ES2280079T3 - Polipeptidos implicados en la expresion de la resistencia a los antibioticos glicopeptidos. - Google Patents
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Abstract
Proteína purificada necesaria para la expresión o para la regulación de la resistencia a los antibióticos de la familia de los glicopéptidos, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias de aminoácidos identificadas en la lista las secuencias por SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 3 (VanX), SEQ ID NO 20 (VanC), SEQ ID NO 4 (VanR) o SEQ ID NO 5 (VanS).
Description
Polipéptidos implicados en la expresión de la
resistencia a los antibióticos glicopéptidos.
La invención se refiere a los polipéptidos
asociados a la expresión de la resistencia a los antibióticos de la
familia de los glicopéptidos, en particular, a bacterias Gram
positivos, en particular de la familia de los cocci Gram positivos.
Igualmente, la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos
codificadora de estos polipéptidos. Se refiere también a la
utilización de estos polipéptidos y de su secuencia de nucleótidos
como medios de detección "in vitro" de una resistencia a
los glicopéptidos. Entre los cocci Gram positivos, la invención se
refiere muy especialmente a los enterococos, a los estreptococos y a
los estafilococos que presentan un interés particular para el
empleo de la invención.
Los glicopéptidos, entre los cuales la
vancomicina y la teicoplanina, son antibióticos inhibidores de la
síntesis de la pared bacteriana. Estos antibióticos se utilizan
mucho para el tratamiento de las infecciones severas debidas a los
cocci Gram positivos (enterococos, estreptococos y estafilococos),
en particular en los casos de alergia y resistencia a las
penicilinas. A pesar de un largo uso clínico de la vancomicina, este
antibiótico siguió siendo activo sobre la casi totalidad de las
cepas hasta el año 1986, fecha en la cual se aislaron las primeras
cepas resistentes. Desde entonces, la resistencia a los
glicopéptidos fue detectada por numerosos microbiólogos en Europa y
en los Estados Unidos, en particular, en cepas aisladas de enfermos
immunodeprimidos, haciendo necesario una evaluación sistemática de
la sensibilidad de los gérmenes en medio hospitalario.
La actividad de los glicopéptidos depende de la
formación de un complejo entre el antibiótico y los precursores del
peptidoglicano, más que de la interacción directa con enzimas del
metabolismo de la pared celular. En particular, se constató que los
glicopéptidos se fijan en los residuos terminales
D-Alanil-D-alanina
(D-Ala-D-Ala) de
los precursores del peptidoglicano.
La reciente aparición de una resistencia a los
glicopéptidos, en particular, en enterococos, condujo a la
obtención de algunos resultados a nivel del conocimiento de los
factores que conferían esta resistencia.
Por ejemplo, se ha constatado en unas cepas de
enterococo particular, Enteroccus faecium BM4147, que el
determinante de la resistencia a los glicopéptidos se localizaba
sobre un plásmido de 34 kb, el plásmido pIP816. Este determinante
se clonó en E. coli (Brisson Noël et al, 1990,
Antimicrob Agents Chemother 34, 924-927).
Leclercq R. et al (The New England
Journal of Medecine, vol. 319, nº 3, pág. 157-161)
describe el estudio de la resistencia de dos aisladores de E.
faecium con elevadas tasas de vancomicina y de teicoplanina. El
plásmido pIP816 y los fragmentos de restricción HindIII de 10 kb se
utilizan en reacciones de hibridación con el ADN de plásmido de los
aisladores BM4152 y BM4152-1 de E.
faecium.
Según los resultados obtenidos hasta la
actualidad, la resistencia a los glicopéptidos se asociaba con la
producción de una proteína de peso molecular de aproximadamente 40
kDa, siendo la síntesis de esta proteína inducida por
concentraciones sub-inhibidoras de algunos
glicopéptidos tal como la vancomicina.
Al realizar un estudio más profundo de la
resistencia de algunas cepas de cocci Gram positivos frente a
glicopéptidos, en particular, de la vancomicina o de la
teicoplanina, los inventores constataron que esta resistencia
estaría vinculada a la expresión de varias proteínas o polipéptidos
codificados por secuencias generalmente llevadas por plásmidos en
las cepas resistentes. Los nuevos resultados obtenidos por los
inventores permiten además distinguir los genes codificadores para
dos fenotipos de resistencia, por una parte las cepas altamente
resistentes a los glicopéptidos y, por otra parte, de las cepas
resistentes a un bajo nivel.
Por cepas resistentes de un alto nivel, se
entiende una cepa de bacteria en particular una cepa de cocci Gram
positivo para la cual las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI)
de vancomicina y de teicoplanina son respectivamente superiores a
32 y 8 \mug/ml. Las CMI de la vancomicina frente a las cepas
resistentes de bajo nivel están comprendidas entre 16 y 32
\mug/ml. Estas cepas son aparentemente sensibles a la
teicoplanina.
Los inventores aislaron y purificaron, entre los
componentes necesarios para la expresión de la resistencia a los
glicopéptidos, una proteína particular denominada VANA o VanA que
presenta una determinada homología con
D-alanina-D-alanina
ligasas. VanA es sin embargo funcionalmente distinta de las
ligasas.
Se designará en principio por "van..." una
secuencia de gen y por "Van..." una secuencia de
aminoácidos.
La invención se refiere a polipéptidos o a
proteínas implicados en la expresión de una resistencia a los
antibióticos de la familia de los glicopéptidos y, en particular, a
la vancomicina y/o a la teicoplanina, así como las secuencias de
nucleótidos codificadores de tales complejos.
Igualmente, la invención se refiere a sondas de
nucleótidos utilizables para la detección de una resistencia a los
glicopéptidos, en particular, por la reacción de polimerización en
cadena (PCR), o por ensayos que hacen intervenir anticuerpos.
La invención se refiere a una proteína
purificada necesaria para la expresión o para la regulación de la
resistencia a los antibióticos de la familia de los glicopéptidos,
caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos elegida
entre las secuencias de aminoácidos identificados en la lista de las
secuencias por SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 3 (VanX), SEQ ID NO 20
(VanC), SEQ ID NO 4 (VanR) o SEQ ID NO 5 (VanS), o una secuencia que
hibrida con uno de los encadenamientos de nucleótidos identificados
en la lista de las secuencias por SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID
NO 10 o SEQ ID NO 21 o con una de las secuencias V1 o V2 siguientes
en condiciones de astringencias o de poca astringencias:
Una primera composición particular según la
invención implicada en la expresión de la resistencia a los
glicopéptidos se caracteriza porque comprende al menos 3 proteínas
o cualquier parte de una o varias de estas proteínas necesarias
para conferir a las bacterias Gram positivos, la resistencia a los
antibióticos de la familia de los glicopéptidos, en particular, a
la vancomicina y/o a la teicoplanina, o en favorecer esta
resistencia, en particular en cepas de la familia de los cocci Gram
positivos.
Se caracterizó otra proteína, VanC, vinculada
con D-Ala-D-Ala
ligasas pero de diferente especificidad en Enterococcus
gallinarum BM4173; el gen vanC presenta dominios que tienen una
homología suficiente con el gen vanA, para que sondas que
corresponden a regiones determinadas de vanA permiten su
detección.
E. gallinarum es un aislador resistente
de manera constitutiva a bajos niveles de vancomicina
(Dutka-Malen et al, Antimicrob. Agents
Chemother 34 (1990b) 1875-1879).
Por la expresión "polipéptidos" se entiende
cualquier encadenamiento de aminoácidos que pueden contener
proteínas, o de un tamaño inferior al de una proteína.
Las condiciones de astringencia que están en
cuestión más arriba se determinan según las modalidades habituales
tratándose de la hibridación de secuencias de nucleótidos. A título
de ejemplo, tratándose de las secuencias que hibridan con la
secuencia del gen vanA (SEQ ID NO 8) se podrán aplicar las
siguientes condiciones:
- -
-
\vtcortauna
- \ding{118}
- temperatura de la reacción 65ºC durante una noche en una solución que contiene 0,1% de SDS, 0,7% de leche en polvo desnatada, 6xSSC (1xSSC = 0,15M NaCl y 0,015M de citrato de sodio a pH = 7,0)
- \ding{118}
- lavados a 65ºC en 2xSSC-0,1% SDS;
- -
-
\vtcortauna
La expresión de una resistencia a glicopéptidos
se puede traducir en la persistencia de una infección debida a
gérmenes habitualmente sensibles a los glicopéptidos.
Un polipéptido o una proteína son necesarios
para la expresión de una resistencia a los glicopéptidos, a partir
de entonces su ausencia hace que las cepas que contienen este
polipéptido o esta proteína, sean más sensibles a los glicopéptidos
y que este polipéptido o proteína no esté presentes en las cepas
sensibles.
Existen distintos niveles de resistencia a los
glicopéptidos, en particular, entre las cepas de cocci Gram
positivos.
Igualmente, la invención se refiere a una
composición formada por la asociación de las proteínas identificadas
en la lista de las secuencias por SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 2
(VanA) y SEQ ID NO 3 (VanX).
Por lo tanto, los inventores constataron que la
expresión de una resistencia a los glicopéptidos en bacterias Gram
positivos, necesita la expresión de al menos tres proteínas o de
polipéptidos procedentes de estas proteínas.
Según un primer modo de realización particular
de la invención, los polipéptidos de la composición se caracterizan
también porque las secuencias de aminoácidos necesarios para la
expresión de la resistencia a los antibióticos de la familia de los
glicopéptidos están bajo el control de elementos de regulación, en
particular, de las proteínas que corresponden a las secuencias
designadas por SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 en la lista las secuencias,
y que corresponde respectivamente a una secuencia R de regulación,
y a una secuencia S sensora.
VanS y VanR constituyen un sistema de regulación
de dos componentes, siendo VanR un activador de transcripción y
VanS estimulante de la transcripción dependiente de VanR. VanS es
susceptible de modular el nivel de fosforilación de VanR en
respuesta a la vancomicina presente en el medio externo e interviene
así en el control de la transcripción de los genes con resistencia
a la vancomicina.
Estas secuencias de regulación son capaces, en
particular, de aumentar el nivel de resistencia, en la medida en
que favorecen la expresión de las proteínas de resistencia
comprendidas en los polipéptidos de la invención.
Según otro modo de realización ventajoso de la
invención, los polipéptidos de la composición citada más arriba se
codifican por la secuencia SEQ ID NO 6 identificada en la lista de
las secuencias, que representa la secuencia codificadora de las 5
proteínas descritas anteriormente.
Otra secuencia según la invención se designa por
SEQ ID NO 11 que contiene la secuencia SEQ ID NO 6 así como un
encadenamiento aguas arriba de SEQ ID NO 6 codificadora para una
transposasa (codificada por la hebra (-) de la secuencia, y un
encadenamiento aguas abajo de SEQ ID NO 6 que corresponde a genes
vanY y vanZ y en cada extremo, secuencias invertidas repetidas de
38 pb. SEQ ID NO 11 constituye un transposón cuyos genes intervienen
en niveles diferentes en el establecimiento de la resistencia a los
glicopéptidos.
La secuencia identificada por la abreviatura SEQ
ID NO 1 contiene la proteína VanH codificada por el gen vanH, esta
proteína incluye 322 aminoácidos y comienza por una metionina. Esta
proteína es una enzima implicada en la síntesis del peptidoglicano
y tiene un peso molecular de 35,754 kDa. VanH presenta algunas
similitudes con deshidrogenasas que catalizan la oxidación
dependiente de NAD^{+} de los ácidos
2-hidroxi-carboxílicos para formar
los ácidos 2-keto-carboxílicos
correspondientes. En realidad la proteína VanH podría emplear el
NADP^{+} en lugar de NAD^{+}. La proteína VanH contiene también
varios residuos de sitios reactivos que participan probablemente
directamente en el enlace del substrato y en la catálisis. VanH está
implicada en la síntesis de un substrato de la ligasa VanA. Este
substrato de VanA sería un ácido
D-\alpha-hidroxi-carboxílico,
que sería condensado por VanA con la D-alanina en
sitio de un aminoácido D, lo que afectaría al enlace del precursor
del peptidoglicano, con la vancomicina, por pérdida de un enlace de
hidrógeno ya que uno de los enlaces de hidrógeno formados entre la
vancomicina y el
N-acetil-D-Ala-D-Ala
se realiza con la grupo NH del residuo D-alanina
terminal. Recordemos que "Ala" es la abreviatura de
"alanina".
"alanina".
Los inventores pudieron poner de relieve algunas
interacciones entre las proteínas VanA y VanH y pudieron, en
particular, describir esto: la naturaleza la proteína VanA (ligasa
D-alanina: D-alanina de
especificidad alterada para su substrato) que permitió la
resistencia a los glicopéptidos implica la biosíntesis de un nuevo
compuesto diferente de
D-Ala-D-Ala por
VanA, péptido que se puede incorporar a los peptidoglicanos pero no
es reconocido por la vancomicina. En particular la observación de
las similitudes entre el producto del gen vanH con los
\alpha-ceto-ácidos reductasas D específicos
permitió determinar que este compuesto pueda no ser un aminoácido D
pero un ácido hidroxi D, que cuando se une a la
D-alanina por VanH puede generar un nuevo
depsipéptido precursor del peptidoglicano.
La invención se refiere también a cualquier
combinación de estas distintas proteínas en un complejo de
resistencia, así como proteínas híbridas que comprende una o varios
de las proteínas citadas más arriba, o parte de estas proteínas, en
asociación con una secuencia determinada de aminoácidos. Se refiere
en particular a una composición de polipéptidos que forman un
complejo de resistencia a los antibióticos, caracterizada porque
está formada por la asociación de las proteínas según la
reivindicación 1 designadas por SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 20
(VanC) y SEQ ID NO 3 (VanX).
Igualmente, entran en el marco de la invención
las secuencias de nucleótidos codificadoras para una de las
secuencias de aminoácidos descritos anteriormente.
Una secuencia de nucleótidos según la invención
se caracteriza porque consiste en:
- a.
- uno de los encadenamientos de nucleótidos identificados en la lista siguiente de secuencias: SEQ ID NO 9 (vanH), SEQ ID NO 10 (vanX);
- b.
- una secuencia codificadora de un gen, que hibrida en condiciones de astringencias con una secuencia complementaria del uno de los encadenamientos definidos en a., en cuanto permite la detección de cepas resistentes a los antibióticos de la familia de los glicopéptidos;
- c.
- uno de los encadenamientos de nucleótidos identificados en la lista siguiente de secuencias: SEQ ID NO 21 (vanC), SEQ ID NO 23 (vanR), o SEQ ID NO 24 (vanS); o,
- d.
- un fragmento de las secuencias definidas en a. o en c., que permite la detección de cepas resistentes a los antibiótico de la familia de los glicopéptidos;
\newpage
o porque se trata de una parte de uno de los
encadenamientos de SEQ ID NO 6, de SEQ ID NO 7 o de SEQ ID NO 22,
susceptible:
- a.
- bien sea de constituir un cebador, para la detección de una resistencia a los antibióticos de la familia de los glicopéptidos, en particular, a la vancomicina y/o a la teicoplanina, en particular en cepas de la familia de los cocci Gram positivos,
- b.
- o bien de codificar para una secuencia necesaria para la expresión o para la regulación de la resistencia a los antibióticos de la familia glicopéptidos, en particular, a la vancomicina y/o a la teicoplanina, en particular en cepas de la familia de los cocci Gram positivos.
La secuencia SEQ ID NO 7 codifica para las 3
proteínas de resistencia VanH, VanA y VanX.
La secuencia SEQ ID NO 22 y la secuencia SEQ ID
NO 11 comprenden un transposón representado en la figura 7a; este
transposón contiene los genes necesarios para la expresión de la
resistencia a los glicopéptidos, así como los genes asociados a
esta resistencia implicados por ejemplo en la regulación de la
expresión de los genes necesarios para obtener el fenotipo de
resistencia o implicados en la cantidad de polipéptido de
resistencia obtenida.
Una secuencia particular que responde a la
definición citada más arriba es una las siguientes secuencias:
V1 y V2 permiten la constitución de sondas en su
caso en asociación con otros nucleótidos, según el grado de
especificidad buscado para detectar vanA y vanC y pueden también ser
utilizadas como cebadores en reacciones de polimerización en
cadena.
Otros encadenamientos de nucleótidos descritos
en la presente descripción son los encadenamientos SEQ ID NO 8, SEQ
ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 12 (transposasa), SEQ
ID NO 13 (resolvasa), SEQ ID NO 14 (vanY), SEQ ID NO 15 (vanZ), SEQ
ID NO 23 (vanR), SEQ ID NO 24 (vanS) o de una variante de uno de
estos encadenamientos a partir de entonces codificadora para una
proteína que tiene propiedades inmunológicas y/o funcionales
similares a las de las proteínas codificadas por los encadenamientos
SEQ ID NO 8 SEQ (vanA), SEQ ID NO 9 (vanH), SEQ ID NO 10 (vanX), o
SEQ ID NO 21 (vanC), SEQ ID NO 12 (transposasa), SEQ ID NO 13
(resolvasa), SEQ ID NO 14 (vanY), SEQ ID NO 15 (vanZ), SEQ ID NO 23
(vanR), SEQ ID NO 24 (vanS) o porque permite la detección de cepas
resistentes a los antibióticos de la familia de los
glicopéptidos.
Variantes engloban todos los fragmentos de las
secuencias que tienen las propiedades siguientes.
Estas secuencias codifican para las proteínas de
resistencia VanH, VanA y VanX.
La secuencia de nucleótidos designada por SEQ ID
NO 8 corresponde a un fragmento de ADN de 1029 pb situado entre el
codón ATG en posición 377 y el codón TGA en posición 1406 sobre el
plásmido pAT214 (Fig. 6).
La localización de las proteínas de regulación y
resistencia se ilustra en la figura 3.
Los inventores identificaron aguas arriba y
aguas abajo los genes vanR, vanS, vanH, vanA y vanX necesarios o
asociados a la expresión de la resistencia a glicopéptidos a un
nivel dado, a partir de genes codificadores para una transposasa y
una resolvasa (aguas arriba del grupo antes citado) y genes vanY y
vanZ, aguas abajo de este grupo. Los genes de transposasa y de
resolvasa están implicados en funciones de transposición y el gen
vanY codificador para una D, D-carboxi peptidasa
está implicado en el metabolismo del peptidoglicano, y podría
contribuir a la resistencia a los glicopéptidos en E. faecium
BM4147 aunque vanR, vanS, vanH, vanA y vanX llevados por un
plásmido a número elevado de copias, confieren solamente una
resistencia de alto nivel.
Tengamos en cuenta que la secuencia codificadora
de la transposasa se localiza sobre la hebra (-) de la secuencia ID
NO 22 que codifica a vanR, vanS, vanH, vanA, vanX, vanY, vanZ y la
resolvasa.
\newpage
La invención se refiere no sólo a las secuencias
de ADN identificadas en la lista de las secuencias sino también a
las secuencias de ADN complementarias y a las secuencias de ARN
correspondientes. La invención se refiere por otro lado a las
secuencias equivalentes de las anteriores, bien sea en término de
expresión de proteínas, de polipéptidos o de sus fragmentos
descritos más arriba, o bien en términos de capacidad a detectar,
por ejemplo, por las técnicas de polimerización en cadena, de las
cepas de bacterias Gram positivos, que presenta una resistencia a
los antibióticos de la familia de los glicopéptidos tales como la
vancomicina o la teicoplanina.
Forman también parte de la invención, las
secuencias recombinantes caracterizadas porque comprenden una de
las secuencias de nucleótidos citada más arriba.
La invención se refiere también a un vector
recombinante caracterizado porque comprende una de las secuencias
de nucleótidos citadas más arriba, en un sitio no esencial para su
replicación, bajo el control de elementos de regulación
susceptibles de intervenir en la expresión, de la resistencia a los
antibióticos de la familia de los glicopéptidos, en particular, la
vancomicina o la teicoplanina, en un huésped determinado.
Los vectores recombinantes especialmente
ventajosos para el empleo de la invención son los siguientes
vectores: pAT214 que contiene el fragmento
EcoRV-SacII de 1761 bp que contiene una secuencia de
nucleótidos codificadora para la proteína VanA; en estos vectores
las secuencias de la invención se colocan ventajosamente bajo el
control de promotores tales como el promotor lac.
La invención se refiere también a un huésped
celular recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos tal
como se describe anteriormente o un vector descrito más arriba, en
condiciones que permiten la expresión de la resistencia a los
antibióticos de la familia de los glicopéptidos, en particular, la
resistencia a la vancomicina y/o a la teicoplanina, siendo este
huésped por ejemplo elegido entre las bacterias, en particular, los
cocci Gram positivos. La invención se refiere en particular a un
procedimiento de preparación de un huésped celular recombinante tal
como se describe más arriba.
Para algunas aplicaciones se pueden también
utilizar las levaduras, los hongos y las células de insectos o de
mamíferos.
Igualmente, la invención se refiere a una sonda
de nucleótidos caracterizada porque es capaz de hibridar con una
secuencia descrita anteriormente, estando esta sonda en su caso
marcada. Estas sondas pueden o no ser, específicas de las proteínas
de resistencia a los glicopéptidos.
Marcadores utilizables para las necesidades de
la invención son los marcadores radioactivos conocidos así como
otros marcadores tales como los marcadores enzimáticos o marcadores
quimioluminescentes.
Las sondas así marcadas se pueden utilizar en
ensayos de hibridación para detectar una resistencia a los
glicopéptidos en bacterias Gram positivos. En este caso, se podrán
emplear condiciones de baja astringencia.
Las sondas de nucleótidos según la invención se
pueden caracterizar porque son específicas en bacterias Gram
positivos de las secuencias codificadoras de una proteína de
resistencia a glicopéptidos, en particular, a la vancomicina y/o a
la teicoplanina, pudiendo estas sondas además ser universales entre
estas secuencias.
Por estas sondas específicas, se entiende
cualquier oligonucleótido hibridante con una secuencia de
nucleótidos codificadora para una de las proteínas según la
invención, tal como se describe en las páginas anteriores, y que no
presenta reacción de hibridación cruzada o de amplificación (PCR)
con secuencias presentes en el conjunto de las cepas sensibles.
El carácter universal de los oligonucleótidos
utilizables en PCR, viene determinado por su capacidad de promover
específicamente la amplificación de una secuencia de nucleótidos
implicada en la resistencia en una cepa cualquiera de bacteria Gram
positivo, resistente a los antibióticos de la familia de los
glicopéptidos.
El tamaño de las sondas de nucleótidos según la
invención puede variar en función de la utilización buscada. Para
los oligonucleótidos utilizables en PCR se recurrirá a fragmentos de
longitud usual en esta técnica. Para realizar sondas, se puede
tomar cualquier parte de las secuencias de la invención, por ejemplo
de las sondas fragmentos de 200 nucleótidos.
Según un modo de realización particular de la
invención, se elige una sonda de nucleótidos por su especificidad
frente a una secuencia de nucleótidos codificadora para una proteína
necesaria para la expresión en bacterias Gram positivos de un alto
nivel de resistencia a los antibióticos de la familia de los
glicopéptidos, en particular a la vancomicina y a la
teicoplanina.
Otras sondas ventajosas para la realización de
la invención, se caracterizan por su carácter universal, según la
definición anterior, pero no específica de los genes de resistencia.
Se pueden utilizar también como cebadores de PCR, y son por
ejemplo:
V1 y V2 hibridan con vanA y vanC y son
susceptibles de conducir a la detección en otros microorganismos, de
proteínas asociadas a la resistencia a los glicopéptidos.
Otras sondas particulares de la invención tienen
el carácter específico de una secuencia de nucleótidos codificadora
para una proteína necesaria para la expresión en bacterias Gram
positivos de un bajo nivel de resistencia a los antibióticos de la
familia de los glicopéptidos, en particular a la vancomicina en
bacterias Gram positivos.
De una manera especialmente preferida, se
caracteriza una sonda de la invención porque hibrida, con una
secuencia de nucleótidos cromosómica o no cromosómica de unas cepas
Gram positivos resistentes a glicopéptidos, en particular, la
vancomicina y/o la teicoplanina, en particular porque hibrida con
una secuencia de nucleótidos cromosómica o no cromosómica de una
cepa de cocci Gram positivo, por ejemplo una cepa de enterococo y
preferentemente E. faecium 4147 o E. gallinarum.
Para diferenciar cepas de alto nivel de
resistencia, de cepas de bajo nivel de resistencia se podrá realizar
un ensayo de hibridación empleando condiciones de fuerte
astringencia.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden
obtener a partir de las secuencias de la invención, por corte con
enzimas de restricción, o por síntesis química según los métodos
clásicos.
La invención se refiere por otra parte a
anticuerpos policlonales o monoclonales, caracterizados porque
reconocen el o los polipéptidos descritos más arriba o una
secuencia de aminoácidos descrita más arriba.
Estos anticuerpos se pueden obtener según los
métodos clásicos de producción de anticuerpos. En particular para
la preparación de los anticuerpos monoclonales se recurrirá al
método de Kolher y Milstein según el cual se preparan anticuerpos
monoclonales por fusión celular entre células de mieloma y células
esplénicas de ratones previamente inmunizados con un polipéptido o
una composición según la invención, conforme al procedimiento
clásico.
Los anticuerpos de la invención son utilizables
ventajosamente para la detección de la presencia de proteínas
características de una resistencia a los glicopéptidos, en
particular a la vancomicina y a la teicoplanina.
Entran también en el marco de la invención, los
ensayos para la detección en las bacterias Gram positivos, de una
resistencia a los glicopéptidos, en particular, de los ensayos que
emplean las técnicas ELISA.
Un kit para el diagnóstico in vitro de la
presencia de cepas Gram positivos, resistentes a los glicopéptidos,
en particular a la vancomicina y/o a la teicoplanina, perteneciendo
estas cepas en particular a los cocci Gram positivos por ejemplo de
los enterococos, por ejemplo E. faecium o E.
gallinarum, caracterizado porque comprende:
- -
- anticuerpos que responden a la definición citada más arriba, en su caso marcados,
- -
- un reactivo para la detección de una reacción inmunológica del tipo anticuerpo-antígeno,
- -
- en su caso reactivos para efectuar la lisis de células de la muestra ensayada.
Los medios puestos a punto por los inventores
presentan por a otra parte la ventaja muy interesante de ser
adaptados para la realización de un ensayo o de un kit rápido y
fiable de detección de cepas Gram positivos, resistentes a los
glicopéptidos por la reacción de polimerización en cadena (PCR).
Dicho ensayo permite mejorar la sensibilidad de los ensayos
existentes que siguen siendo poco fiables y pueden permitir en
algunos casos la detección del conjunto de los representantes de la
familia de los genes codificadores para proteínas de resistencia a
los glicopéptidos en bacterias Gram positivos.
La realización de un ensayo por el método de
amplificación de los genes de estas proteínas se realiza por la
técnica PCR o por la técnica IPCR (IPCR: abreviatura de reacción de
polimerización en cadena inversa).
La técnica IPCR permite la amplificación de las
regiones NH_{2} y COOH terminales de los genes que se desea
detectar.
Algunos cebadores particulares permiten
amplificar los genes de las cepas resistentes de bajo nivel.
A título de ejemplo las secuencias siguientes
son utilizables como cebadores para la preparación de sondas para
la detección de una amplificación por el método PCR o IPCR.
X representa una de las bases A, T, C o G o
también corresponde en todos los casos a la inosina.
La invención se refiere naturalmente a las
sondas complementarias de los oligonucleótidos anteriormente
descritos así como eventualmente a las sondas ARN que les
corresponden.
Un kit para el diagnóstico in vitro de la
presencia de cepas de bacterias Gram positivos, resistentes a los
glicopéptidos, en particular resistentes a la vancomicina y/o a la
teicoplanina, perteneciendo estas cepas en particular a los cocci
Gram positivos, en particular, porque se trata de cepas de
enterococos, por ejemplo E. faecium o E. gallinarum,
se caracteriza porque comprende:
- -
- una sonda de nucleótidos que responde a las definiciones citadas más arriba y en su caso,
- -
- oligonucleósidos trifosfatos en cantidad suficiente para permitir la amplificación de la secuencia buscada,
- -
- un tampón de hibridación, y
- -
- un agente de polimerización de ADN.
La invención se refiere también a un
procedimiento de detección in vitro de la presencia de cepas
Gram positivos, resistentes a los glicopéptidos, en particular a la
vancomicina y/o a la teicoplanina, perteneciendo estas cepas en
particular a la familia de los cocci Gram positivos, en particular,
porque se trata de cepas de enterococos, por ejemplo E.
faecium o E. gallinarum, caracterizado porque
comprende:
- a)
- la puesta en contacto de una muestra biológica susceptible de contener las cepas resistentes, con un cebador constituido por una secuencia de nucleótidos descrita más arriba, o cualquier parte de una secuencia anteriormente descrita, capaz de hibridar, con una secuencia de nucleótidos buscada necesaria para la expresión de la resistencia a los glicopéptidos, siendo esta secuencia utilizada como matriz, en presencia de los 4 distintos nucleósidos trifosfatos, y de un agente de polimerización, en condiciones de hibridación de tal manera que para cada secuencia de nucleótidos que tenga híbrido con un cebador, se sintetiza un producto de elongación de cada cebador complementario de la matriz,
- b)
- la separación de la matriz y del producto de elongación obtenido, pudiendo igualmente este último entonces incluirse como una matriz,
- c)
- la repetición de la etapa a) de tal manera que se obtenga una cantidad detectable de las secuencias de nucleótidos buscadas, y
- d)
- la detección del producto de amplificación de las secuencias de nucleótidos.
La detección de los productos de elongación de
la secuencia buscada se puede realizar por una sonda idéntica a los
cebadores empleados para efectuar la técnica PCR o IPCR, o también
por una sonda diferente de estos cebadores, estando esta sonda en
su caso marcada.
Detalles relativos al empleo de las técnicas
PCR, se pueden obtener a partir de las solicitudes de patentes
europeas nº 0229701 y 0200362.
Otras ventajas y características de la invención
aparecen en los ejemplos que siguen y en las figuras.
\newpage
- Figura 1: electroforesis sobre gel de
poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) de las proteínas de
las fracciones membranales líneas 1 y 4, estándares de pesos
moleculares; línea 2, E. faecium BM4147 puesto en cultivo en
ausencia de vancomicina; línea 3, BM4147 puesto en cultivo con 10
\mug/ml de vancomicina. La cabeza de flecha indica la posición de
la proteína VANA.
- Figura 2:
\vskip1.000000\baselineskip
- A:
- Mapas de restricción de los insertos de los plásmidos pAT213 y pAT214. El vector y el inserto de ADN se distinguen por segmentos claros y oscuros respectivamente. La flecha abierta representa el gen vanA.
- B:
- Estrategia para el secuenciado de nucleótidos para el inserto de 1761 bp en el plásmido pAT214. Las flechas indican la dirección y el alcance de las reacciones de secuenciado por el método didesoxi. El cebador sintético de oligonucleótidos (5' ATGCTCCTGTCTCCTTTC 3' OH) es complementario de la secuencia entre las posiciones 361 y 378. Solamente se dan los sitios de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 3: posición de las secuencias R, S,
ORF1, ORF2, ORF3.
- Figura 4: representación de SEQ ID NO 6
- Figura 5: representación de SEQ ID NO 6 y de
la proteína correspondiente.
- Figura 6: secuencia del gen vanA y de la
proteína correspondiente.
- Figura 7:
\vskip1.000000\baselineskip
- (a)
- Localización de los genes vanR, vanS, vanH, vanA, vanX, vanY, vanZ, del gen de la transposasa y del gen de la resolvasa, así como de las secuencias terminales invertidas repetidas de 38 bp en el extremo del transposón.
- (b)
- Cartografía de los plásmidos (A) Polilinker de pAT29 y de los derivados construidos en este estudio. La flecha marcada F2 indica la posición y la orientación del promotor P2 de aphA-3 (Caillaud et al, 1987, Mol Gen. Genet. 207: 509-513). (B) Inserto de pAT80. Los rectángulos blancos indican el ADN de pAT29 pero no están representados a la escala. Los rectángulos que se terminan por una flecha indican las secuencias codificadoras. Las flechas de trazos gruesos, verticales y horizontales indican respectivamente la posición y la orientación del gen apha-1 en los derivados de pAT80. Sitios de restricción: Ac, AccI; B, BamHI; Bg, BqlII; Bs, BssHII; E, EcoRI; H, HindIII; Hc, HincII; K, KpnI; P, PstI; S, SmaI; SI, SacI, SII, SacII; Sa, SalI; Sp, SphI; Xb, XbaI. (C) Insertos en pAT86, pAT87, pAT88 y pAT89. Los insertos están representados por trazos gruesos y los vectores correspondientes se indican entre paréntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 8: secuencia de nucleótidos del
transposón representada en la figura 7 y secuencia de aminoácidos
de las proteínas correspondientes. La secuencia de nucleótidos se
presenta para la hebra (+) y para la hebra (-) (que corresponde a
la secuencia complementaria de la hebra (+) de las posiciones 1 a
3189) sobre la cual se localiza la secuencia codificadora de la
transposasa.
- Figura 9: secuencia de nucleótidos del
fragmento de 1347 bp SacI-PstI del plásmido pAT216 que
contiene el gen vanC. La numeración comienza en la primera base G
del sitio de restricción SacI. La secuencia RES potencial
aguas arriba del codón de iniciación de traducción ATG en la
posición 215 está subrayada. El codón STOP (TGA) es indicado por *.
La región codificadora de vanC y la secuencia de aminoácidos
deducida se indica en caracteres gruesos. Clones secuenciales que
se superponen han sido generados por fragmentos de restricción
subclonación de pAT216 en el bacteriófago M13mp10 (Amersham,
Inglaterra). El cebador universal (New England Biolabs Beverly MA)
se utilizó para secuenciar el inserto de los fagos recombinantes. El
secuenciado fue realizado por el método enzimático de
di-desoxi nucleótido (Sanger et al, 1977 PNAS
74: 5463-5467) utilizando la polimerasa de
ADN T7 (Sequenase US B CORP, Cleveland, OH) y el [\alpha^{-35}S]
dATP (Amersham, England). Los productos de las reacciones han
estado cargados sobre geles de poliacrilamida desnaturante a 6%.
- Figura 10: alineamiento de las secuencias de
aminoácidos de VanC, VanA, Ddla y DdlB. Los aminoácidos idénticos
(I) y las sustituciones conservantes (C) en las 4 secuencias se
indican en la alineamiento. Para clasificar las sustituciones
conservantes, los aminoácidos se agruparon como sigue: RK, LFPMVI,
STQNC, AGW, H, ED e Y. Las regiones de alta homología que
corresponden a los dominios 1, 2, 3 y 4 están subrayadas. Las
secuencias que corresponden a los péptidos 1 y 2 están indicadas por
las flechas.
\newpage
- Figura 11: descripción de los oligonucleótidos
V1 y V2
\vskip1.000000\baselineskip
- (A):
- Secuencia de aminoácidos de los péptidos 1 y 2 de VanA y de las D-Ala-D-Ala ligasas. Se indica el número de aminoácidos entre el extremo N-terminal y el péptido 1, entre los péptidos 1 y 2 y el péptido 2 y el extremo C-terminal. Los aminoácidos idénticos entre al menos 2 de las 3 secuencias, están representados con caracteres gruesos.
- (B):
- Péptidos diana y secuencia de nucleótidos deducida. X representa una base cualquiera del ADN. El péptido 2 en DdlB difiere del péptido diana a nivel de 2 posiciones (*).
- (C):
- Secuencia de nucleótidos de V1 y de V2. Nucleótidos alternados y el desoxiinosina (I) que pueden corresponder a cualquier base de ADN, se utilizaron en las posiciones para las cuales las secuencias de nucleótidos codificadoras para los péptidos diana varían. Las flechas dan la dirección de la síntesis de ADN. Los oligonucléotidos fueron sintetizados por el método de metoxi-fosforamidita con un aparato tipo Biosystem ADN 380B (Applied Biosystem, Foster City, Ca). El ADN se aisló a partir de lisatos bacterianos por extracción con el bromuro de hexadecil trimetil amonio (Inst. Biotechnologies, Inc, New Haven, CO) (Le Bouguénec et al, 1990, J. Bacteriol. 172: 727-734) y utilizado como matriz para la amplificación por PCR con un sistema de calefacción controlado "Inteligente Heating Bloque" IBH101 (Hybarid ltd, GB), según la descripción de Mabilat et al (1990, Plasmid 23: 27-34). Los productos de amplificación fueron revelados por electroforesis sobre gel a 0,8%, después de la coloración con bromuro de etidio.
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 12: inactivación por inserción de vanC.
El gen vanC está representado por una flecha abierta y se sombrea
con trazos el fragmento interno de 690 bp
EcoRI-HinCII. En trazos finos se representó el ADN de
pAT114; en trazos gruesos el ADN cromosómico de PM4174; las flechas
indican los genes de resistencia a los antibióticos:
aphA-3 es el gen codificador para la
3'-aminoglicósido fosfotransferasa; erm es el
gen codificador para el ER^{R} metil transferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
- (A):
- El plásmido pAT217 fue construido por ligadura del fragmento EcoRI-HinCII de pAT216 con el vector suicida pAT114 (Trieu-Cuot et al, 1991, Gen 106: 21-27) asimilado con EcoRI y SmaI.
- (B):
- Región vanC del ADN cromosómica de BM4174.
- (C):
- Región vanC después de la integración de pAT217.
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 13: análisis Southern blot de la
integración de pAT217 en el gen vanC de BM4174.
\vskip1.000000\baselineskip
- (parte izquierda): ADN total de BM4175 (línea 2) y BM4174 (línea 3) digerido con EcoRI y resuelto por electroforesis sobre gel de agarosa a 1%. El ADN del bacteriófago lambda digerido con PstI se utilizó como estándar de peso molecular (línea 1). El ADN se transfirió bajo vacío sobre una membrana Nytran (Schleicher y Schül, Alemania) utilizando un aparato tipo Trans-Vac TE80 (Hôfer Scientific Instruments, San Francisco, CA) y unido a la membrana por medio de una luz UV. La hibridación se realizó con la sonda C (Middle) o la sonda aphA-3 específica de pAT114 (Lambert et al, 1985, Annales de l'Institut Pasteur/Microbiol. 136 (b): 135-150).
- (parte derecha): las sondas se marcaron con el ^{32}P por translación de corte. Se indican los pesos moleculares (kb).
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 14: alineamiento de las secuencias de
aminoácidos deducidas de VanS a partir de E. faecium BM4147
y de PhoR y EnvZ de E. coli. Los números sobre la izquierda
se refieren a la posición del primer aminoácido en el alineamiento.
Los números sobre la derecha se refieren a la posición del último
aminoácido de la línea correspondiente. Se encuadran los
aminoácidos idénticos. Los punteados indican agujeros introducidos
para optimizar la similitud. Los trazos indican las posiciones de
los restos conservados de aminoácidos en otros HPK. Los residuos de
histidina en grueso en el resto 1 son sitios potenciales de
autofosforilación.
- Figura 15: alineamiento de las secuencias de
aminoácidos deducidas de VanR de E. faecium BM4147, OmpR y
PhoB de E. coli así como de CheY de Salmonela
typhimurium. Los números sobre la derecha indican la posición
del último aminoácido de la línea correspondiente. Los aminoácidos
idénticos se encuadran. Los punteados indican los agujeros
introducidos para optimizar las similitudes. Los residuos en
carácter grueso corresponden a los aminoácidos muy conservados en
los dominios efectores, de otros RR. El residuo aspártico 57 de CheY
fosforilado por la HPK asociada CheA.
El origen de los plásmidos utilizados se
presenta en la tabla siguiente.
| Cepas o plásmido | Fuente o Referencia |
| Escherichia Coli | |
| JM83 | Messing (1979) |
| AR1062 | Rambach y Hogness (1977) |
| JM103 | Hannshan (1983) |
| ST640 | Lugtenberg y Van Schijndel Van-Dam (1973) |
| Enterococcus faecium | |
| BM4147 | Leclercq et al (1988) |
| Plásmido pUC18 | Norrander et al (1983) |
| pAT213 | Brisson-Noël et al (1990) |
| pAT214 | descrito en este texto |
Enterococcus faecium BM4147 se cultivaron
hasta a la obtención de una densidad óptica (DO_{600}) de 0,7 en
500 ml de caldo corazón-cerebro (medio broth BHI).
La inducción se realizó con 10 \mug/ml de vancomicina (Eli Lilly
Indianapolis Ind). Las etapas posteriores se realizaron a 4ºC. Las
células fueron recuperadas por centrifugación durante 10 minutos a
6000 g, se lavan en un tampón TE (0,01 M TRIS-HC1,
0,002 M EDTA, pH 7,0) y se lisan con bolas de vidrio (100 \mum de
diámetro) en un aparato Braun durante 2 minutos. Los residuos
celulares fueron separados por centrifugación durante 10 minutos a
6000 g. Las membranas fueron recogidas por centrifugación durante 1
hora a 65.000 g y resuspendidas en 0,5 ml de tampón TE.
Se introdujeron plásmidos por transformación en
la cepa E. coli AR1062 preparada en forma de bolsa
bacteriana. Las bolsas bacterianas se recuperaron sobre gradientes
de sacarosa y se marcaron las proteínas con 50 \muCi de
[^{35}S] L-metionina (Amersham, Gran Bretaña)
según el método de Rambach y Hogness (1977, P.N.A.S. EE.UU., 74;
5041-5045).
Se pusieron en cultivo E. coli JM83 y
cepas derivadas en un medio BHI hasta la obtención de una densidad
óptica (DO_{600}) de 0,7, se lavan y se suspenden en un tampón
TE. Se trata la suspensión celular por ultrasonidos (fonólisis)
durante 20 segundos con dosis de 50 W en un aparato de fragmentación
de células en un aparato de ultrasonidos Branson B7 y las células
intactas fueron eliminadas por centrifugación durante 10 minutos a
6000 g. El líquido sobrenadante se ha fraccionado en fracciones
membranales y citoplásmicas por centrifugación durante 1 hora a
100.000 g.
Se separaron por SDS-PAGE las
proteínas de las fracciones bacterianas en geles de gradiente lineal
de poliacrilamida (7,5% - 15%) (Laemmli 1970, Nature 227:
680-685). Se realizó la electroforesis durante 1
hora a 200 V luego durante 3 horas a 350 V. Los geles fueron
coloreados con azul de Coomassie. Se separaron las proteínas de los
extractos en geles de 10% de poliacrilamida y se visualizaron por
autorradiografía.
Se separaron por SDS-PAGE las
proteínas de las fracciones membranales de un cultivo inducido de
E. faecium BM4147. El gel fue electrotransferido durante 1
hora a 200 mA sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno
(Immobilon Transfer, Millipore) utilizando un aparato de
transferencia (Electrophoresis Unit LKB 2117 Multiphor II) según
las recomendaciones del fabricante. Las proteínas transferidas
fueron coloreadas con rojo de Ponceau. Se cortó la porción de
membrana portadora de la proteína interesante, se centró sobre un
filtro de teflón y se colocó en el cartucho del bloque de un
secuenciador (Secuenciador Applied Biosystems modelo 470A). La
proteína fue secuenciada por la degradación automatizada de Edman
(1967, EUR. J. Biochem 1; 80-81).
El plásmido pAT213 (Brisson-Noël
et al, 1990, Antimicrob Agents chemother, 34;
924-927) consiste en un fragmento de ADN
EcoRI de 4,0 kb del plásmido pIP816 de enterococo clon en el
sitio EcoRI de un vector transportador Gram positivo gram
negativo pAT187 (Trieu-Cuot et al, 1987, FEMS
Microbiol Lett 48; 289-294). Para construir pAT214,
se purificó el fragmento de ADN de 1761 bp EcoRV-SacII
de pAT213, se trató con el fragmento de Klenow del ADN polimerasa I
de E. coli y se ligó con el ADN de pUC18 previamente digerido
con SmaI y desfosforilado (figura 2). La clonación (Maniatis
et al, 1982 Cold Spring Harbor Laboratory Press) se realizó
con endonucleasas de restricción (Boehringer Mannheim y Pharmacia)
con la ligasa ADN T4 (Pharmacia) y la fosfatasa alcalina
(Pharmacia) según las recomendaciones del fabricante.
Se subclonan los fragmentos de ADN de
restricción en el polilinker de las formas de replicación de los
derivados mpl8 y mpl9 del bacteriófago M13 (Norrander et al,
1983, Gen 26; 101-106), obtenidos a través de
Pharmacia P-L Biochemicals. Se transfectó E.
coli JM103 con bacteriófagos recombinantes y se preparó el ADN
de hebra sencilla. El secuenciado de nucleótidos fue realizado por
el método enzimático de los di-desoxi nucleótidos
(Sanger et al, 1977, P.N.A.S EE.UU. 74;
5463-5467) utilizando un ADN T7 polimerasa
(Sequenase, United States Biochemical Corporation, Cleveland Ohio)
y de [\alpha^{35}S] dATP (Amersham, Gran Bretaña). Los productos
de las reacciones se revelaron en geles de poliacrilamida que
contienen un tampón desnaturalizador a 6%.
Se ensambló la secuencia de ADN completa
utilizando los programas de ordenador DBCOMP y DBUTIL (Staden, 1980,
Nucleic Acids Res 8; 3673-3694). Se cribó el banco
de datos de proteínas, PSEQIP del Instituto Pasteur utilizando un
algoritmo desarrollado por Claverie (1984, Nucleic Acids Res 12;
397-407). Se construyeron las alineaciones entre
pares de secuencias de aminoácidos utilizando el algoritmo de Wilbur
et al (1983, P.N.A.S EE.UU. 80; 726-730). Se
evaluó el significado estadístico de la homología con el algoritmo
de Lipman y Pearson (1985, Science 227;
1435-1440).
Para cada comparación se utilizaron 20
secuencias de aminoácidos para calcular las medias y las
desviaciones estándares de los resultados aleatorios.
Se introdujeron los plásmidos por transformación
en E. coli ST640, un mutante sensible a la temperatura con
una ligasa no modificada
D-ala-D-ala
(Lugtenberg et al 1973, J. Bacteriol 110;
26-34). Se seleccionaron los transformantes a 30ºC
sobre placas que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y se
verificaron la presencia del ADN plásmido del tamaño buscado y los
mapas de restricción. Se colocaron colonias únicas desarrolladas a
30ºC en un medio de BHI broth que contenía la ampicilina a la vez
sobre un medio de agar BHI que contenía 100 \mug/ml de ampicilina
y en 50 \muM de
isopropilo-1-tio-\beta-D-glacto-piranosido
(IPTG) y se incubaron las placas a una temperatura permisiva de
30ºC o no permisiva de 42ºC. El ensayo de complementación se
consideraba como positivo si las colonias estuvieran presentes
después de las 18 horas de incubación a 42ºC.
Se analizaron por SDS-PAGE las
fracciones membranales de los E. faecium BM4147 puestas en
cultivo por una parte en condiciones de inducción, y por otra parte
en ausencia de inducción. La única diferencia detectable asociada
con la exposición a concentraciones sub-inhibidoras
de vancomicina fue la intensificación marcada de una banda que
corresponde a una proteína de peso molecular estimado de
aproximadamente 40 kDa. En las células inducidas y en las células
no inducidas, la banda proteica representa la misma proteína puesto
que esta banda está ausente de las membranas de un derivado de
BM4147 que perdió el plásmido pIP816. La proteína inductible,
designada por VanA se purificó después de SDS-PAGE y
se realizó una degradación automatizada de Edman sobre una muestra
de 50 pmol. Se identificaron nueve aminoácidos de la secuencia
N-terminal de VanA: Met Asn Arg Ile Lys Val Ala Ile
Leu.
El inserto de 4,0 kb del plásmido pAT213 lleva
el determinante de la resistencia a los glicopéptidos de E.
faecium BM4147. Se subclonaron distintos fragmentos de
restricción de este inserto en pUC18 y se identificaron por
análisis SDS-PAGE los plásmidos recombinantes
específicos de vanA en E. coli de las proteínas de las
fracciones citoplásmicas y membranales o de los extractos de bolsas
bacterianas. Se utilizó esta aproximación ya que E. coli es
intrínsecamente resistente al glicopéptido. El inserto
EcoRV-SacII del plásmido pAT214 (figura 2) codifica
para un único polipéptido de 40 kDa que emigra conjuntamente con
VanA, procedente de las preparaciones membranales de E.
faecium BM4147.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del
inserto EcoRV-SacII de 1761 bp en pAT214 sobre las dos
hebras del ADN según la estrategia descrita a la figura 2. La
localización de los codones de terminación (TGA, TAA, TAG) en tres
marcos de lectura sobre cada hebra de ADN mostró la presencia de un
único marco de lectura abierto (ORF) que tenía un tamaño suficiente
para codificar para la proteína VanA. Este marco de lectura ORF se
localiza entre el codón TAA en posición 281 y el codón TAG en
posición 1406. La secuencia de aminoácidos deducida de ORF se
comparó con la del extremo N-terminal de VanA. Los
nuevos aminoácidos identificados por el secuenciado proteico se
codifican por la secuencia de nucleótidos que comienza con el codón
ATG (metionina) en posición 377 (figura 3). Este codón de
iniciación de traducción está precedido por una secuencia
(TGAAAGGAGA), característica de un sitio de enlace con el ribosoma
(RBS) de bacterias Gram positivos que son complementarias para las 8
bases del ARNr de la subunidad 16S de Bacillus subtilis en
su parte (3' OH UCUUUCCUCC 5') (Moran et al, 1982, Mol Gen.
Genet. 186; 339-346). En este marco ORF, no hay otro
codón de iniciación ATG o GTG entre las posiciones 281 y 377. La
secuencia de 1029 bp que se extiende del codón ATG en posición 377
al codón TGA en posición 1406 codifica para una proteína que
contiene 343 residuos de aminoácidos. El peso molecular calculado de
esta proteína es de 37400 Da lo que estaría de acuerdo con la
estimación de 40 kDa obtenido por el análisis
SDS-PAGE.
El cribado del banco de datos de proteínas,
PSEQIP mostró la existencia de una homología de secuencias entre
VanA y las ligasas
D-Ala-D-Ala de E.
coli (ECOALA, Robinson et al, 1986, J. Bacteriol 167;
809-817) y de Salomella typhimurium (DALIG,
Daub et al, 1988, Biochemistry 27;
3701-3708). El porcentaje de similitud calculado por
pares de proteínas está comprendido entre 28% y 36% para los
aminoácidos idénticos y entre 48% y 55% teniendo en cuenta los
aminoácidos homólogos. VanA y DALIG están más estrechamente
vinculados. El significado estadístico de estas similitudes se
evaluó alineando VANA y secuencias que contenían la misma
composición de aminoácidos que DALIG o ECOALA (Lipman y Pearson,
1985, Science 227; 1435-1440).
La cepa E. coli ST640 es un mutante
termosensible que presenta una actividad ligasa
D-ala-D-ala
deficiente (Lugtenberg et al, 1973, J. Bacteriol 113:
96-104). Los plásmidos pUC18 y pAT214 fueron
introducidos por transformación en E. coli ST640. Las cepas
ST640 y ST640 (pUC18) se desarrollaron solamente normalmente a la
temperatura permisiva (30ºC) mientras que E. coli ST640
(pAT214) se desarrolló a la vez a la temperatura permisiva y a la
temperatura no permisiva (42ºC).
Este ensayo pone de manifiesto que VANA se
vincula funcionalmente con el
D-Ala-D-Ala ligasas
en E. coli y es probablemente capaz de catalizar la misma
reacción de ligación que DALIG.
Se clonaron los fragmentos de restricción de
pIP816 (Tra^{-}, Mob^{+}, Vm^{r}) en derivados del vector
pAT29 que constituye un vector transportador entre las bacterias
Gram positivoss y gram negativos (oriR pAM\beta1, oriR pUC, oriT
RK2, spc, lacZ\alpha) (Trieu-Cuot et al,
1990, Nucleic Acids Res. 18: 4296). Este vector fue
construido por los inventores y utilizado para transformar la cepa
E. coli JM103 (\Delta(lac-proAB),
supE, thi, strA, sbcB15, endA, hspR4, F traD36, proAB, LacIq,
lacZ\DeltaM15) (Messing et al, 1983, Methods Enzymol.
101: 20-78). El ADN plásmido fue preparado
por un protocolo de lisis alcalina de pequeña escala (Sambrook
et al, 1982, Molecular cloning, a laboratorio manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY) e introducido por
electrotransformación (Cruz-Rodz A. L. et al,
- 1990, Mol Gen. Genet. 224: 152-154) en
E. faecalis JH2-2 (Fus^{R}, Rif^{R})
(Jacob A.E. et al, 1974, J. Bacteriol. 117:
360-372), utilizando un aparato Gene Pulser
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, California). Los
perfiles de restricción de los plásmidos purificados a partir de
E. faecalis y de E. coli se compararon para detectar
eventuales cambios de ADN.
El plásmido integrativo pAT113 (Mob^{+},
Em^{R}, Km^{R}, oriR PACYC184, attTn1545, LacZ\alpha)
(Trieu-Cuot et al, Gene 106:
21-27) lleva los extremos juntos al transposón
Tn1545. Este vector no se replica en las bacterias Gram positivoss
sino se integra al cromosoma del huésped por recombinación ilegítima
mediada por la integrasa de Tn1545 o de Tn916
(Trieu-Cuot et al citado anteriormente). Los
plásmidos integrativos fueron introducidos por
electrotransformación en E. faecalis BM4148 (cepa
0JH2-2::Tn916). Se modifica esta cepa por el
transposón Tn916 descrito por Franque A. E. et al (1981, J.
Bacteriol. 145: 494-502).
Los cultivos se realizaron en un caldo
corazón-cerebro (BHI - Brain Heart Infusion Broth) o
sobre agar a 37ºC. El método de Steers et al (Antibiot.
Chemother. Basel. 9: 307-311) fue utilizado
para determinar las concentraciones mínimas de inhibición (MICs) de
los antibióticos sobre un medio gelosado
Mueller-Hinton agar.
La separación del ADN con endonucleasas de
restricción (Boehringer Manheim and Pharmacia), la purificación de
los fragmentos de ADN de restricción a partir de geles de agarosa,
la conversión de los extremos cohesivos en extremos completos con
el fragmento de Klenow del ADN polimerasa I de E. coli
(Boehringer Manheim), la desfosforilación de los extremos del ADN
con la fosfatasa intestino de ternera (Boehringer Manheim), la
ligadura de los fragmentos de ADN con el T4 DNA ligasa (Amersham)
se realizaron según los métodos normales de Sambrook et al
(1982, Molecular Cloning, a laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory. Cold Spring Harbor NY).
El origen de los vectores y de los insertos
utilizados para los plásmidos recombinantes construidos aquí es el
siguiente:
- (i)
- se insertó vector pAT78 para el reconocimiento de promotor: el ADN amplificado del gen cat de cloranfenicol acetil-transferasa del plásmido pC194 de Staphylococcus aureus (Horinouchi et al, 1982, J. Bacteriol. 150: 815-825) entre los sitios de restricción PstI y SphI del vector transportador pAT29. La amplificación por la reacción de polimerización en cadena se efectuó por medio de los cebadores A1 y A2 que fueron sintetizados por el método de metoxi fosforamidita (Mabilat et al, 1990, Plasmid 23: 27-34). La secuencia del cebador A1 (5' GCTGCAGA-TAAAAATTTAGGAGG) está formada por un sitio de reconocimiento PstI (subrayado) y de 18 bases (posiciones 6 a 23) de pC194 que incluyen el sitio de enlace al ribosoma (RBS; AGGAGG posiciones 18 a 23) del gen cat. La secuencia del cebador A2 (5' CGCATGCTATTATAAAA GCCAGTC) contiene el sitio de escisión SphI (subrayado) y es complementaria (posiciones 8 a 24) a 17 bases de el extremo 3' del gen cat. El triplete ATT en las posiciones 9 a 11 corresponde al codón STOP TAA de cat. Los fragmentos de ADN amplificados con los cebadores A1 y A2 consisten, por lo tanto, en una fase abierta de lectura (orf) y en un sitio de enlace al ribosoma para CAT (posiciones 1234 a 1912 según la numeración de Horinouchi et al (1982, J. Bacteriol. 150: 815-825) flanqueados por los sitios PstI y SphI. La posición 1234 se localiza en el interior del bucle de la estructura secundaria del ARNm que bloquea la traducción en ausencia de cloranfenicol. Así la secuencia amplificada no contiene el promotor cat ni la secuencia complementaria del RBS que es esencial para la regulación de traducción Ambulos, N. P. et al, 1984, Gen 28: 171-176).
- (ii)
- vector de expresión pAT79: se insertó el fragmento de 243 bp ClaI-BssHII portador del promotor P2 del gen aphA-3 del plásmido de enterococo pJHl (Caillaud et al, 1987, Mol Gen. Genet. 207: 509-513) entre los sitios de restricción EcoRI y SacI de pAT78.
- (iii)
- plásmido pAT80 y sus derivados: se insertó el fragmento de 5,5 kb BgIII-XbaI de pIP816 entre los sitios BamHI y XbaI de pAT78. El plásmido resultante denominado por pAT80 ha sido digerido parcialmente con HincII y se ligó con el fragmento EcoRV que contiene un gen que pertenece al gen apha-I del transposón Tn903 (Oka A. et al, 1981, J. Mol Biol. 147: 217-226). Este fragmento contiene el gen aphA-I que codifica para el 3' aminoglicósido fosfotranferasa del tipo I que confiere la resistencia a la kanamicina. La inserción de aphA-I se realizó en tres sitios diferentes en pAT80, generando los plásmidos pAT81, pAT83 y pAT85. Se insertaron los casetes BamHI y EcoRI que contiene aphA-I en los sitios BamHI (para formar el plásmido pAT84) y EcoRI (para formar el plásmido pAT82) de pAT80.
- (iv)
- plásmido pAT86, pAT87, pAT88 y pAT89: se construyó el plásmido pAT86 por clonación del fragmento de 2,803 bp, EcoRI-SacII de pAT80 codificadora para VanH y VanA, a nivel de un sitio SmaI de pAT79. Se obtuvo pAT87 insertando el fragmento de 3,4 kb EcoRI-XbaI de pAT80 aguas arriba del gen cat del vector de detección de promotor pAT78. El plásmido pAT88 resultaba de la ligadura de pAT78 digerido con EcoRI y BamHI con el fragmento EcoRI-BamHI de 1,731 bp de pAT80. Se insertó el fragmento BgIII-AccI (posiciones 1 a 2356) de pAT80 en el polilinker del vector integrativo pAT113, que genera pAT89.
Se subclonaron los fragmentos de ADN de
restricción en un polilinker de derivados replicativos del
bacteriófago M13, siendo estos derivados denominados mp18 y mp19
(Norrander et al, 1983, Gen 26:
101-106). Se transfectó E. coli JM103 con
los fagos recombinantes y se preparó un ADN de hebra sencilla. El
secuenciado de los nucleótidos se realizó según las condiciones
descritas por Sanger et al (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
1977 74: 5463-5467) utilizando la polimerasa
de ADN T7 modificada (Sequenase, EE.UU., Biochemical Corporation
Cliveland OH) y [\alpha-35S] dATP (Amersham). Los
productos de las reacciones se solucionaron sobre geles de
gradientes en un tampón de poliacrilamida al 6%.
Se cultivaron los derivados
JH2-2 de E. faecalis a una densidad óptica
OD_{600} de 0,7 en un medio BHI broth completado con
espectinomicina (300 \mug/ml). Se trataron las células con una
lisozima, lisada por sonicación y se centrifugaron los residuos
celulares durante 45 minutos a 100.000 g según la descripción de
Courvalin et al (1978, Antimicrob. Agents Chemother.
13: 716-725). Se midió la formación de
5-tio-2-nitrobenzoato
a 37ºC en presencia y en ausencia de cloranfenicol y la actividad
CAT específica fue expresada en micromoles por minutos y por
miligramo de proteínas (Shaw et al, 1975, Methods Enzymol.
43: 737-755).
Se clonaron los genes vanH y vanA de pIP816 en
un plásmido pAT79 bajo el control del promotor heterólogo P2
(Caillaud et al, 1987, Mol Gen. Genet.
207:509-513) y el plásmido pAT86 formado no
confería a la cepa E. faecalis JH2-2 la
resistencia a la vancomicina. Por lo tanto, estos genes no son
suficientes para la síntesis de peptidoglicano en ausencia del
antibiótico. Se clonaron distintos fragmentos de restricción de
pIP816 en el vector pAT78. El fragmento BgIII-XbaI de
5,5 kb de pAT80 es el más pequeño fragmento obtenido que confería la
resistencia a la vancomicina.
Se determinó la secuencia del inserto en pAT80
sobre las dos hebras de ADN a partir del sitio BgIII hasta
el codón de iniciación de traducción ATG de VanH. Se puso de relieve
dos fases abiertas de lectura (orf) en el interior de la secuencia
de 2475 bp: la primera fase abierta de lectura se extiende del
nucleótido 386 al nucleótido 1123; en posición 431 se encuentra una
secuencia característica de las secuencias RBS de bacterias Gram
positivoss, 6 pares de base aguas arriba del codón de iniciación de
traducción ATG (TGAAAGGGTG); los otros codones de
iniciación de traducción en esta orf no van precedidos de este tipo
de secuencia. La secuencia de 693 bp a partir del codón ATG al
nivel 431 hasta el codón TAA en la posición 1124 es susceptible de
codificar para una proteína de 231 aminoácidos con un peso
molecular de 26,612 Da y que se designa por VanR.
Para la segunda fase abierta de lectura (del
nucleótido 1089 al nucleótido 2255) la secuencia de aminoácidos
deducida a partir del primer codón de iniciación en fase (TTG en
posición 1104) codificaría para una proteína de 384 aminoácidos que
tienen un peso molecular de 43,847 Da y designada por VanS. Los
codones TTG en posición 1116 y ATG en posición 1164 son codones de
iniciación de traducción en fase precedida por secuencias con una
baja complementariedad con la terminación 3' OH de la subunidad 16S
del DNA de B. subtilis
(GGGGGGTTGG-N8-TTG y
AGAACGAAAA-N6-ATG
respectivamente).
Entre el último codón de vanS y el codón de
iniciación de traducción ATG de vanH se observa una secuencia de
217 bp que contiene una secuencia invertida repetida de 17 bp. Esta
secuencia no funciona como un terminador de transcripción
fuerte.
La comparación de las secuencias obtenidas con
bases de datos puso de manifiesto que los restos de aminoácidos
conservados identificados por Stock et al (1989, Microbiol.
Revolución. 53: 450-490) en el dominio
quinasa de 16 HPK (Histidine Protein Kinase) se detectaban en la
parte C-terminal de VanS. VanS presenta dos grupos
de aminoácidos hidrófobos en la región N-terminal.
El residuo Histidina 164 de VanS se alinea con el residuo His216 de
PhoR (Makino et al, 1986, J. Mol Biol. 192:
549-556) y His 243 de EnvZ (Comeau et al,
1985, 164: 578-584) que son sitios presuntos
de autofosforilación en estas proteínas.
De la misma forma los aminoácidos 1 a 122 de
VanR presentan similitudes con los dominios efectores de reguladores
de respuesta RR (Response Regulators). El ácido aspártico 53 de
VanR podría ser un sitio de fosfosrilación puesto que este residuo
se alinea con Asp 57 de Che Y que se fosforila por HPK asociado a
CheA y corresponde a una posición invariable en otras proteínas de
tipo RR (Stock et al citado anteriormente). VanR podría
pertenecer a la subclase OmpR-PhoB de RR que activa
la iniciación de transcripción mediada por el ARN polimerasa que
incluye el factor \sigma70S de E. coli (Stock et al
citado anteriormente).
Casetes de resistencia al kanamicina insertados
en el grupo de genes van, en el plásmido pAT80 mostraron esto: la
inserción en vanR suprime la resistencia a la vancomicina y al
cloranfenicol; VanR es un activador de transcripción necesario para
la expresión de los genes de resistencia a la vancomicina. La
inactivación de vanS conduce a una reducción de dos veces la
concentración mínima inhibidora (MIC) de cloranfenicol y a una
reducción de tres veces de la actividad CAT específica pero la
concentración mínima inhibidora de la vancomicina se mantiene sin
cambio. Por lo tanto, VanS es necesario para obtener un alto nivel
de transcripción de los genes de resistencia a la vancomicina
aunque no sea requerido para la expresión del fenotipo de
resistencia a la vancomicina.
Derivados de pAT80 que llevan insertos en vanH
(pAT83), vanA (pAT84) o en la región de 1,0 kb aguas abajo de vanA
(pAT85), permitieron obtener una resistencia al cloranfenicol pero
no a la vancomicina. Este fenotipo disociado corresponde a la
inactivación de genes codificadores para enzimas que sintetizan los
precursores depsipeptídicos necesarios para el montaje de las
paredes bacterianas en presencia de vancomicina.
Aguas abajo del gen vanA, se puso en evidencia
al nivel de una secuencia de 365 bp después del codón TGA de vanA y
antes del sitio SacII, la presencia de un orf inactivado en
pAT85 y que contiene un codón de iniciación ATG en fase, precedido
de una secuencia RBS-like. Esta secuencia codifica
para una proteína necesaria para la resistencia al glicopéptido,
designada por VanX y que comprende como máximo 330 aminoácidos
aproximadamente.
Se introdujo el plásmido integrativo pAT89
codificador para VanR y VanS en el cromosoma de E. faecalis
BM4138. El plásmido pAT87 portador de los genes vanH, vanA y vanX
clonados aguas arriba del gen cat desprovisto de promotor de
pAT78, confirió la resistencia a la vancomicina a esta cepa pero no
a E. faecalis JH2-2. El nivel de expresión
del gen cat de pAT87 en las cepas BM4138::pAT89 y
JH2-2 indicó que VanR activa la transcripción del
gen receptor localizado en el extremo 3' del grupo de genes Van. Se
observaron unos niveles similares de síntesis CAT para pAT88 que
lleva una fusión de transcripción entre las partes 5' de vanA y el
gen cat. Estos resultados ponen de manifiesto que en E.
faecalis BM4138::pAT89 (pAT87) VanR y VanS codificados por el
cromosoma activan en trans la transcripción de vanA, vanH y vanX de
pAT87 permitiendo la obtención de una resistencia a la
vancomicina.
Por otra parte, se destacó que la expresión del
gen era esencialmente constitutiva cuando vanR y vanS se llevaban
por un plásmido multicopia pAT80 y débilmente inductible por la
vancomicina cuando los genes para las proteínas de regulación
estaban presentes sobre el cromosoma del huésped.
La proteína VanA necesaria para la expresión de
un alto nivel de resistencia a los glicopéptidos en E.
faecium BM4147 comparte alrededor de 28 a 36% de similitud en
aminoácidos con las ligasas
D-Ala-D-Ala de E.
coli pero posee una especificidad de substratos diferente de la
de estas ligasas. Se seleccionaron péptidos designados por 1 y 2
que se conservan en las secuencias de las ligasas Ddla y DdlB
(Zawadzke, 1991 Biochemistry 30: 1673-1682)
de E. coli y en la proteína VanA para sintetizar los
cebadores universales destinados a amplificar fragmentos internos
de genes codificadores para
D-Ala-D-Ala ligasas
o enzimas emparentadas. Los péptidos diana GEDG (S/T)
(I/L)QG y NT (I/L) se tradujeron a cambio tal como muestra la
figura IV. 1, para obtener oligonucleótidos degenerados V1 y V2.
Como los péptidos 1 y 2 de VanA, Ddela y DdlB se separan por
secuencias de aminoácidos de longitud similar, el tamaño predicho
para el producto de amplificación era de alrededor de 640 bp.
Una amplificación por PCR con el ADN de E.
coli JM83 y de E. faecium BM4147 condujo a ampliar
productos que corresponden al tamaño esperado, que se purificaron a
continuación y se clonaron en el bacteriófago M13mp10 (Norrander
et al, 1983, Gen 26: 101-106). El
secuenciado del inserto obtenido con E. coli JM83 indicó que
el producto de PCR era un fragmento interno de ddla. Se utilizó una
sonda generada a partir de un fago recombinante obtenido con el
fragmento de amplificación de BM4147 para el análisis Southern de un
ADN de BM4147 y BM4147-1 que es un derivado de
BM4147 sensible a la vancomicina y que está desprovisto del plásmido
pIP816 (Leclercq et al, 1988, N. Engl. J. Med. 319:
157-161). La sonda hibridaba con el fragmento de ADN
EcoRI de 4 kb de BM4147 pero no con el ADN de E.
faecium BM4147-1. Como el gen vanA se lleva por
el fragmento EcoRI de 4 kb de pIP816, estos resultados
indican que los cebadores permiten también la amplificación de una
parte de vanA. Así, los oligonucleótidos V1 y V2 pueden amplificar
fragmentos de genes codificadores para distintas proteínas
emparentadas con la
D-Ala-D-Ala ligasas,
y esto en especies diferentes.
Se realizó una amplificación por PCR sobre el
ADN total de E. gallinarum BM4174 y el producto de
amplificación obtenido, de aproximadamente 640 bp se clonó en el
bacteriófago M13mp10. Se utilizó el ADN de hebra sencilla aislado a
partir del fago recombinante para construir una sonda C (Hu et
al, 1982, Gen 17: 2171-2177). En
análisis Southern la sonda hibridaba con un fragmento PstI de
1,7 kb de BM4174 pero no con el ADN de BM4147 y
BM4147-1.
BM4147-1.
El ADN de BM4174 ha sido digerido con
PstI y algunos fragmentos de 1,5 y 2 kb fueron purificados
por electroforesis sobre gel de agarosa y se clonaron en pUC18
(Norrander et al, 1983, citado anteriormente). Los plásmidos
recombinantes fueron introducidos en E. coli JM83 por
transformación y se tamizaron por hibridación sobre colonias
(Sambrook et al, 1989, Molecular cloning, a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY) utilizando la sonde C. Se detectó una homología con un
transformante hospedador de un plásmido, denominado pAT216, que
contenía un inserto PstI de 1,7 kb. La secuencia de la parte
de 1347 bp SacI-PstI del inserto de pAT216 se puso en
evidencia sobre las dos hebras de ADN. La localización de los
codones de terminación en los tres marcos de lectura de cada hebra
de ADN reveló la presencia de una fase ORF localizada entre los
codones TGA en las posiciones 47 y 1244. El codón de iniciación de
transcripción ATG en posición 215 está precedido por una secuencia
GAAAGGAAGA característica de las secuencias RBS
complementaria del ARN de la subunidad 16S de B. subtilis
(Moran et al, 1982, Mol Gen. Genet. 186:
339-346). La secuencia de 1029 bp que se extiende
del codón ATG en posición 215 al codón TGA en posición 1244 podría
codificar una proteína de 343 aminoácidos que tiene un peso
molecular calculado de 37504 Da designada por VanC. Se detectó una
similitud de secuencia entre VanC, VanA y las ligasas
D-Ala-D-Ala de E.
coli. En particular cuatro dominios de mucha homología
previamente encontrados entre VanA y las
D-Ala-D-Ala ligasas
de enterobacterias están también presentes en VanC. El porcentaje
de aminoácidos idénticos calculado para estas proteínas tomadas de
dos en dos era entre 29 y 38%. El alineamiento de las cuatro
secuencias reveló la presencia de 57 aminoácidos invariantes que
incluyen los residuos conservados de los péptidos 1 y 2 utilizados
para definir las sondas oligonucleótidos V1 y V2.
Para evaluar la contribución de vanC a la
resistencia a la vancomicina en E. gallinarum BM4174, el gen
vanC fue inactivado por inserción. Se clonó un fragmento de 690 bp
EcoRI-HincII, interno a vanC en pAT114 que no
se replica en las bacterias Gram positivos. Se introdujo el plásmido
pAT217 resultante en BM4174 por electrotransformación
(Cruz-Rodz et al, 1990, Mol Gen. Genet.
224: 152-154) y se seleccionaron los clones
supuestos resultantes de una recombinación homóloga que conducen a
la integración de pAT217 en vanC sobre eritromicina. Se comparó el
clon BM4175 a BM4174 por hibridación Southern utilizando la sonda C
y aphA-3 específica de pAT114. Las dos sondas
hibridaban con el fragmento EcoRI de 8,6 kb de BM4175. La
sonda C hibridaba con un fragmento de 2,5 kb de BM4174 mientras que
no se observaba ninguna señal con la sonda aphA-3. Los
resultados indican que el plásmido pAT217 de 6,1 kb se integró en
el gen vanC. La determinación de la concentración mínima
inhibidora de vancomicina para BM4174 (16 mg/l) y BM4175 (2 mg/l)
indicó que la inactivación por inserción en vanC suprime la
resistencia a la vancomicina.
Por lo tanto, VanC es requerido para la
resistencia a la vancomicina. Se puede, por lo tanto, pensar que
esta proteína sintetiza un dipéptido o un depsipéptido que se
incorpora en los precursores de péptido-glicanos y
no es reconocido por la vancomicina.
Las secuencias que son objeto de la invención se
dan en las páginas siguientes después de la lista las secuencias
que contiene la descripción de estas secuencias. En la lista de las
secuencias, las proteínas se identifican con respecto a la posición
de las bases de nucleótidos que corresponden a los aminoácidos de
los extremos de las proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
(contenidas en las secuencias I
(Ia, Ib), se presentan a continuación o en la secuencia de la figura
5).
SEQ ID NO 1 (VanH): secuencia de la
primera proteína de resistencia, que corresponde a la secuencia de
aminoácidos de la fase de lectura abierta nº 3, que comienza en la
base 3501 y que termina en la base 4529, que contiene la secuencia
codificadora del gen vanH entre las bases 3564 y 4529, con respecto
a la secuencia de la figura 5 o que corresponde a la secuencia entre
las posiciones de los nucleótidos 6018 y 6983 de la secuencia
Ia.
SEQ ID NO 2 (VanA): secuencia de la
proteína VanA, que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la
fase de lectura abierta nº 1, que comienza en la base 4429 y que
termina en la base 5553, con respecto a la secuencia de la figura 5
o que corresponde a la secuencia entre las posiciones de los
nucleótidos 6977 y 7807 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 3 (VanX): secuencia de la
tercera proteína de resistencia, que corresponde a la secuencia de
aminoácidos de la fase de lectura abierta nº 3, que comienza en la
base 5526 y que termina en la base 6167, con respecto a la secuencia
de la figura 5 o que corresponde a la secuencia entre las posiciones
de los nucleótidos 7816 y 8621 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 4 (VanR): secuencia de la
proteína de regulación R, que corresponde a la secuencia de
aminoácidos de la fase de lectura nº 1, que comienza en la base 1477
y que termina en la base 2214, con respecto a la secuencia de la
figura 5 o que corresponde a la secuencia entre las posiciones de
los nucleótidos 3976 y 4668 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 5 (VanS): secuencia de la
proteína sensor S, que corresponde a la secuencia de aminoácidos de
la fase de lectura abierta nº 2, que comienza en la base 2180 y que
termina en la base 3346, con respecto a la secuencia de la figura 5
o que corresponde a la secuencia entre las posiciones de los
nucleótidos 4648 y 5800 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 16: secuencia de la transposasa
que corresponde a los aminoácidos comprendidos entre los nucleótidos
150 y 3112 de la secuencia Ib.
SEQ ID NO 17: secuencia de la resolvasa
que comprende los aminoácidos situados entre las posiciones de
nucleótidos 3187 y 3759 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 18: secuencia VanY que
comprende los aminoácidos situados entre las posiciones de los
nucleótidos 9046 y 9960 en la secuencia Ia.
SEQ ID NO 19: secuencia VanZ que
comprende los aminoácidos situados entre las posiciones de los
nucleótidos 10116 y 10598 en la secuencia Ia.
SEQ ID NO 20: secuencia VanC de
aminoácidos representada en la lista II.
\newpage
SEQ ID NO 6: secuencia de nucleótidos que
contiene la secuencia codificadora para las 5 proteínas, así como
las secuencias flanqueantes representada en la figura 5.
SEQ ID NO 7: secuencia que contiene la
secuencia codificadora para las 3 proteínas de resistencia, así como
las secuencias flanqueantes y que comienza en la base 3501 y que
termina en la base 6167, representada en la figura 5.
SEQ ID NO 8: secuencia del gen Van A, que
comienza en la base 4429 y que termina en la base 5553, de la
secuencia presentada en la figura 5, o que corresponde a la
secuencia de nucleótidos situada entre los nucleótidos 6977 y 7807
de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 9: secuencia codificadora para
la primera proteína de resistencia denominada VanH, que comienza en
la base 3501 y que termina en la base 4529, en particular en la
secuencia vanH cuya secuencia codificadora se localiza entre las
bases 3564 y 4529, de la secuencia presentada en la figura 5, o que
corresponde a la secuencia de nucleótidos situada entre los
nucleótidos 6018 y 6983 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 10: secuencia codificadora para
la tercera proteína de resistencia VanX, que comienza en la base
5526 y que termina en la base 6167, de la secuencia presentada en la
figura 5, o que corresponde a la secuencia de nucleótidos situada
entre los nucleótidos 7816 y 8621 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 11: secuencia del transposón
codificadora para la transposasa, la resolvasa, VanR, VanS, VanH,
VanA, VanX, VanY y VanZ y que contiene la secuencia invertida
repetida de 38 pb en sus extremos N- y C-terminales,
y que corresponde a la secuencia Ia.
SEQ ID NO 12: secuencia codificadora para
la transposasa, que comienza en la base 150 y que termina en la base
3112 de la secuencia Ib.
SEQ ID NO 13: secuencia codificadora para
la resolvasa, que comienza en la base 3187 y que termina en la base
3759 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 14: secuencia codificadora para
VanY que comienza en la base 9046 y que termina en la base 9960 de
la secuencia Ia.
SEQ ID NO 15: secuencia codificadora para
VanZ que comienza en la base 10116 y que termina en la base 10598 de
la secuencia Ia.
SEQ ID NO 21: secuencia codificadora para
VanC, representada en la lista II en correspondencia con la proteína
VanC.
SEQ ID NO 22: secuencia completa Ia del
transposón de E. faecium que comienza en la base 1 y que
termina en la base 10851.
SEQ ID NO 23: secuencia codificadora para
la proteína VanR, que comienza en la base 3976 y que termina en la
base 4668 de la secuencia Ia.
SEQ ID NO 24: secuencia codificadora para
la proteína VanS, que comienza en la base 4648 y que termina en la
base 5800 de la secuencia Ia.
- I.
- Secuencia de nucleótidos del transposón y traducción.
- Ia.
- hebra "+"
Claims (18)
1. Proteína purificada necesaria para la
expresión o para la regulación de la resistencia a los antibióticos
de la familia de los glicopéptidos, caracterizada porque
tiene una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias de
aminoácidos identificadas en la lista las secuencias por SEQ ID NO 1
(VanH), SEQ ID NO 3 (VanX), SEQ ID NO 20 (VanC), SEQ ID NO 4 (VanR)
o SEQ ID NO 5 (VanS).
2. Composición de polipéptidos que forman un
complejo de resistencia a los antibióticos, caracterizada
porque está formada por la asociación de las proteínas según la
reivindicación 1, designadas por SEQ ID NO 1 (VanH) y SEQ ID NO 3
(VanX) y de la proteína designada por SEQ ID NO 2 (VanA).
3. Composición de polipéptidos que forman un
complejo de resistencia a los antibióticos, caracterizada
porque está formada por la asociación de las proteínas según la
reivindicación 1 designadas por SEQ ID NO 1 (VanH), SEQ ID NO 20
(VanC) y SEQ ID NO 3 (VanX).
4. Secuencia de nucleótidos caracterizada
porque consiste en:
- a.
- uno de los encadenamientos de nucleótidos identificados en la lista siguiente de secuencias: SEQ ID NO 9 (vanH) y SEQ ID NO 10 (vanX);
- b.
- una secuencia codificadora de un gen, que hibrida en condiciones de astringencia con una secuencia complementaria de uno de los encadenamientos identificados en a., en cuanto permite la detección de cepas resistentes a los antibióticos de la familia de los glicopéptidos;
- c.
- uno de los encadenamientos de nucleótidos identificados en la lista siguiente de secuencias: SEQ ID NO 21 (vanC), SEQ ID NO 23 (vanR), o SEQ ID NO 24 (vanS); o,
- d.
- un fragmento de las secuencias identificadas en a. o c., que permite la detección de cepas resistentes a los antibióticos de la familia de los glicopéptidos.
5. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 4, caracterizada porque tiene uno de los
siguientes encadenamientos:
6. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 4, caracterizada porque se trata de una
secuencia de ADN complementaria o de una secuencia de ARN.
7. Secuencia de nucleótidos recombinante,
caracterizada porque se trata de una secuencia de nucleótidos
según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, bajo el control
de elementos de regulación susceptibles de intervenir en la
expresión de la resistencia a los antibióticos de la familia de los
glicopéptidos, en particular, la vancomicina o la teicoplanina, en
un huésped determinado.
8. Método de preparación de un huésped celular
recombinante, caracterizado porque comprende la
transformación de un huésped celular por una secuencia de
nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en
condiciones que permiten la expresión de la resistencia a los
antibióticos de la familia de los glicopéptidos.
9. Sonda de nucleótidos, caracterizada
porque se trata de una secuencia de ADN o de ARN según una
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, estando esta sonda en su
caso marcada.
10. Sonda de nucleótidos según la reivindicación
9, caracterizada porque hibrida específicamente en bacterias
Gram positivos, con secuencias codificadoras para una proteína de
resistencia a los glicopéptidos, en particular, a la vancomicina y/o
a la teicopianina y porque es universal entre estas secuencias.
11. Sonda de nucleótidos según la reivindicación
9 ó 10, caracterizada porque hibrida con una secuencia de
nucleótidos no cromosómica de una cepa resistente a los
glicopéptidos, en particular, a la vancomicina y/o a la
teicoplanina, en particular porque hibrida con una secuencia de
nucleótidos no cromosómica de una cepa de cocci Gram positivo, por
ejemplo de una cepa de enterococo y preferentemente E.
faecium 4147.
12. Sonda de nucleótidos una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque se trata de uno
de los oligonucleótidos:
13. Anticuerpos monoclonales,
caracterizados porque reconocen específicamente una proteína
según la reivindicación 1.
14. Kit para el diagnóstico "in
vitro" sobre una muestra biológica, de la presencia de cepas
resistentes a los glicopéptidos, en particular, a la vancomicina y/o
a la teicoplanina, perteneciendo estas cepas en particular a los
cocci Gram positivos, en particular, porque se trata de las cepas de
enterococos, por ejemplo E. faecium, caracterizado
porque comprende:
- -
- anticuerpos según la reivindicación 13, en su caso marcados,
- -
- un reactivo para la detección de una reacción inmunológica del tipo anticuerpo-antígeno,
- -
- en su caso, reactivos para efectuar la lisis de las células de la muestra ensayada.
15. Kit para el diagnóstico en vitro de la
presencia de cepas resistentes a los glicopéptidos, en particular
resistentes a la vancomicina y/o a la teicoplanina, perteneciendo
estas cepas en particular a los cocci Gram positivos, en particular,
porque se trata de cepas de enterococos, por ejemplo E.
faecium, caracterizado porque comprende:
- -
- una sonda de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, y en su caso,
- -
- oligonucleósidos trifosfatos dATP, dCTP, dTTP y dGTP,
- -
- un agente de polimerización de ADN.
16. Procedimiento de detección "in
vitro" de la presencia de cepas resistentes a los
glicopéptidos, en particular a la vancomicina y/o a la teicoplanina,
perteneciendo estas cepas en particular a la familia de los cocci
Gram positivos, en particular, porque se trata de cepas de
enterococos, por ejemplo E. faecium o E. gallinarum,
caracterizado porque comprende:
- a)
- la puesta en contacto de una muestra biológica susceptible de contener las cepas resistentes, con un cebador constituido por una sonda de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, capaz de hibridar con una secuencia de nucleótidos buscada, necesaria para la expresión de la resistencia, siendo esta secuencia utilizada como matriz, en presencia de los 4 distintos oligonucleósidos trifosfatos, y de un agente de polimerización, en condiciones de hibridación tales que para cada secuencia de nucleótidos que haya hibridado con un cebador, se sintetiza un producto de elongación de cada cebador complementario de la matriz,
- b)
- la separación de la matriz y el producto de elongación obtenido, pudiendo este último entonces igualmente incluirse como una matriz,
- c)
- la repetición de la etapa a) de tal manera que se obtenga una cantidad detectable de las secuencias de nucleótidos buscadas,
- d)
- la detección del producto de amplificación de las secuencias de nucleótidos.
17. Utilización de una secuencia de nucleótidos
que codifica para una proteína según la reivindicación 1, o parte de
dicha proteína o de una secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 4, para la detección en vitro de la presencia
de cepas resistentes a los glicopéptidos, en particular, a la
vancomicina y/o a la teicoplanina.
18. Utilización de una secuencia de nucleótidos,
constituida por una parte de uno de los encadenamientos SEQ ID NO 6,
SEQ ID NO 7 o SEQ ID NO 22, como cebador para reacciones de
polimerización en cadena, para la detección de una resistencia a los
antibióticos de la familia de los glicopéptidos, en particular, a la
vancomicina y/o a la teicoplanina, en particular en cepas de las
familias de los cocci Gram positivos.
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| FR9013579 | 1990-10-31 | ||
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