DE69835414T2

DE69835414T2 - Mycobacterium tuberculosis spezifisches DNS-Fragment

Info

Publication number: DE69835414T2
Application number: DE69835414T
Authority: DE
Inventors: Ranjana Srivastava; Deepak Kumar; Brahm Shanker Srivastava
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2018-03-26
Also published as: DE69835414D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein für Mycobacterium tuberculosis spezifisches DNA-Fragment, das IS-artige und repetitive Sequenzen enthält, ein ex vivo-Verfahren zur Herstellung eines solchen DNA-Fragmentes und die ex vivo-Verwendung eines solchen DNA-Fragmentes, z. B. zur schnellen Diagnose einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion in klinischen Proben und zur Identifikation klinischer Isolate von Mycobacterium tuberculosis. Das DNA-Fragment kann verwendet werden, um Informationen über die Epidemiologie einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion zu erhalten. Diese Erfindung betrifft spezifisch die Verwendung sequenzspezifischer DNA-Fragmente zur Diagnose von Mycobacterium tuberculosis und Stämmen von Mycobacterium tuberculosis. Ein Ziel der Untersuchung der Epidemiologie der Tuberkulose ist es, die genetische Diversität des krankheitsverursachenden Organismus Mycobacterium tuberculosis aufzuklären und Informationen über die Variabilität von Stamm zu Stamm zu erhalten. Dies kann durch molekularepidemiologische Verfahren einschließlich von DNA-Fingerprinting und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismusanalyse (RFLP-Analyse) erreicht werden. Solche Ansätze können die Untersuchung von stellenweisen Ausbrüchen, Übertragung und Pathogenese unterstützen und können als Marker zur Typisierung der Stämme verwendet werden.
Die Tuberkulose (TB) ist eine Hauptursache infektiöser Sterblichkeit. Laut einem aktuellen WHO-Bericht war die Anzahl der Todesfälle, die der Tuberkulose zuzuschreiben sind, 1995 größer als in irgendeinem anderen Jahr in der Geschichte (Moran, N. 1996, WHO Issues Another Gloomy Report, Nature Medicine 4 : 377). Die Tuberkulose bleibt weltweit weitverbreitet und stellt insbesondere in den Entwicklungsländern ein bedeutendes Gesundheitsproblem dar. Ein Drittel der gesamten Weltbevölkerung (beinahe zwei Milliarden Menschen) ist mit Mycobacterium tuberculosis infiziert, von denen 5 bis 10 % die Krankheit entwickeln. TB verursacht mehr als 3 Millionen Todesfälle pro Jahr, und unlängst hat die WHO vorhergesagt, dass in den nächsten zehn Jahren 30 Millionen Menschen an TB sterben werden (Joint International Union Against Tuberculosis and World Health Organization Study Group, Tubercl. 63 : 157–169 (1982)).
Die Tuberkulose wird von einem grampositiven, säurefesten Bakterium, Mycobacterium tuberculosis oder M. bovis, verursacht. Dies sind die Tuberkelbazillen der Mycobacteriaceen-Familie. M. bovis ist eine Spezies, die bei Nutzvieh Tuberkulose hervorruft und auf Menschen und andere Tiere übertragen werden kann, bei denen es Tuberkulose auslöst. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt wird praktisch alle Tuberkulose beim Menschen von Mycobacterium tuberculosis verursacht. Gelegentlich resultieren Infektionen von anderen Mycobacterien-Spezies, die gewöhnliche Umwelt-Saprophyten sind. Diese Spezies wurden kollektiv als MOTT („Mycobacteria other than typical tubercle", andere Mycobakterien als typische Tuberkeln), Umweltbazillen oder tuberkuloide Bazillen bezeichnet. Der Unterschied zwischen den beiden Infektionen besteht darin, dass die Infektion mit Mycobacterium tuberculosis stets von Wirt zu Wirt übertragen wird. Im Gegensatz dazu übertragen mit anderen Mycobakterien infizierte Menschen die Krankheit selten.
Daher ist der Zentralbestandteil jedes Tuberkulosebekämpfungsprogramms die Eingrenzung der Krankheit. Die Identifikation infizierter Individuen, insbesondere solcher, die mit der größten Wahrscheinlichkeit lebensfähige Bazillen übertragen können, hat bei Strategien zur Tuberkulosebekämpfung die erste Priorität. Eine frühe und rechtzeitige Diagnose der Tuberkulose ist von ausschlaggebender Bedeutung zur Identifikation von Individuen, die die Bazillen tragen. Daher ist ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Tuberkulose-Diagnose entstanden, das schnell, sensitiv und spezifisch ist. Zu den zur Identifikation von Mycobacterium tuberculosis verwendeten Routinediagnoseverfahren gehören säurebeständige Schmiertests in klinischen Proben wie Sputum, auf dem Wachstum der Bazillen auf spezifischen Medien basierende Tests und differentielle biochemische Tests. Die Kultur der Mycobakterien aus klinischen Proben ist am verlässlichsten und stellt eine definitive Diagnose der Tuberkulose bereit. Obgleich sie zu 100 % spezifisch ist, erfordert sie infolge des langsamen Wachstums der Organismen und weiterer biochemischer Tests, bevor eine Identifikation getroffen werden kann, sechs bis acht Wochen (Heifests, L. B. & Good, R. C. 1994, Current Laboratory Methods for the Diagnosis of Tuberculosis, Tuberculosis Pathogenesis, Protection and Control (ed. B. R. Bloom) ASM Washington DC, pp. 85–110).
Auf Antigen- und Antikörperdetektion in Körperflüssigkeiten und in jüngerer Zeit auf Nukleinsäuresonden (sequenzspezifischen DNA-Fragmenten) basierende Verfahren wurden als Reagenzien zur schnellen Diagnose und Überwachung der Tuberkulose-Epidemiologie entwickelt (Young, D. B. & Mehlert, A. 1989, Serology of Mycobacteria: Characterization of Antigens Recognized by Monoclonal Antibodies, Rev. Infec. Dis.12: S431–S435; Pfyfer, G. E., Kisling, P., Jahn, E. M. I., Martin, H., Salfinger; W. M. & Weber, R. 1996. Diagnostic Performance of Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test with Cerebrospinal Fluid, Other Non Respiratory and Respiratory Specimens, J. Clin. Microbiol. 34 : 834–841).
Die DNA-Sonden verwenden eine weite Palette von Sequenzen aus Mycobacterium tuberculosis, die von vollständiger genomischer DNA bis zu in einzelnen Kopien vorliegenden Sequenzen und zu repetitiven DNA-Elementen reichen. Bei direkter Erprobung an klinischen Proben haben sie sich als hochspezifisch und empfindlich erwiesen und verringern die Zeit zur Diagnose der Tuberkulose auf dramatische Weise (Kiehn, T. E. 1993. The Diagnostic Mycobacteriology Laboratory of the 1990's. Clin. Infect. Dis.17 (suppl. 2) S447–S454).
Mehrere sequenzspezifische Sonden wurden als Ziele zur Identifikation von Mycobacterium tuberculosis durch Amplifikation spezifischer Sequenzen durch PCR verwendet.
IS6110 ist ein in den Mitgliedern des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum und M. microti) vorliegendes IS-Element.
Verschiedene Regionen von IS6110 wurden unter Verwendung verschiedener Primer-Sätze für die PCR-basierte Diagnose amplifiziert, wie z. B. die 123-Basenpaar(bp) oder die 245-bp-Region(Einsenach, K. D., Cave, M. D., Bates, J. H. & Crawford, J. T. 1990. Polymerase chain reaction amplification of repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis.161 : 977–981; Kolk, A. H. J., Schuitema, A. R. J., Kuijper, S., Van Leeuwen J., Hermans, P. W. M., Van Embden, J. D. A., Hartskeerl, R. A., 1992, Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a non radioactive detection system. J. Clin. Microbiol. 30 : 2567–2575).
IS6110 hat einige Nachteile. Es sind mehrere Mycobacterium tuberculosis-Stämme mit einer oder keiner Kopie von IS6110 beschrieben worden (Sahadevan, R., Narayanan, S., Paramsivam, C. N., Prabhakar, R. & Narayanan, P. R. 1995. Restriction fragment length polymorphism typing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from patients with pulmonary tuberculosis in Madras, India by use of direct repeat probe. J. Clin. Microbiol. 33 : 3037–3039; Van Soolingen, D., Dehass, P. E. W., Hermans, P. W. M., Groenen, P. M. A. & Van Embden, J. D. A. 1993. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis, J. Clin. Microbiol. 31 : 1987–1995). So besteht die Möglichkeit, dass das Repertoire von Mycobacterium tuberculosis-Stämmen, die auf der ganzen Welt vorliegen, unter Verwendung eines einzelnen repetitiven Elements oder einer DNA-Sonde, die für Mycobacterium tuberculosis spezifisch ist, nicht selek tiert beziehungsweise amplifiziert wird. Die Suche nach neueren DNA-Sonden ist ein fortwährendes Erfordernis.
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, Mycobacterium tuberculosis in einer klinischen Probe zu detektieren.
Eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein DNA-Fragment zu beschreiben, das eine IS-artige Sequenz und repetitive Sequenzen enthält.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein DNA-Fragment, das eine IS-artige Sequenz und repetitive Sequenzen enthält, zu verwenden, um Mycobacterium tuberculosis ex vivo zu detektieren.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein ex vivo-Verfahren zur Herstellung eines DNA-Fragments, das eine IS-artige Sequenz und repetitive Sequenzen enthält, zu beschreiben.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine 1291 Basenpaar lange Sequenz mit einer IS-artigen Sequenz und repetitiven Sequenzen oder einen Teil oder ein Bruchstück der 1291 Basenpaar langen Sequenz zu verwenden, um Mycobacterium tuberculosis ex vivo zu detektieren.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine squenzspezifische DNA-Sonde zur Identifikation von in klinischen Proben vorliegendem Mycobacterium tuberculosis herzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine sequenzspezifische DNA-Sonde zur Identifikation klinischer Isolate von Mycobacterium tuberculosis zu entwickeln, um es von anderen Mycobakterien zu unterscheiden, die in klinischen Proben vorliegen können.
Die erfindungsgemäßen sequenzspezifischen DNA-Sonden können zur Überwachung der Tuberkulose-Epidemiologie, zur Detektion von Polymorphismen in klinischen Isolaten von Mycobacterium tuberculosis oder zur Bereitstellung eines IS-Elements zur Transposition, Mutagenese und Geninaktivierung in Mycobakterien zur Untersuchung der Pathogenese und Virulent und zur Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden.
Die Aspekte der Erfindung sind wie in den Ansprüchen dargestellt.
Diese Erfindung betrifft ein für Mycobacterium tuberculosis spezifisches DNA-Fragment, das eine IS-artige Sequenz und repetitive Sequenzen enthält, ein ex vivo-Verfahren zur Herstellung eines solchen DNA-Fragmentes und die ex vivo-Verwendung eines solchen DNA-Fragmentes, z. B. zur schnellen Diagnose einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion in klinischen Proben, zur Identifikation von klinischen Isolaten von Mycobacterium tuberculosis und zur Verfolgung der Epidemiologie einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion. Spezifisch betrifft diese Erfindung die ex vivo-Verwendung eines sequenzspezifischen DNA-Fragmentes zur Diagnosis von Tuberkulose und von Stämmen von Mycobacterium tuberculosis. Das für Mycobacterium tuberculosis spezifische DNA-Fragment besteht aus einer 1291 Basenpaar (bp) langen Sequenz, die ein IS-artiges Element und mehrere wiederholte DNA-Sequenzen enthält.
Wenn dieses DNA-Fragment mit klinischen Proben inkubiert wird, die die interessierenden Mycobakterien enthalten können, kann die Gegenwart von Mycobacterium tuberculosis durch die Spezifität der Hybridisierung detektiert werden. Die anhand der Nukleotid-Sequenz dieses 1291 Basenpaar langen Fragments entworfenen DNA-Primer können mit klinischen Proben inkubiert werden, um die DNA von Mycobacterium tuberculosis, das in den klinischen Proben vorliegt, zu amplifizieren. Daher kann, wenn die Proben Mycobacterium tuberculosis enthalten, dieses spezifisch diagnostiziert werden. Wenn es mit genomischer DNA klinischer Isolate von Mycobacterium tuberculosis durch eine Southern-Hybridisierung hybridisiert wird, hybridisiert das DNA-Fragment spezifisch mit Mycobacterium tuberculosis-Isolaten und zeigt den Polymorphismus. Daher kann das Fragment zur spezifischen Diagnose von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen und zur Gewinnung von Informationen über die Epidemiologie von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen verwendet werden.
Mycobakterien können in Proben von Sputum, Liquor cerebrospinalis, Pleuralflüssigkeit, Urin, Ascitesflüssigkeit, Magenproben, Bronchiallavagen, Perikardialflüssigkeit, Eiter oder Lymphknotenaspiraten detektiert werden.
Eine Weise, das erfindungsgemäße für Mycobacterium tuberculosis spezifische DNA-Fragment herzustellen, besteht darin, eine genomische Bibliothek der Mycobacterium tuberculosis-DNA zu verwenden, die in einem Plasmid- oder einem Lambda-gt11-Phagen-Vektor konstruiert werden kann. Die Bibliothek der genomischen DNA- Fragmente kann mit genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis als Sonde durchmustert werden, um diejenigen Fragmente zu selektieren, die rasch mit der genomischen DNA von Mycobacterium tuberculosis hybridisieren.
Die Detektion positiver Hybridisierungssignale innerhalb von 60 Minuten kann anzeigen, dass die Klone repetitive Sequenzen in dem DNA-Fragment von Mycobacterium tuberculosis enthalten können.
Die so erhaltenen Klone können durch DNA-DNA-Hybridisierung mit der genomischen DNA von anderen Mycobakterien als Mycobacterium tuberculosis, die als Sonden verwendet werden, weiter durchmustert werden. Diejenigen Klone, die keinerlei Hybridisierungssignale erzeugen, können als Mycobacterium tuberculosis-spezifische DNA-Fragmente enthaltend ausgewählt werden.
Das erfindungsgemäße DNA-Fragment kann verwendet werden, indem man es mit Proben inkubiert, die die spezifischen interessierenden Mycobakterien (Mycobacterium tuberculosis) enthalten können. Wenn Mycobacterium tuberculosis vorliegt, wird das DNA-Fragment mit der DNA von Mycobacterium tuberculosis hybridisieren, was z. B. durch Dot-Blot oder durch ein Southern-Hybridisierungsassay detektiert werden kann.
Die Nukleotidsequenz des spezifischen DNA-Fragmentes kann bestimmt werden, und DNA-Primer zur spezifischen Amplifikation von Mycobacterium tuberculosis-DNA können entworfen werden. Die spezifischen DNA-Primer können den klinischen Proben zugesetzt werden, um Mycobacterium tuberculosis-DNA, wenn sie in der Probe vorliegt, zu amplifizieren. Das amplifizierte Produkt kann z. B. durch Agarosegelelektrophorese und Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen spezifischen DNA-Fragment sichtbar gemacht werden. Die Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) ebenso wie die Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen spezifischen DNA-Fragment können zeigen, dass die Probe Mycobacterium tuberculosis enthält, und können daher zur Detektion und Diagnose von Tuberkulose verwendet werden. Durch Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen spezifischen DNA-Fragment, können die Epidemiologie der Tuberkulose und von Mycobacterium tuberculosis verfolgt werden, da das Fragment mehrere wiederholte Sequenzen enthält und somit der Stamm-Polymorphismus von Mycobacterium tuberculosis bestimmt werden kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Durchmusterung einer rekombinanten Lambda-gt11-Bibliothek von Mycobacterium tuberculosis mit DIG-markierter denaturierter genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis durch DNA-Hybridisierung. Positive Plaques ergaben Hybridisierungssignale innerhalb von 60 Minuten und erschienen mit blauer Farbe.
2: Analyse von EcoRI-Verdaus rekombinanter Lambda-Klone durch Agarosegelelektrophorese (1 % Agarosegel). Die DNA aus den rekombinanten Phagen wurde isoliert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Lambda × HindIII (BRL) wurde als Molekulargewichtsmarker verwendet. Spur 2: Klon C8; Spur 3: Klon C10; Spur 4: Klon C16; Spur 5: Klon C33; Spur 6: Klon C38; Spur 7: Klon C41; Spur 8: Klon C60; Spur 9: Klon C70; Spur 10: Lambda × HindIII.
3: Southern-Hybridisierung von EcoRI-Verdaus rekombinanter Lambda-Klone mit DIG-markierter denaturierter genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis. Die auf dem Gel gezeigten rekombinanten DNA-Klone sind: Spur 1: Klon C70; Spur 2: Klon C60; Spur 3: Klon C41; Spur 4: Klon C38; Spur 5: Klon C33; Spur 6: Klon C16; Spur 7: Klon C10; Spur 8: Klon C8.
4: Restriktionskarte des 4,2 Kilobasenpaar langen DNA-Fragmentes von Mycobacterium tuberculosis aus dem Klon C8. Die DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen kartiert.
5: Restriktionskarte des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-Fragmentes von Mycobacterium tuberculosis aus dem Klon C8.
6: DNA-Hybridisierung des 1291 Basenpaar langen DNA-Fragmentes aus dem rekombinanten Klon CD8 mit anderer mycobakterieller DNA. Southern-Hybridisierung von EcoRI-Verdaus chromosomaler DNA verschiedener mycobakterieller Spezies (Spuren 1–7) mit dem DIG-markierten denaturierten 1291 Basenpaar langen DNA-Fragment. Spur 1: M. smegmatis; Spur 2: M. phlei; Spur 3: M. avium intracellulare-Komplex; Spur 4: M. scrofulaceum; Spur 5: M. fortuitum; Spur 6: M. kansa sii; Spur 7: M. gordonae; Spur 8: M. asiaticum; Spur 9: M. aurum; Spur 10: M. chitae; Spur 11: M. chelonae; Spur 12: M. xenopi; Spur 13: M. triviale; Spur 14: M. marinum; Spur 15: M. microti; Spur 16: M. flavescens; Spur 17: Mycobacterium tuberculosis.
7: Dot-Blot-Hybridisierung nicht-mycobakterieller DNA mit dem DIG-markierten denaturierten 1291 Basenpaar langen DNA-Fragment: 1. Salmonella typhimurium; 2. Enterobacter alginii; 3. Klebsiella pneumoniae; 4. Pseudomonas aeruginosa; 5. Proteus vulgaris; 6. Staphylococcus aureus; 7. Escherichia coli; 8. Edwardsiella sp.; 9. Mycobacterium tuberculosis; 10. DNA aus der menschlichen Plazenta.
8: DNA-Hybridisierung des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-Fragmentes mit StuI-verdauter genomischer DNA aus klinischen Isolaten von Mycobacterium tuberculosis.
9: Nukleotidsequenz des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-Fragmentes von Mycobacterium tuberculosis.
10: Aus der Nukleotidsequenz (wie in 9) des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragmentes von Mycobacterium tuberculosis hergeleitete Aminosäuresequenz.
Die Erfindung betrifft ein für Mycobacterium tuberculosis spezifisches DNA-Fragment, die ex vivo-Verfahren zur Herstellung eines solchen DNA-Fragmentes, die Charakterisierung eines solchen DNA-Fragmentes, die Nukleotidsequenz eines solchen DNA-Fragmentes und die ex vivo-Verwendung des DNA-Fragmentes oder eines Teils davon zur schnellen Diagnose von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen in klinischen Proben zur Identifikation klinischer Isolate von Mycobacterium tuberculosis und zur Überwachung der Epidemiologie der Mycobacterium tuberculosis-Infektion, wie in den Ansprüchen dargelegt. Insbesondere betrifft die Erfindung die ex vivo eines sequenzspezifischen DNA-Fragmentes zur Diagnose von Tuberkulose und von Mycobacterium tuberculosis-Stämmen.
Die Erfindung betrifft die ex vivo-Herstellung und Identifikation eines DNA-Fragmentes, das eine IS-artige Sequenz und verschiedene wiederholte Sequenzen enthält, die auf Mycobacterium tuberculosis beschränkt sind, welches das hauptsächliche ätio logische Agens der Tuberkulose ist. Insbesondere basiert sie auf der Isolation eines für Mycobacterium tuberculosis spezifischen DNA-Fragmentes, das repetitive Sequenzen enthält, wozu genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis als Sonde verwendet wird. Repetitive Sequenzen sind diejenigen, die im Genom in mehreren Kopien vorliegen und innerhalb einer kurzen Detektionsperiode mit einer genomischen DNA-Sonde positive Hybridisierung ergeben.
Hier wird der Begriff „IS-artiges Element" verwendet, um eine Insertionssequenz zu bezeichnen. Eine Insertionssequenz ist ein kleines, transpositionsfähiges Element von Bakterien (ein kleines Transposon), das sich an mehreren Orten in ein Genom einfügen kann. Insertionssequenzen funktionieren durch die Transposition von Segmenten, die sie flankieren. Üblicherweise enthalten sie Gene, die Proteine codieren, die an ihrer Transposition beteiligt sind, aber sie enthalten keine anderen Gene und haben keine anderen bekannten Wirkungen, als die Transposition zu bewirken. Die Enden jeder Insertionssequenz bestehen aus umgekehrten Wiederholungen.
Demgemäß umfasst das isolierte DNA-Fragment von Mycobacterium tuberculosis 1291 Basenpaare, wobei das DNA-Fragment die folgende Nukleotidsequenz besitzt (SEQ ID NO:1:):
Die Erfindung betrifft auch zu dieser 1291-Basen-Sequenz komplementäre Sequenzen und Sequenzen, die mit irgendeiner der zuvor genannten Sequenzen im Wesentlichen homolog sind oder die damit hybridisieren.
„Im wesentlichen homolog" ist hier so zu verstehen, dass es diejenigen Sequenzen einschließt, die eine Sequenzidentität von ungefähr 95 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr haben. Dies schließt funktionell äquivalente allelische Varianten und durch Austausch, Hinzufügung oder Deletion einzelner oder mehrerer Basen modifizierte verwandte Sequenzen ein, während es immer noch für Mycobacterium tuberculosis spezifisch ist. Die funktionale Äquivalenz deckt Nukleinsäuresequenzen ab, die gleichermaßen für Mycobacterium tuberculosis bestimmend und spezifisch sind. Der Begriff „Hybridisierung" definiert hier diejenigen Sequenzen, die unter nichtstringenten Bedingungen (6 × SSC/50 % Formamid bei Raumtemperatur) und Waschung unter niedrigstringenten Bedingungen (2 × SSC, Raumtemperatur, vorzugsweise 2 × SSC, 42 °C) oder unter Bedingungen höherer Stringenz, z. B. 2 × SSC, 65 °C (wobei SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) binden, und ebenso diejenigen, die lediglich aufgrund der Degenerationen des Codes nicht an die zuvor genannte Sequenz hybridisieren. Jedoch erstrecken sich erfindungsgemäße Sequenzen und Sequenzen zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren auch auf Sequenzen, die unter den nichtstringenten Bedingungen binden und unter den höherstringenten Bedingungen gewaschen werden, wie oben definiert.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung gibt es ein ex vivo-Verfahren zur Herstellung und Identifikationen eines DNA-Fragmentes von Mycobacterium tuberculosis, das 1291 Basenpaare umfasst. Ein solches Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Konstruktion einer genomischen Bibliothek von Mycobacterium tuberculosis in einem Vektor, einschließlich eines Lambda-gt11-Phagen oder eines Plasmids;
(b) Durchmusterung der genomischen Bibliothek von Mycobacterium tuberculosis mit genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis als Sonde zur Selektion von DNA-Fragmenten, die imstande sind, schnell und spezifisch an die genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis zu hybridisieren;
(c) Markierung der Sonde mit einer Markierungsgruppe wie z. B. Digoxigenin, Biotin, einer radioaktiven ³²P-Markierung oder alkalischer Phosphatase;
(d) Isolierung von Klonen, die repetitive DNA-Fragmente umfassen, deren positive Hybridisierungssignale innerhalb von 10 bis 60 Minuten erscheinen; und
(e) weitere Durchmusterung der oben isolierten Klone zur Validierung durch DNA-DNA-Hybridisierung mit genomischer DNA von von Mycobacterium tuberculosis verschiedener Mycobakterien als Sonde, um zu bestätigen, dass der oben selektierte Klon mit der DNA von anderen Mycobakterien als Mycobacterium tuberculosis keine Hybridisierungssignale hervorbringt.

Das in diesem Verfahren identifizierte DNA-Fragment kann zur Detektion von Mycobacterium tuberculosis verwendet werden, indem man das isolierte DNA-Fragment mit Proben inkubiert, die spezifische Mycobakterien (Mycobacterium tuberculosis) enthalten können, und die Gegenwart oder Abwesenheit von Mycobacterium tuberculosis detektiert.
Wenn DNA von Mycobacterium tuberculosis vorliegt, dann hybridisiert das DNA-Fragment mit der DNA von Mycobacterium tuberculosis.
Um ein sequenzspezifisches DNA-Fragment von Mycobacterium tuberculosis herzustellen, kann eine genomische Bibliothek von Mycobacterium tuberculosis-DNA in einem Plasmid oder Lambda-gt11-Phagen-Vektor hergestellt werden. Die Bibliothek genomischer Fragmente kann mit genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis als Sonde durchmustert zu werden, um DNA-Fragmente zu finden und zu selektieren, die mit genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis rasch hybridisieren. Dies kann DNA-Fragmente liefern, die sehr schnell mit Mycobacterium tuberculosis- DNA hybridisieren. Das DNA-Fragment kann mit klinischen Proben inkubiert werden, die in Verdacht stehen, das interessierende Mycobacterium tuberculosis zu enthalten, oder kann nach der Kultur mit Mycobacterium tuberculosis inkubiert werden. Wenn Mycobacterium tuberculosis vorliegt, dann hybridisiert das spezifische DNA-Fragment mit der Mycobacterium tuberculosis-DNA und kann z. B. durch Dot-Blot oder durch ein Southern-Hybridisierungsassay detektiert werden.
Die Nukleotidsequenz des spezifischen DNA-Fragmentes kann bestimmt werden, und auf diese Weise können spezifische DNA-Primer entworfen werden. Die so entworfenen Primer können den klinischen Proben zugesetzt werden. Wenn Mycobacterium tuberculosis in den klinischen Proben vorliegt, kann das zu dem spezifischen DNA-Fragment homologe genomische DNA-Fragment durch PCR amplifiziert werden. Das amplifizierte Produkt kann z. B. durch Agarosegelelektrophorese und Hybridisierung sichtbar gemacht werden. Sowohl die PCR-Amplifikation als auch die Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen spezifischen DNA-Fragment könnten anzeigen, dass die Probe Mycobacterium tuberculosis enthält, und können daher zur Detektion und Diagnose von Tuberkulose verwendet werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäße spezifische DNA-Fragment verwendet werden, um die Epidemiologie der Tuberkulose zu überwachen, und der Stamm-Polymorphismus von Mycobacterium tuberculosis kann bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die schnelle und spezifische Diagnose von Tuberkulose und Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis. Die Beurteilung der Diagnose mit der erfindungsgemäßen DNA-Sonde ist genau, da die DNA-Sonde aufgrund ihrer Sequenzspezifität nur die Hybridisierung und Detektion von Mycobacterium tuberculosis ermöglicht, was zeigt, dass die Probe das Mycobacterium von Interesse enthält, d. h. Mycobacterium tuberculosis.
Die Erfinder haben die Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen DNA-Fragmentes, das 1291 Basenpaare lang ist, bestimmt. Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments zeigt mehrere interessante Merkmale, darunter die Gegenwart wiederholter Sequenzen und einer IS-artigen Sequenz mit einem offenen Leserahmen. Die IS-artige Sequenz wird durch die Gegenwart zweier invertierter Wiederholungen gekennzeichnet, die auf jeder Seite von direkt wiederholten GTT flankiert sind. GTT ist eine direkte Wiederholung an den Positionen 458 bis 460 und 1193 bis 1195.
Ein Abschnitt oder Fragment der 1291-Basenpaar-Sequenz kann ebenfalls verwendet werden, um Mycobacterium tuberculosis zu detektieren.
Die aus der in 9 beschriebenen Nukleotidsequenz des 1291-Basenpaar-DNA-Fragmentes hergeleitete Aminosäurensequenz ist in 10 dargestellt.
I. Konstruktion einer rekombinanten Expressionsbibliothek von Mycobacterium tuberculosis-DNA
Eine rekombinante DNA-Expressionsbibliothek von Mycobacterium tuberculosis-DNA kann unter Verwendung des Lambda-gt11-Vektors hergestellt werden. Die Bibliothek kann auf eine solche Weise mit genomischen DNA-Fragmenten von Mycobacterium tuberculosis hergestellt werden, das alle proteincodierenden Sequenzen repäsentiert und exprimiert werden (Young, R. A., B. R. Bloom, C. M. Grosskinsky, J. Ivyani, D. Thomas and R. W. Davis, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82 : 2583–2587 (1985)).
Lambda-gt11 ist ein Bakteriophagenvektor, der imstande ist, die Expression eingefügter fremder DNA mit Transkriptions- und Translationssignalen von E. coli anzutreiben. Lambda-gt11 exprimiert die eingefügte DNA als Fusionsprotein, das mit den β-Galaktosidase-Polypeptid von E. coli verbunden ist. Lambda-gt11 und die verwendeten E. coli-Stämme (Y1088 und Y1990) wurden zuvor beschrieben (Young, R. A. and R. Davis. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80:1194–1198, 1983). Die Techniken dieser Veröffentlichungen werden hier bezugnehmend eingeschlossen. Die auf diese Weise erhaltene Bibliothek hat einen Titer von 1 × 10¹⁰ pfu/ml). Sie enthält ungefähr 60 % an Rekombinanten mit einer Durchschnittsgröße von 4 Kilobasen.
II. Durchmusterung der Lambda-gt11-Bibliothek von Mycobacterium tuberculosis mit genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis als Sonde
Genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis H37Rv und überprüfte klinische Isolate aus Indien) wurde als Sonde verwendet, um die rekombinante DNA-Bibliothek von Mycobacterium tuberculosis zu durchmustern. Diese Arbeit ist nachfolgend und mit spezifischer Bezugnahme auf die Isolation repetitiver Sequenzen beschrieben.
Die chromosomale DNA aus Mycobacterium tuberculosis wurde mit Digoxigenin markiert und als Sonde verwendet. Die Durchmusterung der genomischen Lambda-Bibliothek erfolgte wie beschrieben bei (Sambrook, H., E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY).
Zusammengefasst wurden die Lambda-gt11-Rekombinanten auf einem Rasen von E. coli Y1088 ausgebracht. Man ließ die Phagen wachsen und übertrug sie auf Nitrozellulosepapier und sondierte sie mit DIG-markierter denaturierter chromosomaler DNA aus Mycobacterium tuberculosis durch DNA-Hybridisierung. Die ein Signal ergebenden Plaques wurden durch mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörper gegen DIG in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers (Boehringer Mannheim, Deutschland) detektiert. Die DNA-Antikörper-Konjugate wurden durch die Reaktion alkalischer Phosphatase mit Nitro Blau Tetrazolium (NBT) und 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP) detektiert. Die positive Hybridisierung wurde in der Form von blauen Plaqueflecken detektiert. Solche ein Signal gebende Klone wurden in einer Durchmusterung von ungefähr 6 × 104 der rekombinanten Plaques innerhalb einer Detektionszeit von ungefähr 60 Minuten isoliert (1).
III. Sondierung des Musters der Lambda-gt11-DNA-Klone mit chromosomaler DNA als Sonde
0,3 ml einer gesättigten Y1088-Kultur wurden mit rekombinanten Phagen (6.000 plaquebildende Einheiten, pfu) gemischt und 10 Minuten lang bei 36 °C inkubiert. Das Gemisch wurde zu 3 ml eines geschmolzenen LB-Weichagars zugesetzt und auf 90 mm-Platten, die 1,5 %-igen LB-Agar enthielten, ausgegossen, und man ließ es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur aushärten. Die Platten wurden über einen Zeitraum, innerhalb dessen die Plaques als klare Punkte mit ungefähr 1 mm Durchmesser sichtbar wurden, bei 37 °C inkubiert. Auf die Platten wurden dann Nitrozellulosefilter aufgelegt. Die nachfolgende Behandlung der Filter zur Detektion von repetitive Sequenzen enthaltenden Klonen war identisch mit den zum Durchmustern einer Lambda-gt11-Bibliothek mit DNA-Sonden beschriebenen Verfahren (Davis, L. G., M. D. Dibner and J. F. Battey. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier. 1986). Das nichtradioaktive DNA-Markierungs- und -Detektions-System von Boehringer Mannheim, Deutschland, wurde zur Markierung, Hybridisierung und Detektion während der Durchmusterung verwendet. Die amplifizierte Bibliothek wurde mit ungefähr 6 × 103 pfu pro Platte unter Verwendung von E. coli Y1088 als Wirtsstamm ausplattiert. Von den insgesamt 60.000 rekombinanten Plaques wurden als Ergebnis der tertiären Durchmusterung mit DIG-markierter denaturierter chomosomaler DNA aus Mycobacterium tuberculosis als Sonde 14 Plaques gepickt. Diese 14 Plaques ergaben innerhalb von 60 Minuten positive Signale.
Die für Mycobacterium tuberculosis spezifische repetitive Sequenzen enthaltenden rekombinanten Plaques wurden durch subtraktive Durchmusterung 14 rekombinanter Plaques mit denaturierter chromosomaler DNA aus anderen mycobakteriellen Stämmen als Mycobacterium tuberculosis durch DNA-Hybridierung isoliert. Dies führte zur Isolierung acht rekombinanter Plaques, die mit Mycobacterium tuberculosis hybridisiserten, aber nicht mit genomischer DNA aus M. avium-intracellulare, M. fortuitum, M. chelonae, M. smegmatis und M. phlei. Diese rekombinanten Plaques wurden aufgereinigt, und die Phagen-DNA wurde isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, um die Größe der eingefügten DNA in den rekombinanten Plaques zu bestimmten (2 in Tabelle 1). Die andere Gruppe wurde Southern-Blotting und Hybridisierung unter Verwendung von DIG-markierter denaturierter genomischer DNA aus Mycobacterium tuberculosis unterzogen. Die positive Hybridisierung wurde innerhalb von 60 Minuten detektiert (3).
Alle acht Klone enthielten Einfügungen unterschiedlicher Größe und hybridisierten mit der chromosomalen DNA von Mycobacterium tuberculosis. Die Einfügung aus dem Klon C8 zeigte innerhalb von 10 Minuten Detektionszeit eine positive Hybridisierung und wurde für eine detaillierte Untersuchung ausgewählt.
Tabelle 1

* Das Fragment beziehungsweise die Fragmente, das/die mit DIG-markierter denaturierter genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis innerhalb von 10–60 Minuten positive Hybridisierungssignale ergab(en).

IV. Manipulation rekombinanter DNA
Der Klon C8 wurde selektiert. Er enthielt eine Einfügung von 4,2 Kilobasenpaaren, die innerhalb von 10 Minuten starke Hybridisierungssignale mit DIG-markierter denaturierter chromosomaler DNA aus Mycobacterium tuberculosis ergab. Das 4,2 Kilobasenpaar-DNA-Fragment aus dem Klon C8 wurde durch Restriktionsverdau und nachfolgende Elution des 4,2-Kilobasenpaar-Fragmentes aus dem Agarosegel isoliert. Das 4,2-Kilobasenpaar-Fragment wurde gereinigt und in den pUC13-Plasmid-Vektor umkloniert. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde als pC8 bezeichnet.
V. Lokalisierung repetitiver Sequenzen innerhalb des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragmentes
Die Restriktionskarte des 4,2 Kilobasenpaar langen DNA-Fragmentes wurde bestimmt (4). Sie enthielt jeweils eine Schnittstelle für BamHI und SalI und jeweils zwei Schnittstellen für die Restriktionsenzyme StuI und KpnI.
Die repetitiven Sequenzen innerhalb des 4,2-Kilobasenpaar-DNA-Fragmentes wurden durch Hybridisierung der BamHI, SalI, StuI- und KpnI-Restriktionsfragmente des 4,2-Kilobasenpaar-DNA-Fragmentes mit DIG-markierter denaturierter genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis weiter lokalisiert.
Die repetitiven Sequenzen wurden innerhalb des StuI-StuI-Fragmentes lokalisiert, das innerhalb des in dieser Erfindung klonierten 4,2 Kilobasenpaar langen DNA-Fragmentes vorliegt. Die detaillierte Restriktionskarte des StuI-StuI-Fragmentes wurde anhand der Nukleotidsequenz von 1291 Basenpaaren hergeleitet und durch nachfolgenden Verdau mit Restriktionsenzymen bestätigt (5).
VI. Hybridisierung des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragmentes mit verschiedenen mycobakteriellen Stämmen und anderen Pathogenen
Die genomische DNA aus verschiedenen Mycobakterien und anderen Pathogenen wurde isoliert und durch Southern-Hybridisierung ebenso wie durch Dot-Blot-Hybridisierung mit dem DIG-markierten 1291-Basenpaar-DNA-Fragment aus pC8 hybridisiert. Wie in 6 gezeigt, hybridisierte das Fragment bei der Southern-Hybridisierung mit den folgenden Mycobakterienstämmen nicht:
M. smegmatis
M. phlei
M. fortuitum
M. chelonae
M. flavescens
M. trivale
M. duvali
M. marinum
M. gordonae
M. kansasii
M. avium
M. intracellulare
M. scrofulaceum
M. gordonae
M. xenopi
M. aurum
M. microti
M. szulgai
Die genomische DNA aus den oben genannten Bakterien wurde isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Der Verdau wurde auf einem 0,8 %-igen Agarosegel aufgetrennt, auf Nitrozellulosepapier übertragen und mit dem DIG-markierten denaturierten 1291-Basenpaar-DNA-Fragment als Sonde hybridisiert.
Die Southern-Hybridisierung des 1291-Basenpaar-Fragmentes mit genomischer DNA aus Mycobacterium tuberculosis ergab mehrere Banden, was die Gegenwart repetitiver Sequenzen innerhalb des 1291-Basenpaar-DNA-Fragmentes bestätigte, wohingegen mit den anderen oben aufgeführten Mycobakterien keine Hybridisierung gefunden wurde (6).
Die Hybridisierung des 1291-Basenpaar-DNA-Fragmentes erfolgte mit genomischer DNA aus anderen pathogenen Organismen, nachfolgend aufgeführt. Das Ergebnis der Dot-Blot-Hybridisierung wird in 7 gezeigt.
Salmonella typhimurium
Staphylococcus aureus
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter alginii
Vibrio cholerae
Bacillus subtilis
Edwardsiella
Lachssperma-DNA
Menschliche Plazenta-DNA
E. coli
Das 1291-Basenpaar-DNA-Fragment hybridisierte mit der genomischen DNA dieser Pathogene nicht (7).
VII. Hybridisierung des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragmentes mit klinischen Isolaten von Mycobacterium tuberculosis
Die Southern-Hybridisierung des 1291 Basenpaar langen DNA-Fragmentes mit genomischer DNA aus klinischen Isolaten aus Mycobacterium tuberculosis sollte die Detektion des 1291 Basenpaar-DNA-Fragmentes in Mycobacterium tuberculosis und seine Verwendung bei der Epidemiologie erlauben.
Die genomische DNA aus überprüften klinischen Isolaten aus Mycobacterium tuberculosis wurde isoliert und mit dem StuI-Restriktionsenzym verdaut. Die Verdaus wurden elektrophoretisch aufgetrennt, auf ein Nitrozellulose-Papier transferiert und mit dem DIG-markierten denaturierten 1291-Basenpaar-DNA-Fragment hybridisisert. Die Ergebnisse mit mehr als zweihundert klinischen Isolaten von Mycobacterium tuberculosis zeigten die Gegenwart dieses Fragments. Die Hybridisierung ergab mehrere Banden, was die repetitive Natur dieses Fragments bestätigte. Es wurden mehrere Isotope identifiziert, jedoch zeigten alle Isolate eine starke Bande von 1291 Basenpaaren (8).
VIII. Nukleotidsequenz des 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragments
Die Nukleotidsequenz des 1291-Basenpaar-DNA-Fragments wurde durch die Didesoxykettenterminations-Sequenzierungstechnik (Biggin, M. D. et al, 1983. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 80 : 3963–3965) bestimmt. Die Produkte der Sequenzierungsreaktionen wurden auf 6 % Acrylamid/7 M Harnstoff/0,5–2,5 × TBE Sequenzierungs-Gradientengelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden unter Vakuum getrocknet, und es wurde Kodak XRP-1-Film aufgelegt. Die Nukleotidsequenzen wurden für beide Stränge des 1291-Basenpaar-DNA-Frag mentes unabhängig bestimmt. Die Computerunterstützte Analyse der Nukleotidsequenz und der hergeleiteten Proteinsequenz wurde unter Verwendung von Datenbanken und Programmen durchgeführt, die vom National Institute of Health bereitgestellt wurden, und auch der Programme von Chou & Fasman und von Hopp & Woods. (Chou, P. Y. & G. D. Fasman, Advances in Enzymol., 47 : 45–148, 1978; Hopp, T. P. & K. P. Woods, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78 : 3824–3828,1981). Die Nukleotidsequenz der 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-Region des 4,2-Kilobasenpaar-DNA-Fragmentes ist in 9 dargestellt. Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragmentes zeigt mehrere interessante Merkmale, darunter die Gegenwart wiederholter Sequenzen und eine IS-artige Sequenz in einem offenen Leserahmen. Die Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen DNA-Fragments ist zusammen mit der IS- und den wiederholten Sequenzen, die in der Sequenz vorliegen, in der Sequenz 9 zu sehen. In Tabelle 2 wird die Gegenwart der direkten Wiederholungen in dem 1291 Basenpaars StuI-StuI-DNA-Fragment gezeigt. Es wurden nur zehn Wiederholungen von mehr als 9 Nukleotidbasen zusammen mit der Sequenz und ihren Positionen dargestellt. In Tabelle III ist die Gegenwart des Haarnadelschleifenortes in dem IS-artigen Element, das in dem 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragment vorliegt, dargestellt. Die beiden invertierten Wiederholungen sind auf beiden Seiten von direkten GTT-Wiederholungen flankiert.
Tabelle II Vorliegen direkter Wiederholungen in dem 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-DNA-Fragment
Tabelle III Der Haarnadelschleifenort in dem IS-artigen Element, das in dem 1291 Basenpaar langen StuI-StuI-Fragment vorliegt

* Fortsetzung der Sequenz

Die invertierten Wiederholungen befinden sich an den Positionen 461 bis 469 (TCCGGTGCC) und 1184 bis 1192 (GGCACCGGA).
Die aus den in 9 beschriebenen Nukleotidsequenz hergeleiteten Aminosäurensequenzen des 1291 Basenpaar langen DNA-Fragmentes wird in 10 dargestellt.

Claims

Verwendung eines für Mycobacterium tuberculosis spezifischen Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Nukleotidsequenz:
oder eine dazu komplementäre Sequenz, oder eine Sequenz, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen durch Bindung unter nichtstringenten Bedingungen (6 × SSC, 50 % Formamid, Raumtemperatur) und Waschung unter höherstringenten Bedingungen (2 × SSC, 65 °C, wobei SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) hybridisiert, oder ein für Mycobacterium tuberculosis spezifisches Fragment von SEQ ID NO:1, zur Detektion und/oder Identifikation von Mycobacterium tuberculosis in einer ex vivo-Probe.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül die Sequenz:
oder eine dazu komplementäre Sequenz oder eine Sequenz, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen durch Bindung unter nichtstringenten Bedingungen (6 × SSC, 50 % Formamid, Raumtemperatur) und Waschung unter höherstringenten Bedingungen (2 × SSC, 65 °C, wobei SSC = 0,15 NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) hybridisiert, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere der Sequenzen aus Tabelle II oder eine dazu komplementäre Sequenz oder eine Sequenz, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen durch Bindung unter nichtstringenten Bedingungen (6 × SSC, 50 % Formamid, Raumtemperatur) und Waschung unter höherstringenten Bedingungen (2 × SSC, 65 °C, wobei SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) hybridisiert, umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Nukleinsäuremolekül als Sonde verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Probe unter klinischen Isolaten und Körperflüssigkeiten ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die klinische Isolatprobe Sputum, Liquor cerebrospinalis, Pleuralflüssigkeit, Urin, Magenlavage, Bronchiallavage, Pericardflüssigkeit oder Lymphknotenaspirat ist.
Ex vivo-Verfahren zur Detektion von M. tuberculosis in einer Probe, wobei mindestens ein Nukleinsäuremolekül, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, in einem DNA-basierten Detektionssystem als Sonde oder Primer verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, umfassend eine Inkubation des Nukleinsäure-Sondenmoleküls mit Proben, die spezifische Mycobakterien (M. tuberculosis) enthalten können, und eine Detektion der Hybridisierung der Nukleinsäure mit der DNA in der Probe.
Ex vivo-Verfahren zur Herstellung und Identifikation eines die in Anspruch 1 definierte 1291-Basenpaar-Sequenz umfassenden DNA-Fragmentes von M. tuberculosis, umfassend die folgenden Schritte: (a) Konstruktion einer genomischen Bibliothek von M. tuberculosis in einem Vektor; (b) Durchmusterung der genomischen Bibliothek von M. tuberculosis mit als Sonde detektierbar markierter genomischer DNA von M. tuberculosis zur Selektion von DNA-Fragmenten, die spezifisch und schnell mit genomischer DNA von M. tuberculosis zu hybridisieren vermögen; (c) Isolation von Klonen, die repetitive DNA-Fragmente mit positiven Hybridisierungssignalen, die innerhalb von 10 bis 60 Minuten erscheinen, enthalten.
Ex vivo-Verfahren nach Anspruch 9, weiterhin umfassend: (d) weitere Durchmusterung der isolierten Klone zur Validierung durch DNA-DNA-Hybridisierung mit genomischer DNA von anderen Mycobakterien als M. tuberculosis als Sonde, um sicherzustellen, dass der isolierte Klon mit diesen anderen Mycobakterien keine Hybridisierungssignale erzeugt.
Ex vivo-Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Nukleinsäuremolekül oder DNA-Fragment durch Dot-Blot-Hybridisierung oder Southern-Hybridisierung oder Microplate-Hybridisierung mit einem mycobakteriellen Nukleinsäuremolekül hybridisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die Proben für M. tuberculosis durch Hybridisierung und PCR-Amplifikation durch Zusatz von für die Nukleotidsequenz des 1291 Basenpaar-DNA-Fragmentes ausgewählten Primern detektiert werden.
Verwendung des in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Nukleinsäuremoleküls zur Restriktionsfragmentlängenmorphismus-Analyse von M. tuberculosis-Isolaten.
Für M. tuberculosis spezifisches Nukleinsäuremolekül, bestehend aus SEQ ID NO:1 oder einer dazu komplementären Sequenz oder einer Sequenz mit einer Sequenzidentität von 95 % oder mehr mit einer der zuvor genannten Sequenzen oder aus einem Fragment von SEQ ID NO:1, wobei jede solche Sequenz oder jedes solche Fragment für Mycobacterium tuberculosis spezifisch ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14, umfassend die Sequenz von SEQ ID NO:7 oder eine oder mehrere der Sequenzen der Tabelle II oder eine dazu komplementäre Sequenz.