KR20110086649A - 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법 - Google Patents

단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유리 기판 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생 병원성균 검출에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 APTES와 글루타알데하이드 각각의 화학물질에 의한 유리기판 표면처리, 수생병원성 균인 Migula, E. coli O157:H7. Salmonella enterica, 그리고 Staphylococcus aureus와 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 유리기판 위에의 고정에 의한 유리기판 단백질 칩 제작, 살아있는 박테리아인 Migula, E. coli O157:H7. Salmonella enterica, 그리고 Staphylococcus aureus의 항원-항체반응에 의한 유리기판 단백질 칩에의 결합, 그리고 상기 방법으로 제작된 칩에 Resazurin 용액 처리에 의한 색 변화를 토대로 살아있는 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 항체가 고정화된 유리기판 단백질 칩에 살아있는 박테리아를 결합시켜서 resazurin 반응을 실시함으로써, 박테리아 내의 특정 성분을 이용한 여러 분석방법에 비해서 과정이 복잡하지 않고, 특정 박테리아만을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 시각적으로 관찰가능하기 때문에 기기장비 비용 절감 등 생산성과 경제성에 향상된 효과를 기대할 수 있다.

Description

단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법{Spectroscopy of aquatic pathogenic bacteria by using protein chip}
본 발명은 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 수생병원성균인 Migula, E. coli O157:H7. Salmonella enterica, Staphylococcus aureus를 특이적으로 결합시킬 수 있는 항체가 부착되어있는 소형화된 단백질 칩을 이용하여 시각적 검출로 살아있는 수생병원성 박테리아를 감지할 수 있는 검출법 개발과 관련된 것이다.
일반적으로 E. coli는 발열, 구토, 설사와 복통 등을 유발하나, 다른 종류는 요로 감염, 호흡기 질병, 폐렴 등을 일으키기도 한다. E. coli 중 Migula는 수질 오염의 지표로 사용되기도 하는데, 음용수 중의 E. coli는 그 자체로서 해가 되지는 않지만 물이 오염되었음을 나타낸다. E. coli 중에서 E. coli O157:H7은 병원성 대장균으로 적혈구와 신장에 손상을 일으키는데, 베로독소(verotoxin)를 생성하여 대장점막에 궤양을 유발하여 조직을 짓무르게 하고 출혈을 유발시키는데, 병원에서 치료를 받지 않는 경우 사망할 수도 있다. 살모넬라(Salmonella)는 물, 토양, 동물의 분변, 날고기, 가금류, 해산물 등에 존재하는데 하수 속의 살모넬라는 물에서도 수 주간 생존할 수 있다. 살모넬라에 의한 식중독도 다른 식중독의 경우와 마찬가지로 발병에 필요한 균량은 환자의 건강상태와 관련된다. 환자의 나이, 건강상태, 섭취량 등에 의해 증상은 다르겠지만 일반적으로 메슥거림, 구토, 설사, 복통, 발열에 의한 전신권태 등에 증상이 나타난다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 물, 하수, 식품, 공기 등에 널리 존재하는데, 대부분 급성으로 감염 시 대개 구토, 구역질, 메스꺼움, 설사, 복통, 쇠약 등의 증상이 공통적으로 발생한다. 개인별 민감도, 오염된 식품의 섭취량, 섭취한 식품 중의 독소량, 섭취한 사람의 건강상태에 따라 증상이 달라질 수 있는데, 사람에 따라 심한 경우 두통, 근육통, 일시적인 혈압 및 맥박 변화가 나타나기도 한다.
이러한 수생 병원성 박테리아는 인간들이 직접적으로 수영 같은 수중활동을 통해서 오염된 지역의 병원성 박테리아에 직접적으로 노출될 수 있으나 이러한 직접적인 노출보다는 주로 수생 병원성 박테리아에 오염된 생선, 농작물 또는 축산물 등의 음식물의 섭취를 통해서 수생 병원성 박테리아가 체내에 들어오게 된다. 수생 병원성 박테리아는 체내에서 피부, 호흡 및 순환기 계통에 각종 질병을 유발할 수 있어서 질병 유발과 관련된 수생 병원성 박테리아의 세균부하(Bacteria load)를 환경 현장에서 직접 검지할 수 있는 것이 중요한 이슈다. 이러한 이유로 수생 병원성 박테리아를 검출하는 방법들이 개발되어왔다.
현재 수생 병원성 박테리아를 검출하는 전통적이고도 확립된 기존 방법으로는 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR), 세포 배양 및 콜로니 계수 및 면역학적 방법들이 존재하는데 각각의 방법은 DNA를 분석하거나 박테리아 수를 세거나 항원-항체반응을 이용하는 것이다. 중합효소 연쇄반응은 특정 박테리아의 유전자 서열을 감지하여 증폭시키는 매우 민감한 방법으로 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR; Rodr´ıyguez-L´azaro et al., 2005), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR; Jofr´e et al., 2005), 및 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase PCR, RT-PCR; Deisingh, 2004)의 서로 다른 PCR 방법들이 존재한다. PCR은 일반적으로 검출하는 데까지 대략 5 내지 24 시간이 소모되기 때문에 세포를 배양하거나 평판(plating)하는 다른 기술에 비해 시간 절약적인 방법으로 여겨지고 있으나, 박테리아 세포 분해를 거쳐 유전자를 추출하는 전처리 과정이 필요하고 살아있는 박테리아 자체를 분석할 수 없을 뿐만 아니라 DNA는 모든 세포 내에 존재하기 때문에 세포 생존 여부를 판단할 수는 없다. 세포 배양 및 콜로니 계수의 방법은 가장 오래된 검출법으로써 정확하게 박테리아 증식을 통해 민감하게 미량의 박테리아를 검지할 수 있으나 서로 다른 박테리아를 검출하기 위해서는 다른 선택배지를 사용해야 하고 PCR보다도 더 시간소모적인 방법으로 신속성 및 현장화를 담보하기 어렵다. 일반적인 면역학적 방법은 항원 항체 반응을 통해 박테리아 표면에 존재하는 리셉터를 인식하는 항체를 개발하여 특정 박테리아를 선택적으로 검출할 수 있는 강력한 방법이나 일반적 면역학을 실제 하천이나 해수에서 현장화시켜 사용하기 위해서는 추가의 다양한 시스템 구축을 위한 시간적 기술적 비용적 소모가 필수불가결하다.
최근에는 광학적 또는 전기화학적 바이오센서를 이용한 박테리아 검출법이 개발되고 있는데, 이 중에서 광학적 바이오센서 중 형광 검출법(Fluorescence detection)와 표면 플라즈몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR)이 단백질을 이용한 검출법이다. 형광 검출법은 빛을 흡수하자마자(<10 ns) 발광하고 PCR, ELISA와 같은 기술과 혼합해서 사용할 수 있어 하나 이상의 미생물을 동시에 검출하는데 좋은 방법이나 검출시간이 30분 이내로 짧음에도 불구하고 좋은 결과를 얻기 위해서 밤새도록 세포 배양을 해야 하고, 고가의 레이저 광원을 이용해야 할 뿐만 아니라 수생 현장에서 사용할 수 없다는 단점을 가지고 있다(US 5,891,394, US 5,858,697, US 5,763,203, US 5,751,839, US 5,663,057). SPR은 단백질-단백질, DNA-RNA, 탄수화물-단백질 상호작용을 칩 표면의 굴절률 변화에 의해서 측정하는 방법으로 다른 센서들에 비해 단백질을 형광물질로 표지할 필요가 없고 실시간으로 분석 가능하다는 장점을 가지고 있으나, 분석을 위해서는 고가의 장비가 필요하고 골드 칩만을 이용해야하며 비특이적인 단백질의 결합을 막기 위한 순도 유지를 위하여 복잡한 정제 공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 단점도 있다 (Hentz etal., Anal. Chem., 68:3939, 1996; Kukar et al., Anal. Biochem., 306:50, 2002; Brockman, J.M. et al., JACS, 121:8044, 1999; Nelson, B.P. et al., Anal. Chem., 73:1, 2001; Jordan, C.E. et al., Anal. Chem., 69:4939, 1997; Goodrich, T.T. et al., JACS, 126:4086, 2004). 이에 더하여 시스템의 이동성이 없다.
생존하는 박테리아를 검출하는 방법에는 다른 것들도 존재한다. WO/2009/095826와 US 7,399,608에서는 병원성 박테리아 검출을 위한 광학적 표시기를 개시한다. 임상적인 테스트 에세이 도안은 바이러스 감염에 의해 분화된 박테리아에 색 표시기를 주입하여 색 변화를 관찰할 수 있게 제작되었는데, 단점은 박테리아는 매우 작기 때문에 색 박테리아 내부의 색 변화를 관찰하기 위해서는 고가의 매우 정밀한 장비가 필요하고 그로 인하여 현장에서 실용화시킬 수 없다는 것이다. WO/2009/112702에서는 배지에 존재하는 박테리아를 정량적으로 검출하기 위하여 β2GPI 단백질에 붙은 마이크로비드를 개시한다. 마이크로 비드에 붙어있는 β2GPI 단백질이 박테리아에 붙어서 정량적인 검출을 가능하게 해 주는데, 이 시스템은 OD600을 측정하기 때문에 고가의 장비를 이용해야 하고 적정 마이크로비드를 선택해야 한다.
이와 같이 현존하는 검사법의 주요 단점은 결과를 얻는데 고가의 기기가 필요하고, 시스템의 이동성이 없다는 점이다. 박테리아에 의한 수생환경 오염은 질병을 초래하기 때문에 현장에서 미생물의 신속한 검출이 필수적인데, 현재까지의 선행기술은 박테리아를 시간절약적이고 민감하고 저렴하면서 낮은 미생물 농도에서도 신뢰할만한 결과를 제공하지 못하였다.
이에 본 발명자들은 유리 기판의 3-아미노프로필-트리에톡시실란(APTES)과 글루타알데하이드 처리에 의해 항체를 고정시키고, 항원-항체 결합반응을 이용하여 특정 박테리아와 결합하는 항체가 고정된 유리 기판 단백질 칩을 제작하여 특정 박테리아를 안정적으로 고정시키고 선적으로 검출할 수 있게 고안하였다.
본 발명자들은 또한 레사주린의 환원반응을 이용한 검출법을 이용하여 생존하는 박테리아 검출을 시각적으로 확인함으로써 시간절약적이면서 낮은 농도에서 신뢰도 높은 결과를 제공하고 고가의 기기가 필요하지 않으면서 이동성이 있는 시스템을 고안하게 되었다.
근래에는 현장에서 수생 병원성 박테리아를 검출하고자 하는 노력의 일환으로 적합한 소형화된 바이오센서 바이오칩을 구축하고 있으며 주로 전기화학적 검출 및 광학적 검출에 기초한 방법들이 개발되고 있다. 전기화학적 검출 방법에 기초한 바이오센서 또는 칩의 경우는 소형화에 적합한 방법이나 광학적 검출에 비해 검출 감도가 낮다. 광학적 검출에 기초한 바이오센서로는 Surface plasmon resonance (SPR)에 기초한 방법이 주류를 이루며 단백질-단백질 또는 항원-항체(단백질) 반응에 기초하여 특히 병원성 박테리아를 검출하는 시도를 이루고 있으나 고가의 분석 장비를 이용해야 한다는 단점을 가지고 있다. 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제들을 해결하기 위하여 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유리기판에 2% 3-아미노프로필-트리에톡시실란(APTES)을 115 ℃에서 처리하는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 얻은 유리기판에 10% 글루타알데하이드를 처리하여 표면에 생체 물질이 결합할 수 있는 유리 기판 단백질 칩을 제조하는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 얻은 유리 기판 단백질 칩에 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 고정시키는 단계(단계 3); 상기 단계 3에서 얻은 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합된 유리 기판 단백질 칩에 생체물질을 고정시키는 단계(단계 4); 및 상기 단계 4에서 얻은 생체물질이 고정화된 유리 기판 단백질 칩에 레사주린(resazurin) 용액을 처리하는 단계(단계 5)를 포함하는 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법을 제공한다
본 발명에 따른 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법은 유리 기판을 사용하기 때문에 일반적으로 SPR에 사용되는 금 박막 단백질 칩에 비해서 비용을 절감할 수 있으며, 유리 기판 위에 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 부착되어있기 때문에 특정 생체물질을 검출할 수 있으며, 살아있는 세포를 그대로 이용하기 때문에 과정이 복잡하지 않고, 수계 현장에서 얻은 시료를 그대로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 레사주린을 이용해서 살아있는 세포에 의한 색 변화를 눈으로 쉽게 관찰할 수 있기 때문에 복잡하고 고가의 기기장비가 필요하지 않아서 비용 절감에 기여할 수 있다.
도 1은 유리기판 단백질 칩에서의 레사주린의 색 변화에 의한 박테리아 검출 시스템 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 Migula를 유리 기판 단백질 칩에 항원-항체반응으로 결합시킨 다음 레사주린의 색 변화를 나타낸 결과(좌)와 분광학적 신호변화를 나타낸 그래프(우)이다.
도 3은 본 발명에서 E. coli O157:H7를 유리 기판 단백질 칩에 항원-항체반응으로 결합시킨 다음 레사주린의 색 변화를 나타낸 결과(좌)와 분광학적 신호변화를 나타낸 그래프(우)이다.
도 4는 본 발명에서 Salmonella enterica를 유리 기판 단백질 칩에 항원-항체반응으로 결합시킨 다음 레사주린의 색 변화를 나타낸 결과(좌)와 분광학적 신호변화를 나타낸 그래프(우)이다.
도 5는 본 발명에서 Staphylococcus aureus를 유리 기판 단백질 칩에 항원-항체반응으로 결합시킨 다음 레사주린의 색 변화를 나타낸 결과(좌)와 분광학적 신호변화를 나타낸 그래프(우)이다.
본 발명은 유리기판에 2% 3-아미노프로필-트리에톡시실란(APTES)을 115 ℃에서 처리하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 유리기판에 10% 글루타알데하이드를 처리하여 표면에 생체 물질이 결합할 수 있는 유리 기판 단백질 칩을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 얻은 유리 기판 단백질 칩에 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 고정시키는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 얻은 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합된 유리 기판 단백질 칩에 생체물질을 고정시키는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4에서 얻은 생체물질이 고정화된 유리 기판 단백질 칩에 레사주린(resazurin) 용액을 처리하는 단계(단계 5)를 포함하는 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법을 제공한다.
이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 상기 단계 1은 유리기판에 2% 3-아미노프로필-트리에톡시실란(APTES)을 처리하는 단계로서, 유리 표면에 1차 아민기(primary amine group)기를 형성할 수 있다. 상기 단계 1은 115 ℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 16 내지 24 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.
다음으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 유리기판에 10% 글루타알데하이드를 처리하여 표면에 생체 물질이 결합할 수 있는 유리 기판 단백질 칩을 제조하는 단계이다.
상기 단계 1에서 표면에 1차 아민기가 형성된 유리기판에 10% 글루타알데하이드를 처리함으로써 아민기를 변형시켜, 유리 표면에 생체 물질과 결합할 수 있는 환경을 만들 수 있다.
상기 유리기판 단백질 칩은 종래 SRP을 이용한 단백질 칩에 비에 비용을 절감할 수 있는 장점을 가진다. 종래의 SPR을 이용한 단백질 칩은 금 박막 단백질 칩을 이용한다. 금 박막 단백질 칩은 고가의 기기를 이용한 공정을 통해 제조할 수 있으므로 제조비용이 높을 뿐만 아니라 상업화 과정에서의 단가가 높아지는 문제점을 가지고 있다. 이에 비해, 본 발명에 따른 단백질 칩은 저렴한 가격의 유리를 사용할 뿐만 아니라, 손쉽게 구할 수 있는 화학물질인 3-아미노프로필-트리에톡시실란(APTES)과 글루타알데하이드를 이용하므로 종래의 금 박막 단백질 칩에 비해 비용을 절감할 수 있어 수생병원성균의 검출비용을 줄일 수 있다.
다음으로, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 유리 기판 단백질 칩에 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 고정시키는 단계이다.
상기 생체물질로는 항원, 단백질, 바이오틴이 융합된 DNA 등을 사용할 수 있으며, 이 중에서 수생병원성균을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 수생병원성균은 실험실에서 연구를 위해서 배양하는 비활성화 박테리아, 활성화 박테리아, 수계 환경에 존재하고 있어서 인간에게 질병을 유발시킬 수 있는 살아있는 박테리아(활성화 단백질) 등인 것이 바람직하며, Migula, E.coli O157:H7, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus 등인 것이 더욱 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생체물질로 살아있는 박테리아를 그대로 이용함으로써 검출과정이 복잡하지 않고 수계 현장에서 얻은 시료를 그대로 사용할 수 있는 장점을 가진다.
상기 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 특정한 생체물질과만 결합할 수 있는 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 예를 들면, Migula, E.coli O157:H7, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus와 같은 각각의 박테리아에 결합할 수 있는 단일클론항체인 것이 바람직하다. 상기 항체는 실험용으로 비활성화시킨 박테리아뿐만 아니라, 살아있는 박테리아와 결합이 가능하기 때문에 상업적으로 판매되고 있는 박테리아와 결합할 수 있는 특징을 가지고 있다.
상기 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 각각의 유리 단백질 칩에 하나씩 고정화시키는 것이 바람직하며, 특정한 생체물질과만 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면 단일클론항체를 사용하는 것이 바람직하다.
다음으로, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합된 유리 기판 단백질 칩에 생체물질을 고정시키는 단계이다.
상기 생체물질이 항원-항체 반응을 통하여 생체물질과 특이적으로 결합하는 물질과 결합함으로써, 유리 기판 단백질 칩에 생체물질을 고정시킬 수 있다.
다음으로, 상기 단계 5는 상기 단계 4에서 얻은 생체물질이 고정화된 유리 기판 단백질 칩에 박테리아 배양 배지에 용해시킨 레사주린(resazurin) 용액을 처리하는 단계이다.
상기 레사주린(resazurin)은 파란색 물질로서, 살아있는 세포 또는 박테리아내로 들어가서 세포 또는 박테리아의 호흡작용에 의해서 미토콘드리아에서 레조루핀(resorufin)으로 환원되어 붉은 색을 나타내게 된다. 따라서, 레사주린에서 레조루핀으로의 색 변화를 시각적으로 관찰함으로써 수생병원성균을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법은 시료에 적은 양의 생체물질이 존재하는 경우에도 검출이 가능하다. 시료에 여러가지 박테리아가 혼재하는 경우에도, 각각의 유리기판 단백질 칩 위에는 하나의 생체물질에만 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 예를 들면 단일클론항체가 고정되어 있기 때문에 하나의 박테리아만 결합될 수 있다. 따라서, 박테리아가 결합한 후 시료를 제거하게 되면 유리기판 단백질 칩 위에는 하나의 박테리아만 남아있게 된다. 이후, 박테리아 배양 배지에 레사주린을 용해시킨 용액을 처리하게 되면 박테리아가 배지에 존재하는 영양분을 섭취해서 증식하기 시작한다. 따라서, 적은 수의 박테리아가 시간이 지나면서 대수기까지 지속적으로 증가하기 때문에 적은 양의 박테리아를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 종래의 방법에 비해 수계 내에 존재하는 적은 양의 수생병원성균을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 각각의 유리기판 단백질 칩 위에는 하나의 생체물질에만 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 예를 들면 하나의 항원에 대해서만 결합할 수 있는 단일클론항체가 고정되어 있다. 따라서 수많은 종의 병원성균이 시료 안에 존재하는 경우에도, 유리기판 단백질 칩 위에 고정된 물질과 특이적으로 결합가능한 병원성균이 존재하지 않는 경우에는 레사주린을 처리한 후, 병원성균이 배양될 수 있는 최적상태로 환경을 조성하는 경우에도 레사주린의 색의 변화가 일어나지 않는다.
나아가, 본 발명에 따른 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법은 레사주린의 레조루핀으로의 색 변화를 시각적으로 관찰함으로써 DNA 칩, 단백질 칩, 펩티드 칩 등의 생체 물질 결합 반응을 분석하는데 필요한 스캐닝 장치를 사용하지 않아 종래의 형광학적 검출법 또는 색 표시기가 주입된 박테리아 검출법에 비해 비용을 절감할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출법은 레사주린을 이용함으로써 분석시간을 절약할 수 있고, 민감도가 뛰어나므로 낮은 농도에서 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 이동성을 높일 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 결론적으로 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
특히, 하기 실시예에서는 유리 기판 단백질 칩에 고정화시키는 박테리아의 종류를 Migula, E.coli O157:H7. Salmonella enterica, 그리고 Staphylococcus aureus 4가지만을 기술하였으나, 단일 클론 항체가 시판되고 있는 박테리아라면 특별히 제한되지 않는다는 것과 실험실에서 배양하는 박테리아뿐만 아니라 수계에 생존하는 모든 박테리아의 검출에도 적용할 수 있음을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
< 실시예 1> 수생병원성균의 검출
단계 1 : 3-아미노프로필- 트리에톡시실란(APTES)의 처리
항원-항체반응을 위한 항체를 단백질 칩에 고정화시키기 위하여 사용한 유리 기판 단백질 칩의 표면처리기법은 보고된 실험법(Pal et al., Lab Chip. 8:1332, 2008)을 참고로 하였다. 먼저 유리 기판을 클로로포름 용액에 넣고 초음파를 이용하여 깨끗하게 세척하였다. 동일한 방법으로 유리 기판을 이소프로필 알코올, 메탄올, 그리고 3차 증류수 용액에 넣고 순차적으로 세척하였다. 씻은 유리기판에 존재하는 액체는 질소가스를 이용해서 제거시켜주고 다음 조건에서 silanization을 실시하였다, 2% (v/v)의 APTES 용액을 톨루엔에 용해시켜서 만든 다음 깨끗한 유리기판을 넣고 밤새도록 115℃에서 열반응을 시켰다. silanization이 끝난 유리기판은 톨루엔을 이용하여 세 번 세척하였다.
단계 2 : 글루타알데하이드의 처리
상기 단계 1에서 APTES 처리에 의해 수득된 silanization된 유리기판을 아미노기가 있는 10% (v/v) 글루타알데하이드 용액에 넣어서 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때 10% 글루타알데하이드 용액은 10 mM 농도의 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.0)에 글루타알데하이드를 용해시켜서 제조하였다. 1시간 뒤, 인산칼륨 완충용액으로 세 번 세척하여 반응하지 않은 글루타알데하이드를 제거하였다. 반응을 끝마치게 되면 표면에 1차 아민기가 존재하게 된다.
단계 3 : 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질의 고정
anti-Migula, anti-E. coli O157:H7, anti-Salmonella enterica, 그리고 anti- Staphylococcus aureus 단일 클론 항체를 상기 단계 2에서 제작된 유리기판 단백질 칩과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 세척버퍼(10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0)로 상온에서 세척하였다. 세척된 유리기판 단백질 칩은 질소가스를 이용하여 물기를 제거하였다.
단계 4 : 생체물질의 고정
상기 단계 3에서 얻은 각각의 항체가 고정화되어있는 유리 기판 단백질 칩에 항원인 Migula, E. coli O157:H7, Salmonella enterica, 그리고 Staphylococcus aureus 용액 (103CFU/mL in PBS)을 각각 1 시간 동안 상온에서 반응을 시킴으로써 항원-항체반응에 의하여 항원이 결합되도록 처리하였다. 이때 Migula, E. coli O157:H7, Salmonella enterica, 그리고 Staphylococcus aureus의 박테리아는 모두 Progro media에서 16 시간 동안 배양한 살아있는 박테리아를 사용하였고 박테리아 농도는 OD값과 비교해서 측정한 후 PBS로 103CFU/mL까지 희석하였다.
단계 5 : 레사주린 ( resazurin ) 용액의 처리
상기 단계 4를 통해서 획득된 항원-항체반응에 의한 수생병원성 박테리아가 고정화되어있는 단백질 칩에 레사주린 용액을 이용하여 살아있는 수생병원성 박테리아를 검출할 수 있다. 즉, 레사주린을 Progro medium에 용해시켜서 1×10-5 또는 2×10-5M 농도의 용액을 제조한 뒤, 수생병원성 박테리아가 고정되어있는 유리기판 단백질 칩에 용액을 넣고 37 ℃에서 배양시키면서 시간별로 관찰하여 박테리아 유무를 검출할 수 있었다. 상기 반응은 눈으로 확인하였다.

Claims (5)

  1. 유리기판에 3-아미노프로필-트리에톡시실란(APTES)을 처리하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 얻은 유리기판에 글루타알데하이드를 처리하여 표면에 생체 물질이 결합할 수 있는 유리 기판 단백질 칩을 제조하는 단계(단계 2);
    상기 단계 2에서 얻은 유리 기판 단백질 칩에 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 고정시키는 단계(단계 3);
    상기 단계 3에서 얻은 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합된 유리 기판 단백질 칩에 생체물질을 고정시키는 단계(단계 4); 및
    상기 단계 4에서 얻은 생체물질이 고정화된 유리 기판 단백질 칩에 레사주린(resazurin) 용액을 처리하는 단계(단계 5)를 포함하는 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 생체 물질은 항원, 단백질, 바이오틴이 융합된 DNA 또는 수생병원성균인 것을 특징으로 하는 유리기판 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 3의 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 Migula, E.coli O157:H7, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아에 결합할 수 있는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 유리기판 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 4의 생체물질 고정은 항원-항체 반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 유리기판 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수생병원성균의 검출은 단계 5의 레사주린(resazurin) 용액에서 레조루핀으로의 색 변화를 시각적으로 관찰함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 유리기판 단백질 칩을 이용한 살아있는 수생병원성균의 분광학적 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103409517A (zh) * 2013-07-24 2013-11-27 福建省亚明食品有限公司 快速检测肠出血性大肠杆菌o157:h7的生物传感芯片
CN107177686A (zh) * 2017-06-21 2017-09-19 浙江大学 基于fret技术检测大肠杆菌o157:h7的方法

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