für den Menschen streng pathogen. Nach einer Kontamination auf oralem Wege überwindet Typhi die intestinale Barriere, um die Ganglia mesenterica zu befallen dank eines genetischen Systems, welches es ihm erm:glicht, sich an die Epithelzellen der Darmschleimhaut anzuheften und in diese einzudringen. Mangels eines experimentellen Modells wird dieser erste Schritt der Infektion in vitro an HeLa-Zellen in Kultur untersucht, weil Typhi in der Lage ist, sich an diese Zellen anzuheften und in diese einzudringen.
- Die Erfindung hat präzise jede Nukleinsäuresequenz zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die Gesamtheit oder einen Teil der genetischen Information trägt, die für die Aktivität einer in vitro-Infektion der HeLa-Zellen in Kultur durch die Bakterien der Gattung Salmonella notwendig ist.
- Die Erfindung hat genauer jede Nukleinsäuresequenz zum Gegenstand, wie sie vorstehend definiert ist und die die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz von 7,9 kb umfaßt, welche von den zwei HindIII-Stellen begrenzt wird, die durch H&sub1; und H&sub2; in der in Figur 1 dargestellten Restriktionskarte dieser Sequenz bezeichnet werden.
- Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung sind genauer jene, die den vorstehend definierten Charakteristika entsprechen und die aus dem Genom des Stamms Ty 2 von Typhi, der bei der Collection de l'Institut Pasteur unter der Nr. CIP 55-35 hinterlegt ist, stammen.
- Die Erfindung betrifft genauer jede Nukleinsäuresequenz, die aus dem Genom des obengenannten Stamms Ty 2 stammt, wobei diese Sequenz die Gesamtheit oder einen Teil der vorstehend definierten genetischen Information trägt und die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz von 2 kb umfaßt, die durch die zwei SacI-Stellen begrenzt wird, die durch S&sub1; und S&sub2; in der in Figur 1 dargestellten Restriktionskarte bezeichnet werden.
- Allgemeiner betrifft die Erfindung jede Nukleinsäuresequenz, die die Gesamtheit oder einen Teil der genetischen Information trägt, die für die Aktivität einer in vitro-Infektion der HeLa-Zellen in Kultur durch die Bakterien der Gattung Salmonella notwendig ist und die mit der Gesamtheit oder einem Teil von mindestens einer der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann. Diese stringenten Bedingungen sind die folgenden: 65ºC während 18 h in 6 x SSC (1xSSC wird gebildet aus: 0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat, pH 7) in Denhardt-Medium (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Rinderserumalbumin).
- Die Erfindung betrifft gleichfalls jede Nukleinsäuresequenz, die in einer der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenzen enthalten ist oder in der Lage ist, mit einer dieser Sequenzen unter den vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren und die als Sonde für das Ausführen eines in vitro-Nachweisverfahrens von Bakterien der Gattung Salmonella und insbesondere der pathogenen Salmonella, wie Typhi, die sich an die Epithelzellen der Darmschleimhaut im Organismus anheften und in diese eindringen können, einsetzbar ist.
- Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuresonden der Erfindung durch eine Aufeinanderfolge von ungefähr 200 bis 500 Nukleotiden gebildet.
- Zu diesem Zweck hat die Erfindung insbesondere eine Nukleinsäuresonde zum Gegenstand, die durch die folgende Aneinanderreihung von Nukleotiden (I) gekennzeichnet ist:
- Die Erfindung betrifft gleichfalls jede Nukleinsäuresequenz, die in einer der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenzen enthalten ist oder in der Lage ist, mit einer dieser Sequenzen unter den vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren und die als Nukleinsäurestartsequenz für die Genamplifikation einer der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung eingesetzt werden kann.
- Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäurestartsequenzen der Erfindung durch eine Aufeinanderfolge von ungefähr 10 bis 30 Nukleotiden gebildet.
- Die Genamplifikationsverfahren sind ein bedeutender Beitrag zur Entwicklung von besonders empfindlichen in vitro- Diagnoseverfahren. Unter diesen Genamplifikationsverfahren können die PCR (Polymerase Chain Reaction)-Technik, wie sie in den Europäischen Patentanmeldungen Nr. 86/302298.4 vom 27. März 1986 und Nr. 87/300203.4 vom 09. Januar 1987 beschrieben ist, oder ferner die sogenannte "Qβ-Replikase"-Technik, beschrieben in Biotechnology, Band 6, Seite 1197 (Oktober 1988) und die mittels einer RNA-Polymerase (T7-RNA-Polymerase) arbeitet, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 89/01050, aufgeführt werden. Diese Techniken erlauben es, die Empfindlichkeit eines Nachweises der Nukleinsäuren der Viren oder der Bakterien zu verbessern und erfordern die Verwendung von spezifischen Synthesestartsequenzen.
- Zu diesem Zweck hat die Erfindung insbesondere die folgenden Nukleinsäurestartsequenzen SS-1 und SS-2 zum Gegenstand:
- die für die Amplifikation der Kopienzahl der Nukleinsäuresequenz, die durch die an den Positionen 26 und 469 der Aneinanderreihung von Nukleotiden (1) der Erfindung befindlichen Nukleotide begrenzt wird, verwendet werden können.
- Gleichfalls Teil der Erfindung sind die in Bezug auf die vorstehend definierte Nukleinsäuresequenz (I) oder die vorstehend definierten Startsequenzen SS-1 und SS-2 abgewandelten Nukleinsäuren, die bestimmte, mit der folgenden Maßgabe lokalisierte Mutationen umfassen, daß diese abgewandelten Nukleinsäu ren mit der vorstehend definierten Sequenz (I) oder den vorstehend definierten Nukleinsäurestartsequenzen unter den vorstehend in der Beschreibung definierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
- Die Erfindung hat gleichfalls jedes Peptid oder Polypeptid zum Gegenstand, das gemäß dem universellen genetischen Code einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung entspricht.
- Zu diesem Zweck betrifft die Erfindung insbesondere jedes Polypeptid, das durch die Gesamtheit oder einen Teil der folgenden Aminosäuresequenz (II) gebildet wird, wobei diese Sequenz gemäß dem universellen genetischen Code der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenz (I) entspricht:
- Es versteht sich von selbst, daß jede Peptidsequenz, die aus der Modifizierung durch Substitution und/oder durch Hinzufügen und/oder Suppression einer oder mehrerer Aminosäuren eines Polypeptids der Erfindung und insbesondere der vorstehend beschriebenen Peptidsequenz (II) oder einer Peptiduntersequenz, die von dieser letzteren abstammt, resultiert, im Rahmen der Erfindung liegt, solange diese Modifizierung die antigenen Eigenschaften dieses Polypeptids nicht verändert.
- Die Erfindung betrifft gleichfalls polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch die Polypeptide der Erfindung erkennen und immunologische Komplexe mit diesen letzteren bilden können.
- Die polyklonalen Antikörper der Erfindung werden durch Immunisierung eines Tieres mit den Polypeptiden der Erfindung, gefolgt von der Gewinnung der gebildeten Antikörper, erhalten.
- Die monoklonalen Antikörper der Erfindung werden durch jedes Hybridom produziert, das durch klassische Verfahren einerseits ausgehend von tierischen Milzzellen, insbesondere von Maus oder Ratte, die gegen eines der gereinigten Polypeptide der Erfindung immunisiert wurden, und andererseits von Zellen einer geeigneten Myelomzellinie gebildet werden kann und das hinsichtlich seiner Fähigkeit, monoklonale Antikörper zu produzieren, die das ursprünglich zur Immunisierung der Tiere eingesetzte Polypeptid erkennen können, selektioniert werden kann.
- Die Erfindung betrifft gleichfalls ein in vitro-Nachweisverfahren (oder in vitro-Diagnoseverfahren) der etwaigen Anwesenheit von Bakterien der Gattung Salmonella in einer biologischen Probe, die diese mzglicherweise enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es umfaßt:
- - gegebenenfalls die Probe in Kultur zu nehmen,
- - gegebenenfalls die Anzahl von Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz mittels eines Paares Nukleinsäurestartsequenzen, wie sie vorstehend definiert wurden, zu amplifizieren,
- - die Probe mit einer Nukleinsäuresonde, wie sie vorstehend definiert wurde, unter den vorstehend aufgeführten Hybridisierungsbedingungen in Kontakt zu bringen,
- - zwischen der vorstehend genannten Sonde und der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz gebildete Hybridisierungskomplexe gegebenenfalls nachzuweisen.
- Der Schritt des In-Kultur-Nehmens der biologischen Probe wird vorteilhafterweise auf die folgende Weise ausgeführt: 25 g der biologischen Probe werden in 200 ml Nährbrühe in einem 1 l- Erlenmeyerkolben 18 h bei 37ºC unter Bewegung in Kultur genommen.
- Der Schritt der Amplifizierung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz umfaßt im vorstehend aufgeführten Verfahren vorteilhafterweise die folgenden Schritte:
- - einen Schritt einer Extraktion der nachzuweisenden Nukleinsäure, die aus dem Genom der Bakterien der Gattung Salmonella stammt, die möglicherweise in der biologischen Probe anwesend sind, und gegebenenfalls einen Schritt einer Behandlung dieser Nukleinsäure mittels einer reversen Transkriptase, sofern die Nukleinsäure in Form von RNA vorliegt,
- - einen Zyklus, der die folgenden Schritte umfaßt:
- -- einen Schritt einer Denaturierung der nachzuweisenden doppelsträngigen Nukleinsäure&sub1; was zur Bildung einer einzelsträngigen Nukleinsäure führt; dieser Schritt wird vorteilhafterweise für 120 s bei 94ºC ausgeführt;
- -- einen Schritt einer Reassozuerung durch Hybridisierung jedes der aufgrund des vorangegangenen Denaturierungsschritts erhaltenen Nukleinsäurestränge mit mindestens einer Startsequenz, wie sie vorstehend definiert wurde, indem die vorstehend genannten Struange mit mindestens einem Paar vorstehend genannter Startsequenzen in Kontakt gebracht werden; dieser Schritt wird vorteilhafterweise für 180 s bei 68ºC ausgeführt.
- -- einen Schritt einer Verlängerung ausgehend von den Startsequenzen durch Bildung zu den Strängen komplementärer DNAs, die mit diesen hybridisiert sind, in Gegenwart einer DNA- Polymerase und geeigneter Mengen der vier verschiedenen Nukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), was zu der Bildung einer größeren Anzahl von nachzuweisenden doppelsträngigen Nukleinsäuren führt als bei dem vorangegangenen Denaturierungsschritt; dieser Schritt wird vorteilhafterweise für 90 s bei 72ºC ausgeführt, wobei dieser Zyklus eine festgelegte Anzahl von Malen wiederholt wird (vorzugsweise zwischen 20- und 30- mal), um die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz, die möglicherweise in der biologischen Probe anwesend ist, in einer ausreichenden Menge, um deren Nachweis zu ermöglichen, zu erhalten.
- Andere Verfahren zu Amplifikation und/oder Nachweis der für Salmonella charakteristischen Nukleinsäuresequenzen, die diese Sonden und gegebenenfalls die vorstehend beschriebenen Nukleinsäurestartsequenzen verwenden, sind im Rahmen der Erfindung einsetzbar. Zu diesem Zweck können das in der Internationalen Patentanmeldung WO 85/06700 beschriebene Verfahren oder ferner das in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0357336 beschriebene Verfahren aufgeführt werden.
- Die Erfindung hat gleichfalls Kits zum Ausführen eines Verfahrens zum in vitro-Nachweis von Bakterien der Gattung Salmonella, wie es vorstehend beschrieben wurde, zum Gegenstand, wobei diese Kits umfassen:
- - gegebenenfalls ein geeignetes Medium, um die biologische Probe in Kultur zu nehmen,
- - mindestens ein Paar vorstehend beschriebener Nukleinsäure startsequenzen,
- - gegebenenfalls geeignete Reagenzien, um den Amplifizierungszyklus durchzuführen, insbesondere DNA- (oder RNA-) Polymerase und geeignete Mengen der vier verschiedenen Nukleosidtriphosphate,
- - eine (oder mehrere) Nukleinsäuresonde(n), wie sie vorstehend beschrieben wurde(n), die markiert sein und mit der (oder den) nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en) hybridisieren kann bzw. können,
- - geeignete Reagenzien, um die Hybridisierungsreaktion zwischen der (oder den) Sonde(n) und der (oder den) vorstehend genannten nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en) zu bewerkstelligen,
- - ein biologische Referenzgewebe oder eine biologische Referenzf lüssigkeit, das bzw. die frei ist von Nukleinsäuresequenzen, die mit der (oder den) vorstehend genannten Sonde(n) hybridisieren können.
- Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zum in vitro- Nachweis der etwaigen Anwesenheit von Bakterien der Gattung Salmonella in einer biologischen Probe, die diese möglicherweise enthält, zum Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es umfaßt:
- - gegebenenfalls die biologische Probe auf die vorstehend angegebene Weise in Kultur zu nehmen,
- - gegebenenfalls die Anzahl von Kopien der Nukleinsäuresequenz, die gemäß dem universellen genetischen Code dem nachzuweisenden Polypeptid entspricht, zu amplifizieren (wobei diese Amplifizierung entsprechend dem vorstehend beschriebenen Amplifizierungszyklus ausgeführt wird),
- - die vorstehend genannte Probe mit Antikörpern der Erfindung in Kontakt zu bringen, die einen immunologischen Komplex mit dem (oder den) nachzuweisenden Polypeptid(en) bilden können,
- - die zwischen den Antikörpern und der (oder den) nachzuweisenden Peptidsequenz(en) gebildeten immunologischen Komplexe gegebenenfalls nachzuweisen.
- Die Erfindung betrifft gleichfalls Kits für das Ausführen des vorstehend beschriebenen Nachweisverfahrens, die enthalten:
- - gegebenenfalls ein geeignetes Medium, um die biologische Probe in Kultur zu nehmen,
- - gegebenenfalls ein Paar vorstehend beschriebener Startsequenzen und geeignete Reagenzien, um den Amplifizierungszyklus durchzuführen, insbesondere DNA- (oder RNA-) Polymerase und geeignete Mengen der vier verschiedenen Nukleosidtriphosphate,
- - polyklonale oder monoklonale Antikörper, die markiert sein können, insbesondere radioaktiv oder enzymatisch, die einen immunologischen Komplex mit der (oder den) nachzuweisenden Peptidsequenz(en) bilden können,
- - die Reagenzien für die Konstitution des zur Ausführung der immunologischen Reaktion zwischen den Antikörpern und der (oder den) vorstehend genannten Peptidsequenz(en) günstigen Mediums,
- - die Reagenzien, die den Nachweis der aufgrund der vorstehend genannten immunologischen Reaktion gebildeten immunologischen Komplexe erlauben; solche Reagenzien können gleichfalls einen Marker tragen oder geeignet sein, ihrerseits durch einen markierten Reaktionspartner erkannt zu werden,
- - ein biologisches Referenzgewebe oder eine biologische Referenzflüssigkeit, das bzw. die frei ist von Polypeptiden, die von den vorstehend genannten Antikörpern erkannt werden können.
- Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- - Inkubation der genomischen DNA, die aus einem Bakterium Salmonella typhi isoliert worden ist, durch Behandlung mit Natronlauge bei pH 12,5;
- - Behandlung der so extrahierten DNA mit einer geeigneten Endonuklease;
- - Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor und Gewinnung der gesuchten Nukleinsäure mittels einer geeigneten Sonde, die unter jenen vorstehend beschriebenen ausgewählt wird.
- Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung umfaßt die folgenden Schritte:
- - die DNA-Synthese unter Einsatz des automatisierten β- Cyanethylphosphoramidit-Verfahrens, beschrieben in Bioorganic Chemistry, 4, 274-325, (1986),
- - die Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor und die Gewinnung der Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde, die unter jenen vorstehend beschriebenen ausgewählt wird.
- Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Nukleotidsequenzen der Erfindung umfaßt die folgenden Schritte:
- - das Aneinanderfügen chemisch synthetisierter Oligonukleotide, die an ihren Enden mit unterschiedlichen Restriktionsstellen versehen sind, deren Sequenzen mit der Aneinanderreihung der Aminosäuren des natürlichen Polypeptids entsprechend dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7461-7465, (1983) beschriebenen Prinzip vereinbar sind,
- - die Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor und die Gewinnung der gesuchten Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde, die unter jenen vorstehend beschriebenen ausgewählt wird.
- Die Erfindung hat gleichfalls jede rekombinante Nukleinsäure zum Gegenstand, die mindestens eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung enthält, welche in eine hinsichtlich der genannten Nukleinsäuresequenz heterologe Nukleinsäuresequenz insertiert ist.
- Die Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, wie sie vorstehend definiert wurde, in welcher der Nukleinsäuresequenz der Erfindung ein Promotor (insbesondere ein induzierbarer Promotor) vorangeht, unter dessen Kontrolle die Transkription der Sequenz bewirkt werden kann und dieser Nukleinsäuresequenz gegebenenfalls eine Sequenz folgt, die Transkriptionsterminationssignale kodiert.
- Die Erfindung betrifft jeden rekombinanten Vektor, der insbesondere für die Klonierung einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung und/oder die Expression des durch diese Sequenz kodierten Polypeptids verwendet wird, und dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine rekombinante Nukleinsäure enthält, wie sie vorstehend definiert wurde, in einer seiner Stellen, die für seine Replikation nicht essentiell ist.
- Beispielhaft für einen obengenannten Vektor können die Plasmide, Cosmide oder die Phagen aufgeführt werden.
- Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung zum Gegenstand durch Transformation eines zellulären Wirts mittels eines rekombinanten Vektors vom vorstehend angegebenen Typ, gefolgt von dem In- Kultur-Nehmen des so transformierten zelluläten Wirts und von der Gewinnung des Polypeptids in dem Kulturmedium.
- Demnach betrifft die Erfindung jeden zellulären Wirt, der durch einen rekombinanten Vektor transformiert wurde, wie er vorstehend definiert wurde und die Regulationselemente enthält, die die Expression der Nukleinsäuresequenz, die das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, ermöglicht.
- Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung, das die folgenden Schritte umfaßt:
- - gegebenenfalls die Amplifizierung der Menge von Nukleotidsequenzen, die das Polypeptid kodieren, mittels zweier DNA- Startsequenzen, die so ausgewählt werden, daß eine dieser Startsequenzen identisch mit 10 bis 30 ersten Nukleotiden der Nukleotidsequenz ist, die das genannte Polypeptid kodiert, wohingegen die andere Startsequenz zu den 10 bis 30 letzten Nukleotiden der genannten Nukleotidsequenz komplementär ist (oder mit diesen 10 bis 30 letzten Nukleotiden der genannten Nukleotidsequenz hybridisiert) oder umgekehrt, daß eine dieser Startsequenzen mit 10 bis 30 letzten Nukleotiden dieser Sequenz identisch ist, wohingegen die andere Startsequenz zu den 10 bis 30 ersten Nukleotiden der genannten Nukleotidsequenz komplementär ist (oder mit diesen 10 bis 30 ersten Nukleotiden der genannten Nukleotidsequenz hybridisiert), gefolgt von der Einführung der genannten, so amplifizierten Nukleotidsequenzen in einen geeigneten Vektor,
- - das In-Kultur-Nehmen eines vorab mit einem geeigneten Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, die die das genannte Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, transformierten zellulären Wirts in einem geeigneten Kulturmedium und
- - die Gewinnung des von dem transformierten zellulären Wirt produzierten Polypeptids aus dem vorstehend genannten Kulturmedium.
- Die erfindungsgemäßen Peptide können durch klassische Verfahren auf dem Gebiet der Peptidsynthese hergestellt werden. Diese Synthese kann in homogener Lösung oder in Festphase realisiert werden.
- Beispielsweise wird auf das Syntheseverfahren in homogener Lösung verwiesen, das von HOUBENWEYL in dem Werk mit dem Titel "Methoden der organischen Chemie", herausgegeben von E. Wunsch, Band 15-I und II, THIEME Verlag, Stuttgart, 1974, beschrieben ist.
- Dieses Syntheseverfahren besteht darin, aufeinanderfolgend paarweise die aufeinanderfolgenden Aminoacylverbindungen in der erforderlichen Reihenfolge zu kondensieren oder Aminoacylverbindungen und vorab gebildete Fragmente, die bereits mehrere Aminoacylverbindungen in der geeigneten Reihenfolge enthalten, zu kondensieren oder ferner mehrere vorab so hergestellte Fragmente, wobei es sinnvoll ist, dafür Sorge zu tragen, zuvor sämtliche reaktiven Funktionen, die diese Aminoacylverbindungen oder Fragmente tragen, mit Ausnahme der Aminfunktionen der einen und der carboxylfunktionen der anderen oder umgekehrt, die normalerweise bei der Bildung der Peptidbindungen wechselwirken müssen, zu schützen, insbesondere nach einer Aktivierung der Carboxylfunktion gemäß den im Rahmen der Peptidsynthese wohlbekannten Verfahren. Als Variante kann auf Kopplungsreaktionen verwiesen werden, die Reaktionspartner einer klassischen Kopplung vom carbodiimid-Typ, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid, einsetzen.
- Wenn die eingesetzte Aminoacylverbindung eine zusätzliche Säurefunktion umfaßt (insbesondere im Falle von Glutaminsäure) werden diese Funktionen geschützt, beispielsweise durch tert.- Butylestergruppen.
- Im Falle der von Aminosäure zu Aminosäure fortschreitenden Synthese beginnt die Synthese vorzugsweise mit der Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die der in der gewünschten Sequenz benachbarten Aminoacylverbindung entspricht, und so nacheinander allmählich fortschreitend bis zur N-terminalen Aminosäure. Nach einem anderen bevorzugten Verfahren der Erfindung wird auf jenes von R.D. MERRIFIELD in der Veröffentlichung mit dem Titel "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154) beschriebene Verfahren verwiesen.
- Um eine Peptidkette nach dem MERRIFIELD-Verfahren herzustellen, wird auf ein sehr poröses Polymerharz zurückgegriffen, an welches die erste C-terminale Aminosäure der Kette angeheftet wird. Diese Aminosäure wird an das Harz über seine Carboxylgruppe angeheftet und seine Aminfunktion ist geschützt, beispielsweise durch die tert. -Butyloxycarbonylgruppe.
- Wenn die erste C-terminale Aminosäure so an das Harz angeheftet ist, entfernt man die Schutzgruppe der Aminfunktion, indem man das Harz mit einer Säure wäscht.
- In dem Falle, wo die Schutzgruppe der Aminfunktion die tert.-Butyloxycarbonylgruppe ist, kann diese durch Behandlung des Harzes mittels Trifluoressigsäure entfernt werden.
- Man koppelt dann die zweite Aminosäure, die die zweite Aminoacylverbindung oder -einheit der gewünschten Sequenz ausgehend vom C-terminalen Aminoacylrest darstellt, an die von ihrer Schutzgruppe befreite Aminfunktion der ersten C-terminalen, an die Kette angehefteten Aminosäure an. Vorzugsweise ist die Carboxylfunktion dieser zweiten Aminosäure aktiviert, beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, und die Aminfunktion ist geschützt, beispielsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe.
- Man erhält so den ersten Teil der gesuchten Peptidkette, die zwei Aminosäuren umfaßt, und deren terminale Aminfunktion geschützt ist. Wie vorstehend beschrieben, entfernt man die Schutzgruppe von der Aminfunktion und kann dann fortschreiten in der Anheftung der dritten Aminoacylverbindung unter den hinsichtlich der Anheftung der zweiten C-terminalen Aminosäure analogen Bedingungen.
- Man heftet so einzeln nacheinander die Aminosäuren, die die Peptidkette bilden sollen, an die jedesmal vorab von ihrer Schutzgruppe befreite Amingruppe des bereits gebildeten Teils der Peptidkette, die an das Harz gebunden ist, an.
- Wenn die Gesamtheit der gewünschten Peptidkette gebildet ist, entfernt man die Schutzgruppen der unterschiedlichen Aminosäuren, die die Peptidkette bilden, und man löst das Peptid von dem Harz beispielsweise mittels Fluorwasserstoffsäure ab.
- Die Erfindung wird vorteilhafterweise mittels der in der folgenden detaillierten Beschreibung enthaltenen Beispiele verdeutlicht, wobei diese letztere keinerlei begrenzenden Charakter aufweist.
- Das Ziel der Erfindung ist die Klonierung des Adhäsions- Invasionssystems von Typhi.
- Der verwendete Stamm ist der Stamm Ty 2 von Typhi, der bei der Collection de L'INSTITUT PASTEUR unter der Referenzbezeichnung CIP 55-35 hinterlegt ist.
- Ausgehend von einer Sammlung von 2000 unabhängigen Mutanten, die durch Insertion eines von Tn5 abgeleiteten Transposons (MANOIL, C. und BECKWITH, J., 1985, TnPhoA: a transposon probe for protein export signals; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8129-8133) in das Genom des Typhi-Stamms Ty 2 erhalten wurden, wurde eine Mutante erhalten, die im HeLa-Zellkultur-Modell nicht mehr invasiv war. Das Infektionsverfahren der HeLa-Zellen in Kultur durch Typhi ist das folgende: die HeLa-Zellen werden in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, gezüchtet. Diese Zellen werden durch Typhi in einem Verhältnis von 100 Bakterien pro Zelle infiziert. Nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC werden die Zellen mit dem Kulturmedium gewaschen, dann erneut in Gegenwart von 100 µg/ml Gentamycin in Kultur genommen. Die intrazellulär lokalisierten Bakterien werden nach 24 h durch eine Giemsa-Anfärbung nachgewiesen.
- Nach einem Verdau des Genoms dieser Mutante durch die Restriktionsendonuklease Saci haben Hybridisierungsexperimente auf Cellulosenitratblättern gezeigt, daß das Transposon in einem SacI-Fragment von 2 Kilobasen (kb) insertiert ist.
- Da das verwendete Transposon die Resistenz gegen Kanamycin kodiert, konnte das SacI-Fragment von 2 kb, das das Transposon enthielt, in die SacI-Stelle des Plasmids pUC18 (VIEIRA, J. und MESSING, J., 1982; The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers; Gene, 19, 259-268) kloniert werden. Unter Verwendung dieses rekombinanten Plasmids wurden die Nukleinsäuresequenzen, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen, isoliert.
- Die genomische DNA des Stamms Ty 2 wurde durch die Endonuklease Saci verdaut und die Produkte dieser Restriktion wurden in die SacI-Stelle des Klonierungsvektors pUC18 ligiert. Diese Ligationsmischung wurde verwendet, um den Stamm Escherichia coli HB101 (hinterlegt bei der Collection de l'INSTITUT PASTEUR unter der Referenzbezeichnung CIP 102400) zu transformieren. Die Selektionierung der Transformanten wurde auf Agar-Agar- Nährböden, die 100 µg/ml Ampicillin enthielten, ausgeführt. Nach einer Inkubation für 24 h in einem Wärmeschrank bei 37ºC wurden die Transformanten auf Scheiben aus Cellulosenitratfolie, die auf Agar-Agar-Nährböden, die 100 µg/ml Ampicillin enthielten, gelegt wurden, übertragen. Um zu einer in situ- Hybridisierung zu gelangen, wurden diese Scheiben dann mit einer Denaturierungslösung (NaOH, 0,5 M), dann mit einer Neutralisierungslösung (1M Ammoniumacetat, 0,02 M NaOH) behandelt. Durch diese Behandlungen freigesetzte und denaturierte DNA wurde auf den Cellulosenitratscheiben durch Erwärmen auf 80ºC für 3 h fixiert.
- Diese so behandelten Cellulosenitratscheiben wurden mit dem SacI-Fragment von 2 kb, das das Transposon enthielt und mit ³²P markiert war, hybridisiert. Die Hybridisierungen wurden bei 65ºC für 24 h in 6 x SSC (1 x SSC wird gebildet aus 0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat, pH 7) in Denhardt-Medium (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Rinderserumalbumin) ausgeführt.
- Auf diese Weise wurde ein E.coli HB101-Klon isoliert, der ein rekombinantes Plasmid enthielt, das aus dem Klonierungsvektor pUC18, in den ein SacI-Fragment von 2 kb insertiert war (begrenzt durch die Stellen S&sub1; und S&sub2; in der Restriktionskarte dieses Fragments, das in der Figur 1 als dicker Strich wiedergegeben ist), gebildet war.
- Die genomische DNA des Stamms Ty 2 wurde durch die Endonuklease HindIII verdaut. Die durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennten Verdauungsprodukte wurden durch Kapillarwirkung auf ein Cellulosenitratblatt übertragen. Sie wurden dann unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen mit dem SacI-BamH1-Fragment von 1,1 kb (Fragment A in Figur 1) oder mit dem HindIII-EcoRI-Fragment von 1,3 kb (Fragment B in Figur 1), die beide innerhalb des SacI-Fragments von 2 kb liegen, hybridisiert.
- Es wurde festgestellt, daß das SacI-Fragment von 2 kb von zwei HindIII-Fragmenten der Größe 2,3 kb bzw. 5,6 kb im Genom des Typhi-Stamms Ty 2 (entsprechend einem 7,9 kb-Fragment, das durch die Stellen H&sub1; und H&sub2; in der enzymatischen Restriktionskarte dieses Bereichs, der in der Figur 1 wiedergegeben ist, begrenzt wird) überspannt wird.
- Die DNA des rekombinanten Plasmids, das das SacI-Fragment von 2 kb enthält, wurde durch die Endonukleasen SacI und HindIII geschnitten. Dieser doppelte Verdau setzte ein SacI- HindIII-Fragment von 487 Basenpaaren frei, das in die SacI- und HindIII-Restriktionsstellen des Klonierungsvektors pUC18 kloniert wurde.
- Dieses SacI-HindIII-Fragment von 487 Basenpaaren wird nachstehend als "Sonde für Salmonella" bezeichnet und entspricht der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz (I). Die Lage dieses SacI-HindIII-Fragments innerhalb des SacI-Fragments von 2 kb ist in Figur 1 angezeigt.
- Um diese Kontrolle auszuführen, wurden die verwendeten Stämme 24 h bei 37ºC in 200 µl Nährlösung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Mittels eines Mehrspitzeninokulators wurden diese Stämme 5 h bei 37ºC auf einem Cellulosenitratblatt, das in einem Behälter mit Agar-Agar-Nährboden angeordnet wurde, erneut in Kultur genommen. Das Cellulosenitratblatt wurde dann für in situ-Hybridisierungsversuche behandelt und verwendet.
- Um die Sonde für Salmonella herzustellen wurde das rekombinante Plasmid (pUC18, das das SacI-HindIII-Fragment von 487 Basenpaaren enthielt) durch die Endonukleasen Saci und HindIII verdaut. Nach Auftrennung der Produkte dieses Verdaus durch Elektrophorese in einem Agarosegel wurde die Sonde für Salmonella durch Elektroelution gereinigt. Sie wurde dann mit ³²P durch Nick-Translation (déplacement de césure) markiert.
- Die Hybridisierungsversuche wurden bei 65ºC in 6 x SSC und in Denhardt-Medium für 18 h Reaktionszeit ausgeführt. Unter diesen Versuchsbedingungen wurde die Spezifität der Sonde für Salmonella bei 768 Bakterienstämmen untersucht, die sich zusammensetzten aus 384 Stämmen, die nicht aus der Gattung Salmonella stammten, und 384 Stämmen, die aus der Gattung Salmonella stammten und die sieben Unterarten der Gattung Salmonella repräsentierten. Diese 768 Stämme stammten aus der Collection du Centre Collaborateur de l'OMS de Reference et de Recherche pour les Salmonella und der Sammlung des Centre National pour les Salmonella.
- Keiner der 384 Stämme, die nicht aus der Gattung Salmonella stammten, ergab eine Antwort mit der Sonde für Salmonella.
- Unter den 384 Stämmen von Salmonella ergaben 382 eine Antwort mit der Sonde für Salmonella. Die zwei Stämme, die mit der Sonde für Salmonella keine Antwort ergaben, stammten in einem Falle von dem Serotyp Wedding und im anderen Falle von dem Serotyp Zürich. Es handelt sich in beiden Fällen um den Referenzstamm des Serotyps. Für diese zwei Stämme wurde verifiziert, daß diese im HeLa-Zellkulturmodell nicht-invasiv sind und daß sie weder das zur Sonde für Salmonella homologe Fragment noch das SacI-Fragment von 2 kb enthalten.
- In einem biologischen Erzeugnis ist es gegenwärtig nicht möglich, ein aus einer vorgegebenen Art stammendes Bakterium unter mehreren Zehnmillionen anderen Bakterien nachzuweisen. Um die Anwesenheit einer Salmonella in einem biologischen polymikrobiellen Erzeugnis mittels einer Nukleotidsonde nachweisen zu können, ist es unerläßlich, vorzunehmen:
- - eine Amplifizierung der Anzahl von nachzuweisenden Bakterien, indem die zu analysierende Probe in Kultur genommen wird,
- - und eine Amplifizierung der Anzahl von Kopien der Zielsequenz, die man mit der Nukleotidsonde nachzuweisen wünscht, indem man die Genamplifizierungstechnik (oder Technik der "Polymerase Cham Reaction" (Polymerasekettenreaktion) oder PCR) anwendet.
- Für die Salmonella ist das SacI-HindIII-Fragment von 487 Basenpaaren (die Sonde für Salmonella) für die Gattung Salmonella spezifisch. Wenn man ausgehend von der biologischen, zu analysierenden Probe die Anwesenheit dieses Fragments nachweist, kann daraus geschlossen werden, daß die untersuchte Probe durch Salmonella kontaminiert ist.
- Ausgehend von der Nukleotidsequenz (I) der Sonde für Salmonella wurden zwei Startsequenzen ausgewählt, die für das Ausführen des Genamplifizierungsverfahrens verwendet wurden.
- Die Aneinanderreihungen von 17 Basen, die den zwei Startsequenzen entsprachen und als SS-1 und SS-2 in der vorstehenden Beschreibung bezeichnet wurden, wurden verwendet, um die Anzahl von Kopien für Salmonella zu amplifizieren.
- Dieses Protokoll wurde unter Verwendung des Kits "Gene amp" (eingetragene Marke) von Perkin Elmer Cetus (Bezugs-Nr. 801-0055) entwickelt. Die Startsequenzen SS-1 und SS-2 wurden in der Endkonzentration von 200 pmol eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt, indem 10 µl der Lösung, die die zu amplifizierende DNA enthielt, in einem Endvolumen von 50 µl verwendet wurde. Diese Mischung wurde unter den folgenden Bedingungen 20 Amplifizierungszyklen unter Verwendung der Vorrichtung "DNA thermal cyder" (eingetragene Marke) von Perkin Elmer Cetus (Bezugs-Nr. 801-0177) unterworfen:
- - Denaturierungsschritt bei 94ºC während 120 s,
- - Reassoziierungsschritt bei 68ºC während 180 s,
- - Elongationsschritt bei 72ºC während 90 s.
- Die so amplifizierte DNA wurde durch Elektrophorese (120 Volt, 30 min) in einem Agarosegel, das 2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (BRL; Bezugs-Nr. 5517) und % normale Agarose (Sigma; Bezugs-Nr. A-6877) enthielt, sichtbar gemacht. Nach Elektrophorese wurde die DNA auf ein Cellulosenitratblatt transferiert und mit der mit ³²P markierten Sonde für Salmonella hybridisiert.
- Der Stamm LT2 von Salmonella, serotyp typhimunum, hinterlegt bei der Collection de l'INSTITUT PASTEUR unter der Referenzbezeichnung CIP 60.62T, und der Stamm HB101 von E.coli (CIP 102.400) wurden verwendet, um die Spezifität und die Empfindlichkeit der PCR-Technik unter den vorstehend beschriebenen Versuchsbedingungen zu untersuchen.
- Die die zu amplifizierende DNA enthaltende Lösung wurde auf die folgende Weise hergestellt:
- 1) die gesamten Bakterien werden in 100 µl destilliertem Wasser suspendiert,
- 2) die Bakteriensuspension wird 10 min bei 400ºC in einem Mikrozentrifugationsgefäß behandelt,
- 3) sie wird dann 3 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Unter Aussparung des Zentrifugationsniederschlags werden 10 µl dieser Lösung entnommen, um die Genamplifikation vorzunehmen.
- Wenn man eine Reinkultur des Stamms LT2 des Salmonella Serotyps typhimunum verwendet, weist man die DNA von 10 oder weniger als 10 Bakterien in 10 µl einer der Amplifikation unterworfenen Lösung nach. Wenn man den Stamm HB101 von E. coli verwendet, ist keinerlei Amplifizierung in 10 µl einer der Amplifikation unterworfenen Lösung nachweisbar, selbst wenn man mit 10&sup6; Bakterien entsprechender DNA arbeitet. Wenn man eine Mischung der zwei Bakterienstämme herstellt, weist man die DNA von 100 oder weniger als 100 Salmonella, die mit der DNA von 10&sup6; E.coli HB101 gemischt wurden, in 10 µl der einer Amplifikation unterworfenen Lösung nach.
- Die verwendete Probe ist eine Charge von für die Ernährung von Tieren bestimmtem Hackfleisch. Es ist sehr stark durch gram-positive oder -negative, aerobe oder anaerobe Bakterien kontaminiert. Eine unter dem Mikroskop vorgenommene ungefähre Zählung ermöglicht es, die Gesamtzahl an Bakterien zu 10&sup9; pro Gramm Hackfleisch zu bestimmen. Durch Zählung auf Gefäßen mit Agar-Agar-Nährboden wurde die Anzahl aerober, auf diesem Medium gezüchteter Bakterien zu 10&sup8; pro Gramm Hackfleisch bestimmt. Diese Probe enthält keine Salmonella: drei mit den klassischen Verfahren der Lebensmittelbakteriologie ausgeführte Analysen erwiesen sich als negativ.
- Die Probe wird rekonstituiert, indem unterschiedliche Anzahlen von Salmonella Serotyp typhimunum (10, 10², 10³, 10&sup4;, 10&sup5; oder 10&sup6;) 25 g Hackfleisch zugesetzt werden. Diese rekonstituierte Probe wird in 200 ml Tryptocasein-Soja-Nährlösung in einem 1 l-Erlenmeyerkolben für 18 h bei 37ºC unter Bewegung in Kultur genommen. Auf identische Weise werden 25 g Hackfleisch ohne Salmonella behandelt.
- Am darauffolgenden Tag wurde der Erlenmeyerkolben 15 min auf dem Labortisch ohne Bewegung bei Labortemperatur stehengelassen, um den größeren Debris sedimentieren zu lassen. Man entnimmt dann an der Oberfläche 1 ml Nährlösung, die in ein Mikrozentrifugationsgefäß überführt und 3 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert wird. Der Überstand wird vollständig mittels einer Pasteurpipette entfernt. Der bakterielle Niederschlag wird in 100 µl destilliertem Wasser vollständig resuspendiert, dann 10 min 100ºC unterworfen. Man zentrifugiert erneut für 3 min bei maximaler Geschwindigkeit. Unter Aussparung des Zentrifugationsniederschlags werden 10 µl dieser Lösung abgenommen, um die Genamplifikation unter den bereits angegebenen Bedingungen auszuführen.
- Wenn man 25 g der Probe ohne Salmonella nimmt, kann man keinerlei Amplifizierung der darin enthaltenen DNA in den 10 µl amplifizierter Lösung nachweisen. Wenn man 25 g der Probe, die 10² oder mehr als 10² Salmonella enthält, weist man eine Amplifikation der darin enthaltenen DNA in den 10 µl der amplifizierten Lösung nach.
Claims (21)
1. Nukleinsäuresequenz,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Gesamtheit oder einen Teil
der Sequenz von 7,9 kb umfaßt, die von den zwei
HindIII-Stellen, die durch H&sub1; und H&sub2; in der in Figur 1 dargestellten
Restriktionskarte der Sequenz aus dem Stamm Salmonella Typhi
Ty2 bezeichnet werden, begrenzt wird und die die genetische
Information enthält, die für die Aktivität einer in vitro-
Infektion der HeLa-Zellen in Kultur notwendig ist.
2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz von 2 kb, die von
den zwei SacI-Stellen, die durch S&sub1; und S&sub2; in der in Figur 1
dargestellten Restriktionskarte bezeichnet werden, begrenzt
wird, oder einen Teil dieser Sequenz umfaßt, die für die
Aktivität einer in vitro-Infektion von HeLa-Zellen in Kultur
notwendig ist.
3. Nukleinsäuresequenz, die die Gesamtheit oder einen Teil
der genetischen Information trägt, die für die Aktivität einer
in vitro-Infektion der HeLa-Zellen in Kultur durch die
Bakterien der Gattung Salmonella notwendig ist, und die in der Lage
ist, mit einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1
oder 2 unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
4. Nukleinsäuresequenz, die durch eine Aufeinanderfolge von
ungefähr 200 bis 500 Nukleotiden gebildet wird, die von einer
Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abstammt und als Sonde
für den in vitro-Nachweis von Bakterien der Gattung Salmonella
verwendet werden kann.
5. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 4,
gekennzeichnet durch die folgende Aneinanderreihung von
Nukleotiden (I):
6. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 4 oder Anspruch 5,
gekennzeichnet dadurch, daß sie gemäß dem universellen
genetischen Code der folgenden Aminosäuresequenz (II) entspricht:
7. Nukleinsäuresequenz,
die durch eine Aufeinanderfolge von ungefähr 10 bis 30
Nukleotiden gebildet wird, die von einer Sequenz nach einem der
Ansprüche 1 bis 6 abstammt und die als Nukleinsäurestartsequenz
für die Genamplif ikation einer Sequenz nach einem der Ansprüche
1 bis 5 verwendet werden kann.
8. Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 7,
die für die Amplifikation der Nukleinsäuresequenz verwendet
werden können, die durch die an den Positionen 26 und 469 der
Nukleotidaneinanderreihung (I) nach Anspruch 6 oder Anspruch 7
befindlichen Nukleotide begrenzt wird, unddie durch die
folgenden Nukleotidaneinanderreihungen gekennzeichnet sind:
9. Polypeptid,
das gemäß dem universellen genetischen Code einer
Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 entspricht.
10. Polypeptid,
das durch die Gesamtheit oder einen Teil der folgenden
Aminosäuresequenz (II) gebildet wird, wobei diese Sequenz gemäß dem
universellen genetischen Code der in Anspruch 5 definierten
Nukleinsäuresequenz (I) entspricht:
11. Polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch
ein Polypeptid nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 erkennen
können.
12. Verfahren zum in vitro-Nachweis der etwaigen Anwesenheit
von Bakterien der Gattung Salmonella in einer biologischen
Probe, die diese möglicherweise enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- gegebenenfalls die Probe in Kultur zu nehmen,
- gegebenenfalls die Anzahl von Kopien der nachzuweisenden
Nukleinsäuresequenz mittels eines Paares
Nukleinsäurestartsequenzen nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 zu amplifizieren,
- die Probe mit einer Nukleinsäuresonde nach einem der
Ansprüche 4 bis 6 unter den in Anspruch 4 definierten
Hybridisierungsbedingungen in Kontakt zu bringen,
- zwischen der vorstehend genannten Sonde und der
nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz gebildete Hybridisierungskomplexe
gegebenenfalls nachzuweisen.
13. Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Amplifizierung der
nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz die folgenden Schritte
umfaßt:
- einen Schritt einer Extraktion der nachzuweisenden
Nukleinsäure, die aus dem Genom der Bakterien der Gattung Salmonella
stammt, die möglicherweise in der biologischen Probe anwesend
sind, und gegebenenfalls einen Schritt einer Behandlung dieser
Nukleinsäure mittels einer inversen Transkriptase, sofern die
Nukleinsäure in Form von RNA vorliegt,
- einen Zyklus, der die folgenden Schritte umfaßt:
eine Denaturierung der nachzuweisenden doppelsträngigen
Nukleinsäure, was zur Bildung einer einzelsträngigen
Nukleinsäure führt,
eine Hybridisierung jedes der aufgrund des
vorangegangenen Denaturierungsschritts erhaltenen Nukleinsäurestränge mit
mindestens einer Startsequenz nach Anspruch 7 oder Anspruch 8,
indem die vorstehend genannten Stränge mit mindestens einem
Paar vorstehend genannter Startsequenzen in Kontakt gebracht
werden,
ausgehend von den Startsequenzen eine Bildung zu den
Strängen komplementärer DNAs, mit denen sie hybridisiert sind,
in Gegenwart einer DNA-Polymerase und geeigneter Mengen der
vier verschiedenen Nukleosidtriphosphate (dNTP), was zu der
Bildung einer größeren Anzahl von nachzuweisenden
doppelsträngigen Nukleinsäuren führt als bei dem vorangegangenen
Denaturierungsschritt, wobei dieser Zyklus eine festgelegte Anzahl
von Malen wiederholt wird, um die nachzuweisende
Nukleinsäuresequenz, die möglicherweise in der biologischen Probe anwesend
ist, in einer ausreichenden Menge, um deren Nachweis zu
ermöglichen, zu erhalten.
14. Kit zum Ausführen eines Verfahrens nach Anspruch 12 oder
Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß er enthält:
- gegebenenfalls ein geeignetes Medium, um die biologische
Probe in Kultur zu nehmen,
- mindestens ein Paar Nukleinsäurestartsequenzen nach
Anspruch 7 oder Anspruch 8,
- gegebenenfalls geeignete Reagenzien, um den
Amplifizierungszyklus durchzuführen, insbesondere DNA-Polymerase und
geeignete Mengen der 4 verschiedenen Nukleosidtriphosphate,
- eine (oder mehrere) Nukleinsäuresonde(n) nach einem der
Ansprüche 4 bis 6, die markiert sein können, die mit der (oder
den) nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en) hybridisieren
können,
- geeignete Reagenzien, um die Hybridisierungsreaktion
zwischen der (oder den) Sonde(n) und der (oder den) vorstehend
genannten nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en) zu
bewerkstelligen,
- ein biologisches Referenzgewebe oder eine biologische
Referenzflüssigkeit, das bzw. die frei ist von Nukleinsäure
sequenzen, die mit der (oder den) vorstehend genannten Sonde(n)
hybridisieren können.
15. Verfahren zum in vitro-Nachweis der etwaigen Anwesenheit
von Bakterien der Gattung Salmonella in einer biologischen
Probe, die diese möglicherweise enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- gegebenenfalls die biologische Probe in Kultur zu nehmen,
- gegebenenfalls nach dem in Anspruch 13 definierten
Verfahren die Anzahl von Kopien der Nukleinsäuresequenz(en),
die gemäß dem universellen genetischen Code dem oder den
nachzuweisenden Polypeptid(en) entspricht bzw. entsprechen, zu
amplifizieren,
- die vorstehend genannte Probe mit Antikörpern nach
Anspruch 11 in Kontakt zu bringen,
- die zwischen den Antikörpern und der (oder den)
nachzuweisenden Peptidsequenz(en) gebildeten immunologischen Komplexe
gegebenenfalls nachzuweisen.
16. Kit zum Ausführen eines Verfahrens nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet, daß er enthält:
- gegebenenfalls ein geeignetes Medium, um die biologische
Probe in Kultur zu nehmen,
- gegebenenfalls ein Paar Nukleinsäurestartsequenzen nach
Anspruch 7 oder Anspruch 8 und geeignete Reagenzien, um den
Amplifizierungszyklus durchzuführen, insbesondere
DNA-Polymerase und geeignete Mengen der 4 verschiedenen
Nukleosidtriphosphate,
- polyklonale oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 11,
die markiert sein können, insbesondere radioaktiv oder
enzymatisch, mit der (oder den) nachzuweisenden Peptidsequenz(en),
- die Reagenzien für die Konstitution des zur Ausführung der
immunologischen Reaktion zwischen den Antikörpern und der (oder
den) vorstehend genannten Peptidsequenz(en) geeigneten Mediums,
- die Reagenzien, die den Nachweis der aufgrund der
vorstehend genannten immunologischen Reaktion gebildeten
immunologischen Komplexe erlauben,
- ein biologisches Referenzgewebe oder eine biologische
Referenzflüssigkeit, das bzw. die frei ist von Polypeptiden,
die von den vorstehend genannten Antikörpern erkannt werden
können
17. Rekombinante Nukleinsäure, die mindestens eine
Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, die in
eine hinsichtlich der genannten Nukleinsäuresequenz heterologe
Nukleinsäure insertiert ist.
18. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleinsäuresequenz nach einem
der Ansprüche 1 bis 8 ein Promotor (insbesondere ein
induzierbarer Promotor) vorangeht, unter dessen Kontrolle die
Transkription der genannten Sequenz bewirkt werden kann, und dieser
Nukleinsäuresequenz gegebenenfalls eine Sequenz folgt, die
Transkriptionsterminationssignale kodiert.
19. Rekombinante Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide oder
Phagen, die eine rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 17
oder Anspruch 18 in einer ihrer Stellen, die für ihre
Replikation nicht essentiell sind, enthalten.
20. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch
9 oder Anspruch 10 durch Transformation eines zellulären Wirts
mittels eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 19, gefolgt
von dem In-Kultur-Nehmen des so transformierten zellulären
Wirts und von der Gewinnung des Polypeptids in dem
Kulturmedium.
21. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch
9 oder Anspruch 10, das die folgenden Schritte umfaßt:
- gegebenenfalls die Amplifizierung der Menge von
Nukleotidsequenzen, die das Polypeptid kodieren, mittels zweier DNA-
Startsequenzen nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, die so
ausgewählt werden, daß eine dieser Startsequenzen identisch mit 10
bis 30 ersten Nukleotiden der Nukleotidsequenz ist, die das
genannte Polypeptid kodiert, wohingegen die andere Startsequenz
zu den 10 bis 30 letzten Nukleotiden der Nukleotidsequenz
komplementär ist (oder mit diesen 10 bis 30 letzten Nukleotiden
der Nukleotidsequenz hybridisiert) oder umgekehrt, daß eine
dieser Startsequenzen mit 10 bis 30 letzten Nukleotiden dieser
Sequenz identisch ist, wohingegen die andere Startsequenz zu
den 10 bis 30 ersten Nukleotiden der Nukleotidsequenz
komplementär ist, gefolgt von der Einführung der genannten so
amplifizierten Nukleotidsequenzen in einen geeigneten Vektor,
- das In-Kultur-Nehmen eines vorab mit einem Vektor nach
Anspruch 19 transformierten zellulären Wirts in einem
geeigneten Kulturmedium,
- die Gewinnung des von dem transformierten zellulären Wirt
produzierten Polypeptids aus dem vorstehend genannten
Kulturmedium.
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