ES2302329T3 - Secuencias nucleicas procedentes del genoma de salmonella typhi y usos de las mismas, especialmente para el diagnostico in vitro de la presencia de bacterias del genero salmonella en los productos alimenticios. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS NUCLEICAS UTILIZABLES COMO SONDAS Y/O CEBOS PARA LA DETECCION IN VITRO DE BACTERIAS DEL TIPO SALMONELLA, CARACTERIZADA EN QUE SE HIBRIDA CON UNA SECUENCIA HINDIII DE 7,9KB DE LA CEPA SALMONELLA TYPHI TY2 EN CONDICIONES ESTRINGENTES. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCESO DE DETECCION DE SALMONELLA MEDIANTE ESTAS SECUENCIAS.
Description
Secuencias nucleicas procedentes del genoma de
Salmonella Typhi y usos de las mismas, especialmente para el
diagnóstico in vitro de la presencia de bacterias del género
Salmonella en los productos alimenticios.
La presente invención tiene por objeto las
secuencias nucleicas, y sus usos, especialmente para el diagnóstico
in vitro de la presencia de bacterias del género
Salmonella en una muestra biológica susceptible de
contenerlas, y más especialmente en los productos alimenticios.
Los productos alimenticios están adquiriendo
actualmente una importancia creciente. Por motivos sociales, los
productos transformados, listos para su consumición, no paran de
suscitar una demanda creciente por parte de los compradores. Ello
tiene como resultado el que las fuentes de producción y la
presentación de estos productos se hayan modificado
considerablemente durante los últimos quince años (fabricación en
masa en las fábricas especializadas, comercialización en unidades
acondicionadas, generalmente bajo una película plástica).
Por razones de sanidad pública, la tecnología de
la fabricación y los productos en sí mismos, están sometidos a una
vigilancia higiénica cada vez más estricta. En el ámbito de los
controles bacteriológicos, se buscan sistemáticamente las bacterias
responsables de las infecciones tóxicas alimentarias, y en entre
ellas, prioritariamente la Salmonella. Las normas de
salubridad son, por otra parte, muy claras para este género de
bacterias: ausencia de Salmonella en 25 gramos del
producto.
Desde el punto de vista taxonómico, el género
Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae.
Este género incluye una única especie, S. enterica, que se
puede subdividir en siete subespecies. Dentro de cada una de estas
subespecies, se puede individualizar un gran número de serotipos con
ayuda de sueros dirigidos contra los antígenos o polisacáridos y
los antígenos H flagelarios. En 1989, se conocían 2267 serotipos de
Salmonella.
Las Salmonella son bacterias entero
invasivas que son patógenas para el hombre y para los animales. Su
poder patogénico está unido a su capacidad de invadir el epitelio
intestinal. Esta etapa se puede limitar, por ejemplo, a la mucosa
en el caso de una infección tóxica, o puede estar seguida de una
dispersión sistemática (caso de la fiebre tifoidea). La
contaminación del huésped por Salmonella tiene lugar por vía
bucal en la gran mayoría de los casos. Esto explica por qué las
Salmonella son buscadas sistemáticamente en los controles
bacteriológicos de muestras
biológicas.
biológicas.
El método de referencia de búsqueda sistemática
de Salmonella, recomendado por la Association Française de
Normalisation (AFNOR), incluye: poner en cultivo el producto a
analizar en dos medios de enriquecimiento diferentes, incubados a
dos temperaturas diferentes y aislados en dos medios selectivos
diferentes (esta etapa está frecuentemente precedida de una etapa
de "revivificación" en un caldo nutritivo); transferencia de 6
colonias al menos a medios de identificación rápida y finalmente
tipificación serológica de la cepa. Puesto que el protocolo AFNOR
debe ser seguido escrupulosamente por un experto oficial, se
comprende que será de difícil aplicación en los controles
sistemáticos a causa del tiempo que se necesita para efectuar el
examen (como mínimo una semana) y de su precio de coste.
Los nuevos métodos de búsqueda de
Salmonella se basan, o bien en pruebas enzimáticas, o bien en
la utilización de sondas nucleicas. Es necesario señalar que en
ambos casos, son recomendables, si no indispensables, una etapa de
cultivo en medio rico y un subcultivo en un medio de
enriquecimiento.
Las pruebas inmunoenzimáticas que utilizan
anticuerpos monoclonales son fáciles de realizar, dan resultados en
cuatro a seis horas y tienen un precio de coste asequible. Su mayor
inconveniente reside en el hecho de que con frecuencia dan falsas
reacciones positivas y a veces falsas reacciones negativas. Las
consecuencias de estas reacciones falsas son importantes en los dos
casos: si se trata de una falsa reacción positiva, habrá que
retener el producto y el laboratorio de análisis tendrá que poner en
marcha un procedimiento para aislar una Salmonella que no
existe; si se trata de una falsa reacción negativa, el producto será
comercializado con los riesgos que esto comporta para la salud
pública.
Un estudio reciente en 250 cepas de
Salmonella y 75 cepas bacterianas no pertenecientes al género
Salmonella, dio hasta 17 falsas reacciones positivas y 2
falsas reacciones negativas (D'AOUST, J.Y. (1987): "Eficacité de
la trousse immunoenzymatique BIOENZABEAD pour le dépistage de
Salmonella spp. dans les aliments", Microorganismes et
Aliments: Technique Rapide, Contrôle industriel. Colloque de la
Societé Française de Microbiologie, Paris). Al haber efectuado esta
prueba en cultivos puros, se puede pensar que el número de
reacciones falsas habría sido más importante con productos
polimicrobianos (competición microbiana; riesgo de reacciones
antigénicas cruzadas).
Las sondas nucleicas están constituidas por un
fragmento de ADN genómico (FITTS, R. et al (1983),
"DNA-DNA Hybridization Assay For Detection Of
Salmonella spp". In Foods, Applied and Environmental
Microbiology, 46 1146-1151). Se trata de sondas
específicas conocidas. Existen varios equipos (o kits)
comercializados. De hecho, resultaba que estas sondas presentaban
dos inconvenientes principales: su falta de especificidad según los
resultados comunicados por los usuarios (reacción cruzada con los
Citrobacter, por ejemplo) y su falta de sensibilidad (umbral límite
de detección: 10^{5} Salmonella; o según algunos autores
2,5 \mug de ADN, es decir aproximadamente 10^{7}
bacterias).
bacterias).
La presente invención tiene precisamente por
objeto las secuencias nucleicas utilizables como sondas nucleicas
para la detección de Salmonella, siendo estas sondas
totalmente específicas del género Salmonella (no reacción
cruzada con otras bacterias, en particular con bacterias del género
Citrobacter).
La invención tiene por objeto igualmente el uso
de estas sondas nucleicas en los métodos de detección o de
dosificación in vitro de Salmonella, presentando las
ventajas siguientes:
- gran sensibilidad,
- respuesta rápida; el resultado del análisis
puede estar emitido en 48 horas, o bien 24 horas,
- realización fácil, especialmente sin el uso de
ningún producto radiactivo.
- precio de coste razonable.
\vskip1.000000\baselineskip
La Salmonella subespecie enterica
serotipo Typhi (bacteria denominada en lo sucesivo
Typhi) es el agente de la fiebre tifoidea humana. Esta
bacteria es estrictamente patógena para el hombre. A continuación
de una contaminación por vía bucal, Typhi va a atravesar la
barrera intestinal y a alcanzar los ganglios mesentéricos, gracias
a un sistema genético, que le permite adherirse y penetrar en las
células epiteliales de la mucosa intestinal. A falta de un modelo
experimental, esta primera etapa de la infección se ha estudiado
in vitro en células HeLa en cultivo, ya que Typhi es
capaz de adherirse y penetrar en estas células.
La invención tiene precisamente por objeto un
ácido nucleico aislado susceptible de utilizarse como sonda y/o
cebador para la detección in vitro de bacterias del género
Salmonella, caracterizado porque es susceptible de
hibridarse a 65ºC en 6x SSC en medio Denhardt, con un fragmento
HindIII de 7,9 kb de la cepa Salmonella Typhi Ty2 que
comprende la cadena nucleotídica (I) siguiente:
La invención tiene por objeto, más
concretamente, toda secuencia nucleica, tal y como se define más
arriba, que contiene toda o parte de la secuencia de 7,9 kb
delimitada por los dos sitios HindIII, denominados H_{1} y
H_{2} en el mapa de restricción de dicha secuencia, representado
en la figura 1.
Las secuencias con las que se hibridan los
ácidos nucleicos de la invención proceden del genoma de la cepa Ty
2 de Typhi, registrada en la Colección del Instituto Pasteur
con el nº CIP 55-35.
Por tanto, la solicitud describe toda secuencia
nucleica procedente del genoma de la cepa Ty 2, mencionada más
arriba, incluyendo esta secuencia toda o parte de la información
genética definida más arriba y que incluye toda o parte de la
secuencia de 2 kb delimitada por los dos sitios SacI, denominados S1
y S2 en el mapa de restricción representado en la figura 1.
De forma más general, la solicitud da a conocer
toda secuencia nucleica que comprende toda o parte de la información
genética necesaria para la infección in vitro de células
HeLa en cultivo por bacterias del género Salmonella y que es
susceptible de hibridarse con toda o parte de al menos una de las
secuencias nucleicas definidas más arriba, en condiciones severas.
Estas condiciones severas son las siguientes: 65ºC durante 18 horas
en 6 x SSC (1 x SSC está constituida de NaCl 0,15 M y citrato
trisódico 0,015 M, a pH 7) en medio de Denhardt (0,1% Ficoll; 0,1%
de polivinil-pirrolidona; 0,1% de albúmina de suero
de vaca).
La invención se refiere igualmente a toda
secuencia nucleica susceptible de hibridarse con una de las
secuencias definidas más arriba, en las condiciones de hibridación
definidas más arriba, siendo utilizable como sonda para llevar a
cabo un procedimiento de detección in vitro de bacterias del
género Salmonella y más particularmente de las
Salmonella patógenas, tales como Typhi, susceptibles
de adherirse y de penetrar en las células epiteliales de la mucosa
intestinal en el organismo.
Ventajosamente, las sondas nucleicas de la
invención están constituidas de una sucesión de aproximadamente 200
a 500 nucleótidos.
A este respecto, la solicitud describe una sonda
nucleica caracterizada por la sucesión de nucleótidos (I)
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere igualmente a toda
secuencia nucleica susceptible de hibridarse con una de las
secuencias nucleicas definidas más arriba en las condiciones de
hibridación definidas más arriba, siendo utilizable como cebador
nucleico para la amplificación génica de una de las secuencias
nucleicas descritas en la solicitud.
Ventajosamente, los cebadores nucleicos de la
invención están constituidos por una sucesión de aproximadamente 10
a 30 nucleótidos.
Las técnicas de amplificación génica son de gran
ayuda para la puesta a punto de métodos de diagnóstico in
vitro especialmente sensibles. Entre estas técnicas de
amplificación génica, se puede citar la técnica PCR (Polymerase
Chain Reaction) (Reacción en cadena de la polimerasa), tal y como se
describe en las solicitudes de patente europea nº 86/302.298.4 de
27-3-1986 y nº 87/300.203.4 de
9-1-1987, o también la técnica
denominada "Q\betareplicasa" descrita en Biotechnology, vol.
6, pág. 1197 (octubre 1988) y la que se lleva a cabo con la ayuda
de una ARN polimerasa (T7RNA polimerasa) descrita en la solicitud de
patente internacional nº W089/01050. Estas técnicas permiten
mejorar la sensibilidad de detección de los ácidos nucleicos de
virus o de bacterias y necesitan de la utilización de cebadores de
síntesis específicos.
Igualmente forman parte de la invención, los
ácidos nucleicos que varían con respecto a la secuencia nucleica
(I) definida más arriba y que contienen algunas mutaciones
localizadas, en la medida en que estos ácidos nucleicos variantes
se hibridan con la secuencia (I) anteriormente definida, en las
condiciones de hibridación definidas más arriba en la memoria
descriptiva.
La solicitud describe igualmente todo péptido o
polipéptido que corresponde según el código genético universal, a
una secuencia nucleica de la invención.
En este aspecto, más especialmente a todo
polipéptido constituido por toda o parte de la secuencia de
aminoácidos (II) siguiente, correspondiendo esta secuencia, según
el código genético universal, a la secuencia nucleica (I) descrita
más arriba:
No es necesario decir, que toda secuencia
peptídica derivada de la modificación, por sustitución y/o por
adición y/o supresión, de uno o varios aminoácidos de un
polipéptido de la solicitud, y más especialmente de la secuencia
peptídica (II) descrita más arriba o de una subsecuencia peptídica
derivada de esta última se divulga dentro del ámbito de la presente
solicitud, ya que esta modificación no altera las propiedades
antigénicas de dicho polipéptido.
La solicitud describe igualmente a los
anticuerpos policlonales o monoclonales, susceptibles de reconocer
específicamente a los polipéptidos descritos más arriba y de formar
complejos inmunológicos con estos últimos.
Estos anticuerpos policlonales se obtienen por
inmunización de un animal con los polipéptidos, seguido de la
recuperación de los anticuerpos formados.
Estos anticuerpos monoclonales son producidos
por todo hibridoma susceptible de ser formado por métodos clásicos,
por una parte, a partir de células esplénicas de un animal, en
particular de ratón o de rata, inmunizados contra uno de los
polipéptidos purificados descritos en la solicitud y, por otra, de
células de una línea celular de un mieloma apropiado y de ser
seleccionado por su capacidad de producir anticuerpos monoclonales
que reconocen el polipéptido inicialmente utilizado para la
inmunización de los animales.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de detección (o método de diagnóstico) in vitro
de la presencia eventual de bacterias del género Salmonella
en una muestra biológica susceptible de contenerlas, caracterizado
porque comprende:
- dado el caso, el cultivo de la muestra,
- dado el caso, la amplificación del número de
copias de la secuencia nucleica a detectar con la ayuda de un par
de cebadores nucleicos como los definidos más arriba,
- la puesta en contacto de la muestra con una
sonda nucleica como la definida más arriba, en las condiciones de
hibridación mencionadas anteriormente.
- la detección eventual de los complejos de
hibridación formados entre la sonda mencionada anteriormente y la
secuencia nucleica a detectar.
La etapa del cultivo de la muestra biológica, se
realiza ventajosamente de la manera siguiente: 25 g de la muestra
biológica se ponen en cultivo en 200 ml de caldo nutritivo en un
erlenmeyer de 1 litro, durante 18 horas a 37ºC, con agitación.
La etapa de amplificación de la secuencia
nucleica a detectar, en el procedimiento mencionado anteriormente,
comprende ventajosamente las siguientes etapas:
- una etapa de extracción del ácido nucleico a
detectar perteneciente al genoma de las bacterias del género
Salmonella, eventualmente presentes en la muestra biológica,
y dado el caso, una etapa de tratamiento con la ayuda de una
transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico, si éste último está
en forma de ARN.
- un ciclo que comprende las siguientes
etapas:
- \bullet
- etapa de desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que lleva a la formación de un ácido nucleico de hebra simple; esta etapa se realiza ventajosamente a 94ºC durante 120 segundos.
- \bullet
- etapa de reasociación por hibridación de cada una de las hebras del ácido nucleico, obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador, tal como se ha definido más arriba, mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos un par de los cebadores anteriormente mencionados; esta etapa se realiza ventajosamente a 68ºC durante 180 segundos.
- \bullet
- etapa de elongación, por formación a partir de los cebadores, de ADN complementarios a las hebras sobre las cuales se hibridan, en presencia de una ADN polimerasa y de cantidades apropiadas de los cuatro nucleósidos trifosfato diferentes (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), lo que lleva a la formación de un mayor número de ácidos nucleicos de doble hebra para detectar que en la etapa de desnaturalización precedente; esta etapa se realiza ventajosamente a 72ºC, durante 90 segundos, repitiéndose este ciclo un número de veces determinado (preferentemente entre 20 y 30 veces) para poder obtener la secuencia nucleica a detectar, eventualmente presente en la muestra biológica, en una proporción suficiente que permita su detección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden utilizar en el ámbito de la presente
invención, otros métodos de amplificación y/o detección de
secuencias nucleicas características de Salmonella,
utilizando las sondas y, dado el caso, los cebadores nucleicos
descritos más arriba. A este respecto, se puede citar el método
descrito en la solicitud de patente internacional WO 85/06700, o la
descrita en la solicitud de patente europea nº 0357336.
La invención tiene igualmente por objeto los
equipos para llevar a cabo el procedimiento de detección in
vitro de bacterias del género Salmonella, como se ha
descrito más arriba, incluyendo estos equipos:
- dado el caso, un medio apropiado para el
cultivo de la muestra biológica,
- al menos un par de cebadores nucleicos como
los descritos más arriba,
- dado el caso, reactivos apropiados para la
realización del ciclo de amplificación, especialmente la ADN (o
ARN) polimerasa, y cantidades apropiadas de los 4 nucleósidos
trifosfato diferentes,
- una (o varias) sonda(s)
nucleica(s) como la(s) descrita(s) más arriba,
que pueda ser marcada y que sea capaz de hibridarse con la (o las)
secuencia(s) nucleica(s) a detectar.
- reactivos apropiados para la realización de la
reacción de hibridación entre la (o las) sonda(s) y la (o
las) secuen-
cia(s) nucleica(s) a detectar anteriormente mencionadas.
cia(s) nucleica(s) a detectar anteriormente mencionadas.
- un tejido o fluido biológico de referencia
desprovisto de secuencias nucleicas susceptibles de hibridarse con
la (o las) sonda(s) mencionada(s) anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud divulga igualmente un procedimiento
de detección in vitro de la presencia eventual de bacterias
del género Salmonella en una muestra biológica susceptible de
contenerlas, caracterizado porque comprende:
- dado el caso, el cultivo de la muestra
biológica, según la forma indicada más arriba,
- dado el caso, la amplificación del número de
copias de la secuencia nucleica correspondiente, según el código
genético universal, al polipéptido a detectar (realizándose esta
amplificación siguiendo el ciclo de amplificación descrito más
arriba),
- la puesta en contacto de la muestra
anteriormente mencionada con los anticuerpos de la invención,
susceptibles de formar un complejo inmunológico con el (o los)
polipéptido(s) a detectar,
- la detección eventual de los complejos
inmunológicos formados entre dichos anticuerpos y la (o las)
secuencia(s) peptídica(s) a detectar.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención describe igualmente los equipos
para llevar a cabo el procedimiento de detección descrito más
arriba, que contienen:
- dado el caso, un medio apropiado para el
cultivo de la muestra biológica,
- dado el caso, al menos un par de cebadores
como los descritos más arriba y reactivos apropiados para la
realización del ciclo de amplificación, especialmente la ADN (o ARN)
polimerasa, y cantidades apropiadas de los 4 nucleósidos trifosfato
diferentes,
- anticuerpos policlonales o monoclonales, que
puedan ser marcados, especialmente radiactiva o enzimáticamente,
susceptibles de formar un complejo inmunológico con la (o las)
secuencia(s) peptídica(s) a detectar,
\newpage
- los reactivos para la constitución del medio
apropiado para la realización de la reacción inmunológica entre los
anticuerpos y la (o las) secuencia(s) peptídicas
anteriormente mencionadas.
- los reactivos que permiten la detección de los
complejos inmunológicos formados en la reacción inmunológica
anterior. Tales reactivos pueden llevar igualmente un marcador o ser
susceptibles de ser reconocidos a su vez por un reactivo
marcado,
- un tejido o fluido biológico de referencia
desprovisto de polipéptidos susceptibles de ser reconocidos por los
anticuerpos anteriormente mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud enseña igualmente un procedimiento
de preparación de las secuencias nucleicas descritas más arriba,
comprendiendo este procedimiento las siguientes etapas:
- la incubación del ADN genómico, aislado a
partir de una bacteria Salmonella Typhi, mediante
tratamiento con sosa a pH 12,5
- el tratamiento del ADN así extraído con una
endonucleasa apropiada,
- la clonación de los ácidos nucleicos así
obtenidos, en un vector apropiado y la recuperación del ácido
nucleico buscado con ayuda de una sonda apropiada, seleccionada
entre las descritas más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento especialmente ventajoso para la
preparación de las secuencias nucleicas de la invención incluye las
siguientes etapas:
- la síntesis de ADN utilizando el método
automatizadode la \beta-cianetil fosforamidita
descrito en Bioorganic Chemistry 4; 274-325
(1986),
- la clonación de los ácidos nucléicos así
obtenidos, en un vector apropiado y la recuperación del ácido
nucleico por hibridación con una sonda apropiada, seleccionada
entre las descritas más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro procedimiento para la preparación de las
secuencias de nucleótidos de la invención comprende las siguientes
etapas:
- el ensamblaje de los oligonucleótidos
sintetizados químicamente, provistos en sus extremos de sitios de
restricción diferentes, cuyas secuencias son compatibles con la
sucesión de aminoácidos del polipéptido natural, según el principio
descrito en el Proc.Natl.Acad. Sci, USA, 80;
7461-7465, (1983),
- la clonación de los ácidos nucleicos así
obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido
nucleico mediante hibridación con una sonda apropiada,,
seleccionada entre las células descritas más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene igualmente por objeto todo
ácido nucleico recombinante que contenga al menos una secuencia
nucleica de la invención, insertada en un ácido nucleico heterólogo
frente a dicha secuencia nucleica.
La invención se refiere más especialmente a un
ácido nucleico recombinante, tal y como se describe más arriba, en
el que la secuencia nucleica de la invención está precedida de un
promotor(especialmente un promotor inducible), bajo cuyo
control la trascripción de dicha secuencia es susceptible de ser
efectuada y, dado el caso, seguida de una secuencia que codifica
para las señales de finalización de la trascripción.
La invención se refiere a todo un vector
recombinante, utilizado en particular para la clonación de una
secuencia nucleica de la invención y/o la expresión del polipéptido
codificado por esta secuencia y caracterizado porque contiene un
ácido nucleico recombinante, tal y como se ha definido más arriba,
en uno de los lugares no esenciales para su replicación.
Como ejemplo de uno de los vectores mencionados
anteriormente, se citan los plásmidos, los cósmicos o los
fagos.
fagos.
La solicitud describe igualmente un
procedimiento para la preparación de un polipéptido de la invención,
mediante la transformación de un huésped celular con la ayuda de un
vector recombinante del tipo indicado anteriormente, seguido del
cultivo del huésped celular así transformado y de la recuperación
del polipéptido en el medio de cultivo.
Por consiguiente, la invención se refiere a todo
huésped celular transformado por un vector recombinante, tal y como
se ha definido anteriormente, que contiene los elementos de
regulación que permiten la expresión de la secuencia nucleica que
codifica para un polipéptido de la invención.
La solicitud describe también muy especialmente
un procedimiento para la preparación de un polipéptido de la
invención, que comprende las siguientes etapas:
- dado el caso, la amplificación de la cantidad
de la cantidad de la secuencia de nucleótidos que codifican para
dicho polipéptido, con ayuda de dos cebadores de ADN seleccionados
de forma que uno de los cebadores sea idéntico a los 10 a 30
primeros nucleótidos de la secuencia de nucleótidos que codifica
para dicho polipéptido, mientras que el otro cebador es
complementario de los 10 a 30 últimos nucleótidos (o hibrida con
estos 10 a 30 últimos nucleótidos) de dicha secuencia de
nucleótidos o, al contrario, de forma que uno de estos cebadores
sea idéntico a los 10 a 30 últimos nucleótidos de dicha secuencia,
mientras que el otro cebador es complementario de los 10 a 30
primeros nucleótidos (o hibrida con los 10 a 30 primeros
nucleótidos) de dicha secuencia de nucleótidos, seguida de la
introducción de dichas secuencias de nucleótidos amplificadas de
esta manera, en un vector apropiado,
- el cultivo, en un medio de cultivo apropiado,
de un huésped celular previamente transformado por un vector
apropiado, que contiene un ácido nucleico de la invención, que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho
polipéptido y
- la recuperación a partir de dicho medio de
cultivo del polipéptido producido por dicho huésped celular
transformado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos descritos en la solicitud pueden
prepararse mediante las técnicas clásicas en el campo de la
síntesis de péptidos. Esta síntesis se puede realizar en solución
homogénea o en fase sólida.
Por ejemplo, se recurrirá a la técnica de la
síntesis en solución homogénea descrita por HOUBENWEYL en el
trabajo titulado "Methode der Organischen Chemie" (Método de
Química Orgánica) editado por E. Wunsch, vol. 15-I
y II., THIEME, Stuttgart 1974.
Este método de síntesis consiste en unir
sucesivamente dos a dos los aminoacilos sucesivos en el orden
requerido o en unir los aminoacilos y los fragmentos previamente
formados y, que contienen ya varios aminoacilos en el orden
apropiado, o incluso varios fragmentos previamente preparados de
esta forma, entendiendo que se habrá tenido cuidado de proteger
previamente todas las funciones reactivas que llevan estos
aminoacilos o fragmentos, con excepción de las funciones amino, por
un lado, y de las funciones carboxilo, por otro, o viceversa, que
deben intervenir normalmente en la formación de los enlaces
peptídicos, especialmente tras la activación de la función
carboxilo, según los métodos bien conocidos de la síntesis de
péptidos. Como variante, se podrá recurrir a las reacciones de
acoplamiento que utilizan reactivos de acoplamiento clásicos del
tipo carbodiimida, como por ejemplo la
1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida.
Cuando el aminoacilo utilizado posee una función
ácida suplementaria (especialmente en el caso del ácido glutámico),
estas funciones estarán protegidas, por ejemplo, con grupos como el
éster terc-butílico.
En el caso de la síntesis progresiva, aminoácido
por aminoácido, la síntesis comienza con preferencia con la unión
del aminoácido C-terminal con el aminoácido que
corresponde al aminoacilo vecino en la secuencia deseada y así sin
interrupción, hasta el aminoácido N-terminal. Según
otra técnica preferida de la invención, se recurre a la descrita
por R.D. MERRIFIELD en el artículo titulado "Solid phase peptide
synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45,
2149-2154).
Para fabricar una cadena peptídica según el
procedimiento de MERRIFIELD, se recurre a una resina de polímero
muy porosa, sobre la cual se fija el primer aminoácido C terminal de
la cadena. Este aminoácido está fijado a la resina por medio de su
grupo carboxilo y su función amino está protegida, por ejemplo con
el grupo t-butiloxicarbonilo.
Cuando el primer aminoácido C terminal está
fijado de esta manera a la resina, se separa el grupo protector de
la función amino lavando la resina con un ácido.
En el caso de que el grupo protector de la
función amino sea el grupo t-butiloxicarbonilo, éste
se puede eliminar por tratamiento de la resina con ayuda del ácido
trifluoroacético.
Se acopla a continuación el segundo aminoácido
que facilita el segundo aminoacilo de la secuencia buscada, a
partir del residuo aminoacil C terminal, sobre la función amino
desprotegida del primer aminoácido C terminal fijado sobre la
cadena. Preferiblemente, la función carboxilo de este segundo
aminoácido está activada, por ejemplo, con
diciclohexilcarbodiimida, y la función amino está protegida, por
ejemplo, con t-butiloxicarbonilo.
Se obtiene así la primera parte de la cadena
peptídica buscada, que contiene dos aminoácidos y cuya función
amino terminal está protegida. Al igual que antes, se desprotege la
función amino y se puede proceder a continuación a la fijación del
tercer aminoacilo, en condiciones análogas a las de la adición del
segundo aminoácido C terminal.
De esta manera, se fijan unos tras otros los
aminoácidos que van a constituir la cadena peptídica, sobre el
grupo amino, previamente desprotegido cada una de las veces, de la
porción de la cadena peptídica ya formada y que está unida a la
resina.
Cuando la totalidad de la cadena peptídica
deseada se ha formado, se eliminan los grupos protectores de los
diferentes aminoácidos que constituyen la cadena peptídica y se
separa el péptido de la resina, por ejemplo, mediante ácido
fluorhídrico.
La invención será además ilustrada mediante los
ejemplos contenidos en la descripción detallada que sigue, no
representando esta última ningún carácter limitativo.
El objeto de la presente invención es la
clonación del sistema adhesión-invasión de
Typhi.
La cepa utilizada es la cepa Ty 2 de
Typhi registrada en la Colección del INSTITUTO PASTEUR con la
referencia CIP 55-35.
Partiendo de una colección de 2000 mutantes
obtenidos independientemente por inserción de un transposón derivado
de Tn5 (MANOIL C. y BECKWITH, J., 1985. TnPhoA: a transposon probe
for protein export signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
8129-8133) en el genoma de la cepa Typhi Ty
2, se ha obtenido un mutante que ya no era invasivo en el modelo de
las células HeLa en cultivo. La técnica de infección de las células
HeLa en cultivo por Typhi es la siguiente: se cultivan las
células HeLa en medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino
fetal. Estas células se infectan con Typhi en una proporción
de 100 bacterias por célula. Tras una hora de incubación a 37ºC,
las células se lavan con el medio de cultivo, después se vuelven a
poner en cultivo en presencia de 100 \mug/ml de gentamicina. Las
bacterias intracelulares se detectan tras 24 h con un colorante
Giemsa.
Tras la digestión del genoma de este mutante con
la endonucleasa de restricción SacI, las pruebas de hibridación
sobre papel de nitrocelulosa han mostrado que el transposón estaba
insertado en un fragmento SacI de 2 kilobases (kb).
Como el transposón utilizado codifica para la
resistencia a la kanamicina, el fragmento SacI de 2 kb que contiene
el transposón, ha podido clonarse en el sitio SacI del plásmido
pUC18 (VIEIRA J. y MESSING J., 1982. The PUC plasmids, an
M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and
sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19,
259-268). Utilizando este plásmido recombinante se
han aislado las secuencias nucleicas objeto de la presente
invención.
El ADN del genoma de la cepa Ty 2 se ha digerido
con la endonucleasa SacI y los productos de esta restricción han
sido ligados al sitio SacI del vector de clonación puC18. Esta
mezcla de ligación se ha utilizado para transformar la cepa
Escherichia coli HB101 (registrada en la Colección del
INSTITUTO PASTEUR con la referencia CIP 102400). La selección de
los transformados se ha efectuado sobre agar nutritivo que contiene
100 \mug/ml de ampicilina. Tras incubación durante 24 horas, en
estufa a 37ºC, las transformadas se han transferido a discos de
nitrocelulosa dispuestos sobre agar nutritivo, que contienen 100
\mug/ml de ampicilina. Con vistas a proceder a una hibridación
in situ, estos discos se han tratado a continuación con una
solución desnaturalizante (NaOH 0,5M), seguido de una solución
neutralizante (acetato amónico IM, NaOH, 0,02 M). El ADN liberado y
desnaturalizado con estos tratamientos se ha fijado sobre los
discos de nitrocelulosa calentando a 80ºC durante 3 horas.
Estos discos de nitrocelulosa así preparados, se
han hibridado con el fragmento SacI de 2 kb que contiene el
transposón y que está marcado con ^{32}P. Las hibridaciones se han
realizado a 65ºC durante 24 horas en 6 x SSC (1 x SSC está
constituido por NaCl 0,15M y citrato trisódico 0,015M, a pH 7) en
medio de Denhardt (0,1% Ficoll; 0,1%
polivinil-pirrolidona; 0,1% de albúmina de suero
bovino).
Asimismo, se ha aislado un clon de E.
coli HB101 que contiene un plásmido recombinante constituido por
el vector de clonación pUC18, en el cual estaba insertado un
fragmento SacI de 2kb (delimitado por los sitios S1 y S2 en el mapa
de restricción de este fragmento, que está representado en la figura
1 con un trazo más grueso).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del genoma de la cepa Ty 2 se ha digerido
con la endonucleasa HindIII. Los productos de la digestión,
separados por electroforesis en gel de agarosa, se han transferido
por capilaridad a papel de nitrocelulosa. A continuación, se han
hibridado en las condiciones descritas más arriba, con el fragmento
SacI-BamH1 de 1,1 kb (fragmento A de la figura 1) o
con el fragmento HindIII-EcoR1 de 1,3 kb (fragmento
B de la figura 1), siendo ambos internos al fragmento SacI de 2
kb.
Se ha constatado que el fragmento SacI de 2 kb
estaba englobado por 2 fragmentos HindIII de un tamaño de 2,3 kb y
5,6 kb respectivamente, en el genoma de la cepa Typhi Ty 2
(es decir un fragmento de 7,9 kb, delimitado por los sitios H_{1}
Y H_{2} en el mapa de restricción enzimática de esta región, que
se representa en la figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del plásmido recombinante que contiene el
fragmento SacI de 2kb se ha sometido a restricción con las
endonucleasasa SacI y HindIII. Esta doble digestión libera un
fragmento SacI-HindIII de 487 pares de bases que se
ha reclonado entre los sitios de restricción SacI y HindIII del
vector de clonación pUC18.
Este fragmento SacI-HindIII de
487 pares de bases, denominado en lo sucesivo "Sonda para
Salmonella", corresponde a la secuencia nucleica (I)
definida más arriba. La posición de este fragmento
SacI-HindIII en el fragmento SacI de 2 kb se indica
en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para efectuar este control, las cepas utilizadas
se han cultivado durante 24 horas a 37ºC en 200 \mul de caldo
nutritivo en placas microvaloradas de 96 pocillos. Con la ayuda de
un inoculador multipunto, estas cepas se vuelven a poner en cultivo
durante 5 horas a 37ºC sobre un papel de nitrocelulosa dispuesto
sobre una placa de agar nutritivo. La hoja de papel de
nitrocelulosa se trata y se utiliza para los experimentos de
hibridación in situ.
Para preparar la sonda para Salmonella,
el plásmido recombinante (pUC18 que contiene el fragmento
SacI-HindIII de 487 pares de bases) se ha digerido
con las endonucleasas SacI y HindIII. Tras la separación de los
productos de esta digestión por electroforesis en gel de agarosa,
la sonda para Salmonella se ha purificado por
electroelución. A continuación, se ha marcado con ^{32}P mediante
desplazamiento de la mella.
Los experimentos de hibridación se han realizado
a 65ºC en 6 x SSC y en medio de Denhardt durante 18 horas de
reacción. En estas condiciones experimentales, la especificidad de
la sonda para Salmonella se ha controlado con 768 cepas
bacterianas, que se dividen en 384 cepas no pertenecientes al género
Salmonella y 384 cepas pertenecientes al género
Salmonella y que representan a las siete subespecies del
género Salmonella. Estas 768 cepas proceden de la Colección
del Centro Colaborador de la OMS de Consulta e Investigación para
la Salmonella y de la colección del Centro Nacional para la
Salmonella.
Ninguna de las 384 cepas que no pertenecían al
género Salmonella han respondido a la sonda para
Salmonella.
De las 384 cepas de Salmonella, 382 han
respondido a la sonda para Salmonella. Las dos cepas que no
han respondido a la sonda para Salmonella pertenecen, una al
serotipo Wedding y la otra al serotipo Zuerich. Se trata en los dos
casos de la cepa de referencia del serotipo. Para estas dos cepas,
se ha verificado que no son invasivas en el modelo sobre células
HeLa en cultivo y que no poseen el fragmento homólogo de la sonda
para Salmonella, ni siquiera el fragmento SacI de 2 kb.
\vskip1.000000\baselineskip
En un producto biológico, no se puede detectar
hoy en día una bacteria que pertenezca a una especie dada entre
decenas de millones de otras bacterias. Para poder poner en
evidencia la presencia de una Salmonella en un producto
biológico polimicrobiano, con ayuda de una sonda de nucleótidos, es
indispensable proceder:
- \bullet
- a una amplificación del número de bacterias a detectar poniendo en cultivo la muestra a analizar;
- \bullet
- y a una amplificación del número de copias de la diana que se quiere detectar con la sonda de nucleótidos, utilizando la técnica de amplificación génica [o técnica de la "Polymerase Chain Reaction" o PCR (Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa)].
Para la Salmonella, el fragmento
SacI-HindIII de 487 pares de bases (la sonda para
Salmonella) es específico del género Salmonella. Si a
partir de la muestra biológica a analizar, se pone en evidencia la
presencia de este fragmento, se podrá deducir que la muestra
estudiada está contaminada con Salmonella.
A partir de la secuencia de nucleótidos (I) de
la sonda para Salmonella, se han seleccionado dos cebadores
utilizados para llevar a cabo la técnica de amplificación
génica:
Las sucesiones de 17 bases correspondientes a
los dos cebadores, designados como SS-1 y
SS-2 anteriormente en la memoria descriptiva, se
han utilizado para amplificar el número de copias para
Salmonella.
Este protocolo se ha puesto a punto utilizando
el equipo "Gene amp" (marca registrada) de Perkin Elmer Cetus
(ref. nº 801-0055). Los cebadores
SS-1 y SS-2 se han utilizado en una
concentración final de 200 pmoles. La mezcla de reacción se ha
realizado según las instrucciones del fabricante utilizando 10
\mul de la solución que contiene el ADN a amplificar, en un
volumen final de 50 \mul. Esta mezcla se ha sometido a 20 ciclos
de amplificación utilizando el dispositivo "DNA thermal cycler"
(marca registrada) de Perkin Elmer Cetus (ref. nº
801-0177), en las condiciones siguientes:
- \bullet
- etapa de desnaturalización a 94ºC durante 120 segundos
- \bullet
- etapa de reasociación a 68ºC durante 180 segundos,
- \bullet
- y etapa de elongación a 72ºC durante 90 segundos.
El ADN amplificado de esta manera, se ha
visualizado por electroforesis (120 voltios durante 30 minutos) en
gel de agarosa, que contiene 2% de agarosa con punto de fusión bajo
(BRL; ref. 5517) y % de agarosa normal (Sigma; ref.
A-6877). Tras la electroforesis, el ADN se
transfiere a un papel de nitrocelulosa y se hibrida con la sonda
para Salmonella marcada con ^{32}P.
La cepa LT2 de Salmonella, serotipo
Typhimurium, registrada en la Colección del Instituto Pasteur
con la referencia CIP 60.62T y la cepa HB101 de E.coli (CIP
102.400), se han utilizado para estudiar la especificidad y la
sensibilidad de la técnica PCR en las condiciones experimentales
descritas más arriba.
La solución que contiene el ADN a amplificar se
ha preparado de la siguiente manera:
1) las bacterias completas se ponen en
suspensión en 100 \mul de agua destilada;
2) la suspensión bacteriana se trata durante 10
minutos a 100ºC en un microtubo de centrifugación;
3) se centrifuga a continuación durante 3
minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga. Evitando el
residuo de la centrifugación, se toman 10 \mul de esta solución
para proceder a la amplificación génica.
Cuando se utiliza un cultivo puro de la cepa LT2
de Salmonella serotipo Typhimurium, se detecta el ADN
de 10 bacterias o menos en 10 \mul de la solución sometida a
amplificación. Cuando se utiliza la cepa HB101 de E. coli,
no se detecta ninguna amplificación, incluso trabajando con el ADN
correspondiente a 10^{6} bacterias en 10 \mul de la solución
sometida a amplificación. Cuando se hace una mezcla de dos cepas
bacterianas, se detecta el ADN de 100 o menos de 100
Salmonella mezclado con el ADN de 10^{6} E. coli
HB101 en 10 \mul de la solución sometida a amplificación.
La muestra utilizada es un lote de carne picada
destinada a la alimentación animal. Está fuertemente contaminada
por bacterias grampositivas o gramnegativas, aerobias o anaerobias.
Un conteo aproximado efectuado al microscopio, permite evaluar el
número total de bacterias en 10^{9} por gramo de carne picada.
Haciendo un recuento sobre las placas de agar nutritivo, se ha
visto que el número de bacterias aerobias cultivadas en este medio
es igual a 10^{8} por gramo de carne picada. Esta muestra no
contiene Salmonella: los tres análisis efectuados con las
técnicas clásicas de bacteriología alimentaria dieron negativos.
5.4.1. Preparación de la muestra para el
análisis por PCR. La muestra se ha reconstituido añadiendo un
número variable de Salmonella serotipo Typhimurium
(10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5} ó 10^{6}) por 25 g de
carne picada. Esta muestra reconstituida se pone en cultivo, en 200
ml de caldo de tripto-caseína soja, en un
erlenmeyer de 1 litro durante 18 horas a 37ºC, con agitación. Se
tratan de manera idéntica 25 g de carne picada sin
Salmonella.
Al día siguiente, el erlenmeyer se deja durante
15 minutos, sin agitación, a la temperatura del laboratorio de
forma que se sedimentan los restos más grandes. Se toma entonces de
la superficie del caldo 1 ml, el cual se pasa a un microtubo para
centrifugación y se centrifuga durante 3 minutos a la velocidad
máxima en una microcentrífuga. El sobrenadante se elimina
totalmente con ayuda de una pipeta Pasteur. El residuo bacteriano
se vuelve a suspender en su totalidad en 100 \mul de agua
destilada, pasándolo a continuación durante 10 minutos a 100ºC. Se
centrifuga de nuevo durante 3 minutos a la velocidad máxima.
Evitando el residuo de la centrifugación, se toman 10 \mul de
esta solución para proceder a la amplificación génica en las
condiciones ya indicadas.
Cuando se parte de los 25 gramos de muestra sin
Salmonella, no se puede detectar ninguna amplificación del
ADN contenido en los 10 \mul de la solución amplificada. Cuando se
parte de 25 gramos de muestra que contiene 10^{2} o más
Salmonella, se detecta una amplificación del ADN contenido en
los 10 \mul de la solución amplificada.
Claims (9)
1. Un ácido nucleico aislado susceptible de
utilizarse como sonda y/o cebador par la detección in vitro
de bacterias del género Salmonella, caracterizado
porque es susceptible de hibridarse a 65ºC en 6x SSC en medio
Denhardt, con un fragmento HindIII de 7,9 kb de la cepa
Salmonella Typhi Ty2 que comprende la cadena nucleotídica
(I) siguiente:
2. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque es susceptible de
hibridarse a 65ºC en 6x SSC en medio Denhardt con un fragmento SacI
de 2 kb de la cepa Salmonella Typhi Ty2 que comprende la
cadena nucleotídica (I).
3. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque es susceptible de
hibridarse a 65ºC en 6x SSC en medio Denhardt con la cadena
nucleotídica (I) siguiente:
4. Procedimiento de detección in vitro de
la presencia eventual de bacterias del género Salmonella en
una muestra biológica susceptible de contenerlas,
caracterizado porque comprende:
- dado el caso, el cultivo de la muestra,
- dado el caso, la amplificación del número de
copias de la secuencia nucleica a detectar con la ayuda de un par
de cebadores nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1 a 3,
- la puesta en contacto de la muestra con una
sonda nucleica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, a
65ºC en 6x SSC en medio Denhardt,
- la detección eventual de los complejos de
hibridación formados entre la sonda mencionada anteriormente y la
secuencia nucleica a detectar.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque la etapa de
amplificación de la secuencia nucleica a detectar, comprende las
siguientes etapas:
- una etapa de extracción del ácido nucleico a
detectar, perteneciente al genoma de las bacterias del género
Salmonella, eventualmente presentes en la muestra biológica,
y dado el caso, una etapa de tratamiento con la ayuda de una
transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico, si éste último está
en forma de ARN,
- un ciclo que comprende las siguientes
etapas:
- \bullet
- desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que lleva a la formación de un ácido nucleico de hebra simple;
- \bullet
- hibridación de cada una de las hebras del ácido nucleico, obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos un par de los cebadores anteriormente mencionados;
- \bullet
- formación a partir de los cebadores, de ADN complementarios a las hebras sobre las cuales se hibridan, en presencia de una ADN polimerasa y de cantidades apropiadas de los cuatro nucleósidos trifosfato diferentes (dNTP), lo que lleva a la formación de un mayor número de ácidos nucleicos de doble hebra para detectar que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número de veces determinado, para poder obtener dicha secuencia nucleica a detectar, eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente que permita su detección.
6. Un equipo para la detección de la presencia
eventual de bacterias del género Salmonella en una muestra
biológica caracterizado porque comprende:
- dado el caso, un medio apropiado para el
cultivo de la muestra biológica,
- al menos un par de cebadores nucleicos de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3,
- dado el caso, reactivos apropiados para la
realización del ciclo de amplificación, en particular la ADN
polimerasa, y cantidades apropiadas de los 4 nucleósidos trifosfato
diferentes,
- una (o varias) sonda(s)
nucleica(s) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3,
que pueda ser marcada, capaz de hibridarse con la (o las)
secuencia(s) nucleica(s) a detectar,
- dado el caso reactivos apropiados para la
realización de la reacción de hibridación entre la (o las)
sonda(s) y la (o las) secuencia(s) nucleica(s)
a detectar anteriormente mencionadas,
- un tejido o fluido biológico de referencia
desprovisto de secuencias nucleicas susceptibles de hibridarse con
la (o las) sonda(s) mencionada(s) anteriormente.
7. Un ácido nucleico recombinante que contiene
al menos un ácido nucleico aislado de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, insertado en un ácido nucleico heterólogo
frente a dicho ácido nucleico aislado.
8. Un ácido nucleico recombinante de acuerdo con
la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico
aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 está
precedido por un promotor (especialmente un promotor inducible)
bajo cuyo control, la transcripción de dicho ácido nucleico aislado
es susceptible de efectuarse y, dado el caso, seguida de una
secuencia que codifica para las señales de finalización de la
transcripción.
9. Los vectores recombinantes, especialmente
plásmidos, cósmidos o fagos, que contienen un ácido nucleico
recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación
8, en uno de sus sitios no esenciales para su replicación.
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Families Citing this family (16)
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| EP0707651A1 (en) * | 1993-04-26 | 1996-04-24 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF $i(SALMONELLA) |
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| PT889120E (pt) * | 1994-12-09 | 2002-09-30 | Microscience Ltd | Genes de virulencia no grupo vgc2 de salmonella |
| FR2729392B1 (fr) * | 1995-01-16 | 1997-03-28 | Pasteur Institut | Oligonucleotides pour la detection de salmonella |
| US6936425B1 (en) | 1998-09-04 | 2005-08-30 | Microscience Limited | Attenuated salmonella SP12 mutants as antigen carriers |
| US6165721A (en) * | 1999-04-12 | 2000-12-26 | Becton Dickinson And Company | Amplification and detection of Salmonella spp |
| GB9910812D0 (en) | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| US7241566B2 (en) * | 2001-06-22 | 2007-07-10 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella sp., E. coli O157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US6696254B2 (en) * | 2001-11-21 | 2004-02-24 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection and identification of enteric bacteria |
| WO2005030027A2 (en) * | 2003-04-29 | 2005-04-07 | The Cleveland Clinic Foundation | Salmonella detection identification |
| US20060246463A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-02 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
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| US5055394A (en) * | 1983-10-13 | 1991-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Nucleic acid probe and method for the rapid detection of typhoid fever bacteria |
| US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
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| CA2009708A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-13 | Jane D. Madonna | Nucleic acid probe for the detection of salmonella human pathogens |
| FR2664614B1 (fr) * | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
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