CN108120708A - 一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法。主要通过无机盐试剂对金纳米粒子溶胶进行特异性优化，使金纳米粒子溶胶与样品中金黄色葡萄球菌相互作用，从而提高拉曼光谱的信号强度和和可重复性，以比较简便的方法实现了在短时间内测定金黄色葡萄球菌的目的。同时选用便携式拉曼光谱仪，可实现现场的快速致病菌测定，避免的实验室大型仪器的复杂操作及检测时间。

Description

一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域
本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术，利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法，属于食源性致病菌分析检测领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种球形革兰氏阳性菌，为常见的食源性致病菌，可引起许多严重感染，在环境以及人类的皮肤上广泛分布。通常情况下金黄色葡萄球菌不致病，但受伤的皮肤感染金葡菌后会引起严重的感染，症状为胃痛、腹泻、呕吐和发热，引起如腹膜炎、膀胱炎、胆囊炎等疾病，甚至疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。据世界卫生组织估计，每年全球有数十亿人感染上食源性疾病，如今，食源性疾病使全球食品安全面临巨大威胁。我国GB 19295-2011《食品安全国家标准规定速冻米面制品》中金黄色葡萄球菌的最大限量为1000CFU/g。
多年来科研工作者一直在研究快速、准确的方法来检测食品中的致病菌，目前，微生物的检测方法主要有：传统的增菌、菌落分离和血清学鉴别、生化鉴定方法。这些方法可准确对致病菌进行鉴定，但缺点是必须进行预增菌，从取样到定性鉴别、定量微生物，至少需要一天以上的时间。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法是以核酸分子为探针高灵敏的检测技术，此技术虽然在数小时内可以得到检测结果，但是需要熟练的专业操作能力以及较长的前期准备，而且临床检测结果假阳性率偏高。酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是一种将细菌表面抗原与抗体特异性反应和酶的高效催化作用原理有机结合的免疫学分析方法，该方法已经比较成熟，具有特异性强，灵敏度高，结果直观易观察的优点，但是抗体制备过程复杂、不稳定且价格昂贵。
表面增强拉曼（SERS）技术具有特异性高、选择性强、灵敏度高的优点，可以从分子水平上鉴别物质，因此被广泛用于食品检测，免疫学，环境分析，生物化学，珠宝鉴定等多个方面，随着其发展也逐渐渗透到分子生物学和微生物学领域。和其他微生物检测技术不同的是SERS检测前处理简单、水干扰小，可以省去微生物技术中的预增菌、提取和纯化步骤，节省大量的时间，通过拉曼光谱仪检测出分子的特征拉曼位移，能够尽可能多的从生物样品中获取其化学信息，提供细菌的指纹图谱，从而根据它们的拉曼光谱对细菌种类进行鉴别。但是目前技术中，由于难以控制纳米颗粒与细菌的结合，因此在不同的条件下，测得的拉曼光谱有一定的差异，病原菌信号具有重复性差的问题，而且大型拉曼光谱仪不适合突发性致病菌事件的快速检测响应。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中方法的不足，提供一种便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的拉曼增强光谱方法，通过向金纳米粒子溶胶中加入调控细菌与纳米颗粒相结合的无机盐试剂，从而提高光谱的信号强度和和可重复性。该方法灵敏度高，特异性强，检测速度快，成本低廉，克服了鉴别细菌时谱图重复性差的问题。
本发明通过如下步骤实现。
（1）选择检测金黄色葡萄球菌：使用BHI培养基中培养震荡冷冻的金黄色葡萄球菌，37oC条件下200 r/min培养10小时，取10 mL细菌培养液，用去离子水在5000 r/min下洗涤2 min、洗涤两次，然后将细菌贮存在4oC冰箱中等待检测。
（2）配制含无机阴离子浓度为0.05~2 mol/L的无机阴离子溶液。
（3）将透明载玻片用王水（浓盐酸：浓硝酸v/v=3:1）浸泡清洗，去除表面杂质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用。
（4）在5~20 s的时间内迅速按顺序在透明载玻片上滴加1~2体积步骤（1）中处理得到的待测金黄色葡萄球菌、1~4体积金纳米粒子溶胶和1体积步骤（2）中无机阴离子溶液，混合均匀并室温下干燥。
（5）设定便携式拉曼光谱仪条件，在200~500 mW能量激光和1~20秒积分时间条件下，焦点对准干燥后步骤（4）中样品进行测定，得到金黄色葡萄球菌样品拉曼谱图。
其中，步骤（2）所述的试剂可以是KBr、NaNO3、NaCl、KCl溶液中的一种，或者其中几种的组合。
另外，步骤（5）中所述的便携式拉曼光谱仪其激发波长785nm，光谱扫描范围150~3500cm-1。
最后，通过观察所述金黄色葡萄球菌样品拉曼谱图545 cm-1、729 cm-1、1328 cm-1、1578 cm-1位置是否出现信噪比大于3的特征峰，若出现则说明提取液中含有金黄色葡萄球菌。
本发明的有益效果：通过对金纳米粒子溶胶的处理，以及无机阴离子和待测溶液添加的特殊组合顺序与特殊比例，以比较简便的方法实现了在短时间内测定金黄色葡萄球菌的目的。
选用便携式拉曼光谱仪，通过仪器条件的优化选择及样品与焦点的准确匹配，可实现突发事件现场的快速致病菌测定，避免了实验室大型仪器的复杂操作及检测时间。
附图说明
图1 是金黄色葡萄球菌的表面增强拉曼图谱，激光波长为785 nm，能量为300 mW，积分时间5 s。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：金黄色葡萄球菌悬液拉曼光谱检测。具体如下。
（1）待测病菌样品制备：使用BHI培养基中培养震荡冷冻的金黄色葡萄球菌，37oC条件下200 r/min培养10小时，取10 mL细菌培养液，用去离子水在5000 r/min下洗涤2min、洗涤两次，用无菌水悬浮细胞至浓度为105CFU/mL，作为待测细菌样品。
（2）配制含Br-1离子浓度为0.1 mol/L的KBr溶液。
（3）将透明载玻片用王水（浓盐酸：浓硝酸 v/v=3:1）浸泡清洗，去除表面杂质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用。在10 s的时间内迅速按顺序在透明载玻片上滴加10 μL步骤（1）中处理得到的金黄色葡萄球菌悬液、40 μL金纳米粒子溶胶和10μL步骤（2）中KBr溶液，混合均匀并室温下干燥。
（4）病菌拉曼光谱检测：设定便携式拉曼光谱仪条件，在300 mW能量激光和5秒积分时间条件下，焦点对准干燥后步骤（3）中样品进行测定，得到金黄色葡萄球菌菌悬液拉曼谱图。
实施例2：牛奶中金黄色葡萄球菌拉曼光谱原位检测，具体如下。
（1）牛奶样品的前处理：取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品10g，取37oC条件下BHI培养基中培养震荡冷冻10小时的金黄色葡萄球菌，用无菌水稀释成108CFU/mL菌悬液。将菌悬液用消毒后注射器接种至牛奶样品中，置于无菌培养皿28oC培养箱中保湿培养24h。接种金黄色葡萄球菌24h后，取1~5 mL牛奶细菌液于离心管中，4oC5000r/min洗涤2 min，去除上清液加入去离子水再次离心洗涤，得到待测液。
（2）配制含Cl-1离子为0.05 mol/L，Br-1离子浓度为0.1 mol/L的KBr、KCl混合溶液。
（3）将透明载玻片用王水（浓盐酸：浓硝酸 v/v=3:1）浸泡清洗，去除表面杂质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用。在10 s的时间内迅速按顺序在透明载玻片上滴加10 μL步骤（1）中处理得到的待测液、40 μL金纳米粒子溶胶和10μL步骤（2）中KBr、KCl混合溶液，混合均匀并室温下干燥。
（4）病菌拉曼光谱检测：设定便携式拉曼光谱仪条件，在300 mW能量激光和10秒积分时间条件下，焦点对准干燥后步骤（3）中样品进行测定，得到牛奶中金黄色葡萄球菌拉曼谱图。
实施例3：米饭中金黄色葡萄球菌拉曼光谱原位检测，具体如下。
（1）米饭样品的前处理：取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品10 g，取37oC条件下BHI培养基中培养震荡冷冻10小时的金黄色葡萄球菌，用无菌水稀释成108CFU/mL菌悬液。将菌悬液用消毒后注射器接种至米饭样品中，置于无菌培养皿28oC培养箱中保湿培养24h。接种金黄色葡萄球菌24h后，用无菌镊子取米饭腐败部分，置于2ml无菌水中，捣碎米饭，使细菌溢出至水中。静置片刻后，用无菌纱布过滤，先用3层纱布滤掉组织碎片，再用2层纱布再次过滤。取滤出液于离心管中，在4oC、5000 r/min条件下洗涤2 min，去除上清液加入去离子水再次离心洗涤，得到待测液。
（2）配制含Cl-1离子为0.05 mol/L，Br-1离子浓度为0.1 mol/L的KBr、KCl混合溶液。
（3）将透明载玻片用王水（浓盐酸：浓硝酸 v/v=3:1）浸泡清洗，去除表面杂质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用。在10 s的时间内迅速按顺序在透明载玻片上滴加10 μL步骤（1）中处理得到的待测液、40 μL金纳米粒子溶胶和10μL步骤（2）中KBr、KCl混合溶液，混合均匀并室温下干燥。
（4）病菌拉曼光谱检测：设定便携式拉曼光谱仪条件，在300 mW能量激光和10秒积分时间条件下，焦点对准干燥后步骤（3）中样品进行测定，得到米饭中金黄色葡萄球菌拉曼谱图。
以上实施例均说明了本发明的使用方法，但本发明所保护的内容不仅限于实施例中的用法，本领域技术人员根据本发明进行的属自然延伸性质的改进也属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：
（1）选择检测金黄色葡萄球菌：使用BHI培养基中培养震荡冷冻的金黄色葡萄球菌，37oC条件下200 r/min培养10小时，取10 mL细菌培养液，用去离子水在5000 r/min下洗涤2min、洗涤两次，然后将得到的金黄色葡萄球菌贮存在4oC冰箱中等待检测；
（2）配制含无机阴离子浓度为0.05~2 mol/L的无机阴离子溶液；
（3）将透明载玻片用王水浸泡清洗，去除表面杂质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用；
（4）在5~20 s的时间内迅速按顺序在所述透明载玻片上滴加1~2体积步骤（1）中处理得到的待测金黄色葡萄球菌、1~4体积金纳米粒子溶胶和1体积所述无机阴离子溶液，混合均匀并室温下干燥；
（5）设定便携式拉曼光谱仪条件，在200~500 mW能量激光和1~20秒积分时间条件下，焦点对准干燥后步骤（4）中样品进行测定，得到金黄色葡萄球菌样品拉曼谱图，根据特征峰信息可以定性判断样品液中是否含有金黄色葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述无机阴离子溶液可以是KBr、NaNO3、NaCl、KCl溶液中的一种、或者其中几种的组合。
3.根据权利要求1所述的一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述便携式拉曼光谱仪激发波长785nm、光谱扫描范围150~3500cm-1。
4.根据权利要求1所述的一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，通过观察所述金黄色葡萄球菌样品拉曼谱图545 cm-1、729 cm-1、1328 cm-1、1578 cm-1位置是否出现信噪比大于3的特征峰，若出现则说明提取液中含有金黄色葡萄球菌。
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