JP2002509446A

JP2002509446A - サンプル中の遺伝毒性化合物の存在を測定するための診断システム及び方法

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Publication number: JP2002509446A
Application number: JP55096499A
Authority: JP
Inventors: デルルリ，ダニエルヴァン; アニェルイジャンボスコルニエル，リュク; タガヴィ，サフィ; ジルベールジスランコルビシェ，フィリップ; フィリパヌエドゥアルヴェルシェヴ，ルュク
Original assignee: ヴラームスインステリングヴールテクノロギシュオンデルゾーク（ヴィアイティーオー）
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-12
Publication date: 2002-03-26
Anticipated expiration: 2019-04-12
Also published as: EP0977896A1; CN1227367C; CN1263561A; EP0950717A1; DE69934847T2; CA2290354A1; EP0977896B1; WO1999053092A1; BR9906356A; CA2290354C; ES2281173T3; DE69934847D1; PT977896E; DK0977896T3; ATE351922T1; US6472152B1; AU3694499A; JP4272265B2

Abstract

(57)【要約】本発明は以下のものからなる診断システムに関する：環境傷害に暴露されるとレポーター活性を増大させることができる形質転換された微生物（ただし前記微生物はアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーター分子をコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されているストレス誘導可能なプロモーター配列を持つ）、及びアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーター分子をコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている、構成的であってストレス誘導可能でないプロモーター配列を持つ形質転換された微生物。

Description

【発明の詳細な説明】サンプル中の遺伝毒性化合物の存在を測定するための診断システム及び方法発明の属する分野本発明はサンプル中の遺伝毒性化合物の存在を測定するための診断システム及び方法に関する。発明の背景及び従来技術の現状国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１７４５は組換え核酸配列、前記核酸配列を含む宿主微生物及びサンプル中の遺伝毒性化合物の存在を検出するための前記宿主微生物の使用を記載している。前記の細菌を用いる遺伝毒性試験は生物発光に基づいており、遺伝毒性化合物の容易で極めて迅速かつ低コストの検出を可能にする。この試験はエイムス試験及びＳＯＳ染色試験と少なくとも同じぐらい敏感であり、遺伝毒性の速度（kinetics）の測定及び試験化合物又は材料の毒性の同時評価を可能にすることが示されている（van der Lelie等，1997）。それ故、ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）と称されるこの新規の試験は多様な目的のための短時間で遺伝毒性及び毒性を測定できる有用な試験とみなされていた。この試験はＳＯＳシステムの一部分であるrecN遺伝子の転写制御下にあるヴィブリオ・フィシェリ（Vibrio fischerl）のluxオペロンを含む細菌に基づいている。遺伝毒性化合物の存在下での細菌の培養後、recNプロモーターが脱抑制され、その結果luxオペロンが発現する。この発現は遺伝毒性の関数としての光生産をもたらす。元来、この試験は様々な改変されたエシェリキア・コリ（Escheric hia coli）及びサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）株を用いて行われていた。サルモネラ・チフィムリウム株（TA98，TA100及びTA104）の方がよく用いられていた。というのもこの細菌は変異原性の試験のためによく知られており、しかも必要とあらば同じ細菌を古典的なエイムス試験のためにも用いることができるからである。recNプロモーターアップ突然変異（promoterup m utation）（recN2-4）を用いた構築物はすべての株において最良の結果を生じた。更に、すべてのサルモネラ属細菌株は極めて匹敵し得る結果を与えるので、他の雑種株よりも時折ほんの少し敏感であることが示されているTA104構築物（TA104（recN2-4）と称する）のみを用いることが提案されていた（van der Lelie等，1997）。しかし、いくつかの化合物は光生産に直接作用する（例、アルデヒド、有機溶媒）か又は細菌の代謝を増大させ、偽陽性の結果を作り出す。発明の目的本発明は従来技術の欠点を有しない、サンプル中の遺伝毒性化合物の存在の如き環境傷害の検出のための新規の診断システム及び方法を提供することを目的とする。本発明の主目的は偽陽性及び偽陰性の結果を除外する新規の診断システム及び方法を提供することである。本発明の更なる目的は中間化合物又は活性化学化合物、化粧品化合物及び／又は薬品化合物の予備確認研究として、化学、化粧品又は薬品産業分野において得られる遺伝毒性化合物のスクリーニングのために用いることができるような診断システム及び方法を提供することである。本発明の最後の目的は極めて少量のサンプルに基づいて自動的なスクリーニングを可能にするような診断システム及び方法を提供することである。発明の詳細な説明本発明は以下のものからなる診断システムに関する： − 環境傷害に暴露されると、好ましくは遺伝毒性化合物に暴露されるとレポーター活性を増大させることができる形質転換された微生物（ただし前記微生物はアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーター分子をコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって（operatively）連結されているストレス誘導可能なプロモーター配列を持ち、好ましくは前記プロモーター配列は遺伝毒性化合物によって誘導可能である）、及び − アッセイ可能なシグナルを生ずるレポーター分子をコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている、構成的であってストレス誘導可能でないプロモーター配列を持つ形質転換された微生物（好ましくは前記構成的プロモーター配列は前記遺伝毒性化合物によって誘導可能でない）。形質転換された微生物は両方とも生物発光性微生物であり、シグナルは光生産としてアッセイされることができることが好ましい。他の可能性はペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−gal及びgus遺伝子配列であり、その場合シグナルは色彩変化として又は化学発光光生産として色彩分析機又は光電倍増管装置を用いてアッセイされる。有利には本発明の診断システムは二つの形質転換された生物発光性微生物からなり、第一の生物発光性微生物は遺伝毒性化合物の存在下で「活性化され（acti vated）」、光生産としてアッセイ可能なシグナルを生じ、一方第二の生物発光性微生物の光生産はサンプル中の遺伝毒性化合物の存在によって影響を受けない。光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードする核酸配列は従来技術において既に記載されている。好ましくは本発明による形質転換された生物発光性微生物はluxA及びluxB遺伝子を含む発現性lux遺伝子複合体としても同定されるルシフェラーゼＡ及びＢ遺伝子、又は翻訳luxAB融合遺伝子を含む。形質転換された生物発光性微生物は再生利用される制限脂肪酸基質の生産に要求されるルシフェラーゼＣ，Ｄ及びＥ遺伝子をも含んでいてもよい。本発明の好ましい実施態様によれば診断システムはSigma 70コンセンサス配列（TTGACA(-35)……17/18 bp……TATAAT(-10)）を持つ構成的であってストレス誘導可能でないプロモーター配列を持つ形質転換された生物発光性微生物を含み、その転写はプロモーターレベルで正の調節又は負の調節を受けていない。前記プロモーターコンセンサスはHoopes BC及びMcClure WR（1987）：Strategies in R egulation of Transcriptional Initiation；in“Escherichia Coli and Salmon ella typhimurium”，Cellular and Molecular Biology，FC Neidhart，JL Ingr aham，KB Low，B Maganasik，M Schaechter，HE Umbaeger(eds.)，American Soc iety for Microbiology，Washington D.C.，pp 1231-1240に記載されている。本発明の好ましい実施態様によれば、形質転換された生物発光性微生物はイー・コリ（E．coli）又はサルモネラ・チフィムリウムからなる群から選択され、有利には好適なエイムス試験用微生物であり、好ましくはTA98，TA100，TA102， TA104，TA1535，TA1538，TA7001〜TA7006，及びTA7041〜TA7046からなる群から選択されるか、及び／又は寄託番号ＬＭＧＰ−１８３１８の微生物を持つ。寄託番号ＬＭＧＰ−１８３１８を持つ微生物は以下「pr1」株として称される。有利には本発明による診断システムの形質転換された生物発光性微生物中のストレス誘導可能なプロモーター配列はgroEL，dnaK，grpE，phoA，glnA，lon，ly sU，rpoD，clpB，clpP，uspA，katG，uvrA，frdA，micF，fabA，lac，his，sodA ，sodB，soi-28，recA，xthA，narG，recF，recJ，recN，recO，recQ，ruv，uvr D，ars，cad，mer，pco及びsfiAからなる群から選択される。本発明の好ましい実施態様によればストレス誘導可能なプロモーター配列はre cN、有利にはrecN2-4である。前記微生物は「recN2-4」株として以下称される。好ましい実施態様においては本発明による診断システムはストレス誘導可能なプロモーター配列を持つ形質転換された生物発光性微生物を含み、前記ストレス誘導可能なプロモーター配列はＳＯＳ調節プロモーター配列であり、好ましくは４０より高い誘導比率を持ち、かつ有利にはプロモーター強度又は調節を改善する突然変異を含む（ただし前記突然変異はＳＯＳ調節を破壊しない）。突然変異したrecNプロモーター配列の特別な例は国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１７４５に記載されている。この文献はここに参考文献として組入れる。前記ストレス誘導可能なプロモーター配列はプロモーターアップ突然変異、好ましくは国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１７４５に記載されている前記プロモーターの−３５領域のプロモーターアップ突然変異をも含む。本発明は診断キットにも関し、前記キットは本発明の診断システムの要素、及び所望により必要な付加的な反応剤、希釈剤及び／又は前記診断のための固体支持体（例えば緩衝溶液、β−gal遺伝子配列の使用に基づく診断のためのＸ−ga １（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトシド）の如き特異的マーカーを含む溶液、ペルオキシダーゼ遺伝子配列の使用に基づく診断のためのルミノール等）を含む。本発明は環境ストレス又は傷害の診断のための、好ましくはサンプル中の遺伝毒性化合物の存在を決定するための一般的方法にも関する。前記方法は本発明の診断システムを前記環境傷害に暴露させるステップ（好ましくは診断システムをサンプル中に存在する遺伝毒性化合物に暴露させるステップを含む）、そしてシグナル、好ましくは前記診断システムの発光の変化を測定するステップを含む。本発明は上記方法に基づいてサンプル中の化合物の遺伝毒性の速度を測定する方法にも関し、そこでは誘導可能な形質転換された微生物及び構成的な形質転換された微生物の両方の発光の測定を様々な時点で、好ましくは連続的に行い、それに加えて前記時点で形質転換された微生物についてのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比率を測定し、誘導可能な微生物のＳ／Ｎ比率を構成的微生物のＳ／Ｎ比率で割ってこれらのデータをプロットする（ただし前記プロットはサンプル中の遺伝毒性化合物の遺伝毒性の修正された速度を表す）ステップを行う。有利には本発明の診断システム及び方法は以下に記述する通りエイムス及び／又はＳＯＳ染色試験及び方法と組合せることができる。本発明は以下のステップを含む環境傷害の分析方法にも関する： − 上述のように前記環境傷害の診断を行い、 − 両方の形質転換された微生物のシグナル対ノイズ比率を計算し、 − 少なくとも一つの計算されたシグナル対ノイズ比率が０．８より低い場合、前記環境傷害を毒性として分類し、 − ストレス誘導可能なプロモーター配列を含む微生物のシグナル対ノイズ比率が０．８〜１．２の間である場合、前記環境傷害を影響なしとして分類し、そして − ストレス誘導可能なプロモーター配列を含む微生物のシグナル対ノイズ比率が１．２より高くかつ構成的プロモーター配列を含む微生物のシグナル対ノイズ比率よりも少なくとも５０％高い場合、前記環境傷害を誘導的であり（induci ng）かつ遺伝毒性があるとして分類する。本発明はサンプル中の化合物が遺伝毒性及び／又は毒性であるかどうかを測定するための装置にも関し、前記装置は前記サンプルによって誘導される上述したような診断システム、前記診断システムからのシグナルをアッセイすることができる検出装置を含む検出システムを含む（ただし前記検出システムは上述したような分析方法を行うようにプログラムされたコンピューターに接続されている）。本発明は以下の図面を参照しつつ、以下の非制限的な例において詳細に説明される。図面の簡単な説明図１はrecN2-4及びpr1株におけるエピクロロヒドリンについてのシグナル対ノイズ比率を示す。図２はrecN2-4及びpr1株におけるZnCl₂についてのシグナル対ノイズ比率を示す。図３はrecN2-4及びpr1株におけるアジ化ナトリウムについてのシグナル対ノイズ比率を示す。図４はrecN2-4及びpr1株におけるニフロキサアザイド（nifuroxazide）についてのシグナル対ノイズ比率を示す。図５は本発明による診断試験の起こり得る結果を区分するための決定図を示す。図６は本発明による装置を示す。発明の詳細な説明材料及び方法エイムス試験及びＳＯＳ染色試験ＳＯＳ染色試験及びエイムス試験は周知のかつ幅広く用いられている細菌を用いた遺伝毒性試験である（例、Quillardet & Hofnung，1993；Mersch-Sunderman n等，1994；Mortelmans等，1986）。「古典的」なエイムス試験はMaron及びAmes （1983）によって記述された標準プロトコールを用いてサルモネラ・チフィムリウム株TA98及びTA100を用いて機械的に行われた。ＳＯＳ染色試験はOrgeni cs ltd（Yavne，Israel）から試験キットとして購入された。試験は製造者の指示に示される通りに行われた。ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験サルモネラ・チフィムリウム株 recNプロモーター領域はイー・コリのrecN遺伝子の一部分であり（Rostas等， 1987）、二つのLexA結合部位を含む。一方のLexA結合部位は−３５領域と重複し、他方は−１０領域及びrecNプロモーターの転写開始点と重複する。イー・コリ recNプロモーターは発現ベクターpMOL877のluxCDABEオペロンの上流にクローニングされた（van der Lelie等，1997）。これはpMOL1066を生じた。recNプロモーターは細菌のＳＯＳシステムの制御下にあるので、luxオペロンの発現はＳOS 調節されるようになった。これは遺伝毒性の存在下、光生産を生ずる。いくつかのrecNプロモーター誘導体もpMOL877にクローニングされた。LexA2部位を欠くものはpMOL1067を生じ、プロモーターアップ突然変異を持つもの（pMOL1068）及び両方の組合せであるもの（pMOL1069）も生じた。すべての構築物はエイムス試験株TA98，TA100及びTA104に導入され、遺伝毒性化合物を検出することができた。しかし、最良の結果は株TA104（pM0L1068）で得られたので、この株がいわゆるＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験において更に用いられた。それは前に詳しく記述され、recN2-4PCR断片を含んでいるため、TA104 recN2-4と称された（van der Lelie等，1997）。TA104 recN2-4（試験株）以外にいわゆるTA104 pr1株が「コントロール株」として今や追加される。プラスミドpMOL1046はluxCDABE発現ベクター中のアルカリゲネス・エウトロフス（Alcaligenes eutrophus）CH34からの無作為EcoRI消化DNA断片でクローニングすることによって構築された（pMOL877 ）。エー・エウトロフス（A．eutrophus）CH34（ATCC 43123）は亜鉛工場のデカンテーションタンク由来のグラム陰性非病原性土壌細菌である（Mergeay等，1 985，J．Bact）。イー・コリ１１０６への形質転換（Murray等，1977，Mol．Gen ．Genet.）後、クローンは光生産について選択された。測光器において定量される通りの最高の光生産を与える最良の構成的に光を放出するクローンは様々なプラスミド形質転換体の中から次に選択され（＝プラスミドpM OL1046）、エス・チフィムリウム（S．typhimurium）株TA104に導入された。これは「pr1」株と命名された。それは構成的プロモーターの制御下にluxCDABE遺伝子を含んでいるので、光生産は遺伝毒性化合物によって影響を受けない。pr1 株はrecN2-4株と同時に用いられ、培養されて全く同様に処理される。試験手順１．培養細菌は８６９培地で３７℃で回転振盪機で一晩インキュベートされた；これは Luria Broth培地に匹敵する通常の増殖培地であり、細菌の増殖に最適なように余分のCaCl₂が添加されており、van der Lelie等（1997，Mutation Res．）に記載されている。翌朝、細菌懸濁液は８６９培地に１０倍に希釈され、５０μｌの希釈物は２．５ｍｌの８６９培地に接種され、回転振盪機（１７０rpm）で３７ ℃でもう一時間インキュベートされた。２．９６ウェルプレートの調製その間に９６ウェルプレートがＳ９混合物あり（２−ＡＦ）又はＳ９混合物なし（４−ＮＱＯ）での遺伝毒性試験のための陽性コントロール、様々な濃度の試験化合物又は溶媒１０μｌを含むように調製された。Maron及びAmes（1983，Mut ation Res．）に従って調製されたＳ９混合物は代謝活性化後にのみ遺伝毒性となる化合物の存在を検出するために用いられる。Ｓ９混合物は使用直前に調製された。Ｓ９混合物ありの試験のためには１４０μｌの細菌（recN2-4又はpr1）が８６０μｌの貧８６９培地及び４００μｌのＳ９混合物に添加された。この混合物から９０μｌがウェルに既に存在する１０μｌの溶液に添加された。Ｓ９混合物なしの試験のためには１２６０μｌの貧８６９培地が１４０μｌの細菌懸濁液に添加され、混合物のうち９０μｌが次に１０μｌの試験化合物又はコントロールを含むウェルに移された。３．遺伝毒性及び毒性の測定９６ウェルマイクロプレート測光計（BertholdからのLuminoscan）が試験化合物への暴露に続く光生産の測定に用いられた。各々のウェルからの光放出は５分ごとに５時間にわたって測定された（３０℃、１秒／ウェル、３００秒毎の６０サイクル）。測定の完了後、データはMS Excelマイクロシートに移され、暴露された細胞の光生産を未暴露の細胞の光生産で割ったものであるシグナル対ノイズ比率（Ｓ／Ｎ）が各測定について計算された。Ｓ／Ｎが少なくとも二つの濃度について２より高くかつ明瞭な用量−効果関係が観察された場合、化合物は遺伝毒性があるとみなされた。TA104 pr1株が導入された二番目の実験においては、Ｓ／ＮはRecN2-4及びpr1株について別々に計算され、recN2-4及びpr1株の最大Ｓ／Ｎ値と平均Ｓ／Ｎ値の間の比率（rec／pr1）も計算された。すべての計算は６０分のインキュベーションと２４０分のインキュベーションの間で行われた。ここにおいて、recN2-4株におけるＳ／Ｎが溶媒コントロール値の１．５倍より大きい（しかも最初に行われたように２ではなく）ものの、この増大が（非遺伝毒性誘導メカニズムの指標である）pr1株における匹敵し得る増大によって伴われていない場合にのみ、化合物は遺伝毒性があるとみなされる。pr1株に対するrecN2 -4のＳ／Ｎ比率が１．５（実験背景上の限定セット）と等しいか又は１．５より高い場合、化合物は遺伝毒性があるとみなされる。このようにして「偽陽性」の結果は回避されることができる。「偽陰性」の結果はrecN2-4株のＳ／Ｎ比率が０．８〜１．２の間にあるがpr1 センサーのＳ／Ｎ比率が０．８より低い場合に同定され得る。これは遺伝毒性であると同時に毒性でもあるサンプルについて通常あてはまる。 pr1株は毒性の評価についても極めて有用である。細菌毒性は光放出が用量依存的に実質的に減少しており、試験の開始３０分以内に０．８より低いＳ／Ｎ比率となった場合に推定される。システムの自動化は図６に記載の如き装置を用いて可能である。上述の通り診断システムから放出されるシグナルのための少なくとも一つの検出器を含む検出装置（２）は上述の通りのそして図５に分類される通りの分析方法に従って検出データを受け取って処理するコンピュータ（１）に接続されている。このようにしてサンプルの自動化された分析及び毒性及び／又は遺伝毒性としての分類が可能である。試験化合物 TA104 recN2-4株のみを用いて以前に評価されたいくつもの商業的に入手可能な周知化合物（van der Lelie等，1997参照）は本研究においてはTA104 recN2-4 及びTA104 pr1株を用いて再評価された。それらは表１に与えられている。結果ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験を用いて以前に報告された結果はサルモネラ・チフィムリウム株TA104 recN2-4で得られたものであった（van der Lelie等， 1997）。試験を更に改良するため、我々はpr1株を導入した。recN2-4株において得られた結果は、増大した光生産が遺伝毒性によるのではあり得ないpr1株において得られた結果と比較して評価されるべきである。それ故、recN2-4株における光生産の増大はこれがpr1株における光生産の匹敵し得る増大によって伴われていない場合にのみ遺伝毒性の指標として解釈することができる。両方の細菌株を用いて我々は以前に研究された化学物質を再評価した。結果は表１に与えられている。表はrecN2-4試験株において最大Ｓ／Ｎ値が２より大きくなる濃度並びに最大及び平均recN2-4 Ｓ／Ｎとpr1 Ｓ／Ｎの間の比率が１．５以上になる（rec／pr1）濃度を与える。最後に表は試験されてpr1 Ｓ／Ｎ曲線によって評価される用量範囲内の毒性の存在をも示す。知られた遺伝毒性化合物は実際に遺伝毒性があるとして評価され、一方、非遺伝毒性化合物は所定の用量範囲において必要なＳ／Ｎ比率を示さなかったことが分かる。結果のいくつかの例は図１−４において図示された（Ｓ９混合物なしの試験の例）。図１はrecN2-4 及びpr1株におけるエピクロロヒドリンについてのＳ／Ｎ曲線を与える。recN2-4 株においてはＳ／Ｎ値は２５６ppmの用量で２よりも大きくなるが、pr1株においてはＳ／Ｎ値は１から大きくははずれなかった。図２は遺伝毒性はないが７．４ μＭより高い濃度でサルモネラ・チフィムリウムTA104にとっては毒性があるZnC l₂についての結果を与える。アジ化ナトリウムは図３において第三の例として与えられている。ここではＳ／Ｎ比率はrecN2-4及びpr1株の両方において２よりもかなり高く、毒性の指標が時間と共に得られる（Ｓ／Ｎ＜０．８）。図４はニフロキサアザイドについて得られた結果を示す。recN2-4株については低用量は高用量よりも明らかにずっと遺伝毒性があったが、pr1株は光生産において用量依存性の減少を示し、毒性があることを示した。考察ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験は遺伝毒性化合物を検出する敏感で迅速な方法である（van der Lelie等，1997）。しかし、（最初に行われていたように）r ecN2-4株のみが用いられた場合、いくつかの解釈の誤りが起こり得る。本発明は pr1株の使用に基づいている。pr1株を加える価値はいくつかの例によって示された。図１においては所定の用量範囲においては毒性ではない遺伝毒性化合物（エピクロロヒドリン）の例が与えられている。recN2-4株のみから得られた結果に基づくと、「ノイズ」値の２倍を越える光生産における用量依存性の増大が観察されたので（Ｓ／Ｎ＞２）、化合物は遺伝毒性であると結論するかもしれない。 pr1株の算入のみがこの評価を確認することができる。もしもpr1株において光生産の増大が見出されたならば、これは遺伝毒性以外の他の誘導メカニズム（例、未暴露培養物の「ノイズレベル」と比較すると「ノイズレベル」を増大させる細胞増殖の増大）によるものであると結論付けることができたはずであった。しかし、これは真相ではなかった。光生産の減少はなかったので、毒性の徴候はなかった。これは図２の曲線によって示される通りZnCl₂については明らかに正しかった。recN2-4株についての図は３．７μＭの用量は遺伝毒性でも毒性でもないが、高い用量では低用量におけるある種の回復に引き続く毒性効果を示唆する光放出の減少が観察されたことを示す。このことは回復が５８．８μＭのZnCl₂までの用量においてより一層目に見えるpr1株によって確認される。１１７．５μ Ｍ以上のZnCl₂では、回復はもはや不可能である。このようにZnCl₂は非遺伝毒性であり、低用量においてのみいかなる毒性を持たないように見えることが示された。導入部及び材料及び方法セクションにおいて示唆された通り、ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験はＳＯＳシグナルの検出に本質的に基づいている。それ故、それはエイムス試験よりもＳＯＳ染色試験と一致する結果を理論的に生み出す。それでもいくつかの差異が以前に見出されている。例えば発明者らはアジ化ナトリウムについて「陽性」の応答を報告しているがこの化合物はＳＯＳ染色試験においては通常「陰性」の結果を与える（van der Lelie等，1997）。この矛盾に対する一つの理由はＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験はエイムス試験のサルモネラ・チフィムリウムTA104株を用いているので（大部分の薬品化合物と）同様の特性（例えばDNA修復能力の減少及び複合分子の透過性の増大）を持つということがあり得る。これは多くの事例において確かに有効な説明ではあるものの、アジ化ナトリウム（N₃Na）の如き小分子についてはたぶん有効な説明ではないであろう。ここにおいてＳＯＳ染色試験の結果との差異についての別の理由を予測することができる。例えばrecN2-4株において見出されるような光生産の増大は遺伝毒性以外の他の誘導メカニズムによるものであるとすることができる。pr1株の導入によってこの憶説を証明することができる。図３から分かる通り、recN2-4 株において観察される光生産は遺伝毒性によるものではない。というのも、pr1 株においても光放出の増大が観察され、これはＳＯＳ応答によるものではあり得ないからである。従って、アジ化ナトリウムは我々の試験では非遺伝毒性として解釈される。それはrecN2-4株のみが用いられた場合には「偽陽性」の結果を与える「化合物」の良い例である。発明者らは一層多くの薬品化合物を試験し、他の細菌試験と比較した。異なる試験によって得られた結果は多くの場合、相互に完全に一致していた。ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験においては最小検出可能濃度がエイムス又はＳＯＳ染色試験よりも１−１００倍低いので、ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験はエイムス又はＳＯＳ染色試験よりもずっと敏感である。 pr1株を用いる他の利点は遺伝毒性以外に毒性がrecN2-4株のみを用いる場合よりもより良く評価することができるということである。毒性しきい値付近の用量レベルで調査される遺伝毒性化合物は遺伝毒性と毒性の「中間」のＳ／Ｎ比率を recN2-4株において示すことがあり得る。というのも（遺伝毒性による）光生その化合物は遺伝毒性でもなければ毒性でもない（偽陰性の結果）として解釈されるであろう。pr1株は光放出の減少を明らかに示すので、その化合物が所定の用量で既に毒性であるということが示唆される。このことはニフロキサアザイドが一例としてとられている図４において少なくともいくらかの用量について示されている。用量依存性毒性のため、低用量が最大の遺伝毒性応答を与えたことが分かる。pr1株についてのＳ／Ｎ曲線は０．１６ppmまでの低用量のみが毒性でなかったことを明らかに示唆する。高用量は遺伝毒性と組合された毒性を示す（例、０．３２ppm）か又は毒性が強すぎて遺伝毒性を示さない（最高用量）かもしれない。 recN2-4及びpr1株は両方とも化合物の毒性濃度を検出することができることが示された。しかし、毒性試験においてはpr1株の方がずっと有用である。というのもＳ／Ｎ曲線は遺伝毒性によって影響を受けることがあり得ないので毒性（又はその不在）のみを反映するからである。毒性評価のみに関心がある人にとってはpr1株は完璧なツールを明らかに提供する。我々は現在、pr1株を用いた場合の化学物質及び複合混合物の毒性評価をMicrotox（登録商標）試験を用いた場合のそれと比較している。後者は現在最もよく用いられており国際的に受け入れられている微生物毒性試験であり、同様に生物発光に基づいている（Hasting，1 ば、ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験はMicrotox（登録商標）試験と同様の結果を与えるが、前者の方が行うのがより容易でありしかも一層敏感であることが多い。従ってＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験又はそのpr1要素は少なくともこれらの予備結果が確認できる場合、極めて価値のある毒性試験である。結論としてTA104 recN2-4及びTA104 pr1サルモネラ・チフィムリウム株は極めて価値のある遺伝毒性及び／又は毒性試験システムを提供するということを強調することができる。両方の株は遺伝毒性試験のために一緒に用いられるべきであるが、pr1株は毒性試験のみに必要である。ＶＩＴＯＴＯＸ（登録商標）試験は化学物質の（遺伝）毒性に関して極めて迅速（２−４時聞以内）でかつ極めて敏感な解答を提供すること、及びそのために新規化学物質及び中間生成物のスクリーニング及び予備スクリーニングにおいて極めて有用であることが示された。試験は９６ウェルプレートで行われるので、一日当たり８の化学物質（代謝酵素画分Ｓ９の添加あり及び添加なしで）、又は一週間当たり４０の化学物質を調査することが少なくとも可能である。測定は自動的に行われ、データの収集及びデータの処理もほとんど完全に自動化することができる。マイクロプレートの自動化はこの速度を１０倍大きくすることができるであろう。例えばプレート当たりのウェルの数を増大させることによるスケールアップも明らかである。従って人件費は最大限に削減される。最後に、追加的でかつ極めて重要な利点は極めて少量の試験化合物しか必要でない（２０ｍｇ未満）ということである。このことは薬品産業にとっては特に重要である。というのもそこでは発見段階においてはほんの数１００ミリグラムの化合物しか利用できないからである。かかる新規化学物質を（大部分の）他の試験システムでスクリーニングすることは全く不可能である。株「pr1」の寄託はブダペスト条約に従って寄託番号ＬＭＧＰ−１８３１８ Universiteit Gent，K.L．Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，Belgiumにおいて行われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42）Ｃ１２Ｒ 1:42）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者タガヴィ，サフィベルギー，ベ―4000 リエージュ，ボワトポスタル 71，ケドロム 85 (72)発明者コルビシェ，フィリップジルベールジスランベルギー，ベ―2400 モル，ボーレタン 222 (72)発明者ヴェルシェヴ，ルュクフィリパヌエドゥアルベルギー，ベ―1160 ブリュッセル，ゲブローデルゴメルラーン 36

Claims

【特許請求の範囲】 1. 以下のものからなる診断システム： − 環境傷害に暴露されるとレポーター活性を増大させることができる形質転換された微生物（ただし前記微生物はアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーター分子をコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されているストレス誘導可能なプロモーター配列を持つ）、及び − アッセイ可能なシグナルを生ずるレポーター分子をコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている、構成的であってストレス誘導可能でないプロモーター配列を持つ形質転換された微生物。 2. シグナルが光生産及び／又は色彩変化としてアッセイされる請求の範囲１のシステム。 3. 形質転換された生物発光性微生物がイー・コリである請求の範囲１又は２のシステム。 4. 形質転換された生物発光性微生物がサルモネラ・チフィムリウム、好ましくは好適なエイムス試験用微生物であり、有利にはTA98，TA100，TA102，TA104 ，TA1535，TA1538，TA700l〜TA7006，及びTA7041〜TA7046から選択されるか、及び／又は寄託番号ＬＭＧＰ−１８３１８の微生物を持つ請求の範囲１又は２のシステム。 5. ストレス誘導可能なプロモーター配列が、groEL，dnaK，grpE，phoA，gln A，lon，lysU，rpoD，clpB，clpP，uspA，katG，uvrA，frdA，micF，fabA，lac ，his，sodA，sodB，soi-28，recA，xthA，narG，recF，recJ，recN，recO，rec Q，ruv，uvrD，ars，cad，mer，pco及びsfiAからなる群から選択される請求の範囲１〜４のいずれかのシステム。 6. 構成的であってストレス誘導可能でないプロモーター配列がSigma 70コンセンサス配列（TTGACA(-35)……17/18bp……TATAAT(-10)）を持つ配列であり、その転写がプロモーターレベルで正の調節又は負の調節を受けていない請求の範囲１〜５のいずれかのシステム。 7. レポーターコード核酸配列がルシフェラーゼＡ及びＢ遺伝子又はluxAB翻訳融合遺伝子を含む請求の範囲１〜６のいずれかのシステム。 8. レポーターコード核酸配列がルシフェラーゼＡ及びＢ遺伝子、及び再生利用される制限脂肪酸基質の生産に要求されるルシフェラーゼＣ，Ｄ及びＥ遺伝子を含む請求の範囲１〜７のいずれかのシステム。 9. 環境傷害がサンプルへの遺伝毒性及び／又は毒性化合物の存在である請求の範囲１〜８のいずれかのシステム。 10. 請求の範囲１〜９のいずれかの診断システムの要素、及び所望により必要な付加的な反応剤、希釈剤及び／又は固体支持体を含む診断キット。 11. 以下のステップを含む、環境傷害の診断のための、好ましくはサンプル中の遺伝毒性及び／又は毒性化合物の存在を決定するための方法： − 請求の範囲１〜８のいずれかの診断システムを前記環境傷害に暴露させ、そして − 前記診断システムの形質転換された生物発光性微生物のシグナルを測定する。 12. サンプル中の化合物の遺伝毒性の速度を測定する方法であって、誘導可能な形質転換された微生物及び構成的な形質転換された微生物の両方の発光の測定を様々な時点で、好ましくは連続的に行い、それに加えて前記時点で形質転換された微生物についてのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比率を測定し、誘導可能な微生物のＳ／Ｎ比率を構成的微生物のＳ／Ｎ比率で割ってこれらのデータをプロットする（ただし前記プロットはサンプル中の遺伝毒性化合物の遺伝毒性の修正された速度を表す）ステップを行う方法。 13. 以下のステップを含む環境傷害の分析方法： − 請求の範囲１１に記載されたように前記環境傷害の診断を行い、 − 両方の形質転換された微生物のシグナル対ノイズ比率を計算し、 − 少なくとも一つの計算されたシグナル対ノイズ比率が０．８より低い場合、前記環境傷害を毒性として分類し、 − ストレス誘導可能なプロモーター配列を含む微生物のシグナル対ノイズ比率が０．８〜１．２の間である場合、前記環境傷害を影響なしとして分類し、そして − ストレス誘導可能なプロモーター配列を含む微生物のシグナル対ノイズ比率が１．２より高く、かつ構成的プロモーター配列を含む微生物のシグナル対ノイズ比率よりも少なくとも５０％高い場合、前記環境傷害を誘導的でかつ遺伝毒性があるとして分類する。 14. 以下のものを含むサンプル中の化合物が遺伝毒性及び／又は毒性であるかどうかを測定するための装置：前記サンプルによって誘導される請求の範囲１〜９のいずれかに記載の診断システム、前記診断システムからのシグナルをアッセイすることができる検出装置（２）を含む検出システム（ただし前記検出システムは請求の範囲１１〜１３のいずれかによる分析方法を行うようにプログラムされたコンピューター（１）に接続されている）。