ES2281173T3 - Sistema de diagnostico y metodo para determinar la presencia de un compuesto genotoxico en una muestra. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un sistema de diagnóstico preparado a partir de: un microorganismo trasnformado capaz de aumentar la actividad del gen reportero mediante la exposición a un desafío ambiental, el mencionado microorganismo presenta una secuencia de promotor inducible por stress unida de forma operativa a un gen reportero que codifica la secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula reportera que da lugar a una señal que se puede analizar, y de un microorganismo transformado que presenta una secuencia de promotor no inducible por stress y constitutivo que está unida de forma operativa a un gen reportero que codifica una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula reportera que da lugar a una señal que se puede analizar.
Description
Sistema de diagnóstico y método para determinar
la presencia de un compuesto genotóxico en una muestra.
La presente invención se refiere a un sistema de
diagnóstico y a un método para determinar la presencia de un
compuesto genotóxico en una muestra.
La solicitud de patente internacional WO9741251
describe una secuencia de ácido nucleico recombinante, un
microorganismo huésped que comprende dicha secuencia de ácido
nucleico y la utilización de dicho microorganismo huésped para
detectar la presencia de compuestos genotóxicos en una muestra.
Dicha prueba de genotoxicidad bacteriana está basada en
bioluminiscencia y permite una detección de compuestos genotóxicos
fácil, muy rápida y de bajo coste. Se demostró que la prueba era
por lo menos tan sensible como la prueba Ames y la cromoprueba SOS
y permitía realizar medidas de la cinética de la genotoxicidad así
como una evaluación simultánea de la toxicidad del compuesto o
material de prueba (van der Lelie et al., 1997). Esta nueva
prueba, denominada prueba VITOTOX®, se consideró por tanto que era
una prueba de genotoxicidad y toxicidad a corto plazo valiosa para
muchos propósitos diferentes.
La prueba está basada en bacterias que contienen
el operón lux de Vibrio fischeri bajo control
transcripcional del gen recN, que es parte del sistema SOS.
Tras la incubación de la bacteria en presencia de un compuesto
genotóxico, se desreprime el promotor de recN, dando como resultado
la expresión del operón lux. Esta expresión da como resultado la
producción de luz en función de la genotoxicidad. Originalmente, la
prueba se realizaba con distintas cepas de Escherichia coli
y Salmonella typhimurium modificadas. Se utilizaron además
cepas de Salmonella typhimurium (TA98, TA100 y TA104), dado
que las bacterias son bien conocidas por someter a prueba la
mutagenicidad y porque la misma bacteria podría asimismo utilizarse
para una prueba Ames clásica, en caso de que se requiera. El
constructo que usa un promotor de recN de mutación ascendente (recN
2-4) dio los mejores resultados en todas las cepas.
Además, como todas las cepas de Salmonella dieron resultados
muy comparables, se ha propuesto utilizar adicionalmente sólo los
constructos de TA104 [llamados TA104 (recN2-4)] dado
que se mostraron que en ocasiones eran un poco más sensible que
otras cepas híbridas (van der Lelie et al., 1997).
Sin embargo, algunos compuestos actúan
directamente sobre la producción de luz (por ejemplo aldehídos,
disolventes orgánicos) o potencian el metabolismo de la bacteria
creando resultados falsos positivos.
La presente invención pretende proporcionar un
nuevo sistema de diagnóstico y un método para la detección de
ataques ambientales tales como la presencia de un compuesto
genotóxico en una muestra, que no presenta los inconvenientes del
estado de la técnica.
El principal objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar un nuevo sistema de diagnóstico y un
método que excluye los resultados falsos positivos y falsos
negativos.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar dichos sistema de diagnóstico y método que podrían
usarse para la selección de compuestos genotóxicos obtenidos en el
campo de la industria farmacéutica, cosmética o química, como un
estudio de prevalidación de compuestos farmacéuticos, cosméticos y/o
químicos activos o intermedios.
Un último objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar dichos sistema de diagnóstico y método que
permitirá una selección automática en un volumen muy pequeño de
muestra.
La presente invención se refiere a un sistema
diagnóstico constituido por
- \bullet
- un microorganismo transformado que puede presentar una actividad del indicador aumentada tras la exposición a un ataque ambiental, preferentemente exposición a un compuesto genotóxico, presentando dicho microorganismo una secuencia de promotor inducible por estrés, preferentemente una secuencia de promotor que es inducible por un compuesto genotóxico, estando dicha secuencia de promotor unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un indicador que codifica para una molécula indicadora dando como resultado una señal que puede analizarse, y por
- \bullet
- un microorganismo transformado que presenta una secuencia de promotor constitutiva y no inducible por estrés, preferentemente una secuencia de promotor constitutiva que no es inducible por dicho compuesto genotóxico, estando dicha secuencia de promotor unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un indicador que codifica para una molécula indicadora dando como resultado una señal que puede analizarse.
Preferentemente, ambos microorganismos
transformados son microorganismos bioluminiscentes y la señal puede
analizarse como producción de luz. Otras posibilidades son la
peroxidasa, fosfatasa alcalina, \beta-gal y la
secuencia genética de gus, en los que la señal se valorará como una
modificación colorimétrica o una producción de luz
quimioluminiscente mediante el uso de un analizador colorimétrico o
un dispositivo fotomultiplicador.
Ventajosamente, el sistema de diagnóstico según
la invención está compuesto por dos microorganismos
bioluminiscentes, el primer microorganismo bioluminiscente se
"activa" en presencia de un compuesto genotóxico y da como
resultado una señal que puede analizarse como producción de luz,
mientras que la producción de luz del segundo microorganismo
bioluminiscente no está influida por la presencia de un compuesto
genotóxico en la muestra.
La secuencia de ácido nucleico que codifica para
un indicador dando como resultado una señal que puede analizarse
como producción de luz ya se ha descrito en el estado de la técnica.
Preferentemente, los microorganismos bioluminiscentes transformados
según la invención comprenden los genes de luciferasa A y B también
identificados como complejos de genes lux expresivos, que
comprenden los genes luxA y luxB o un gen de fusión luxAB de
traducción. Los microorganismos bioluminiscentes transformados
también pueden comprender los genes de luciferasa C, D y E,
requeridos para la producción del sustrato de ácido graso limitante
que se usa en reciclaje.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, el sistema de diagnóstico comprende un
microorganismo bioluminiscente transformado que tiene una secuencia
de promotor constitutiva y no inducible por estrés con una
secuencia consenso Sigma 70 (TTGACA (-35) ...... 17/18 pb ......
TATAAT(-10)) y cuya transcripción no está regulada positiva o
negativamente al nivel del promotor. Dicho promotor consenso se
describe en Hoopes BC y McClure WR (1987): Strategies in Regulation
of Transcriptional Initiation; en “Escherichia Coli and
Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, FC
Neidhart, JL Ingraham, KB Low, B Maganasik, M Schaechter, HE
Umbaeger (eds.), American Society for Microbiology, Washington D.C.,
pp 1231-1240”.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, los microorganismos bioluminiscentes
transformados se seleccionan de entre el grupo constituido por
E. coli o Salmonella typhimurium, y son
microorganismo(s)
ventajosamente adecuados para la prueba Ames, preferentemente seleccionados de entre el grupo constituido por TA98, TA100, TA102, TA104, TA1535, TA1538, TA7001 a TA7006, y TA7041 a TA7046, o el microorganismo que tiene el número de depósito LMG P-18318. El microorganismo con el número de depósito LMG P-18318 se identificará en el futuro como la cepa "pr1".
ventajosamente adecuados para la prueba Ames, preferentemente seleccionados de entre el grupo constituido por TA98, TA100, TA102, TA104, TA1535, TA1538, TA7001 a TA7006, y TA7041 a TA7046, o el microorganismo que tiene el número de depósito LMG P-18318. El microorganismo con el número de depósito LMG P-18318 se identificará en el futuro como la cepa "pr1".
Ventajosamente, la secuencia de promotor
inducible por estrés en el microorganismo bioluminiscente
transformado del sistema de diagnóstico según la invención se
selecciona de entre el grupo constituido por groEL, dnaK, grpE,
phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA,
micF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi-28, recA,
xthA, narG, recF, recJ, recN, recO, recQ, ruv, uvrD, ars, cad, mer,
pco, y sfiA.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, la secuencia de promotor inducible por estrés
es recN, ventajosamente recN2-4. Dicho
microorganismo se identificará en el futuro como la cepa
"recN2-4".
En una forma de realización preferida, el
sistema de diagnóstico según la invención comprende un
microorganismo bioluminiscente transformado que tiene una secuencia
de promotor inducible por estrés que es una secuencia de promotor
reguladora de SOS, que tiene preferentemente una razón de inducción
superior a 40, y que comprende ventajosamente una mutación que
mejora la regulación o fortaleza del promotor, no destruyendo dicha
mutación la regulación de SOS.
Un ejemplo específico de secuencia de promotor
de recN mutada se describe en la solicitud de patente internacional
PCT/EP96/01745, incorporada en la presente memoria como
referencia.
Dicha secuencia de promotor inducible por estrés
comprende también un promotor de mutación ascendente,
preferentemente un promotor de mutación ascendente en la región -35
de dicho promotor, descrito en la solicitud de patente
internacional PCT/EP96/01745, incorporada en la presente memoria
como referencia.
La presente invención se refiere asimismo a un
kit de diagnóstico que comprende los elementos del sistema de
diagnóstico según la invención y posiblemente los reactivos,
diluyentes y/o soportes sólidos adicionales necesarios para dicho
diagnóstico, tales como una disolución tampón, una disolución que
comprende un marcador específico tal como el X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-galactosida)
para un diagnóstico basado en el uso de una secuencia genética de
\beta-gal, el luminol para un diagnóstico basado
en el uso de una secuencia genética de peroxidasa, etc...
La presente invención se refiere asimimo a un
método general para el diagnóstico de un estrés o ataque ambiental,
preferentemente para determinar la presencia de un compuesto
genotóxico en una muestra. Dicho método comprende las etapas que
consisten en exponer el sistema diagnóstico según la invención a
dicho ataque ambiental (preferentemente comprendiendo las etapas
que consisten en exponer el sistema de diagnóstico al compuesto
genotóxico presente en la muestra) y medir una señal,
preferentemente un cambio en la luminiscencia de dicho sistema de
diagnóstico.
La presente invención se refiere asimismo a un
método para determinar la cinética de genotoxicidad de un compuesto
en una muestra, basado en el método identificado anteriormente, en
el que la medida de la luminiscencia tanto de microorganismos
transformados inducibles como constitutivos se produce en múltiples
momentos en el tiempo, preferentemente de manera continua, y además
se lleva a cabo la etapa que consiste en determinar la relación
señal-ruido (S/N) para los microorganismos
transformados en dichos momento y tiempo, se divide la relación S/N
del microorganismo inducible por la de los microorganismos
constitutivos y se representan estos dados, representando dicha
representación las cinéticas de genotoxicidad corregidas del
compuesto genotóxico en la muestra.
Ventajosamente, el sistema de diagnóstico y
método según la invención pueden combinarse con la(s)
cromoprue-
ba(s) y método(s) Ames y/o SOS, tal como se describe en adelante.
ba(s) y método(s) Ames y/o SOS, tal como se describe en adelante.
La presente invención se refiere asimismo a un
método de análisis de un ataque ambiental, que comprende las etapas
de:
- -
- realizar el diagnóstico de dicho ataque ambiental tal como se describe anteriormente,
- -
- calcular la relación señal-ruido de ambos microorganismos transformados,
- -
- clasificar dicho ataque ambiental como tóxico si por lo menos una de las relaciones de la señal con respecto al ruido es inferior a 0,8,
- -
- clasificar dicho ataque ambiental como que no tiene efecto si la relación señal-ruido del microorganismo que comprende la secuencia de promotor inducible por estrés se encuentra entre 0,8 y 1,2, y
- -
- clasificar dicho ataque ambiental como inductor y genotóxico si la relación señal-ruido del microorganismo que comprende la secuencia de promotor inducible por estrés es superior a 1,2 y es por lo menos 50% superior a la relación de la señal con respecto al ruido del microorganismo que comprende la secuencia de promotor constitutiva.
La presente invención se describirá de manera
detallada en los siguientes ejemplos no limitativos, haciendo
referencia a las siguientes figuras.
La figura 1 representa la relación señal ruido
para epiclorhidrina en las cepas recN2-4 y
pr1.
La figura 2 representa la relación
señal-ruido para ZnCl_{2} en las cepas
recN2-4 y pr1.
La figura 3 representa la relación
señal-ruido para azida de sodio en las cepas
recN2-4 y pr1.
La figura 4 representa la relación
señal-ruido para nifuroxazida en las cepas
recN2-4 y pr1.
La figura 5 representa un diagrama de
determinación para diferenciar las posibles salidas de una prueba de
diagnóstico según la invención.
La figura 6 representa una instalación según la
invención.
La cromoprueba SOS y la prueba Ames son pruebas
de genotoxicidad bacteriana bien conocidas y ampliamente utilizadas
(por ejemplo, Quillardet & Hofnung, 1993;
Mersch-Sundermann et al., 1994; Mortelmans
et al., 1986). La prueba Ames "clásica" se realizó de
manera rutinaria con cepas de Salmonella typhimurium TA98 y
TA100 usando el protocolo convencional descrito por Maron y Ames
(1983). La cromoprueba SOS se adquirió como un kit de prueba de
Orgenics ltd (Yavne, Israel). La prueba se realizó tal como se
indica en las instrucciones del fabricante.
La región promotora de recN, que era parte del
gen recN de E. coli (Rostas et al., 1987) contiene
dos sitios de unión a LexA. Un sitio de unión a LexA se solapa con
la región -35 mientras que el segundo se solapa con la región -10 y
el punto de inicio de la transcripción del promotor de recN. Se
clonó el promotor de recN de E. coli en sentido 5' del
operón luxCDABE del vector de expresión pMOL877 (van der
Lelie et al., 1997). Esto dio como resultado pMOL1066. Dado
que el promotor de recN está bajo control del sistema SOS
bacteriano, la expresión del operón lux se regula por SOS.
Esto da como resultado producción de luz en presencia de
genotoxinas. Algunos derivados de promotor de recN también se
clonaron en pMOL877. Uno que carecía del sitio LexA2 dio como
resultado pMOL1067, uno que tenía un promotor de mutación ascendente
(pMOL1068) y uno que era una combinación de ambos (pMOL1069). Se
introdujeron todos los constructos en las cepas de prueba Ames TA98,
TA100 y TA104 y pudieron detectar compuestos genotóxicos. Sin
embargo, dado que los mejores resultados se obtuvieron con la cepa
TA104 (pMOL1068), esta cepa se utilizó además en la denominada
prueba VITOTOX®. Se describió exhaustivamente antes y se designó
como recN2-4 de TA104 dado que contiene el fragmento
de PCR recN2-4 (van der Lelie et al., 1997).
Aparte de recN2-4 de TA104 (la cepa de prueba), se
añade entonces la cepa denominada pr1 de TA104 como "cepa
de control". Se construyó el plásmido pMOL1046 clonando al azar
fragmentos de ADN digeridos con EcoRI a partir de
Alcaligenes eutrophus CH34 en el vector de expresión luxCDABE
(pMOL877). A. eutrophus CH34 (ATCC 43123) es una bacteria
del suelo no patógena gram negativa derivada de un tanque de
decantación de una fábrica de cinc (Mergeay et al., 1985,
J.Bact). Tras la transformación en E. coli 1106 (Murray et
al., 1977, Mol. Gen. Genet.), se seleccionaron clones para
producción de luz. Los mejores clones que emiten luz
constitutivamente, que dan la mayor producción de luz tal como se
cuantifica en un luminómetro, se seleccionaron entonces de entre
los distintos transformantes de plásmidos (=plásmido pMOL1046) y se
introdujeron en la cepa S. typhimurium TA104. Ésta se
denominó la cepa "pr1". Contiene genes luxCDABE bajo el
control de un promotor constitutivo de manera que la producción de
luz no está influida por compuestos genotóxicos. La cepa pr1
se usa en paralelo con la cepa recN2-4 y se cultiva
y trata exactamente de la misma manera.
Se incubaron durante la noche las bacterias en
un agitador rotativo a 37°C en medio 869; éste es un medio de
crecimiento normal equivalente al medio de caldo Luria complementado
con CaCl_{2} extra para permitir un crecimiento bacteriano óptimo
y se describe en van der Lelie et al.(1997, Mutation Res.).
La mañana siguiente se diluyó la suspensión 10 veces en medio 869 y
luego se inocularon 50 \mul de la dilución en 2,5 ml de
medio 869 y se incubaron durante una hora más a 37°C en un agitador
rotativo (170 rpm).
Mientras tanto se prepararon placas de 96
pocillos de manera que contengan 10 \mul o bien de disolvente, o
bien de distintas concentraciones de compuesto de prueba o bien del
control positivo para someter a prueba la genotoxicidad con
(2-AF) o sin (4-NQO) mezcla S9. Se
usa la mezcla S9, preparada según Maron y Ames (1983, Mutation
Res.), para detectar la presencia de compuestos que sólo se vuelven
genotóxicos tras la activación metabólica. Se preparó la mezcla S9
justo antes de usar. Para pruebas con la mezcla S9, se añadieron 140
\mul de las bacterias (recN2-4 o prl) a 860
\mul de medio 869 pobre y a 400 \mul de mezcla S9. Se añadieron
entonces 90 \mul de esta mezcla a los 10 \mul de disolución ya
presentes en los pocillos. Para pruebas sin la mezcla S9, se
añadieron 1260 \mul de medio 869 pobre a 140 \mul de
suspensión bacteriana y luego se transfirieron 90 \mul
de la mezcla a los pocillos que contenían 10 \mul del compuesto
de prueba o controles.
Se utilizó un luminómetro de microplaca de 96
pocillos (Luminoscan de Berthold) para las medidas de la producción
de luz tras la exposición de los compuestos de prueba. Se midió la
emisión de luz a partir de cada uno de los pocillos cada 5 minutos
durante 5 horas (30°C, 1 seg/pocillo, 60 ciclos de 300 seg cada
uno). Tras completar las medidas, se transfirieron los datos en una
macro hoja de MS Excel y se calculó para cada medida la relación
señal-ruido (S/N), estando la producción de luz de
células expuestas dividida por la producción de luz de células no
expuestas. Un compuesto se consideraba genotóxico cuando la S/N era
superior a 2 para por lo menos dos concentraciones y cuando se
observaba una clara relación dosis-efecto. En el
segundo experimento en el que se introdujo la cepa pr1 de
TA104, se calculó la S/N para las cepas
RecN2-4 y pr1 por separado así como
la relación entre los valores de S/N máximo y medio de las cepas
recN2-4 y pr1 (rec/pr1). Todos
los cálculos se realizaron entre los 60 y 240 minutos de
incubación. Aquí, un compuesto se considera genotóxico cuando la
S/N en la cepa recN2-4 es mayor que 1,5 x el valor
de control del disolvente (y no "2" como al principio), pero
sólo cuando este aumento no está acompañado por un aumento
comparable en la cepa pr1 (lo que indicaría un mecanismo de
inducción no genotóxico). Un compuesto es genotóxico cuando la
relación S/N de la cepa recN2-4 sobre
pr1 es igual o superior a 1,5 (límite fijado en base
experimental). De esta manera pueden evitarse los resultados
"falsos positivos".
Pueden identificarse resultados "falsos
negativos" cuando la relación S/N de la cepa
recN2-4 permanece entre 0,8 y 1,2, mientras que la
relación S/N del detector de pr1 disminuye por debajo de 0,8. Este
es típicamente el caso de las muestras que son genotóxicas y
tóxicas al mismo tiempo.
Además la cepa pr1 es también muy valiosa
para la evaluación de la toxicidad. Se supone toxicidad bacteriana
cuando la emisión de luz disminuye sustancialmente de una manera
dependiente de la dosis y alcanza valores de S/N inferiores a 0,8
durante los 30 primeros minutos de la prueba.
Es posible la automatización del sistema, usando
una instalación tal como se describe en la figura 6. Un aparato de
detección (2) que comprende por lo menos un detector para la señal
que se emite a partir del sistema diagnóstico tal como se describe
anteriormente, está unido a un ordenador (1) que recibe y procesa
los datos del detector según el método de análisis tal como se
describe anteriormente y tal como se clarifica en la figura 5. De
esta manera, es posible un análisis automatizado de muestras y la
clasificación como tóxico y/o genotóxico.
En el presente trabajo se volvieron a evaluar
varios compuestos bien conocidos disponibles comercialmente que se
evaluaron previamente sólo con la cepa recN2-4 de
TA104 (véase van der Lelie et al., 1997) usando la cepa
recN2-4 de TA104 y pr1 de TA104. Se
proporcionan en la tabla 1.
Los resultados notificados anteriormente con la
VITOTOX® se obtuvieron en la cepa de Salmonella typhimurium
TA104 RecN2-4 (van der Lelie et al., 1997).
Con el fin de mejorar adicionalmente la prueba se introdujo la cepa
pr1. Los resultados obtenidos en la cepa
RecN2-4 deben evaluarse en comparación con los
resultados obtenidos en la cepa pr1 en la que una producción
de luz aumentada no puede deberse a un acontecimiento genotóxico.
Por lo tanto, una producción de luz aumentada en la cepa
recN2-4 puede interpretarse sólo como una indicación
de la genotoxicidad cuando no está acompañada por un aumento
comparable en la producción de luz en la cepa pr1.
Usando ambas cepas bacterianas, se volvieron a
evaluar varios de los productos químicos estudiados anteriormente.
Los resultados se proporcionan en la tabla 1. La tabla proporciona
las concentraciones a las que el valor S/N máximo en la cepa de
prueba recN2-4 se hace >2, así como las
concentraciones en las que la relación entre la S/N de
recN2-4 media y máxima y la S/N de pr1
alcanza 1,5 o más (rec/pr1). Finalmente, la tabla también
indica la presencia de toxicidad dentro del intervalo de dosis
probado y tal como se evaluó mediante las curvas S/N de pr1.
Puede apreciarse que los compuestos genotóxicos conocidos se
evaluaron en efecto como genotóxicos mientras que los compuestos no
genotóxicos no mostraron la relación S/N requerida en los intervalos
de dosis dados. Se representaron gráficamente unos pocos ejemplos
de los resultados en las figuras 1 a 4 (ejemplos de pruebas sin
mezcla S9). La figura 1 proporcoina las curvas S/N para la
epiclorhidrina en las cepas recN2-4 y
pr1. En la cepa recN2-4 los valores de S/N se
hicieron superior a 2 en la dosis de 256 ppm, (no mostrado),
mientras que los valores de S/N en la cepa pr1 no se
desviaron mucho de 1. La figura 2 da los resultados para
ZnCl_{2}, que no es genotóxico pero si tóxico para Salmonella
typhimurium TA104 a concentraciones superiores a 7,4 \muM (no
mostrado). Se da la azida de sodio como un tercer ejemplo en la
figura 3. En ella, la relación S/N era considerablemente superior a
2 tanto en la cepa recN2-4 como en la pr1 y
las indicaciones de toxicidad se obtienen con el tiempo
(S/N<0,8). La figura 4 ilustra los resultados que se obtuvieron
para la nifuroxazida. Haciendo referencia a la cepa
recN2-4, dosis inferiores aparentemente eran más
genotóxicas que dosis superiores, pero la cepa pr1 mostró un
descenso en la producción de luz dependiente de la dosis que indica
toxicidad.
La prueba VITOTOX® es un método sensible y
rápido para detectar compuestos genotóxicos (van der Lelie et
al., 1997). Sin embargo, si se usa únicamente la cepa
recN2-4 (como se hacía inicialmente) eran posibles
algunas malas interpretaciones. La presente invención se basa en el
uso de la cepa pr1. El valor añadido de la cepa pr1
se ilustró mediante unos pocos ejemplos. En la figura 1, se
proporciona un ejemplo de un compuesto genotóxico (epiclorhidrina)
que no era tóxico en el intervalo de dosis dado. Basándose en los
resultados obtenidos de la cepa recN2-4 sola, se
puede concluir que el compuesto era genotóxico ya que se observó un
aumento en la producción de luz dependiente de la dosis que excedía
el valor de "ruido" en más de un factor de dos (S/N>2). La
inclusión de la cepa pr1 sólo confirmó esta evaluación. Si se
encontrase una producción de luz aumentada en la cepa pr1,
se debería concluir en efecto que esto se debía a otro mecanismo de
inducción diferente de la genotoxicidad (por ejemplo, proliferación
celular aumentada que potenciaría el "nivel de ruido" comparado
con el de cultivos no expuestos, etc.). Pero este no era el caso.
No había tampoco signo de toxicidad ya que no existía producción de
luz disminuida. Éste era claramente el caso del ZnCl_{2} tal como
se indica mediante las curvas de la figura 2. La figura para la
cepa recN2-4 muestra que la dosis de 3,7 \muM no
es genotóxica ni tóxica pero a dosis superiores se observa una
emisión de luz disminuida que indica un efecto tóxico seguido por
una cierta recuperación a dosis inferiores. Esto se confirma
mediante la cepa pr1 en la que la recuperación es incluso
más visible a dosis de hasta 58,8 \muM de ZnCl_{2} (no
mostrado). A partir de ZnCl_{2} 117,5 \muM la recuperación ya
no es posible. Por tanto, el ZnCl_{2} mostró que no era genotóxico
y sólo las dosis más bajas parecían carecer de cualquier
toxicidad.
Tal como se indica en la introducción y la
sección de materiales y métodos, la prueba VITOTOX® se basa
esencialmente en la detección de una señal de SOS. Por lo tanto, se
deben producir teóricamente resultados que están más de acuerdo con
la cromoprueba SOS que con la prueba Ames. Pero se descubrieron
previamente algunas diferencias. Los inventores han notificado por
ejemplo una respuesta "positiva" para la azida de sodio
mientras que este compuesto normalmente puntúa "negativo" en
la cromoprueba SOS (van der Lelie et al, 1997). Una razón
para esta discrepancia puede ser que la prueba VITOTOX® usa la cepa
TA104 de Salmonella typhimurium de la prueba Ames y por lo
tanto tiene las mismas características, por ejemplo, capacidad de
reparación del ADN reducida y permeabilidad aumentada para
moléculas complejas (como la mayoría de los compuestos
farmacéuticos). Ésta es ciertamente una explicación válida en
muchos casos pero probablemente no para una molécula pequeña como
la azida de sodio (N_{3}Na). Aquí puede anticiparse otra razón
para la diferencia con los resultados de la cromoprueba SOS. Puede
ser por ejemplo que la producción de luz aumentada tal como se
encuentra en la cepa recN2-4 se deba a otro
mecanismo de inducción diferente de la genotoxicidad. Con la
introducción de la cepa pr1 se puede verificar esta
afirmación. Tal como puede verse en la figura 3, la producción de
luz observada en la cepa recN2-4 no se debe a la
genotoxicidad ya que la emisión de luz aumentada se observa también
en la cepa pr1 y ésta no puede deberse a una respuesta de
SOS. Por lo tanto, debe interpretarse la azida de sodio como no
genotóxica en la prueba. Es un buen ejemplo de un "compuesto"
que sería un "falso positivo" cuando sólo se usaba la cepa
recN2-4.
Los inventores han probado y comparado muchos
más compuestos farmacéuticos con las otras pruebas bacterianas. Los
resultados obtenidos por las diferentes pruebas a menudo concordaban
completamente entre sí. La prueba VITOTOX® normalmente es también
mucho más sensible que la cromoprueba SOS o Ames ya que las
concentraciones mínimas detectables son 1-100 veces
inferiores en la prueba VITOTOX®.
Otra ventaja de usar la cepa pr1 es que
además de la genotoxicidad, puede evaluarse mejor la toxicidad que
con la cepa recN2-4 sola. Un compuesto genotóxico
que se investiga a niveles de dosis a aproximadamente el umbral de
toxicidad puede mostrar razones S/N en la cepa
recN2-4 que son "intermedias" entre
genotoxicidad y toxicidad ya que el aumento en la producción de luz
(debido a la genotoxicidad) compite con un descenso (debido a la
toxicidad) que da como resultado una S/N \cong 1. Por lo tanto, el
compuesto se interpretaría como ni genotóxico ni tóxico (resultado
falso negativo). La cepa pr1 mostrará claramente un descenso
en la emisión de luz que indica que el compuesto ya es tóxico a la
dosis dada. Es decir, al menos para algunas dosis, ilustradas en la
figura 4 en la que se tomó como ejemplo la nifuroxazida. Puede
apreciarse que las dosis inferiores proporcionaron la mayor
respuesta genotóxica debido a la toxicidad dependiente de la dosis.
Las curvas S/N para la cepa pr1 indican claramente que sólo
las dosis más bajas hasta 0,16 ppm no eran tóxicas. Las dosis
superiores pueden mostrar toxicidad combinada con genotoxicidad (por
ejemplo, 0,32 ppm) o pueden ser demasiado tóxicas para mostrar
genotoxicidad (las dosis más
altas).
altas).
Tanto la cepa recN2-4 como la
pr1 mostraron que podían detectar concentraciones tóxicas de
un compuesto. Sin embargo, la cepa pr1 es más valiosa en
pruebas de toxicidad ya que las curvas S/N no pueden estar influidas
por la genotoxicidad y por tanto reflejan sólo la toxicidad (o su
ausencia). La cepa pr1 proporciona aparentemente una
herramienta perfecta para los que están interesados sólo en la
valoración de la toxicidad. Los inventores están comparando
actualmente valoraciones de la toxicidad de productos químicos y
mezclas complejas con la cepa pr1 y con la prueba Microtox®.
La última es una de las pruebas de toxicidad microbiana más
utilizada actualmente e internacionalmente aceptada, que se basa
también en bioluminiscencia (Hasting, 1978; Férard et al.,
1983). Según los datos limitados ya disponibles por los inventores,
la prueba VITOTOX® da los mismos resultados que la prueba Microtox®
pero la primera es de más fácil realización y a menudo es mucho más
sensible. Por lo tanto, la prueba VITOTOX®, o sólo su elemento de
pr1, puede considerarse como una prueba de toxicidad
extremadamente valiosa, por lo menos cuando estos resultados
preliminares puedan confirmarse.
En conclusión, puede recalcarse que las cepas de
Salmonella typhimurium TA104 recN2-4 y
TA104 pr1 proporcionan sistemas de prueba de la
genotoxicidad y/o toxicidad muy valiosos. Ambas cepas pueden usarse
de manera concomitante para someter a prueba la genotoxicidad
mientras que la cepa pr1 sólo se requiere para someter a
prueba la toxicidad. Se ha mostrado que la prueba VITOTOX®
proporciona una respuesta muy rápida (en 2-4 horas)
y muy sensible con respecto a la (geno)toxicidad de
productos químicos y que por esa razón puede ser muy útil en la
selección y preselección de nuevos productos intermedios y químicos.
Dado que la prueba se realiza en placas de 96 pocillos, es posible
investigar por lo menos 8 productos químicos (con y sin la adición
de una fracción de enzima metabólica S9) al día o 40 productos
químicos a la semana. Las medidas se producen automáticamente y la
recogida de datos y tratamiento de datos también pueden estar además
casi completamente automatizados. La robotización de microplacas
debe poder multiplicar esta velocidad por un factor de 10. La
ampliación a escala, por ejemplo aumentando la cantidad de pocillos
por placa, es obvia. Por lo tanto, los costes de mano de obra se
reducen al
máximo.
máximo.
Finalmente, un atractivo complementario y muy
importante es que sólo se requieren volúmenes muy pequeños del
compuesto de prueba (menos de 20 mg). Esto es particularmente
importante para la industria farmacéutica en la que sólo están
disponibles unos pocos cientos de miligramos de un compuesto en la
fase de descubrimiento. Es casi imposible seleccionar tales
productos químicos nuevos de ese tipo con la mayoría de los otros
sistemas de
prueba.
prueba.
Se ha realizado un depósito de la cepa
"pr1" según el Tratado de Budapest con el número de depósito
LMG P-18318 en el BCCM/LMG, Laboratorium voor
Microbiologie - Bacteriënverzameling, Universiteit Gent, K.L.
Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica.
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(1997): Two-component regulatory system
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Claims (13)
1. Sistema de diagnóstico constituido
por:
- -
- un microorganismo transformado que puede presentar una actividad indicadora aumentada tras la exposición a un ataque ambiental, presentando dicho microorganismo una secuencia de promotor inducible por estrés que está operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un indicador que codifica para una molécula indicadora que da como resultado una señal que puede analizarse, y
- -
- un microorganismo transformado que presenta una secuencia de promotor constitutivo y no inducible por estrés que está operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un indicador que codifica para una molécula indicadora que da como resultado una señal que puede analizarse,
siendo adecuados dichos microorganismos para
detectar de manera conjunta dicho ataque ambiental mientras que se
eliminan los resultados falsos positivos y falsos negativos.
2. Sistema según la reivindicación 1, en el
que la señal se analiza como producción de luz y/o modificación
colorimétrica.
3. Sistema según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el microorganismo bioluminiscente transformado es la E.
coli.
4. Sistema según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el microorganismo bioluminiscente transformado es una
Salmonella thyphimurium, siendo preferentemente un
microorganismo adecuado para la prueba Ames, seleccionado
ventajosamente entre el grupo constituido por TA98, TA100, TA102,
TA104, TA1535, TA1538, TA7001 a TA7006, y TA7041 a TA7046, o que
tiene el número de depósito de microorganismo LMG
P-18318.
5. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 4, en el que la secuencia de
promotor inducible por estrés se selecciona del grupo constituido
por groEL, dnaK, grpE, phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP,
uspA, katG, uvrA, frdA, micF, fabA, lac, his, sodA, sodB,
soi-28, recA, xthA, narG, recF, recJ, recN, recO,
recQ, ruv, uvrD, ars, cad, mer, pco y sfiA.
6. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 5, en el que la secuencia de
promotor constitutivo y no inducible por estrés es una secuencia
con una secuencia consenso Sigma 70 (TTGACA(-35) ..... 17/18 pb
...... TATAAT (-10)) y cuya transcripción no está regulada positiva
o negativamente al nivel del promotor.
7. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 6, en el que la secuencia de ácido
nucleico que codifica para el indicador comprende los genes de
luciferasa A y B o un gen de fusión de traducción luxAB.
8. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 7, en el que la secuencia de ácido
nucleico que codifica para el indicador comprende los genes de
luciferasa A y B y los genes de luciferasa C, D y E requeridos para
producir el sustrato de ácido graso limitante que se utiliza en
reciclaje.
9. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 8, en el que el ataque ambiental es
la presencia de un compuesto genotóxico y/o tóxico en una
muestra.
10. Kit de diagnóstico que comprende los
elementos del sistema de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 9 y posiblemente los reactivos,
diluyentes y/o soportes sólidos adicionales necesarios.
11. Método para el diagnóstico de un ataque
ambiental, preferentemente para determinar la presencia de un
compuesto genotóxico y/o tóxico en una muestra, que comprende las
etapas siguientes:
- -
- exponer el sistema de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8 a dicho ataque ambiental, y
- -
- medir una señal del (de los) microorganismo(s) bioluminiscente(s) transformado(s) de dicho sistema de diagnóstico.
12. Método para determinar la cinética de
genotoxicidad de un compuesto en una muestra con un sistema de
diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el
que la medición de la luminiscencia tanto de los microorganismos
transformados inducibles como constitutivos se produce en momentos
en el tiempo múltiples, preferentemente de manera continua, y
además se lleva a cabo la etapa que consiste en determinar la
relación señal-ruido (S/N) de los microorganismos
transformados en dichos momento y tiempo, dividiendo la relación
S/N del microorganismo inducible por la de los microorganismos
constitutivos y se representan gráficamente estos datos,
representando dicha representación gráfica la cinética corregida de
genotoxicidad del compuesto genotóxico en la
muestra.
muestra.
13. Método de análisis de un ataque ambiental,
que comprende las etapas siguientes:
- -
- realizar el diagnóstico de dicho ataque ambiental tal como se describe en la reivindicación 11,
- -
- calcular la relación señal-ruido de ambos microorganismos transformados,
- -
- clasificar dicho ataque ambiental como tóxico si por lo menos una de las relaciones señal-ruido calculadas es inferior a 0,8,
- -
- clasificar dicho ataque ambiental como que no tiene efecto si la relación señal-ruido del microorganismo que comprende la secuencia de promotor inducible por estrés está comprendida entre 0,8 y 1,2, y
- -
- clasificar dicho ataque ambiental como inductor y genotóxico si la relación señal-ruido del microorganismo que comprende la secuencia de promotor inducible por estrés es superior a 1,2 y es por lo menos 50% superior a la relación señal-ruido del microorganismo que comprende la secuencia de promotor constitutivo.
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