JPH0319688A - テイコ抵抗性を与える配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、適切なベクターにより感受性微生物宿主中へ
の形質転換のとき、ダルバヘプチド抗生物質に対する抵
抗性を与えることができる、新規なＤＮＡ断片または小
断片に関する。

これらのダルバヘプチド抗生物質は、時にはグ７ リコベブチド抗生物質と定義され、主としてダラム陽性
バクテリアに対して活性である抗バクテリア因子の１つ
のクラスであり、そして次のものを包含する：増加する
数の因子、例えば、パンコマイシン（米国特許第３，０
６７，０９９号）、リストセチン（米国特許第４，０８
３，９６４号）、アポバルンン（米国特許第３，３３８
．７８６号および米国特許第４，３２２，３４３号）、
テイコプラニン（米国特許第４，２３９，７５１号およ
び米国特許第４，５４２，０１８号）、アクタプラニン
（米国特許第３，８　１　６，６　１　８号および米国
特許第４．５３７，７１５号）　、ＡＡＤ−２　１　６
またはアルダシン（米国特許第４，５４８，９７４号）
、ＡＭ３７４（米国特許第３．８０３．３０６号）、Ａ
４７７（米国特許第３，９２８，５７１号）、Ａ４０９
２６　（欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）１７７，８８２号）
、Ａ４１０３０　（米国特許第４，５３７，７７０号）
　、ＡＡＤ−６０９　＜欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）２　
１　８，４　１　６号）、およびＡ３３５１２ｂ　（米
国特許第４．０　２　９，’７　６　９）号。

構造的観点から、これらの抗生物質７つのアミノ酸から
構成され、それらの５つが絶えずアリルーおよびアリー
ルメチルアミノ酸である、コアのへブタベブチド構造に
より特性決定され、前記構造は共通の作用機構、すなわ
ち、細胞壁の合戒の１または２以上の中間体のＤ−アラ
ニルーＤアラニンの末端との特異的複合化、の決定因子
である。アリールおよび／またはアリールメチル部分は
、たいていの場合において、○−グリコシド結合により
結合した数個の糖単位を有する。しばしは、これらの糖
は所定のダルバヘプチドに典型的である［参照、Ｆ．パ
レンチ（Ｐａｒｅｎｔｉ）おＪ：びＢ．カバレリ（Ｃａ
ｖａｌｌｅｒｉ）：ｒダルバヘプチドとしてパンコマイ
シンーリストセチン様グリコベプチドを命名する提案（
Ｐ　ｒ　ｏ　ｐ　ｏｓａｌｕ　　　ｔｏ　　　ｎａｍｅ
　　　ｔ　ｈｅ　　　ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｉｓｔ
ｏｃｅｔｉｎ　　ｌｉｋｅｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ
　　ａｓ　　ｄａｌｂａｈｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ．Ｔｈｅ
　　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，
Ｖｏｌ．４２．Ｎｏ．　　１２、　ｐｐ．　　１８８２
−１８８３、　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　　　＋９８９７　　
。

ダルバヘプチドの共通の「作用機構」は、増殖するバク
テリアの細胞壁のＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラニルペンタ
ペブチドへそれらが結合し、こうしてベブチドアグリノ
Ｊ冫の重合を障害することを包含する。他の細胞壁阻害
因子と同様に、ダルバヘプチド抗生物質は活性に増殖す
る病原体に対してのみ殺バクテリア性である。

また、このクラスには、選択的部分的ハイブリダイゼー
ションまたは他の化学的修飾の方法により得られる、前
述の物質の誘導体が包含される。

例えば、テイコプラニンアグリコンおよびンユードアグ
リコンは、Ａ．マラバルバ（Ｍａｌａｂａｒｂａ）ら、
Ｊ．Ａｎｔ　ｉｂｉｏｔ　ｉｃｓ，３７、９８８（１９
ｇ４）、３９、１４３０（］９８６）、および欧州特許
出願（ＥＰ−Ａ）３０１，２４７号に記載されている。

テイコブラニン化合物のカルポキンエステル誘導体は、
Ａ．マラバルバ（Ｍａｌａｂａｒｂａ）ら、Ｊ．Ａｎｔ
　ｉｂ．４０，１０ １５７２　（１９８７）に記載されているが、カルボキ
ンアミド類は欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）２１８，０９９
号、ＷＯ８　８／０　６　６　０　０，欧州特許出願公
開第３５２．５３８号および欧州特許出願第８９１２２
８７４．４号に記載されている。

上に定義した抗生物質のいずれをも、ならびにそれらの
誘導体はこの出願において「ダルバヘプチド抗生物質」
と呼ぶ。この定義は、もちろん、将来抗微生物性物質の
この膨張するクラスに添加されそして前述と同一の特徴
共有する物質を包含する。

本発明の目的は、適当なベクターにより感受性微生物宿
主中への形質転換のときグルバヘプチド抗生物質に対す
る抵抗性を与えることができるＤＮＡ配列である。

前述したように、本発明のＤＮＡ物質により与えられる
抵抗性は単一の物質に対して特異的ではないが、効率は
程度が異なることがあるが、ダルバヘプチド抗生物質に
向けられる。このような抵抗性の機構はこれまで証明さ
れてきていない場合１１ でさえ、わずかの実験を下に表し、本発明の配列により
与えられる抵抗作用が形質転換された細胞においてそれ
自体発現する可能な方法を示す。

いずれの場合においても、本発明の開示は作用の機構ま
たはそれに対する理論に限定されることを意図しない。

便宜上、上に定義した本発明の本発明のＤＮＡ配列は、
「テイコーＲを与える配列」と呼ぶ。

本発明の特定の目的は、「テイコーＲを与える配列」を
提供することであり、その由来源はダルバヘグチド抗生
物質を産生ずる微生物である。

このようなテイコーＲを与える配列の１例は、アクチノ
プラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ
ｓ　　ｔｅ＋ｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕ　ｓ）ＡＴＣＣ３
　１　］．２　１のゲノムからのＤＮＡ制限断片として
得ることができる、約２６１４ｂｐのＢ　ａ　ｍ　Ｈ　
Ｉ断片中に含有される。

この断片は、ダルバヘプチド抗生物質の所定の産生体（
すなわち、テイコプラニンを産生ずるアクチノプラネス
・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　　　
ＬｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕＳ）ＡＴＣＣ３１１２１
）（以後、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　　　
ＡＴＣＣ３］１２１）のゲノムから誘導されるが、また
、他のダルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与える
ことができる。

本発明のＤＮＡ断片は、こうして、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍ
ｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３１１２１のゲノムのＢ　
ａ　ｍ　Ｈ　ｌの処理により得ることができる２６１４
ｂｐのＤＮＡ断片、この断片を含有するＤＮＡ配列、そ
の小断片（ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）または、培地の低
い厳格さにおいて上のＢａｍＨＩ断片と有意の程度に、
またはそれから誘導可能なブローブとハイブリダイゼー
ションするＤＮＡ配列であり、そして感受性微生物宿主
中への形質転換のときダルバヘプチド抗生物質に対ずる
抵抗性を与えることかできる。

したがって、本発明は、また、高い厳格さの条件下に、
前述の制限断片またはその小断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そして感受性微生物宿主中への形質転換のとき
タルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与える能力を
維持する、ＤＮＡ配列を包含する。

すべての上のＤＮＡ配列は、ティコ−Ｒを与える配列の
本発明の定義に包含され、したかってａ）アクチノブラ
不ス・テイコミセチクス（ＡｃＬｉｎｏｐｌａｎｅｓｔ
ｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔ　ｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３］　１２
１のゲノムのＢａｍＨＩの処理により得ることができる
２　６　］．　４　ｂｐのＤＮＡ断片、その小断片（ｓ
ｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）またはそれを含有するＤＮＡ配
列、これらは感受性微生物宿主中への形質転換のときダ
ルバヘプチド（ｄａｌｂａｈｅｐｔｉｄｅ）抗生物質に
対する抵抗性を与えることができる、ｂ）感受性微生物
宿主中への形質転換のときダルバヘプチド抗生物質に対
する抵抗性を与えることができ、そしてａ）に前述のＤ
ＮＡ断片とハイブリダイゼーションする、核酸配列、 Ｃ）ａ）に述べた断片とハイブリダイゼーションし、そ
して感受性微生物宿主中への形質転換のＩ４ ときダルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与えるこ
とかできる、ＤＮＡインサートの部分、および ｄ）ａ）またはｂ）に定義したＤＮＡ配列に対する遺伝
コードのディジェ不レイション（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉ
ｏｎ）の結果、ディジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔ
ｅ）Ｌ、そして感受性微生物宿主中への形質転換のとき
ダルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与えることが
できる、ＤＮＡ配列、 を包含する。

テイコーＲを与える配列は、感受性微生物宿主中への形
質転換のときダルバヘプチド抗生物質に対するテイコー
Ｒ仲介抵抗性を与えるベクターの構成において使用する
ことができる。

次の定義は、普通に理解され、そしてこの分野において
使用されるが、ここで便宜上報告する表現に関する． 「組み換えＤＮＡクローニングベクター」または「ベク
ター」は自律的に複製または組み込む因１５ 子であり、次のものを包含するが、これらに限定されな
い，プラスミド、コスミド、７アージなど。

「制限断片」は、ＤＮＡを１または２以」二の制限酵素
で消化することによって得られる線状ＤＮＡ配列である
。

「核酸配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの自然、合或また
は混合した由来の、任意の長さのポリヌクレオチド配列
である。こうして、この定義は特にｃＤＮＡを包含する
。

「感受性宿主細胞」または「感受性微生物宿主」は、そ
れが抵抗性を与える配列で形質転換されないかぎり、所
定の抗生物質の存在下に増殖することができない宿主細
胞である。

「形質転換体」は、形質転換を行った、受容体宿主細胞
であるが、「形質転換」は、遺伝子型を変化させそして
受容体細胞において変化を生ずる、受容体宿主細胞中へ
のＤＮＡの導入である。

「宿主細胞」は、そのための形質転換ベクタが知られて
いるか、あるいはこの分野における知識に基づいて案出
することができる、既知の原核または真核の微生物のい
ずれであることもできる。

こうして、それは噛乳動物、鳥類、両生類、酵母菌、お
よびバクテリアおよび植物の由来の細胞を包含する。宿
主の好ましい群は、アクチノミセタレス（Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔａｌｅｓ）の目およびス１・レプ］・ミセス
（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ）、アクチノプライ・ス（
Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アミコラトブシス（Ａｍ
ｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、ノカルジア（ｎｏｃａｒｃ
ｌｉａ）、アクチノマズラ（Ａｃｔ　ｉｎｏｍａｄｕ＋
゜ａ）またはキブデロスボルンギウム（Ｋｉｂｄｅｌｏ
ｓｐｏｒｎｇｉｕｍ）の属に属するバクテリア菌株によ
り代表される。

微生物宿主の最も好ましい群の１つは、ダルバヘプチド
抗生物質を産生ずる微生物、例えば、上に報告したダル
バヘプチド抗生物質の産生体により代表される。

用語「ハイブリダイゼーション」を使用するとき、核酸
のハイブリダイゼーション、すなわち、２つの一本鎖の
ポリヌクレオチドが二本鎖の分子クローニングを、２つ
の鎖において相補的塩基の間の水素結合で、形成する方
法を意図する。ハイブリタイゼーンヨンはＤＮＡおよび
Ｒ　Ｎ　Ａの両者の相補的鎖の間で実施して、二重らせ
んのＤＮＡ、二重らせんのＲＮＡまたは二重らせんのＤ
ＮＡＲＮＡのハイブリッド分子を産生ずることができる
。この方法は、標識したＤＮＡまたはＲＮＡブローブと
のハイブリダイゼーションにより特異的ＤＮＡ配列を同
定することができる。ハイブリダイゼーションの条件は
、時には、使用する緩衝化生理的塩類溶液、すなわち、
一般に塩化ナ１・リウム／クエン酸プ川・リウム溶液（
普通に、ＳＳＣ）、の濃度に依存して、「低」、「高」
または「中コの厳格さと定性される。とくに、「中〜低
の厳格さ」はＩＸｓｓｃ　（すなわち、０．１５モルの
塩化ナトリウムおよび０．Ｑ１５モルのクエン酸ナトリ
ウムの溶液）の範囲の濃度を呼ぶが、「高の厳格さ」は
約０．１〜０．５ＸＳＳＣの範囲の濃度を呼び、約０．
２ＸＳＳＣ　（すなわち、０．０３モルの塩化ナ１・リ
ウムおよび０．００３モルのクエ１８ ン酸ナトリウム）は少なくともある場合において好まし
い。

本発明のテイコーＲを与える配列を使用して、適当なテ
イコーＲ含有ベクターにより感受性微生物宿主中への形
質転換のときダルバヘプチド抗生物質に対する選択可能
な抵抗性を与えることができる。例えば、選択マーカー
、例えば、チオストレプトン抵抗性遺伝子を有するスト
レブトマイセスナリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｉｖｉｄａｎｓ）（例えば、菌株Ｓ．Ｉｉｖｉｄａｎ
！３，Ｊｏｈｎ　　Ｉｎｎｅｓ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ　　Ｎｏ．３１３１中に含有されるもの）についての
プラスミドベクターを使用して、テイコＲを与える配列
を適当な制限部位に挿入して、２つの抵抗マーカーをも
つプラスミドを得ることができる：チオストレブトン（
ｔｈｉｏＲ）またはテイコプラニンまたは他のダルバヘ
プチド抗生物質（ｔｅｉｃｏＲ）。次いで、新規なプラ
スミドを、テイコブラニン抵抗性遺伝子内の少なくとも
１つの認識部位を有する制限酵素で消化して直Ｉ９ 線化し、こうして複製の由来および変更しないチオスト
レプトンに対する抵抗性を残すことができる。これによ
り、ダルバヘプチド抗生物質に対するｔｅｉｃｏＲ仲介
抵抗性を破壊する外来ＤＮＡの挿入が可能となり、こう
してキメラブラスミドで形質転換された有機体をダルバ
ヘプチド抗生物質、例えば、テイコブラニンに対ずる同
時の感受性および他のマーカー（例えば、チオス］・レ
プ１・ン）に対する抵抗性について選択可能とする。テ
イコーＲを与える配列が前述のＢ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉ制限
断片である場合、この場合において便利に使用できる内
部の制限部位はＳｓｔｌ制限部位である（参照、第１図
）。

本発明の他の実施態様に従い、テイコーＲを与える配列
は、適当なベクターを経て、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅ
ｔｉｃｕｓ菌株中に、または他のダルバヘプチド抗生物
質産生菌株、例えば、上に列挙した抗生物質の産生体中
に導入することができる。産生体菌株のこの形質転換は
、その抗微生物産生物に対する菌株の抵抗性を与えるか
、あるいはより可能なことには、その程度を増加するこ
とによって、抗生物質の産生収率を改良することができ
る。多くの場合において、事実、抗生物質を産生ずる殺
微生物のプロセスの効率は、高い濃度のそれ自体の産生
物に対する産生体菌株の感受性により制限される［参照
、Ｋ．カタギリ（Ｋａｔａｇｉｒｉ）、Ｊ．ＡｎＬｉｂ
ｉｏｔ＋ｃｓ，７、４５−５２　（１９５４）］。これ
はと〈に抵抗の機構が抗生物質の酵素仲介不活性化を含
まないときである。なぜなら、それはテイコーＲ仲介抵
抗性ついてと思われるからである。

抗生物質産生微生物はそれら自身の産生物に対する抵抗
性の種々の機構を発生した：これらの機構の多くは研究
されかつ完全に特性決定されてきている［参照、例えは
、Ｅ．クンドリ・冫フエ（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ）、Ｂｒ
ｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４０、６１６７　（１９８４
）］　。しかしながら、ダルバヘプチド抗生物質につい
て、抵抗性の特定の機構は産生菌株においてこれまで記
載されてきていない。これらの抗生物質に対する臨床的
分離物の抵抗性は出現しつつあり　［Ｋ．Ｌ．ロウフ（
Ｒｏｕｆ　ｆ）、ＣＩ　ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｏ１．Ｎｅ
ｗｓｌｅｔｔ．ｌｌｙ　　Ｉ　　４、１９８９］そして
いくつかの伝達可能な抵抗性はすでに記載されている［
Ｃ．Ｄ．　　ンユレス（Ｓｃｈｌａｅｓ）、Ａｎｔｉｍ
ｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎＬｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３３、
ｌ９８−２０３、１９８９およびＲ．レクレルク（Ｌｅ
ｃｌｅｒｃｑ）ら、　　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ
ｎＬｓ　　　　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３３、１０−１５
、１．９８９］が、それらの作用の機構はまだ明らかに
されきていない。これらの抗生物質のバクテリアの標的
は細胞壁であるので、排除機構のだめの抵抗性はある著
者らにより「理解することが困難である」と考えられた
［参照、Ｒ．レクレルク（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ）ら、Ａｎ
ｔ　ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　　Ｃｈｅｍｏｔｈ
ｅｒ．３３、１０−１５、１９８９およびＤ．グリーン
ウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）、Ｊ．ＡｎＬｉｍｉｃｒ
ｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２１、ｓｕｐｐｌ．Ａ．１
　　１３、２２ １９８８］　　。

本発明のテイコーＲを与える配列、例えば、前述のＢａ
ｍＨＩ制限断片またはその小断片の他の使用は、このよ
うなＤＮＡ配列をプローブとして、適当なハイブリダイ
ゼーション条件下に、を使用して、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍ
ｙｃｅｔｉｃｕｓ　　ＡＴＣＣ３１１２１以外のダルバ
ヘプチド抗生物質の産生体のゲノムから対応する領域を
取り出すことにＪ：って表される。

これらのＤＮＡ配列は、いったん分離されると、感受性
微生物宿主を形質転換するために使用して、それにダル
バヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与えることができ
る。それらの特徴にかんがみて、これらのＤＮＡ配列は
、当業者とって明らかなように、テイコーＲを与える配
列の本発明の定義に包含される。例えば、上に定義した
、ダルバヘプチド抗生物質の産生体菌株の遺伝子バンク
を、それ自体既知の方法において調製し、そして本発明
のテイコーＲを与える配列を任意の既知の方法、例えば
、ザザンプロット、ドットプロットまたは２３ 他の適当な手順に従って使用してスクリーニングするこ
とができる。プローブと中〜低の厳格さ（例えば、ＩＸ
ＳＳＣ以上）においてノ）イブリダイゼーションするす
べてのクローンを、感受性宿主中でダルバヘプチド抗生
物質に対する抵抗性を与えるそれらの能力について分析
することができる。次いで、ダルバヘプチド抗生物質に
対する抵抗性を与える陽性のクローン中に存在するＤＮ
Ａインサートは、ティコ−Ｒを与える配列ついて前述の
ように、使用することができ、そして事実ティコ−Ｒを
与える配列の定義により包含される。

本発明の配列の他の適用はブローブとしてそれを使用し
て、中〜低の厳格さの条件下に臨床的分離物中の同様な
ＤＮＡ配列の存在について検出することである。この試
験に対ずる陽性は、分離物中のこの種類の抵抗性の存在
を示すことができ、こうして試験した菌株が、このクラ
スの抗生物質に対するテイコーＲ型抵抗性を発生するこ
とができるか、あるいはすでに発生した可能性を示唆す
る。

本発明のテイコーＲを与える配列は、Ａ．Ｌｅｉｃｈｏ
ｍｙｃｅ　Ｌ　ｉｃｕｓ　　ＡＴＣＣ３１　１２１のＤ
ＮＡ抽出物から、特定の制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ
）で部分的消化し、ダルバヘプチド抗生物質に対する自
然に感受性の所定の宿主細胞について既知のベクターに
結合し、ダルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を獲得
した形質転換された細胞を選択し、そして獲得した抵抗
性の原因であるＤＮＡ配列を分離することによって調製
することができる。単一工程の方法は、それ自体既知の
技術により実施され、それらの技術は、当業者によりこ
の開示中に含有される情報に基づいて容易に反復するこ
とができるので、ここで詳細に述べる必要はないであろ
う。

本発明のテイコーＲを与える配列を調製する他の方法は
、また本発明の開示にかんがみて、当業者とって明らか
であり、そして配列、例えば、上のＡ．ｔｅｉｃｈｏｍ
ｙｃｅｔｉｃｕｓのＢａｍＨ　ｒ断片またはその小断片
、例えば、ＳｓｔｌＫｐｎｌの内部の断片を使用して、
それと中〜低の厳格さ（またはこれより高い厳格さ）に
おいてハイブリダイゼーンヨンしそしてテイコーＲを与
える能力を有するＤＮＡ配列を取り出すことを包含する
。また、合成プローブは、普通の方法により、必要に応
じて、テイコーＲ配列またはその部分を配列決定した後
、調製することができる。

テイコーＲを与える配列を調製する他の方法は、ＲＮＡ
配列をｃＤＮＡ中にコピーし、次いでこれを、通常形質
転換技術または同様な既知の技術に従い、使用してテイ
コーＲ仲介抵抗性を与える。

形質転換しない宿主と比較して、本発明のテイコーＲを
与える配列で形質転換された宿主のい〈つかの抗生物質
に対する感受性を評価することによって、形質転換体は
他のダルバヘプチド抗生物質に対する交差抵抗性を示す
と同時に、他の抗生物質に対ずる同一レベルの感受性を
維持することを理解することができる。これらの実験は
、液体または固体の両者の増殖培地中で通常手順に従い
実施することができる。

さらに、普通の手順により、また、本発明のテ２６ イコーＲ配列で形質転換された宿主は、ダルバヘプチド
抗生物質に暴露したとき、ＨＰＬＣ分析により明らかな
ように、検出可能な方法でそれを化学的に修飾しないこ
と評価することができる。

このような形質転換体へのダルバヘプチド抗生物質の結
合アッセイを実施することによって、通常結合条件下に
、全細胞による標的抗生物質の結合の減少を示すデータ
が得られる。

実施例 次の実施例によって、本発明をさらに説明する以下の節
において報告または言及した分子生物学の方法およびプ
ロトコルの多くは、それ自体知られており、そして当業
者のバックグラウンドの知識の一部分である。それらは
多数の参考文献およびマニュアル、例えば、次のものに
報告されている＋Ｄ．Ａ．ホプウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ
）ら、ステプトマイセスの遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）：実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、Ｔｈｅ２７ Ｊｏｈｎ　　Ｉｎｎｅｓ　　ｆｏｕｄａｔｉｏｎ．ノウ
ィッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）、Ｕ．Ｋ．（１９８５）；Ｔ
．　マ＝アチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、：実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｓ　コールド・スプリング＋ハーバー
（Ｃｏｌｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）、ニューヨ
ーク（１９８２）および分子生物学における現在のプロ
トコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　　ｉ
ｎ　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒ
ｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓａｎｄ　　Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ１
ニューヨーク（１９８７）。退屈な、時間消費するおよ
び当業者にとおて表面的な、これ゛の既知の技術の長た
らしい報告を回避するために、既知のプロトコルおよび
方法の両者の所定の参考文献およびマニュアルをもっぱ
ら引用する。便宜上、前述のマニュアルを、それぞれ、
「ホブウソド」、「マニアチス」および「現在のプロト
コル」と呼ぶ。

実施例１・ティコ−Ｒを与えるＤＮＡ配列の分離 置１ アクチノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏｐ
ｌａｎｅｓ　　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴ
ＣＣ３１１２１の完全なゲノムＤＮＡを、ホブウッド（
参照、ｐｐ７９−８０および１５２−１５３）および現
在のプロトコル（参照、の存在下に節Ｉ、ユニット３．
１およびことに３．１．１〜３．１．４）に記載されて
いる手順に従い、分離し、制限エンドヌクレアーゼＢ　
ａ　ｍ　Ｈ　１で部分的に消化し、モしてスクロース勾
配の遠心により大きさに従い分画した。これらのプロ］
・フルに導入した唯一の変化は、分離工程において使用
したリソチーム溶液か２ｍｇ／ｍｃの代わりに５ｍｇ／
ｒｒｌでありそしてリゾチーム処理して菌糸体のインキ
コベーション時間が３０分の代わりに２時間であること
である。

１．２ 次いで、分画した２．５〜ｌ　Ｑ　ｋ．　ｂの断片を｝
３ｇｌＩＩ直線化、ホスファクーゼ処理したブラスミド
ｐ１３７０２ｃ普通に入手可能であり、そしてＳ．Ｉｉ
ｖｉｄａｎｓを含有した、Ｊ　ｏ　ｈ　ｎＩｎｎｓ　　
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　３１３１；その制限地図はｈ
ｅ，ｐｐ．２９２−２９３に報告されている）と結合し
た。この結合工程は本質的にボプウソド（ｐｐ．１５４
−１５７）に従い約ｌ：５のベクター：インザーｌ・の
比で実施したｐｌＪ７０２の直線化およびホスファター
ゼ処理は通常の手順に従い実施した、参照、ホプウ・７
ドｐｐ．１５８−１５９、１６４および２８４−２８５
， １．３ 次いで、得られた結合混合物を使用して、Ｓ．Ｉ　ｉｖ
ｉｄａｎｓ６６原３ 形質体を形質転換した（参照、例えば、ホブウ・ンドｐ
ｐｌ２−１４、＋１０−１１１８よび２３０、それ以上
の技術的または方法の詳細について）。

３０ チオステプ１・冫（２５ｍｇ／な）で選択後、約１１０
００の形質転換体が得られ、これらは組み換えブラスミ
ドを含有した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ６６は、Ｊｏｈｎ
　　Ｉｎｎｓ　　ＣｏｌｌｅｃｔｉＯｎにおいて受け入
れ番号１３２６で受託されている。

１．４ これらの形質転換体の胞子懸濁液を、テイコプラニン抵
抗性について選択するために低い密度で配置した；１つ
のクローンを２０ｍｇ／（２の抗生物質の存在下に増殖
する能力について選択した。

このクローン中に存在するプラスミドをｐＴＲｌ６８と
命名した。

実施例２：選択したプラスミドがテイコーＲを与える配
列を含有することの確証 ２．１ プラスミドｐＴＲ１６８を上で得られた細胞から抽出し
（ホブウッド、ｐ．８５−９１）そしてＳ．Ｉｉｖｉｄ
ａｎｓ６６原形質体の形質転換に使用した（実施例１　
３に記載する方法に従う）。

３ｌ チオス］・レプトン抵抗性形質転換体の９５％より多く
は、また、テイコプラニンに対して抵抗性であり、テイ
コブラニン抵抗性はｐＴＲ　１　６　８に結合されたこ
とが実証された。

２．２ プラスミドの制限地図は、その末端に２つのＸｈｏ１１
部位を含有する２６１４ｂｐの長さのインサート（参照
、第１図）を明らかにし、それらの部位はＢｇｌＩＩお
よびＢａｍＨＴ粘着末端の接合により由来した、１つＳ
ｍａ　Ｔ部位、Ｓｓｔ■、Ａｐａｒ、Ｓｍａ　Ｉ，Ｐｖ
ｕ　Ｉ　ＩおよびＫｐｎｌについて制限部位であり、そ
して明らかにＢａｍＨＩ、Ｂｇｌｌｌ，Ｃｌａｌ、Ｅｃ
ｏＲＩ，ＥｃｏＲＶ，Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｓｐｈ　Ｉ，Ｘｈ
ｏ　Ｔについての制限部位ではなかった。

２．３ 」二に報告した約１．５ｋｂのテイコーＲを与える配列
の内部のＳｓｔｌおよびＫｐｎ　Ｉ断片を分離し、放射
線標識し、そして既知の手順に従い種々の制限酵素（Ｋ
ｐｎ　Ｉ−Ｓｓ　ｔ　ｒ；ＢａｍＨＩ，Ｐｓｔｌ；Ｐｖ
ｕｌｌ、およびＢｇｌｌＩ）で消化したＡ．ｔｅｉｃｈ
ｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　　Ａ′ｒＣＣ３１ｌ２ｌのゲノ
ムのＤＮＡとのザザンブロソ１・ハイブリダイゼーンヨ
ンにおいて使用した（実施例１．１において報告したよ
うに）。ハイブリダイゼーンヨンは普通の方法において
、膜の製造業者の使用説明書にまた記載されているよう
に、実施する。ブローブの放射線標識はランダムオリゴ
ヌクレオチドープライムド合成（現在のプロトコル、３
．５．８、３．５．９）に従い行ったが、ゲノムのＤＮ
Ａは、すでに上に報告した手順に従う制限後、トリスー
アセテート緩衝液中で１％のアガロースで電気泳動で分
離し、そしてナイロン膜」二に移した。さらに詳しくは
、分離されたＤＮＡを含有するゲルを０．４Ｎｌ７：１
ＮａＯＨＯ，６モルのＮａＣ　ｌ中で３０分間室温にお
いてインキユベーションしてＤＮＡを変性し、次いで１
．５モルのＮａＣＩ−０．５モルのトリスーＨ　Ｃｐ　
Ｈ　７　．　５とともｌこ３０分間インキユベーション
してそれを中和し、そしてＩＯＸｓｓｃ　（１−５モル
のＮａＣＩ−０．１５モルのクエン酸ナ１・リウム）中
で調製したナイロン膜（Ｇｅｎｅ　　Ｓｃｒｅｅｎ　　
Ｐｌｕｓ．ＮＥＮ）ｊ：に移した。移送はＩ　ｏＸｓＳ
Ｃ中で一夜続け、次いで膜を空気乾燥し、紫外線処理し
、そして標識したブローブとのハイブリダイゼーンヨン
を既知の手順に従い６５°Ｃにおいて実施し、ここで既
知の手順はこの膜をｌｏｍｌ２の１％のドデンル硫酸ナ
トリウム、１モルのＮａＣｌ、］％のデンハル１・溶液
およびｌＯ％のデキス１・ラン硫酸の溶液で、密閉可能
なプラスチックバッグ内で処理し、次いでこのバングを
密閉し、そして一定に撹拌しながら少なくとも１５分間
６５°Ｃにおいてインキコベーションすることよる予備
ハイブリダイゼーションを包含する。次いで、０　５〜
ｌｍＱの変性ザケ精子ＤＮＡ（≧Ｉ　０　０　ｔｔ　ｇ
／ｍＱ　）および変性標識したブローブ（最終濃度≦ｌ
Ｏｎｇ／ｍ０．または１〜４Ｘｌ０５ｄｍｐ／ｍｆｆ）
の溶液を添加した。再密閉したバッグを一定に撹拌しな
がら約１６時間６５゜Ｃにおいてインキユベーションし
た。過剰のブ一３４ ローブを０．２ＸＳＳＣで６５゜Ｃにおいて洗浄除去し
た。

得られた結果から、プローブは、２つのバンドが検出さ
れるＰｖｕ　Ｉ　ｒ消化したＤＮＡを除外して、常に消
化したＤＮＡ調製物の各々ｌこつき１つのみのＤＮＡ制
限断片とハイブリダイゼーションしすることが示される
。これらの結果は、プローブ内の１つの部位を有する使
用した制限酵素のうちでＰｖｕ　Ｉ　Ｉが唯一のもので
あることを考慮すると、ｐＴＲ１６８中のインサートが
Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　　ＡＴＣＣ３１
１２１中に独特部位として存在するという仮説と一致す
る。

実施例３：ティコグラニン抵抗性を与えるプラスミドｐ
ＴＲ　１　６　８のヌクレオチド配列全体のＤＮＡセグ
メントをジデオキシ連鎖停止方法により、「現在のプロ
トコル」　（節７、Ｉ１〜６．５）に記載されている手
順に従い配列決定した。この目的で、標識ＤＮＡポリメ
ラーゼ配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ　　Ｓｔａｔｅｓ
　　Ｂ一３５ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
米国オハイオ州タレブランド）を使用した（ＴＡＱｕｅ
ｎｃｅｅ；Ｔａｇ　　ＤＮＡボリメラーゼ配列決定シス
テム；ＴＡＱｕｅｎｃｅを使用してステップ・パイ・ス
テソプのプロトコル、第１版、１　９　８　９）。

第２図において、矢印は、配列決定分析に７アジＭ１３
ｍｐｌ８およびＭｌ　３ｍｐ　Ｉ　９　（Ｒ．Ｍ．デイ
ル（Ｄａｌｅ）、Ｂ．Ａ．　マククルーレ（ＭｃＣｌｕ
ｒｅ）およびＪ．Ｐ．ホウチンス（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ）
、Ｐｌａｓｍｉｄ　　１３、３ｍ−４１、１９８５）中
にクローニングしたＤＮＡ制限断片および配列決定した
ＤＮＡ領域の向きおよび程度を示す。

多数の矢印は、プライマーとして適当なオリゴヌクレオ
チドを使用して配列決定したＤＮＡ断片を示す。配列の
分析は、他のアクチノミセテスが有する範囲と同一範囲
内ある７５．４％のＧ　−１−　Ｃ含量を示す。配列は
ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．Ｉと表示する「配列のリスト
」の下に報告する。

実施例４：形質転換した宿主および形質転換しない宿主
のいくつかの抗生物質に対する感受性４．１ ｐｌＪ７０２またはテイコーＲを与えるｐＴＲ１６８を
収容するＳ．］ｉｖｉｄａｎｓ６６を、アンチバイオダ
ラム（ａｎ　ｔ　ｉ　ｂ　ｉ　ｏｇｒａｍ）ディスクの
アッセイによりいくつかの抗生物質に対するそれらの感
受性について試験した。標準の５ｍｍのアンチバイオダ
ラムディスク（ＢＢＬ、米国マリイランド州コツケイス
ビレ）を標準する菌株の密な胞子懸濁液上に堆積し、そ
して阻害ゾンを２８℃において２日のインキュベーショ
ン後に測定した。結果を下表■に報告する。

期待されるように、２つの菌株の間の唯一の差は、テイ
コーＲを与えるｐＴＲ１６８を含有する細胞の増殖を阻
害しない、テイコプラニンを使用して見いだされた。

表■ 親のプラスミドｐｌＪ７０２または組み換えブラスミド
１６８を収容するＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓへの既知の抗生
物質の活性の比較 ＊一国際単位 ３８ ４．２ 両者の菌株は、また、寒天平板上でそれらのダルバヘプ
チド抗生物質に対する抵抗性について試験した。

パンコマイシン、テイコプラニンおよび抗生物質Ａ４０
９２６をこの試験において使用した。

Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓは、１００ｍｇ／４のパンコマイ
シンを含有する平板上でさえ増殖したので、パンコマイ
シンに対して顕著に抵抗性であると思われる。ｐＴＲ　
１　６　８を含有する細胞は、１００％の平板培養の効
率で、１００ｍｇ／ｆｆのテイコプラニンまたは５０ｍ
ｇ／４のＡ／４　０　９　２６の存在下に増殖したが、
ｐＩＪ７０２を収容する菌株は３．２ｍｇ／４のいずれ
の抗生物質によっても阻害された。

これらのデータが示唆するように、ｐＴＲｌ６８により
を与えられる抵抗性はダルバヘプチド抗生物質について
特異的であり、そしてテイコプラニンに限定されない。

実施例５：親または組み換え体のｐＴＲ　１　６　８３
９ プラスミドを有するＳ．Ｉｉｖｉｄａｎｓについてのテ
イコブラニン結合アッセイ ５．１ テイコプラニンの化学的修飾は、抵抗性（ｐＴＲ１６８
）または感受性（ｐＩＪ７０２）のＳ，ｌ　ｉｖｉｄａ
ｎｓ培養物の上澄み液を、抗生物質との１８時間までの
濃縮後、Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析（参照、リバ（Ｒ　ｉ　ｖ
ａ）Ｅ．ら、クロマトグラフイア（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｉａ）、１９８７、２４、２９５−３０１）に
より検出されなかった。

しかしながら、より少ないテイコブラニンが感受性細胞
の培養物から回収された。これはあたかもこれらの細胞
が抵抗性のものよりも抗生物質に結合したかのようであ
った。

５．２ ｐｌＪ７０２を有するＳｔｒｅｏｔｉｍｙｃｅＳ　　ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ（以後、Ｓ．Ｉｉｖｉｄａｎｓ　　ｐｌ
Ｊ７０２と表示ずる）または組み換えプラスミドｐＴＲ
　１　６　８を有するＳ．Ｉｉｖｉｄａｎｓ　（以後、
Ｓ．Ｉ　ｉｖｉｄａｎｓＲｐＴＲｌ６８と表示する）を
、３０６Ｃｌこおいて後期の対数期に増殖させた。各培
養物の２つのアリコー１・を遠心した，上澄み液および
沈澱の再懸濁液を使用して、次の混合物を調製した： Ａ）　　Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ（ｐｌＪ７０２）十それ
自身の上澄み液 Ｂ）　　Ｓ．Ｉｉｖｉｄａｎｓ（ｐｌＪ７０２）＋ｓ．
ｌ　ｉｖｉｄａｎｓＲ（ｐＴＲ１６８）からの上澄み液 Ｃ）Ｓ．ｌ　ｉｖｉｄａｎｓＲ（ｐＴＲ１６８）十それ
自身の上澄み液 Ｅ）Ｓ．ｌ　ｉｖｉｄａｎｓＲ（ｐＴＲ１６８）＋ｓ．
ｌ　ｉｖｉｄａｎｓ　（ｐｌＪ７０２）からの上澄み液
。

各混合物Ｉこ、１０ｍｇ／（ｌの３Ｈ標識したテイコブ
ラニン（３７ｋＢｑ）を添加し、次いで３０゜Ｃにおい
て撹拌しながらインキユベーションした。

合計の組み込まれた放射能を抗生物質の添加の時に決定
した。次いで、インキユベーションした培養物を遠心し
、そして上澄み液の放射能を決定し浄し、そして洗浄溶
液の放射能を細胞に結合したままであるものと一緒に決
定した。

下表２に示すように、感受性細胞は培地中に存在するテ
イコプラニンの約１／２と結合した。上澄み液源に無関
係に、非常にわずかの抗生物質は洗浄により除去された
。抵抗性細胞は、いずれの上澄み液中においても、有意
の量の抗生物質と結合しなかった。

表２ テイコプラニン結合アッセイ 値は合計の組み込まれた放射能の百分率として表わす：
各欄の合計は、サンプリングおよび計数における変動性
のために、正確に１００％ではない４２ ５．３ 他のテイコブラニン結合実験は、既知の受容体結合イム
ノアッセイに従い実施した（ＲＡＳＡ；コルチ（Ｃｏｒ
ｔｉ）ら、１９８７、ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍｉ．３９／９
、１６１５−１６１８）。

ｐＩＪ７０２、ｐＴＲＩ６８を収容するＳ．｝１ｖｉｄ
ａｎｓの培養物、または接種しないブロスを０．１５〜
４．８ｍｇ／Ｉ２のテイコブラニンの存在下に３０°Ｃ
において１時間インキユベーションした。遠心後、上澄
み液中に残留するテイコフラニンの量をＲＡＳＡにより
決定した。便宜上、この方法の簡単な説明を下に報告す
る。（参照、また、欧州特許出願公開第２２１２８２号
）。

この方法は、アルブミンーエブシロンーアミノ力ブロイ
ルーＤ−アラニルーＤ−アラニンで被覆したマイクロタ
イタープレート上へのテイコプラニンの選択的吸着およ
び抗テイコブラニン抗体との反応に基づく。次いで、複
合体を、抗一抗テイコグラニン抗体とのインキュベーシ
ョンおよび０７エニレンジアミンとの発色性顕色反応に
より／１３ 検出する。テイコプラニンをアッセイするために、試料
を２０％の血清、２０％のＳ／ビスブロスおよび４０％
のＲＡＳＡ緩衝液（ＰＢＳ−ＢＴＳ　：リン酸塩緩衝液
＋０　．５　ｍＱのツイーン２０／１２、３ｇのＢＳＡ
／Ｑ，および２０％の血清）中でｌ：５に希釈した。マ
イクロタイターブレー１・の各ウェルを、前以てアルブ
ミンーエプシロンーアミノノノブロイルーＤ−アラニル
ーＤ−アラニンで被覆し（コルチ（Ｃｏｒｅｉ）ら、上
を参照）、これらのウェルにＯ．ｌｍ（２の希釈した試
料を添加し、そして蓋をした湿った箱内で３０゜Ｃにお
いて２時間インキユベーションした。次いで、プレート
を８回ＰＢＳ−Ｔ　（ＰＢＳ，０．５ｍ（ｌのツイーン
２０を添加した）で洗浄し、次いでＰＢＳ−ＢＴ（上の
ＰＢＳ−ＢＴＳにおけるようであるが、２０％の血清を
含有しない）中でｌ：２５０に希釈したウサギ抗テイコ
プラニン抗血清の０．１を添加した。反応を室温におい
て１時間続けた。洗浄後、０．１ｍｌ２のウサギ■ｇＧ
に対するベルオキシダーゼ接合特異的ヤギ抗体（１：５
００に希釈した）を各中で分散させ、室温において１時
間放置した。洗浄後、０１５ｍＱの発色性ベルオキシダ
ーゼ溶液（１．ｇ／ｆｆの０−フェニレンジアミンおＪ
：び３　５ミリモル／ｃＬの酸素ベルオキンダーゼ、０
．１モルのクエン酸ナｌ・リウム緩衝液ｐＨ５）を添加
した。３０゜Ｃにおいて３０分後、反応を０．０５ｍ（
ｌの硫酸の添加により停止した。４９２ｎｍにおける吸
収をタイタイテク・ムルチスカン＋　７才１・メーター
（Ｆｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で決定した
。標準を同一方法でｌＯ，４０、およびｌ　６　０　ｎ
　ｇ／ｍ（ｌのテイコブラニンを使用して調製した。合
計結合および比結合を、それぞれ、希釈緩衝液中のｌＯ
ｍｇ／ｍｆｆのテイコブラニン、および希釈緩衝液単独
で決定した。再び、感受性細胞は抵抗性細胞より効率的
に抗生物質と結合した。試験したすべての濃度について
、テイコブラニンの８５％より多くはｐＴＲ１６８を収
容する細胞の上澄み液中に残ったが、ｐＴＪ７０２を収
容する細胞を使用したときわずかに２５％が残留した。

，データが示すように、ｐＴＲ　ｌ　６　８が誘発した
抵抗性は細胞へのテイコブラニンの結合の減少ど相関関
係をもつ。

配列のリスト ＳＥＱ　　　ＩＤ　　　Ｎｏ．　　１ 配列の型　　　　　　　　　　ヌクレオチド配列の長さ
　　　：２６１４塩基対 鎖　　　　　　　　　　　　：二本 １〜ボロジー　　　二線状 分子の型　　　　　　　　　　ゲノムのＤＮＡ由来源の
有機体　：アクチノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃ
ｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃ
ｕｓ）ＡＴＣＣ３１１２１中間の実験源　　：Ｓ．Ｉ　
ｉｖｉｄａｎｓブラスミドｐＴＲ１６８ 性質　　　　　　　　　　　：テイコプラニン抵抗性を
与える遺伝子を含有する。

４６ ４７ ＧＧＡ’ｌ’ＣＣＧＧＴＴ ＧＣＣＴＣＧＣＧＴＡ ＣＧＧＣＧＣＣＧＧＡ ＴＧＡＴＧＧＴＣＧＧ ＴＣＧＣＣＧＣＣＧＴ ＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧ ＧＧＣＧＡＴＧＣＡＧ ＧＧＧＣＧＴＡＣＧＧ ＣＧＴＣＴＣＧＧＣＡ ＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣ ＣＧＣＧＣＡＧＴＴＣ ＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧ ＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧ ＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣ ＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣ ＴＧＴＧＣＧＧＣＧＣ ＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣ ＧＣＧＧＣＡＣＧＧＣ ＧＧＧＣＣＧＧＡＴＣ ＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣ ＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴ ＣκＴＣＧＴＧＣＴＧ ＣＧＡＣＧＣＧＧＴＣ ＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧ ＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣ ＣＧＧＧＴＡＣＧＧＧ ＣＡＣＣＧＧＣＴＧＧ ＣＧＴＣＣＧＧＣＣＧ ＧＧＣＧＡＧＧＣＣＧ ＧＧＧＣＴＧＴＣＣＣ ＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧ ＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧ ＡＡＣＣＴＣＧＴＣＧ 入ＣＧＴＴＧＡＧＣＧ ＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧ ＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣ ＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡ ＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧ ＡＣＧＣＣＧＧＡＧＣ ＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡ ＴＣＧＡＣＣＡＣＧＴ ＣＧＣＧＣＧＧＴＧＧ ＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧ ＧＧＣＧＡＣＣＣＣＧ ＧＴＧＣＧＣＧＡＣＴ ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧ ＣＣＧＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＴＧＧＡＣＧＣＣ ＧＣＡＡＧ入ＣＣＣＴ ＧＣＡＣＣＧＡＣＧＴ ＣＣＧＣＧＣＴＧＴＡ ＴＣＧＡＣＧＣＧＡＧ ＧＣＧＣＣＴＡＣＴＧ ＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴ ＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧ ＴＧＧＴＣＴＣＣＧＣ ＣＣＣＴＧＧＧＧＣＡ ＣＧＡＴＣＧＧＣＡＣ ＧＧＧＴＣＧＣＣＧＡ ＧＣＧＧＴＣＣＧＣＧ ＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣ ＡＣＣＴＧＣＴＣＧＧ ＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧ ＣＧＣＡＡＣＴＧＧＴ ＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣ ＣＧＡＣＣＧＣＴＣＧ ＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣ ＣＧＡＴＣＣＣＧＧＣ ＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧ ＧＧＴＧＧＴＣＧＣＧ ＣＣＡＣＣＧＧＧＧＣ ＣＧＴＣＧＧＣＧＧＣ ＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧ ＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣ ＧＣＧＣＴＣＧＣＡＣ ＣＧＡＣＧＡＧＣＧＧ ＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧ ＧＧＴＣＴＴＣＧＣＣ ＧＣＡＣＧＣＣＧＡＧ ＣＧＣＣＣＧＣＴＣＧ ＧＡＣＧＡＧＧＴＧＣ ＣＧＴＧＡＣＣＣＧＣ ＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣ ＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡ ＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣ ＧＧＣＧＣＣＣＧＣＣ ＧＴＧＣＣＧＣＡＣＣ ＧＡＧＣＧＣＴＡＣＴ ＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡ ＡＡＧＡＣＣＧＧＧＧ ＧＣＧＧＴＧＣＴＣＴ ＴＡＣＧＧＣＧＡＧ入 ＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡ ＧＡＧＡＧＣＴＣＣＧ ＧＴＣＧＧＣＡＣＣＧ ＧＧＡＣＧＣＣＴＣＧ ＧＴＧＧＴＣＧＣＣＣ ＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧ ＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣ ＣＡＧＧＡＧＧＣＣＧ ＧＴＣＡＣＣＧＣＧＡ ＣＣＧＧＡＣＧＴＧＧ ＴＧＡＣＣＡＣＣＡＣ ＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣ ＧＧＧＣＣＧＴＣＧＴ ＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣ ＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴ ＧＡＴＣＧＡＣＣＡＣ ＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣ ＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣ ＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡ ＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧ ＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧ ＧＣＣＧＧＣＧＧＣメ ＧＣＴＴＣＡＣＧＣＴ ＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴ ＡＣＴＡＣＧＧＣＣＴ ６０ １２０ １８０ ２４０ ３００ ３６０ ４２０ ４８０ ５４０ ６００ ６６０ ７２０ ７８０ ８４０ ９００ ９６０ １０２０ １０８０ １工４０ １２００

【図面の簡単な説明】

第１図は、アクチノブラ不ス・テイコミセチクス　（Ａ
ｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　　　　　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃ
ｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３１１２１のゲノムのＤＮＡの
２６１４ｂｐのＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片の制限地図で
ある。 それは、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩの粘着末端の接合
により由来した、その末端に２つのｘｈｏｒ１部位を含
有するインサートを明らかにする。 関連する制限部位のみが地図の図面に報告されている。 内部のＳｓｔｌおよびＫｐｎｌ認識部位の間の黒色の線
は、サザンハイプリダイゼーションのだめのブローブ硫
酸アンモニウム使用した断片を示す（参照、実施例２）
。 第２図１よ、配列決定の厳格さを示す。 ４９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヌクレオチド配列からなり、前記ヌクレオチド配列
   は、 ａ）アクチノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎ
   ｏｐｌａｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）Ａ
   ＴＣＣ３１１２１のゲノムのＢａｍＨＩの処理により得
   ることができる２６１４ｂｐのＤＮＡ断片、その小断片
   （ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）またはそれを含有するＤＮ
   Ａ配列、これらは感受性微生物宿主中への形質転換のと
   きダルバヘプチド（ｄａｌｂａｈｅｐｔｉｄｅ）抗生物
   質に対する抵抗性を与えることができる、 ｂ）感受性微生物宿主中への形質転換のときダルバヘプ
   チド抗生物質に対する抵抗性を与えることができ、そし
   てａ）に前述のＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションす
   る、核酸配列、 ｃ）ａ）に述べた断片とハイブリダイゼーションし、そ
   して感受性微生物宿主中への形質転換のときダルバヘプ
   チド抗生物質に対する抵抗性を与えることができる、Ｄ
   ＮＡインサートの部分、および ｄ）ａ）またはｂ）に定義したＤＮＡ配列に対する遺伝
   コードのディジェネレイション（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉ
   ｏｎ）の結果、デイジエネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔ
   ｅ）し、そして感受性微生物宿主中への形質転換のとき
   ダルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与えることが
   できる、ＤＮＡ配列、 から選択されることを特徴とするテイコーＲを与える配
   列。 ２、感受性微生物宿主中への形質転換のときダルバヘプ
   チド抗生物質に対する抵抗性を与えることができる、ア
   クチノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏｐｌ
   ａｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ
   ３１１２１のゲノムのＢａｍＨＩの処理により得ること
   ができる２６１４ｂｐのＤＮＡ断片、その小断片または
   それを含有するＤＮＡ配列であるテイコーＲを与える配
   列。 ３、感受性微生物宿主中への形質転換のときダルバヘプ
   チド抗生物質に対する抵抗性を与えることができ、そし
   てアクチノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏ
   ｐｌａｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴ
   ＣＣ３１１２１のゲノムのＢａｍＨＩの処理により得る
   ことができる２６１４ｂｐのＤＮＡ断片、その小断片ま
   たはそれを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼーショ
   ンする核酸配列であるテイコーＲを与える配列。 ４、感受性微生物宿主中への形質転換のときダルバヘプ
   チド抗生物質に対する抵抗性を与えることができ、アク
   チノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａ
   ｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３
   １１２１のゲノムのＢａｍＨＩの処理により得ることが
   できる２６１４ｂｐのＤＮＡ断片、その小断片またはそ
   れを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする
   ＤＮＡインサートの部分であるテイコーＲを与える配列
   。 ５、その由来源がアクチノプラネス・テイコミセチクス
   （Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔ
   ｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３１１２１以外のダルバヘプチド抗
   生物質を産生する微生物である、上記第１項の節ａ）、
   ｃ）またはｄ）記載のテイコーＲを与える配列。 ６、次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するテイコーＲを与えるＤＮＡ分離物またはダルバ
   ヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与えることができる
   その断片。 ７、上記第１、２、３、４、５および６項記載のテイコ
   ーＲを与える配列からなる、微生物宿主の形質転換に適
   した組み換えプラスミド。 ８、上記第７項記載の組み換えプラスミドで形質転換さ
   れた微生物宿主細胞。 ９、ダルバヘプチド抗生物質の産生体である、上記第８
   項記載の微生物細胞。 １０、上記第８項記載の形質転換された宿主細胞を適当
   な培地中で増殖させ、それからテイコーＲを与える配列
   を回収および分離することからなる、上記第１、２、３
   、４、５および６項記載のテイコーＲを与える配列を調
   製する方法。 １１、工程： ａ）ダルバヘプチド抗生物質の産生体である微生物のゲ
   ノムからＤＮＡの分画を抽出し、それを特定の制限酵素
   で部分的に消化し、 ｂ）前記制限断片を感受性宿主細胞のための直線化ベク
   ターに結合し、そして ｃ）前記形質転換された細胞を獲得した抵抗性により選
   択し、そしてテイコーＲを与える配列をそれらから分離
   する、 からなる、上記第１、２、３、４、５および６項記載の
   テイコーＲを与える配列を調製する方法。 １２、微生物はアクチノプラネス・テイコミセチクス（
   Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉ
   ｃｕｓ）ＡＴＣＣ３１１２１である、そして消化酵素は
   ＢａｍＨＩである、上記第１１項記載の方法。 １３、微生物細胞のゲノムから、対応する領域、または
   それらを含有するインサートを検出し、分離し、または
   精製するための、上記第１、２、３、４、５および６項
   記載のテイコーＲを与える配列の使用。 １４、微生物はダルバヘプチド抗生物質の産生体である
   、上記第１３項記載の使用。 １５、ダルバヘプチド抗生物質に対する微生物宿主の抵
   抗性を導入または増加するための、上記第１、２、３、
   ４、５および６項記載のテイコーＲを与える配列の使用
   。 １６、微生物細胞はダルバヘプチド抗生物質の産生体で
   ある、上記第１５項記載の使用。１７、上記第１、２、
   ３、４、５および６項記載の標識したテイコーＲ配列に
   より表されるプローブを、核酸分画とハイブリダイゼー
   ションさせ、そして必要に応じて前記プローブとハイブ
   リダイゼーションする核酸断片を分離することからなる
   、ダルバヘプチド抗生物質に対する抵抗性を与えること
   ができる核酸配列、またはそれを含有するインサートを
   分離し、同定し、または精製するための、上記第１、２
   、３、４、５および６項記載のテイコーＲを与える配列
   の使用。