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Die
Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen
und deren Verwendung, insbesondere zur in vitro-Diagnose des Vorliegens
von Bakterien der Gattung Salmonella in einer biologischen Probe,
die diese möglicherweise
enthält,
und insbesondere in Lebensmittelerzeugnissen.
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Lebensmittelerzeugnisse
erlangen gegenwärtig
eine zunehmende Bedeutung. Aus gesellschaftlichen Gründen besteht
nach wie vor eine verstärkte
Nachfrage nach verarbeiteten, verbrauchsfertigen Nahrungsmitteln
von Seiten der Käufer.
Dies führt
dazu, dass sich die Produktionsstätten und die Darbietung dieser
Erzeugnisse während
der letzten fünfzehn
Jahre beträchtlich
verändert
haben (Massenfertigung in spezialisierten Betrieben; Vertrieb in
abgepackten Einheiten, im Allgemeinen unter Kunststofffolie).
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Aus
Gründen
der öffentlichen
Gesundheit werden die Fertigungstechnologie und die Produkte selbst einer
zunehmend strengeren hygienischen Überwachung unterworfen. Im
Rahmen der bakteriologischen Kontrollen wird systematisch auf die
Bakterien, die für
Lebensmittelvergiftungen verantwortlich sind, untersucht und unter
diesen sind es Salmonella, denen besondere Aufmerksamkeit geschenkt
wird. Die gesundheitlichen Normen sind überdies für diese Bakteriengattung sehr
deutlich: Abwesenheit von Salmonella in 25 g Erzeugnis.
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Vom
Standpunkt der Taxonomie stammt die Gattung Salmonella aus der Familie
der Enterobacteriaceae. Diese Gattung umfasst eine einzige und alleinige
Art, S. enterica, die in sieben Unterarten unterteilt werden kann.
Innerhalb jeder dieser Unterarten kann man eine große Anzahl
von Serotypen mit Hilfe von Seren identifiziert werden, die gegen
die O-Polysaccharid-Antigene und die H-Flagellen-Antigene gerichtet
sind. 1989 waren 2267 Serotypen von Salmonella bekannt.
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Salmonella
sind enteroinvasive Bakterien, die für Mensch und Tier pathogen
sind. Ihr pathogenes Vermögen
hängt mit
ihrer Fähigkeit
zusammen, in das Darmepithel einzudringen. Dieser Schritt kann beispielsweise
im Falle einer Vergiftung auf die Schleimhaut beschränkt sein
oder ihm kann eine systemische Verbreitung folgen (im Falle von
Typhus). Die Kontamination des Wirts durch Salmonella findet in
der weitaus größten Mehrzahl
der Fälle
auf oralem Weg statt. Dies erklärt,
warum im Rahmen bakteriologischer Kontrollen biologischer Proben
systematisch auf Salmonelle untersucht wird.
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Das
Referenzverfahren einer systematischen Untersuchung auf Salmonella,
das von der Association Francaise de Normalisation (AFNOR) empfohlen
wird, umfasst: das Inkulturbringen des zu analysierenden Produkts
in zwei unterschiedlichen Anreicherungsmedien, die bei zwei unterschiedlichen
Temperaturen inkubiert und über
zwei unterschiedliche Selektionsmedien isoliert werden (diesem Schritt
geht häufig
ein Schritt einer „Wiederbelebung" in einer Nährlösung voraus);
Umsetzen von mindestens 6 Kolonien auf Medien zur raschen Identifizierung;
zuletzt eine serologische Typisierung des Stamms. Wenn das AFNOR-Protokoll
aus Anlass eines offiziellen Gutachtens genau befolgt werden muss,
stellt man fest, dass es im Rahmen systematischer Kontrollen aufgrund
der für
die Durchführung
der Prüfung
erforderlichen Zeit (mindestens eine Woche) und dessen Selbstkostenpreis
schwierig anzuwenden ist.
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Neue
Verfahren zur Untersuchung auf Salmonella beruhen entweder auf enzymatischen
Tests oder auf der Verwendung von Nukleinsäuresonden. Es sei unterstrichen,
dass in diesen Fällen
ein Schritt einer Kultivierung in Vollmedium und eine Subkultivierung
in einem Anreicherungsmedium empfohlen werden, ja sogar unabdingbar
sind.
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Die
immunenzymatischen Tests, die monoklonale Antikörper einsetzen, sind leicht
durchzuführen,
liefern Ergebnisse in vier bis sechs Stunden und haben einen erschwinglichen
Selbstkostenpreis. Ihr großer Nachteil
besteht in der Tatsache, dass sie häufig falsche Positivreaktionen
und gelegentlich falsche Negativreaktionen liefern. Die Konsequenzen
dieser falschen Reaktionen sind in beiden Fällen beträchtlich: wenn es sich um eine
falsche Positivreaktion handelt, wird eine Beschlagnahme des Produkts
erfolgen und durch das Analysenlabor ein Prozess in Gang gesetzt,
um ein Salmonella-Bakterium zu isolieren, das nicht existiert; wenn
es sich um eine falsche Negativreaktion handelt, wird das Produkt
in den Handel gebracht, mit den Risiken, die dies für die öffentliche
Gesundheit mit sich bringt.
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Eine
vor kurzem durchgeführte
Studie an 250 Stämmen
von Salmonella und 75 Bakterienstämmen, die nicht aus der Gattung
Salmonella stammen, hat zu 17 falschen Positivreaktionen und 2 falschen
Negativreaktionen geführt
(D'AOUST, J. Y., (1987): „Efficacité de la
trousse immunoenzymatique BIOENZABEAD pour le dépistage de Salmonella spp.
dans les aliments",
Microorganismes et Aliments: Technique Rapide, Contrôle industriel;
Colloque de la Socété Francaise
de Microbiologie, Paris). Da diese Untersuchung an Reinkulturen durchgeführt wurde,
kann man sich vorstellen, dass die Anzahl an Falschreaktionen bei
polymikrobiellen Produkten noch beträchtlicher sein wird (durch
Mikroben verursachte Kompetition; Risiko antigener Kreuzreaktionen).
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Die
Nukleinsäuresonden
bestehen aus einem Fragment genomischer DNA (FITTS, R. et al. (1983) „DNA-DNA
Hybridization Assay For Detection Of Salmonella spp." in Fonds, Applied
and Environmental Microbiology, 46, 1146-1151). Sie werden als spezifisch
angesehen. Es existieren mehrere im Handel vertriebene Zusammenstellungen
(oder Kits). Tatsächlich
scheinen diese Sonden zwei hauptsächliche Nachteile aufzuweisen:
ihr Mangel bei der Spezifität
hinsichtlich der durch die Verwender mitgeteilten Ergebnisse (beispielsweise Kreuzreaktion
mit Citrobacter) und ihr Mangel hinsichtlich der Empfindlichkeit
(untere Nachweisgrenze: 105 Salmonella;
oder gemäß bestimmten
Autoren 2,5 μg
DNA, was ungefähr
107 Bakterien entspricht).
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Die
Erfindung hat speziell Nukleinsäuresequenzen
zum Gegenstand, die als Nukleinsäuresonden
zum Nachweis von Salmonella geeignet sind, wobei diese Sonden eine
perfekte Spezifität
für die
Gattung Salmonella aufweisen (keine Kreuzreaktion mit anderen Bakterien,
insbesondere mit den Bakterien der Gattung Citrobacter).
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Die
Erfindung hat gleichfalls die Verwendung dieser Nukleinsäuresonden
bei in vitro-Verfahren zum Nachweis oder zur mengenmäßigen Bestimmung
von Salmonella zum Gegenstand, wobei diese die folgenden Vorteile
aufweist:
- – hohe
Empfindlichkeit;
- – schnelle
Antwort: das Analysenergebnis kann in 48 Stunden, ja sogar 24 Stunden
erhalten werden;
- – leichte
Durchführung,
insbesondere ohne Einsatz eines radioaktiven Produkts;
- – angemessener
Selbstkostenpreis.
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Die
Salmonella-Unterart enterica Serotyp Typhi (ein Bakterium, das im
Folgenden als „Typhi" bezeichnet wird)
ist der Erreger von Typhus beim Menschen. Dieses Bakterium ist für den Menschen
hochgradig pathogen. In der Folge einer Kontamination auf oralem
Wege überwindet
Typhi die Darmbarriere, um die Ganglia mesenterica zu befallen dank
eines genetischen Systems, welches ihm gestattet, sich an die Epithelzellen
der Darmschleimhaut anzuheften und in diese einzudringen. Aus Mangel
an einem experimentellen Modell wird dieser erste Schritt der Infektion
in vitro an HeLa-Zellen in Kultur untersucht, weil Typhi in der
Lage ist, sich an diese Zellen anzuheften und in diese einzudringen.
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Die
Erfindung hat speziell eine isolierte Nukleinsäuresequenz zum Gegenstand,
die geeignet ist, als Sonde und/oder Primer zum in vitro-Nachweis
von Bakterien der Gattung Salmonella verwendet zu werde, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie geeignet ist, bei 65°C in 6 × SSC in
Denhardt-Lösung
mit einem 7,9 kb großen
HindIII-Fragment vom Stamm Salmonella TyphiTy2 zu hybridisieren,
welches die folgende Aneinanderreihung von Nukleotiden (I) aufweist:
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Die
Erfindung hat genauer jede Nukleinsäuresequenz, wie sie zuvor definiert
wurde, zum Gegenstand, die die gesamte oder einen Teil der Sequenz
von 7,9 kb umfasst, welche von den zwei HindIII-Schnittstellen begrenzt
wird, die mit H1 und H2 in
der in 1 dargestellten Restriktionskarte der besagten
Sequenz bezeichnet sind.
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Die
Sequenzen, mit denen die Nukleinsäuren der Erfindung hybridisieren,
stammen aus dem Genom des Stamms Ty2 von Typhi, der bei der Collection
de I' Institut Pasteur
unter der Nr. CIP 55-35 hinterlegt ist.
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Die
Anmeldung beschreibt auch jede Nukleinsäuresequenz, die aus dem Genom
des obengenannten Stamms Ty2 stammt, wobei diese Sequenz die gesamte
oder einen Teil der 2 kb großen
Sequenz umfasst, die durch die zwei SacI-Schnittstellen begrenzt
wird, die in der in 1 dargestellten Restriktionskarte
mit S1 und S2 bezeichnet
werden.
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Allgemeiner
offenbart die Anmeldung jede Nukleinsäuresequenz, die die gesamte
oder einen Teil der genetischen Information aufweist, die für die Aktivität einer
in vitro-Infektion von HeLa-Zellen in Kultur durch die Bakterien
der Gattung Salmonella notwendig ist, und die geeignet ist, mit
der gesamten oder einem Teil von mindestens einer der zuvor definierten
Nukleinsäuresequenzen
unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Diese stringenten
Bedingungen sind folgende: 18 Stunden lang 65°C in 6 × SSC (1 × SSC besteht aus: 0,15 M NaCl
und 0,015 M Trinatriumcitrat bei pH 7) in Denhardt-Medium (0,1%
Ficoll; 0,1% Polyvinylpyrrolidon; 0,1% Rinderserumalbumin).
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls jede Nukleinsäuresequenz, die in der Lage
ist, mit einer der zuvor definierten Sequenzen unter den zuvor definierten
Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, und die als Sonde einsetzbar
ist für
die Durchführung
eines in vitro-Nachweisverfahrens von Bakterien der Gattung Salmonella
und insbesondere der pathogenen Salmonella, wie etwa Typhi, die
sich an die Epithelzellen der Darmschleimhaut im Organismus anheften
und in diese eindringen können.
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Vorteilhafterweise
bestehen die Nukleinsäuresonden
der Erfindung aus einer Abfolge von ungefähr 200 bis 500 Nukleotiden.
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Zu
diesem Zweck beschreibt die Anmeldung eine Nukleinsäuresonde,
die durch die folgende Aneinanderreihung von Nukleotiden (I) gekennzeichnet
ist:
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls jede Nukleinsäuresequenz, die geeignet ist,
mit den zuvor definierten Nukleinsäuresequenzen unter den zuvor
definierten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, und die
als Nukleinsäureprimer
für die
Ge namplifikation einer der in der Anmeldung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen
eingesetzt werden kann.
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Es
ist von Vorteil, wenn die Nukleinsäureprimer der Erfindung aus
einer Abfolge von ungefähr
10 bis 30 Nukleotiden bestehen.
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Die
Genamplifikationsmethoden sind ein bedeutender Beitrag zur Entwicklung
von besonders empfindlichen in vitro-Diagnoseverfahren. Unter diesen
Genamplifikationsmethoden kann man die PCR(Polymerase Chain Reaction)-Methode,
wie sie in den
Europäischen Patentanmeldungen
Nr. 86/302 298.4 vom 27.3.1986 und Nr.
87/300 203.4 vom 9.1.1987 beschrieben
ist, oder auch die sogenannte „Qβ-Replikase"-Methode, die in
Biotechnology, Bd. 6, Seite 1197 (Oktober 1988) beschrieben ist
und die mit Hilfe einer RNA-Polymerase (T7-RNA-Polymerase) arbeitet,
die in der Internationalen Patentanmeldung Nr.
WO 89/01050 beschrieben ist, nennen.
Diese Methoden gestatten, die Empfindlichkeit eines Nachweises von
Nukleinsäuren von
Viren oder Bakterien zu verbessern, und erfordern die Verwendung
von spezifischen Syntheseprimern.
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Ebenso
Teil der Erfindung sind die in Bezug auf die zuvor definierte Nukleinsäuresequenz
(I) abgewandelten Nukleinsäuren,
die bestimmte lokalisierte Mutationen umfassen, mit der Maßgabe, dass
diese abgewandelten Nukleinsäuren
mit der vorstehend definierten Sequenz (I) unter den zuvor in der
Beschreibung definierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
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Die
Anmeldung beschreibt gleichfalls jedes Peptid oder Polypeptid, das
gemäß dem universellen
genetischen Code einer Nukleinsäuresequenz
der Erfindung entspricht.
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Zu
diesem Zweck offenbart die Anmeldung insbesondere jedes Polypeptid,
das aus der gesamten oder einem Teil der folgenden Aminosäuresequenz
(II) besteht, wobei diese Sequenz gemäß dem universellen genetischen
Code der zuvor beschriebenen Nukleinsäuresequenz (I) entspricht:
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Es
versteht sich von selbst, dass jede Peptidsequenz, die sich aus
der Modifikation, durch Substitution und/oder durch Hinzufügen und/oder
Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren eines Polypeptids der
Anmeldung und insbesondere der zuvor beschriebenen Peptidsequenz
(II) oder einer Peptidsubsequenz, die von Letzterer abstammt, ergibt,
im Rahmen der vorliegenden Anmeldung offenbart ist, solange diese
Modifikation die antigenen Eigenschaften des besagten Polypeptids
nicht verändert.
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Die
Anmeldung beschreibt gleichfalls polyklonale oder monoklonale Antikörper, die
geeignet sind, spezifisch die zuvor beschriebenen Polypeptide zu
erkennen und immunologische Komplexe mit Letzteren zu bilden.
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Diese
polyklonalen Antikörper
werden durch Immunisierung eines Tieres mit den Polypeptiden erhalten,
gefolgt von der Rückgewinnung
der gebildeten Antikörper.
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Diese
monoklonalen Antikörper
werden durch jedes Hybridom produziert, das durch klassische Verfahren
einerseits ausgehend von Milzzellen eines Tieres, insbesondere von
Maus oder Ratte, die gegen eines der gereinigten Polypeptide, die
in der Anmeldung beschrieben sind, immunisiert wurden, und andererseits von
Zellen einer geeigneten Myelomzellinie gebildet werden kann, und
das hinsichtlich seiner Fähigkeit,
monoklonale Antikörper
zu produzieren, die das ursprünglich
zur Immunisierung der Tiere eingesetzte Polypeptid erkennen, selektioniert
werden kann.
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahrem zum in vitro-Nachweis
(oder -Diagnose) des etwaigen Vorliegens von Bakterien der Gattung
Salmonella in einer biologischen Probe, die diese enthalten kann,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:
- – gegebenenfalls
die Probe in Kultur zu bringen,
- – gegebenenfalls
die Amplifikation der Anzahl an Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz
mit Hilfe eines Paares von Nukleinsäureprimern, wie sie zuvor definiert
wurden,
- – die
Probe mit einer Nukleinsäuresonde,
wie sie zuvor definiert wurde, unter den zuvor erwähnten Hybridisierungsbedingungen
in Kontakt zu bringen,
- – den
etwaigen Nachweis der zwischen der zuvor erwähnten Sonde und der nachzuweisenden
Nukleinsäuresequenz
gebildeten Hybridisierungskomplexe.
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Der
Schritt des Inkulturbringens der biologischen Probe erfolgt vorteilhaft
auf die folgende Art und Weise: 25 g der biologischen Probe werden
in 200 ml Nährstofflösung in
einem Erlenmeyerkolben 18 h bei 37°C unter Bewegung kultiviert.
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Der
Schritt der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz
in dem zuvor erwähnten
Verfahren umfasst vorteilhafterweise die folgenden Schritte:
- – einen
Schritt der Extraktion der nachzuweisenden Nukleinsäure, die
aus dem Genom der Bakterien der Gattung Salmonella stammt, die möglicherweise
in der biologischen Probe vorliegen, und gegebenenfalls einen Schritt
einer Behandlung der besagten Nukleinsäure mittels einer reversen
Transkriptase, sofern diese in Form von RNA vorliegt,
- – einen
Zyklus, der die folgenden Schritte umfasst:
• einen Schritt
der Denaturierung der nachzuweisenden doppelsträngigen Nukleinsäure, was
zur Bildung einer einzelsträngigen
Nukleinsäure
führt;
dieser Schritt wird vorteilhafterweise 120 Sekunden lang bei 94°C durchgeführt;
• einen Schritt
der Reassoziierung durch Hybridisierung jedes der aufgrund des vorhergehenden
Denaturierungsschritts erhaltenen Nukleinsäurestränge mit mindestens einem Primer,
wie er zuvor definiert wurde, indem die zuvor erwähnten Stränge mit
mindestens einem Paar der zuvor erwähnten Primer in Kontakt gebracht
werden; dieser Schritt wird vorteilhafterweise 180 Sekunden lang
bei 68°C
durchgeführt.
• einen Schritt
der Verlängerung
durch Bildung von DNA, ausgehend von den Primern, die zu den Strängen komplementär sind,
mit denen sie hybridisiert sind, in Gegenwart einer DNA-Polymerase
und geeigneter Mengen der vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), was zur Bildung einer größeren Anzahl
von nachzuweisenden doppelsträngigen
Nukleinsäuren
führt als
bei dem vorhergehenden Denaturierungsschritt; dieser Schritt wird
vorteilhafterweise 90 Sekunden lang bei 72°C durchgeführt, wobei dieser Zyklus eine
festgelegte Anzahl von Malen wiederholt wird (vorzugsweise zwischen
20- und 30-mal), um die besagte nachzuweisende Nukleinsäuresequenz,
die möglicherweise
in der biologischen Probe vorliegt, in einer ausreichenden Menge
zu erhalten, um deren Nachweis zu ermöglichen.
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Andere
Verfahren zur Amplifikation und/oder zum Nachweis von für Salmonella
charakteristischen Nukleinsäuresequenzen,
die die Sonden und gegebenenfalls die zuvor beschriebenen Nukleinsäureprimer
verwenden, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar.
Zu diesem Zweck könnte
man das in der Internationalen Patentanmeldung
WO 85/06700 beschriebene Verfahren
oder ferner das in der
Europäischen Patentanmeldung
Nr. 0357336 beschriebene Verfahren anführen.
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Die
Erfindung hat gleichfalls Kits zur Durchführung eines Verfahrens zum
in vitro-Nachweis
von Bakterien der Gattung Salmonella zum Gegenstand, wie es zuvor
beschrieben wurde, wobei diese Kits umfassen:
- – gegebenenfalls
ein geeignetes Medium, um die biologische Probe in Kultur zu bringen,
- – mindestens
ein Paar der zuvor beschriebenen Nukleinsäureprimer,
- – gegebenenfalls
geeignete Reagenzien, um den Amplifikationszyklus durchzuführen, insbesondere DNA-(oder
RNA-)Polymerase und geeignete Mengen der 4 unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate,
- – eine
(oder mehrere) Nukleinsäuresonde(n),
wie sie zuvor beschrieben wurden, die markiert sein können und
die in der Lage sind, mit der (oder den) nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en)
zu hybridisieren
- – geeignete
Reagenzien, um die Hybridisierungsreaktion zwischen der (oder den)
Sonde(n) und der (oder den) oben erwähnten nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen
durchzuführen.
- – ein
biologisches Referenzgewebe oder -fluid, das frei ist von Nukleinsäuresequenzen,
die geeignet sind, mit der (oder den) oben erwähnten Sonde(n) zu hybridisieren.
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Die
Anmeldung offenbart gleichfalls ein Verfahren zum in vitro-Nachweis
des etwaigen Vorliegens von Bakterien der Gattung Salmonella in
einer biologischen Probe, die diese möglicherweise enthält, das
dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:
- – gegebenenfalls
die biologische Probe auf die zuvor angegebene Art und Weise in
Kultur zu bringen,
- – gegebenenfalls
die Amplifikation der Anzahl an Kopien der Nukleinsäuresequenz,
die gemäß dem universellen
genetischen Code dem nachzuweisenden Polypeptid entspricht (wobei
diese Amplifikation entsprechend dem zuvor beschriebenen Amplifikationszyklus
erfolgt),
- – die
oben erwähnte
Probe mit erfindungsgemäßen Antikörpern in
Kontakt zu bringen, die geeignet sind, einen immunologischen Komplex
mit dem (oder den) nachzuweisenden Peptidsequenzen zu bilden,
- – den
etwaigen Nachweis von immunologischen Komplexen, die zwischen den
besagten Antikörpern
und der (oder den) nachzuweisenden Peptidsequenzen gebildet werden.
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Die
Erfindung beschreibt gleichfalls Kits für die Durchführung des
zuvor beschriebenen Nachweisverfahrens, die enthalten:
- – gegebenenfalls
ein geeignetes Medium, um die biologische Probe in Kultur zu bringen,
- – gegebenenfalls
ein Paar der zuvor beschriebenen Primer und geeignete Reagenzien,
um den Amplifikationszyklus durchzuführen, insbesondere DNA-(oder RNA-)Polymerase
und geeignete Mengen der 4 unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate,
- – polyklonale
oder monoklonale Antikörper,
die markiert sein können,
insbesondere auf radioaktive oder enzymatische Weise, mit der (oder
den) nachzuweisenden Peptidsequenzen,
- – die
Reagenzien für
die Erzeugung des zur Durchführung
der immunologischen Reaktion zwischen den Antikörpern und der (oder den) oben
erwähnten
Peptidsequenz(en) geigneten Mediums,
- – die
Reagenzien, die den Nachweis der durch die oben genannte immunologischen
Reaktion gebildeten immunologischen Komplexe ermöglichen. Solche Reagenzien
können
gleichfalls einen Marker tragen oder geeignet sein, ihrerseits durch
ein markiertes Reagenz erkannt zu werden,
- – ein
biologisches Referenzgewebe oder -fluid, das frei ist von Polypeptiden,
die von den oben erwähnten Antikörpern erkannt
werden können.
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Die
Anmeldung lehrt gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung der zuvor
beschriebenen Nukleinsäuresequenzen,
wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- – Inkubation
der genomischen DNA, die aus einem Bakterium Salmonella typhi isoliert
worden ist, durch Behandlung mit Natronlauge bei pH 12,5
- – Behandlung
der so extrahierten DNA mit einer geeigneten Endonuklease,
- – die
Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor
und die Rückgewinnung
der gesuchten Nukleinsäure
mit Hilfe einer geeigneten Sonde, die unter den zuvor beschriebenen
ausgewählt wird.
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Ein
besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
umfasst die folgenden Schritte:
- – die DNA-Synthese
unter Einsatz des automatisierten β-Cyanethylphosphoramidit-Verfahrens,
das in Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986) beschrieben ist,
- – die
Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor
und die Rückgewinnung
der Nukleinsäure
durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde, die unter jenen
zuvor beschriebenen ausgewählt
wird.
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Ein
anderes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
umfasst die folgenden Schritte:
- – die Assemblierung
chemisch synthetisierter Oligonukleotide, die an ihren Enden mit
unterschiedlichen Restriktionsschnittstellen versehen sind, deren
Sequenzen mit der Aneinanderreihung der Aminosäuren des natürlichen
Polypeptids gemäß dem Prinzip,
das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465, (1983) beschriebenen ist, kompatibel
sind,
- – die
Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Vektor
und die Gewinnung der gesuchten Nukleinsäure durch Hybridisierung mit
einer geeigneten Sonde, die unter den zuvor beschriebenen ausgewählt wird.
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Die
Erfindung hat gleichfalls jede rekombinante Nukleinsäure zum
Gegenstand, die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält, welche
in eine hinsichtlich der besagten Nukleinsäuresequenz heterologe Nukleinsäuresequenz
insertiert ist.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante Nukleinsäure, wie
sie zuvor definiert wurde, in welcher der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
ein Promotor (insbesondere ein induzierbarer Promotor) vorangeht,
unter dessen Kontrolle die Transkription der besagten Sequenz bewirkt
werden kann, und der gegebenenfalls eine Sequenz folgt, die Transkriptionsterminationssignale
codiert.
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Die
Erfindung betrifft jeden rekombinanten Vektor, der insbesondere
für die
Klonierung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
und/oder die Expression des durch diese Sequenz codierten Polypeptids
verwendet wird, und der dadurch ge kennzeichnet ist, dass er in einer
seiner Regionen, die für
seine Replikation nicht essentiell sind, eine rekombinante Nukleinsäure enthält, wie
sie zuvor definiert wurde.
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Beispielhaft
für einen
oben erwähnten
Vektor können
Plasmide, Cosmide oder Phagen genannt werden.
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Die
Anmeldung beschreibt gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen Polypeptids
durch Transformation eines zellulären Wirts mittels eines rekombinanten
Vektors vom oben angegebenen Typ, gefolgt vom Inkulturbringen des
so transformierten zellulären
Wirts und der Rückgewinnung
des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
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Demnach
betrifft die Erfindung jeden zellulären Wirt, der durch einen rekombinanten
Vektor transformiert wurde, wie er zuvor definiert wurde und der
die Regulationselemente umfasst, die die Expression der Nukleinsäuresequenz
ermöglicen,
die für
ein Polypeptid gemäß der Erfindung
codiert.
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Insbesondere
beschreibt die Anmeldung gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung
eines erfindungsgemäßen Polypeptids,
das die folgenden Schritte umfasst:
- – gegebenenfalls
die Amplifikation der Menge an Nukleotidsequenzen, die für das besagte
Polypeptid codieren, mittels zweier DNA-Primer, die so ausgewählt werden,
dass einer dieser Primer mit 10 bis 30 ersten Nukleotiden der Nukleotidsequenz,
die für
das besagte Polypeptid codiert, identisch ist, wohingegen der andere
Primer zu 10 bis 30 letzten Nukleotiden der besagten Nukleotidsequenz
komplementär
ist (oder mit diesen 10 bis 30 letzten Nukleotiden hybridisiert),
oder umgekehrt, dass einer dieser Primer mit 10 bis 30 letzten Nukleotiden
der besagten Sequenz identisch ist, wohingegen der andere Primer
zu 10 bis 30 ersten Nukleotiden der besagten Nukleotidsequenz komplementär ist (oder
mit den 10 bis 30 ersten Nukleotiden hybridisiert), gefolgt vom
Einbringen der besagten, so amplifizierten Nukleotidsequenzen in
einen geeigneten Vektor,
- – das
Inkulturbringen eines zellulären
Wirtes, der vorab mit einem geeigneten Vektor transformiert wurde, welcher
eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung
enthält,
die die für
das besagte Polypeptid codierende Nukleotidsequenz umfasst, in einem
geeigneten Kulturmedium, und
- – die
Rückgewinnung
des von dem transformierten zellulären Wirt produzierten Polypeptids
aus dem oben genannten Kulturmedium.
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Die
in der Anmeldung beschriebenen Peptide können mittels klassischer Methoden
auf dem Gebiet der Peptidsynthese hergestellt werden. Diese Synthese
kann in homogener Lösung
oder in Festphase durchgeführt
werden.
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Beispielsweise
wird auf die Synthesemethode in homogener Lösung verwiesen, die von HOUBENWEYL
in dem Werk mit dem Titel „Methode
der organischen Chemie",
herausgegeben von E. Wunsch, Bd. 15-I und II., THIEME, Stuttgart
1974, beschrieben ist.
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Dieses
Syntheseverfahren besteht daraus, aufeinanderfolgend paarweise die
aufeinanderfolgenden Aminoacylverbindungen in der erforderlichen
Reihenfolge zu kondensieren, oder Aminoacylverbindungen und vorab
gebildete Fragmente, die bereits mehrere Aminoacylverbindungen in
der geeigneten Reihenfolge enthalten, zu kondensieren, oder auch
mehrere vorab so hergestellte Fragmente, wobei es sich versteht,
dass man dafür
sorgt, dass vorab sämtliche
reaktiven Funktionen, die diese Aminoacylverbindungen oder Fragmente
aufweisen, geschützt
werden, mit Ausnahme der Aminfunktionen der einen und der Carboxylfunktionen
der anderen oder umgekehrt, die normalerweise an der Bildung der
Peptidbindungen beteiligt sein müssen,
insbesondere nach einer Aktivierung der Carboxylfunktion gemäß denbei
der Peptidsynthese wohlbekannten Verfahren. Als Variante kann auf
Kopplungsreaktionen verwiesen werden, die Reagenzien einer klassischen
Carbodiimid-Kopplung
einsetzen, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.
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Wenn
die eingesetzte Aminoacylverbindung eine zusätzliche Säurefunktion umfasst (insbesondere
im Falle von Glutaminsäure)
werden diese Funktionen geschützt,
beispielsweise durch t-Butylestergruppen.
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Im
Falle der fortschreitenden Synthese von Aminosäure zu Aminosäure beginnt
die Synthese vorzugsweise mit der Kondensation der C-terminalen
Aminosäure
mit der Aminosäure,
die der in der gewünschten
Sequenz benachbarten Aminoacylverbindung entspricht, und so nacheinander
allmählich
fortschreitend bis zur N-terminalen
Aminosäure.
Nach einer anderen bevorzugten Methode der Erfindung wird auf jene
von R. D. MERRIFIELD in dem Artikel mit dem Titel "Solid Phase peptide
synthesis" (J. Am.
Chem. Soc., 45, 2149-2154) beschriebene Methode verwiesen.
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Um
eine Peptidkette nach dem MERRIFIELD-Verfahren herzustellen, wird
auf ein sehr poröses
Polymerharz zurückgegriffen,
an welchem die erste C-terminale Aminosäure der Kette angeheftet wird.
Diese Aminosäure
wird an dem Harz über
seine Carboxylgruppe angeheftet und seine Aminfunktion ist geschützt, beispielsweise
durch die t-Butyloxycarbonylgruppe.
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Wenn
die erste C-terminale Aminosäure
so an dem Harz angeheftet wurde, entfernt man die Schutzgruppe der
Aminfunktion, indem das Harz mit einer Säure gewaschen wird.
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In
dem Fall, in dem die Schutzgruppe der Aminfunktion die t-Butyloxycarbonylgruppe
ist, kann sie durch Behandlung des Harzes mit Trifluoressigsäure entfernt
werden.
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Man
koppelt dann die zweite Aminosäure,
die die zweite Aminoacylverbindung der gewünschten Sequenz liefert, ausgehend
vom C-terminalen Aminoacylrest, an die von ihrer Schutzgruppe befreite
Aminfunktion der ersten an die Kette angehefteten C-terminalen Aminosäure. Vorzugsweise
ist die Carboxylfunktion dieser zweiten Aminosäure aktiviert, beispielsweise
durch Dicyclohexylcarbodiimid, und die Aminfunktion ist geschützt, beispielsweise
durch t-Butyloxycarbonyl.
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Man
erhält
so den ersten Teil der gesuchten Peptidkette, die zwei Aminosäuren umfasst,
und deren terminale Aminfunktion geschützt ist. Wie vorstehend beschrieben,
befreit man die Aminfunktion von der Schutzgruppe und kann dann
fortschreiten mit der Anheftung der dritten Aminoacylverbindung
unter Bedingungen, die analog der Anheftung der zweiten C-terminalen
Aminosäure
sind.
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Man
heftet so eine nach der anderen die Aminosäuren, die die Peptidkette bilden
sollen, jedes Mal an die vorab von ihrer Schutzgruppe befreite Amingruppe
des Teils der bereits gebildeten Peptidkette an, die an das Harz
gebunden ist.
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Wenn
die gesamte gewünschte
Peptidkette gebildet ist, entfernt man die Schutzgruppen der unterschiedlichen
Aminosäuren,
die die Peptidkette bilden, und löst das Peptid von dem Harz,
beispielsweise mittels Flußsäure.
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Die
Erfindung wird weiter anhand der Beispiele, die in der folgenden
detaillierten Beschreibung enthalten sind, verdeutlicht, wobei letztere
keinerlei einschränkenden
Charakter besitzt.
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1. Isolierung des 2 kb großen SacI-Fragments
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Klonierung des Adhäsions-Invasions-Systems von Typhi.
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Der
verwendete Stamm ist der Stamm Ty2 von Typhi, der bei der Collection
de I'INSTITUT PASTEUR unter
der Bezeichnung CIP 55-35 hinterlegt ist.
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Ausgehend
von einer Sammlung von 2000 unabhängigen Mutanten, die durch
Insertion eines von Tn5 abgeleiteten Transposons (MANOIL, C. und
BECKWITH, J., 1985, TnPhoA: a transposon probe for Protein export
signals; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8129-8133) in das Genom
des Stammes Ty2 erhalten wurden, wurde eine Mutante erhalten, die
im Modell von HeLa-Zellen in Kultur nicht mehr invasiv war. Die
Infektionsmethode der HeLa-Zellen in Kultur mit Typhi ist folgende:
die HeLa-Zellen werden in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Kälberserum
enthält,
kultiviert. Diese Zellen werden mit Typhi in einem Verhältnis von
100 Bakterien pro Zelle infiziert. Nach einer Stunde Inkubation
bei 37°C
werden die Zellen mit dem Kulturmedium gewaschen und anschließend erneut
in Gegenwart von 100 μg/ml
Gentamycin in Kultur gebracht. Die intrazellulär lokalisierten Bakterien werden
nach 24 h durch eine Giemsa-Färbung
nachgewiesen.
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Nach
einem Verdau des Genoms dieser Mutante mit der Restriktionsendonuklease
SacI haben Hybridisierungsexperimente auf Cellulosenitratfolie gezeigt,
dass das Transposon in einem2 Kilobasen (kb) großen SacI-Fragment insertiert
ist.
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Da
das verwendete Transposon für
die Resistenz gegen Kanamycin codiert, konnte das 2 kb große SacI-Fragment,
das das Transposon enthielt, in die SacI-Schnittstelle des Plasmids pUC18 (VIEIRA,
J. und MESSING, J., 1982; The pUC Plasmids, an M13mp7-derived system
for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal
primers; Gene, 19, 259-268) kloniert werden. Unter Verwendung dieses
rekombinanten Plasmids wurden die Nukleinsäuresequenzen, die den Gegenstand
der vorliegenden Erfindung darstellen, isoliert.
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Die
genomische DNA des Stamms Ty2 wurde durch die Endonuklease SacI
verdaut und die Produkte dieser Restriktion wurden in die SacI-Schnittstelle
des Klonierungsvektors pUC18 ligiert. Diese Ligationsmischung wurde
verwendet, um den Stamm Escherichia coli HB101 (hinterlegt bei der
Collection de I'INSTITUT PASTEUR
unter der Bezeichnung CIP 102400) zu transformieren. Die Selektionie rung
der Transformanten erfolgte auf Agar-Nährböden, die 100 μg/ml Ampicillin
enthielten. Nach einer Inkubation für 24 Stunden in einem Brutschrank
bei 37°C
wurden die Transformanten auf Scheiben aus Cellulosenitrat übertragen,
die auf Agar-Nährböden, die
100 μg/ml
Ampicillin enthielten, gelegt wurden. Um die in situ-Hybridisierung
fortzusetzen, wurden diese Scheiben dann mit einer Denaturierungslösung (0,5
M NaOH), anschließend
mit einer Neutralisierungslösung
(1 M Ammoniumacetat, 0,02 M NaOH) behandelt. Die durch diese Behandlungen
freigesetzte und denaturierte DNA wurde auf den Cellulosenitratscheiben
durch Erwärmen
auf 80°C
für 3 h
fixiert.
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Diese
so hergestellten Cellulosenitratscheiben wurden mit dem 2 kb großen SacI-Fragment hybridisiert,
das das Transposon enthielt und mit 32P
markiert war. Die Hybridisierungen erfolgten bei 65°C für 24 Stunden
in 6 × SSC
(1 × SSC
besteht aus 0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat bei pH 7) in
Denhardt-Medium (0,1% Ficoll; 0,1% Polyvinylpyrrolidon; 0,1% Rinderserumalbumin).
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Auf
diese Weise wurde ein E. coli HB101-Klon isoliert, der ein rekombinantes
Plasmid enthielt, das aus dem Vektor bestand, in den ein 2 kb großes SacI-Fragment
insertiert war (begrenzt durch die Schnittstellen S1 und S2 in der
Restriktionskarte dieses Fragments, das in der 1 als
dicker Strich wiedergegeben ist).
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2. Mit dem 2 kb großen SacI-Fragment assoziierter
genetischer Bereich
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Die
genomische DNA des Stammes Ty2 wurde durch die Endonuklease HindIII
verdaut. Die durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennten
Verdauprodukte wurden durch Kapillarwirkung auf Cellulosenitratfolie übertragen.
Sie wurden dann unter den zuvor beschriebenen Bedingungen mit dem
1,1 kb großen
SacI-BamHI-Fragment
(Fragment A in der 1) oder mit dem 1,3 kb großen HindIII-EcoRI-Fragment (Fragment
B in der 1) hybridisiert, die beide innerhalb
des 2 kb großen
SacI-Fragments liegen.
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Es
wurde festgestellt, dass das 2 kb große SacI-Fragment von zwei HindIII-Fragmenten, die jeweils 2,3
kb bzw. 5,6 kb groß sind,
im Genom des Typhi-Stammes
Ty2 abgedeckt ist (entsprechend einem 7,9 kb großen Fragment, das von den Stellen
H1 und H2 in der enzymatischen Restriktionskarte dieses Bereichs,
der in der 1 wiedergegeben ist, begrenzt
wird).
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3. Isolierung der Sonde für Salmonella
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Die
DNA des rekombinanten Plasmids, welches das 2 kb große SacI-Fragment
enthält,
wurde mit den Endonukleasen SacI und HindIII geschnitten. Dieser
Doppelverdau setzte ein 487 Basenpaar großes SacI-HindIII-Fragment frei,
das zwischen die Restriktionsschnittstellen SacI und HindIII des
Klonierungsvektors pUC18 kloniert wurde.
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Dieses
487 Basenpaar große
SacI-HindIII-Fragment wird nachstehend als "Sonde für Salmonella" bezeichnet und entspricht
der zuvor definierten Nukleinsäuresequenz
(I). Die Lage dieses SacI-HindIII-Fragments innerhalb des 2 kb großen SacI-Fragments ist in 1 dargestellt.
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4. Kontrolle der Spezifität der Sonde
für Salmonella
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Um
diese Kontrolle durchzuführen,
wurden die verwendeten Stämme
24 Stunden lang bei 37°C
in 200 μl
Nährlösung in
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen kultiviert. Mittels eines
Mehrspitzeninokulators wurden diese Stämme 5 Stunden lang bei 37°C auf einer
Cellulosenitratfolie, die in einen Behälter mit Agar-Nährboden gegeben
wurde, erneut in Kultur gebracht. Die Cellulosenitratfolie wurde
dann für
in situ-Hybridisierungsversuche behandelt und eingesetzt.
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Um
die Sonde für
Salmonella herzustellen, wurde das rekombinante Plasmid (pUC18,
das das 487 Basenpaar große
SacI-HindIII-Fragment enthielt) mit den Endonukleasen SacI und HindIII
verdaut. Nach einer Auftrennung der Produkte dieses Verdaus durch
Elektrophorese in einem Agarosegel wurde die Sonde für Salmonella
durch Elektro-Elution gereinigt. Sie wurde dann mit 32P
durch Nick-Translation
(déplacement
de césure)
markiert.
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Die
Hybridisierungsversuche wurden bei 65°C in 6 × SSC und in Denhardt-Medium über eine
Reaktionsdauer von 18 Stunden durchgeführt. Unter diesen Versuchsbedingungen
wurde die Spezifität
der Sonde für
Salmonella bei 768 Bakterienstämmen
untersucht, die sich aus 384 Stämmen,
die nicht zur Gattung Salmonella gehörten, und 384 Stämmen, die
zur Gattung Salmonella gehörten
und die sieben Unterarten der Gattung Salmonella repräsentierten,
zusammensetzten. Diese 768 Stämme
stammten aus der Collection du Centre Collaborateur de I'OMS de Référence
et de Recherche pour les Salmonella und der Sammlung des Centre National
pour les Salmonella.
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Keiner
der 384 Stämme,
die nicht zur Gattung Salmonella gehörten, reagierte mit der Sonde
für Salmonella.
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Von
den 384 Stämmen
von Salmonella reagierten 382 mit der Sonde für Salmonella. Die zwei Stämme, die
nicht mit der Sonde für
Salmonella reagierten, gehörten
in einem Fall zum Serotyp Wedding und im anderen Fall zum Serotyp
Zürich.
Es handelt sich in den beiden Fällen
um den Referenzstamm des Serotyps. Für diese zwei Stämme wurde
bestätigt,
dass sie im Modell von HeLa-Zellen in Kultur nicht-invasiv sind
und dass sie weder das zur Sonde für Salmonella homologe Fragment
noch das 2 kb große
SacI-Fragment enthalten.
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5. Nachweis von Salmonella
in biologischen Produkten nach einer Genamplifikation
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In
einem biologischen Produkt ist es gegenwärtig nicht möglich, ein
aus einer gegebenen Art stammendes Bakterium unter mehreren Zehnmillionen
anderen Bakterien nachzuweisen. Um das Vorliegen eines Salmonella-Bakteriums
in einem polymikrobiellen biologischen Produkt mittels einer Nukleotidsonde
nachweisen zu können,
ist es unerlässlich,
folgendermaßen
vorzugehen:
- – eine Amplifikation der Anzahl
an nachzuweisenden Bakterien, indem die zu analysierende Probe in
Kultur gebracht wird;
- – und
eine Amplifikation der Anzahl an Kopien der Zielsequenz, die man
mit der Nukleotidsonde nachweisen will, indem man die Genamplifikationsmethode
(oder Methode der Polymerasekettenreaktion oder PCR) anwendet.
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Bei
Salmonella ist das 487 Basenpaar große SacI-HindIII-Fragment (die
Sonde für
Salmonella) für
die Gattung Salmonella spezifisch. Wenn man ausgehend von der zu
analysierenden biologischen Probe das Vorliegen dieses Fragments
nachweist, kann man daraus schließen, dass die untersuchte Probe
mit Salmonella kontaminiert ist.
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5.1 Beschreibung der zwei für die PCR
verwendeten Primer
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Ausgehend
von der Nukleotidsequenz (I) der Sonde für Salmonella wurden zwei Primer
ausgewählt, die
für die
Durchführung
der Genamplifikationsmethode eingesetzt wurden.
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Die
Aneinanderreihungen von 17 Basen, die den zwei Primern entsprachen
und in der vorstehenden Beschreibung als SS-1 und SS-2 bezeichnet
wurden, wurden verwendet, um die Anzahl an Kopien für Salmonella
zu amplifizieren.
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5.2 Für
die PCR mit den Primern SS-1 und SS-2 verwendetes Protokoll
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Dieses
Protokoll wurde unter Verwendung des Kits „Gene amp" (eingetragene Marke) von Perkin Elmer
Cetus (Ref.-Nr. N801-0055) entwickelt. Die Primer SS-1 und SS-2
wurden in einer Endkonzentration von 200 pmol eingesetzt. Die Reaktionsmischung
wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers erzeugt, indem 10 μl der Lösung, die die zu amplifizierende
DNA enthielt, in einem Endvolumen von 50 μl verwendet wurde. Diese Mischung
wurde unter den folgenden Bedingungen 20 Amplifikationszyklen unter
Verwendung des Geräts „DNA thermal
cycler" (eingetragene
Marke) von Perkin Elmer Cetus (Ref.-Nr. N801-0177) unterzogen:
- • Denaturierungsschritt
bei 94°C
für 120
Sekunden,
- • Reassoziierungsschritt
bei 68°C
für 180
Sekunden,
- • Elongationsschritt
bei 72°C
für 90
Sekunden.
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Die
so amplifizierte DNA wurde durch Elektrophorese (120 Volt für 30 Minuten)
in einem Agarosegel sichtbar gemacht, das 2% Agarose mit niedrigem
Schmelzpunkt (BRL; Ref.-Nr. 5517) und % normale Agarose (Sigma;
Ref.-Nr. A-6877) enthielt. Nach der Elektrophorese wurde die DNA
auf Cellulosenitratfolie transferiert und mit der mit 32P
markierten Sonde für
Salmonella hybridisiert.
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5.3 Spezifität und Empfindlichkeit der Methode
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Der
Stamm LT2 von Salmonella, Serotyp typhimurium, hinterlegt bei der
Collection de l'Institut
Pasteur unter der Referenz CIP 60.62T und der Stamm HB101 von E.
coli (CIP 102.400) wurden verwendet, um die Spezifität und die
Empfindlichkeit der PCR-Methode unter den zuvor beschriebenen Versuchsbedingungen
zu untersuchen.
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Die
die zu amplifizierende DNA enthaltende Lösung wurde auf folgende Weise
hergestellt:
- 1) die gesamten Bakterien werden
in 100 μl
destilliertem Wasser suspendiert;
- 2) die Bakteriensuspension wird 10 Minuten lang bei 100°C in einem
Mikrozentrifugationsgefäß behandelt;
- 3) sie wird dann 3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit
in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Unter Aussparung des Zentrifugationsniederschlags
werden 10 μl
dieser Lösung
entnommen, um mit der Genamplifikation fortzufahren.
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Wenn
man eine Reinkultur des Salmonella-Stammes LT2 des Serotyps typhimurium
verwendet, weist man die DNA von 10 oder weniger als 10 Bakterien
in 10 μl
einer Lösung,
die der Amplifikation unterzogen wurde, nach. Wenn man den Stamm
HB101 von E. coli verwendet, ist keinerlei Amplifikation in 10 μl einer Lösung, die
der Amplifikation unterzogen wurde, nachweisbar, selbst wenn man
mit DNA arbeitet, die 106 Bakterien entspricht.
Wenn man eine Mischung der zwei Bakterienstämme herstellt, weist man die
DNA von 100 oder weniger als 100 Salmonella-Bakterien, die mit der DNA von 106 E. coli HB101-Bakterien gemischt wurde, in
10 μl einer
Lösung,
die der Amplifikation unterzogen wurde, nach.
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5.4 Versuch des Nachweises von Salmonella
in einer im Labor rekonstituierten Probe
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Die
verwendete Probe ist eine Charge von als Tiernahrung vorgesehenem
Hackfleisch. Es ist sehr stark mit gram-positiven oder -negativen,
aeroben oder anaeroben Bakterien kontaminiert. Eine unter dem Mikroskop
durchgeführte
ungefähre
Zählung
ermöglicht
es, die Gesamtzahl an Bakterien auf 109 pro
Gramm Hackfleisch zu bestimmen. Durch Zählung in Behältern mit
Agar-Nährboden
wurde die Anzahl aerober, auf diesem Medium wachsender Bakterien
auf 108 pro Gramm Hackfleisch bestimmt.
Diese Probe enthält
keine Salmonella: drei mit den klassischen Methoden der Lebensmittelbakteriologie
durchgeführte
Analysen erwiesen sich als negativ.
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5.4.1 Herstellung der Probe für die PCR-Analyse
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Die
Probe wird rekonstituiert, indem unterschiedliche Anzahlen von Salmonella,
Serotyp typhimurium (10, 102, 103, 104, 105 oder 106) zu 25
g Hackfleisch zugesetzt werden. Diese rekonstituierte Probe wird
in 200 ml Tryptocasein-Soja-Nährlösung in
einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben 18 Stunden lang bei 37°C unter Bewegung
kultiviert. Auf identische Weise werden 25 g Hackfleisch ohne Salmonella
behandelt.
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Am
folgenden Tag wurde der Erlenmeyerkolben 15 Minuten lang auf dem
Labortisch ohne Bewegung bei Labortemperatur stehen gelassen, damit
sich die größe ren Feststoffe
absetzen. Dann entnimmt man an der Oberfläche 1 ml der Nährlösung, die
in ein Mikrozentrifugationsgefäß überführt und
3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge
zentrifugiert wird. Der Überstand
wird mittels einer Pasteurpipette vollständig entfernt. Der bakterielle
Niederschlag wird in 100 μl
destilliertem Wasser vollständig
resuspendiert, danach 10 Minuten lang bei 100°C gehalten. Man zentrifugiert
erneut 3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit. Unter Aussparung
des Zentrifugationsniederschlags werden 10 μl dieser Lösung abgenommen, um die Genamplifikation
unter den bereits angegebenen Bedingungen durchzuführen.
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5.4.2. Spezifität und Empfindlichkeit der Methode
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Wenn
man 25 g einer Probe ohne Salmonella einsetzt, kann man keinerlei
Amplifikation der enthaltenen DNA in den 10 μl der amplifizierten Lösung nachweisen.
Wenn man 25 g der Probe, die 102 oder mehr
als 102 Salmonella enthält, einsetzt, weist man eine
Amplifikation der enthaltenen DNA in den 10 μl der amplifizierten Lösung nach.
