CN103409517A

CN103409517A - 快速检测肠出血性大肠杆菌o157:h7的生物传感芯片

Info

Publication number: CN103409517A
Application number: CN2013103153714A
Authority: CN
Inventors: 吴其明
Original assignee: FUJIAN YAMING FOOD Co Ltd
Current assignee: FUJIAN YAMING FOOD Co Ltd
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明公开了快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，包括以下步骤：（1）金纳米棒的制备；（2）金纳米棒在玻璃基质上的固定；（3）核酸探针的固定。该方法制备出的生物传感芯片能应用于环境、食品及其它样品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的高灵敏度、高特异性及快速检测。相比于传统的细菌学检测方法，本发明所述方法大大地缩短了样品的检测周期。同时，相比于O157:H7的免疫学检测方法，本方法在特异性及稳定性方面也有一定优势。

Description

快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片

技术领域

本发明属于分析化学及食品分析领域，具体涉及快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片。

背景技术

肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌的一个亚型，分为157、26、111血清型，主要致病菌株为O157∶H7，可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。O157：H 7于1982年首次被证实为致病菌（M icrobiol Methods, 2003, 55 ( 2): 383）, 肠出血性大肠杆菌感染是一种人畜共患病。凡是体内有肠出血性大肠杆菌感染的病人、带菌者和家畜、家禽等都可传播本病。能引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征等严重的临床症状, 可通过食物和饮水导致大规模暴发（Appl Environ Microbiol. 1999，65(5), 1966; Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70, 527），例如， 2011年6月，德国报告的由肠出血性大肠杆菌感染的确诊或疑似病例2000余例，死亡达24例，其中15例是女性。除德国外，奥地利、捷克、丹麦、法国、荷兰、挪威、西班牙、瑞典、瑞士、英国、卢森堡、美国、加拿大等15个国家也报告了输入性肠出血性大肠杆菌感染病例或其严重并发症——溶血性尿毒综合征病例(PLoS ONE, 2011, 6 (7): e22751)。

快速检测和鉴定病原体是突发性传染病诊断、治疗和控制的关键。长期以来, 致病性O157：H 7感染的实验室诊断主要依靠传统的细菌学检测方法, 步骤繁琐且需要数天才能得出结果(Biosens. Bioelectron., 2010, 26, 112)。免疫学方法主要是检查肠出血性大肠杆菌菌体抗原O157和鞭毛抗原H7(Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 3558)。包括试管凝集、玻片凝集和针对O157抗原而发展起来的一些其他方法，但均在不同程度上存在特异性和敏感性问题。因此, 建立一种快速而且特异的诊断致病性O157：H 7感染的方法已成为一项重要研究课题。DNA探针技术目前已根据肠出血性大肠杆菌的质粒和其致病性有关的假设，发展了特异性的DNA探针(Biosens. Bioelectron., 2013, 42, 581; J. Microbiol. Methods, 2012, 88, 110)。该探针已被国际公认，并在世界上多数实验室试用，其特异性和敏感性均可达99%以上，成为鉴定肠出血性大肠杆菌菌株的关键指标。但由于该方法对技术要求较高，目前主要用于临床研究或流行病学调查。

发明内容

本发明的目的在于提供快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片。应用该生物传感芯片制备成本低，制得的生物芯片易于保存，稳定性好，能够实现对样品中O157:H7特异基因的快速诊断，有望在环境监测、食品安全控制及医学诊断等领域得到广泛应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，包括以下步骤：

（1）金纳米棒的制备：采用传统的金种生长法（Jana et al, Adv. Mater. 2001, 13, 1389）制备长径比为2-6的金纳米棒；

（2）金纳米棒在玻璃基质上的固定：包括以下三个步骤：

a. 玻璃基质的清洗：将玻璃基质浸入体积比为4：1的浓硫酸与过氧化氢的混合溶液中氧化，然后放入超声仪中超声；所述的浓硫酸的含量大于等于98%；所述的过氧化氢的质量分数大于等于30%；

b. 3-氨丙基三甲氧基硅烷修饰：将清洗后的玻璃基质浸入3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，静置反应2小时，然后用甲醇和去离子水反复冲洗3遍后放入烘箱于120℃下烘2小时；

c. 聚苯乙烯磺酸钠修饰：将上述表面修饰有3-氨丙基三甲氧基硅烷的玻璃基质浸入聚苯乙烯磺酸钠水溶液中，静置反应40-70分钟；

d. 金纳米棒的修饰：将上述修饰有聚苯乙烯磺酸钠的玻璃基质浸入步骤（1）中制备的金纳米棒溶液中，静置反应40-70分钟。

（3）核酸探针的固定：将步骤（2）中修饰有金纳米棒的玻璃基质浸入末端修饰有巯基的核酸探针溶液中，静置反应6-12小时；

所述的步骤（2）中所述的玻璃基质包括各种成份及形状的透明玻璃。

所述的步骤（2）b中3-氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液的质量分数为3%－8%。

所述的步骤（2）c中聚苯乙烯磺酸钠水溶液的浓度为15-25 mg/mL。

所述的步骤（2）d中使用的金纳米棒溶液中含有80-100 mM的NaCl。

所述的步骤（2）中所述的核酸探针的序列为：TGG AAT TGA GCA GCG TTG G。

所述步骤（3）中所述的核酸探针浓度为5 mM, 溶解于0.1 M， pH＝7.4 的Tris-HCl缓冲液中。

本发明的有益效果在于：

（1）芯片制备及检测成本低。该芯片采用普通的玻璃基质制备，无论相比于传统的免疫学方法还是商品化的DNA芯片技术，在传感器的制备成本方面都有较大的优势；同时，该芯片的检测只需用到便携式的UV－Vis光谱仪，不但设备成本低，而且便于搬运和携带，可用于环境样品的现场检测。

（2）制得的生物芯片稳定性高。该传感芯片的传感基底为金纳米棒，在常温下能够长时间稳定存在；同时，我们采用DNA探针为特异基因识别单元，相比于免疫学方法使用的蛋白质抗原抗体而言，DNA的稳定性要高得多。

（3）检测速度快。本方法制备的生物芯片能够在30分钟内实现对样品中肠出血性大肠杆菌O157:H7特异基因的识别与检测，而传统的生物学方法则需要数天时间。

附图说明

图1是应用本发明所述方法制备的生物传感芯片的SEM图。

图2是应用本发明方法制备的生物传感芯片检测肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组DNA的光谱图。其中黑色实线为不含O157:H7的空白样品，而黑色虚线为含1.0 ng/mL的O157:H7基因组DNA。

图3是应用本发明方法制备的生物传感芯片检测肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组DNA的工作曲线。

具体实施方式

本发明所述快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片的制备方法包括以下三个步骤：

（2）金纳米棒在玻璃基质上的固定。所述的玻璃基质包括各种成份及形状的透明玻璃。具体实施方式包括以下三个步骤：

b. 3-氨丙基三甲氧基硅烷修饰：将清洗后的玻璃基质浸入质量分数为3%－8%的3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，静置反应2小时，然后用甲醇和去离子水反复冲洗3遍后放入烘箱于120℃下烘2小时；

c. 聚苯乙烯磺酸钠修饰：将上述表面修饰有3-氨丙基三甲氧基硅烷的玻璃基质浸入浓度为15-25 mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠水溶液中，静置反应40-70分钟；

d. 金纳米棒的修饰：将上述修饰有聚苯乙烯磺酸钠的玻璃基质浸入步骤（1）中制备的、含有80-100 mM的NaCl的金纳米棒溶液中，静置反应40-70分钟。

（3）核酸探针的固定：将步骤（2）中修饰有金纳米棒的玻璃基质浸入浓度为5 mM，末端修饰有巯基的、基因序列为TGG AAT TGA GCA GCG TTG G的核酸探针溶液中，该溶液含0.1 M， pH＝7.4 的Tris-HCl缓冲液，静置反应6-12小时。

以下结合附图来叙述本发明的具体实施例：

实施例1：快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片的制备

应用本发明所述方法制备快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片的具体实施例：

（1）金纳米棒的制备：金纳米棒的制备参照文献（Jana et al, Adv. Mater. 2001, 13, 1389）合成方法, 采用晶种生长法制备。用SEM对其进行表征得平均粒径为26.4 nm, 长径比为2.7。在使用前将制备好的金纳米棒于8000转每分钟下离心洗涤两次, 再重新分散于0.1 M NaCl中备用。

（2）金纳米棒在玻璃基质（盖玻片：20 mm×20 mm）上的固定。包括以下三个步骤：

a. 盖玻片的清洗：将盖玻片浸入体积比为4：1的浓硫酸（98%）与过氧化氢（质量分数≥30%）的混合溶液中氧化，然后放入超声仪中超声8分钟；

b. 3-氨丙基三甲氧基硅烷修饰：将清洗后的盖玻片浸入质量分数为5%的3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，静置反应2小时，然后用甲醇和去离子水反复冲洗3遍后放入烘箱于120℃下烘2小时；

c. 聚苯乙烯磺酸钠修饰：将上述表面修饰有3-氨丙基三甲氧基硅烷的盖玻片浸入浓度为20 mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠水溶液中，静置反应60分钟；

d. 金纳米棒的修饰：将上述修饰有聚苯乙烯磺酸钠的盖玻片浸入步骤（1）中制备的、含有100 mM的NaCl的金纳米棒溶液中，静置反应60分钟。

（3）核酸探针的固定：将步骤（2）中修饰有金纳米棒的玻璃基质浸入浓度为5 mM，末端修饰有巯基的、基因序列为TGG AAT TGA GCA GCG TTG G的核酸探针溶液中，该溶液含0.1 M， pH＝7.4 的Tris-HCl缓冲液，静置反应6-12小时。得到能用于快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，图1为该芯片的高分辨SEM图。

实施例2：利用上述方法制得的生物芯片快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组DNA

利用上述方法制得的生物芯片快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组DNA主要有以下实验步骤：

（1）DNA杂交缓冲液的配制：在100 mL 容量瓶中加入20×SSC溶液30 ml，50×Denhardt’溶液10 ml，10% SDS溶液5 ml和10 mg/ml鲑鱼DNA 1 ml，最后用灭菌过的超纯水定容至100 mL。

（2）DNA杂交：取适量O157:H7基因组DNA，置于35mm直径的培养皿中，加入1mL DNA杂交缓冲液，振荡溶解后，将实施例1中制得的芯片浸入该溶液中，置于37℃恒温水浴中反应15分钟后，将芯片取出，用超纯水冲洗。

（3）样品检测：使用便携式UV-Vis光谱仪扫描吸附有O157:H7基因组DNA的生物芯片，得到的吸收光谱与未吸附O157:H7基因组DNA之前的生物芯片的吸收光谱进行对照，如图2所示，求得最大吸收波长的位移（记作△λ）。

（4）绘制工作曲线：重复步骤（2）和（3），分别获取不同基因组浓度下的最大吸收波长的位移,以浓度为横坐标,以相应的最大吸收波长处的位移为纵坐标,绘制工作曲线(如图3所示)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：包括以下步骤：

（2）金纳米棒在玻璃基质上的固定：包括以下三个步骤：

2.（3）核酸探针的固定：将步骤（2）中修饰有金纳米棒的玻璃基质浸入末端修饰有巯基的核酸探针溶液中，静置反应6-12小时；

根据权利要求1所述的快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：所述的步骤（2）中所述的玻璃基质包括各种成份及形状的透明玻璃。

3.根据权利要求1所述的快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：所述的步骤（2）b中3-氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液的质量分数为3%－8%。

4.根据权利要求1所述的快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：所述的步骤（2）c中聚苯乙烯磺酸钠水溶液的浓度为15-25 mg/mL。

5.根据权利要求1所述的快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：所述的步骤（2）d中使用的金纳米棒溶液中含有80-100 mM的NaCl。

6.根据权利要求1所述的快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：所述的步骤（2）中所述的核酸探针的序列为：TGG AAT TGA GCA GCG TTGG。

7.根据权利要求1所述的快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生物传感芯片，其特征在于：所述步骤（3）中所述的核酸探针浓度为5 mM, 溶解于0.1 M， pH＝7.4 的Tris-HCl缓冲液中。