CN101113476B - 一种病原微生物dna检测芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病原微生物的DNA检测芯片，该芯片包括载体和位于载体上的核酸探针，该核酸探针具有用于检测病原微生物目标基因的目标检测探针。其中所述的病原微生物包括但不限于：霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌、李斯特菌。本发明还涉及所述病原微生物DNA检测芯片的制备方法。本发明还提供病原微生物DNA检测芯片在检测病原微生物中的应用。本发明还提供一种病原微生物DNA检测芯片试剂盒。
Description
本发明基于以下受资助的课题：
1、课题一：国家自然科学基金 批准号：30170052《格林-巴利综合征相关空肠弯曲菌的分子生物学研究》2002.01-2004.12：
2、课题二：科技部社会公益项目：《国家进出口食品快速检测方法体系的建立》2003；项目编号：2002DIA50036；
3、课题三：科技部社会公益项目：《食品中病原体及转基因标签的快速检测体系建立》2005；项目编号：2004DIB2J065。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种病原微生物DNA检测芯片及其制备方法和应用。
背景技术
由微生物导致的传染病仍是目前威胁全球人类健康的主要疾病。它的防治与监控在我国面临的一个严重问题。随着我国经济发展越来越快，人员流动越来越频繁，一些传统的监控方法已不能适应我国经济发展的需要。另一方面，我国地域宽广，各地差异很大，这对这类传染病的防治与监控十分不利。而且在广大的农村及偏远地区，这类传染病仍然是人群的主要危险因素之一。传染病的控制主要从发现、诊断、治疗和预防几个方面进行。其中，诊断对于尽早发现、尽早控制传染病非常重要。目前我国对于微生物的诊断主要依靠血清学诊断和微生物的培养。这些诊断方法，从采样、培养到鉴定，往往需要数十小时到几天的时间，在一些偏远地区，花费的时间会更长，特别是要在短时间内完成相关鉴别诊断则更加困难。另一方面，随着我国加入WTO，我国对外贸易发展迅速，各种食品、化妆品的的进出口量迅猛增加。进出口检疫面临巨大压力。以食品为例，一些保质期很短的食品在病原微生物方面的检疫就需要几天的时间，加上运输所需的时间，往往刚刚到货就过了保质期。这大大阻碍了食品的进出口。因此，目前迫切需要有新的技术和设备满足高通量和日益增加的各种基因信息的低成本检测。
DNA芯片技术以其快速、灵敏、高通量的特点可以满足以上需求。DNA芯片技术又叫Microarray技术，是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，其原理是采用探针合成后固定、光导原位合成或显微印刷等方法，将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，能在短时间内快速、准确地获取大量信息。DNA芯片技术具有PCR方法的同样的优点。可以精确地进行目标基因的定性检测。不同之处在于可以在固体表面固定众多个特定的探针。能够在一次单独的分析中筛查、定性样品中的大量的不同种类的基因。此外，DNA芯片技术非常灵活，当有新的基因标识出现时可以在阵列中增加布点，将新的基因序列包括在筛查程序中。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供一种病原微生物DNA检测芯片。
本发明的另一个目的是提供一种本发明的病原微生物DNA检测芯片的制备方法。
本发明的另一个目的是提供本发明的病原微生物DNA检测芯片在检测样品中的病原微生物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种病原微生物DNA检测芯片试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种检测病原微生物的方法。
本发明根据从相关数据库收集和多种途径获取的序列资料自行选择病原微生物，包括霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌、李斯特菌等八种肠道重要致病菌属的特异毒力基因并针对这些基因自行设计引物，并进行退火温度一致性和特异性的筛选。通过这些特异性引物进行的PCR扩增，产物经纯化制备成特异性较高的双链DNA固定探针，对各项指标进行优化后，将固定探针布点在载体上，制备成应用于病原微生物检测的DNA芯片。芯片与多重PCR体系扩增的荧光标记的待测样品杂交，3-6个小时后通过芯片扫描仪进行扫描分析，根据杂交信号直观地判读该样品中所含有的病原微生物的种类、型别、毒力、侵袭力，从而综合判断其致病情况。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种病原微生物DNA检测芯片，该芯片包括载体和位于载体上的核酸探针，该核酸探针为用于检测目标基因的目标检测探针。其中组合-包括16个探针，分别为检测以下目标基因：ompW、o1ag、rtxC、o1391、rfbe(o157)、ipaH、aaf、bfpA、st、toxR、mapA、iroB、rfbG、rfbR、wzy、prf的探针，以用于定性检测以下病原微生物：霍乱弧菌，出血性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌，黏附集聚性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，产毒性大肠杆菌，副溶血弧菌，空肠弯曲菌，沙门菌，志贺菌A、F2A、D群，单增李斯特菌。优选这些探针为本发明的目标检测探针：SEQ ID No.73、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.77、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.74、SEQ ID No.90、SEQ ID No.84、SEQ ID No.94、SEQ ID No.98、SEQ ID No.97、SEQ ID No.99、SEQ ID No.102；优选本发明的组合二包括组合一中的所有探针，还包括用于检测目标基因ct、tl、tdh、trh、lt、vt1、vt2、hlyA、spvC、cdt、yst、hlyO的探针，以进一步鉴定所述病原微生物的产毒情况。在一个优选实施方式中，组合二中除包括组合一中的本发明目标检测探针外，还包括如下本发明目标检测探针：SEQ ID No.69、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.75、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.83、SEQ ID No.96、SEQ ID No.85、SEQ ID No.92、SEQ ID No.101。组合三包括组合一和二中的所有探针，还包括用于检测目标基因eae、ceuE，invA、yad、virF、iap的探针，以进一步鉴定所述病原微生物的侵袭力。在一个优选实施方式中，组合三除包括组合一和二中的所有本发明目标检测探针外，还包括如下本发明目标检测探针：SEQ IDNo.76、SEQ ID No.86、SEQ ID No.95、SEQ ID No.91、SEQ ID No.93、SEQ ID No.100。组合一主要为具种属特异性且与毒力相关的管家基因，单独应用组合一可以对样品中所含有的一种或几种病原菌定性检测，并区分不同的血清群和生物型，组合二多为编码各类菌带有的与致病力强弱密切相关的毒素的基因，与组合一联合应用可以进一步判断所检测的病原菌的毒力强弱，组合三为决定病原侵袭力的毒力因子编码基因，与组合一和组合二联合应用可综合判断该病原侵袭性与毒性致病力的强弱。
本发明的芯片固定探针所检测的基因的中英文名称对照表
| 基因英文名称 | 中文名称(编码蛋白) | 基因英文名称 | 中文名称(编码蛋白) |
| ompW | 外膜蛋白 | aaf/I | 集聚黏附性菌毛 |
| o1ag | 01抗原 | ipaH | 侵袭素 |
| o139ag | 0139抗原 | iroB | 菌毛调节因子 |
| rtxC | 毒素激活子 | invA | 侵袭因子 |
| ct | 霍乱肠毒素 | spvC | 沙门菌质粒毒力基因 |
| toxR | 毒力表达调控子 | mapA | 外膜蛋白A |
| tl | 产热稳定溶血素相关因子 | ceuE | 铁转运因子 |
| tdh | 热稳定直接溶血素 | cdt | 细胞致死毒素 |
| trh | 热稳定间接溶血素 | yad | 耶尔森氏菌黏附素 |
| rfbe o157:H7 | o157:H7抗原 | yst | 耶尔森氏菌热稳定毒素 |
| eaeA | 黏附抹平因子 | virF | 毒力相关因子 |
| hlyA | 溶血素 | rfbR | 志贺菌O抗原 |
| vt1 | vero毒素I | rfbG | 志贺菌O抗原 |
| vt2 | vero毒素II | wzy | O-抗原聚合酶基因 |
| bfpA | 束状菌毛 | iap | P60蛋白 |
| lt | 不耐热肠毒素 | hlyO | 李斯特菌溶血素O |
| st | 耐热肠毒素 | prf | 转录激活调节蛋白 |
在本发明的检测芯片中，为监控杂交反应结果，设有严格的质控。50％的DMSO(二甲基亚砜)点样液做阴性对照，非点样区做空白对照。若杂交后阴性对照点和空白对照点检测无信号，表明正常；若有信号，表明杂交失败。为监控杂交反应中假阴性的出现，特设立阳性对照，该阳性对照探针为一段与目标检测基因无同源性的核苷酸片段，且与所有的固定探针的杂交条件一致，可以和其他探针一同固定在芯片上。在每次杂交检测时，将带有标记的阳性对照片段掺比到待测目标基因中同芯片进行杂交，若杂交后检测有信号，表明正常；若无信号，表明杂交失败。为了监控杂交反应中非特异信号出现，芯片上各矩阵中的不同探针可以互为对照。经已知的样品进行验证表明杂交信号显示的检测结果准确。所述探针在芯片上的布阵没有特别的限制，可以是任意进行布阵。可以将为了不同目的，将组合一单独置于芯片上，或将组合二单独置于芯片上或将组合三单独置于芯片上。但为了检测方便，可以将上述组合一置于芯片上的一个矩阵，将组合二置于一个矩阵，将组合三置于一个矩阵，也可以将检测同种病原微生物，例如霍乱弧菌，出血性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌，黏附集聚性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，产毒性大肠杆菌，副溶血弧菌，空肠弯曲菌，沙门菌，志贺菌A、F2A、D群，单增李斯特菌的探针分别置于同一矩阵。将为监控杂交结果的可靠性，每个探针在芯片上至少重复2个点，例如至少重复3个点，至少4个点，至少5个点，至少6个点，同时兼顾到经济因素和操作方便，优选重复3、4或5个点。在杂交后同一探针的所有点若信号一致，表明正常；若有的有信号，有的无信号则结果不可信。
发明人利用本发明DNA诊断芯片检测了腹泻粪便样品，34份标本中24份检出阳性信号，其中5份提示可能存在2种以上腹泻病原的混合感染，为进一步验证芯片检测结果的可靠性，对部分呈现阳性信号的样品用该探针对应的引物扩增，对于未扩出的基因，在内侧设计嵌套式引物以一次扩增的产物为模板进行巢式PCR。通过对PCR产物进行测序，测序结果与原始探针序列比对，序列相似性为95.8％～100％。证明了阳性点的准确性。本发明的基因芯片对腹泻粪便标本的检测显示出较高的特异性和灵敏度，特别是对混合感染的标本检测显示出一定的优势。在24小时内完成从样品DNA提取、荧光标记、杂交检测、结果分析一系列实验。作为一项高通量快速并行的诊断技术，对细菌性腹泻等临床感染性疾病的早期诊断、传染病暴发流行的疫情监控以及病原菌毒力基因谱在传播过程中的变化等方面具有广阔的应用前景。
本发明还提供一种病原微生物DNA检测芯片的制备方法，该方法包括：
(1)根据病原微生物的目标序列设计并合成扩增引物；
(2)利用(1)所述的扩增引物从病原微生物的DNA中扩增目标检测探针；
(3)将所述探针固定在载体上。
本发明在对芯片检测目标基因扩增引物的设计上要求所有引物必须保证在同一退火温度，PCR产物的长度要求比较一致，且扩增效率良好。这样对于样品的混合PCR放大、标记过程以及芯片的杂交过程中温度及其他条件的控制极为有利，同时将引物间的相互影响及扩增效率的影响降到最低。
经过发明人大量的实验和研究，本发明最终确定了适用于本发明的优选引物序列和探针序列，并列表1如下：
这些扩增引物可以分为3个组合。其中组合一的扩增引物包括本发明的SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ ID Nos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68，其分别与组合一的探针相对应，用于以用于定性检测以下病原微生物：霍乱弧菌，出血性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌，黏附集聚性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，产毒性大肠杆菌，副溶血弧菌，空肠弯曲菌，沙门菌，志贺菌A、F2A、D群，单增李斯特菌；组合二包括组合一中的所有探针，还包括本发明的以下扩增引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ ID Nos.13和14、SEQ ID Nos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.29和30、SEQ ID Nos.55和56、SEQ IDNos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、SEQ ID Nos.65和66，其与组合二的探针相对应，以检测进一步所述病原微生物的产毒情况；组合三的引物包括组合一和二中的所有引物，还包括以下扩增引物：SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.35和36、SEQ ID Nos.53和54、SEQ ID Nos.45和46、SEQ ID Nos.49和50、和SEQ ID Nos.63和64，其与组合三的探针相对应，以进一步检测所述病原微生物的侵袭力。
在本发明的病原微生物DNA检测芯片的制备方法中，用于基于引物与模板的特异结合产生特异扩增产物的酶促核酸体外扩增检测技术进行扩增；优选所述扩增选自：聚合酶链式反应(PCR)连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。其中，在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓冲液组成。耐热DNA聚合酶包括：从水生栖热菌中分离的Taq DNA聚合酶、从嗜热栖热菌中分离的Tth DNA聚合酶、从litoralis栖热球菌中分离的VENT DNA聚合酶和从酶热浴硫化裂片菌中分离的Sac耐热DNA聚合酶等。连接酶链式反应(LCR)，目的为检测靶序列中有无点突变：设计一对引物A、B覆盖了靶序列，经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口，加入连接酶封闭缺口，两引物与靶序列形成完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。链置换扩增(SDA)，在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增；核酸单碱基取代、转录介导扩增(包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification，TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acid s sequence based amplification，NASBA)。TMA是一种利用Money鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶和T7 RNA多聚酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统，主要扩增原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。NASBA的原理与TMA相似，只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。在本发明中，更优选PCR反应。本发明提供一种优选的PCR反应，其条件为：95℃预变性3～5min；94℃变性1min；50～58℃退火40秒；72℃延伸30秒；进行40个循环；72℃延伸0.5～5min。
本发明的探针可以不经过修改，或者经过磷酸化、氨基化、醛基化、丙烯酰胺化等化学修饰后固定该载体上。优选经过磷酸化修饰。将所述探针固定在载体上的方法可以采用本领域常用的点样方法。点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上，优选使用GeneTAC Microarraying接触式点样；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。在本发明中，优选接触式点样。为了本发明的目的，载体可以使用本领域已知的载体，例如硝酸纤维素膜、各种表面处理的微珠、玻璃片，所述玻璃片可以为氨基、醛基、多赖氨酸化的玻璃片，优选使用氨基化的玻璃片。
另一方面，本发明提供一种利用本发明所述病原微生物DNA检测芯片检测离体样品的方法。本发明所说的病原微生物包括但不限于霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌、李斯特菌。本发明的检测范围涵盖所述八个菌属的管家基因和毒力基因。所说的样品包括但不限于排泄物、肠积液、呕吐物。在本发明的一个具体实施例中，本发明以34份腹泻病人粪便标本为检测对象，在对样品进行简单处理提取细菌基因组后，用特异引物、荧光素扩增标记，产物与芯片杂交，扫描完成结果判读。这种方法在一天时间内即可完成对一个种属或几个种属不同血清群的腹泻病原菌感染病人的诊断和鉴别诊断，并确定相关病原体产毒情况，判断该菌致病力的强弱程度。并对部分阳性杂交结果通过巢式PCR克隆测序的方法对芯片检测的特异性进行验证，证明了本发明的DNA检测芯片的检测结果正确性。
本发明的病原微生物DNA检测芯片可以用于进行微生物属种血清型的检测，(参见实施例5)；可以用于产毒情况的判定(参见实施例6)，可以对毒力侵袭力及致病情况的综合判定(参见实施例7)；因此，本发明提供了一种可对病原微生物进行从菌属到种到血清型的分型毒力检测DNA芯片，这对于简化程序，快速、高通量地进行病原微生物的检测和鉴定具有重要意义。
在本发明的一个实施方式中，所述方法可以具体包括以下步骤：提取待测样品DNA；按照不同目的，选择前述组合一、组合二或组合三的引物对提取的DNA进行PCR扩增并标记；将经标记的扩增产物与本发明的病原微生物DNA检测芯片杂交；确定所述待测样品中是否含有病原微生物，以及具血清型和毒力情况。在选择组合二的引物的情况下，可以将所述引物分为两组，例如其中一组为组合一；在选择组合三的情况下所述引物分成三个组，然后再用每个组分别进行PCR扩增并标记，这样可以减少多对引物间的干扰。对这三组引物分别标记、纯化后再混合杂交，这样既没有损失检测信息，且仍可以体现芯片的高通量的特点。此外，上述步骤中对样品进行标记的方法一般为荧光标记。荧光标记基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。在本发明的实施例中使用Cy5-dUTP进行标记，使用目前已知的荧光检测技术进行检测。本领域技术人员已知，如何根据杂交检测结果，确定样品中是否含有病原微生物及其属种和毒力情况。具体可以参见实施例3、4、5、6、7。
此外，本发明还提供一种病原微生物DNA检测芯片试剂盒，该病原微生物DNA检测芯片试剂盒除了包含本发明的病原微生物DNA检测芯片外，还可以包含扩增引物，这些扩增引物例如SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ IDNos.51和52、SEQ ID Nos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68；优选还有以下所述的扩增引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ ID Nos.13和14、SEQ IDNos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.55和56、SEQ ID Nos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、SEQ ID Nos.65和66；更优选还有以下所述的扩增引物：SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.35和36、SEQ ID Nos.53和54、SEQ ID Nos.45和46、SEQ ID Nos.49和50、和SEQ ID Nos.63和64。这些引物可以装在一个容器内，也可以分成几组，分别装在不同的容器内，或也可以均装在单独容器内。此外，该试剂盒中还可以包含用于检测或扩增的一种或多种组分。按照具体检测方法及扩增方法的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。
本发明的优点和效果
病原微生物检测DNA芯片是以DNA芯片为平台建立起的用以鉴定样品中病原微生物的属种、型别及其产毒情况的一种新技术。区别于普通PCR一次只能检测一个基因，DNA芯片能够高通量地检测样品中的大量的不同种类病原微生物。在一天时间内即可完成对一个种属或几个种属不同血清群病原的诊断和鉴别诊断，并确定产毒情况，协助判断该菌致病力的强弱程度。还可有效检测同一样品中含有的几种病原的混合感染。和多重PCR相比DNA芯片的杂交检测更灵敏，结果判读更准确。
DNA芯片的探针对引物的要求较高，即除了要遵循引物设计的一般原则外，还要使引物退火温度尽量保持一致，扩增片段的长度尽量一致，各引物间减少互补序列，这增加了引物设计和筛选的难度。本发明筛选出的34对高特异性引物PCR扩增效率较高、扩增的探针同源性较低，用此34对引物进行PCR扩增来制备本芯片的探针可以满足对样品中病原微生物的诊断和鉴别诊断的要求。例如对于霍乱弧菌，根据探针ompW我们可以判定为霍乱弧菌属而非其他菌属，根据探针o1ag或o139ag我们可以进一步判断属于01或O139血清群，根据rtx探针可以确定属于霍乱古典或El-tor生物型，根据ct探针可以判断起是否产霍乱毒素。
另外，由于本发明的34个探针均固定在同一载体上，可以通过一次的杂交反应同时获取多种信息。对比目前的PCR技术具有高灵敏度、高通量、快速的优势。
应用结果显示本发明病原微生物DNA检测芯片可以对上述8个菌属以及各菌属相应的菌种、血清型、产毒情况等多个目标基因进行识别检测，具有较高的特异性和较好的重复性。
附图说明
图1为本发明的芯片制作流程图。
图2为本发明的DNA芯片的点阵排布示意图(应用纯菌为检测对象的验证)。
图3为本发明的芯片对空肠弯曲菌的检测结果；其中模板为空肠弯曲菌cj6，空肠弯曲菌探针阵列中Cdt、CeuE、MapA均为阳性信号。
图4为本发明的芯片对鼠伤寒沙门菌的检测结果；其中模板为鼠伤寒沙门菌STM，探针阵列中IroB、InvA、SpvC均为阳性信号。
图5为本发明的芯片对肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的检测结果。
图6为本发明的芯片对肠致病性大肠杆菌(EPEC)的检测结果。
图7为本发明的芯片(组合一)对单增李斯特菌的种属特异性的检测结果。
图8A为本发明的芯片(组合一、组合二与组合三)对EHEC的检测结果；图8B为本发明的芯片(组合一与组合二)对霍乱属的检测。
图9A为临床样品检测芯片点阵示意图，其中芯片上的点阵具体位置如下：
| 点阵位置 | 检测以下基因的探针 | 点阵位置 | 检测以下基因的探针 | 点阵位置 | 检测以下基因的探针 |
| b2-5c2-5d2-5e2-5b8-11c8-11d8-11e8-11b26-29c26-29d26-29e26-29h20-23k20-23 | rtxrfbErfbRiapo1ageaeAt1yadA阴性对照vt2virFctaaf/ItoxR | h2-5i2-5j2-5k25h811i8-11j8-11k8-11h1417i14-17h20-23i20-23i2023 | spvChlyAmapArfbG阳性对照wzyo139agyst阴性对照ceuE阴性对照cdtiroB | b14-17c14-17d14-17e14-17b20-23c20-23d20-23e20-23j14-17k14-17j20-23k2023j20-23 | 阴性对照ltipaHhlyO阴性对照stompWprfAvt1trhbfpAtdhinvA |
图9B为阳性点克隆测序后与Genbank序列比对结果，其中：
a.样品sd10扩出的mapA与原始序列相似性比对结果，相似性100％；
b.样品sd10扩出的ceuE与原始序列相似性比对结果，95.8％；
c.样品sd10扩出的cdt与原始序列相似性比对结果，99.8％；
d.样品sd22、sd7、sd18扩出的ipaH与原始序列相似性比对结果，100％。
图10A～图10F为基因芯片检测临床粪便样品的杂交结果。
图11A和图11B显示芯片阳性杂交点的PCR扩增，其中：
图11A显示通过常规PCR进行的扩增后检测结果，其中，a：DNA标记100bp梯度；b：mapA；c：ceuE；d：cdt；e：hlyA；f：lt；g：st；h：virF；I：lt；j：st；k：hlyA；l：ipaH(样品sd22的检测结果)；m：ipaH(样品sd7的检测结果)；n：ipaH(样品sd18的检测结果)；o：yst；p：cd t(o-p是样品s d16的检测结果)；
图11B显示用巢式PCR进行的扩增后检测结果，其中，a：DNA标记100bp梯度；b：virF(样品sd10的检测结果)216bp；c：hly(样品sd16的检测结果)327bp；d：hly(样品s d10的检测结果)327bp；e：lt(样品s d16的检测结果)149bp；f：st(样品sd16的检测结果)256bp；g：lt(样品sd10的检测结果)272bp；h：wzy(样品sd3的检测结果)。
图12A～图12C是应用实时荧光定量PCR扩增腹泻病人粪便标本的结果，其中图12A为实时荧光定量PCR的标准曲线，显示梯度稀释呈较好的线性关系；图12B为荧光定量PCR的扩增曲线，结合标准曲线计算出CT值(阈值)，从而计算出样品中DNA的含量；图12C为熔解曲线，重叠性较好的单一的峰证明扩增结果特异性好。结果计算得出样品中病原DNA含量为58个拷贝(copies)/μl。
具体实施方式
实施例1：病原微生物检测芯片的制备
1、病原微生物基因组DNA的提取：利用常规提取以下病原微生物：霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌、李斯特菌的DNA。(见分子克隆实验指南(第三版)，冷泉港出版社)
2、引物的筛选和检测探针的制备
将上述病原微生物基因组DNA作为模板，分别用各菌株所对应的引物(见表1，由北京赛百盛基因技术有限公司、上海生工生物工程有限公司和北京奥科生物技术有限责任公司合成)对所述菌株进行PCR扩增(TaqDNA聚合酶，购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)，将获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，经乙醇沉淀纯化后做为固定探针布点在芯片上。具体流程见图1。
操作步骤：
(1)PCR反应扩增目的基因片段
PCR反应体系25μl：PCR缓冲液，2.5μl；引物(上、下游各5μM)，2.5μl；dNTP(10mM)，0.5μl；模板DNA(分别为上述某一种病原微生物基因组DNA)，0.5μl；Taq(5U/μl)，0.5μl；去离子水，18.5μl。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min；56℃退火40s；72℃延伸30s；进行40个循环；72℃延伸10min。
PCR产物的检测：扩增完毕后，取2.0μl反应液与0.4μl 6×溴酚蓝缓冲液混合，在2％琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/ml)中电泳，用读胶仪观察结果并照相。
(2)检测探针的纯化和定量
乙醇沉淀法纯化检测探针，具体操作如下：
(a)取200μl PCR反应液，加400μl无水乙醇及20μl乙酸钠(终浓度为0.3mol/L)，-20℃ 1小时。
(b)4℃12,000rpm离心10min，弃上清。
(c)70％乙醇，4℃12,000rpm离心2min，弃上清。
(d)37℃干燥后，溶于10μl无菌去离子水中。
(e)取1μl溶液2％琼脂糖凝胶电泳，检验探针质量。
(f)取2μl溶液稀释到50ul在紫外分光光度计下测定探针浓度。
(g)用无菌去离子水将探针浓度稀释到500ng/μl。
(h)加入等体积的100％DMSO溶液(100％DMSO为点样液)混匀后-20℃保存备用。
(3)玻片的表面处理
(4)检测探针在氨基化玻片上的固定
3、PCR产物检测探针的固定
操作步骤：
(1)将固定探针放入384孔板中，每孔5μl，浓度为250ng/μl。
(2)将384孔板及硅烷化好的玻片(氨基化玻璃片(购于上海百奥公司))放在指定位置。
(3)设置点样程序用点样仪(GeneTAC Microarraying，Perkin Elmer公司，关国)点样。
(4)点样后处理：湿化：60℃蒸汽湿化35s；干烤：80℃1小时；紫外交联：将玻片上打印有DNA的面朝上，紫外释放能量为250mJ，将DNA固定在玻片上；2％十六烷基磺酸钠(SDS)洗2min。超纯水(Ω≥18兆欧)冲洗2min；变性：90℃水中煮2min，立即浸入冰无水乙醇中3min；晾干待杂交。排布如图2所示。
实施例2：待测样品中目标基因的标记
(1)按照实施例1所述的方法制备待测样品；
(2)样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl，其中的引物为混合引物即组合一、组合二、组合三，浓度为1.6μM，分别用三组引物标记待测样品，然后将标记产物混合并纯化。
实施例3：待测样品的检测
1.基于PCR产物固定方法的杂交检测芯片
操作步骤：
(1)将玻片放置在杂交仓内。
(2)将装有标记探针的微离心管加热变性：100℃沸水煮3min。
(3)向管中加入100μl高效杂交液(博大泰克公司)，吹打混匀后注入杂交仓。42℃杂交18小时。
(4)18小时后将玻片取出，放入洗膜I液(2×SSC、0.1％SDS)中洗涤2min。
(5)洗膜II液(0.1×SSC、0.1％SDS)洗涤2min。
(6)超纯水洗涤2min，晾干待扫描。
2.芯片的清洗
(1)放入洗膜I液(2×SSC、0.1％SDS)中洗涤2min。
(2)洗膜II液(0.1×SSC、0.1％SDS)洗涤2min。
(3)超纯水(Ω≥18兆欧)洗涤2min，晾干待扫描。
3.扫描仪下观察杂交结果
检测结果根据扫描仪读取的信号进行判断。在扣除背景信号的基础上阳性信号判定为阳性，阴性信号判定为阴性。图3～图6。
杂交检测芯片结果判读表：
注：‘+’为阳性；‘-’为阴性。
对上表的解释：34个基因分别用于鉴别八个种属的病原菌，鉴别不同的血清群和生物型，鉴别病原菌产毒情况及侵袭致病力的强弱。以霍乱弧菌为例：ompW基因是存在于所有霍乱弧菌的具有种属特异性的管家基因，若为阳性，可以区别于其它7个菌属；o1ag和o139ag分别为霍乱弧菌o1群和o139群的特异抗原编码基因，若o1ag为阳性，判断为霍乱弧菌o1血清群，若o139ag阳性，判断为霍乱弧菌o139血清群。若o1ag和o139ag均为阴性，判断为非o1、非o139群霍乱弧菌；若rtxC基因阳性，结合o1ag基因阳性判断为霍乱o1血清群ElTor生物型，若rtxC阴性，结合o1ag基因判断为霍乱o1血清群古典生物型；若ct基因阳性，判断该菌株是否产生CT毒素；这样根据一次杂交反应的结果，从基因点的阴性或阳性可以判断出该菌株是否为霍乱弧菌，若为霍乱弧菌，是o1血清群还是o139血清群，是o1古典生物型还是ElTor生物型，是否能产生CT毒素(霍乱肠毒素)。这对于快速诊断和流行病学追踪溯源具有重要意义，不仅能够短时间控制疫情，并且有利于临床上快速对症诊治。
实施例4：芯片用于种属的检测
芯片制作与检测方法同实施例1，2，3。应用引物组合一标记单增李斯特菌并杂交。
结果，见图7，单增李斯特菌的种属特异性检测探针iap基因的四个重复点呈阳性信号，除坐标点外其他位置没有阳性信号，证明待测样品为单增李斯特菌，同时与其他七种病原菌鉴别开来。
实施例5：用于血清型及产毒情况的检测
芯片制作与检测方法同实施例1、2、3。应用组合一与组合二的混合引物标记霍乱18506并杂交。
结果，见图8B。霍乱弧菌的种属特异性检测探针ompW基因，o1血清群检测探针o1ag基因，o1血清群eltor生物型检测探针rtx，霍乱肠毒素(CT)检测探针ct基因，每种基因的四个重复点呈阳性信号，除坐标点外其他位置没有阳性信号，证明待测样品为霍乱弧菌O1血清群eltor生物型产CT毒素的菌株，同时与其他七种病原菌鉴别开来。
实施例6：用于毒力致病力等综合情况的判定，混合PCR拆分标记后杂交
芯片制作与检测方法同实施例1、2、3。分别用组合一、二、三的混合引物标记EHEC后将标记产物混合与芯片杂交。
结果，见图8A。EHEC O157:H7的亚型特异性检测探针rfbE基因，侵袭性相关检测探针eaeA基因，致病性相关检测探针hlyA基因，VTI和VTII型毒素相关检测探针vt1，vt2基因，每种基因的四个重复点呈阳性信号，除坐标点外其他位置没有阳性信号，证明待测样品为EHEC，同时与其他七种病原菌鉴别开。
实施例7：腹泻病人粪便样品的检测
1.材料
34份腹泻病人粪便标本取自某医院2005年8-10月间就诊腹泻病人；cy5标记dNTP(Amersham pharmacia)；氨基化玻片(上海百傲)；PCR纯化试剂盒(Quigen)。
2.方法
(1)粪便标本中细菌DNA的提取
样品以0.9％NaCl溶解混匀，95℃10分钟裂解细胞壁，4000rpm离心5分钟，取上清2μl用于荧光标记。
(2)芯片制作(与前述相同)
3.杂交反应
取纯化后的标记样品20μl，加入80μl杂交液(购于博大泰克生物公司)混匀，注入杂交仪，覆盖按照实施例1方法制备的芯片探针样品阵列上，不同之处在于点阵排列见图9A，42℃杂交12小时，用清洗液将未结合探针洗脱并除盐，晾干。
芯片杂交结果扫描检测与分析
用GenTAC LS IV扫描仪(Genomic Solutions Inc公司，美国)读取杂交结果，设置Gain为60，Black为10，用Analyzer4.0将荧光强度数值化，对照阵列构成图判读样品检测结果。
结果：34份标本中24份检出阳性信号，其中5份提示可能存在2种以上腹泻病原的混合感染。部分杂交结果见图10。其中，图10A.样品sd10：其中显示如下阳性信号：空肠弯曲菌的检测探针map(j2-5)，ceuE(i14-17)，cdt(i20-23)，产毒性大肠杆菌lt(c14-17)和st(c20-23)；大肠埃希菌EHEC O157:H7的hlyA基因(i2-5)，小肠结肠炎耶尔森菌属的virF(d26-29)，yad(e8-11)，霍乱弧菌CT基因(e26-29)，其中mapA为空弯种属特异性基因，编码外膜蛋白A，据此基因可以与结肠弯曲菌相鉴别。ceuE编码铁载体转运蛋白(siderphore transport)，铁摄取是感染的重要方面，故铁结合蛋白转运系统是重要的毒力相关因素。Cdt(cytolethal distending toxin)编码细胞扩张致死性毒素，为AB型细胞毒素，包括A，B，C三个亚单位，B为毒素活性单位，AC为结合单位，其作用机制是通过损伤细胞DNA，在G2/M期发生作用，使细胞周期停滞，导致胞质膨胀，与细菌定植能力和致病力密切相关。lt编码不耐热肠毒素，st编码耐热肠毒素，是ETEC的主要致泻因子。hlyA编码溶血性大肠EHEC：O157溶血素。所以该样品含有弯曲菌、产毒性大肠杆菌、耶尔森菌、出血性大肠、霍乱弧菌；提示病人可能存在两种以上病原菌的混合感染。这种情况用常规的培养鉴定或免疫学方法通常很难鉴定。图10B.样品sd16，显示如下阳性信号：大肠埃希菌EHEC O157：H7的hlyA基因(i2-5)，空肠弯曲菌的检测探针cdt(i20-23)，产毒性大肠杆菌ETEC的st毒素(c20-23)，志贺D群探针wzy(i8-11)，霍乱弧菌CT毒素基因(e26-29)，小肠结肠炎耶尔森菌yst(k8-11)和virF(d26-29)。图10C.样品sd3：其中显示如下阳性信号，志贺D群探针wzy(i8-11)。图10D.样品sd22：其中显示如下阳性信号：侵袭性大肠EIEC的ipaH基因(d14-17)。图10E.样品sd7：其中显示如下阳性信号：侵袭性大肠EIEC的ipaH基因(d14-17)。图10F.样品sd18：其中显示如下阳性信号：侵袭性大肠EIEC的ipaH基因(d14-17)。志贺菌D群检测探针wzy(i8-11)。
实施例8、杂交阳性基因的克隆测序分析
(1)第一次PCR扩增
用芯片阳性杂交点对应的特异引物扩增相应的样品。反应体系与反应条件(见上)。模板样品为6个粪便样品，分别称为sd10，sd16，sd3，sd22，sd7，sd18。扩增基因包括mapA，ceuE，cdt，hlyA，lt，st，virF，wzy，ipaH，wzy，ct，yad，yst。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带胶回收纯化，连载体，克隆扩增，测序。
结果：参见图11A，通过对这些点的PCR克隆验证，只有hlyA，st，cdt扩增阳性序列一致，其余四个均未扩出。对于这些常规PCR未扩出而芯片检测呈阳性的结果，利用下述巢式PCR进行扩增。
(2)巢式PCR扩增
在芯片特异探针的内侧设计以下嵌套式引物，对于部分经第一轮PCR未扩出的，取扩增产物2μl进行第二轮扩增，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，见图11B。产物纯化克隆测序。
上述嵌套式引物如下：
序列测定由北京奥科生物公司完成。测序结果用Vector NTI与原序列作相似性比对。
结论：序列相似性为95.8％～100％(见图9B)。证明了阳性点的准确性，也为诊断芯片技术方法的改进提供可靠的依据。
实施例9、实时荧光定量PCR测定粪便样品中病原菌的含量。
反应体系20μl 2×SYBRGreen PCR MasterMix，上下游引物200nmol，16μl ddH20，2μl模板DNA.反应条件：95℃预变性10分钟，94℃变性15秒，50～58℃退火30秒，72℃延伸30秒。结果：
见图12A～图12C。根据PCR反应基线标准差的10倍确定CT值.根据标准曲线确定R2＝0.997，得出公式Ct＝-6.08Lg Copy number+39.95(R2)，计算出拷贝数(copy number)＝58个拷贝(copies)/μl。根据熔点曲线确定扩增特异性好，曲线重合度较好，均在79.5℃出现单一峰型。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>一种病原微生物DNA检测芯片及具制备方法和应用
<130>GBI07CN0254-C
<160>110
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
cactgaactg ccctgaaact g 21
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
ggcagaacag cagtcagaca ta 22
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ggtgagcata gagaatacgt cg 22
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
tggtttcgat tcggaagcgg 20
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
tggcggcggt aggcgttag 19
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
gctctttcgt ctggcatt 18
<210>54
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
ttccactgcg ataacgg 17
<210>55
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
gtagctgctt atgatggg 18
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
gaggtgttct gtgccgtta 19
<210>57
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
gcattccttg ctctatcctc ac 22
<210>58
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
aagccgatgt ttctaaatgc gt 22
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
tcttattcca tccagcgtag cc 22
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>60
gccgtattcg caatgagttt 20
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>61
ttctttttct ggatagccga gc 22
<210>62
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
ccaataatcc ctaactgagc cg 22
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>63
caaactgcta acacagctac t 21
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>64
tcagcaataa tagcacttgc a 21
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>65
actgcgttgt taacgtttga 20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>66
tccgcctgca agtcctaaga 20
<210>67
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
aacatcggtt ggctat 16
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
tctttgagga ctaccgta 18
<210>69
<211>310
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>69
ggcatacagt cctcatccag atgaacaaga agtttctgct ttaggtggga ttccatactc 60
ccaaatatat ggatggtatc gagttcattt tggggtgctt gatgaacaat tacatcgtaa 120
taggggctac agagatagat attacagtaa cttagatatt gctccagcag cagatggtta 180
tggattggca ggtttccctc cggagcatag agcttggagg gaagagccgt ggattcatca 240
tgcaccgccg ggttgtggga atgctccaag atcatcgatg agtaatactt gcgatgaaaa 300
aacccaaagt 310
<210>70
<211>412
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>70
tagacccgca gaggtagaaa cgctgttagg tgatcctagc ctagctaaga aggagcttgg 60
atgggtgcca gaaattactt tacaacagat ggtttctgaa atggtagctt ctgatttaga 120
acaagctcaa agtcatgcac tattgaaaaa acatggctat aacgtaaatg tatctgtaga 180
gtgaggtcct ttaaatgatt cctgtatacg aaccaagttt ggatggaaat gagcgtaaat 240
atctaaacga ttgcattgat tccggttggg tatcctcaag ggggaaatat attgatcgct 300
tcgaaactga gtttgcggag tttttaaaag taaagcacgc cacaacagta tctaatggaa 360
cagttgcgct acatttggca atgagcgcgt tgggaataac tcaaggcgat ga 412
<210>71
<211>390
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>71
taggtggtgt gatgctgctc agccagcatt cgccgcttca tcgtcgttat gtggttgcag 60
aatggctgca acgcattctg cctgcgtttg agctaaacca gttttgctat tacgaagatg 120
agcatgggcg tccaattgcc ttttgtaatt gggcgtttgt ctctgagcag atccgagatg 180
agctgctttc tggtgtgcgc gaaatatctc catccgactg gcgttcgggc cagcaaatct 240
acattccaga gatgattgct ccattcgggc atggtcgcga ggtcgtcaat gatcttcgtc 300
gtcgtgtatt tcttccgtgg caggggcaga aagtctgtac tgtccgcggc aaggtggatg 360
ctcaaaatga ccgctgtatc cgaaaggtgc 390
<210>72
<211>494
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>72
gtggtctatg ggttgatgat gactttggtg tctgtttagc gcacgcacgc ttatcaatac 60
aggatttaag ttcagctggg catcagccga tgcattcaaa atctgagcgc tatgttatga 120
tttttaatgg tgaaatatac aatcatttaa cattgcgtga agaactgatc gagattgtac 180
caagttactg gaatggtcat tcagataccg aaaccttgtt ggctggtttt gaagtgtggg 240
gaatagaaca gaccatacaa aaatgtgtcg gtatgtttgc tatcgtccta tgggataaag 300
tacttaaaca gttgatcttg attcgggatc gatttggtga gaagcctctt tattacgggt 360
ggcagcgcga tacttttctg tttgcttctg agttaaaagc gcttaaagct catcccagtt 420
ttgaaggcag cattaatcgt caggcgttat cgcatttttt tcgtttgaat tacataccaa 480
cgcccttatc catt 494
<210>73
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>73
ccacctacct ttatggtcca atactacttt ggtgaagcta attcgacaaa ccgtccatat 60
gttggtgcgg gtttgaatta caccactttc tttgatgaaa gctttaatag tacgggtact 120
aataatgcat tgagtgattt aaaactggac gactcatggg gacttgctgc taacgttggc 180
tttgattata tgctcaatga tagctggttc ctcaacgctt atgtgtggta tgccaatatt 240
gaaacaacgg caacctacaa agcaggtgca gatgccaaat ccacggatgt tgaaatcaat 300
ccttgggtat ttatcatcgc gggtggttat aagttc 336
<210>74
<211>325
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>74
aagcgagtgc acctcgacat ataacatgat gcaactcaca aaaaaaaata aaaaaattgc 60
aaaatccgtt taactaatct caaatatccg tgaaacaaca tgacgggagg taacatgaaa 120
aagctaatgt tggcaatttt tatttctgta ttatctttcc cctcttttag tcagtcaact 180
gaatcacttg actcttcaaa agagaaaatt acattagaga ctaaaaagtg tgatgttgta 240
aaaaacaaca gtgaaaaaaa atcagaaaat atgaacaaca cattttactg ctgtgaactt 300
tgttgtaatc ctgcctgtgc tccat 325
<210>75
<211>440
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>75
ggcgacaaat tataccgtgc tgactctaga cccccagatg aaataaaacg ttccggaggt 60
cttatgccca gagggcataa tgagtacttc gatagaggaa ctcaaatgaa tattaatctt 120
tatgatcacg cgagaggaac acaaaccggc tttgtcagat atgatgacgg atatgtttcc 180
acttctctta gtttgagaag tgctcactta gcaggacagt ctatattatc aggatattcc 240
acttactata tatatgttat agcgacagca ccaaatatgt ttaatgttaa tgatgtatta 300
ggcgtataca gccctcaccc atatgaacag gaggtttctg cgttaggtgg aataccatat 360
tctcagatat atggatggta tcgtgttaat tttggtgtaa ttgatgaacg attacatcgt 420
aacagggaat atagagaccg 440
<210>76
<211>386
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>76
actatactcc gattcctctg gtgacgatgg ggatcgatta ccgtcatggt acgggtaatg 60
aaaatgatct cctttactca atgcagttcc gttatcagtt tgataaatcg tggtctcagc 120
aaattgaacc acagtatgtt aacgagttaa gaacattatc aggcagccgt tacgatctgg 180
ttcagcgtaa taacaatatt attctggagt acaagaagca ggatattctt tctctgaata 240
ttccgcatga tattaatggt actgaacaca gtacgcagaa gattcagttg atcgttaaga 300
gcaaatacgg tctggatcgt atcgtctggg atgatagtgc attacgcagt cagggcggtc 360
agattcagca tagcggaagc caaagc 386
<210>77
<211>418
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>77
agattgcgct gaagcctttg gttctaaata taaaggtaaa tatgtgggaa catttggaga 60
tatttctact tttagctttt ttggaaataa aactattact acaggtgaag gtggaatggt 120
tgtcacgaat gacaaaacac tttatgaccg ttgtttacat tttaaaggcc aaggattagc 180
tgtacatagg caatattggc atgacgttat aggctacaat tataggatga caaatatctg 240
cgctgctata ggattagccc agttagaaca agctgatgat tttatatcac gaaaacgtga 300
aattgctgat atttataaaa aaaatatcaa cagtcttgta caagtccaca aggaaagtaa 360
agatgttttt cacacttatt ggatggtctc aattctaact aggaccgcag aggaaaga 418
<210>78
<211>555
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>78
ttcgctctgc aataggtact ccattacaga ctatttcatc aggaggtacg tctttactga 60
tgattgatag tggcacaggg gataatttgt ttgcagttga tgtcagaggg atagatccag 120
aggaagggcg gtttaataat ctacggctta ttgttgaacg aaataattta tatgtgacag 180
gatttgttaa caggacaaat aatgtttttt atcgctttgc tgatttttca catgttacct 240
ttccaggtac aacagcggtt acattgtctg gtgacagtag ctataccacg ttacagcgtg 300
ttgcagggat cagtcgtacg gggatgcaga taaatcgcca ttcgttgact acttcttatc 360
tggatttaat gtcgcatagt ggaacctcac tgacgcagtc tgtggcaaga gcgatgttac 420
ggtttgttac tgtgacagct gaagctttac gttttcggca aatacagagg ggatttcgta 480
caacactgga tgatctcagt gggcgttctt atgtaatgac tgctgaagat gttgatctta 540
cattgaactg gggaa 555
<210>79
<211>385
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>79
gccttctaag caatcggtca ctggttcgaa tccagtacaa cgcgccatac ttattttttc 60
tggctcgctt ttgcgggcct tttttatatc tgcgccgggt ctggtgctga ttacttcagc 120
caaaaggaac acctgtatat gaagtgtata ttatttaaat gggtactgtg cctgttactg 180
ggtttttctt cggtatccta ttcccgggag tttatgatag acttttcgac ccaacaaagt 240
tatgtctctt cgttaaatag tatacggaca gagatatcga cccctcttga acatatatct 300
caggggacca catcggtgtc tgttattaac cacaccccac cgggcagtta ttttgctgtg 360
gatatacgag ggcttgatgt ctatc 385
<210>80
<211>338
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>80
acggacaaca gaatacactc catcgccccc tggctgatgc cgtgacagca tggttcccgg 60
aaaacaaaca atctgatgta tcacagatat ggcatgcttt tgaacatgaa gagcatgcca 120
acaccttttc cgcgttcctt gaccgccttt ccgataccgt ctctgcacgc aatacctccg 180
gattccgtga acaggtcgct gcatggctgg aaaaactcag tgcctctgcg gagcttcgac 240
agcagtcttt cgctgttgct gctgatgcca ctgagagctg tgaggaccgt gtcgcgctca 300
catggaacaa tctccggaaa accctcctgg tccatcag 338
<210>81
<211>505
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>81
tattataagg acggcacaac aagcaacttc aaaggggttg ttaccccctc cacacctgta 60
aatacgaacc aagacattaa caagacaaat aaggttggag tccaaaaata tagtgctcta 120
accgaatggg ttaaataata tcgagctcta gctaaaattt caactctcca cgctggattc 180
ctatccagcg ttttgggaat gacatttctt gtgattgatc ccaccctcgt aatatggaca 240
caggtctaag cgaggttcta gttttcaaat tgttccggac tgagaccacc aggtgccagc 300
gattgtaatc acattcgata taattaaaca ctgttgcccg cattatttcc cggctgataa 360
aatgttcttc gtggagacat tccactttca gcgaatgaaa gaacctttcc acgcaggcat 420
tatcgtagca gtatcccttg gcgcgcatcc tgtatattat tggcgatatg ccaacatacg 480
ggtatcaccg tgtctgggcg atact 505
<210>82
<211>331
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>82
ccagtctgcg tctgattcca ataagtcgca gaatgctatt tcagaagtaa tgagcgcaac 60
gtctgcaatt aatggtctgt atattgggca gaccagttat agtggattgg actcaacgat 120
tttacttaac acatctgcaa ttccggataa ttacaaagat acaacaaaca aaaaaataac 180
caacccattt gggggggaat taaatgtagg tccagcaaac aataacaccg catttggtta 240
ctatctgacg cttaccaggt tggataaagc ggcatgtgtt agtcttgcaa ccttgaactt 300
aggtacttca gcgaaaggct acggtgttaa t 331
<210>83
<211>584
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>83
agtaaaatag gaagaaccgc tgaaaatgta ggtaataatc tgggaaaagc cggaacagtt 60
ctctcagcac tacagaattt tacggggatt gctttatcag gcatggctct tgatgaattg 120
ctgagaaaac aacgggaagg agaggatata agtcagaatg atattgccaa aagtagtatt 180
gaacttatta atcagcttgt agatacagta tcaagtataa acagtaccgt tgattcattt 240
tctgagcagc ttaaccagct tggctcattt ttatccagta aacctcgctt aagttctgtt 300
ggtgggaaat tacaaaattt accagacctg ggctccctgg gggatgggct ggatgttgtc 360
tccggaattc tttctgctgt atcagcaagc tttattctgg gaaacagtga cgcacataca 420
ggaacaaaag ctgcagcggg tatcgaactg acaactcagg ttcttggaaa tgttggtaaa 480
gctgtttcgc aatatattct ggctcagaga atggcacagg ggttatcgac aacagctgca 540
agtgcgggtc tgatcacatc ggctgttatg ctggctatca gtcc 584
<210>84
<211>437
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>84
ttcttgtgaa agtcctggtg gttttgaagc aaagattaaa gggcttttat acattagcga 60
tgttggaatt caatgttgtg ccaataaacg cactttagac actggtattg ctttgaaaaa 120
ggtttattta catagatttt atgatttaaa agaagggcaa aaggttttaa atgctaaagg 180
gaaaaagtta tttgtcgatg tgaattttaa tgcggtattt tatacttatt taaaacaaga 240
acttgaagct agaggaatag ttgtgcttga caataacgat caaaattcac cttatgtgag 300
taagattgat ttagaattta tatcttatgg agcaactcaa gatgctatag gattacattc 360
aaaactagta ggagttttac aagttagtga tataaataaa aataagaaat ttacaatccg 420
caccaagcaa gatgtac 437
<210>85
<211>464
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>85
agaacagcca ctccaacagg acgccatgtg caacaaggtg gaacacctat tgatgaatat 60
gagtggaatt taggaactct ttcaaggcct gatagggttt ttatttatta ttctcgcgtt 120
gatgtaggag ctaatcgtgt aaatttagct atagtttcaa gaatgcaagc tgaagaagtg 180
attgttttac ctccacctac tacagtttca agacccatta taggaattcg caatggaaat 240
gatgcttttt tcaatatcca tgctttagct aatggaggaa cagatgtagg agcaattatc 300
acagctgtag atgcacattt tgcaaatatg cctcaagtta actggatgat agcaggggat 360
tttaaccgtg atccttctac tataacaagt acagtggata gagaattagc aaatagaatt 420
agagtggttt ttccaactag cgcaactcaa gcaagcggag ggac 464
<210>86
<211>346
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>86
cgctttgaga ttattcacga tgttttaggg attaacgcag tagatgagaa tataaaagta 60
ggcactcacg gcaaaagtat caattctgaa tttatactag aaaaaaatcc tgattatatt 120
tttgttattg atagaaatat cattgtaggc aacaaagaac gcgctcaagg catactcgat 180
aatgcacttg tcgctaaaac caaagcagca caaaacaaaa agatcatcta tcttgatcca 240
gaatactggt atttagcaag tggaaatgga ctagagtctt taaaaactat gattttagaa 300
atcaaaaacg ctgtaaaata atataacttc gcaagggcta gtctct 346
<210>87
<211>447
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>87
gcaaggttac aacatcacgt tgtttgatac tcacgccttg ttcgagacgc taacttctgc 60
gcccgaagag cacggtttcg tgaacgcgag cgatccttgt ttggacatca accgctcatc 120
gtctgtcgat tacatgtaca cccacgcatt gcgctctgag tgtgcagcgt ctggtgctga 180
gaagtttgtg ttctggaatg tcacgcatcc aacaacagca actcaccgct atgttgcaga 240
gaaaatgcta gaaagtagca acaacttagc cgagtaccgt ttctaaccgg acacggcttc 300
tgagttgaaa ccttatcttc gtacacacgt tgataacgaa cacatcgtgg ccatttttat 360
cgaaggaacg ttgtggtcac agcagtcaca acgctaaaca agttacagtg gcgcgacgtc 420
ggttccccct aaagactggt aaagcgt 447
<210>88
<211>294
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>88
ttccatctgt cccttttcct gcccccggtt ctgatgagat attgtttgtt gttcgagata 60
caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg acaaaccgta 120
atgtaaaaag aaaaccgtac gaagatgttt atggtcaatc agtattcaca acgtcaggta 180
ctaaatggtt gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat acaatggcag 240
cggtgtctgg ctataagagc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcaggt caag 294
<210>89
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>89
gattgacctg ccatccatac cttttccttc tccaggttcg gatgagctac tatttgtcgt 60
tagaaataca acaataaaaa ctgaatcacc agttaacgca atcgttgatg actactggac 120
aaaccgaaac ataaaacgaa aaccatataa aagcgttcac ggtcaatcta ttttcacgac 180
ttcaggctca aaatggttaa gcgcctatat gacggtaaat attaatggaa ataactacac 240
aatggctgct ctttctggct ataaagatgg cctttcaacg gtcttcacaa aatcagaaaa 300
aacaagccta aatcagaact attcttctgt tagtgatttc gttggtgaga a 351
<210>90
<211>367
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>90
gtcttctgac gcaatcgttg aaccagaagc gccagtagta cctgaaaaag cacctgtggc 60
ttctgctgtg aatccttgga ttccacgcgt tattttattt ttggcactat tactaccgat 120
ttgcgtactg ctgtttacaa acccagcgga atctcagttc cgtcagattg gtgagtatca 180
gaacgtacca gtgatgacac ctgtaaatca cccgcaaatc aacaactggt tgccttctat 240
tgagcagtgt attgaacgct acgttaagca ccatgcagaa gactccttac cagtggaagt 300
gattgccact ggcggacaaa ataaccagct gattttgaac tacattcatg acagcaacca 360
ctcgtat 367
<210>91
<211>306
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>91
atctgcgttg ttctcatctc catatgcatt tgccgatgat tacgacggta ttcctaattt 60
gacagcagtt caaataagcc caaatgctga tcctgctttg ggtctggaat atacagtaag 120
accaccagta ccaggcgcag gcgggctcaa tgctagcgct aagggtatcc atagcattgc 180
gattggtgct actgctgaag cagcgaaagg agcagcagtt gctgtgggcg ctggttcaat 240
tgcaacaggc gttaattctg ttgcaattgg tcctttaagt aaggcattgg gagattcggc 300
agttac 306
<210>92
<211>314
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>92
ttgaaataac taggctgggt cgatgaatat aaactatgat taaattagct tgggaaattt 60
aatgctaaaa acagttgtct cggtacttaa atagaatgcg tggtagaccg caaaaacaat 120
ttaactattg gattttattt atttttaaac tcaaaaattc tttttctgtt attgacacca 180
ctgcgtcgat atttttgtac ccattctaca aatgagtgat ggaggatcta tgaaaaagat 240
agtttttgtt cttgtgttaa tgctgtcttc atttggagca ttcggccaag aaacagtttc 300
agggcagttc agtg 314
<210>93
<211>561
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>93
ggcagaacag cagtcagaca tatgatttag atgaggggaa tatgctgttt ttgcgtcgtg 60
gcagctatgc tgttcgatgt ggtacaaaag aaccctgcca attactttgg attccattac 120
caggcagttt tttgagtact tttttacatc ggtttggttc tttgcttagt gaaattagac 180
gagacaatgc cacacccaag ccattgttaa tttttaatat ttcaccaata ttatcacaat 240
ccattcaaaa tctatgtgcc atattggaac ggagtgattt tccgtcagta ttaacgcaac 300
tgcgtattga ggaattattg cttttgcttg cctttagctc gcaaggggct ttattcctct 360
cggctctgcg ccatttaggc aaccgcccag aagaacggtt gcagaaattt atggaggaaa 420
attatctaca agggtggaaa ctaagcaaat ttgcgcgaga attcggcatg ggattaacca 480
cattcaaaga actgtttggt acagtttatg gcatttcacc acgcgcctgg ataagcgagc 540
gacgtattct ctatgctcac c 561
<210>94
<211>294
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>94
tggtttcgat tcggaagcgg gttatcgccg tcaggaggca ttgcgaaaag aaaataacat 60
tggaacaaaa atggggaact tctcattttt cagcgaagag atgaccgacc cgctggtcgc 120
gttcgccgga cagtggcggc cagatctcat cgtctatcct ccccttgggg tcgttggacc 180
actgattgcc gctaagtatg acattccggt agtaatgcaa accgtcggct tcggtcatac 240
gccctggcac atcaaaggcg tgacgaaatc actttctaac gcctaccgcc gcca 294
<210>95
<211>373
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>95
gctctttcgt ctggcattat cgatcagtac cagccgtctt atcttgattg aagccgatgc 60
cggtgaaatt atcgccacgt tcgggcaatt cgttattggc gatagcctgg cggtgggttt 120
tgttgtcttc tctattgtca ccgtggtcca gtttatcgtt attaccaaag gttcagaacg 180
cgtcgcggaa gtcgcggccc gattttctct ggatggtatg cccggtaaac agatgagtat 240
tgatgccgat ttgaaggccg gtattattga tgcggatgct gcgcgcgaac ggcgaagcgt 300
actggaaagg gaaagccagc tttacggttc ctttgacggt gcgatgaagt ttatcaaagg 360
tgacgctatt gcc 373
<210>96
<211>484
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>96
gtagctgctt atgatggggc ggaaatacca tctacaaata agcacctgaa aaataatttc 60
aactccttgc acaaccaaat gcggaagatg ccggtatccc actttaaaga ggcgctggat 120
gtgcctgact attcagggat gcgccagagt ggtttctttg ctatgagcca aggttttcag 180
ctgaataacc atggttacga tgttttcatc catgctcgtc gagaatcacc tcagtctcag 240
ggcaaatttg ccggtgacaa gttccacatc agtgtgctca gggatatggt gccacaagca 300
tttcaagcgc tgtccggatt gctgttttca gaggacagtc cggtagataa gtggaaagtg 360
accgatatgg agaaggtcgt tcaacaagcc cgtgttagcc tgggcgctca gttcacgttg 420
tatataaaac cagaccagga aaattcgcag tacagtgcgt cgtttctcca caagacacgg 480
caat 484
<210>97
<211>371
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>97
cgtaaggaac gagataggag tgttctcgtt tgtttctatt taatgaaaag ctatacactt 60
ttatagccta acagctttcg aatattactc tgtgattccg tataagaact taaattattc 120
ttacactttt tattttcgta attactatca cacgaaaaag agctggttct gagacttcaa 180
ctaaatttaa ggtagttata aaacaaactt tgatatagtc gtcgtctcag attacactac 240
tatcagcgcc ccttagggta ttcctctcta cctgatggca tatatctaat gggggtgtga 300
catttgttac attttaaaca ttaatcatca atacgacaca tagcgaatct gcgtaaatct 360
ttgtagccga a 371
<210>98
<211>587
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>98
gccgtattcg caatgagttt atcaaaaaac tttcctgcta tatggataat gaaaatgcaa 60
aaatagctgg cccagttttt attgatagag ataagtcaca ttattatcct atttgtaata 120
tcaaaaaaaa tggtcttcga gagaaaattc atgtcactga aggacagaca ccgtttaaaa 180
gttcagtaac aatctcatcc ggaaccatgg tttcaaaaga agtttttgag attgttggaa 240
tgatggatga ggaacttttt attgattatg tcgatacaga atggtgtctt agatgcttaa 300
actatggcat attagttcat atcattcctg atatagaaat ggttcatgct attggggata 360
agtcagtaaa aatctgtggg attaacatac caattcactc gccagtacgt cgttattatc 420
gagtaagaaa tgcatttctt ttgcttagaa aaaatcatgt gcctctttta ctctctatta 480
gggaagttgt tttttcttta attcatacga ctttaattat cgcaactcaa aaaaataaaa 540
ttgaatatat gaaaaaacat attttggcta cgctggatgg aataaga 587
<210>99
<211>409
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>99
ttctttttct ggatagccga gcaggaataa tatcatttgc tatatcgttg ttttttgttt 60
ttcttcagtt aacaaagaag gaaaagttat taatatcatt gttttttgtt cctcttctaa 120
ctttaggtat ttcttttact gatataggca ctcgtcttga acgaatgctg tcttcgtcac 180
aggttatatt ctctggtggt aacactctta caaaaagtca gaatgattat cgtcgagttg 240
agttagtatt tattggggtt gatgttttaa aagaaaatta tttaattggc actggattag 300
gtgttgcaaa ttatgtaaag gctatagata aaaagttttt aggaagtacc aactttgggt 360
tggcgcataa tttttattta tcttattcgg ctcagttagg gattattgg 409
<210>100
<211>371
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>100
caaactgcta acacagctac tccaaaagca gaagtgaaaa cggaagctcc agcagctgaa 60
aaacaagcag ctccagtagt taaagaaaat actaacacaa atactgctac tacagagaaa 120
aaagaaacag caacgcaaca acaaacagca cctaaagcac caacagaagc tgcaaaacca 180
gctcctgcac catctacaaa cacaaatgct aataaaacga atacaaatac aaatacaaac 240
aatactaata caccatctaa aaatactaat acaaactcaa atactaatac gaatacaaac 300
tcaaatacga atgctaatca aggttcttcc aacaataaca gcaattcaag tgcaagtgct 360
attattgctg a 371
<210>101
<211>414
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>101
tccgcctgca agtcctaaga cgccaatcga aaagaaacac gcggatgaaa tcgataagta 60
tatacaagga ttggattaca ataaaaacaa tgtattagta taccacggag atgcagtgac 120
aaatgtgccg ccaagaaaag gttacaaaga tggaaatgaa tatattgttg tggagaaaaa 180
gaagaaatcc atcaatcaaa ataatgcaga cattcaagtt gtgaatgcaa tttcgagcct 240
aacctatcca ggtgctctcg taaaagcgaa ttcggaatta gtagaaaatc aaccagatgt 300
tctccctgta aaacgtgatt cattaacact cagcattgat ttgccaggta tgactaatca 360
agacaataaa atcgttgtaa aaaatgccac taaatcaaac gttaacaacg cagt 414
<210>102
<211>342
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>102
aacatcggtt ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat 60
caaaataaac gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt 120
ccaaacccta caaaaacaag tttcatacag tctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa 180
cgggaagctt ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga 240
aactcctgat ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc 300
aagaggcatc gcacatagct cagctgttag cagaattatt tc 342
<210>103
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>103
acacccaagc cattgttaa 19
<210>104
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>104
tttctgcaac cgttcttct 19
<210>105
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>105
ctttatcagg catggctct 19
<210>106
<211>19
<2t2>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>106
tatgtgcgtc actgtttcc 19
<210>107
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>107
tgctcactta gcaggacag 19
<210>108
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>108
cacctaacgc agaaacctc 19
<210>109
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>109
tttaactaat ctcaaatatc cgtga 25
<210>110
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>110
atggagcaca ggcaggatta c 21
Claims (11)
1.一种病原微生物DNA检测芯片，该芯片包括载体和位于载体上的核酸探针，该核酸探针至少包括检测以下目标基因ompW、olag、rtxC、ol391、rfbEo157、ipaH、aaF、bfpA、st、toxR、mapA、iroB、rfbG、rfbR、wzy、prf的探针；
其中，检测所述目标基因的探针为以下探针：SEQ ID No.73、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.77、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.74、SEQ ID No.90、SEQ ID No.84、SEQ ID No.94、SEQ ID No.98、SEQ ID No.97、SEQ IDNo.99、SEQ ID No.102。
2.如权利要求1所述的病原微生物DNA检测芯片，其中，该芯片载体上的核酸探针还包括检测目标基因ct、tl、tdh、trh、lt、vt1、vt2、hlyA、spvC、cdt、yst、hly0的探针；
其中，检测所述目标基因ct、tl、tdh、trh、lt、vt1、vt2、hlyA、spvC、cdt、yst、hly0的探针为以下探针：SEQ ID No.69、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.75、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.83、SEQ ID No.96、SEQ ID No.85、SEQ ID No.92、SEQ ID No.101。
3.如权利要求2所述的病原微生物DNA检测芯片，其中，该芯片载体上的核酸探针还包括检测目标基因eae、ceuE，invA、yad、virF、iap的探针；
其中，所述检测目标基因eae、ceuE，invA、yad、virF、iap的探针为以下探针：SEQ ID No.76，SEQ ID No.86，SEQ ID No.95，SEQ ID No.91，SEQ ID No.93，SEQ ID No.100。
4.如权利要求1所述的病原微生物DNA检测芯片，其中所述的病原微生物包括：霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌、李斯特菌。
5.如权利要求1所述的病原微生物DNA检测芯片，其中所述载体为硝酸纤维素膜、表面处理的微珠、玻璃片。
6.如权利要求5所述的病原微生物DNA检测芯片，其中，所述玻璃片为氨基化、醛基化或多赖氨酸化的玻璃片。
7.一种如权利要求1所述的病原微生物DNA检测芯片的制备方法，该方法包括：
(1)根据病原微生物的目标序列设计并合成扩增引物，这些扩增引物为以下退火温度接近的引物：SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ IDNos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68；
(2)利用(1)所述的扩增引物从病原微生物的DNA中扩增目标检测探针；
(3)将所述探针固定在载体上。
8.一种如权利要求2所述的病原微生物DNA检测芯片的制备方法，该方法包括：
(1)根据病原微生物的目标序列设计并合成扩增引物，这些扩增引物为以下退火温度接近的引物：SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ IDNos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68；所述退火温度接近的引物还包括以下引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ IDNos.13和14、SEQ ID Nos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.29和30、SEQ ID Nos.55和56、SEQ ID Nos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、SEQ ID Nos.65和66；
(2)利用(1)所述的扩增引物从病原微生物的DNA中扩增目标检测探针；
(3)将所述探针固定在载体上。
9.一种如权利要求3所述的病原微生物DNA检测芯片的制备方法，该方法包括：
(1)根据病原微生物的目标序列设计并合成扩增引物，这些扩增引物为以下退火温度接近的引物：SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ IDNos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68；所述退火温度接近的引物还包括以下引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ IDNos.13和14、SEQ ID Nos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.29和30、SEQ ID Nos.55和56、SEQ ID Nos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、SEQ ID Nos.65和66；所述退火温度接近的引物还包括以下引物：SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.35和36、SEQ ID Nos.53和54、SEQ IDNos.45和46、SEQ ID Nos.49和50、和SEQ ID Nos.63和64；
(2)利用(1)所述的扩增引物从病原微生物的DNA中扩增目标检测探针；
(3)将所述探针固定在载体上。
10.如权利要求7或8或9所述的病原微生物DNA检测芯片的制备方法，其中步骤(2)包括利用聚合酶链式反应从病原微生物的DNA中扩增目标检测探针，聚合酶链式反应的条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟；50～58℃退火40秒；72℃延伸30秒；进行40个循环；72℃延伸0.5～10min。
11.一种DNA检测芯片试剂盒，该试剂盒含有如权利要求1～6任一项所述的病原微生物DNA检测芯片。
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| CN1786195A (zh) * | 2005-09-08 | 2006-06-14 | 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 | 转基因农产品dna检测芯片及其制备方法和应用 |
-
2007
- 2007-05-30 CN CN200710099758A patent/CN101113476B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| WO2022246521A1 (en) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | Western Sydney Local Health District | Reagents and methods for diagnosing shigella species |
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