CN114736976B

CN114736976B - 用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物与试剂盒

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Publication number: CN114736976B
Application number: CN202210457917.9A
Authority: CN
Inventors: 郭立芸; 刘秀; 谢鑫; 梁玉林; 徐文文; 宋玉梅; 贾风超; 宋全厚
Original assignee: Beijing Yanjing Beer Group Corp; Sinolight Inspection and Certification Co Ltd
Current assignee: Beijing Yanjing Beer Group Corp; Sinolight Inspection and Certification Co Ltd
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2042-04-28
Also published as: CN114736976A

Abstract

本发明公开了用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物与试剂盒。本发明公开的用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物由名称分别为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的引物组成，F3、B3、FIP、BIP、LF和LB分别为序列表中序列1‑6所示的单链DNA。本发明用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物可以检测干酪乳杆菌，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速便捷等优点，利用环介导等温扩增方法扩增干酪乳杆菌特异性基因片段，填补了啤酒中干酪乳杆菌LAMP检测方法的空白，本发明适用于酒厂基层应用和现场快速检测。

Description

用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物与试剂盒。

背景技术

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)属革兰氏阳性菌，乳杆菌属，是典型啤酒腐败菌之一。与短乳杆菌、林氏乳杆菌相比，干酪乳杆菌引起的啤酒腐败事件较少，但干酪乳杆菌产生双乙酰的能力强，一旦污染干酪乳杆菌将会使啤酒产生不能接受的黄油味，给消费者产生不好的感官体验。干酪乳杆菌的实时检测成为啤酒厂质量监控亟待解决的一大问题。

目前国内常用的啤酒干酪乳杆菌检测方法为传统检测法，通过专项培养基对其进行培养检测，检测时间通常为3天以上，无法及时为企业提供风险预警。此外ATP生物发光法、免疫学方法和聚合酶链式反应PCR也被广泛研究。ATP生物发光法通过荧光素、荧光素酶与镁离子、氧及生物体内ATP发生酶反应产生荧光，进而完成微生物活菌计数，是一种啤酒腐败菌定量的快速检测方法。1988年英国sussex大学举行的ATP生物发光法学术讨论会中也就ATP检测法在生物、医学、食品方面应用进行阐述。但ATP生物发光法仅能用于定量检测，当需对微生物进行定性时，ATP法的弊端就会显露出来。免疫学方法是依据抗原抗体特异结合反应进行目标微生物检测，2000年TSUCHIYA等人利用乳酸菌细胞免疫小鼠获得单克隆抗体，实现啤酒中乳酸菌污染程度快速预测，此后MARCH、CHABAN等人也对此进行研究。与其他方法相比，免疫学方法在特异性方面具有极大优势，精确度高，但价格昂贵，难以满足酒厂大批量检测需求。此外PCR技术也是20世纪以来广受关注的一种微生物检测方法。PCR技术通过反复变温完成引物与核酸的结合扩增，进而实现微生物定性鉴定，应用该技术进行的检测特异性好，灵敏度较高，且避免了繁琐的操作步骤，极大程度降低了检测耗时。但PCR方法也具有一定局限性，对实验人员和仪器精密度要求高，且核酸提取检测过程需有严格实验分区，众多因素使其无法在车间基层得到有效应用。

环介导等温扩增技术LAMP是21世纪以来新兴的一种基因扩增检测技术，自发明起便受到世界卫生组织、相关政府部门的广泛关注。该技术是由4条引物针对靶基因6个特定区域在等温60-65℃下完成核酸扩增检测，与前两种方法相比，LAMP技术具有操作简单、特异性强、产物检测便捷等特点，目前已被广泛应用于各种病毒、微生物检测，并得到国内外学者、企业认可。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定干酪乳杆菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一个引物组，所述引物组由名称分别为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的引物组成；

所述F3为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述B3为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述FIP为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述BIP为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述LF为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述LB为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组为基于环介导等温扩增的引物组。

所述引物组的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌；(b2)检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌。

所述引物组中，F3、B3、FIP、BIP、LF、LB的摩尔配比依次为1:1:8:8:4:4。

本发明还提供了所述引物组的下述任一应用：

X1)制备鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌试剂或试剂盒；

X2)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌试剂或试剂盒；

X3)鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌；

X4)检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌。

本发明还提供了一种试剂，所示试剂包括所述引物组。

所述试剂还可包括进行LAMP反应所需的其他试剂。所述其他试剂可为IsothermalMaster Mix(中轻检验认证有限公司，货号为ISO-004)。

所述试剂可由所述引物组与Isothermal Master Mix组成。每11μL所述试剂可包含：外游引物F3 2.5pmol、B3 2.5pmol，内游引物FIP 20pmol、BIP 20pmol，环引物LF10pmol、LB 10pmol，Isothermal Master Mix7.5μL。

所述试剂在鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述试剂在检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种含有所述引物组或所述试剂的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：(b1)鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌；(b2)检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌。

所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒在检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测微生物的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以提取核酸为模板的特异性扩增，待测微生物为或候选为干酪乳杆菌；如果所述引物组不能实现以提取核酸为模板的特异性扩增，待测微生物为或候选为非干酪乳杆菌。

本发明还提供了一种检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以提取核酸为模板的特异性扩增，所述待测样本含有或候选含有干酪乳杆菌；如果所述引物组不能实现以提取核酸为模板的特异性扩增，所述待测样本不含有或候选不含有干酪乳杆菌。

上述方法中，所述待测样本可为啤酒样本。

采用所述引物组进行环介导等温扩增的反应体系可为(12.5μL)：IsothermalMaster Mix 7.5μL，所述引物组3.5μL，待测模板溶液1.5μL。3.5μL引物组中，各引物含量为：外游引物F3 2.5pmol、B3 2.5pmol，内游引物FIP 20pmol、BIP 20pmol，环引物LF10pmol、LB 10pmol。

采用所述引物组进行环介导等温扩增的反应条件可为：65℃、30min。

本发明的有益效果：(1)灵敏度高：比传统PCR方法高出1-2个数量级；(2)特异性强：针对靶基因6个特定区域进行引物互补延伸，完成核酸扩增过程，特异性强；(3)检测耗时短：2条环引物的引入，使反应可以在30min内完成从几个拷贝的靶基因扩增到109水平；(4)操作简单：不论DNA还是RNA，仅需将引物、酶和核酸模板混合于反应管中，60-65℃恒温30min即可完成扩增过程；(5)仪器精密度要求低：无需特殊仪器，一台水浴锅或恒温箱即可实现扩增反应；(6)结果检测简单：无需PCR扩增后凝胶电泳检测步骤，LAMP扩增后结果可通过白色焦磷酸镁沉淀或SYBR GreenⅠ试剂颜色反应直接判断，也可应用荧光反应试剂进行目标扩增实时监控，简单直观。

本发明利用环介导等温扩增技术扩增干酪乳杆菌特异性基因片段，填补了啤酒中干酪乳杆菌LAMP检测方法的空白，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速便捷等优点，适用于酒厂基层应用和现场快速检测。

附图说明

图1为实施例2中特异性检测的荧光扩增曲线。

图2为实施例3中LAMP的荧光扩增曲线。

图3为实施例3中实时荧光PCR的荧光扩增曲线。

图4为对比例中分别采用三个引物组进行LAMP反应的荧光扩增曲线。

图5为对比例中采用P3引物组进行LAMP反应的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、用于鉴定干酪乳杆菌的引物组的制备

本实施例提供的用于鉴定干酪乳杆菌的引物组由六条引物组成，序列如下：

外游引物F3(序列表的序列1)：5’-GCGCGGTACTGTTTACCTT-3’；

外游引物B3(序列表的序列2)：5’-AGAGCGAAATCGCTACACAA-3’；

内游引物FIP(序列表的序列3)：5’-CACTTCGCCGATCAACCGCGACTGAACGCGCTATCGAATC-3’；

内游引物BIP(序列表的序列4)：5’-TGGCTATTCACATGGCTCGGACCCCGAAGCAGGAGACGAA-3’；

环引物LF(序列表的序列5)：5’-CCAGCGCCGAATTAACAACA-3’；

环引物LB(序列表的序列6)：5’-TTGGCAACTGGCCAATGGTGG-3’。

用于鉴定干酪乳杆菌的引物组引物组中，外游引物F3、外游引物B3、内游引物FIP、内游引物BIP、环引物LF与环引物LB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

实施例2、特异性

供试菌分别为：干酪乳杆菌CICC6117(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌CICC20994(Lactobacillus casei)、短乳杆菌CICC24450(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌CICC20261(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌CICC6047(Lactobacillusdelbrueckii)、嗜酸乳杆菌CICC6074(Lactobacillus acidophilus)、长双岐杆菌CICC6069(Bifidobacterium longum)、乳酸乳球菌CICC6242(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌CICC6038(Streptococcus thermophilus)、枯草芽孢杆菌CICC24713(Bacillussubtilis)、戊糖片球菌CICC21862(Pediococcus pentosaceus)、肠膜明串珠菌CICC20714(Leuconostoc mesenteroides)、铜绿假单胞菌CICC10204(Pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希氏菌CICC10003(Escherichia coli)。各菌株均为CICC产品，CICC即中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)，http:// sales.china-cicc.org/。

1、制备模板溶液

取10⁵CFU/mL供试菌菌液，99℃处理5min，以4℃终止反应，收集上清液，得到各菌种核酸模板溶液。

2、进行LAMP反应

利用实施例1的引物组进行LAMP反应，环介导等温扩增的反应体系(12.5μL)：Isothermal Master Mix 7.5μL，引物组3.5μL，模板溶液1.5μL。3.5μL引物组中，各引物含量为：外游引物F3 2.5pmol、B3 2.5pmol，内游引物FIP 20pmol、BIP 20pmol，环引物LF10pmol、LB 10pmol。其中Isothermal Master Mix：中轻检验认证有限公司，货号为ISO-004。

设置用无菌双蒸水代替模板溶液作为阴性对照。

环介导等温扩增的反应条件：65℃、30min。反应在GenieⅡ实时荧光检测仪中进行。

荧光扩增曲线见图1。2株干酪乳杆菌均能产生荧光扩增曲线，其它供试菌未能产生荧光扩增曲线。结果表明，实施例1的引物组具有很好的特异性。

实施例3、灵敏度

供试菌为：干酪乳杆菌CICC6117。

1、制备模板溶液

通过平板计数确定供试菌菌悬液浓度，以无菌生理盐水对其进行10倍梯度稀释，得到菌浓度为10⁰-10⁵CFU/mL梯度的菌悬液。取菌悬液，99℃处理5min，最终以4℃终止反应，收集上清液，获得干酪乳杆菌不同浓度的核酸模板溶液。

2、进行LAMP反应

采用实施例1的引物组进行LAMP反应，反应体系同实施例2。

设置用无菌双蒸水代替模板溶液作为阴性对照。

反应条件：65℃、30min。反应在GenieⅡ实时荧光检测仪中进行。

荧光扩增曲线见图2。10²-10⁵CFU/mL浓度菌悬液的核酸可以产生荧光扩增曲线，10²CFU/mL及以下浓度的菌悬液均无荧光扩增曲线。表明，经简单核酸提取，特异引物组对干酪乳杆菌的检测灵敏度为10²CFU/mL。

3、进行实时荧光PCR

反应体系(20μL)：TB Green Fast qPCR Mix(2X)10μL，ROX Reference Dye(50X)0.4μL，实施例1的外游引物F3和B3，模板溶液2μL，余量为水。反应体系中，各引物含量为：外游引物F38pmol、B3 8pmol。

反应条件：95℃30s；95℃ 5s、60℃15s，45个循环。反应在ABI7900实时荧光检测仪中进行，对于Ct值≤40的扩增结果判定为阳性。

荧光扩增曲线见图3。10³-10⁵CFU/mL浓度菌悬液的核酸可以产生荧光扩增曲线，检测灵敏度为10³CFU/mL。结果表明，经同样核酸提取步骤，本发明的LAMP检测法比实时荧光PCR的灵敏度高10倍。

实施例4、制备用于检测干酪乳杆菌的LAMP检测试剂

检测试剂：Isothermal Master Mix 7.5μL，实施例1的引物组的各条引物。11μL检测试剂中各引物含量为：外游引物F3 2.5pmol、B3 2.5pmol，内游引物FIP 20pmol、BIP20pmol，环引物LF 10pmol、LB 10pmol。

检测试剂的使用方法：取11μL检测试剂，加入1.5μL待测样本的核酸模板，于GenieⅡ实时荧光检测仪进行LAMP反应。反应条件：65℃、30min。反应结果通过荧光扩增曲线判定。

对比例、不同引物组的效果比较

发明人还检测了其他两个LAMP引物组(P1引物组、P2引物组)对干酪乳杆菌的检测效果，各引物组的序列如表1所示，检测步骤具体如下：

表1

供试菌为：干酪乳杆菌CICC6117。

1、取10⁵CFU/mL供试菌菌液，99℃处理5min，以4℃终止反应，收集上清液，得到干酪乳杆菌核酸模板溶液。

2、进行LAMP。

分别采用三个引物组进行LAMP反应，环介导等温扩增的反应体系(12.5μL)：Isothermal Master Mix 7.5μL，引物组3.5μL，模板溶液1.5μL。3.5μL引物组中，各引物含量均为：外游引物F3(表1中的P1-F3、P2-F3或P3-F3)2.5pmol、B3(表1中的P1-B3、P2-B3或P3-B3)2.5pmol，内游引物FIP(表1中的P1-FIP、P2-FIP或P3-FIP)20pmol、BIP(表1中的P1-BIP、P2-BIP或P3-BIP)20pmol，环引物LF(表1中的P1-LF、P2-LF或P3-LF)10pmol、引物LB(表1中的P1-LB、P2-LB或P3-LB)10pmol。

每个引物组均设置用无菌双蒸水代替模板溶液作为阴性对照。

荧光扩增曲线结果见图4。无论是扩增时间还是荧光值，P3引物组均优于其他引物组。P3引物组的退火温度为88℃(见图5)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>北京燕京啤酒股份有限公司、中轻检验认证有限公司

<120>用于鉴定干酪乳杆菌的专用引物与试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

gcgcggtact gtttacctt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

agagcgaaat cgctacacaa 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cacttcgccg atcaaccgcg actgaacgcg ctatcgaatc 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tggctattca catggctcgg accccgaagc aggagacgaa 40

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ccagcgccga attaacaaca 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ttggcaactg gccaatggtg g 21

Claims

1.引物组，由名称分别为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的引物组成；

所述F3为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述B3为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述FIP为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述BIP为序列表的序列4所示的单链DNA分子；

所述LF为序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述LB为序列表的序列6所示的单链DNA分子。

2.权利要求1所述引物组的下述任一应用：

X1）制备鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌试剂或试剂盒；

X2）制备检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌试剂或试剂盒；

X3）鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌；

X4）检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌。

3.一种试剂，包括权利要求1所述引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括进行LAMP反应所需的其他试剂。

5.权利要求3或4所述试剂在鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌中的应用；

或，权利要求3或4所述试剂在检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌中的应用。

6.含有权利要求1所述引物组或权利要求3或4所述试剂的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（b1）或（b2）：（b1）鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌；（b2）检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌。

7.权利要求6所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌中的应用；

或，权利要求6所述试剂盒在检测或辅助检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌中的应用。

8.一种鉴定或辅助鉴定干酪乳杆菌的方法，包括如下步骤：

（1）提取待测微生物的核酸；

（2）以步骤（1）提取的核酸为模板，采用权利要求1所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以提取核酸为模板的特异性扩增，待测微生物为或候选为干酪乳杆菌；如果所述引物组不能实现以提取核酸为模板的特异性扩增，待测微生物为或候选为非干酪乳杆菌。

9.一种检测待测样本中是否含有干酪乳杆菌的方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样本的核酸；

（2）以步骤（1）提取的核酸为模板，采用权利要求1所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以提取核酸为模板的特异性扩增，所述待测样本含有或候选含有干酪乳杆菌；如果所述引物组不能实现以提取核酸为模板的特异性扩增，所述待测样本不含有或候选不含有干酪乳杆菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待测样本为啤酒样本。