CN106636361A - 一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌检测方法，具体是一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌是常见的沙门氏菌致病的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。
鼠伤寒沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法(可参见国标GB/T4789.4-2008)，正如刘振湘在《特产研究》2007年第1期第56～57页发表的题为“白鹭鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴”文中提及，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，虽然结果可靠，但是操作复杂，费时费力，通常要3～5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。为了能够快速、准确、简便的检验鼠伤寒沙门氏菌，以分子生物学为基础的检测方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一。PCR技术以其操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，逐步应用于沙门氏菌的检疫之后，对沙门氏菌病的诊断和防治工作起到了积极作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25-30℃，培养时间为18-24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述SYBER Green II荧光染料为80-100倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8-15mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为15-35mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述硫酸铁溶液的浓度为10-15mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90-96℃变性1-2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（1）中培养温度为28℃，培养时间为21h。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述SYBERGreenII荧光染料为90倍稀释。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述磷酸氢二钠溶液的浓度为11mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述枸橼酸钠溶液的浓度为25mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述硫酸铁溶液的浓度为13mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（3）中93℃变性1.5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25℃，培养时间为18h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；
所述SYBER Green II荧光染料为80倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为15mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；
所述硫酸铁溶液的浓度为10mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90℃变性1min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例2
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为26℃，培养时间为20h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；
所述SYBER Green II荧光染料为85倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为9mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为20mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；
所述硫酸铁溶液的浓度为11mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，91℃变性1min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例3
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为28℃，培养时间为21h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8；
所述SYBER Green II荧光染料为90倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为11mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为25mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8；
所述硫酸铁溶液的浓度为13mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，93℃变性1.5min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例4
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为29℃，培养时间为22h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.9；
所述SYBER Green II荧光染料为95倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为13mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为32mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.9；
所述硫酸铁溶液的浓度为13mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，95℃变性2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例5
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为30℃，培养时间为24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.9；
所述SYBER Green II荧光染料为100倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为15mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为35mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.9；
所述硫酸铁溶液的浓度为15mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，96℃变性2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (9)
1.一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25-30℃，培养时间为18-24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述SYBER Green II荧光染料为80-100倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、碳酸铵；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8-15mmol/L；
所述枸橼酸钠溶液的浓度为15-35mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述硫酸铁溶液的浓度为10-15mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90-96℃变性1-2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
2.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（1）中培养温度为28℃，培养时间为21h。
3.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。
4.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中所述SYBER Green II荧光染料为90倍稀释。
5.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中所述磷酸氢二钠溶液的浓度为11mmol/L。
6.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中所述枸橼酸钠溶液的浓度为25mmol/L。
7.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。
8.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（2）中所述硫酸铁溶液的浓度为13mmol/L。
9.根据权利要求1所述的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，具体步骤（3）中93℃变性1.5min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170510 |
|
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