CN100441696C - 肠出血性大肠杆菌o157：h7菌株的检测方法 - Google Patents

肠出血性大肠杆菌o157：h7菌株的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7菌株的特异序列SEQID NO：1及利用根据该序列或其同源序列设计的引物或探针检测该菌株的方法。针对该序列进行的检测方法快速、特异、敏感，可用来检测和鉴定EHEC O157:H7菌株。本发明还涉及到应用所设计的引物或探针的试剂盒。

Description

肠出血性大肠杆菌O157：H7菌株的检测方法
技术领域
本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的检测方法，特别涉及肠出血性大肠杆菌(EHEC)的特异序列以及根据该序列或其同源序列设计的引物或探针来检测EHEC O157:H7菌株的方法，还涉及应用此引物或探针的试剂盒。
背景技术
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)是近年来发现的危害严重的肠道致病菌。自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，EHEC O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，日益成为人类关注的病原菌。它可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合征和血小板减少性紫癜等。美国CDC调查表明，每年约有70,000左右的肠出血性大肠杆菌感染病例，因此它已经成为重要的威胁人群健康的重要公共卫生问题。
目前，已公开了检测EHEC O157:H7的很多方法。这些方法均基于该病原菌区别于其它大肠杆菌的各种特点，如24小时内不发酵山梨醇、缺乏β-葡糖醛酸糖苷酶活性、可表达O157菌体抗原和H7鞭毛抗原、产生志贺样毒素、具有溶血素基因hly和eae基因。相应地，检测此大肠杆菌的方法包括选择性培养基法、核酸探针法、血清蛋白印迹法和检测菌株的志贺样毒素法等。
由于人们业已发现山梨醇发酵阳性和β-葡糖醛酸糖苷酶活性阳性的大肠杆菌O157菌株，因此，不能通过不发酵山梨醇、缺乏β-葡糖醛酸糖苷酶活性的特征来特异鉴定大肠杆菌O157菌株。此外，沙门氏菌的N群、小肠结肠炎耶尔森氏菌等菌的菌体抗原也能与O157菌体抗原的抗体发生交叉反应，因此，也不能通过鉴定O157菌体抗原来特异鉴定大肠杆菌O157菌株。
同时，许多非O157:H7血清型的EHEC，如O26、O111、O91、O103、O146等血清型的大肠杆菌以及志贺氏菌、霍乱弧菌、枸橼酸杆菌等的部分菌株也具有志贺样毒素基因，因此，单纯使用检测毒素基因的引物或探针，无法区分这些菌株与肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)及EHEC的不同血清型。而且，志贺样毒素基因变异较大，用一对引物很难检测出所有的毒素基因。EPEC也有LEE毒力岛，它的eae基因和EHEC的eae基因有高度的同源性。EHEC O26、O111等也有溶血素基因hly，同样可以引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征，因此对eae、hly基因的鉴定也不能特异检测大肠杆菌O157:H7菌株。
菌体抗原为O157的大肠杆菌菌株具有多种多样的鞭毛抗原。而许多非O157血清型菌株，尤其是大肠杆菌O55:H7菌株，它们也有H7鞭毛基因fliC。而且有研究认为大肠杆菌O157:H7是由其进化而来，两者有特别近的亲缘关系。所以，与菌体抗原O157的基因一样，H7鞭毛基因的引物只能作为辅助检测手段用于大肠杆菌O157:H7菌株的鉴定。
因此，到目前为止还没有出现关于运用特异性引物或探针鉴定EHECO157:H7菌株的报道。EHEC O157:H7菌株的全基因组序列约5.5Mb，在如此之长的序列中寻找出与其它众多菌株不同的且能用于特异鉴定的特异序列，是目前没有解决的技术难题，这也是导致目前还没有特异检测和鉴定EHEC O157:H7菌株方法的原因之一。
因此，鉴定EHEC O157:H7菌株的特异序列，并据此发明一种快速、特异、敏感的检测和鉴定EHEC O157:H7菌株方法，实乃本领域所急需。
发明内容
本发明的目的是提供EHEC O157:H7菌株的特异序列及针对其特异序列的快速、特异、敏感检测和鉴定EHEC O157:H7菌株的方法，以填补目前没有特异检测和鉴定EHEC O157:H7菌株方法的空白，克服现有技术的不足。
为实现上述目的，本发明提供一种肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的检测方法，包括：
提供肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的特异序列SEQ ID NO：1(见序列表)；
根据所述SEQ ID NO：1或其同源序列设计引物或探针；
利用所设计的引物或探针检测受测个体的基因序列；及
根据所述的检测结果判断是否是肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株。
根据本发明中的序列SEQ ID NO：1或其同源序列而设计的引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7或其同源序列；所设计的探针选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或其同源序列。
本发明方法中检测受测个体的基因序列方法包括PCR、Southern blot杂交、原位杂交或斑点杂交等，优选使用PCR方法。
本发明中PCR反应条件为：所设计引物的终浓度在0.25～0.5μM之间；该PCR反应退火温度可在50℃～54℃之间变动；Taq DNA聚合酶的终浓度可在0.05～0.075U/μl之间变动。
本发明的又一目的是提供用来鉴别肠出血性大肠杆菌EHECO157:H7菌株的试剂盒，其中含有根据序列SEQ ID NO：1或其同源序列设计的引物或探针。
本发明试剂盒中的引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7或其同源序列；所设计的探针选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或其同源序列。
本发明的方法可一次性实现对EHEC O157:H7菌株的鉴定。而传统检测EHEC O157:H7菌株的PCR方法往往需要对几对引物的检测结果进行综合判断。本发明的方法具有较高的灵敏度，至少可以检测到48CFU/PCR(20μl的反应体系)的EHEC O157:H7菌株。
附图说明
图1是用引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的部分菌株PCR检测结果。代表肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株和其阳性对照的泳道有一条约为427bp的条带，与所设计的引物预扩增的理论值吻合，而其余所测菌株均为阴性。
图2是用引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的PCR产物标记的探针与部分菌株染色体的Southern blot杂交结果。代表肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株和其阳性对照的泳道有一条阳性条带，而其余所测菌株均为阴性。
图3是用引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4的部分菌株PCR检测结果。代表肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株和其阳性对照的泳道有一条约为427bp的条带，与所设计的引物预扩增的理论值吻合，而其余所测菌株均为阴性。
图4是用引物SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7的部分菌株PCR检测结果。代表肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株和其阳性对照的泳道有一条约为641bp的条带，与所设计的引物预扩增的理论值吻合，而其余所测菌株均为阴性。
具体实施方式
本发明中的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的序列SEQ ID NO：1如序列表所示，该序列从Genebank中获取，登录号为GI：12519288。
同源序列是指从某一共同祖先经过共进化而形成的不同序列。本领域所属技术人员根据本发明中的SEQ ID NO：1，能够显而易见地得出SEQID NO：1的同源序列。
根据本发明的序列SEQ ID NO：1或其同源序列设计出的适合用于本发明方法的引物或探针对本领域所属技术人员是显而易见的。这些引物或探针可检测序列SEQ ID NO：1中的核酸片段。
作为非限制性示例，可用于本发明的引物选自SEQ ID NO：3和SEQID NO：4，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7或其同源序列；所设计的探针选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或其同源序列。其序列如序列表所示。
应当理解，本领域所属技术人员可对所设计的引物或探针进行碱基增加、删减或改变，设计出检测序列SEQ ID NO：1或其同源序列的上述引物或探针的其它同源序列。如将SEQ ID NO：3改变为序列SEQ ID NO：5：5′-CCT ATC CCT TTT TGT TCT GG-3′，同样能够实现本发明的目的。
本发明方法中，检测受测个体的基因序列方法可以选择PCR、Southern blot杂交、原位杂交或斑点杂交等方法中的任一种。在这些方法中，优选使用PCR方法。
本发明的一个实施方案是利用引物SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4，通过PCR方法对受测体样品进行检测，扩增出本发明中序列SEQ ID NO：1中的一段核酸序列SEQ ID NO：2，鉴别肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7菌株。SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：2序列如序列表所示。
本发明的另一实施方案是利用引物SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：7，通过PCR方法对一受测体样品进行检测，扩增出本发明中特异序列SEQID NO：1中的另一段核酸序列SEQ ID NO：8，鉴别肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7菌株。SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8序列如序列表所示。
其反应条件为：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的终浓度为0.25～0.5μM；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的PCR反应退火温度可为50℃～54℃；Taq DNA聚合酶的终浓度可为0.05～0.075U/μl。
本领域所属技术人员可根据具体所选用的引物和其它情况确定PCR的条件。
在一优选的实施方案中，PCR反应条件为：
反应体系：11.7μl水，1.2μl MgCl2，2μl 10×buffer，引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的终浓度为0.5μM，每种dNTP的终浓度为0.2mM，0.075U/μl Taq DNA聚合酶，1μl模板，终反应体系为20μl。
引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的PCR反应扩增条件：首先94℃预变性5分钟，以94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟循环30次，最后72℃延伸8分钟。
引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的PCR反应扩增条件：首先94℃预变性5分钟，以94℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分钟循环30次，最后72℃延伸8分钟。
本发明的受测个体可以为怀疑受到肠出血性大肠杆菌污染的食品和环境、怀疑受感染的动物和人等。
本发明也提供用来鉴别肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7菌株的试剂盒，所述试剂盒包括含有本发明描述的引物或探针。这些试剂盒可制成PCR检测试剂盒、Southern blot杂交试剂盒、原位杂交试剂盒或斑点杂交试剂盒等。
在本发明一个实施方案中，PCR检测试剂盒包含所设计的引物，以及本技术领域技术人员所熟知的其它成分，如Taq酶、反应buffer、dNTP、水等。
可用于本发明PCR检测试剂盒的引物的例子包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。
下面以具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此限定本发明的范围。
实施例1
鉴定肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7菌株的PCR方法
(1)实验菌株
实验选取了234株菌，包括：
7株致泻性大肠杆菌的国际或国内参考株；
6株EPEC；
8株肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxingenic E.coli，ETEC)；
1株泌尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)；
EHEC O26、EHEC O111各1株；
46株志贺氏菌；
4株耶尔森氏菌；
4株肺炎克雷伯氏菌；
12株沙门氏菌(包括A、B、C、D、E、F、I各群)；
10株柠檬酸杆菌；
2株摩根氏菌；
霍乱弧菌、变形杆菌、聚团肠杆菌、普罗菲登斯菌、蜂房哈夫尼菌各1株；
从临床病人或动物体上分离的大肠杆菌O157菌株127株，其中62株为大肠杆菌O157:H7菌株，65株属于大肠杆菌O157的其它H血清型。
美国测序菌株EHEC O157:H7 EDL933在实验中作为阳性对照菌株，大肠杆菌MG1655作为阴性对照菌株。
(2)PCR反应模板的制备
挑取单菌落密涂于LB平板上37℃生长过夜。刮取适量菌落于1.5ml离心管，用水悬菌。在沸水中煮10分钟后12,000转/分离心10分钟。上清即为模板DNA，在-20℃保存备用。
(3)PCR扩增
终反应体系为20μl，在0.5ml离心管中依次加入以下成分：11.7μl水，1.2μl MgCl2，2μl 10×buffer，使引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的终浓度为0.5μM，每种dNTP的终浓度为0.2mM，Taq DNA聚合酶的终浓度为0.075U/μl，1μl模板。混匀后，按扩增条件进行反应：首先94℃5分钟；以94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟循环30次；最后，72℃延伸8分钟。
(4)PCR产物检测
用常规的琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物，具体方法参见《分子克隆》第二版。
(5)PCR产物测序
将PCR扩增产物通过电泳切胶后用纯化试剂盒纯化，然后直接进行测序。
(6)实验结果
用电泳检测PCR产物的结果如图1所示，其中M：markerDL2000；1：为阳性对照大肠杆菌O157:H7 EDL933；2：为阴性对照大肠杆菌MG1655；3-9依次为：EHEC O157:H7菌株病21、大肠杆菌O157:H42菌株25、EPEC 2348/69、志贺氏菌301、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3、沙门氏菌50001-24、肺炎克雷伯氏菌。
可见，只有阳性对照大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株和EHECO157:H7菌株病21扩增为阳性，其余所测菌株均为阴性。
测序结果与所述特异序列SEQ ID NO：1比对，未发生碱基突变或丢失，即为肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株。
(7)结论
结果表明，根据SEQ ID NO：1或其同源序列SEQ ID NO：2设计的引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4可以用于EHEC O157:H7菌株的检测，并且最少可以检测到48CFU/PCR(20μl的反应体系)。
实施例2
EHEC O157:H7菌株的Southern blot杂交实验
(1)探针的制备
用切胶回收试剂盒回收引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的PCR扩增产物，用德国罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Corporation)的地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kit)标记PCR扩增产物得到探针。
(2)Southern blot杂交
进行Southern印迹分析的方法见于Sambrook等，1989所述，该方法包括：
1)用限制性内切酶EcoRV酶切细菌染色体过夜；
2)常规电泳分离酶切产物；
3)转膜及膜处理：
用蒸馏水洗去胶上多余的EB并切去多余部分，切去左上角作为标记。在变性液(0.5N NaOH、1.5M NaCl)中变性45分钟，并不断地摇动。蒸馏水稍事漂洗。用中和液(1.5M NH4Ac、0.02M NaOH；或0.5M Tris·HCl、3M NaCl，pH7.5)中和两次，每次15分钟，每次均用蒸馏水冲洗。准备硝酸纤维素膜：将膜在去离子水中浸透，再用20×SSC(3M NaCl、300mM柠檬酸钠，pH7.0)浸泡至少5分钟。同时用2×SSC(将20×SSC用蒸馏水10倍稀释)浸泡两张与膜同样大小的滤纸。将胶翻转(加样孔朝下)放于用滤纸包好的支撑物上，用塑料膜围绕一周以防短路；将膜放于胶上，除去气泡，将滤纸放于膜上，再将略小于滤纸的吸水纸压于其上。转膜8-24小时。取出膜，用6×SSC(将20×SSC用蒸馏水3.33倍稀释)浸泡5分钟，以除去粘在膜上的琼脂糖凝胶；取出膜，在干净的滤纸上晾干30分钟后80℃固定2小时。
4)预杂交和显色检测
将膜封于袋中，加入预杂交液(5×SSC、0.1％十二烷基肌氨酸钠、0.02％十二烷基磺酸钠、2％封闭液)，68℃水浴2小时。
准备探针：将探针加入少量的预杂交液中，沸水中煮10分钟，立即置于冰上，加入一定量的预杂交液，使探针的浓度为5-25ng/ml，将杂交液加入袋中。
68℃水浴16小时；
用洗膜I液(2×SSC  0.1％SDS)洗两次，每次5分钟；
用洗膜II液(0.1×SSC 0.1％SDS)68℃洗两次，每次15分钟；
BufferI(0.1M顺丁烯二酸、0.15M NaCl，用NaOH调pH值至7.5)液洗1分钟；
Buffer II液(以BufferI10倍稀释10×封闭液，即封闭剂终浓度为1％)洗30-60分钟；
BufferII液+抗体(1∶10000稀释)室温温育30分钟；
BufferI液洗两次，每次15分钟；
BufferIII液(100mM Tris·HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH9.5)平衡2-5分钟后显色，显色剂为每10ml Buffer III加200μl NBT/BCIP。
10×封闭液由固体封闭剂溶于Buffer I中，终浓度为1％(体积比)；固体封闭剂、抗体、显色剂均来自地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNALabeling and Detection Kit)。
(3)Southern blot杂交结果
Southern blot杂交结果如图2所示，其中M：λDNA HindIII；1：阳性对照大肠杆菌O157:H7EDL933；2：阴性对照大肠杆菌MG1655；3-13依次为：EHEC O157:H7菌株病21、大肠杆菌O157:H42菌株25、EPEC2348/69、志贺氏菌301、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3、沙门氏菌50001-24、肺炎克雷伯氏菌、EIEC 8401、ETEC 10407、EAggEC O42、UPEC CFT073。
可见，只有1泳道的阳性对照大肠杆菌O157:H7 EDL933和3泳道的EHEC O157:H7菌株病21的杂交结果阳性，其余所测菌株均为阴性。
(4)结论
结果表明，利用SEQ ID NO：2作为探针可对EHEC O157:H7菌株进行Southern blot杂交分析，可以用于EHEC O157:H7菌株的检测。同时也说明了PCR扩增产物为EHEC O157:H7菌株的特异序列。
实施例3
引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4的特异性研究实验
(1)实验菌株
实验选取了232株菌，包括：
7株致泻性大肠杆菌的国际或国内参考株；
6株EPEC；
8株肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxingenic E.coli，ETEC)；
1株泌尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)；
EHEC O26、EHEC O111各1株；
46株志贺氏菌；
4株耶尔森氏菌；
4株肺炎克雷伯氏菌；
11株沙门氏菌(包括A、B、C、D、E、F、I各群)；
9株柠檬酸杆菌；
2株摩根氏菌；
霍乱弧菌、变形杆菌、聚团肠杆菌、普罗菲登斯菌、蜂房哈夫尼菌各1株；
从临床病人或动物体上分离的大肠杆菌O157菌株127株，其中62株为大肠杆菌O157:H7菌株，65株属于大肠杆菌O157的其它H血清型。
美国测序菌株EHEC O157:H7 EDL933在实验中作为阳性对照菌株，大肠杆菌MG1655作为阴性对照菌株。
(2)实验方法
改变引物SEQ ID NO：3序列中的某些碱基得到引物SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：5为5′-CCT ATC CCT TTT TGT TCT GG-3′，与SEQ ID NO：4配对，运用同实施例1相同的PCR方法进行扩增。
将PCR扩增产物通过电泳切胶后用纯化试剂盒纯化，然后直接进行测序。并将测序结果与所述特异序列SEQ ID NO：1比对，测序方法同实施例1。
(3)实验结果
用引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4对部分菌株的PCR扩增结果如图3所示，其中，M：marker DL2000，1：阳性对照大肠杆菌O157:H7 EDL9332：阴性对照大肠杆菌MG1655 3-9依次为EHEC O157:H7菌株病21、大肠杆菌O157:H42菌株25、EPEC 2348/69、志贺氏菌301、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3、沙门氏菌50001-24、肺炎克雷伯氏菌。
只有阳性对照大肠杆菌O157:H7EDL933菌株和EHEC O157:H7菌株病21扩增为阳性，并与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所扩增片段长度相同，其余所测菌株均为阴性。
PCR产物测序结果与所述特异序列SEQ ID NO：1比对，未发生碱基突变或丢失，即为肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株。
(4)结论
证明引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4具有同样的特异性，可以用于EHEC O157:H7菌株的检测。
实施例4
鉴别肠出性大肠杆菌(EHEC)O157:H7菌株的PCR方法
(1)实验菌株
实验选取了131株菌，包括：
7株致泻性大肠杆菌的国际或国内参考株；
EHEC O26、EHEC O111各1株；
45株志贺氏菌；
3株耶尔森氏菌；
4株肺炎克雷伯氏菌；
10株沙门氏菌(包括A、B、C、D、E、F、I各群)；
7株柠檬酸杆菌；
2株摩根氏菌；
霍乱弧菌、变形杆菌、聚团肠杆菌、普罗菲登斯菌、蜂房哈夫尼菌各1株；
从临床病人或动物体上分离的大肠杆菌O157菌株46株，其中19株为大肠杆菌O157:H7菌株，27株属于大肠杆菌O157的其它H血清型。
美国测序菌株EHEC O157:H7EDL933在实验中作为阳性对照菌株，大肠杆菌MG1655作为阴性对照菌株。
(2)实验方法
根据SEQ ID NO：1基因的前半部分设计一对引物SEQ ID NO：6、SEQID NO：7，SEQ ID NO：6为5′-CAT CCG CAG TTT CAT CTA CC-3′，SEQ IDNO：7为5′-CTC ACA TCT TGC CGA ACT TC-3′，运用同实施例1相同的PCR方法进行扩增，扩增SEQ ID NO：8，长度为641bp。
将PCR扩增产物通过电泳切胶后用纯化试剂盒纯化，然后直接进行测序。并将测序结果与所述序列SEQ ID NO：1比对，测序方法同实施例1。
(3)实验结果
用引物SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7对部分菌株的PCR扩增结果如图4所示，其中，M：markerDL2000，1：阳性对照大肠杆菌O157：H7 EDL9332：阴性对照大肠杆菌MG1655 3-9依次为EHEC O157:H7菌株病21、大肠杆菌O157:H42菌株25、EPEC 2348/69、志贺氏菌301、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3、沙门氏菌50001-24、肺炎克雷伯氏菌。
只有阳性对照大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株和EHEC O157:H7菌株病21扩增为阳性，其余所测菌株均为阴性。
PCR产物测序结果与所述特异序列SEQ ID NO：1比对，未发生碱基突变或丢失，即为肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株。
(4)结论
针对SEQ ID NO：1或其同源序列SEQ ID NO：8设计的引物，具有同样的特异性，可用于大肠杆菌O157:H7菌株的检测。
应该理解，本发明的实施例仅是为了更好地理解本发明而对本发明做出的非限制性说明。本领域的技术人员在没有偏离本发明的精神和范围内可对本发明做出各种修改、替换和变更，这些修改、替换和变更仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的检测方法
<130>04F394-WDZ
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1318
<212>DNA
<213><223>
<400>1
ttaattttga tgccagccag gttggtcatt ctcaaatacc tcagcctcgg ggaatatttt   60
agtcaatggg ataacatatt tgaccagatc atgggtaaaa aagtcatccg cagtttcatc  120
taccatccac gcagagttct catctatgcg tggcacgaga taatgaacat tcaggcggac  180
tattttagat ttttgctcaa aatttactat ggcagcatag tttttttccc ttcgtttatc  240
ggcaacatcc ttttgaatat ctacatccaa agctatatgc cctacgccta gaccataatc  300
caaaagctgg ttatctatct ctgctaatgt ttttgttaca tgtcgcgaac gtgcatcgaa  360
agatttttca ttgatacaac gccatgttat caaagaagca agtttaactt tggttatgaa  420
acgtgagtcg cgctcatctg gtcgtcccat agcaacaact tggtaatttt catcttccag  480
aggggagcct ttgataagac gagcaagttt agtgttgactagtaatgagc cgttttcagt   540
gatatcttcc ctgataagat ttaagttggc cggtctaatc gttccttttc cataatcatc  600
attccattca taaaatacac ctttaaagtt ttttaagtgg ctaatgatat agttttcagg  660
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gatatgaagt tcggcaagat gtgagcgtat atgatgctgt aatatttcct gctttacgta  780
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<210>2
<211>427
<212>DNA
<213><223>
<400>2
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attgcgcgat ctctagcgcc agtaattcta tcgagcgatt tagcacacac tcctaattgt    180
ttaacccatg gtattatatt tgaagcatta gtaacttcgt aagaccttct attatcgata    240
agcgattttg cttgtgcgaa ataaccagca accacgtcgg aaccatacca ttctgggtca    300
aactgtttcc cgaaattggc agctttttgg gttgtagcta tgtaaaattg ctgtgctttt    360
gctaagcgct ggtaaaagtg ttgtttgttc tcttgagttg atgctaacca ctcaagacca    420
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<400>3
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<400>5
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<210>7
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<213><223>
<400>7
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<212>DNA
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<400>8
catccgcagt ttcatctacc atccacgcag agttctcatc tatgcgtggc acgagataat     60
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tttcccttcg tttatcggca acatcctttt gaatatctac atccaaagct atatgcccta    180
cgcctagacc ataatccaaa agctggttat ctatctctgc taatgttttt gttacatgtc    240
gcgaacgtgc atcgaaagat ttttcattga tacaacgcca tgttatcaaa gaagcaagtt    300
taactttggt tatgaaacgt gagtcgcgct catctggtcg tcccatagca acaacttggt    360
aattttcatc ttccagaggg gagcctttga taagacgagc aagtttagtg ttgactagta    420
atgagccgtt ttcagtgata tcttccctga taagatttaa gttggccggt ctaatcgttc    480
cttttccata atcatcattc cattcataaa atacaccttt aaagtttttt aagtggctaa    540
tgatatagtt ttcaggcgcg tctttaactt cacataaata tgtgacatca gtccatacgt    600
tcatcttttt ggatttgata tgaagttcgg caagatgtga g                        641

Claims (8)

1.一种用于非诊断目的的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的检测方法，其特征在于：
提供特异检测肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的引物或探针，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4、SEQID NO：6和SEQ ID NO：7；所述的探针选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；
利用所述引物或探针检测受测个体的基因序列；及
根据所检测的结果判断所述个体是否是肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述检测受测个体的基因序列的方法选自PCR、Southern blot杂交、原位杂交和斑点杂交。
3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述检测受测个体的基因序列的方法为PCR。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述PCR反应条件为：所设计引物的终浓度为0.25～0.5μM；所述PCR反应退火温度为50℃～54℃；Taq DNA聚合酶的终浓度为0.05～0.075U/μl。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述PCR反应条件为：
反应体系：11.7μl水，1.2μl MgCl2，2μl 10×缓冲液，引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的终浓度为0.5μM，每种dNTP的终浓度为0.2mM，0.075U/μl Taq DNA聚合酶，1μl模板，终反应体系为20μl；
引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的PCR反应扩增条件：首先94℃预变性5分钟，以94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟循环30次，最后72℃延伸8分钟；
引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的PCR反应扩增条件：首先94℃预变性5分钟，以94℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分钟循环30次，最后72℃延伸8分钟。
6.鉴别肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的试剂盒，其中包含用于特异检测肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的引物或探针，所述的引物选自SEQID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；所述的探针选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其选自PCR反应、Southern blot杂交、原位杂交和斑点杂交试剂盒。
8.肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的特异序列SEQ ID NO：1。
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