PT977896E - Sistema de diagnóstico e método para determinação na presença de um composto genotóxico numa amostra - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

SISTEMA DE DIAGNÓSTICO E MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE UM COMPOSTO GENOTÓXICO NUMA AMOSTRA

Campo da invenção [0001] 0 presente invento .refere-se a um sistema de diagnóstico e a um. método para determinar a presença de um composto genotóxico numa amostra.

Bases do invento e estado da técnica [0002] O Pedido de Patente Internacional W09741251 descreve uma sequência de ácido nucleico recombinante, um microrganismo hospedeiro compreendendo a dita sequência de ácido nucleico e o use desse microrganismo hospedeiro para detecção da presença de compostos genotóxicos numa amostra. 0 aludido teste de genotoxicidade bacteriana é baseado em bioiuminescência e permite uma detecção de compostos genotóxicos fácil, muito rápida e barata. O teste mostrou ser pele menos tão sensível como o teste Ames e o cromoteste SOS e permitir a medição da cinética da genotoxicidade, bem como a avaliação simultânea da toxicidade do ccmposuo ou material testado (van der Lelie et al., 1997). Este novo teste, referido como teste VITOTOX®, foi, portanto, considerado como sendo um. valioso teste de genotoxicidade e toxicidade de curto prazo, para diferentes propósitos.

[0003] 0 teste é baseado em bactérias que contêm o operâo lux de Víbrio fischeri sob controlo transcritivo do gene recN, que faz parte do sistema SOS. Após a incubação das bactérias na presença de compostos genotóxicos, o promotor recN é desreprimido, resultando na expressão do operão lux. Esta expressão resulta na produção de luz em função da genotoxicidade. Originalmente, o teste foi realizado com diferentes estirpes modificadas de

Escherichia coli e Salmonella typhimurium. As estirpes Salmonella typhimurium (TA98, TA1Q0 e TA104) foram adicionalmente usadas, já que as bactérias são bastante conhecidas para testes de mutagenicidade e porque as mesmas bactérias poderão também ser usadas num teste clássico Ames, caso tal seja requerido. A construção que usa um promotor recN até à mutação (recN 2-4), dá os melhores resultados em todas as estirpes. Além disso, uma vez que todas as estirpes Salmonella deram resultados muito comparáveis, foi proposto, para uso posterior, utilizar apenas as construções TA104 [chamadas TA104 (recN2-4)j já que mostraram ser, por vezes, um pouco mais sensíveis do que as outras estirpes híbridas (van der Lelie et al., 1997).

[0004] No entanto, alguns compostos actuara directamente na produção de luz (p. ex., aldeídos e solventes orgânicos) ou aumentam o metabolismo das bactérias criando resultados falsos positivos.

Objectivos do invento [0005] 0 presente invento tem por objectívo fornecer um novo sistema de diagnóstico e um novo método, para a detecção de uma agressão ambiental - como sei a a presença de um composto genotóxíco numa amostra · que não apresentem as desvantagens do estado da arte.

[0006] Um objectívo principal do presente invento é o de fornecer um novo sistema de diagnóstico e um novo método que excluam resultados falso-positivos e falso-negativos.

[0007] Um outro objectívo do presente invento é o de fornecer um sistema de diagnóstico e um método que possam ser usados para o rastreio de compostos genotóxicos obtidos no campo da indústria química, cosmética ou farmacêutica, como um estudo de pré-validação de compostos químicos, cosméticos e/ou farmacêuticos intermediários ou activos.

[0008] Um último objectivo do presente invento é o de fornecer um sistema de diagnóstico e de método que possibilitem o rastreio automático com base num volume de amostra muítc pequeno.

Descrição do invento [0009] 0 presente invento refere-se a um sistema de diagnóstico feito de: um microrganismo transformado capaz de uma elevada activídade informativa quando exposto a uma agressão ambiental, preferencialmente uma exposição a um composto genotóxico, microrganismo esse possuindo uma sequência promotora induzida pela tensão, preferencíalmente uma sequência promotora que é induzida por um composto genotóxico, sendo operativamente ligada a uma sequência informativa codificadora de ácidos nucleicos codificando uma molécula informativa que resulta num sinal que pode ser analisado, e de um microrganismo transformado tendo uma sequência constitutiva e promotora não induzida pela tensão, preferencialmente uma sequência constitutiva e promotora que não é induzida por tal composto genotóxico, sendo tal sequência promotora operativamente ligada a uma sequência informativa codificadora de ácidos nucleicos codificando uma molécula informativa que resulta num sinal que pode ser analisado.

[0010] Preferencialmente, ambos os microrganismos cransformados são bioluminescentes e o sinal pode ser analisado como produção de luz. Outras possibilidades sãc a peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactose e a sequência genética gus, onde o sinal será analisado como uma modificação colorimétrica ou uma produção de luz quimiluminescente quando usado um analisador colorimétrico ou um aparelho fctomultiplicador.

[0011] Vantajosamente, o sistema de diagnóstico de acordo com o invento é feito de dois microrganismos bioluminescentes transformados, sendo o primeiro microrganismo bioluminescente "activado" na presença de um composto genotóxico, o que resulta num sinal que pode ser analisado como produção de luz, enquanto que a produção de luz do segundo microrganismo bioluminescente não é influenciada pela presença de um composto genotóxico na amostra.

[0012] A sequência de ácidos nucleícos codificadora de um repórter que resulta num sinal que pode ser analisado como produção de luz já foi descrita no estado da técnica. Preferencialmente, os microrganismos bioluminescentes transformados de acordo com o invento compreendem os genes A e B da luciferase, também identificados como complexo expressivo de genes lux, compreendendo os genes luxA e luxB ou um gene iuxAB de tradução de fusão. Os microrganismos bioluminescentes transformados também podem compreender os genes C, D e E da luciferase requeridos para a produção de substrato de ácido gordo limirador que é usado na reciclagem.

[0013] De acordo com uma materialização preferencial do presente invento, o sistema de diagnóstico compreende um microrganismo bioluminescente transformado, tendo uma sequência constitutiva e promotora não induzida pela tensão, com uma sequência de consenso Sigma 70 (ITGACA ("35)......17/18bp......TATAAT (-10) e cuja transcrição não esta regulada positiva ou negativamente a nível do promotor. Tal promotor de consenso é descrito em HOOPES 3C e McClure WR (1987): Strategies in Regulation of Transcriptional Initiation; in Escherichia Col i and Salmcnella typhimuzium, Cellular and Molecular Biology, FC Neidhart, JL Ingraham, KB Low, B Maganasik, M Schaechter, HE Umbaeger (eds.), American Society for Microbiology, Washington D.C., pp 1231-1240.

[0014] De acordo com uma materialização preferencial dc presente invento, os microrganismos bioluminescentes transformados são seleccíonados do grupo consistindo de E. colí. cu Salmonella thyphimurium e são vantajosamente microrganismos adequados ao teste times, preferencialmente seleccionados do grupo que contém TA98, TA100, TA102, TA104, TA1535, TA1538, TA7001 a TA7006 e TA7041 a TA7046, ou tendo c microrganismo com número de depósito LMG P-18318. 0 microrganismo com número de depósito LMG P-18318 será doravante identificado como estirpe "prl".

[0015] Vantajosamente, a sequência promotora induzida pela tensão no microrganismo bioluminescente transformado do sistema de diagnóstico de acordo com o invento é seleccionada do grupo compreendendo groEL, dnaK, grpE, phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, micF, fabA, lac, his, scdA, sodB, soi-28, recA, xthA, narG, recF, recJ, recN, recO, recQ, ruv, uvrD, ars, cad, mer, pco e sfiA.

[0016] De acordo com uma materialização preferencial do presente invento, a sequência promotora induzida pela tensão é recN, vantajosamente recN2-4. Tal microrganismo será doravante identificado como estirpe "recN2-4”.

[0017] Numa materialização preferencial, o sistema de diagnóstico de acordo com o invento compreende um microrganismo bioluminescente transformado que tem uma sequência promotora induzida pela tensão que é uma sequência promotora regulada por SOS, tende preferenciaimente uma razãc de indução superior a 40 e compreendendo, vantajosamente, uma mutação que melhora a resistência ou regulação dc promotor, não destruindo tal mutação a regulação SOS.

[0018] Um exemplo específico de sequência promotora de recN mutada é descrito no Pedido de Patente Internacional PCT/EP96/01745 e aqui incorporado por referência.

[0019] Tal sequência promotora induzida pela tensão também compreende um promotor com mutação, preferencialmente um promotor ccm mutação na região -35 de tal promotor, descrito no Pedido de Patente Internacional PCT/EP96/01745 e aqui incorporado por referência.

[0020] o presente invento também se refere a um estojo de diagnóstico compreendendo os elementos do sistema de diagnóstico de acordo com a invenção e possivelmente reagentes adicionais, diluentes e/ou suportes sólidos, necessários para tal diagnóstico, tal como uma solução tampão, uma solução compreendendo um marcador específico tal como X-galactose (5-bromo-4-cloro-3-indolil-3-galacto-sida) para um diagnóstico baseado nc uso de uma sequência genética de β-gaiactose, o luminol para um diagnóstico baseado no uso de uma sequência genética de peroxidase, etc...

[0021] 0 presente invento também se refere a um método geral para o diagnóstico de uma tensão ou agressão ambiental, preferenciaimente para determinar a presença, numa amostra, de um compost o genotóxíco. 0 di to método compreende as fases de exposição do sistema de diagnóstico de acordo com a invenção à dita agressão ambiental (preferenciaimente compreendendo a fase tíe exposição do sistema de diagnóstico ao composto genotóxíco presente na amostra) e de medição de um sinal, preferenciaimente uma mudança na luminescência de tal sistema de diagnóstico. [0022] 0 presente invento também se refere a um método para determinar a cinética da genotoxicidade de um composto numa amostra, baseado no métcdo acima mencionado, no qual se procede à medição da luminescência, quer dos microrganismos transformados inductíveis, quer dos microrganismos transformados constitutivos, em múltiplos pontos no tempo, preferencialmente de modo contínuo, e, adicionalmente, se leva a cabo a determinação da razão (S/N) entre o sinal e o ruído para os microrganismos transformados nos ditos ponto e tempo, dividindo a razão S/N do microrganismo inductível pela dos microrganismos constitutivos, e a representação desses dados; traduzindo tal representação a cinética corrigida da genotoxicidade do composto genotóxico na amostra.

[0023] Vantajosamente, o sistema de diagnóstico e o método de acordo com o invento podem ser combinados com o método e teste Ames e/ou o método e cromoteste SOS, como se descreve mais adiante.

[0024] 0 presente invento também se refere a um método de análise de uma agressão ambiental, compreendendo as fases de: realização do diagnóstico de tal agressão ambiental, conforme descrito acima; cálculo da razão entre o sinal e o ruído de ambos os microrganismos transformados; classificação de tal agressão ambiental como tóxica se, pelo menos, uma das razões entre o sinal e o ruído calculadas for mais baixa que 0,8; classificação de tal agressão ambiental como não tende efeito se a razão entre o sinal e o ruído do microrganismo que compreende uma sequência promotora induzida pela tensão ficar entre 0,8 e 1,2; e classificação de tal agressão ambiental como indutora e ger.otóxica se a razão entre o sinal e o ruído do microrganismo que compreende a sequência promotora induzida pela tensão for mais alta do que 1,2 e se for, pelo menos, 50% mais alta do que a razão entre o sinal e o ruido do microrganismo que compreende a sequência promotora constitutiva.

[0025] 0 presente invento será descrito em detalhe nos seguintes exemples não limitativos, com referência às seguintes figuras.

Breve descrição dos desenhos [0026]

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 representa a razão entre o smal e o ruído, para epicloridrina, nas estirpes recN2-4 e prl. representa a razão entre o sinal e o ruído, para ZnCl2 nas estirpes recN2-4 e prl. representa a razão entre o sinal e o ruído, para azeto de sódio, nas estirpes recN2-4 e prl. representa a razão entre o sinal e o ruído, para nífuroxazida, nas estirpes recM2-4 e prl. representa um esquema de determinação para. diferenciar os possíveis resultados de um teste de diagnóstico conforme o invento, representa uma instalação de acordo com o invento.

Descrição detalhada do invento

MATERIAIS E MÉTODOS

Teste Ames e cromoteste SOS

[0027] o cromoteste SOS e o "este Arr.es são testes de

genotoxicidade bacteríana bastante conhecidos e largamente usados (p, ex., Quillardet & Hofnung, 1993; Mersh--Sundermann et ai., 1994; Mortelmans et al., 1986). O teste Ames "clássico'' habitualmente foi efectuado com estirpes Salmonella typhimurium TA98 e TA100, usando o protocolo padrão descrito por iMaron e Ames (1983). 0 cromoteste SOS foi adquirido como um estojc de teste, da Grgenics Itd (Yavne, Israel). O teste foi realizado tal ccmo indicado nas instruções dos fabricantes. O teste VITOTOX®

Estirpe Salmonella typhimurium [0028] A região promotora recN, que foi parte do gene recN da E. coli (Rostas et al., 1987), contém dois locais de ligação LexA. Um local de ligação LexA sobrepõe-se à região -35, enquanto o segundo se sobrepõe à região -10 e ao ponto de partida da transcrição do promotor recN. O promotor recN da E. coli foi clonado a montante do operãc luxCDABE do vector de expressão pMOL877 (van der Lelie et al., 1997). Isto resultou em pMOL1066. Uma vez que o promotor recN esrá sob controlo do sistema SOS bacteriano, a expressão do operão lux tornou-se regulada por SOS. Isto resulta na produção de luz na presença de genotoxinas. Alguns derivados do promotor recN foram também clonados em pMOL877. Um, sem o local LexA2, resultou em pMOL1067, um tendo um promotor com mutação (pMOL1068), sendo outro uma combinação de ambos (pMO11069). Todas as construções foram introduzidas nas estirpes TA98, TA100 e TA104 do teste

Ames e mostraram-se aptas a detectar compostos genotóxicos. No entanto, como os melhores resultados foram obtidos com a estirpe ΪΑ104 (pMOL1068), esta estirpe foi adicionalmente usada no chamado teste VITOTOX®. Ela foi extensívamente descrita anteriormence e foi designada como ΤΆ104 recN2-4, já que ccntérr,. o fragmento recN2-4 PCR (van der Lelie eu ai., 1997). Além de TA104 recN2-4 (a estirpe de prova), a chamada estirpe TA104 prl é agora adicionada como "estirpe de controlo". 0 plasmídeo pMQL1046 foi construído através da clonagem aleatória de fragmentos de DMA dissolvidos £coRI a partir de Alcaligenes eutrophus CH34, em iuxCDABE - expressão de vector (pMOL877). A. eutrophus CH34 (ATCC 43123) é uma bactéria gram-negatíva não patogénica do solo, derivada de um tanque de decantação de uma fábrica de zinco (Mergeay et ai., 1985, J. Bact) . Após a transformação em E. coli 1106 (Murray et al., 1977, Mel. Gen.Genet.), foram seleccionados clones para a produção de luz. O melhor clone intrinsecamente emissor de luz, dando a mais alta produção de luz tal como quantificada num luminómetro (medidor de luz), foi então seleccionado de entre os diferentes transformados de plasmídeo (=plasmídeo pMOL1046) e introduzidos na estirpe S. typhímuríum TA1Q4. Esta foi denominada estirpe "prl". Contém genes IuxCDABE sob controlo de um promotor constitutivo para que a produção de luz não seja influenciada por compostos genotóxicos. A estirpe prl é usada em paralelo com a estirpe recN2-4 e é cultivada e tratada exactamente do mesmo modo.

Procedimento do teste 1. Culturas [0029] As bactérias foram incubadas durante a noite num misturador rotativo a 37°C num meio 869; este é um meio de crescimento normal equivalente ao meio Luría Broth suplementado com CaCl2 extra para permitir um crescimento bacteriano optimizado, encontrando-se descrito em van der Lelie et al. (1997, Mutation Res.). Na manhã seguinte, a suspensão bacteríana foi diluída 10 vezes em meio 869 e 50μ1 da diluição foram então introduzidos em 2,5mi dc meio 869 e incubados durante mais uma hora a 37 °C num misturador rotativo (170rpm). 2. Preparação de placas com 96 poços [0030] Entretanto foram preparadas placas de 96 poços para conter 10μ1 de solvente, ou do composto a testar em diferentes concentrações, ou do controlo positivo para testar a genotoxicidade, com (2-AF) ou sem (4-NQO) mistura S9. A mistura 39, preparada de acordo com Maron e Ames (1983, Mutation Res.), é usada para detectar a presença de compostos que só se tornam genotóxicos depois de activação metabólica. A mistura S9 foi preparada de fresco antes de ser usada. Para testes com mistura S9, adicionaram-se 140μ1 de bactérias (recN2-4 ou prl) a 860μ1 de meio 869 pcbre e 400μ1 de mistura S9. Foram então adicionados 90μ1 desta mistura aos 10μ1 de solução já presentes nos poços. Para testes sem a mistura S9, foram adicionados 1260μ1 de meio 869 pobre a 140μ1 da suspensão bacteríana, sendo então 90μ1 da mistura transferidos para os poços contendo 10μ1 do composto a testar ou controlos. 3. Medidas de genotoxicídade e toxicidade [0031] Um lumir.cmetro de microplacas de 96 poços (Luminoscan da Berthold) foi usado para a medição da produção de luz após a exposição aos compostos do teste. A emissão de luz de cada poço foi medida cada 5 minutos durante 5 horas (30°C, Is/poço, 60 ciclos de 300s cada). Depois de completadas as medições, os dados foram transferidos para uma macro folha de cálculo MS Excel e foi calculada, para cada medição, a razão (S/N) entre o sinal e o ruído, como sendo o quociente entre a produção de luz das células expostas e a produção de luz de células não expostas. Um composto foi considerado genotóxico guando a razão S/N foi maior que 2 paraf pelo menos, duas concentrações e quando foi observada uma clara relação dose-efeito. Na segunda experiência, na qual fci introduzida a estirpe TA104 prl, a razão S/N foi calculada para as estirpes recN2-4 e prl separadamente, assim como a razão (rec/prl) entre os valores S/N máximos e médios das estirpes recN2-4 e prl. Todos os cálculos foram efectuados entre 60 e 240 minutes de incubação. Neste caso, um composto é considerado genotóxico quando a razão S/N, na estirpe recN2-4, for 1,5 x maior do que o valor do solvente de controlo (e não "2" como fci inicialmente feito), mas só quando este crescimento não for acompanhado por um crescimento comparável na estirpe prl (que indicaria um mecanismo de indução não genotóxica). Um composto é genotóxico quando a razão da razão S/N da recN2-4 sobre a da estirpe prl for igual ou maior do que 1,5 (limite estabelecido com base experimental). Deste modo podem ser evitados resultados "falso positivos".

[0032] Os resultados "falso negativos" podem ser identificados quando a razão S/N da estirpe recN2-4 ficar entre 0,8 e 1,2, enquanto que a razão S/N do sensor prl desce abaixo de 0,8. Isto é tipicamente o caso de amostras que são genotcxicas e tóxicas ao mesmo tempo.

[0033] A estirpe prl é além disso muito valiosa para a avaliação da toxicidade. A toxicidade bacteriana é assumida quando a emissão de luz decresce substancíalmente num modo dependente da dose e atinge valores S/N maís baixos dc que 0,8 dentro dos primeiros 30 minutos do teste.

[0034] E possível a automatização do sistema, usando uma instalação tal como descrita na fíg. 6. Um aparelho de detecção (2), compreendendo, pelo menos, um. detector para o sinal que é emitido a partir de um sistema, de diagnóstico tal como acima descrito, está ligado a um computador (1) que recebe e processa os dados do detector, em conformidade com o método de análise acima descrito e tal como clarificado na figura 5. Deste modo, é possível uma análise automatizada de amostras e a sua classificação como tóxicas e/ou genotóxicas.

Os compostos do teste [0035] Um número de compostos bem conhecidos disponíveis comercialmente, que haviam sido anterdormente avaliados apenas com a estirpe TA1G4 recN2-4 (veja-se van der Leiie et al., 1997), foram reavaliados no presente trabalho usando as estirpes TA104 recN2-4 e TA104 prl, Eles são dados na tabela 1.

Tabela 1: resultados do teste VITOTOX para produtos químicos seleccionados

Concentração para a qual a razão das razões S/R de rec/prl >1,5 COMPOSTO* S9** GAMA DE DOSES TESTADA S/R>2 (recN2-4) MÁX MÉDIA TÓXICO (prl) Furazoiídor.a 0,125-32ppb 0,25ppb 0,5ppb 0,25ppfc 4NQO 0,4-102ppb 0,6ppb 1,6ppb 0,Sppb - Nifuroxazida 2-/5fcppb Sppb loppb Sppb r MIC 3,S-500ppb 31,2ppb 31,2ppb 15,6ppb - 3-Nlrrofiuoranteno 7,9-1000ppb 15,7ppb 31,3ppb 15,7ppb “ 3-Nitrofluordnteno x25 7,9-100Cppb 15,7ppb 31,2ppb 15,7ppb - Nífuroxazida 0,04-5,12ppm 0, 04ppm 0,04pprri 0,0 4ppm + 3Nitrcfluoranteno - 0,C04-C,512ppm 0,032ppm 0,064ppm C,032ppm - Carbadox 0, C4-5,12ppir 0,08ppm C,08ppm 0,04ppm

Acido nalidíssicc - 0,02-2,56ppm D,16ppm 0,1oppm 0,16ppm + 2,4,5,7 - 0,01-1,2Spprr Ο,ΟΒρριη 0,"oppm 0 fU^Dm + Tetranotro-9-fiuoreron cá B (a) F -25 'J f 'J iá D “ 5 / + ju/Oiii 0/2 ppm 0,2ppm 0, Ipm - +A* ^•25 0,2-3,2ppia 0,2 ppm 0,2ppm 0,2ppn - B(a; P “25 0,1-1,6ppm 0,2ppm 0,2 Oiti 0,2pm - 2 7 +25 0,04-lCppra 0,62ppra 0,62ppm 0,62ppm - Dinítrofluoreno Q f 3 ϊ P 4-100 0,1-12,Sppra 0,8ppm 0, 8 ppm 0,4ppm - ICR 191 Acridina - 0,02-2,5ppm 0,62ppm 1,2 oppm 0,3lppm - a-Naftilamina +25 0,G8-10ppm 5ppm 2,5ppm 2,5ppm - 4Nitro-o- - 0,i3-100ppm 3,lppm 3, lppm. 1,57ppm + -Fenilenodiainina Fluoranteno + 100 3,1-40Oppm 3,lppm 3,lppm 3,lppm - h2°2 - 0,25~32ppm 2ppm 4 rpm 2 ppm - K2Cr2°7 - 0,5-64ppn 4 ppm ^ΌΌΓΠ 4 ppm + Fenantrsno +100 3,l-400ppm 6,2ppm 6,2ppm 6,2ppm + AMS - 4-64ppm 16ppm 8ppm 8 ppm - MMS - C,5“123ppm Bppm 8ppm 8ppm - Críseno + 100 0,15-20ppm - ICppm 5 ppm - 4-Nicro-o- +25 0,79-lC0ppm 1215ppm 12,5ppm 12,5ppm + -Fenílenodiamina N- .25 3,25-480ppm 12Oppm 12Oppm 24Oppm - -Nitrosodietilami Fpicloridrina - 4-512ppm 120ppm 256ppm 12 Oppm - EMS - 8~lC24ppm 256ppm 2 5 oppm 2 5 Spprr, - Epiclcridrína - 8-lQ24ppm 2 5 oppm. 512ppir. 128cpiti t ZnCl2 - 0,5-64ppm - - - + CdCl2 - 0,78-100ppm - - - + Comemicina Ai - 1,56-200ppm - - - + Azeto de sódio - 2-256ppm - - - !Kad3) fS _ 0, 04-lOppin _ - - - 0,08-10ppm a-Naftilamina (*alguns produtos químicos foram investigados várias vezes em diferentes gamas de dosagem ou condições; ** μ!/ml de mistura 39 usada na incubação)

RESULTADOS

[0036] Os resultados anunciados anteriormente com o teste VITOTOX® foram obtidos com a estirpe SaImonella typhimurium TA104 recN2-4 (van der Lelie et al., 1997). De modo a melhorar ainda mais o teste, introduziu-se a estirpe prl. Os resultados obtidos com a estirpe recN2-4 deveriam ser avaliados em comparação com os resultados obtidos com a estirpe prl onde o aumento da produção de luz não pode ser devido a uma ocorrência genotóxica. Consequentemente, um aumento de produção de luz pela estirpe recN2-4 apenas pode ser interpretado como indicação de genetoxicidade quando não é acompanhado de um aumento comparável na produção de luz pela estirpe prl.

[0037] Usando ambas as estirpes bacterianas reavaliaram-~se vários químicos estudados anteriormente. Os resultados são dados na tabela 1. A tabela dá as concentrações para as quais o valor S/N máximo na estirpe de prova recN2~4 se torna > 2, assim como as concentrações onde a razão entre os máximos e as médias das razões S/N da recN2-4 e da prl alcança 1,5 ou ir.ais (rec/prl) . Finalmente, a tabela também indica a presença de toxicidade dentro da gama de dosagens testada, tal como avaliada a partir das curvas das razões S/N da prl. Pode-se ver que compostos genotóxicos conhecidos foram efectívamente avaliados como genotóxicos, enquanto que compostos não genotóxicos não mostraram a razão de razões S/N necessária na gama de dosagens dada. resultados foram

Alguns exemplos dos resultados foram representados graficamente nas figuras 1-4 (exemplos de testes sem mistura 39). A figura 1 mostra as curvas S/N para epicloridrina nas estirpes recN2-4 e prl, Na estirpe recN2-4 os valores S/N tornam-se maiores do que 2 para a dose de 256ppm, (não mestrado) enquanto que os valores S/N na estirpe prl não se afastam muito de i, A figura 2 mostra os resultados para ZnClz, que, a concentrações mais elevadas do que 7,4μΜ e para a Salmonella typhimurium TA104, não é genotóxico mas é tóxico (não mostrado), 0 azeto de sódio (ou azida de sódio) é dado como um terceiro exemplo na figura 3. Neste caso, a razão S/N foi consideravelmente mais elevada do que 2 em ambas as estirpes recN2-4 e prl, obtendo-se indicações de toxicidade com o tempo (S/N<0,8). A figura 4 mostra os resultados que foram obtidos para nifuroxazida.

Relativamente à estirpe recN2-4 as doses mais baixas foram aparentemente mais genotóxicas que as doses mais altas, mas a estirpe prl mostrou uma diminuição na produção de iuz dependente da dose, que indica toxicidade.

DISCUSSÃO

[0038] 0 teste VITOTOX® é um método sensível e rápido de detecção de compostos genotóxicos (van der Lelre et ai., 1997). No entanto, se só fosse usada a estirpe recN2-4 (como foi inicialmente feito), seriam possíveis algumas interpretações erróneas. 0 presente invento é baseado no uso da estirpe prl. O valor acrescentado da estirpe prl foi mostrado por meio de alguns exemplos. Na figura 1 ê dado um exemplo de um composto genotóxico (epicloridrina) que não era tóxico para a gama de dosagem dada. Com base nos resultados obtidos a partir apenas da estirpe reeN2-4 pode-se concluir que o composto foi genotóxico, já que foi observado um aumento na produção de luz dependente da dose e excedendo o valor do "ruído" por um factor maior do que deis (S/N>2). A introdução da estirpe prl apenas confirmou esta avaliação. Se tivesse sido encontrado um aumento na produção de luz na estirpe prl dever-se-ia concluir que tal fora de facto devido a outro mecanismo de indução que não o da genctoxicidade (por exemplo, uma elevada proliferação de células que intensificaria c "nível de ruído" comparado com o das culturas não expostas, etc.j-Mas tal nãc foi o caso. Também não houve sinal de toxicidade, já que não houve diminuição na produção de luz. Isto fei já claramente o caso para o ZnCl2, tal como indicado peias curvas da figura 2. A figura mostra que para a estirpe recN2-4 a dose de 3,7 μΜ não é nem genotóxíca nem tóxica, mas que para doses elevadas se observa uma diminuição na emissão de luz que indica um efeito tóxico seguido por uma certa recuperação para doses ma is baixas. Isto é confirmado pela estirpe prl onde a recuperação é ainda mais visível em doses até 58,8 μΜ ZnCL· (não mostrado). A partir de 117,5 μΜ ZnCÍ2, a recuperação já não é possível. Ccnsequentemente, o ZnCl2 revelou-se não genotóxíco e apenas a dose mais baixa mostrou ser isenta de qualquer toxicidade.

[0039] Tal como indicado na introdução e na secção materiais e métodos, o teste VITGTOX® é, essencialmente, baseado na detecção de um sinal SOS. Assim, teoricamente, deveria produzir resultados que estivessem mais de acordo com o cromoteste SOS do que com o teste Ames. No entanto, foram anteriormente encontradas algumas diferenças. Os Inventores referiram, per exemplo, uma resposta "positiva" para azeto de sódio, quando este composto normalmente é classificado como "negativo" no cromoteste SOS (van der Lelie et al, 1997). Uma razão para esta discrepância poderia ser a de que o teste VITOTGX® usa a estirpe Salmonella typhimurium TA104 do teste Ames e, consequentemente, tem as mesmas características, por exemplo, reduzida capacidade de reparação do DNA e elevada permeabilidade às moléculas complexas (como a maioria dos compostos farmacêuticos) . Esta é csrtamente uma explicação válida para muitos casos, mas, provavelmente, não para uma molécula pequena como o azeto de sódio (NaN3) . Neste caso outra razão para a diferença de resultados com o cromoteste SOS pode ser antecipada. Pode ser, por exemplo, que o aumento na produção de luz, tal como encontrado na estirpe recN2-4, seu a devido a outro mecanismo de indução que não o da genotoxicidade. Com a introdução da estirpe prl está-se apuo a verificar esta suposição. Como se demonstra na figura 3, a produção de luz observada na estirpe recN2-4 não é devida à genotoxicidade, já que o aumento na emissão de luz também é observado na estirpe prl e este não pode ser devido a uma resposta SOS. 0 azeto de sódio deverá, assim, ser interpretado no presente teste como não genotóxico. É um bom exemplo de um "composto" que seria um "falso positivo" quando apenas fosse usada a estirpe recN2-4.

[0040] Os Inventores testaram e compararam muitos mais compostos farmacêuticos com os outros testes bacterianos. Os resultados obtidos pelos diferentes testes estavam, a maioria das vezes, completamente de acordo uns com os outros. Além disso, o teste VITOTOX® é, normaimente, muito mais sensível do que o teste Ames ou o cromoteste SOS, visto que as concentrações mínimas detestáveis são 1-100 vezes mais baixas no teste VITOTOX®.

[0041] Outra vantagem de usar a estirpe prl é a de que, além da genotoxicidade, a toxicidade pode ser melhor avaliada do que somente com a estirpe recN2-4. Um composto genotóxico que é investigado para dosagens próximas do limite de toxicidade pode mostrar razões S/N na estirpe recN2~4 que são "intermédias" entre a genotoxicidade e a toxicidade, uma vez que o aumento na produção de luz (devido a genotoxicidade) compete com a diminuição (devida à toxic^^a^e'1 ' resultando numa razão S/N =1. 0 composto gfiria? portanto, interpretado como não sendo nem gen0T-óxic0 nem tóxico (resultado falso negativo) . A estirpe P1® mostrará claramente uma diminuição na emissão de luz/ indicando que o composto já é tóxico na dosagem dada. Isto é mostrado, pelo menos para algumas doses, na figura 4 onde a nifuroxazida foi tomada como exemplo. Pode verificar-se que as doses mais baixas deram a maior resposta genotóxica, atendendo à toxicidade ser dependente da dose. As curvas S/N para a estirpe prl indicam claramente que apenas as doses mais baixas, até 0,16ppm, nâc eram tóxicas. As doses mais elevadas podem mostrar toxicidade combinada com genotoxicidade (por exemplo, 0,32ppm) ou podem ser demasiado tóxicas para mostrar genotoxicidade (doses mais elevadas).

[0042] Ambas as estirpes recN2-4 e prl demonstraram ser capazes de detectar concentrações tóxicas de um composto. No entanto, a estirpe prl é mais valiosa nos testes de toxicidade, uma vez que as curvas S/N não podem ser influenciadas pela genotoxicidade e, consequentemente, reflectem apenas a toxicidade (ou a sua ausência). A estirpe prl aparentemente providencia uma ferramenta perfeita para aqueles que apenas estejam, interessados na determinação da toxicidade. Presentemente, está-se a comparar as determinações de toxicidade em produtos químicos e misturas complexas, obtidas com a estirpe prl e com c teste Microtox®. Este último é um dos testes de toxicidade microbiana correntemente mais usados e melhor aceite internacionalmente, o qual é também baseado na bioluminescência (Hasting, 1978; Férara et ai., 1983). De acordo com os dados limitados de que já se dispõe, o teste VITOTOX® fornece os mesmos resultados que o teste Microtox® sendo, contudo, mais fácil de executar e, na maioria das vezes, muito mais sensível. O teste VITOTOX®, ou apenas o seu elemento prl, pode, assim, ser também considerado como um teste de toxicidade extremamente valioso, pelo menos quando estes resultados preliminares puderem ser confirmados.

[0043] Em suma, pode salientar-se que as estirpes

Salmonella typhimurium TA1G4 recN2-4 e TA104 prl fornecem sistemas de teste de genotoxicidade e/ou toxicidade muito valiosos. Ambas as estirpes deveriam ser usadas simultaneamente para os testes ae genotoxicidade enquanto que apenas é requerida a estirpe prl para testes de toxicidade. Foi demonstrado que o teste VITOTOX® fornece uma resposta muito rápida (dentro de 2-4 horas) e é muito sensível em relação à (geno)toxicidade de produtos químicos e pode ser, por esse motivo, muito útil no rastreío e pré-rastreio de novos produtos químicos e intermediários. Como o teste é efectuado em placas de 96 poços é possível investigar, pelo menos, 8 produtos químicos (com e sem adição de uma fracçâo de enzima metabólica S9) por dia ou 40 produtos químicos por semana. As medições ocorrem automaticamente e, além disso, a recolha e tratamento de dados pode também ser quase completamente automática. A robotização das microplacas deverá ser capaz de multiplicar este número por um factor de 10. Aumentos de escala, por exemplo, pelo aumento do número de poços por placa é óbvio. Os custos de mão-de--obra são, assim, fortemente reduzidos.

[0044] Finalmente, um ponto suplementar e muito importante é o de que apenas são requeridos pequeníssimos volumes do composto a testar (menos de 20mg). Isto é partícularmente importante para a indústria farmacêutica onde apenas algumas centenas de miligramas de um composto estão disponíveis na fase de descoberta. De facto, é quase impossível proceder ao rastreío desses novos produtos químicos com (a maior parte d)os outros sistemas de teste.

[0045] Foi feito um depósito da estirpe "prl" em conformidade com o Tratado de Budapeste sob o número de depósito LMG P-18318 no BCCM/LMG, Lafcoratorium voor Mícrobíologie - Bacteríenverzameling, Universíteit Gent, K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Bélgica.

REFERÊNCIAS

[0046] Férard JF, et al., (1983): Application d'un test d! inhibitior, de luminíscence bactéríenne de 1'étude toxicologique d'effluents complexes et de substances chimique. Revue Française des Sciences de 1'Eau 2: 221 - 237.

Hasting JW (1978): Bacterial biolaminescense: an overview. In: Methods in Enzymology. Academic Press, pp. 125 - 152.

Maron DM, Ames BN (1983): Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res.113: 173 - 215.

Mergeay M, et al., (1985): Alcalígenes eutrophus CH34 ís a facuitative chemolithotroph with plasmid-bound resístance to heavy metais. J. Bacteriology, 162, 328 -331.

Mersch-Sundermann V, et al., (1994): SOS induction ín Encherichia coli and Salmonella mutagenicity; a comparison using 300 compounds. Mutagenesis 3: 205 - 224.

Morteimans K et al., (1986): Salmonella mutagenicity tests: II. Results from the testing of 270 Chemicals.

Environ. Mclec. Mutagen. 8, suppl. 7:1- 119.

Murray NE, et al., (1997): Lambdold phages that simplify the recovery of in vitrc recombínants.

Mol.Gen.Genet. 150: 53 - 61.

Quillardet P, Hofnung M (1993): The SOS chromotest; a review. Mutation Res. 297: 235 - 279.

Rostas K et al., (1987): Nucleotide sequence and LexA regulatíon of Escherichia coli recN gene. Nucl. Acids Res. 15 : 5041-5049. van der Lelíe D ec al., (1997); The VITO-TOX teso, a SOS-bioluminescence Salmonella tvphimurium test to measure genotoxicity kinetics. Mutation Res.389: 279 -290. van der lelíe D. et al., (1997): Two-component regulatory System involved in transcriptional control of heavy-metal homeostasis ín Alcaligenes eutrophus.

Molecular Mícrobíology 23 (3): 439 - 503.

Porto, 17 de Abril de 2007

Claims (13)

1. RE IVIND ICAÇQE S 1. Sistema de diagnóstico consistindo: - nuir. microrganismo transformado capaz de uma elevada activídade informativa quando exposto a uma agressão ambientai, microrganismo esse possuindo uma sequência promorora induzida pela tensão, sendo operativamente ligada a uma sequência informativa codificadora de ácidos nucleícos codificando uma molécula informativa que resulta num sinal que pode ser analisado, e num microrganismo transformado tendo uma sequência constitutiva e promotora não induzida pela tensão, sendo operativamente ligada a uma sequência informativa codificadora de ácidos nucleicos codíficanao uma molécula informativa que resulta num sinal que pode ser analisado, sendo os dites microrganismos adequados para detectarem co-operatívamente a dita agressão ambiental, eliminando simultaneamente os resultados falsamente positivos e falsamente negativos.
2. 2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, no qual o sinal é analisado como produção de luz e/ou modificação colorímétrica.
3. 3. Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual o microrganismo bioluminescente transformado é E. colí.
4. 4. Sistema de acordo com as reivindicações 1 ou 2, no qual o microrganismo bioluminescente transformado é uma Salmonella thyphimurium, sendo, preferencialmente, um microrganismo adequado ao teste Ames, vantajosamente seleccionado do grupo que contém TA98, TA1Q0, TA102, TA104, ΤΆ1535, ΤΆ1538, TA7001 a TA7006 e TA7041 a TA7046, ou tendo o microrganismo com número de depósito LMG P-16318.
5. 5. Sistema de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 4, no qual a sequência promotora induzida pela tensão é seieccionada do grupo compreendendo groEL, dnaK, grpE, phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, nicF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi-28, recA, xthA, narG, recF, recJ, recN, recO, recQ, ruv, uvrD, ars, cad, mer, pco e sfiA.
6. 6. Sistema de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 5, no qual a sequência constitutiva e promotora nâo induzida pela tensão é uma sequência cora uma sequência de consenso Sigma 7 0 (TTGACA (-35),.____17/18 bp......ΤΆΤΆΆΤ (-10)) e cuja transcrição não está regulada posíuíva ou negativamente a nível do promotor.
7. 7. Sistema de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 6, no qual a sequência de ácidos nucleicos codificadora do repórter compreende os genes A e B da lucíferase ou um gene luxAB de tradução de fusão,
8. 8. Sistema de acorde com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 7, no qual a sequência de ácidcs nucleicos codificadora do repórter compreende os genes A e B da luciferase e os genes C, D e E da iuciferase requeridos para a produção de substracto de ácido gordo limitador que é usado na reciclagem.
9. 9. Sistema de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 8, no qual a agressão ambiental é a presença, numa amostra, de um composto genotóxico e/ou tóxico.
10. 10. Um estojo de diagnóstico compreendendo os elementos do sistema de diagnóstico conforme qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 9 e, possivelmente, reagentes adicionais, diluentes e/ou suportes sólidos, necessários.
11. 11. iMétodo para o diagnóstico de uma agressão ambiental, preferencialmente, para determinar a presença, numa amostra, de um composto genotóxico e/cu tóxico, compreendendo as fases de: - exposição do sistema de diagnóstico conforme qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 8, a tal agressão ambiental, e - medição de um sinal do(s) microrganismo(s) bíoluminescente (s) transformado(s) de tal sistema de diagnóstico,
12. 12. Método para determinar a cinética da genotoxicidade de um composto numa amestra com o sistema de diagnóstico de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, no qual se procede à medição da luminescência, quer dos microrganismos transformados inductíveis, quer dos microrganismos transformados constitutivos, em múltiplos pontos no tempo, preferencialmente de modo contínuo, e, adicionalmente, se leva a cabo a determinação da razão (S/N) entre o sinal e o ruído para os microrganismos transformados nos ditos ponto e tempo, a divisão da razão S/N do microrganismo ínductível pela dos microrganismos constitutivos, e a representação desses dados; traduzindo tal representação a cinética corrigida da genotoxicídade do composto genotóxico na amostra.
13. 13. Método de análise de uma agressão ambiental, compreendendo as fases de: realização do diagnóstico de tal agressão ambientai, conforme descrito na reivindicação 11; cálculo da razão entre o sinal e o ruído ae ambos os microrganismos transformados; classificação de tal agressão ambiental como tóxica se, pelo menos, uma das razões entre o sinal e o ruído calculadas for mais baixa que 0,8; classificação de tal agressão ambiental como não tendo efeito se a razão entre o sinal e o ruído do microrganismo que compreende uma sequência promotora induzida pela tensão ficar entre 0,8 e 1,2; e classificação de tai agressão ambiental como indutora e genotóxica se a razão entre o sinal e o ruído do microrganismo que compreende a sequência promotora induzida pela tensão for mais alta do que 1,2 e se for, peio menos, 50% mais alta do que a razão entre o sinal e o ruído do microrganismo que compreende a sequência promotora constitutiva. Porto, 17 de Abril de 2007