DE69133555T2 - Polypeptide die in der exprimierung der glykopeptidantibiotikaresistenz einbegriffen sind - Google Patents

Polypeptide die in der exprimierung der glykopeptidantibiotikaresistenz einbegriffen sind Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Polypeptide, welche mit der Exprimierung der Resistenz gegenüber Antibiotika der Familie der Glykopeptide verbunden sind, nämlich bei Gram-positiven Bakterien, insbesondere der Familie der Gram-positiven Kokken. Die Erfindung betrifft auch eine Nukleotidsequenz, welche für diese Polypeptide kodiert. Sie betrifft auch die Verwendung dieser Polypeptide und ihrer Nukleotidsequenz als in-vitro-Nachweismittel einer Resistenz gegenüber Glykopeptiden. Unter den Gram-positiven Kokken ist die Erfindung ganz besonders auf die Enterokokken, die Streptokokken und die Staphylokokken gerichtet, welche ein besonderes Interesse für die Anwendung der Erfindung darstellen.
  • Die Glykopeptide, darunter das Vancomycin und das Teicoplanin, sind inhibitorische Antibiotika der Synthese der Bakterienwand. Diese Antibiotika werden sehr häufig zur Behandlung ernster Infektionen verwendet, welche durch Gram-positive Kokken (Enterokokken, Streptokokken und Staphylokokken) bedingt sind, insbesondere im Fall der Allergie und der Resistenz gegen Penicilline. Trotz langer klinischer Verwendung von Vancomycin blieb dieses Antibiotikum gegen quasi die Gesamtheit der Stämme bis 1986 aktiv, dem Datum, bei welchem die ersten resistenten Stämme isoliert worden sind. Danach wurde die Resistenz gegen Glykopeptide von vielen Mikrobiologen in Europa und den Vereinigten Staaten festgestellt, insbesondere bei Stämmen, welche bei Immunerkrankungen isoliert worden waren, was eine systematische Bewertung der Empfindlichkeit von Keimen in einem Wirtsmilieu erforderlich machte.
  • Die Aktivität der Glykopeptide hängt von der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antibiotikum und den Peptidoglykanvorläufern ab, mehr als von der direkten Wechselwirkung mit Enzymen des Zellwandmetabolismus. Insbesondere hat man festgestellt, dass sich die Glykopeptide an dem D-Alanyl-D-Alanin-terminalen Ende (D-ala-D-ala) des Peptidoglykanvorläufers binden.
  • Das kürzliche Auftreten einer Resistenz gegen Glykopeptide, insbesondere bei den Enterokokken, hat zum Erhalten bestimmter Ergebnisse auf der Ebene des Erkennens von Faktoren geführt, welche diese Resistenz verleihen.
  • Man hat beispielsweise in einem besonderen Enterokokkenstamm, Enterococcus faecium BM4147, festgestellt, dass die Determinante der Resistenz gegen Glykopeptide auf einem Plasmid von 34 kb, dem Plasmid pIP816, angeordnet war. Diese Determinante wurde in E.coli kloniert (Brisson Noel et al, 1990, Antimicrob Agents Chemother 34, 924–927).
  • R. Leclercq et al (The New England Journal of Medecine, Bd. 319, Nr. 3, S. 157–161) beschreiben die Untersuchung der Resistenz von zwei Isolaten von E. faecium mit erhöhten Gehalten von Vancomycin und Teicoplanin. Das Plasmid pIP816 und die Restriktionsfragmente HindIII von 10 kb werden bei den Hybridisierungsreaktionen der plasmidischen DNA der Isolate BM4152 und BM4152-1 von E. faecium verwendet.
  • Nach den bis jetzt erhaltenen Ergebnissen war die Resistenz gegen Glykopeptide mit der Produktion eines Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kDa verbunden, wobei die Synthese dieses Proteins durch unterinhibitorische Konzentrationen bestimmter Glykopeptide, wie dem Vancomycin, induziert wurde.
  • Bei der Durchführung tiefer gehender Untersuchungen der Resistenz bestimmter Stämme Gram-positiver Kokken gegenüber Glyko peptiden, insbesondere dem Vancomycin oder dem Teicoplanin, haben die Erfinder festgestellt, dass diese Resistenz mit der Exprimierung verschiedener Proteine oder Polypeptide verbunden ist, welche durch Sequenzen kodiert werden, die im Allgemeinen durch Plasmide bei den resistenten Stämmen getragen werden. Die von den Erfindern erhaltenen neuen Ergebnisse erlauben des Weiteren, die Gene zu unterscheiden, welche für zwei Phenotypen der Resistenz kodieren, zum einen die Stämme, welche hochgradig gegen Glykopeptide resistent sind, zum anderen Stämme, welche auf niederem Niveau resistent sind.
  • Unter einem auf hohem Niveau resistentem Stamm versteht man einen Bakterienstamm, insbesondere einen Gram-positiven Kockenstamm, für welchen die minimal inhibierenden Konzentrationen (CMI) von Vancomycin und von Teicoplanin über 32 bzw. 8 μg/ml liegen. Die CMI-Werte von Vancomycin gegenüber auf niedrigem Niveau resistente Stämme sind zwischen 16 und 32 μg/ml enthalten. Diese Stämme sind wahrscheinlich auf Teicoplanin sensibel.
  • Die Erfinder haben unter den zur Exprimierung der Resistenz gegenüber Glykopeptide erforderlichen Komponenten ein besonderes Protein isoliert und gereinigt, genannt VANA oder VanA, welche eine bestimmte Homologie mit D-Alanin-D-Alanin-Ligasen zeigen. VanA ist nichtsdestoweniger von Ligasen funktionell verschieden.
  • Man wird prinzipiell durch "van..." eine Gensequenz und durch "Van..." eine Aminosäuresequenz bezeichnen.
  • Die Erfindung betrifft Polypeptide oder Proteine, welche in der Exprimierung einer Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide und insbesondere gegen Vancomycin und/oder Teicoplanin einbegriffen sind, sowie die Nukleotidsequenzen, welche für jene Komplexe kodieren.
  • Die Erfindung ist auch auf Nukleotidsonden gerichtet, welche zur Feststellung einer Resistenz gegen Glykopeptide verwendbar sind, nämlich durch Kettenpolymerisationsreaktion (PCR), oder durch Tests, welche Antikörper in Einsatz bringen.
  • Die Erfindung betrifft ein gereinigtes Protein, welches zur Exprimierung und/oder Regulation der Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erforderlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, welche unter den Aminosäuresequenzen ausgewählt ist, die in der Sequenzliste durch SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 3 (VanX), SEQ ID NO 20 (VanC), SEQ ID NO 4 (VanR) oder SEQ ID NO 5 (VanS) identifiziert sind, oder eine Sequenz, welche mit einer der Nukleotidketten hybridisiert, welche in der Sequenzliste durch SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10 oder SEQ ID NO 21 identifiziert ist oder mit einer der folgenden Sequenzen V1 oder V2 unter stringenten oder weniger stringenten Bedingungen:
    Figure 00040001
  • Eine erste besondere Zusammensetzung gemäß der Erfindung, welche in der Exprimierung der Resistenz gegen Glykopeptide einbegriffen ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens drei Proteine oder alle Teile eines oder mehrerer dieser Proteine umfasst, welche erforderlich sind, den Gram-positiven Bakterien die Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide, insbesondere dem Vancomycin und/oder dem Teicoplanin, zu verleihen oder diese Resistenz zu begünstigen, insbesondere in Stämmen der Familie Gram-positiver Kokken.
  • Ein weiteres Protein VanC, verwandt mit den D-Ala-D-Ala-Ligasen, aber von unterschiedlicher Spezifität, wurde bei Enterococcus gallinarum BM4173 charakterisiert; das vanC-Gen zeigt Domänen, welche eine ausreichende Homologie mit dem vanA-Gen aufweisen, damit Sonden, welche bestimmten Bereichen von vanA entsprechen, ihre Feststellung erlauben.
  • E. gallinarum ist ein Isolat, welches in wesentlicher Weise gegen geringe Mengen Vancomycin resistent ist (Dutka-Malen et al, Antimicrob. Agents Chemother 34 (1990b) 1875–1879).
  • Unter dem Begriff "Polypeptide" versteht man alle Verkettungen von Aminosäuren, welche Proteine enthalten können oder einen geringeren Teil wie jenen eines Proteins.
  • Die oben in Rede gestellten stringenten Bedingungen werden nach herkömmlichen Modalitäten bestimmt, welche die Hybridisierung der Nukleotidsequenzen vorantreibt. Beispielsweise kann man, was Sequenzen, welche mit der Sequenz des vanA-Gens (SEQ ID NO 8) hybridisieren, die folgenden Bedingungen anwenden:
    • – für eine Hybridisierung unter Bedingungen mit starker Stringenz: * Reaktionstemperatur 65°C während einer Nacht in einer Lösung, welche 0,1 × SDS, 0,7 % Milchpulver, entrahmt, 6 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat bei pH = 7,0) enthält, * Waschen bei 65°C in 2 × SSC-0,1 × SDS;
    • – für eine Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen beträgt die Hybridisierungstemperatur 60°C während einer Nacht und die Waschtemperatur 45°C.
  • Die Exprimierung einer Resistenz gegen Glykopeptide kann sich durch eine Persistenz bzw. Dauerhaftigkeit einer Infektion infolge herkömmlicher Keime, welche gegen Glykopeptide sensibel sind, ausdrücken.
  • Ein Polypeptid oder ein Protein ist zur Exprimierung einer Resistenz gegen Glykopeptide erforderlich, wohingegen die Abwesenheit den Stamm, welcher dieses Polypeptid oder dieses Prote in enthält, sensibler gegenüber Glykopeptiden macht und dieses Polypeptid oder Protein in den sensiblen Stämmen nicht vorliegt.
  • Unterschiedliche Resistenzniveaus gegen Glykopeptide existieren insbesondere unter den Gram-positiven Kokkenstämmen.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, welche durch die Verbindung der Proteine gebildet ist, welche in der Liste von Sequenzen durch SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 2 (VanA), SEQ ID NO 3 (VanX) identifiziert sind.
  • Die Erfinder haben folglich festgestellt, dass die Exprimierung einer Resistenz gegen Glykopeptide bei Gram-positiven Bakterien die Exprimierung von wenigstens drei Proteinen oder Polypeptiden, die von diesen Proteinen abstammen, erfordern.
  • Gemäß einer ersten besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Polypeptide der Zusammensetzung des Weiteren dadurch charakterisiert, dass die Aminosäuresequenzen, welche zur Exprimierung der Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erforderlich sind, sich unter der Kontrolle von Regulationselementen befinden, insbesondere Proteinen, welche den Sequenzen entsprechen, die durch SEQ ID NO 4 oder SEQ ID NO 5 in der Liste von Sequenzen bezeichnet sind und welche einer Regulationssequenz R bzw. einer Sensorsequenz S entsprechen.
  • VanS und VanR bilden ein Regulationssystem mit zwei Bestandteilen, wobei VanR ein Transkriptionsaktivator ist und VanS die VanR-abhängige Transkription stimuliert. VanS kann die Größenordnung der Phosphorilierung von VanR in Antwort auf das Vancomycin modulieren, das im externen Milieu vorliegt, und greift damit in die Kontrolle der Transkription der Resistenzgene gegen Vancomycin ein.
  • Diese Regulationssequenzen sind insbesondere dazu fähig, das Resistenzniveau zu steigern, in dem Maß, wo sie die Exprimie rung von Resistenzproteinen, welche in den Polypeptiden der Erfindung enthalten sind, begünstigen.
  • Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die Polypeptide der obigen Zusammensetzung durch die Sequenz SEQ ID NO 6 kodiert, welche in der Liste von Sequenzen identifiziert ist, welche die Kodierungssequenz der 5 vorher beschriebene Proteine darstellt.
  • Eine weitere Sequenz der Erfindung wird durch SEQ ID NO 11 bezeichnet, welche die Sequenz SEQ ID NO 6 sowie eine stromaufwärtige Kette von SEQ ID NO 6, welche für eine Transposase (kodiert durch den Strang (–)) der Sequenz kodiert und eine stromabwärtige Kette von SEQ ID NO 6, entsprechend dem vanY- und vanZ-Genen und an jedem Ende inverse Mehrfachsequenzen von 38 pb enthält. SEQ ID NO 11 bildet ein Transposon, dessen Gene auf unterschiedlichen Ebenen in die Etablierung der Resistenz gegen Glykopeptide eingreifen.
  • Die durch die Abkürzung SEQ ID NO 1 bezeichnete Sequenz enthält das Protein VanH, welches durch das vanH-Gen kodiert wird, dieses Protein umfasst 322 Aminosäuren und beginnt mit einem Methionin. Dieses Protein ist ein Enzym, welches die Synthese von Peptidoglykan impliziert und eine Molekularmasse von 35,754 kDa besitzt. VanH zeigt bestimmte Ähnlichkeiten mit Dehydrogenasen, welche die von NAD+ abhängige Oxidation von 2-Hydroxycarbonsäuren katalysieren, um die entsprechenden 2-Ketocarbonsäuren zu bilden. Tatsächlich kann das Protein VanH die NADP+ eher ausführen als die NAD+. Das Protein VanH beinhaltet auch mehrere Reste der reaktiven Stellen, welche wahrscheinlich direkt an der Bindung des Substrates und der Katalyse partizipiert sind. VanH kann in die Synthese eines Substrates der VanA-Ligase einbegriffen sein. Dieses Substrat von VanA wird eine D-α-Hydroxycarbonsäure sein, welche durch VanA mit dem D-Alanin an der Stelle einer Aminosäure D kondensiert werden wird, welche die Bindung des Vorläufers von Peptidoglykan mit dem Vancomycin beeinflusst, durch Verlust einer Wasser stoffbindung, da eine der Wasserstoffbindungen, welche zwischen dem Vancomycin und N-Acetyl-D-Ala-D-Ala mit der Gruppe NH des endständigen D-Alanin-Restes verwirklicht wird. Es ist festzuhalten, dass "Ala" die Abkürzung von "Alanin" ist.
  • Die Erfinder konnten bestimmte Interaktionen zwischen den Proteinen VanA und VanH nachweisen und konnten insbesondere Nachfolgendes beschreiben: Die Natur des Proteins VanA (D-Alanin:D-Alanin-Ligase von geänderter Spezifität für sein Substrat), welche die Resistenz gegen Glykopeptide erlaubt, impliziert die Biosynthese einer neuen Verbindung, welche von D-Ala-D-Ala verschieden ist, durch VanA, ein Peptid, das in Peptidoglykane einverleibt sein kann, aber nicht durch das Vancomycin erkannt wird. Unter besonderer Beobachtung der Ähnlichkeiten zwischen dem Produkt des Genes vanH mit den spezifischen α-Ketosäure-Reduktasen haben es ermöglicht zu bestimmen, dass diese Verbindung keine Aminosäure D sein kann, sondern eine Hydroxysäure D, welche, da sie mit dem D-Alanin durch VanH verbunden war, einen neuen Depsipeptid-Vorläufer von Peptidoglykan erzeugen kann.
  • Die Erfindung betrifft auch alle Kombinationen dieser verschiedenen Proteine in einem Resistenzkomplex, sowie Hybridproteine, welche eines oder mehrere der obigen Proteine umfassen oder einen Teil dieser Proteine, in Verbindung mit einer bestimmten Aminosäuresequenz. Sie betrifft insbesondere eine Zusammensetzung von Polypeptiden, welche einen Resistenzkomplex gegen Antibiotika bilden, dadurch gekennzeichnet, dass er durch die Verbindung von Proteinen gemäß Anspruch 1, bezeichnet durch SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 20 (VanC), SEQ ID NO 3 (VanX), gebildet ist.
  • Im Umfang der Erfindung sind auch die Nukleotidsequenzen enthalten, welche für eine der Aminosäuresequenzen, die oben beschrieben sind, kodieren.
  • Eine Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie besteht aus:
    • a. einer der Nukleotidketten, identifiziert in der folgenden Liste von Sequenzen: SEQ ID NO 9 (vanH), SEQ ID NO 10 (vanX);
    • b. einer Codesequenz eines Genes, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Komplementärsequenz einer der unter a. identifizierten Ketten hybridisiert, wodurch sie die Feststellung von Resistenzstämmen gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erlaubt;
    • c. einer der Nukleotidketten, welche in der folgenden Liste von Sequenzen identifiziert sind: SEQ ID NO 21 (vanC), SEQ ID NO 23 (vanR) oder SEQ ID NO 24 (vanS); oder
    • d. einem Fragment von Sequenzen, welche unter a. oder c. identifiziert sind, das die Feststellung von Resistenzstämmen gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erlaubt;
    oder wenn es sich um einen Teil einer der Ketten von SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 oder SEQ ID NO 22 handelt, in der Lage ist
    • a. entweder einen Starter zu bilden, für die Feststellung einer Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide, insbesondere gegen Vancomycin und/oder Teicoplanin, insbesondere in Stämmen der Familie der Gram-positiven Kocken,
    • b. oder für eine Sequenz zu kodieren, welche zur Exprimierung oder Regulation der Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erforderlich ist, insbesondere gegen Vancomycin und/oder Teicoplanin, insbesondere in Stämmen der Familie der Gram-positiven Kokken.
  • Die Sequenz SEQ ID NO 7 kodiert für die drei Resistenzproteine VanH, VanA und VanX.
  • Die Sequenz SEQ ID NO 22 und die Sequenz SEQ ID NO 11 enthalten ein Transposon, das in der 7a dargestellt ist; dieses Transposon enthält die Gene, welche zur Exprimierung der Resistenz gegen Glykopeptide erforderlich sind, sowie die Gene, wel che mit dieser Resistenz verbunden sind, einbegriffen beispielsweise die Regulation der Exprimierung der Gene, welche erforderlich sind, um den Phenotyp der Resistenz zu erhalten oder in der Menge des erhaltenen Resistenzpolypeptids einbegriffen sind.
  • Eine besondere Sequenz, welche der obigen Definition entspricht, ist eine der folgenden Sequenzen:
    Figure 00100001
  • V1 und V2 erlauben gegebenenfalls die Bildung von Sonden in Verbindung mit weiteren Nukleotiden, gemäß dem Grad der gewünschten Spezifität zur Feststellung von vanA und vanC und können auch als Starter in Kettenpolymerisationen verwendet werden.
  • Weitere Nukleotidketten, welche in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind, sind die Ketten SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 12 (Transposase), SEQ ID NO 13 (Resolvase), SEQ ID NO 14 (vanY), SEQ ID NO 15 (vanZ), SEQ ID NO 23 (vanR), SEQ ID NO 24 (vanS) oder eine Variante einer dieser Ketten, wenn sie für ein Protein kodieren, welches immunologische und/oder funktionelle Eigenschaften besitzt, welche ähnlich zu jenen von Proteinen sind, welche durch die Ketten SEQ ID NO 8 SEQ (vanA), ID NO 9 (vanH), SEQ ID NO 10 (vanX) oder SEQ ID NO 21 (vanC), SEQ ID NO 12 (Transposase), SEQ ID NO 13 (Resolvase), SEQ ID NO 14 (vanY), SEQ ID NO 15 (vanZ), SEQ ID NO 23 (vanR), SEQ ID NO 24 (vanS) kodieren oder wenn sie die Feststellung von Stämmen erlauben, welche gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide resistent sind.
  • Varianten umfassen alle Fragmente von Sequenzen, welche die folgenden Eigenschaften besitzen.
  • Diese Sequenzen kodieren für die Resistenzproteine VanH, VanA und VanX.
  • Die durch SEQ ID NO 8 bezeichnete Nukleotidsequenz entspricht einem DNA-Fragment von 1029 pb, welches zwischen dem ATG-Kodon in Position 377 und dem TGA-Kodon in Position 1406 auf dem Plasmid pAT214 (6) liegt.
  • Die Lokalisierung der Regulations- und Resistenzproteine ist in 3 veranschaulicht.
  • Die Erfinder haben stromaufwärts und stromabwärts der vanR-, vanS-, vanH-, vanA- und vanX-Gene identifiziert, welche für die Exprimierung der Resistenz gegen Glykopeptide bei einem gegebenen Niveau erforderlich oder damit verbunden sind, Gene, welche für eine Transposase und eine Resolvase stromaufwärts (zur vorgenannten Gruppe) kodieren und vanY- und vanZ-Gene stromabwärts von dieser Gruppe. Die Transposase- und Resolvase-Gene werden in die Transpositionsfunktionen einbegriffen sein und das vanY-Gen, kodierend für eine D,D-Carboxypeptidase, wird in den Peptidoglykanmetabolismus einbegriffen sein und kann zur Resistenz gegen Glykopeptide bei E. faecium BM4147 beitragen, sogar wenn vanR, vanS, vanH, vanA und vanX auf einem Plasmid mit erhöhter Anzahl von Kopien, selbst eine Resistenz von hohem Niveau verleihen.
  • Es ist festzuhalten, dass die Codesequenz der Transposase auf dem Strang (–) der Sequenz ID NO 22 lokalisiert ist, welcher für vanR, vanS, vanH, vanA, vanX, vanY, vanZ und die Resolvase kodiert.
  • Die Erfindung betrifft nicht allein die DNA-Sequenzen, welche in der Liste von Sequenzen identifiziert sind, sondern auch die komplementären DNA-Sequenzen und die entsprechenden RNA-Sequenzen. Die Erfindung betrifft des Weiteren äquivalente Sequenzen der vorhergehenden, entweder bezüglich der Exprimierung von Proteinen, von Polypeptiden oder ihren weiter oben beschriebenen Fragmenten oder bezüglich ihrer Fähigkeit beispielsweise durch die Techniken der Kettenpolymerisation Grampositive Bakterienstämme festzustellen, welche eine Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide zeigen, wie dem Vancomycin oder dem Teicoplanin.
  • Auch sind rekombinante Sequenzen Teil der Erfindung, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine der obigen Nukleotidsequenzen enthalten.
  • Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine der obigen Nukleotidsequenzen umfasst, an einer Stelle, welche für seine Replikation nicht wesentlich ist, unter der Kontrolle von Regulationselementen, welche in die Exprimierung der Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide eingreifen kann, insbesondere dem Vancomycin oder dem Teicoplanin, in einem bestimmten Wirt.
  • Insbesondere vorteilhafte rekombinante Vektoren für die Durchführung der Erfindung sind die folgenden Vektoren: pAT214, welcher das Fragment EcoRV-SacII von 1761 bp enthält, welches eine Nukleotidsequenz enthält, die für das Protein VanA kodiert; in diesen Vektoren sind die Sequenzen der Erfindung vorteilhafterweise unter die Kontrolle von Promotoren, wie dem lac-Promotor gestellt.
  • Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Zellwirt, welcher eine Nukleotidsequenz, wie vorher beschrieben, oder einen oben beschriebenen Vektor umfasst, unter Bedingungen, welche die Exprimierung der Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erlaubt, insbesondere die Resistenz gegen Vancomycin oder/und Teicoplanin, wobei der Wirt beispielsweise un ter den Bakterien, insbesondere den Gram-positiven Kokken ausgewählt wird. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Zellwirtes, wie er oben beschrieben ist.
  • Für bestimmte Anwendungen kann man auch die Hefen, die Pilze, die Insekten- oder Säugetierzellen verwenden.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Nukleotidsonde, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mit einer vorher beschriebenen Sequenz hybridisieren kann, wobei die Sonde gegebenenfalls markiert ist. Diese Sonden können spezifisch für Proteine der Resistenz gegen Glykopeptide sein oder nicht.
  • Für den Zweck der vorliegenden Erfindung verwendbare Marker sind bekannte radioaktive Marker sowie weitere Marker, wie die enzymatischen Marker oder die chemolumineszenten Marker.
  • So markierte Sonden können in Hybridisierungstests verwendet werden, um eine Resistenz gegen Glykopeptide bei Gram-positiven Bakterien festzustellen. In diesem Fall kann man Bedingungen schwacher Stringenz einsetzen.
  • Nukleotidsonden gemäß der Erfindung können dadurch gekennzeichnet sein, dass sie spezifisch bei Gram-positiven Bakterien für Sequenzen sind, welche für ein Resistenzprotein gegen Glykopeptide kodieren, insbesondere gegen Vancomycin und/oder Teicoplanin, wobei diese Sonden des Weiteren unter diesen Sequenzen universell sein können.
  • Unter diesen spezifischen Sonden versteht man alle Oligonukleotide, welche mit einer Nukleotidsequenz hybridisieren, die für eines der Proteine gemäß der Erfindung kodiert, wie sie auf den vorangehenden Seiten beschrieben sind, und keine Kreuzhybridisierungs- oder Verstärkungs-(PCR)-Reaktion mit den Sequenzen zeigen, welche in der Gesamtheit der sensiblen Stämme vorliegen.
  • Die universelle Eigenschaft von Oligonukleotiden, welche bei PCR verwendbar sind, ist durch ihre Kapazität bestimmt, spezifisch die Verstärkung einer Nukleotidsequenz zu fördern, welche in der Resistenz bei einem Stamm einbegriffen ist, wie dem Gram-positiven Bakterium, das gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide resistent ist.
  • Der Umfang bzw. die Größe der Nukleotidsonden gemäß der Erfindung kann in Funktion der gewünschten Verwendung variieren. Für die bei PCR verwendbaren Oligonukleotide kann man auf Fragmente gewöhnlicher Länge bei dieser Technik zurückgreifen. Um Sonden zu realisieren kann man alle Teile der Sequenzen der Erfindung verwenden, beispielsweise Fragmentsonden von 200 Nukleotiden.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird eine Nukleotidsonde im Hinblick auf ihre Spezifität gegenüber einer Nukleotidsequenz ausgewählt, welche für ein Protein kodiert, welches zur Exprimierung bei Gram-positiven Bakterien von einem hohen Niveau der Resistenz gegen Antibiotika der Familien der Glykopeptide erforderlich ist, insbesondere gegen das Vancomycin und das Teicoplanin.
  • Weitere vorteilhafte Sonden zur Durchführung der Erfindung sind durch ihre universelle Eigenschaft gemäß der vorangehenden Definition charakterisiert, aber nicht spezifisch für Resistenzgene. Sie können auch als PCR-Starter verwendet werden, und sind beispielsweise:
    Figure 00140001
  • V1 und V2 hybridisieren mit vanA und vanC und können die Feststellung von mit der Resistenz gegen Glykopeptide verbundenen Proteinen bei weiteren Mikroorganismen verwendet werden.
  • Weitere besondere Sonden der Erfindung haben die spezielle Eigenschaft einer Nukleotidsequenz, welche für ein Protein kodiert, welche zur Exprimierung bei Gram-positiven Bakterien auf unterem Niveau der Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide erforderlich sind, insbesondere dem Vancomycin bei Gram-positiven Bakterien.
  • Nach einer besonders bevorzugten Form charakterisiert man eine Sonde der Erfindung dadurch, dass sie mit einer chromosomalen oder nicht-chromosomalen Nukleotidsequenz eines Gram-positiven Stammes hybridisiert, welcher gegen Glykopeptide resistent ist, insbesondere das Vancomycin und/oder das Teicoplanin, insbesondere dadurch, dass sie mit einer chromosomalen oder nicht-chromosomalen Nukleotidsequenz eines Stammes Gram-positiver Kokken hybridisiert, beispielsweise einem Enterokokkenstamm und vorzugsweise E. faecium 4147 oder E. gallinarum.
  • Um Stämme mit hohem Resistenzniveau von Stämmen mit niedrigem Resistenzniveau zu unterscheiden, kann man einen Hybridisierungstest realisieren, indem man Bedingungen starker Stringenz durchführt.
  • Die Oligonukleotide der Erfindung können ausgehend von Sequenzen der Erfindung durch Schneiden bzw. Stückelung mit Restriktionsenzymen oder durch chemische Synthese gemäß den klassischen Verfahren erhalten werden.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie das oder die oben beschriebenen Polypeptide oder eine oben beschriebene Aminosäuresequenz erkennen.
  • Diese Antikörper können durch klassische Antikörperherstel lungsverfahren erhalten werden. Insbesondere kann man zur Herstellung monoklonaler Antikörper auf das Verfahren von Kolher und Milstein zurückgreifen, gemäß welchem man monoklonale Antikörper durch Zellfusion zwischen Myelomzellen und Rückenmarkszellen von der Maus herstellt, welche vorher mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung immunisiert worden sind, entsprechend dem klassischen Verfahren.
  • Die Antikörper der Erfindung sind vorteilhafterweise zur Feststellung der Anwesenheit von Proteinen verwendbar, die für eine Resistenz gegen Glykopeptide, insbesondere dem Vancomycin und dem Teicoplanin charakteristisch sind.
  • Im Umfang der Erfindung sind auch Tests an den Gram-positiven Bakterien zur Feststellung einer Resistenz gegen Glykopeptide enthalten, insbesondere Tests, welche die ELISA-Techniken einsetzen.
  • Ein Kit für die in-vitro-Diagnose der Gegenwart von Grampositiven Stämmen, welche resistent gegen Glykopeptide, insbesondere das Vancomycin und/oder das Teicoplanin sind, wobei diese Stämme insbesondere Gram-positiven Kokken angehören, beispielsweise Enterokokken, beispielsweise E. faecium oder E. gallinarum, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie umfassen:
    • – Antikörper entsprechend der obigen Definition, gegebenenfalls markiert,
    • – einen Wirkstoff zur Feststellung einer immunologischen Reaktion vom Typ Antikörper-Antigen,
    • – gegebenenfalls Reagenzmittel zur Bewerkstelligung der Zell-Lyse der untersuchten Probe.
  • Die durch die Erfinder fokussierten Mittel stellen darüber hinaus den durchaus interessanten Vorteil dar, dass sie für die Realisierung eines raschen und zuverlässigen Tests oder eines Kits zur Feststellung von Gram-positiven Stämmen, welche gegen Glykopeptide resistent sind, durch die Kettenpolymerisationsre aktion (PCR), angepasst sind. Ein solcher Test erlaubt es, die Empfindlichkeit existierender Tests zu verbessern, welche weniger zuverlässig sind und welche in bestimmten Fällen die Feststellung der Gesamtheit der Repräsentanten der Genfamilie erlauben, welche für Resistenzproteine gegen Glykopeptide bei Gram-positiven Bakterien kodieren.
  • Die Realisierung eines Tests durch das Amplifizierungsverfahren von Genen dieser Proteine wird durch die PCR-Technik oder durch die IPCR-Technik durchgeführt (IPCR: Abkürzung für inverse Kettenpolymerisationsreaktion).
  • Die IPCR-Technik erlaubt die Amplifizierung von terminalen NH2- und COOH-Regionen von Genen, welche man feststellen will.
  • Bestimmte Starter erlauben insbesondere die Amplifizierung der Gene von Stämmen mit niedrigem Niveau.
  • Beispielsweise sind die folgenden Sequenzen als Starter zur Herstellung von Sonden für die Feststellung einer Amplifizierung durch das PCR- oder IPCR-Verfahren verwendbar.
  • Figure 00170001
  • X stellt eine der Basen A, T, C oder G dar und entspricht des Weiteren in allen Fällen dem Inosin.
  • Die Erfindung betrifft natürlicherweise die Komplementärsonden von vorher beschriebenen Oligonukleotiden sowie gegebenenfalls die RNA-Sonden, welche diesen entsprechen.
  • Ein Kit zur in-vitro-Diagnostik in Gegenwart von Stämmen, welche gegen Glykopeptide resistent sind, insbesondere das Vancomycin und/oder das Teicoplanin, wobei diese Stämme insbesondere von Gram-positiven Kokken abstammen, insbesondere wenn es sich um Stämme von Enterokokken, beispielsweise E. faecium oder E. gallinarum handelt, ist dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst:
    • – eine Nukleotidsonde, welche auf die obigen Definitionen antwortet und gegebenenfalls,
    • – Oligonukleotid-Triphosphate in ausreichender Menge, um die Vervielfachung bzw. Verstärkung der gewünschten Sequenz erlaubt,
    • – einen Hybridisierungspuffer,
    • – ein DNA-Polymerisationsmittel.
  • Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur in-vitro-Feststellung der Anwesenheit von Gram-positiven Stämmen gerichtet, welche gegen Glykopeptide resistent sind, insbesondere gegen das Vancomycin und/oder das Teicoplanin, wobei diese Stämme insbesondere von der Familie Gram-positiver Kokken abgeleitet sind, insbesondere wenn es sich um Enterokokkenstämme handelt, beispielsweise E. faecium oder E. gallinarum, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:
    • a) das Inkontaktbringen einer biologischen Probe, welche dazu geeignet ist, die resistenten Stämme zu enthalten, mit einem Starter, welcher durch eine oben beschriebene Nukleotidsequenz oder die Gesamtheit einer vorher beschriebenen Sequenz gebildet ist, welche dazu in der Lage ist, mit einer gewünschten Nukleotidsequenz zu hybridisieren, welche zur Exprimierung der Resistenz gegen Glykopeptide erforderlich ist, wobei diese Sequenz als Matrix verwendet wird, in Anwesenheit der vier verschiedenen Nukleotidtriphosphate und einem Polymerisationsmittel, unter Hybridisierungsbedingungen, unter welchen für jede mit einem Starter hybridisierte Nukleotidsequenz ein Verlängerungsprodukt eines jeden komplementären Starters der Matrix synthetisiert wird,
    • b) die Trennung der Matrix und des erhaltenen Verlängerungsproduktes, wobei letzteres dann sich auch wie eine Matrix verhalten kann,
    • c) die Wiederholung der Stufe a) in einer Weise, um eine feststellbare Menge der gewünschten Nukleotidsequenzen zu erhalten,
    • d) die Feststellung des Verstärkungs- bzw. Vervielfältigungsproduktes der Nukleotidsequenzen.
  • Die Feststellung des Verlängerungsproduktes der gewünschten Sequenz kann durch eine Sonde realisiert werden, welche identisch mit den eingesetzten Startern zur Durchführung der PCR- oder IPCR-Technik eingesetzt wurde, oder auch durch eine unterschiedliche Sonde dieser Starter, wobei diese Sonde gegebenenfalls markiert sein kann.
  • Einzelheiten betreffend die Durchführung von PCR-Techniken kann ausgehend von den Patentanmeldungen EP 0 229 701 und EP 0 200 362 erhalten werden.
  • Weitere Vorteile und charakteristische Merkmale der Erfindung erscheinen in den folgenden Beispielen und in den Figuren.
  • FIGUREN
  • 1: Elektrophorese an Polyacrylamidgel SDS (SDS-PAGE) von Proteinen von Membranfraktionen der Linien 1 und 4, Molekulargewichtsstandards; Linie 2, E. faecium BM4147, kultiviert in Abwesenheit von Vancomycin; Linie 3, BM4147, kultiviert mit 10 μg/ml Vancomycin. Die Pfeilspitze zeigt die Position des VANA-Proteins.
  • 2:
    A: Restriktionskarten von Einfügungen (Inseraten) der Plasmide pAT213 und pAT214. Der Vektor und die DNA-Einfügungen sind durch helle bzw. dunkle Segmente deutlich unterschieden. Der offene Pfeil stellt das vanA-Gen dar.
    B: Strategie für die Nukleotidsequenzierung für das Inserat von 1761 bp in dem Plasmid pAT214. Die Pfeile zeigen die Richtung und Ausdehnung der Sequenzierungsreaktionen durch das Dideoxy-Verfahren. Der synthetische Oligonukleotidstarter (5' ATGCTCCTGTCTCCTTTC 3' OH) ist komplementär zu der Sequenz zwischen den Positionen 361 und 378. Es sind nur die wesentlichen Restriktionsstellen angegeben.
  • 3: Position der Sequenzen R, S, ORF1, ORF2, ORF3.
  • 4: Darstellung der SEQ ID NO 6
  • 5: Darstellung der SEQ ID NO 6 und des entsprechenden Proteins.
  • 6: Sequenz des vanA-Gens und des entsprechenden Proteins.
  • 7:
    (a): Lokalisierung der Gene vanR, vanS, vanH, vanA, vanX, vanY, vanZ des Transposasegenes und des Resolvasegenes sowie der sich wiederholenden inversen terminalen Sequenzen von 38 bp am Ende des Transposon.
    (b): Kartographie der Polylinker-Plasmide (A) von pAT29 und von bei dieser Untersuchung konstruierten Derivaten. Der mit P2 markierte Pfeil zeigt die Position und Orientierung des Promotors P2 von aphA-3 (Caillaud et al, 1987, Mol. Gen. Genet. 207: 509–513). (B) Inserat von pAT80. Die leeren Rechtecke zeigen die DNA von pAT29, sind jedoch nicht in der Skala dargestellt. Die Rechtecke enden in einem Pfeil, welcher die kodierenden Sequenzen indiziert. Die Pfeile mit durchgezogenen Linien, vertikal und horizontal, zeigen jeweils die Position und Richtung des apha-1-Genes in den Derivaten von pAT80. Restriktionsstellen: Ac, AccI; B, BamHI; Bg, BglII; Bs, BssHII; E, EcoRI; H, HindIII; Hc, HincII; K, KpnI; P, PstI; S, SmaI; SI, SacI, SII, SacII; Sa, SalI; Sp, SphI; Xb, XbaI. (C) Inserate in pAT86, pAT87, pAT88 und pAT89. Die Inserate sind durch durchgezogene Linien dargestellt und ihre entsprechenden Vektoren sind in Klammern angegeben.
  • 8: Nukleotidsequenz von Transposon, welche in 7 dargestellt ist und Aminosäuresequenz der entsprechenden Proteine. Die Nukleotidsequenz ist für den Strang (+) und für den Strang (–) dargestellt (entsprechend der komplementären Sequenz des Stranges (+) der Positionen 1 bis 3189), auf welchem die für die Transposase kodierende Sequenz lokalisiert ist.
  • 9: Nukleotidsequenz des Fragmentes von 1347 bp SacI-PstI des Plasmids pAT216, enthaltend das vanC-Gen. Die Nummerierung beginnt bei der ersten Base G der Restriktionsstelle SacI. Die potentielle RBS-Sequenz stromaufwärts des Initiierungskodons der ATG-Übersetzung in der Position 215 ist unterstrichen. Das STOP-Kodon (TGA) ist durch * gezeigt. Der Kodierungsbereich von vanC und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind fett gedruckt dargestellt. Sich überlappende sequentielle Klone sind durch Restriktionsfragmente der Unterklonierung von pAT216 in dem Bakteriophagen M13mp10 (Amersham, England) erzeugt worden. Ein universeller Starter (New England Biolabs Beverly MA) wurde zur Sequenzierung des Inserats der rekombinanten Phagen verwendet. Die Sequenzierung wurde durch das enzymatische Didesoxynukleotid-Verfahren (Sanger et al, 1977, PNAS 74: 5463–5467) durchgeführt, unter Verwendung der DNA-Polymerase T7 (Sequenase US B CORP, Cleveland, OH) und dem [α-35S]dATP (Amersham, England). Die Reaktionsprodukte wurden zu 6 % auf das denaturierende Polyacrylamidgel aufgeladen.
  • 10: Ausrichtung der Aminosäuresequenzen VanC, VanA, DdlA und DdlB. Die identischen Aminosäuren (I) und die konservativen Substitu tionen (C) in den 4 Sequenzen sind in der Ausrichtung gezeigt. Zur Klassifizierung der konservativen Substitutionen wurden die Aminosäuren wie folgt gruppiert: RK, LFPMVI, STQNC, AGW, H, ED und Y. Die Bereiche starker Homologie, welche den Domänen 1, 2, 3 und 4 entsprechen, sind unterstrichen. Die den Peptiden 1 und 2 entsprechenden Sequenzen sind durch die Pfeile dargestellt.
  • 11: Beschreibung der Oligonukleotide V1 und V2
    (A): Aminosäuresequenz der Peptide 1 und 2 von VanR und der D-Ala-D-Ala-Ligasen. Die Zahl von Aminosäuren zwischen dem N-terminalen Ende und dem Peptid 1, zwischen den Peptiden 1 und 2 und dem Peptid 2 und dem C-terminalen Ende sind angegeben. Die zwischen wenigstens zwei der drei Sequenzen identischen Aminosäuren sind in Fettdruck angegeben.
    (B): Target-Peptide und davon abgeleitete Nukleotidsequenz.
    X repräsentiert eine beliebige DNA-Base. Das Peptid 2 in DdlB unterscheidet sich vom Target-Peptid in Höhe von 2 Positionen (*)
    (C): Nukleotidsequenz von V1 und V2. Alternative Nukleotide und Deoxyinosin (I), welches allen DNA-Basen entsprechen kann, wurden in Positionen verwendet, in welchen die für die Target-Peptide kodierenden Nukleotidsequenzen variieren. Die Pfeile zeigen die Richtung der DNA-Synthese. Die Oligonukleotide wurden durch das Methoxy-Phosphoramidit-Verfahren mit einer Vorrichtung Biosystem DNA 380B (Applied Biosystem, Foster City, Ca) synthetisiert. Die DNA wurde ausgehend von bakteriellen Lysaten durch Extrahierung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Inst. Biotechnologies, Inc, New Haven, CO) (Le Bouguenec et al, 1990, J. Bacteriol. 172: 727–734) isoliert und als Matrix zur Vervielfachung durch PCR mit einem kontrollierten Heizsystem "Intelligent Heating Block" IBH101 (Hybarid ltd, GB) gemäß der Vorschrift von Mabilat et al (1990, Plasmid 23: 27–34) verwendet. Die Vervielfachungsprodukte wurden durch Elektrophorese auf Gel bei 0,8 % nach Anfärbung mit Ethidiumbromid gewonnen.
  • 12: Inaktivierung durch Insertion von vanC. Das vanC-Gen ist durch einen offenen Pfeil dargestellt und das interne Fragment von 690 bp EcoRI-HinCII ist gestrichelt. Durch einen dünnen Strich hat man die DNA von pAT114 dargestellt; durch einen fetten Strich die chromosomale DNA von PM4174; die Pfeile zeigen die Resistenz gegen Antibiotika: aphA-3 und das Gen, welches für 3'Aminoglycosidphosphotransferase kodiert; erm ist das Gen, welches für die ERR-Methyltransferase kodiert.
    (A): Das Plasmid pAT217 wurde durch Ligation des Fragments Eco-RI-HinCII von pAT216 mit dem Suizid-Vektor pAT114 (Trieu-Cuot et al, 1991, Gene 106: 21–27), verdaut mit EcoRI und SmaI konstruiert.
    (B): vanC-Bereich von chromosomaler DNA von BM4174.
    (c): vanC-Bereich nach Integration von pAT2317.
  • 13: Southern-Blot-Analyse der Integration von pAT217 in das vanC-Gen von BM4174.
    (linker Teil): Gesamt-DNA von BM4175 (Linie 2) und GM4174 (Linie 3), verdaut mit EcoRI und durch Elektrophorese auf 1%igem Agarose-Gel aufgelöst. Die DNA des Bakteriophagen lambda, verdaut mit PstI, wurde als Molekularmassenstandard (Linie 1) verwendet. Die DNA wurde unter Luftabschluss auf eine Nytran-Membran (Schleicher und Schül, Deutschland) unter Verwendung eines Apparates Trans-Vac TE80 (Höfer Scientific Instruments, San Francisco, CA) übertragen und mit der Membran mittels einer UV-Belichtung verbunden. Die Hybridisierung wurde mit der Sonde C (Middle) oder der Sonde aphA-3, spezifisch für pAT114 (Lambert et al, 1985, Annales de l'Institut Pasteur/Microbiol. 136(b): 135–150) realisiert.
    (rechter Teil): Die Sonden wurden mit 32P durch Translationsschnitt markiert. Die Molekularmassen (kb) sind angegeben.
  • 14: Ausrichtung der von VanS abgeleiteten Aminosäuresequenzen ausgehend von E. faecium BM4147 und von Phon und EnvZ von E. coli.
    Die Zahlen links beziehen sich auf die Position der ersten Aminosäure in der Ausrichtung. Die Zahlen rechts beziehen sich auf die Position der letzten Aminosäure der entsprechenden Linie. Die identischen Aminosäuren sind umrandet. Die Punktierungen zeigen Leerräume, welche eingeführt sind, um die Ähnlichkeit zu optimieren. Die Linien zeigen die Positionen der konservierten Motive von Aminosäuren in weiteren HPK an. Die im Motiv 1 fett dargestellten Histidin-Reste sind potentielle Stellen der Autophosphorylierung.
  • 15: Ausrichtung der von VanR von E. faecium BM4147, OmpR und PhoB von E. coli sowie von CheY von Salmonella typhimurium abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Die Zahlen rechts zeigen die Position der letzten Aminosäure in der entsprechenden Linie an. Die identischen Aminosäuren sind eingerahmt. Die Punktierungen zeigen die zur Optimierung der Ähnlichkeit eingeführten Leerräume an. Die in Fettbuchstaben angegebenen Reste entsprechen den Aminosäuren, welche in den Wirkungsdomänen stark konserviert sind und verschieden von RR sind. Der Aspartanrest 57 von CheY wird durch HPK verbunden mit CheA phosphoryliert.
  • I – Identifizierung von vanA
  • Materialien und Methoden für die Identifizierung und die Charakterisierung des vanA-Genes Bakterienstämme und Plasmide
  • Der Ursprung der verwendeten Plasmide ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
    Stamm oder Plasmid Quelle oder Referenz
    Escherichia Coli
    JM83 Messing (1979)
    AR1062 Rambach und Hogness (1977)
    JM103 Hannshan (1983)
    ST640 Lugtenberg und van Schijndel
    van-Dam (1973)
    Enterococcus faecium
    BM4147 Leclercq et al (1988)
    Plasmid pUC18 Norrander et al (1983)
    pAT213 Brisson-Noel et al (1990)
    pAT214 in diesem Text beschrieben
  • Herstellung von Enterokokken-Membranen
  • Enterococcus faecium BM4147 wurde bis zum Erreichen einer optischen Dichte (DO600) von 0,7 in 500 ml Herz-Hirn-Brühe (Kraftbrühemilieu) kultiviert. Die Induktion wurde mit 10 μg/ml Vancomycin (Eli Lilly Indianapolis Ind) durchgeführt. Die nachfolgenden Stufen wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 6000 g gewonnen, in einem TE-Puffer (0,01 M TRIS-HCl, 0,002 M EDTA, pH 7,0) gewaschen und mit Glaskügelchen (von 100 μm Durchmesser) in einer Braun-Apparatur während 2 Minuten lysiert. Die Zellrückstände wurden durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 6000 g abgetrennt. Die Membranen wurden durch Zentrifugieren während 1 Stunde bei 65000 g gesammelt und in 0,5 ml TE-Puffer resuspendiert.
  • Herstellung von Minizellen
  • Plasmide wurden durch Transformation in den Stamm E. coli AR1062, hergestellt in Form von Bakteriensäcken, eingeführt. Die Bakteriensäcke wurden an Sucrosegradienten gewonnen, und die Proteine wurden mit 50 μCi von [35S]L-Methionin (Amersham, Großbritannien) gemäß der Methode von Rambach und Hogness (1977, P.N.A.S. USA, 74; 5041–5045) markiert.
  • Herstellung von Membranfraktionen und Cytoplasmafraktionen von E. coli
  • E. coli JM83 und abgeleitete Stämme wurden in einem BHI-Milieu bis zum Erhalten einer optischen Dichte (DO600) von 0,7 kultiviert, gewaschen und in einem TE-Puffer suspendiert. Die Zellsuspension wurde durch Ultraschall (Phonolyse) während 20 Sekunden mit Dosen von 50 W in einer Zellfragmentierungsapparatur in einer Branson B7-Ultraschallapparatur behandelt, und die intakten Zellen wurden durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 6000 g eliminiert. Der Überstand wurde in Membranfraktionen und Cytoplasmafraktionen durch Zentrifugieren während einer Stunde bei 100000 g fraktioniert.
  • Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel SDS (SDS-PAGE) Die Proteine der Bakterienfraktionen wurden durch SDS-PAGE in einem linearen Gradientengel von Polyacrylamid (7,5 %–15 %) (Laemmli 1970, Nature 227: 680–685) getrennt. Die Elektrophorese wurde während 1 Stunde bei 200 V, dann 3 Stunden bei 350 V durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau angefärbt. Die Proteine der Extrakte wurden in den Gelen von 10 % Polyacrylamid getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • Reinigung der Proteinbande und Bestimmen der N-terminalen Sequenz
  • Die Proteine von Membranfraktionen einer durch E. faecium BM4147 induzierten Kultur wurden durch SDS-PAGE getrennt. Das Gel wurde während 1 Stunde bei 200 mA auf eine Difluoridpolyvinyliden-Membran (Immobilon Transfer, Millipore) elektrotransferiert, indem eine Transportapparatur (Elektrophoresis Unit LKB 2117 Multiphor II) gemäß den Herstellerempfehlungen verwendet wurde. Die übertragenen Proteine wurden mit Ponceau-Rot angefärbt. Der Membranteil, welcher das Protein von Interesse trägt, wurde abgeschnitten, auf einem Teflonfilter zentriert und in die Kartusche des Blockes einer Sequenziereinheit (Sequenceur Applied Biosystems Modell 470A) eingebracht. Das Protein wurde durch den automatisierten Abbau von Edman (1967, Eur. J. Biochem. 1; 80–81) sequenziert.
  • Konstruktion von Plasmiden
  • Das Plasmid pAT213 (Brisson-Noel et al, 1990, Antimicrob Agents Chemother, 34; 924–927) besteht aus einem EcoRI-DNA-Fragment von 4,0 kb des Plasmids pIP816 von an der EcoRI-Stelle eines Gram-positiven-Gram-negativen Schiffchenvektors pAT187 (Trieu-Cuot et al, 1987, FEMS Microbiol. Lett. 48; 289–294) klonierten Enterokokken. Zur Konstruktion von pAT414 wurde das DNA-Fragment von 1761 bp EcoRV-SacII von pAT213 gereinigt, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli behandelt und an die DNA von pUC18 ligiert, welche vorher mit SmaI verdaut und dephosphoryliert worden war (2). Die Klonierung (Maniatis et al, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press) wurde mit Restriktionsendonukleasen (Boehringer Mannheim und Pharmacia), mit der Ligase DNA T4 (Pharmacia) und der basischen Phosphatase (Pharmacia) gemäß den Herstellerempfehlungen durchgeführt.
  • Unterklonierung in M13 und Nukleotidsequenz
  • Die DNA-Restriktionsfragmente wurden in den Polylinkern in Form der Replikation der Derivate mp18 und mp19 des Bakteriophagen M13 (Norrander et al, 1983, Gene 26; 101–106) unterkloniert, erhalten von Pharmacia P-L Biochemicals. E. coli JM103 wurde mit rekombinanten Phagen transfektiert und es wurde Einzelstrang-DNA hergestellt. Die Nukleotidsequenz wurde durch das enzymatische Didesoxynukleotid-Verfahren durchgeführt (Sanger et al, 1977, P.N.A.S. USA 74; 5463–5467), indem eine DNA-T7-Polymerase (Sequenase, United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio) und [α35S]dATP (Amersham, Großbritannien) verwendet wurden. Die Reaktionsprodukte wurden in Polyacrylamid-Gelen entwickelt, welche einen denaturierenden Puffer zu 6 enthielten.
  • Informations- und Grundlagenanalyse an der Sequenz
  • Die vollständige DNA-Sequenz wurde unter Verwendung von Computerprogrammen DBCOMP und DBUTIL zusammengestellt (Staden, 1980, Nucleic Acids Res. 8; 3672–3694). Die Protein-Datenbank, PSEQIP von Institut Pasteur wurde unter Verwendung eines von Claverie (1984, Nucleic Acids Res. 12; 397–407) entwickelten Algorithmus durchsiebt. Die Ausrichtungen zwischen den Paaren von Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung des Algorithmus von Wilbur et al (1983, P.N.A.S USA 80; 726–730) konstruiert. Die statistische Signifikanz der Homologie wurde mit dem Algorithmus von Lipman und Pearson (1985, Science 227; 1435–1440) bewertet.
  • Für jeden Vergleich wurden 20 Aminosäuresequenzen verwendet, um den Mittelwert zu berechnen und die Standardabweichungen der stochastischen Ergebnisse.
  • Genetische Komplementierungstests
  • Die Plasmide wurden durch Transformation in E. coli ST640, einem auf Temperatur empfindlichen Mutanten, mit einer nicht- modifizierten D-ala-D-ala-Ligase (Lugtenberg et al 1973, J. Bacteriol 110; 26–34) eingeführt. Die Transformanten wurden bei 30°C auf Platten selektioniert, welche 100 μg/ml Ampicillin enthielten, und die Anwesenheit plasmidischer DNA im gewünschten Maß und die Restriktionskarten wurden überprüft. Einzelkolonien, welche bei 30°C in einem BHI-Kraftbrühenmilieu, welches Ampicillin enthält, vorangetrieben wurden, wurden auf ein Mal auf ein BHI-Agarmilieu aufgebracht, welches 100 μg/ml Ampicillin enthält, und in 50 μM Isopropyl-1-thio-β-D-glactopyranosid (IPTG) und die Plättchen wurden bei einer erlaubten Temperatur von 30°C und einer nicht erlaubten Temperatur von 42°C inkubiert. Der Komplementierungstest wurde als positiv betrachtet, wenn die Kolonien nach 18 Stunden Inkubation bei 42°C vorhanden waren.
  • ERGEBNISSE
  • Indentifizierung des VanA-Proteins und der N-terminalen Sequenz
  • Die Membranfraktionen von E. faecium BM4147, welche teils in Induktionsbedingungen und teils in Abwesenheit von Induktion kultiviert wurden, wurden durch SDS-PAGE analysiert. Der einzige feststellbare Unterschied, verbunden mit der Exponierung bei unter-inhibitorischen Konzentrationen von Vancomycin war die deutliche Intensivierung einer Bande, welche einem Protein von einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 40 kDa entspricht. In den induzierten Zellen und den nicht-induzierten Zellen stellt die Proteinbande dasselbe Protein dar, bis diese Bande keine Membranen eines Derivates von BM4147 zeigt, welches das Plasmid pIP816 verloren hat. Das induktible Protein, bezeichnet durch VanA, wurde nach SDS-PAGE gereinigt und es wurde ein automatischer Abbau nach Edman an einer Probe von 50 pmol durchgeführt. Es wurden 9 Aminosäuren der N-terminalen Sequenz von VanA identifiziert: Met Asn Arg Ile Lys Val Ala Ile Leu.
  • Unterklonierung des vanA-Gens
  • Das Inserat von 4,0 kb des Plasmids pAT213 trägt die Determinante der Resistenz gegen Glykopeptide von E. faecium BM4147. Verschiedene Restriktionsfragmente dieses Inserates wurden in pUC18 unterkloniert und die rekombinanten Plasmide, spezifisch für vanA in E. coli wurden durch SDS-PAGE-Analyse der Proteine der Cytoplasma- und Membranfraktionen oder der Bakteriensackextrakte identifiziert. Diese Annäherung wurde verwendet, da E. coli intrinsisch resistent gegen Glykopeptid ist. Das Inserat EcoRV-SacII des Plasmids pAT214 (2) kodiert für ein einzelnes Polypeptid von 40 kDa, das zusammen mit VanA migriert, stammend aus Membranpreparationen von E. faecium BM4147.
  • Nukleotidsequenz des Inserats in pAT214 und Identifizierung der Codesequenz vanA
  • Die Nukleotidsequenz des Inserates EcoRV-SacII von 1761 bp in pAT214 wurde an den zwei DNA-Strängen gemäß der in der 2 beschriebenen Strategie bestimmt. Die Lokalisierung der Endkodons (TGA, TAA, TAG) in drei Leserahmen an jedem DNA-Strang hat die Anwesenheit eines einzelnen offenen Leserahmens (ORF) gezeigt, welcher eine ausreichende Größe aufweist, um für das VanA-Protein zu kodieren. Der Leserahmen ORF ist zwischen dem TAA-Kodon in Position 281 und dem TAG-Kodon in Position 1406 lokalisiert. Die von ORF abgeleitete Aminosäuresequenz wurde mit jener des N-terminalen Endes von VanR verglichen. Die neun durch die Proteinsequenzierung identifizierten Aminosäuren werden durch die Nukleotidsequenz kodiert, die mit dem ATG-Kodon (Methionin) in Position 377 (3) beginnt. Diesem Übersetzungsinitiierungskodon geht eine Sequenz (TGAAAGGAGA) voraus, welche charakteristisch für eine Bindungsstelle an (RBS) Ribosomen von Gram-positiven Bakterien charakteristisch ist, welche komplementär für die acht Basen von rRNA der Untereinheit 16S von Bacillus subtilis in seinem Abschnitt (3'OH UCUUUCCUCC 5') ist (Moran et al, 1982, Mol. Gen. Genet. 186; 339–346). In diesem ORF-Rahmen gibt es kein weiteres Initiierungskodon ATG oder GTG zwischen den Positionen 281 und 377. Die Sequenz von 1029 bp, welche sich vom Kodon ATG in Position 377 zum Kodon TGA in Position 1406 erstreckt, kodiert für ein Protein, das 343 Aminosäurereste enthält. Das berechnete Molekulargewicht dieses Proteins beträgt 37400 Da, was mit der Schätzung von 40 kDa übereinstimmt, welche durch die SDS-PAGE-Analyse erhalten wurde.
  • Homologie der Aminosäuresequenzen von VanA und Ligaseenzyme D-ala-D-ala
  • Die Durchsuchung der Protein-Datenbank PSEQIP hat die Existenz einer Homologie von Sequenzen zwischen VanA und den D-ala-D-ala-Ligasen von E. coli (ECOALR, Robinson et al, 1986, J. Bacteriol. 167; 809–817) und von Salomella typhimurium (DALIG, Daub et al, 1988, Biochemistry 27; 3701–3708) gezeigt. Der Prozentsatz der Ähnlichkeit, berechnet pro Proteinpaaren, war zwischen 28 % und 36 % für die identischen Aminosäuren und zwischen 48 % und 55 % unter Berücksichtigung der homologen Aminosäuren enthalten. VanA und DALIG sind am weitesten rechts vereinigt. Die statistische Signifikanz dieser Ähnlichkeit wurde unter Ausrichtung von VANA und von Sequenzen bewertet, welche die gleiche Aminosäurezusammensetzung enthalten, wie DALIG oder ECOALA (Lipman und Pearson, 1985, Science 227; 1435–1440).
  • Test der genetischen Komplementierung für die Aktivität von D-ala-D-ala-Ligase
  • Der Stamm E. coli ST640 ist ein wärmeempfindlicher Mutant, der eine ungenügende D-ala-D-ala-Ligaseaktivität zeigt (Lugtenberg et al, 1973, J. Bacteriol. 113: 96–104). Die Plasmide pUC18 und pAT214 wurden durch Transformation in E. coli ST640 eingeführt. Die Stämme ST640 und ST640 (pUC18) wurden normalerweise nur bei der erlaubten Temperatur (30°C) vorangetrieben, wohingegen E. coli ST640 (pAT214) gleichzeitig bei der erlaubten Temperatur und bei der nicht-erlaubten Temperatur (42°C) vorangetrieben wurde.
  • Dieser Test zeigt, dass VANA funktionell ähnlich zu D-Ala-D-Ala-Ligasen in E. coli ist und wahrscheinlich dieselbe Ligationsreaktion katalysieren kann wie DALIG.
  • II – Regulationssystem aus zwei Bestandteilen VanS-VanR, für die Kontrolle der Synthese von Vorläufer-Depsipeptiden von Peptidoglykanen
  • Materialien und Methoden
  • Stämme, Plasmide und Kultivierungsbedingungen
  • Die Restriktionsfragmente von pIP816 (Tra–, Mob+, Vmr) wurden in Derivaten des Vektors pAT29 kloniert, welcher einen Schiffchenvektor unter den Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien bildet (oriR pAMβ1, oriR pUC, oriT RK2, spc, lacZα) (Trieu-Cuot et al, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 4296). Dieser Vektor wurde durch die Erfinder konstruiert und verwendet, um den Stamm E. coli JM103 (Δ(lac-proAG), supE, thi, strA, sbcB15, endR, hspR4, F traD36, proAB, LacIq, lacZΔM15) zu transformieren (Messing et al, 1983, Methods Enzymol. 101: 20–78). Die plasmidische DNA wurde durch ein Protokoll alkalischer Lyse in kleinem Maßstab hergestellt (Sambrook et al, 1982, Molecular cloning, ein Laborhandbuch, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY) und durch Elektrotransformation (Cruz-Rodz A.L. et al, 1990, Mol. Gen. Genet. 224: 152–154) in E. faecalis JH2-2 (FusR, RifR) (Jacob A.E. et al, 1974, J. Bacteriol. 117: 360–372) eingeführt, indem ein Gen-Pulser-Apparat (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) verwendet wurde. Die Restriktionsprofile der ausgehend von E. faecalis und von E. coli gereinigten Plasmide wurden verglichen, um eventuelle Neuordnungen von DNA festzustellen.
  • Das integrierende Plasmid pAT113 (Mob+, EmR, KmR, oriR PACYC184, attTn1545, LacZα) (Trieu-Cuot et al, Gene 106: 21–27) trägt die verbundenen Enden des Transposons Tn1545. Dieser Vektor repliziert sich in Gram-positiven Bakterien nicht, sondern integriert sich im Wirtschromosom durch unerlaubte Rekombination, welche durch die Integrase Tn1545 oder Tn916 mediiert ist (Trieu-Cuot et al, w.o.). Die integrierenden Plasmide wurden durch Elektrotransformation in E. faecalis BM4148 (Stamm JH2-2::Tn916) eingeführt. Dieser Stamm ist durch das von Franque A.E. et al (1981, J. Bacteriol. 145: 494–502) beschriebene Transposon Tn916 modifiziert.
  • Die Kulturen wurden in einer Herz-Hirn-Bouillon realisiert (BHI – Brain Heart Infusion Broth) oder auf Agar bei 37°C. Das Verfahren von Steers et al (Antibiot. Chemother. Basel. 9: 307–311) wurde verwendet, um die minimalen Konzentrationen antibiotischer Inhibierung (MICs) an einem Mueller-Hinton Agargel-Milieu zu bestimmen.
  • Rekombinante DNA-Techniken
  • Die DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen (Boehringer Mannheim und Pharmacia), die Reinigung der DNA-Restriktionsfragmente mittels Agarosegelen, die Umwandlung der fest kohäsiven Enden und der gekreuzten Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I von E. coli (Boehringer Mannheim), die Dephosphorylierung der DNA-Enden mit der Kalbsdarmphosphatase (Boehringer Mannheim), die Ligatur bzw. Bindung der DNA-Fragmente mit der T4-DNA-Ligase (Amersham) wurden gemäß den Standardverfahren von Sambrook et al (1982, Molecular Cloning, ein Laborhandbuch; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY) durchgeführt.
  • Plasmidkonstruktion
  • Der Ursprung der Vektoren und Inserate, welche für die hier konstruierten rekombinanten Plasmide verwendet werden, ist der folgende:
    • (i) Vektor pAT78 für die Promotorerkennung: Amplifizierte DNA des Genes cat von Chloramphenicolactyltransferase des Plasmids pC194 von Staphylococcus aureus (Horinouchi et al, 1982, J. Bacteriol. 150: 815–825) wurde zwischen den Restriktionsstellen PstI und SphI des Schiffchenvektors pAT29 eingeführt. Die Amplifizierung durch die Kettenpolymerisationsreaktion wurde mittels von Startern A1 und A2 durchgeführt, welche durch das Methoxy-Phosphoramidit-Verfahren (Mabilat et al, 1990, Plasmid 23: 27–34) synthetisiert worden sind. Die Startersequenz A1 (5'GCTGCAGATAAAAATTTAGGAGG) ist aus einer Erkennungsstelle PstI (unterstrichen) und 18 Basen (Positionen 6 bis 23) von pC194 zusammengesetzt, welche die Bindungsstelle am Ribosom (RBS; AGGAGG-Positionen 18 bis 23) des cat-Genes beinhalten. Die Sequenz des Starters A2 (5'CGCATGCTATTATAAAA GCCAGTC) enthält die Spaltstelle SphI (unterstrichen) und ist komplementär (Positionen 8 bis 24) zu 17 Basen des 3'-Endes des cat-Genes. Das Triplet ATT in den Positionen 9 bis 11 entspricht dem Stopp-Kodon TAA von cat. Die mit den Startern A1 und A2 amplifizierten DNA-Fragmente bestehen folglich aus einer offenen Phase der Ablesung (orf) und aus einer Bindungsstelle an das Ribosom für CAT (Positionen 1234 bis 1912 gemäß der Nummerierung von Horinouchi et al (1982, J. Bacteriol. 150: 815–825), flankiert von den Stellen PstI und SphI. Die Position 1234 ist im Inneren der Windung der Sekundärstruktur der mRNA lokalisiert, welche die Übersetzung in Abwesenheit von Chloramphenicol blockiert. So enthält die amplifizierte Sequenz weder den cat-Promotor noch die Komplementärsequenz von RBS, was wesentlich für die Übersetzungsregulierung ist, Ambulos, N.P. et al, 1984, Gene 28: 171–176).
    • (ii) Exprimierungsvektor pAT79: Das ClaI-BssHII-Fragment von 243 bp, welches den Promotor P2 des Genes aphA-3 des Enterokockenplasmids pJH1 (Caillaud et al, 1987, Mol. Gen. Genet. 207: 509–513) trägt, wurde zwischen den Restriktionsstellen EcoRI und SacI von pAT78 inseriert.
    • (iii) Plasmid pAT80 und seine Derivate: Das BglII-XbaI-Fragment von 5,5 kb von pIP816 wurde zwischen die BamHI- und XbaI-Stellen von pAT78 inseriert. Das durch pAT80 bezeichnete resultierende Plasmid wurde teilweise mit HincII verdaut und mit dem EcoRV-Fragment gebunden, welches ein Gen enthält, das ähnlich dem Gen apha-I von Transposon Tn903 ist (Oka A. et al, 1981, J. Mol. Biol. 147: 217–226). Dieses Fragment enthält das Gen aphA-I, welches für die 3'Aminoglycosid-Phosphotransferase vom Typ I kodiert, welche die Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Die Insertion bzw. Einführung von aphA-I wurde an drei verschiedenen Stellen in pAT80 durchgeführt, wodurch die Plasmide pAT81, pAT83 und pAT85 erzeugt werden. Die aphA-I enthaltenden BamHI- und EcoRI-Kassetten wurden an den Stellen BamHI (zur Bildung des Plasmids pAT84) und EcoRI (zur Bildung des Plasmids pAT82) von pAT80 inseriert.
    • (iv) Plasmid pAT86, pAT87, pAT88 und pAT89: Das Plasmid pAT86 wurde durch Klonierung des Fragmentes von 2803 bp, EcoRI-SacII von pAT80, kodierend für VanH und VanA, in Höhe einer SmaI-Stelle von pAT79 konstruiert. pAT87 war durch Inserieren des Fragmentes von 3,4 kb, EcoRI-XbaI von pAT80 stromaufwärts des cat-Genes des Detektionsvektors von Promotor pAT78 erhalten worden. Das Plasmid pAT88 resultierte aus der Ligation von pAT78, verdaut mit EcoRI und BamHI, mit dem EcoRI-BamHI-Fragment von 1731 bp von pAT80. Das BglII-AccI-Fragment (Positionen 1 bis 2356) von pAT80 wurde in den Polylinker des integrierenden Vektors pAT113 unter Erzeugung von pAT89 inseriert.
  • Unterklonierung in M13 und Sequenzierung
  • Die DNA-Restriktionsfragmente wurden in einem Polylinker von replikativen Derivaten des Bakteriophagen M13 kloniert, wobei diese Derivate mp18 und mp19 genannt werden (Norrander et al, 1983, Gene 26: 101–106). E. coli JM103 wurde mit den rekombinanten Phagen transfektiert und ein DNA-Einzelstrang wurde hergestellt. Die Sequenzierung der Nukleotide wurde gemäß den durch Sanger et al beschriebenen Bedingungen durchgeführt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463–5467), unter Verwendung der modifizierten T7-DNA-Polymerase (Sequenase, USA, Biochemical Corporation Cleveland, OH) und [α-35S]dATP (Amers ham). Die Reaktionsprodukte wurden auf Gradientengelen in einem Polyacrylamidpuffer von 6 % aufgelöst.
  • Enzymatischer Test
  • Die JH2-2-Derivate von E. faecalis wurden auf eine optische Dichte OD600 von 0,7 in einem BHI-Brühenmilieu, ergänzt mit Spectinomycin (300 μg/ml), kultiviert. Die Zellen wurden mit einem Lysozym behandelt, durch Beschallung lysiert und die Zellrückstände wurden während 45 Minuten bei 100000 g gemäß der Beschreibung von Courvalin et al (1978, Antimicrob. Agents Chemother. 13: 716–725) zentrifugiert. Die Bildung von 5-Thio-2-nitrobenzoat wurde bei 37°C in Gegenwart und in Abwesenheit von Chloramphenicol gemessen und die spezifische CAT-Aktivität wurde in Mikromol pro Minute und pro Milligramm Proteine ausgedrückt (Shaw et al, 1975, Methods Enzymol. 43: 737–755).
  • ERGEBNISSE
  • Die Gene vanH und vanA von pIP816 wurden in einem Plasmid pAT79 unter der Kontrolle des heterologen Promotors P2 (Caillaud et al, 1987, Mol. Gen. Genet. 207: 509–513) kloniert und das gebildete Plasmid pAT86 verleiht dem Stamm E. faecalis JH2-2, nicht die Resistenz gegenüber Vancomycin. Diese Gene sind jedoch für die Synthese von Peptidoglykan in Abwesenheit des Antibiotikums nicht ausreichend. Verschiedene Restriktionsfragmente von pIT816 wurden in dem Vektor pAT78 kloniert. Das Fragment BglII-XbaI von 5,5 kb von pAT80 ist das kleinste erhaltene Fragment, welches der Resistenz gegen Vancomycin entspricht.
  • Nukleotidsequenz der Gene vanR und vanS
  • Die Sequenz des Inserates in pAT80 wurde an den zwei DNA-Strängen ausgehend von der Stelle BglII bis zum Übersetzungsinitiierungskodon ATG von VanH bestimmt. Zwei offene Ablesungsphasen (orf) wurden im Inneren der Sequenz von 2475 bp nachgewiesen: Die erste offene Ablesephase erstreckt sich von Nukleo tid 386 bis Nukleotid 1123; in Position 431 findet man eine Sequenz, welche für die RBS-Sequenzen von Gram-positiven Bakterien charakteristisch ist, 6 Basenpaare stromaufwärts vom Übersetzungsinitiierungskodon ATG (TGAAAGGGTG); den weiteren Übersetzungsinitiierungskodons in diesem orf geht dieser Sequenztyp nicht voraus. Die Sequenz von 693 bp ausgehend vom ATG-Kodon in Höhe von 431 bis zum TAA-Kodon in der Position 1124 kann für ein Protein von 231 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von 26612 Da kodieren, das durch VanR bezeichnet ist.
  • Für die zweite offene Ablesephase (vom Nukleotid 1089 zum Nukleotid 2255) wird die ausgehend von dem ersten Phaseninitiierungskodon abgeleitete Aminosäuresequenz für ein Protein von 384 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von 43,847 Da kodieren und ist durch VanS bezeichnet. Die Kodone TTG in Position 1116 und ATG in Position 1164 sind Phasenübersetzungsinitiierungskodone, denen Sequenzen mit einer schwachen Komplementarität mit dem Ende 3'OH der Untereinheit 16S der RNA von B. subtilis (GGGGGGTTGG-N8-TTG bzw. AGAACGAAAA-N6-ATG) vorangehen.
  • Zwischen dem letzten Kodon von vanS und dem Übersetzungsinitiierungskodon ATG von vanH bemerkt man eine Sequenz von 217 bp, welche eine wiederholte inverse Sequenz von 17 bp enthält. Diese Sequenz wirkt nicht als ein starker Transkriptionsterminator.
  • Der Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit den Grunddaten haben gezeigt, dass die konservierten Aminosäuremotive, identifiziert durch Stock et al (1989, Microbiol. Rev. 53: 450–490) in der Kinasedomäne von 16 HPK (Histidin-Protein-Kinase) in dem C-terminalen Teil von VanS festgestellt worden sind. VanS zeigt zwei hydrophobe Aminosäuregruppen im N-terminalen Bereich. Der Histidin-Rest 164 von VanS ist mit dem His216-Rest von Phon (Makino et al, 1986, J. Mol. Biol. 192: 549–556) und dem His243-Rest von EnvZ (Comeau et al, 1985, 164: 578–584) ausgerichtet, welche unterstellte Stellen der Autophosphorylierung an diesen Proteinen sind.
  • Gleichermaßen zeigen die Aminosäuren 1 bis 122 von VanR Ähnlichkeiten mit den wirksamen Domänen des Antwortregulators RR (Response Regulators) dar. Die Aspartinsäure 53 von VanR kann eine Phosphorylierungsstelle sein, bis dieser Rest mit Asp 57 von Che Y ausgerichtet ist, welcher durch HPK verbunden mit CheA phosphoryliert ist, und einer invarianten Position in weiteren Proteinen vom RR-Typ entspricht (Stock et al, w.o.). VanR kann in der Unterklasse OmpR-PhoB von RR erscheinen, welcher die Transkriptionsinitiierung, mediiert durch RNA-Polymerase, enthaltend den Faktor σ70S von E. coli, aktiviert (Stock et al, w.o ).
  • Inaktivierung durch Insertion der van-Gene
  • Kassetten von Resistenz gegen Kanamycin, inseriert in die Gruppe der van-Gene, in dem Plasmid pAT80, haben folgendes gezeigt: Die Insertion in vanR unterdrückt die Resistenz gegen Vancomycin und gegen Chloramphenicol; VanR ist ein Aktivator der erforderlichen Transkription zur Exprimierung der Resistenzgene gegen Vancomycin. Die Inaktivierung von vanS führt zu einer zweifachen Reduktion der inhibierenden Minimalkonzentration (MIC) von Chloramphenicol und zu einer dreifachen Reduktion der spezifischen CAT-Aktivität, jedoch bleibt die inhibierende Minimalkonzentration von Vancomycin unverändert. Dennoch ist VanS erforderlich, um ein hohes Niveau der Transkription der Gene der Resistenz gegen Vancomycin zu erhalten, obwohl es nicht erforderlich für die Exprimierung des Phenotyps der Resistenz gegen Vancomycin sein muss.
  • Derivate von pAT80, welche die Insertionen in vanH (pAT83), vanA (pAT84) oder in der Region von 1,0 kb stromabwärts von vanA (pAT85) tragen, haben es erlaubt, eine Resistenz gegen Chloramphenicol zu erhalten, aber nicht gegen Vancomycin. Dieser dissoziierte Phenotyp entspricht der Inaktivierung von Genen, welche für Enzyme kodieren, welche die depsipeptidischen Vor läufer bzw. Precurser synthetisieren, welche für den Verbund der Bakterienwände in Gegenwart von Vancomycin erforderlich sind.
  • Stromabwärts des Genes vanA hat man auf Ebene einer Sequenz von 365 bp nach dem TGA-Kodon von vanA und stromaufwärts der Stelle SacII die Gegenwart eines inaktiven orf in pAT85 nachgewiesen und welche ein Initiierungskodon ATG in gleicher Phase enthält, dem eine RBS-artige Sequenz vorausgeht. Diese Sequenz kodiert für ein Protein, welches für die Resistenz gegen Glykopeptid erforderlich ist, das durch VanX bezeichnet ist und das im Maximum etwa 330 Aminosäuren entspricht.
  • Transaktivierung der Transkription der Gene van
  • Das integrierende Plasmid pAT89, das für VanR und VanS kodiert, wurde in das Chromosom von E. faecalis BM4138 eingeführt. Das Plasmid pAT87, welches die Gene vanH, vanA und vanX trägt, die stromaufwärts zum cat-Gen frei vom Promotor pAT78 kloniert sind, haben diesem Stamm die Resistenz gegen Vancomycin verliehen, aber nicht E. faecalis JH2-2. Das Niveau der cat-Genexprimierung von pAT87 in den Stämmen BM4138::pAT89 und JH2-2 hat gezeigt, dass VanR die Transkription des Reportergenes aktiviert, welches am 3'-Ende der Gruppe des van-Genes lokalisiert ist. Ähnliche Niveaus der CAT-Synthese sind für pAT88 beobachtet worden, welches eine Transkriptionsfusion zwischen den 5'-Abschnitten von vanA und dem cat-Gen tragen. Diese Ergebnisse zeigen, dass in E. faecalis BM4138::pAT89 (pAT87) VanR und VanS für das Chromosom kodieren, das trans der Transkription von vanA, vanH und vanX von pAT87 aktiv ist, was den Erhalt einer Resistenz gegen Vancomycin erlaubt.
  • Man hat darüber hinaus festgestellt, dass die Exprimierung des Genes im Wesentlichen konstitutiv war, wenn vanR und vanS von einem Multikopie-Plasmid pAt80 getragen war und schwach induzierend, wenn die Gene für die Regulierungsproteine auf dem Wirtzchromosom vorhanden waren.
  • III – Charakterisierung der Sequenz des Genes vanC von Enterococcus gallinarum BM4174
  • Definition und Verwendung universeller Starter zur Amplifizierung von Genen, welche für die D-Ala-D-Ala-Ligasen und ähnliche Proteine kodieren, die in der Resistenz gegen Vancomycin impliziert sind
  • Das zur Exprimierung eines hohen Niveaus der Resistenz gegen Glykopeptide in E. faecium BM4147 erforderliche VanA-Protein teilt ungefähr 28 bis 36 % Ähnlichkeit in Aminosäuren mit den D-Ala-D-Ala-Ligasen von E. coli, besitzt aber eine andere Substratspezifität von jenen dieser Ligasen. Durch 1 und 2 bezeichnete Peptide, welche in den Sequenzen der DdlA- und DdlB-Ligasen (Zawadzke, 1991, Biochemistry 30: 1673–1682) von E. coli und in dem VanA-Protein konserviert sind, wurden selektioniert, um die universellen Starter zu synthetisieren, welche zur Amplifizierung interner Genfragmente, die für D-Ala-D-Ala-Ligasen oder ähnliche Enzyme bestimmt sind. Die durchsuchten Peptide GEDG(S/T) (I/L)QG und NT(I/L)PGFT wurden rückübersetzt, wie das die Fig. IV.1 zeigt, um degenerierte Oligonukleotide V1 und V2 zu erhalten. Als die Peptide 1 und 2 von VanA wurden DdlA und DdlB durch Aminosäuresequenzen ähnlicher Länge getrennt, die vorhergesagte Größe für das Amplifizierungsprodukt war etwa 640 bp.
  • Eine Amplifizierung durch PCR mit DNA von E. coli JM83 und von E. faecium BM4147 hat zur Amplifizierung von Produkten geführt, welche der erwarteten Größe entsprechen, welche dann gereinigt und in dem Bakteriophagen M13mp10 (Norrander et al, 1983, Gene 26: 101–106) kloniert wurden. Die Sequenzierung des mit E. coli JM83 erhaltenen Inserates hat gezeigt, dass das PCR-Produkt ein internes Fragment von ddlA war. Eine ausgehend von einem rekombinanten Phagen erzeugte Sonde, welche mit dem Amplifizierungsfragment von BM4147 erhalten wurde, wurde zur Southern- Analyse einer DNA von BM4147 und von BM4147-1, welcher ein auf Vancomycin empfindliches Derivat von BM4147 ist, verwendet, welcher frei von Plasmid pIP816 ist (Leclercq et al, 1988, N. Engl. J. Med. 319: 157–161). Die Sonde hybridisiert mit dem DNA-Fragment EcoRI von 4 kb von GM4147, aber nicht mit der DNA von E. faecium BM4147-1. Weil das vanA-Gen durch das Fragment EcoRI von 4 kb von pIP816 getragen ist, zeigen diese Ergebnisse an, dass die Starter auch die Amplifizierung eines Teils vanA erlauben. Ebenso können die Oligonukleotide V1 und V2 Genfragmente amplifizieren, welche für verschiedene Proteine, ähnlich zu den D-Ala-D-Ala-Ligasen sind, kodieren und das in verschiedenen Spezien.
  • Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung des vanC-Genes Eine Amplifizierung durch PCR wurde an der gesamten DNA von E. gallinarum BM4174 verwirklicht und das erhaltene Amplifizierungsprodukt, etwa 640 bp, wurde in den Bakteriophagen M13mp10 kloniert. Einstrangige DNA, isoliert ausgehend von dem rekombinanten Phagen, wurde zur Konstruktion einer Sonde C verwendet (Hu et al, 1982, Gene 17: 2171–2177). Gemäß Southern-Analyse hybridisiert die Sonde mit einem Fragment PstI von 1,7 kb von BM4174, aber nicht mit der DNA von BM4147 und BM4147-1.
  • Die DNA von BM4174 wurde mit PstI verdaut und Fragmente von 1,5 und 2 kb wurden durch Elektrophorese auf Agarosegel gereinigt und in pUC18 kloniert (Norrander et al, 1983, wie oben erwähnt). Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli JM83 durch Transformation eingeführt und durch Hybridisierung unter Verwendung der Sonde C auf Kolonien durchsucht (Sambrook et al, 1989, Molecular cloning, ein Laborhandbuch, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Es wurde eine Homologie mit einem Transformanten festgestellt, welcher ein mit pAT216 bezeichnetes Plasmid beherbergt, welches ein Inserat von PstI von 1,7 kb enthielt. Die Sequenz des Teiles von 1347 bp SacI-PstI des Inserates von pAT216 wurde an den beiden DNA-Strängen nachgewiesen. Die Lokalisierung von Endkodons in den drei Leserahmen jedes DNA-Stranges hat die Gegenwart einer ORF-Phase zwiwschen den Kodons TGA in Positionen 47 und 1244 aufgedeckt. Dem Transkriptionsinitiierungskodon ATG in Position 215 geht eine Sequenz GAAAGGAAGA voraus, welche für komplementäre RBS-Sequenzen der RNA der Untereinheit 16S von B. subtilis charakteristisch ist (Moran et al, 1982, Mol. Gen. Genet. 186: 339–346). Die Sequenz von 1029 bp, welche sich vom ATG-Kodon in Position 215 zum TGA-Kodon in Position 1244 erstreckt, kann ein Protein von 343 Aminosäuren mit einer berechneten Molekularmasse von 37504 Da, bezeichnet durch VanC, kodieren. Es wurde eine Sequenzähnlichkeit zwischen VanC, VanA und den D-Ala-D-Ala-Ligasen von E. coli festgestellt. Insbesondere sind auch vier Domänen starker Homologee, welche vorher zwischen VanA und den D-Ala-D-Ala-Ligasen von Enterobakterien gefunden wurden, in VanC vorhanden. Der Prozentsatz identischer Aminosäuren, welcher für diese Proteine paarweise genommen berechnet wurde, lag zwischen 29 und 38 %. Die Ausrichtung der vier Sequenzen hat die Gegenwart von 57 invarianten Aminosäuren aufgedeckt, welche die konservierten Reste der Peptide 1 und 2 beinhalten, welche verwendet werden, um die Oligonukleotidsonden V1 und V2 zu definieren.
  • Inaktivierung durch Insertion des vanC-Genes
  • Zur Bewertung des Beitrages von vanC für die Resistenz gegen Vancomycin bei E. gallinarum BM4174 wurde das Gen vanC durch Insertion inaktiviert. Ein Fragment von 690 bp EcoRI-HincII innerhalb von vanC wurde in pAT114 kloniert, das sich in den Gram-positiven Bakterien nicht repliziert. Das resultierende Plasmid pAT217 wurde in BM4174 durch Elektrotransformation eingeführt (Cruz-Rodz et al, 1990, Mol. Gen. Genet. 224: 152–154) und die mutmaßlichen Klone resultieren aus einer homologen Rekombination, die zur Integrierung von pAT217 in vanC führen, wurden durch Erythromycin selektioniert. Der Klon BM4175 wurde mit BM4174 durch Southern-Hybridisierung verglichen, unter Verwendung der Sonde C und aphA-3, spezifisch für pAT114. Die zwei Sonden hybridisieren mit dem Fragment EcoRI von 8,6 kb von BM4175. Die Sonde C hybridisierte mit einem Fragment von 2,5 kb von BM4174, wohingegen keinerlei Signal mit der Sonde aphA-3 beobachtet wurde. Die Resultate zeigen, dass das Plasmid pAT217 von 6,1 kb in das vanC-Gen integriert war. Die Bestimmung der inhibierenden Minimalkonzentration von Vancomycin für GM4174 (16 mg/l) und BM4175 (2 mg/l) hat gezeigt, dass die Inaktivierung durch Insertion in vanC die Resistenz gegen Vancomycin aufhebt.
  • VanC ist daher für die Resistenz gegen Vancomycin erforderlich. Man kann daher denken, dass dieses Protein ein Dipeptid oder ein Depsipeptid synthetisiert, das in die Peptidoglykan-Vorläufer inkorporiert ist und nicht durch Vancomycin erkannt wird.
  • Die Sequenzen, welche Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, sind auf den folgenden Seiten nach der Liste von Sequenzen, welche die Beschreibung dieser Sequenzen enthalten, angegeben.
  • In der Liste der Sequenzen sind die Proteine im Verhältnis zur Position der Nukleotidbasen zu finden, welche den endständigen Aminosäuren der Proteine entsprechen.
  • Liste der Sequenzen
  • (enthalten in den Sequenzen I (Ia, Ib), den nachfolgend gezeigten Sequenzen II oder in der Sequenz von 5)
  • Aminosäuresequenzen
  • SEQ ID NO 1 (VanH): Sequenz des ersten Resistenzproteins, entsprechend der Aminosäuresequenz der offenen Ablesephase Nr. 3, beginnend bei der Base 3501 und endend bei der Base 4529, enthaltend die Kodierungssequenz des vanH-Genes zwischen den Basen 3564 und 4529, bezogen auf die Sequenz der 5 oder entsprechend der Sequenz zwischen den Positionen der Nukleotide 6018 und 6983 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 2 (VanA): Sequenz des Proteins VanA, entsprechend der Aminosäuresequenz der offenen Ablesephase Nr. 1, beginnend bei der Base 4429 und endend bei der Base 5553, bezogen auf die Sequenz der 5 oder entsprechend der Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 6977 und 7807 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 3 (VanX): Sequenz des dritten Resistenzproteins, entsprechend der Aminosäuresequenz der offenen Ablesephase Nr. 3, beginnend bei der Base 5526 und endend bei der Base 6167, bezogen auf die Sequenz von 5 oder entsprechend der Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 7816 und 8621 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 4 (VanR): Sequenz des Regulierungsproteins R, entsprechend der Sequenz von Aminosäuren der Ablesephase Nr. 1, beginnend bei der Base 1477 und endend bei der Base 2214, bezogen auf die Sequenz der 5 oder entsprechend der Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 3976 und 4668 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 5 (VanS): Sequenz des Sensorproteins S, entsprechend der Sequenz von Aminosäuren der offenen Ablesephase Nr. 2, beginnend bei der Base 2180 und endend bei der Base 3346, bezogen auf die Sequenz der 5 oder entsprechend der Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 4648 und 5800 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 16: Sequenz der Transposase, entsprechend den Aminosäuren, enthalten zwischen den Nukleotiden 150 und 3112 der Sequenz Ib.
  • SEQ ID NO 17: Resolvase-Sequenz, enthaltend die zwischen den Nukleotidpositionen 3187 und 3759 der Sequenz Ia angeordneten Aminosäuren.
  • SEQ ID NO 18: VanY-Sequenz, enthaltend die zwischen den Nukleotidpositionen 9046 und 9960 in der Sequenz Ia angeordneten Aminosäuren.
  • SEQ ID NO 19: VanZ-Sequenz, enthaltend die zwischen den Nukleotidpositionen 10116 und 10598 in der Sequenz Ia angeordneten Aminosäuren.
  • SEQ ID NO 20: VanC-Sequenz von Aminosäuren, dargestellt in der Liste II.
  • Nukleotidsequenzen
  • SEQ ID NO 6: Nukleotidsequenz, enthaltend die für die fünf Proteine kodierende Sequenz, sowie die flankierenden Sequenzen, dargestellt in der 5.
  • SEQ ID NO 7: Sequenz, enthaltend die Sequenz, welche für die drei Resistenzproteine kodiert, sowie die flankierenden Sequenzen und beginnend bei der Base 3501 und endend bei der Base 6167, dargestellt in der 5.
  • SEQ ID NO 8: Sequenz des vanA-Genes, beginnend bei der Base 4429 und endend bei der Base 5553 der in 5 dargestellten Sequenz, oder entsprechend der Nukleotidsequenz, welche zwischen den Nukleotiden 6977 und 7807 der Sequenz Ia angeordnet ist.
  • SEQ ID NO 9: Sequenz, kodierend für das erste VanH genannte Resistenzprotein, beginnend bei der Base 3501 und endend bei der Base 4529, insbesondere die vanH-Sequenz, deren Kodierungssequenz zwischen den Basen 3564 und 4529 lokalisiert ist, der in 5 dargestellten Sequenz oder entsprechend der Nukleotidsequenz, welche zwischen den Nukleotiden 6018 und 6983 der Sequenz Ia angeordnet ist.
  • SEQ ID NO 10: Sequenz, kodierend für das dritte Resistenzprotein VanX, beginnend bei der Base 5526 und endend bei der Base 6167 der in 5 dargestellten Sequenz oder entsprechend der Nukleotidsequenz, welche zwischen den Nukleotiden 7816 und 8621 der Sequenz Ia angeordnet ist.
  • SEQ ID NO 11: Transposon-Sequenz, kodierend für die Transposase, die Resolvase, VanR, VanS, VanH, VanA, VanX, VanY und VanZ und enthaltend die wiederholte inverse Sequenz von 38 pb an ihren N- und C-terminalen Enden und entsprechend der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 12: Sequenz, kodierend für die Transposase, beginnend bei der Base 150 und endend bei der Base 3112 der Sequenz Ib.
  • SEQ ID NO 13: Sequenz, kodierend für die Resolvase, beginnend bei der Base 3187 und endend bei der Base 3759 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 14: Sequenz, kodierend für VanY, beginnend bei der Base 9046 und endend bei der Base 9960 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 15: Sequenz, kodierend für VanZ, beginnend bei der Base 10116 und endend bei der Base 10598 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 21: Sequenz, kodierend für VanC, dargestellt in der Liste II in Übereinstimmung mit dem Protein VanC.
  • SEQ ID NO 22: Vollständige Sequenz Ia des Transposons von E. faecium, beginnend bei der Base 1 und endend bei der Base 10851.
  • SEQ ID NO 23: Sequenz, kodierend für das Protein VanR, beginnend bei der Base 3976 und endend bei der Base 4668 der Sequenz Ia.
  • SEQ ID NO 24: Sequenz, kodierend für das Protein VanS, beginnend bei der Base 4648 und endend bei der Base 5800 der Sequenz Ia.
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
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  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001

Claims (18)

  1. Gereinigtes Protein, das zur Expression oder Regulation der Resistenz auf Antibiotika der Familie der Glykopeptide erforderlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt unter den Sequenzen von Aminosäuren, welche in der Liste der Sequenzen durch SEQ ID NR 1 (VanH), SEQ ID NR 3 (VanX), SEQ ID NR 20 (VanC), SEQ ID NR 4 (VanR) oder SEQ ID NR 5 (VanS) identifiziert sind.
  2. Polypeptidzusammensetzung, welche einen Resistenzkomplex gegen die Antibiotika bildet, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch die Assoziation der Proteine gemäß Anspruch 1, bezeichnet durch SEQ ID NR 1 (VanR) und SEQ ID NR 3 (VanX), und des durch SEQ ID NR 2 (VanR) bezeichneten Protein gebildet ist.
  3. Polypeptidzusammensetzung, welche einen Resistenzkomplex gegen die Antibiotika bildet, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Assoziation der Proteine gemäß Anspruch 1, bezeichnet durch SEQ ID NR 1 (VanH), SEQ ID NR 20 (VanC), SEQ ID NR 3 (VanX), gebildet ist.
  4. Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus a. einer der Nukleotidketten, welche in der nachfolgenden Sequenzliste identifiziert ist: SEQ ID NR 9 (vanH), SEQ ID NR 10 (vanX); b. einer für ein Gen kodierenden Sequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer der unter a. identifizierten Ketten hybridisiert, demzufolge sie das Feststellen von auf die Antibiotika der Familie der Glykopeptide resistenten Stämme erlaubt; c. einer der Nukleotidketten, welche in der nachfolgenden Sequenzliste identifiziert ist: SEQ ID NR 21 (vanC), SEQ ID NR 23 (vanR), oder SEQ ID NR 24 (vanS); oder d. einem Fragment der Sequenzen, welche unter a. oder c. identifiziert sind, welche das Feststellen von gegen die Antibiotika der Familie der Glykopeptide resistenten Stämme erlaubt, besteht.
  5. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine der folgenden Ketten aufweist:
    Figure 00740001
  6. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine komplementäre DNS-Sequenz oder eine RNS-Sequenz handelt.
  7. Rekombinante Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 handelt, unter der Kontrolle von Regulationselementen, welche in einem vorbestimmten Wirt in die Expression der Resistenz auf Antibiotika der Familie der Glykopeptide eingreifen können, insbesondere das Vancomycin oder das Teicoplanin.
  8. Verfahren zur Herstellung eines rekompinanten zellulären Wirts, dadurch gekennzeichnet, dass es die Transformation einer Wirtszelle durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 unter Bedingungen umfasst, welche die Expression der Resistenz auf Antibiotika der Familie der Glykopeptide erlaubt.
  9. Nukleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine DNS- oder RNS-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 handelt, wobei diese Sonde gegebenenfalls markiert ist.
  10. Nukleotidsonde gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie speziell in Gram-positiven Bakterien mit Sequenzen hybridisiert, welche für ein Resistenzprotein gegen Glykopeptide kodiert, nämlich gegen das Vancomycin und/oder das Teicoplanin und dass sie unter diesen Sequenzen universell ist.
  11. Nukleotidsonde gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer nicht-chromosomalen Nukleotidsequenz eines Stammes hybridisiert, welcher gegen die Glykopeptide resistent ist, insbesondere gegen das Vancomycin und/oder das Teicoplanin, insbesondere dass sie mit einer nich-chromosomalen Nukleotidsequenz eines Stammes Grampositiver Kokken hybridisiert, beispielsweise einem Enterokokkenstamm und vorzugsweise E. faecium 4147.
  12. Nukleotidsonde gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eines der Oligonukleotide:
    Figure 00750001
    oder
    Figure 00760001
  13. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass sie speziell ein Protein gemäß Anspruch 1 erkennen.
  14. Kit zur in-vitro-Diagnostik an einer biologischen Probe in Gegenwart von Stämmen, welche gegen Glykopeptide resistent sind, insbesondere das Vancomycin und/oder das Teicoplanin, wobei diese Stämme insbesondere von Gram-positiven Kokken abstammen, insbesondere wenn es sich um Stämme von Enterokokken, beispielsweise E. faecium handelt, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – Antikörper gemäß Anspruch 13, gegebenenfalls markiert, – ein Reagenz zum Nachweis einer immunologischen Reaktion vom Typ Antikörper-Antigen, – gegebenenfalls Reagenzien zur Durchführung der Lyse der Zellen der zu untersuchenden Probe.
  15. Kit für die in-vitro-Diagnostik der Gegenwart von Stämmen, welche gegen Glykopeptide resistent sind, insbesondere resistent gegen Vancomycin und/oder Teicoplanin, wobei diese Stämme insbesondere von Gram-positiven Kokken abstammen, insbesondere wenn es sich um Enterokokkenstämme handelt, beispielsweise E. faecium, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – eine Nukleotidsonde gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 und gegebenenfalls – Oligonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dTTP, dGTP, – ein DNS-Polymerisationsmittel.
  16. Verfahren zum in-vitro-Nachweis der Gegenwart von Stämmen, welche gegen Glykopeptide resistent sind, insbesondere gegen Vancomycin und/oder Teicoplanin, wobei diese Stämme insbesondere von der Familie der Gram-Positiven Kocken abstammen, es sich insbesondere um Enterokockenstämme handelt, beispielsweise E. faecium oder E. gallinarum, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) das Inkontaktbringen einer biologischen Probe, welche die resistenten Stämme enthalten kann, mit einem Starter, gebildet durch eine Nukleotidsonde gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, welche dazu fähig ist, mit einer gesuchten Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die zur Expression der Resistenz notwendig ist, wobei diese Sequenz als Matrix verwendet wird, in Gegenwart von 4 verschiedenen Oligonukleosidtriphosphaten, und einem Polymerisationsmittel, unter Hybridisierungsbedingungen, so dass für jede mit einem Starter hybridisierte Nukleotidsequenz ein Verlängerungsprodukt eines jeden komplementären Starters der Matrix synthetisiert wird, b) die Abtrennung der Matrix und des erhaltenen Verlängerungsproduktes, wobei das Letztere sich so ebenfalls als eine Matrix darstellen kann, c) Wiederholung des Schrittes a), um eine feststellbare Menge der gesuchten Nukleotidsequenzen zu erhalten, d) Feststellen des Vermehrungsproduktes der Nukleotidsequenzen.
  17. Verwendung einer Nukleotidsequenz, welche für ein Protein gemäß Anspruch 1, oder ein Teil des genannten Proteins oder eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 4, kodiert, um in-vitro die Gegenwart von gegen Glykopeptide resistenten Stämmen, insbesondere dem Vancomycin und/oder dem Teicoplanin, festzustellen.
  18. Verwendung einer Nukleotidsequenz, welche zu einem Teil aus einer der Ketten SEQ ID NR 6, SEQ ID NR 7 oder SEQ ID NR 22 besteht, als Starter für die Kettenpolymerisationsreaktion, zur Feststellung einer Resistenz gegen Antibiotika der Familie der Glykopeptide, insbesondere dem Vancomycin und/oder dem Teicoplanin, insbesondere in Stämmen der Familien Gram-positiver Kokken.
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