JP2002512813A - 腸管出血性大腸菌（ｅｈｅｃ）検出用ヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）群の細菌中に存在するプラスミド起源の核酸配列、ＥＨＥＣ、特にエンテロヘモリシンおよびインチミンビルレンス因子をコードする遺伝子を有するものの探索のための、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７血清型の特異的検出のためのこの配列の使用に関する。本発明はまた、この配列を使用する方法およびこの配列を含む検出キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）群の細菌中に存在するプラスミド起源
の２つの核酸配列、ＥＨＥＣ、特にビルレンス因子であるエンテロヘモリシン（
enterohemolysine）およびインチミン（intimine）をコードする遺伝子を有する
ものの同定のための、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７血清型の特異的検出のための
この配列の使用に関する。本発明はまた、この配列を使用する方法およびこの配
列を含む検出キットに関する。

【０００２】 ＥＨＥＣ群の細菌は、その結果としてヒトにおいて致死的となり得る下痢性症
候群の原因となるベロ毒素生産エシェリキア・コリ（Escherichia coli）または
ＶＴＥＣファミリーに属する。特に、ＥＨＥＣは出血性大腸炎（ＨＣ）およびお
そらく溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）または血栓症血小板減少性紫斑病のような
主要な合併症の出現を引き起こし得る（Griffin et Tauxe, Epidemiol. Rev. 13 , 1991, 60-98）。

【０００３】 従って、これらの感染によって、特に流行の場合、公衆衛生が食材および迅速
な検出手段の監視を増加させるといった影響がある。

【０００４】 以下のようなＥＨＥＣ群に属するいくつかの血清型が同定されており、種々の
流行性病巣の原因であるとされている：Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ１
１１：ＮＭ、Ｏ１０３：Ｈ２、Ｏ１４５：ＮＭなど（Acheson et Keush, ASM Ne
ws 62, 1996, 302-306）。しかし、最も頻繁に単離されているのはＯ１５７：Ｈ
７血清型である。

【０００５】 従来の検出法は、細菌の同定または細菌によって分泌される毒素の検出からな
っている。イー・コリ（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ７の検出は主に、代謝特性につ
いての試験（ソルビトール発酵の不在および／またはβ−グルクロニダーゼ活性
の不在を含む）と組合せた、血清型決定に基いて実施される。さらに、ＥＨＥＣ
の検出に特異的な細菌学的方法は存在しないが、診断の方向付けを可能にする試
験は存在する。特に、血液または洗浄赤血球を補充した寒天を使用することによ
り、ＥＨＥＣ中に一般的に存在する腸管溶血特性を示すことができる。

【０００６】 一般に、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出に関する細菌学的および免疫学的方
法は長く、退屈で、比較的高価であり、血清学的確認を必要とする。さらに、こ
れらの方法は、他の細菌属および種との交差反応（これ解釈を困難にするが）の
ために、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の同定を確立することができない。

【０００７】 それゆえ、核酸プローブの使用がこれらの従来法の代替として出現した。高感
度かつ特異的に、ＥＨＥＣ型イー・コリ細菌（ＨＣおよび／またはＨＵＳ症例に
関与し、その最も広まった原型がイー・コリＯ１５７：Ｈ７である）を検出でき
るプローブを開発するために多大な努力がなされている。

【０００８】 特に、イー・コリのビルレンスの原因遺伝子（ビルレンス因子とも呼ばれる）
の検出を可能にするプローブまたはフラグメントが公開されている。しかし、現
在知られているビルレンス因子のいずれによってもイー・コリＯ１５７：Ｈ７ま
たはＥＨＥＣの病原性株を単独で同定することはできない。

【０００９】 従って、多くの研究グループによって記載されたベロ毒素をコードする遺伝子
（ｖｔ１またはｓｔ１、ｖｔ２またはｓｔ２）の検出のための核酸プローブまた
はフラグメントの使用によって（Karch et Meyer, J. Clin. Microbiol. 27, 19
89, 2751-2757; Gannon et al., Appl. Env. Microbiol. 58, 1992, 3809-3815;
Begum et al., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 3153-3156; Witham et al., A
ppl. Env. Microbiol. 62, 1996, 1347-1353）、ベロ毒素をコードする遺伝子は
病原性細菌株イー・コリＯ１５７：Ｈ７および他のＥＨＥＣに関連するが、非病
原性イー・コリ株またはおそらく他の細菌型（例えば、シゲラ・ジセンテリエ（
Shigella dysenteriae）、シトロバクター・フレンディ（Citrobacter freundii
）など）にも存在し得ることが示された。

【００１０】 同様に、インチミンと呼ばれる接着タンパク質もＥＨＥＣ型細菌のビルレンス
に関与している。特に、プローブが対応する遺伝子（ｅａｅ）上で選択されてい
る（Gannon et al., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 1268-1274, Louie et al.
, Epidemiol. Infect. 112, 1994, 449-461およびMeng et al., Int. J. Food M
icrobiol. 32, 1996, 103-113）。しかし、このビルレンス因子はＥＨＥＣ群に
密接に関連しているが、血清型Ｏ５５：Ｈ７を含む腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）
にも見出される。

【００１１】 最後に、とりわけ、多くのＥＨＥＣにも存在するビルレンス因子であるエンテ
ロヘモリシンをコードする６０ＭＤａのプラスミド上でプローブが選択されてい
る（Levine et al., J. Infect. Dis. 156, 1987, 175-182; Schmidt et al., I
nfect. Immun. 63, 1995, 1055-1061）。米国特許第5,475,098号はｈｌｙＡおよ
びｈｌｙＢ遺伝子ならびにｈｌｙＡ−ｈｌｙＢ遺伝子間領域に対応するエンテロ
ヘモリシンオペロンに含まれる核酸配列に関する。請求されるオリゴヌクレオチ
ド配列によってＥＨＥＣの特異的検出が可能になるが、この発明によってイー・
コリＯ１５７：Ｈ７を他のＥＨＥＣから区別することはできない。さらに、米国
特許第5,652,102号は６０ＭＤａのプラスミドに由来する制限フラグメントに位
置する核酸配列を記載している。しかし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にお
いてこの配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用しても、単独でＯ１５７：Ｈ
７血清型を特異的に検出することはできず、その結果ベロ毒素およびインチミン
をコードする遺伝子を増幅するプライマーの併用が必要となる。

【００１２】 臨床試料から得られたイー・コリＯ１５７：Ｈ７株から単離されたプラスミド
ｐＯ１５７の全体が最近記載された（Makino et al., DNA Research 5, 1998, 1
-9）。プラスミドのゲノム上の異なる遺伝子の順序を表すプラスミドのマッピン
グによって、１８６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在が示さ
れている。しかし、核酸配列についてのデータがないので（文献の公開時にデー
タは利用可能でなかった）、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の特異的検出について診
断上関心のある領域を同定することはできない。

【００１３】 最近では、特許出願WO 97/32045はＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic
DNA）法によって得られた染色体配列から選択されたオリゴヌクレオチドに関し
、これによって約９９．５％のイー・コリＯ１５７：Ｈ７が検出されるが、請求
される核酸配列はほぼ３％の非ＥＨＥＣイー・コリも検出し、特に農食材分野に
おいて特異性の点で満足なものではない。

【００１４】 それゆえ、全てのこれらの検出系の主な不利益は、そのいずれもがイー・コリ
Ｏ１５７：Ｈ７血清型の同定を明確に確立しかつ単純化することができないとい
う事実にある。結果を正確にするためには、実際、頻繁にいくつかの増幅および
／または検出系を組合せる必要がある。使用するプロトコルは実施が困難になり
（複数の同時の増幅）、得られる結果は、感度および特異性に関して、使用する
核酸標的のみならず操作条件にもおおいに依存する。

【００１５】 しかし、上記で示したように、この血清型は死に至る可能性がある重篤な症候
群を引き起こし得、このことは、特に流行の場合に、迅速かつ信頼性のある検出
手段の必要性を意味する。

【００１６】 本発明者による作業は、イー・コリＯ１５７：Ｈ７ゲノムライブラリー由来の
特異的配列について試験し、ヒトに対して病原性である主要なイー・コリ血清型
、より詳細にはＯ１５７：Ｈ７の認識を可能にすることからなる。ライブラリー
を腸病原性大腸菌Ｏ５５：Ｈ７に対してスクリーニングした。Ｏ５５：Ｈ７は血
清型Ｏ１５７：Ｈ７の祖先であると推定されており、T. Whittam et al., Infec
t. Immun. 61, 1993, 1619-1629によって実施された多型分析によれば２つのゲ
ノムは非常に近縁である。

【００１７】 この作業によって、ＥＨＥＣの検出、より詳細にはイー・コリＯ１５７：Ｈ７
の検出用の２つの目的の核酸フラグメントを単離することができた。これらは６
０ＭＤａの腸溶血性プラスミド上に位置する配列番号１および配列番号２の核酸
配列を含む。これらの配列を含む対応するクローンｐＤＦ３およびｐＤＦ４は、
１９９８年３月２６日にそれぞれ番号Ｉ−１９９９およびＩ−２０００のもとに
コレクション・ナショナル・ドゥ・クルチュル・ドゥ・ミクロオルガニスム（Co
llection Nationale de Cultures de Microorganismes）に寄託された

【００１８】 驚くべきことに、挿入配列ＩＳ９１の一部とイー・コリＯ１５７：Ｈ７ ｋａ
ｔＰ遺伝子由来の配列またはその一部の安定な組合せを含む第１の配列（配列番
号１）が同定された。それから生じる核酸鎖は他所で記載されたことはなく、イ
ー・コリＯ１５７：Ｈ７において特異的に見出される。

【００１９】 カタラーゼ−ペルオキシダーゼをコードするｋａｔＰ遺伝子はイー・コリＯ１
５７：Ｈ７および多数のＥＨＥＣの腸溶血性プラスミド上に存在する（Brunder
et al., Microbiol. 142, 1996, 3305-3315）し、イー・コリのα−溶血性プラ
スミド上で同定された挿入配列ＩＳ９１（Zabala et al., J. Bacteriol. 151,
1982, 472-476）は未だにイー・コリＯ１５７：Ｈ７型腸溶血性株において記載
されていない。

【００２０】 短縮された挿入配列がＩＳ９１−ｋａｔＰ連結（ＩＳ９１の左逆方向反復配列
（ＩＲ_L）が存在しない）のレベルで同定されたことはまた、ＩＳ９１のイー・
コリＯ１５７：Ｈ７ゲノムのこの部分への安定な組込みを示唆する。

【００２１】 種々の起源の多数のＯ１５７：Ｈ７株の増幅産物の分析は、このヌクレオチド
鎖がＯ１５７：Ｈ７血清型内で保存されていることを示す。

【００２２】 実際、それぞれＩＳ９１およびｋａｔＰの配列中に位置する配列番号３および
配列番号４のプライマーを用いて、試験した全ての株（５５個のイー・コリＯ１
５７：Ｈ７および１個のイー・コリＯ１５７：Ｈ−）において６７０塩基対の増
幅産物が観察された。

【００２３】 さらに、異なる起源の５個のＯ１５７：Ｈ７株の増幅産物について作成したＡ
ｌｕＩおよびＲｓａＩ制限プロフィールから得られたデータならびに３個の株（
米国（１９９３年）および日本（１９９６）の流行から単離された２個を含む）
について実施した配列分析によって、分析した配列部分（配列番号１、２７２〜
６２４位（ｎｔ））における完全な保存、すなわち１００％の相同性が示された
。

【００２４】 さらに、安定な、保存されたヌクレオチド鎖はおそらく、進化の間にイー・コ
リＯ１５７：Ｈ７において生じた比較的古い組換え事象である。なぜなら、異な
る場所および時期に単離された株がこの同じ特性を示すからである。

【００２５】 それゆえ、この配列は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７の特異的検出に好ましい標的を
表す。

【００２６】 第２の配列はビルレンス因子エンテロヘモリシン（ｅｈｌｙ）およびインチミ
ン（ｅａｅ）の存在に関連した同じプラスミド上に特徴付けられた（配列番号２
）。これらの特性は血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む腸管出血性大腸菌株に特異的で
ある。この点で、このフラグメントには疫学的興味がある。なぜなら、いくつか
の分子系の使用を必要とする既に公知の方法とは異なり（Paton and Paton, J.
Clin. Microbiol. 36, 1998, 598-602）、診断適用のためにこの配列を使用する
ことによって、使用が簡略化され、結果がより迅速に解釈されるからである。

【００２７】 それゆえ、本発明は、食物、臨床的、獣医学的または環境試料中のＥＨＥＣの
特異的検出のために使用できる、配列番号１および配列番号２の核酸配列、その
相補配列、それに由来する配列およびそのフラグメントに関する。

【００２８】 本発明は、より詳細には、配列番号１の配列、この配列のフラグメントまたは
それに由来する配列を含む、血清型イー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出用の特異的
配列に関する。

【００２９】 本発明によれば、配列番号１の配列は、ｋａｔＰ遺伝子の配列またはその一部
と短縮された挿入配列ＩＳ９１との間の安定な組換え事象から生じたヌクレオチ
ド鎖を含む。

【００３０】 本発明によれば、核酸配列なる表現は、ＤＮＡもしくは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）配列、または対応するＲＮＡ配列のいずれかを意味すると理解される。

【００３１】 本発明はまた、配列番号１または配列番号２に由来する核酸配列、すなわち、
１個以上の塩基の変異、挿入、欠失および／または置換で異なるが、それにもか
からわず上記の配列の１つと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする
配列に関する。

【００３２】 本発明によれば、高ストリンジェンシーなる表現は、２つの相補的な核酸フラ
グメント間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、非特異的結合を制限す
るような温度およびイオン強度条件を意味すると理解される（Sambrook et al.,
Molecular Cloning, Second Edition (1989), 9.47-9.62）。ハイブリッド配列
の一方が短い場合（約２０ヌクレオチド）、温度条件は一般に（Ｔｍ−５℃）〜
（Ｔｍ−１０℃）である。Ｔｍは、理論的融点であり、対合した鎖の５０％が分
離する温度であると定義される。

【００３３】 配列番号１に由来する核酸配列なる表現はまた、本発明によれば、後者と１個
以上の塩基の変異、挿入、欠失および／または置換で異なり、ｋａｔＰ遺伝子と
短縮された挿入配列ＩＳ９１との間の安定な組換えの鎖を含むいずれかの配列を
意味すると理解される。

【００３４】 より詳細には、核酸配列は、図１の鎖の少なくとも８個、好ましくは１０個、
さらに好ましくは１４個の連続したヌクレオチドを含み、４００〜４０７位のヌ
クレオチドを含む。

【００３５】 本発明はまた、ＥＨＥＣに特異的な第２の配列（配列番号２）、その相補配列
、そのフラグメントおよびそれに由来する配列に関する。これらの配列はＥＨＥ
Ｃ、特にエンテロヘモリシン（ｅｈｌｙ）およびインチミン（ｅａｅ）をコード
する遺伝子を連結して有するＥＨＥＣにおいて常に検出される；この配列番号２
の配列を図２に示す。

【００３６】 本発明はまた、配列番号１および配列番号２の配列に由来するオリゴヌクレオ
チドに関する。これは増幅手順におけるプライマーとしてまたは検出法の使用に
関してプローブとして使用することができ、配列番号１または配列番号２のヌク
レオチド鎖の少なくとも８個、有利には少なくとも１０個、より有利には１４個
、好ましくは３０個までの連続したヌクレオチドを含む。このプライマーは前記
配列に上記で規定したような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズでき
る。

【００３７】 本発明のプライマーまたはプローブはまた、いくつかのヌクレオチドの置換お
よび／または付加および／または抑制によって、あるいは末端（一般にプライマ
ーについては５’；プローブについては３’または５’）の一方での所望の配列
にとって外来の核酸配列または標識分子の付加によって改変され得るオリゴヌク
レオチドを含む。このオリゴヌクレオチドはそれにもかかわらずイー・コリＯ１
５７：Ｈ７またはＥＨＥＣ中に存在する相補的核酸配列と高ストリンジェンシー
条件下でハハイブリダイズすることができる。

【００３８】 本発明の好ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチドを遺伝子増幅手順に
おけるプライマーとして使用してもよい。これによって配列番号１のフラグメン
トまたは配列番号２のフラグメントの大量のコピーが生産され、それぞれイー・
コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣの特異的検出が可能になる。

【００３９】 増幅工程を、特に、Kwoh et al., PNAS, 86, 1989, 1173-1177によって提唱さ
れるＴＡＳ（Transcription-based Amplification System）技術、Fahy et al.,
PCR Meth. Appl. 1, 1991, 25-33に記載の３ＳＲ（Self-Sustained Sequence R
eplication）技術、特許EP 329 822に記載のＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequenc
e-Based Amplification）技術、またはWalker et al., P.N.A.S., 89, 1992, 39
2-396に記載のＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）技術、あるいは有
利には、特にCetusの欧州特許EP 200 362およびEP 201 184に記載のＰＣＲ技術
、あるいは後者に由来する技術およびインビトロにおける核酸配列の増幅に所望
されるいずれかの他の方法のようなＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的増幅の従来法を
使用するいずれの方法によって実施してもよい。

【００４０】 本発明の好ましい実施態様において、配列番号１および配列番号２の配列に由
来するオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおいて使用する。

【００４１】 増幅産物の検出を、その中で増幅を実施した反応媒質の全部または一部の、特
にアガロースまたはポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって、あるい
はキャピラリー電気泳動またはクロマトグラフィーによって実施してもよい。ゲ
ルの特定の点に局在化された核酸フラグメントのバンドの可視化によって、大き
さを評価することができる。このバンドの強度を試料中の検出しようとする標的
の最初のコピー数におおまかに相関させることが可能である。

【００４２】 本発明の別の実施態様によれば、上記で規定するようなオリゴヌクレオチドを
、標的核酸配列の直接検出のために、または、増幅後に増幅産物の検出のために
ハイブリダイゼーション手順においてプローブとして使用してもよい。

【００４３】 例として、ヌクレオチドフラグメントを放射性元素（例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³
Ｈ、¹²⁵Ｉ）または非放射性分子（特にビオチン、アセチルアミノフルオレン、
蛍光色素、ジゴキシゲニン）または酵素分子またはハプテンで標識してもよい。
プローブの非放射性標識の例は、例えば、P. Kourilsky、フランス特許第78.109
75号、またはM.S. Urdea et al., Nucleic Acids Symp. Ser., 24, 1991, 197-2
00、あるいはR. Sanchez-Pescador, J. Clin. Microbiol. 26, 1988, 1934-1938
に記載されている。

【００４４】 最も一般的なハイブリダイゼーション法は、分析しようとする試料から抽出し
た核酸を支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレンなど）上に固定化
し、固定化した核酸をプローブとともに規定された温度およびイオン強度の条件
下でインキュベートすることからなる。ハイブリダイゼーション後、過剰のプロ
ーブを除去し、形成されたハイブリダイズした分子を、適切な方法によって検出
する（プローブに結合した放射能、蛍光または酵素活性の測定）。

【００４５】 形成されたハイブリッド分子を「結合」相および「非結合」相の分離の必要な
しに検出してもよい。これは、検出を均質相で実施するという。これらの方法（
T. Walker et al., Clin. Chemistry 42, 1996, 9-13およびL. Morrison (Nonis
otopic DNA Probe Techniques, Academic Press, 1992, 312-352)に記載される
）は特に蛍光分極に関する。ここで、プローブをフルオレセインで標識し、ハイ
ブリダイゼーションによって蛍光の修飾またはエネルギーの移行が引き起こされ
る。後者の場合、検出は２つのマーカーの分子間または分子内相互作用に基く。
「ドナー」と呼ばれる第１のマーカーは特定の波長の光の吸収によって励起され
る。エネルギーは「アクセプター」と呼ばれる第２のマーカーに移行される。こ
れは次に励起されエネルギーを発する。

【００４６】 オリゴヌクレオチドプローブを、オリゴヌクレオチドのアレイ配列を含む検出
デバイスにおいて使用してもよい。このアレイ配列において、所定の長さのオリ
ゴヌクレオチドが事前に決定された順序で支持体に結合させられ、互いに１以上
の塩基が重複しており；各オリゴヌクレオチドは検出しようとする標的配列のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的である。標的配列（これは有利には標識されてい
る）を、アレイデバイスと接触させ、支持体に結合したプローブとハイブリダイ
ズさせることができる。次いで、酵素処理によって不完全なハイブリッドを除去
することができる。アレイの決定された位置におけるプローブの配列がわかって
おり、分析した標的配列のヌクレオチド配列を推定すること、生じた可能な変異
を推定することができる。

【００４７】 ハイブリッドが形成されるアレイの位置において例えば電子供与体として作用
できる材料（金のような）の支持体に結合させたプローブとの標的配列のハイブ
リダイゼーションの「バイオエレクトロニクス」的検出を可能にする支持体を使
用して、標識配列の使用の代替としてもよい。次いで、標的核酸配列の検出を、
電子デバイスによって測定する。バイオセンサーの例示的な実施態様は、Affyma
x Technologiesの特許出願EP-0721 016に記載されている。

【００４８】 単純かつ有利な実施態様によれば、核酸プローブを捕獲プローブとして使用し
てもよい。この場合、「捕獲プローブ」と称するプローブを支持体上に固定化し
、これは特異的ハイブリダイゼーションによって、試験しようとする試料から標
的核酸を捕獲するように作用する。必要であれば、固体支持体を試料から分離し
、捕獲プローブと標的核酸配列との間に形成された二重鎖を「検出プローブ」と
称する検出可能な要素で標識した第２のプローブによって検出する。有利には、
捕獲プローブおよび検出プローブは、検出しようとする標的配列（増幅されたか
またはそうではない）内部の２つの異なる領域に相補的である。

【００４９】 固体支持体への捕獲プローブの結合を、当業者に周知の方法に従って、特に受
動的吸着または共有結合によって行ってもよい（Cook et al., Nucleic Acids R
es. 16, 1988, 4077-4095; Nagata et al., FEBS Lett. 183, 1985, 379-382; M
. Longlaru et al., EP 420 260 A2; T. Gingeras et al., EP 276 302; E Horn
es and L.M. Kornes, EP 446 260）。

【００５０】 捕獲プローブおよび検出プローブのハイブリダイゼーションは別々に（２段階
で）または同時に、特にLanghale and Malcolm, Gene 36, 1985, 201-210、Rank
i et al. Gene 21, 1993, 77-85、Dunn and Hassel, Cell, 12, 1977, 23-36ま
たはRanki and Soderlund, 米国特許第4,486,539号および同第4,563,419号によ
って記載される方法の１つに従って生じ得る。

【００５１】 それゆえ、本願はまた、配列番号１または配列番号２に由来する、プライマー
またはプローブとして選択された、ストリンジェントな条件下で、イー・コリＯ
１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣに特異的な、試験試料中に含まれる標的核酸配列と
ハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに関する。

【００５２】 標的核酸配列なる表現は、本発明によるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェ
ンシー条件下でハイブリダイズできるいずれかのＤＮＡまたはｃＤＮＡまたはＲ
ＮＡ分子を意味すると理解される。

【００５３】 その配列が添付物に記載されている好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の表
に報告される配列番号１および配列番号２の配列の位置に対応する： 配列 配列番号１における位置 配列番号 ３ ９ − ３０ 配列番号 ４ ６７９ − ６５８ 配列番号 ５ ６ − ３０ 配列番号 ６ ６８２ − ６５８ 配列番号 ７ ２４１ − ２６３ 配列番号 ８ ４７ − ６９ 配列番号 ９ ２５１ − ２７４ 配列番号１０ ４２６ − ４０１ 配列番号１１ ４２７ − ４０２ 配列番号１２ ３９１ − ４２１ 配列番号１３ ３８７ − ４１７ 配列番号１４ ２９１ − ３２１ 配列番号１５ ５１０ − ５４０ 配列番号１６ ３３１ − ３５０ 配列番号１７ ６８ − ８７ 配列番号１８ ３９７ − ４１０ 配列番号１９ ３９６ − ４１１ 配列番号２０ ３９５ − ４１２ 配列番号２１ ７１８ − ７３９ 配列番号２２ １０９９ − １０７８ 配列番号２３ ４１ − ６０ 配列番号２４ ８８４ − ８６３ 配列番号２５ ９２８ − ９５８ 配列番号２６ ９７０ − １０００ 配列番号２７ ８８３ − ９０３

【００５４】 本発明はまた、上記のようなオリゴヌクレオチド対に関し、これは、イー・コ
リＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣのゲノムに含まれる配列番号１または配列番号
２に対応する標的核酸配列の増幅用のプライマーとして使用することができる。

【００５５】 好ましいプライマーの対は以下のとおりである： ・イー・コリＯ１５７：Ｈ７の増幅用 − 配列番号３と配列番号４ − 配列番号５と配列番号６ − 配列番号６と配列番号７ − 配列番号６と配列番号８ − 配列番号６と配列番号９ ・ＥＨＥＣの増幅用 − 配列番号２１と配列番号２２ − 配列番号２３と配列番号２４

【００５６】 配列番号５および配列番号６のプライマーの対をイー・コリＯ１５７：Ｈ７の
核酸の増幅を実施するために使用することによって、イー・コリＯ１５７：Ｈ７
株に特徴的な６７６ ｂｐの核酸フラグメントが増幅される。適切な場合、この
フラグメントの特異性を、配列番号１８のプローブを使用することによって管理
してもよい。

【００５７】 同様に、配列番号２１および配列番号２２のプライマーの対を使用することに
よって、ＥＨＥＣ（エンテロヘモリシンおよびインチミンの特性も有する）中に
存在する３８２ ｂｐの核酸配列が特異的に増幅される。他の大腸菌群に属する
細菌（例えば、ＥＴＥＣ（エンテロトキシン産生大腸菌）、ＥＰＥＣなど）は検
出されない。増幅産物の特異性を増幅フラグメント内部のオリゴヌクレオチドプ
ローブ（例えば、配列番号２７）によってさらに確認することができる。

【００５８】 本発明はまた、随意に増幅されたヌクレオチド配列の検出用のプローブとして
使用できる上記のようなオリゴヌクレオチドに関する。例えば、配列番号１４、
配列番号１５および配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を、イー・コリＯ１
５７：Ｈ７の特異的検出のために使用してもよい。同様に、配列番号２５、配列
番号２６および配列番号２７の配列を使用することによって、Ｏ１５７：Ｈ７を
含むＥＨＥＣの検出が可能になる。

【００５９】 本発明はまた、上記の配列番号１および配列番号２の配列を含むプラスミドな
らびにそれらを含む宿主細胞に関する。

【００６０】 本発明はまた、試料中のイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣのインビト
ロ検出法に関する。この方法は以下の工程を包含することを特徴とする： １．試料を、上記のプライマーの対の１つと接触させる工程であって、試料中
に含まれる核酸配列は、適切な場合、試験される標的の核酸とのプライマーのハ
イブリダイゼーションに接近可能にされている工程、 ２．選択したプライマーの対が隣接する核酸配列を増幅する工程、 ３．上記のような当業者に公知の方法に従って増幅産物の存在の可能性を確認
することができる。

【００６１】 有利な実施態様によれば、増幅されたフラグメントをいわゆる「サンドイッチ
」法の原理に従って検出してもよい。

【００６２】 以下の工程を包含することを特徴とする、支持体（例えば、マイクロタイター
プレート）上での検出による、イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣに特異
的な以前に増幅されたヌクレオチド配列のインビトロ検出のための方法も本発明
の範囲内に入る： − 物理的または化学的手段によるイー・コリＯ１５７：Ｈ７および／または
ＥＨＥＣの増幅配列の変性。２００ｍＭ ＮａＯＨ、４０ｍＭ ＥＤＴＡから構
成される変性溶液の添加が好ましい、 − 変性した増幅フラグメントの、適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で
の、一方で支持体に結合した少なくとも１つの捕獲プローブとの、他方でハイブ
リダイゼーション緩衝液中の少なくとも１つの遊離検出核酸プローブとの接触。
検出プローブは所望により標識されており、捕獲プローブとハイブリダイズする
のと同じ増幅フラグメントの鎖と、捕獲プローブとハイブリダイズするのとは異
なる領域でハイブリダイズでき；このハイブリダイゼーション溶液を、有利には
５倍濃度のＳＳＰＥ（Sodium Saline Phosphate EDTA; Molecular Cloning, A p
ractical guide, Sambrook et al., Vol. 3, 1989, annexe B13）、０．５％
Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０１％ メルチオレート（Merthiolate）とすることが
できる、 − ハイブリダイゼーションを可能にするに十分長い時間の反応混合物のイン
キュベーション；このインキュベーションを、例えば、有利には３７℃で約１時
間実施することができる、 − 全ての未反応核酸配列を除去するための前記混合物の１回以上の洗浄；こ
の洗浄を、例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび
０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４を含有する溶液を用いて実施すること
ができる、 − 増幅した核酸配列とハイブリダイズした検出プローブの可視化。

【００６３】 本発明の有利な実施態様によれば、検出プローブをペルオキシダーゼで標識し
、ハイブリダイズした検出プローブに結合したペルオキシダーゼの活性を、以下
の工程に従って、色素原性基質の存在下での比色読み取りによって可視化する： − 反応混合物を含有する各ウェルにおける色素原性基質（例えば、テトラメ
チルベンジジン（ＴＭＢ））を含有する溶液の沈着、およびマイクロプレートの
暗所での十分な時間（一般に２０〜３０分間）のインキュベーション。次いで、
反応をブロッキング溶液（有利にはこの溶液は最終濃度０．５Ｎで使用するＨ₂
ＳＯ₄溶液である）を添加することによって停止する、 − 光学密度の測定。ＴＭＢを色素原性基質として使用する場合、この測定を
４５０ ｎｍ（参照６２０ ｎｍ）の波長で実施する。

【００６４】 特に有利な実施態様によれば、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の検出に使用する捕
獲プローブは配列番号１５であってもよく、検出プローブは配列番号１８のオリ
ゴヌクレオチドである。同様に、ＥＨＥＣ細菌の検出に使用する捕獲プローブは
配列番号２５であってもよく、検出プローブは配列番号２７のオリゴヌクレオチ
ドである。

【００６５】 本発明はまた、試料中に含まれるイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣの
同定用の検出キットに関する。このキットは試薬の中に以下を含む： − イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣ群の細菌の増幅用のプライマー
として使用される上記で規定するような少なくとも２個のオリゴヌクレオチド、 − 所望により、増幅フラグメントの配列の確認用の成分、より詳細には上記
で規定するような核酸プローブ。

【００６６】 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限
定するものではない。

【００６７】 実施例１ 配列番号１および配列番号２の配列の特徴付け １）イー・コリＯ１５７：Ｈ７ゲノムライブラリーの構築： 出血性大腸炎に罹患し、１型および２型ベロ毒素を産生している患者の糞便か
ら単離されたイー・コリＯ１５７：Ｈ７株のゲノムＤＮＡを、３７℃で１時間緩
衝化媒質中で１μｇのＤＮＡあたり０．０３酵素単位を作用させることによって
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ（Boehringer Mannheim, Ref. 621625）で部分消化
した。このようにしてゲノムＤＮＡを消化することによって３５〜４５ｋｂのフ
ラグメントを生成することができた。コスミドｐＨＣ７９（Hohn and Murray, P
roc. Natl. Acad, Sci 74, 1977, 3259-3263）を同様に消化し、自己連結を回避
するように脱リン酸化した。

【００６８】 ９００ｎｇのベクターと２．６μｇの３５〜４５ｋｂのＤＮＡフラグメント（
すなわち、ベクター／インサートモル比２）を混合することによって連結を実施
した。２単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim; Ref. 481220）を
補充した後、反応媒質を１４℃で１８時間放置した。組換えコスミドをインビト
ロで包膜化し、これを用いてイー・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ細菌（Stratage
ne; Ref. 200300）を形質転換した。形質転換した細菌を１時間３７℃でＬＢ培
地（Luria-Bertani, Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook et al.
, Vol. 3, 1989, annexe A1）中でインキュベートした。３５〜４５ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを、アンピシリン耐性部位をなくし、テトラサイクリン耐性部位
を保存するようにベクターｐＨＣ７９に挿入し、次いで細菌を１２．５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを含有する選択寒天培地にプレーティングした。

【００６９】 コスミドＤＮＡのミニ調製物をQuiagen（reference 26171）によって供給され
るＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ９６ Ｋｉｔを使用してテトラサイクリン上で単離した最
初の３６０個のコロニーから作製した。

【００７０】 次いで、これらの調製物のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩ（Boehringer Mannheim, Ref. 621625、703737および567663）で
消化し、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析し、次いでＨｙｂｏ
ｎｄ Ｎ⁺ナイロンフィルター（Amersham, Ref. RPN 303B）に移した。ＵＶに５
分間曝露することによってＤＮＡを不可逆的に固定した。

【００７１】 ２）ライブラリーのスクリーニング： イー・コリＯ１５７：Ｈ７株（コレクション・ドゥ・ランスティトゥ・パスト
ゥール（Collection de l'Institut Pasteur）No. 103571）から得た同種ＤＮＡ
プローブおよび８個のイー・コリＯ５５：Ｈ７株（コレクション・ドゥ・ランス
ティトゥ・パストゥール、No. 105215, 105216, 105217, 105228, 105239, 1052
40, 105241, 105242）から得たＤＮＡの「プール」からなる異種ＤＮＡプローブ
を用いてハイブリダイゼーションを実施した。

【００７２】 種々のフィルターを、６倍濃度のＳＳＣ緩衝液（Sodium Saline Citrate; Mol
ecular Cloning, A practical guide, Sambrook et al., Vol. 3, 1989, annexe
B13）、５倍濃度のデンハルト溶液（Molecular Cloning, Vol. 3, 1989, annex
e B15）、１０％デキストラン硫酸（Pharmacia Biotech, Ref. 17-0340-02）、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ １本鎖サケ精子Ｄ
ＮＡおよび関連ＤＮＡ（Ｏ１５７：Ｈ７）を含有する溶液中で１６〜１８時間６
５℃でハイブリダイズさせた。

【００７３】 ハイブリダイゼーション後、フィルターを１０分間２倍濃度のＳＳＣ緩衝液中
で６５℃で２回、３０分間２倍濃度のＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する緩
衝液中で６５℃で１回、次いで１０分間１／１０希釈したＳＳＣ中で６５℃で１
回洗浄した。濡れたままのフィルターを増感スクリーンとともに２４〜４８時間
−８０℃でカセット中で露光した。

【００７４】 必要な露光時間の後、フィルムを現像し、次いでナイロンメンブレンを、撹拌
しながら４５℃で４〜５サイクルの水浴を実施することによって脱ハイブリダイ
ズした。各サイクルについて、３０分間の０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液および次いで
３０分間の１／１０希釈したＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で
の２回の連続した水浴を実施した。メンブレンを最後に２倍濃度のＳＳＣ中で洗
浄し、カセットに入れて、ハイブリダイゼーションの痕跡が残存していないこと
を確認した。脱ハイブリダイゼーション後、フィルターを上記と同様に非関連Ｄ
ＮＡ（Ｏ５５：Ｈ７）のプールとハイブリダイズさせた。

【００７５】 ３）配列番号１および配列番号２のフラグメントの単離およびクローニング これらのハイブリダイゼーションの結果、２つのコスミドクローンを同定する
ことができ、それぞれから同種プローブとはハイブリダイズするが異種プローブ
とはハイブリダイズしない約１〜２ｋｂのフラグメント１つが単離された。「ド
ットブロット」ハイブリダイゼーションによって種々のＯ１５７：Ｈ７株におい
てそれらが保存されていることを確認した後、これらのフラグメントをベクター
ｐＵＣ１８（Oncor Appligene Ref. 161131）中にクローン化し、次いで大量に
調製した。組換えプラスミドはｐＤＦ３およびｐＤＦ４と称し、それぞれ配列番
号１および配列番号２の配列に対応する。

【００７６】 ４）配列番号１および配列番号２の配列の決定 Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1977, 5463に記載されるSanger et al.の方法に
従って、プラスミドｐＵＣ１８の「ユニバーサルプライマー」および「リバース
プライマー」ならびに配列の内部のオリゴヌクレオチドを使用してフラグメント
の配列決定をした。

【００７７】 １４８９ｂｐを含む配列番号１の配列（図１）は、４０７〜１４８９の領域に
おいてイー・コリＯ１５７：Ｈ７のｋａｔＰ遺伝子との９９．９％の相同性およ
び１〜４０６の領域においてイー・コリのＩＳ９１との９５．８％の相同性を示
す。

【００７８】 １１８１ｂｐを含む配列番号２の配列（図２）の解析によっては、腸溶血性プ
ラスミドの既知の配列は示されない。２３７〜５７０の部分がシゲラ・フレクス
ネリ（Shigella flexneri）ビルレンスタンパク質をコードするｖｉｒＫプラス
ミド遺伝子と６８％の相同性を示すのみである。

【００７９】 実施例２ イー・コリＯ１５７：Ｈ７の特異的検出 異なる血清型の１００個のイー・コリ株および４２個の非イー・コリ株（とり
わけ、イー・コリＯ１５７：Ｈ７と交差反応し得る細菌（例えば、サルモネラ（
Salmonella）、シゲラ・ジセンテリエ、シトロバクター・フレンディ、ハフニア
・アルベイ（Hafnia alvei）、エシェリキア・ヘルマニ（Escherichia hermanii
））を含む）について特異性の研究を実施した。

【００８０】 １）ＤＮＡの抽出： ＤＮＡ配列を、Chelex（InstaGene^TM Matrix, Biorad）の存在下での煮沸法に
よって得た。試料を以下のプロトコルに従って調製した： 細菌懸濁物を、滅菌超純水中に、Tryptone-Caseine-Soja寒天（Sanofi Diagno
stics Pasteur, Ref. 53455）上で単離したいくつかの細菌コロニーから作製し
、１０，０００〜１２，０００回転／分で２〜３分間遠心分離し、上清を慎重に
除去する。細菌ペレットを２００μｌの溶解試薬中に再懸濁し、ホモジナイズし
、次いでヒートブロックで１００℃で１０〜１５分間インキュベートする。試料
を再度ホモジナイズし、次いで１０，０００〜１２，０００回転／分で２〜３分
間遠心分離する。このＤＮＡを直接増幅するか、または−２０℃で貯蔵できる。

【００８１】 ２）ＰＣＲによる増幅： 増幅反応を５０ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３；０
．０１％ゼラチン；３ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．２５μＭの配列番号５および配列
番号６の各プライマー；１００μＭ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）；４００
μＭ ｄＵＴＰ；０．５単位のウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ; BR
L Life Technologies）；１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（BRL Life Tech
nologies）およびパラグラフ１に示すように調製したＤＮＡ ５μｌを含有する
総量１５μｌで実施する。

【００８２】 ５０℃で２分間、次いで９５℃で５分間インキュベートした後、試料を３５回
の増幅サイクル（１５秒９５℃、１５秒６５℃、１５秒７２℃から構成される）
に供する。プレートを除くまでチューブを７２℃に維持する。

【００８３】 温度サイクルを「Perkin-Elmer 9600」サーモサイクラー中で実施する。

【００８４】 各実験はポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。

【００８５】 ３）増幅産物の可視化： 増幅反応物をアガロースゲル上で可視化するかまたはマイクロプレート上で検
出する。

【００８６】 ３−１）アガロースゲル： 増幅後、１５μｌのクロロホルムを各試料に添加して、ＵＤＧを不活化し、次
いで１アリコートの各反応物をサイズマーカーの存在下で臭化エチジウムで染色
した１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析する。６７６ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントの可視化によって、試験試料中のイー・コリＯ１５７：Ｈ７の存
在が示される。

【００８７】 ３−２）マイクロプレート中でのハイブリダイゼーション： 増幅産物を、２００ｍＭ ＮａＯＨ、４０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液を等
量添加することによって変性する。ウェルの表面を配列番号１５の捕獲プローブ
でコートしたマイクロプレートを、５倍濃度のＳＳＰＥ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ
２０および０．０１％メルチオレートを含有するハイブリダイゼーション緩衝
液中でプレハイブリダイズする。次に、マイクロプレートをからにし、各ウェル
に、変性した増幅フラグメントおよび配列番号１８の表示用プローブを含有する
ハイブリダイゼーション緩衝液２００μｌを入れる。インキュベーションを３７
℃で撹拌しながら１時間実施する。

【００８８】 次いで、ウェルを、４００μｌの溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７
．４；３００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で６回洗浄し
、次いでプローブに結合したペルオキシダーゼの活性を、色素原テトラメチルベ
ンジジン（ＴＭＢ）を含有する検出溶液２００μｌを各ウェルに添加することに
よって検出する。マイクロプレートを３７℃で暗所で３０分間インキュベートし
、次いで１００μｌの１．５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄溶液を添加して、反応をブロックする
。光学密度値を６２０ｎｍの参照に対して４５０ｎｍで測定する。

【００８９】 ４）特異性の研究： 総数１４２個の細菌株に対して、ＰＣＲ増幅工程用の配列番号５および配列番
号６のプライマーの対、配列番号１５の捕獲プローブおよびマイクロプレートで
のハイブリダイゼーション工程用の配列番号１８の検出プローブを使用して試験
を実施した。

【００９０】 イー・コリ株および非イー・コリ株（異なる属および種の細菌）を用いてマイ
クロプレート上で得られた結果をそれぞれ以下の表Ｉおよび表ＩＩに示す

【００９１】

【表１】 （＋）の結果はＯＤ₄₅₀＞２．５に対応する。 （＋）の結果はＯＤ₄₅₀＜０．０５に対応する。

【００９２】

【表２】 （＋）の結果はＯＤ₄₅₀＞２．５に対応する。 （＋）の結果はＯＤ₄₅₀＜０．０５に対応する。

【００９３】 結論として、Ｏ１５７：Ｈ７および１５７：Ｈ−株のみが上記の系を用いてマ
イクロプレート上で検出される。

【００９４】 実施例３ ＥＨＥＣの特異的検出 種々の血清型のイー・コリおよびＥＨＥＣの検出を妨害し得る他の細菌種を含
む総数１４２個の細菌株について特異性を試験した。

【００９５】 ＤＮＡを実施例２の第１パラグラフに記載したプロトコルに従って抽出した。

【００９６】 増幅条件は以下のとおりである：反応を、５０ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；それぞれ０．５μＭの配
列番号２１および配列番号２２のプライマー；２００μＭ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）；１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（BRL Life Tec
hnologies）および実施例２のパラグラフ１で示したように調製したＤＮＡ ５
μｌを含有する総容量５０μｌで実施する。

【００９７】 温度サイクルを「Perkin-Elmer 9600」サーモサイクラー中で実施する。

【００９８】 各実験はポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。

【００９９】 増幅産物をＥｔＢｒで染色したアガロースゲル上で可視化した。３８２ｂｐの
バンドの存在は試験試料中のＥＨＥＣの存在を示す。

【０１００】 結果を表ＩＩＩに示す。 ヒト感染から単離された株に頻繁に関連するビルレンス因子であるｅｈｌｙお
よびｅａｅ特性を示す株のみが、配列番号２１および配列番号２２のプライマー
の対を用いるＰＣＲによって検出される。

【０１０１】 さらに、このプライマーの対を使用することによっても、特に単一の増幅反応
によって、腸管出血性大腸菌に特徴的な遺伝子型（ｖｔ⁺、ｅａｅ⁺、ｅｈｌｙ⁺
）を有するイー・コリ株を検出することが可能となる。

【０１０２】

【表３】

【０１０３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 配列番号１の配列を示す図である。

【図２】 配列番号２の配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ドミニク・ティエリー フランス、エフ−92100ブローニュ、リ ュ・デ・ロン・プレ４番 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 AA20 BA38 CA02 CA09 DA06 EA06 HA12 4B050 DD02 LL02 LL03 4B063 QA01 QA07 QA18 QQ06 QQ43 QQ58 QR32 QR39 QR55 QR66 QS25 QS34 QS36 4B065 AA26X BD34 BD35 CA24 CA46 4H045 AA30 CA11 DA83 EA52

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の核酸配列または配列番号２の核酸配列を含む単
   離されたヌクレオチド配列、その相補配列、そのフラグメント、および１個以上
   の塩基の変異、挿入、欠失および／または置換で異なり、それぞれ配列番号１お
   よび配列番号２の配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするそれ
   に由来する配列。
2. 【請求項２】 配列番号１の配列を含む単離されたヌクレオチド配列、その
   相補配列、および挿入配列ＩＳ９１の少なくとも一部およびｋａｔＰ遺伝子の配
   列の少なくとも一部の安定な組合せから生じるヌクレオチド鎖を含むそれに由来
   する配列。
3. 【請求項３】 配列番号１の配列の少なくとも８個、有利には１０個、好ま
   しくは１４個の連続したヌクレオチド鎖を含み、４００〜４０７位のヌクレオチ
   ドを含む請求項２記載の単離されたヌクレオチド配列。
4. 【請求項４】 配列番号１の配列もしくは配列番号２の配列、または請求項
   １において定義するそれに相補的でそれに由来する配列の少なくとも８個の連続
   したヌクレオチドを含む単離されたヌクレオチド配列。
5. 【請求項５】 以下の核酸配列： 配列番号３：5'- CGGAGATGAAAGCACCACTGTG -3' 配列番号４：5'- GGGCTGTGTAATCTCAGAGGAG -3' 配列番号５：5'- GTCCGGAGATGAAAGCACCACTGTG -3' 配列番号６：5'- TCAGGGCTGTGTAATCTCAGAGGAG -3' 配列番号７：5'- GGCGCTGATACCGGCAAGAATGG -3' 配列番号８：5'- GGTCCCGCAGGCCATGATTTTTG -3' 配列番号９：5'- CCGGCAAGAATGGTCGCAAACTCC -3' 配列番号１０：5'- AAGGGGTTCCAAGCCGCAACTGACGA -3' 配列番号１１：5'- TAAGGGGTTCCAAGCCGCAACTGACG -3' 配列番号１２：5'- CTCAACGGCATCGTCAGTTGCGGCTTGGAAC -3' 配列番号１３：5'- AGCACTCAACGGCATCGTCAGTTGCGGCTTG -3' 配列番号１４：5'- CTATTTCAGGATACCCTTCGTCATCAACACG -3' 配列番号１５：5'- AATTTCCCTTAATCCGGAGCTATTCGTATGA -3' 配列番号１６：5'- GAAGACCAGCTTTTTGTTTC -3' 配列番号１７：5'- TGTCACAGACTCAATGACTA -3' 配列番号１８：5'- GGCATCGTCAGTTG -3' 配列番号１９：5'- CGGCATCGTCAGTTGC -3' 配列番号２０：5'- ACGGCATCGTCAGTTGCG -3' 配列番号２１：5'- CCACCTGAACGATAAGCGGAAC -3' 配列番号２２：5'- CACCTTCCTTCCATCCTCAGAC -3' 配列番号２３：5'- ATCCCAGCGCGCTCCAGCTG -3' 配列番号２４：5'- ACCCATGATGGCGCATCTGATG -3' 配列番号２５：5'- ACGTTCTGGTCTTACGGGTGATGTAGGTTTT -3' 配列番号２６：5'- TAGTGAAGCGGTGACAGCATATCAGACGGCT -3' 配列番号２７：5'- GTGAGATAGGCACAACAATGA -3' から選択される請求項４記載の単離されたヌクレオチド配列。
6. 【請求項６】 以下の配列の以下の対： 配列番号３と配列番号４、 配列番号５と配列番号６、 配列番号６と配列番号７、 配列番号６と配列番号８、 配列番号６と配列番号９、 配列番号２１と配列番号２２、 配列番号２３と配列番号２４ から選択される、プライマーとして使用される請求項４または５記載の単離され
   たヌクレオチド配列の対。
7. 【請求項７】 以下の配列：配列番号１４、配列番号２５、配列番号１５、
   配列番号２６、配列番号１８および配列番号２７から選択されるプローブとして
   使用される請求項４または５記載の単離されたヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 標識されていることを特徴とする請求項７記載の単離された
   ヌクレオチド配列。
9. 【請求項９】 支持体に固定化されていることを特徴とする請求項７記載の
   単離されたヌクレオチド配列。
10. 【請求項１０】 １９９８年３月２６日にそれぞれ番号Ｉ−１９９９および
    Ｉ−２０００のもとにコレクション・ナショナル・ドゥ・クルチュル・ドゥ・ミ
    クロオルガニスムに寄託されたプラスミドｐＤＦ３およびｐＰＤＦ４。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載のプラスミドを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 以下の工程： （ａ）試料を、請求項５に定義されるオリゴヌクレオチドから選択されるオリ
    ゴヌクレオチドプライマーの対と接触させる工程であって；試料中に含まれる核
    酸は、適切な場合、試験される標的の核酸とのプライマーのハイブリダイゼーシ
    ョンに接近可能にされている工程、 （ｂ）選択したプライマーの対が隣接する核酸配列を増幅する工程、 （ｃ）増幅産物に特異的な少なくとも１個のプローブを使用することによって
    増幅産物の存在を確認する工程、 を包含する試料中のイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣの検出法。
13. 【請求項１３】 工程（ｃ）が以下の下位工程： （ｃ₁）増幅配列を物理的または化学的手段によって変性する工程、 （ｃ₂）工程（ｃ₁）の変性した増幅フラグメントを含有する溶液を、一方で少
    なくとも１個の捕獲プローブと、他方で所望により標識した少なくとも１個の検
    出プローブと接触させる工程であって、捕獲および検出プローブは請求項１で定
    義される配列を有し、増幅フラグメントと同じ鎖とハイブリダイズでき、接触が
    ハイブリダイゼーション反応をさせるために十分な時間実施される工程、 （ｃ₃）少なくとも１回洗浄して未反応核酸配列を除去する工程、 （ｃ₄）増幅核酸配列とハイブリダイズした検出プローブを可視化する工程、 を含む請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 捕獲プローブがマイクロタイトレーションプレートの壁の
    表面に結合されている請求項１２または１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 検出プローブがペルオキシダーゼで標識されている請求項
    １２または１３記載の方法。
16. 【請求項１６】 反応した検出プローブに結合したペルオキシダーゼの活性
    の検出が、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のような色素原性基質の存在下で
    の比色反応によって以下の工程： − 反応混合物を含むウェルへＴＭＢ溶液のような色素原性基質を添加する工
    程、 − 発色に十分な時間暗所でインキュベートする工程、 − ブロッキング溶液の添加によって反応をブロックする工程、 − 適切な波長で光学密度を測定する工程、 を使用して実施される請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. 【請求項１７】 以下のオリゴヌクレオチド： − 増幅用プライマーとしての配列番号５および配列番号６の配列、 − 捕獲プローブとしての配列番号１５の配列、 − 検出プローブとしての配列番号１８の配列。 を使用する請求項１２〜１６のいずれか１項記載のイー・コリＯ１５７：Ｈ７の
    検出法。
18. 【請求項１８】 以下のオリゴヌクレオチド： − 増幅用プライマーとしての配列番号２１および配列番号２２の配列、 − 捕獲プローブとしての配列番号２５の配列、 − 検出プローブとしての配列番号２７の配列。 を使用する請求項１２〜１６のいずれか１項記載のＥＨＥＣの検出法。
19. 【請求項１９】 試薬の中に以下： − プライマーの対として使用される少なくとも２個の請求項５記載のオリゴ
    ヌクレオチド、 − 所望により増幅産物の検出用の少なくとも１個の請求項５記載のオリゴヌ
    クレオチドプローブ、 を含むイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはＥＨＥＣ検出用キット。