CN101532057B - 福氏痢疾杆菌血清型检测用引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及福氏痢疾杆菌血清型检测用引物及其应用，所述引物包括分别为检测以下目标基因：gtr I、gtr II、gtr IV、gtr V、gtr X和/或oac基因的扩增引物，可鉴定福氏痢疾杆菌的血清型。本发明还涉及利用所述引物进行单重扩增检测的方法。本发明进一步涉及所述检测用引物在制备检测用制剂中的应用。本发明进一步涉及包含上述引物的福氏痢疾杆菌血清型检测用试剂盒。本发明的技术用于福氏痢疾杆菌血清型的鉴定，对于及时、准确鉴定临床分离病原菌的血清型及细菌性痢疾的防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及福氏痢疾杆菌血清型检测用引物及其应用，特别涉及使用所述引物进行单重扩增以用于鉴定福氏痢疾杆菌血清型。
背景技术
福氏痢疾杆菌(S.flexneri)是发展中国家细菌性痢疾的主要病原菌(Wang，X.Y.et al.Trend and disease burden of bacillary dysentery in China(1991-2000).Bulletin of The World Health Organization 84，561-568，(2006))，每年全球大约有2百万人感染，导致65万人死亡(W.H.O.Research prioritiesfor diarrhoeal disease vaccines：memorandom from a WHO meeting.Bull.W.H.O. 69，667-676(1991))。在我国，福氏痢疾发病数占全国痢疾感染的2/3以上，是重要的致病菌(http://www.moh.gov.cn)。
福氏痢疾杆菌菌体外膜脂多糖(LPS)O抗原是痢疾杆菌重要的毒力因子，也是宿主针对痢疾杆菌感染保护性免疫反应的作用靶位。根据O抗原的不同，福氏痢疾杆菌分为Fx、Fy、F1a、F1b、F1c、F2a、F2b、F3a、F3b、F4a、F4b、F5a、F5b、Fxb(关于该血清型的命名存在争议，Pryamukhina等人在1988年将其命名为F4c(Pryamukhina，N.S.&Khomenko，N.A. Suggestion to supplement Shigella flexneri classification scheme with thesubserovar Shigella fle
目前，鉴定福氏痢疾杆菌及其它群痢疾杆菌的血清型主要采用免疫动物的抗血清与分离菌株进行玻片凝集反应，根据免疫凝集结果进行判定(Edwards，P.R.，and W.H.Ewing.Identification of Enterobacteriaceae.Burgess Publishing Company，Minneapolis，Minn，126-131(1972))。尽管福氏痢疾杆菌血清型诊断系统已经建立(Ewing，W.H.Edwards and Ewing′sidentification of Enterobacteriaceae，.Elsevier Science Publishing Co，lnc，NewYork.4th ed.，，135-172(1986))，而且多种商业化诊断血清亦广泛应用，但是仍有具有诸多不足(Evins，G.M.，Gheesling，L.L.&Tauxe，R.V.Qualityof commercially produced Shigella serogrouping and serotyping antisera.J ClinMicrobiol 26，438-442(1988))，如：样品需要进行预培养和分离单菌落，延长了诊断周期；血清反应受细菌培养条件和生长状态影响；部分血清型间存在交叉反应，导致错误判读；结果判定通过肉眼观察，具有个体主观性。因此，寻找福氏痢疾杆菌血清型的分子标识，发展基于PCR等分子生物学技术的鉴定方法，对于及时、准确鉴定病原菌血清型具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的在于寻找福氏痢疾杆菌血清型的分子标识，发展分子生物学技术鉴定福氏痢疾杆菌血清型的方法。
本发明的另一目的在于提供一种福氏痢疾杆菌血清型检测用引物。
本发明的另一目的在于提供所述引物的应用，具体包括其在检测福氏痢疾杆菌血清型中的应用，以及在制备福氏痢疾杆菌血清型检测用制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物扩增检测福氏痢疾杆菌血清型的方法。
本发明的另一目的在于提供一种福氏痢疾杆菌血清型检测用制剂如试剂盒。
福氏痢疾杆菌O抗原多糖骨架上的修饰作用是由整合到菌株基因组中的噬菌体或隐性噬菌体携带的相关基因(gtrA、gtrB、gtr(I、II、IV、V、X)和/或oac)介导的糖基转移和乙酰化作用完成的。其中，gtrI、gtrII、gtrIV、gtrV、gtrX和oac基因分别存在温和噬菌体SfI、SfII、SfIV、SfV、SfX、Sf6上(Adams，M.M.，Allison，G.E.&Verma，N.K.Type IV O antigenmodification genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296.Microbiology 147，851-860(2001)；Adhikari，P.，Allison，G.，Whittle，B.&Verma，N.Serotype 1a O-Antigen modification：molecular characterization ofthe genes involved and their novel organization in the Shigella flexnerichromosome.Journal of Bacteriology 181，4711-4718(1999)；Bastin，D.A.，Lord，A.&Verma，N.K.Cloning and analysis of the glucosyl transferase geneencoding type I antigen in Shigella flexneri.FEMS Microbiology Letters 156，133-139(1997)；Clark，C.A.，Beltrame，J.&Manning，P.A.The oac geneencoding a lipopolysaccharide O-antigen acetylase maps adjacent to theintegrase-encoding gene on the genome of Shigella flexneri bacteriophage Sf6.Gene 107，43-52(1991)；Guan，S.，Bastin，D.A.&Verma，N.K.Functionalanalysis of the O antigen glucosylation gene cluster of Shigella flexneribacteriophage SfX.Microbiology 145(Pt 5)，1263-1273(1999)；Huan，P.T.，Whittle，B.L.，Bastin，D.A.，Lindberg，A.A.&Verma，N.K.Shigella flexneritype-specific antigen V：cloning，sequencing and characterization of the glucosyltransferase gene of temperate bacteriophage SfV.Gene 195，207-216，doi：S0378-1119(97)00144-3[pii](1997)；Huan，T.P.，Bastin，D.A.，Whittle，B.L.，Lindberg，A.A.&Verma，N.Molecular characterization of the genesinvolved in O-antigen modification，attachment，integration and excision inShigella flexneri bacteriophage SfV.Gene 195，217-227(1997)；Mavris，M.，Manning，P.A.&Morona，R.Mechanism of bacteriophage SfII-mediatedserotype conversion in Shigella flexneri.Molecular Microbiology 26，939-950(1997)；Verma，N.K.，Brandt，J.M.，Verma，D.J.&Lindberg，A.A.Molecularcharacterization of the O-acetyl transferase gene of converting bacteriophageSF6 that adds group antigen 6 to Shigella flexneri.Mol Microbiol 5，71-75(1991)；Verma，N.K.，Verma，D.J.，Huan，P.T.&Lindberg，A.A.Cloning andsequencing of the glucosyl transferase-encoding gene from convertingbacteriophage X (SFX) of Shigella flexneri.Gene 129，99-101，doi：0378-1119(93)90702-5[pii](1993))，分别编码糖基转移酶和O-乙酰转移酶，介导多糖骨架的糖基化和/或乙酰化，具有血清型别的特异性和唯一性(Adams，M.M.，Allison，G.E.&Verma，N.K.Type IV O antigenmodification genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296.Microbiology 147，851-860(2001))。
本发明根据gtrI、gtrII、gtrIV、gtrV、gtrX和oac基因具有血清型别的特异性和唯一性，将其作为分子标识，来鉴定福氏痢疾杆菌及其血清型。
一方面，本发明提供了一种福氏痢疾杆菌血清型检测用引物。其中包括分别为检测以下目标基因：gtrI、gtrII、gtrIV、gtrV、gtrX和/或oac基因的扩增引物。在本发明的一具体实施例中(参见实施例1)，根据已知的gtrI、gtrII、gtrIV、gtrV、gtrX和oac基因序列，设计了具特异性的、退火温度接近的扩增引物，具体为本发明的以下扩增引物：如SEQ ID No.1和2，用于扩增gtrI基因片段；SEQ ID No.3和4，用于扩增gtrII基因片段；SEQ ID No.5和6，用于扩增oac基因片段；SEQ ID No.7和8，用于扩增gtrIV基因片段；SEQ ID No.9和10，用于扩增gtrV基因片段；以及SEQ ID No.11和12，用于扩增gtrX基因片段。
本发明的引物，可用于定性检测福氏痢疾杆菌血清型。
根据本发明的一优选实施方案，本发明提供了一套福氏痢疾杆菌血清型检测用引物，其包括：SEQ ID No.1和2；SEQ ID No.3和4；SEQ ID No.5和6；SEQ ID No.7和8；SEQ ID No.9和10；以及SEQ ID No.11和12。
另一方面，本发明还提供了所述引物的应用，所述的应用具体包括所述引物在检测福氏痢疾杆菌血清型中的应用，以及所述引物在制备福氏痢疾杆菌血清型检测用制剂中的应用。
根据本发明提供的所述引物在检测福氏痢疾杆菌血清型中的应用，本发明还建立起一套快速、灵敏、易于推广使用的扩增检测福氏痢疾杆菌血清型的方法，其具体为单重扩增检测方法。本发明提供的单重扩增检测方法包括利用所述的引物进行扩增，用于基于引物与模板的特异结合产生特异扩增产物的酶促核酸体外扩增检测技术中；优选所述扩增选自：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。在本发明中，更优选PCR反应。在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓冲液组成。本发明在选择优选引物的基础上，还对反应体系和条件进行了优化。本发明提供一种优选的PCR反应，其条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55～58℃退火30s，72℃延伸40s，共15～30个循环；最后72℃延伸5min。
对于本发明所述的单重扩增检测方法，优选进一步包括在所述扩增之后进行定性分析。定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如包括利用凝胶电泳显示所述扩增产物，本领域技术人员可根据扩增产物的大小，确定所用的凝胶和浓度。
在本发明的一具体实施方案中(参见实施例1)，利用本发明优选的引物，PCR扩增了目前常见的13个福氏痢疾杆菌血清型菌株中gtr基因，在本发明中，除Fxb外，福氏痢疾杆菌各血清型标准菌株的型/群抗原表型与其特异基因gtr的PCR扩增结果一致，即血清型与PCR扩增结果吻合，应用本发明的引物与扩增检测方法，可以及时、准确鉴定福氏痢疾杆菌的血清型；而且本发明的PCR具有很好的特异性，非福氏痢疾杆菌的肠道细菌PCR扩增均为阴性(参见实施例2)。
根据本发明的具体实施方案，如已知待测样品中所含福氏痢疾杆菌菌株血清型部分信息，或仅需测定待测福氏痢疾杆菌菌株是否为某种或某些种血清亚型，可以仅利用本发明的部分引物对(例如SEQ ID No.1和2；SEQ ID No.3和4；SEQ ID No.5和6；SEQ ID No.7和8；SEQ ID No.9和10；以及SEQ ID No.11和12中的一对或多对)进行扩增检测，以确定具体的血清型和亚型。在本发明的一具体实施方案中，本发明还提供了一种单重扩增检测福氏痢疾杆菌是否为Fxb血清型的方法，该方法包括：利用包含为检测gtrII、oac、gtrV、gtrX基因的引物对进行单重扩增；优选还包括血清凝集方法检测待测菌株与单价血清IV或单克隆抗体MASF IV-1是否发生凝集的过程。
根据本发明提供的所述引物在制备福氏痢疾杆菌血清型检测用制剂中的应用，本发明中所述检测用制剂优选用于对分离的福氏痢疾杆菌菌株进行检测。根据本发明的具体实施方案，所述的检测用制剂可以是试剂盒。
本发明还提供了一种福氏痢疾杆菌血清型检测用试剂盒，该试剂盒包括本发明的所述引物。所述试剂盒还可以包括用于检测目标基因的目标检测探针，所述的探针优选为本发明如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和/或SEQ ID No.18所示的探针。本发明的试剂盒可用于定性检测福氏痢疾杆菌血清型。
综上所述，本发明提供了福氏痢疾杆菌血清型检测用引物，建立了基于福氏痢疾杆菌O抗原修饰酶基因的单重PCR检测方法。本发明的扩增引物以及单重扩增方法具有较高的特异性，鉴定时只需要菌株或样品的DNA作为模板，不需要分离单菌落；而且结果判定简易、客观，避免了血清免疫凝集反应中的主观性、不稳定性等问题。本发明的方法可作为血清凝集方法的补充和完善，用于福氏痢疾杆菌血清型的鉴定，对于及时、准确鉴定临床分离病原菌的血清型及细菌性痢疾的防治具有重要的实际意义和应用价值。
附图说明
图1显示标准菌株gtr基因PCR扩增结果。其中，I、II、oac、IV、V、X分别代表特异基因gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX扩增产物；DNA分子量标准为广谱DNA分子量标准(100～6,000)，1～8条带分别为6000bp、4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp。
图2显示PCR扩增特异性检测结果。其中，图片A、B、C、D、E、F分别为gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV和gtrX基因扩增结果；各图片中，1为阳性对照菌株，2～24分别为菌株S.dysenteriae(1)、S.boydii(1)、S.Sonnie(S)、S.Sonnie(R)、猪霍乱沙门氏菌(50109-3)、甲型副伤寒沙门氏菌(50001-24)、EAggEc(17-2)、EHEC(EDL933)、EPEC(234869)、大肠杆菌K12(HB101)、EHEC(Sakai)、ETEC(10407)、EIEC(44825)、鼠伤寒沙门氏菌(50013-6)、UPEC(CFT073)、大肠杆菌K12(MG1655)、EHEC(882364)、EAggEc(O42)、小肠结肠炎耶尔森菌(W/O)、霍乱弧菌(N16961)、鼠伤寒沙门氏菌(LT2)、单增李斯特菌(54003)、S.flexneriF6。DNA标准为广谱DNA分子量标准(100～6,000)，1～8条带分别为6000bp、4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp。
图3显示PCR扩增灵敏性检测结果。其中，图片A、B、C、D、E、F分别为gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV和gtrX基因扩增结果，特异基因的扩增模板分别为51571(S.flexneri 1a)、301(S.flexneri 2a)、51575(S.flexneri3b)、51576(S.flexneri 4a)、51247(S.flexneri 5a)、2002017(S.flexnerixb)；各图片中，1、2、3、4、5、6分别代表扩增20μl体系中模板DNA量为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg；DNA分子量标准为DL2,000TMDNA分子量标准，1～3条带分别为2000bp、1000bp、750bp。
图4显示特异基因的southern blot结果。其中，A：阳性对照菌株51576(4a)；B：阴性对照菌株2003036(Fy)；C：2002017(Fxb)；探针为51576菌株gtr IV基因扩增产物。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
菌株、培养条件和鉴定：
下列实施例中所用标准福氏痢疾杆菌菌株中，菌株号：51571、51572、51251、51575、51576、51577、51247、51246的菌株购自中国生物制品药品检定所，菌株号：2002110、2003036、2002014、2002017的菌株为2002～2003年间在中国河南省分离，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室保存；301菌株为1985年在中国北京昌平分离，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室保存。
用于特异性分析的菌株为商购标准菌株，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室收藏保存；
检测分析的福氏痢疾杆菌为2001～2006年间在中国河南省临床分离株，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室保存。
主要试剂及材料：
Tag DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶购自TaKaLa公司；
DNA回收纯化试剂盒为QIGEN公司产品；
染色体DNA提取试剂盒购自上海生工公司；
福氏痢疾杆菌群抗原和型抗原单价抗血清购自日本生研公司；
福氏痢疾杆菌群抗原和型抗原单克隆抗体购自瑞典Reagensia AB公司；
广谱DNA分子量标准(Wide Range DNA Marker)(100～6,000)为宝生物工程有限公司产品；
ECL直接标记和检测试剂盒(ECL direct labeling and detection system，RPN3000)为GE healthcare公司产品；
其它试剂均为分析纯。
实施例1、引物设计与单重PCR
1、引物设计：根据已经发表的gtrI(GenBank接受序列号：AF139596)、gtrII(GenBank接受序列号：AF021347)、oac(GenBank接受序列号：AF547987)、gtrIV(GenBank接受序列号：AF288197)、gtrV(GenBank接受序列号：U82619)、gtr X(GenBank接受序列号：L05001)基因序列，应用primer 5.0软件设计引物。选择退火温度接近的引物作为备选引物，以方便PCR扩增同时进行。本发明中所设计的优选的引物序列请参见下表1，这些引物的理论Tm值为55～58℃，这样保证了所有的扩增可以在同一退火温度下进行，提高了时效性。各引物委托上海生物工程公司合成。
表1实施例中所用的引物
| 基因名称 | 引物序列(5’→3’) | Tm(℃) | 扩增片段(探针)长度(bp) | 扩增片段(探针) |
| gtrI | 上游：SEQ ID No.1下游：SEQ ID No.2 | 55 | 1122 | SEQ ID No.13 |
| gtrII | 上游：SEQ ID No.3下游：SEQ ID No.4 | 55 | 1090 | SEQ ID No.14 |
| oac | 上游：SEQ ID No.5下游：SEQ ID No.6 | 55 | 700 | SEQ ID No.15 |
| gtrIV | 上游：SEQ ID No.7下游：SEQ ID No.8 | 58 | 960 | SEQ ID No.16 |
| gtrV | 上游：SEQ ID No.9下游：SEQ ID No.10 | 55 | 905 | SEQ ID No.17 |
| gtrX | 上游：SEQ ID No.11下游：SEQ ID No.12 | 58 | 935 | SEQ ID No.18 |
2、目的基因的单重PCR扩增：
DNA的提取：利用染色体DNA提取试剂盒提取细菌染色体DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
分别以标准菌株51571(S.flexneri 1a)、51572(S.flexneri 1b)、301(S.flexneri 2a)、51251(S.flexneri 2b)、2002110(S.flexneri 3a)、51575(S.flexneri 3b)、51576(S.flexneri 4a)、51577(S.flexneri 4b)、51247(S.flexneri 5a)、51246(S.flexneri 5b)、2003036(S.flexneri Y)、2002014(S.flexneri X)和2002017(S.flexneri xb)的染色体为模板，分别利用本发明表1中所列引物，PCR扩增gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX基因片段。
PCR反应体系：上、下游引物各1μmol、dNTP 10mmol、10×缓冲液(10×buffer)2.0μl、T ag DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的混合物(1∶1)0.2μl(1U)、DNA模板1μl(1mmol)，补充蒸馏水至20μl。
PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
3、结果：
在利用本发明的引物进行扩增时，不同引物对检测到所说的扩增产物表明样品中该引物所对应的特异性基因的存在。其他引物对未检测到所说的扩增产物表明样品中该引物所对应的特异性基因的不存在。检测扩增的方法包括但不限于：电泳。
PCR扩增产物经凝胶电泳，结果请参见图1所示，gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX基因扩增产物分别在约1100、1000、700、900、900和900bp位置有相应条带，与预期扩增片段长度相符(gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX基因预期扩增产物长度分别为1122、1090、700、960、905和935bp)。
PCR扩增产物纯化、测序及序列比对：PCR扩增产物经胶回收纯化后，送上海生物工程公司测序。所测序列与目的基因序列进行比对，经测序证实为目的片段。
本实施例中，进一步将以不同血清型的标准菌株DNA为模板PCR扩增gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX基因的结果与各标准菌株的血清凝集反应(痢疾杆菌常规在LB琼脂平板上培养，挑取单菌落进行群抗原和型抗原的血清学鉴定，操作按照产品说明书进行)进行比对分析，结果请参见下表2所示。
表2标准福氏痢疾杆菌菌株血清型及PCR扩增结果
*：与单价血清IV(日本生研公司)和单克隆抗体MASF-IV1(瑞典Reagensia AB公司)凝集，但与IV型特异性的单克隆抗体MASF-IV2(瑞典Reagensia AB公司)不发生凝集
由上表2可以看出，除Fxb血清型菌株外，其它血清型菌株血清型与PCR扩增结果一致，具有不同型/群抗原的血清型菌株其对应的特异基因均扩增阳性，而扩增阴性的特异基因均没有对应的型/群抗原表型。
据此，本发明提供的一具体的检测福氏痢疾杆菌血清型的方法可以为：
应用本发明的为检测目标基因gtrI、gtrII、oacg、trIV、gtrV和gtrX基因的六对扩增引物(例如SEQ ID No.1和2、SEQ ID No.3和4、SEQ IDNo.5和6、SEQ ID No.7和8、SEQ ID No.9和10、SEQ ID No.11和12)，以待测福氏痢疾杆菌菌株的染色体DNA为模板，分别进行单重PCR扩增。
根据PCR结果，即可鉴定该待测福氏痢疾杆菌菌株的血清型。例如(可参照表2所示内容，排除待测福氏痢疾杆菌菌株血清型为F1c或F6，或确定待测福氏痢疾杆菌菌株血清型属于表2所列13种血清型)：
当为检测gtrI基因的引物对扩增阳性(利用为检测gtrI基因的引物对如SEQ ID No.1和2扩增，扩增产物中检测到该引物对所对应的特异性基因gtrI的存在)、而其他五对引物对扩增阴性(利用某一引物对扩增，扩增产物中未检测到该引物对所对应的特异性基因存在)，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F1a血清型；
当为检测gtrI、oac基因的引物对扩增阳性、而其他四对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F1b血清型；
当为检测gtrII基因的引物对扩增阳性、而其他五对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F2a血清型；
当为检测gtrII、gtrX基因的引物对扩增阳性、而其他四对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F2b血清型；
当为检测oac、gtrX基因的引物对扩增阳性、而其他四对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F3a血清型；
当为检测oac基因的引物对扩增阳性、而其他五对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F3b血清型；
当为检测gtrIV基因的引物对扩增阳性、而其他五对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F4a血清型；
当为检测oac、gtr IV基因的引物对扩增阳性、而其他四对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F4b血清型；
当为检测gtrV基因的引物对扩增阳性、而其他五对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F5a血清型；
当为检测gtrV、gtrX基因的引物对扩增阳性、而其他四对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为F5b血清型；
当所述六对引物对均扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为Fy血清型；
当为检测gtrX基因的引物对扩增阳性、而其他五对引物对扩增阴性，可以鉴定所测福氏痢疾杆菌菌株为Fx或Fxb血清型。
Fxb是近年来在中国流行的福氏血清型，在2001年首次出现，随后四年内取代F2a成为中国优势血清型，其分离率最高达到48％。本发明中通过相关实验表明，Fxb血清型菌株2002017与单价血清IV(日本生研公司)凝集，但与IV型特异性的单克隆抗体MASF-IV2(瑞典Reagensia AB公司)不发生凝集反应，而且gtrIV基因PCR扩增阴性；本发明在后续的实施例中通过Soutern杂交也证实了2002017菌株基因组上没有gtrIV基因(详见实施例5)。所述Fxb菌株与Fx菌株的区别在于Fxb菌株能够与单价血清IV或单克隆抗体MASF IV-1发生凝集，而Fx血清型菌株不发生凝集。
因此，当上述应用本发明中所述六对引物进行单重扩增，为检测gtrX基因的引物对扩增阳性、而其他五对引物对扩增阴性时，如需进一步鉴定所测菌株为Fx或Fxb血清型，可进一步应用血清凝集方法检测其是否与单价血清IV或单克隆抗体MASF IV-1发生凝集。如不发生凝集，则可鉴定为Fx血清型；如发生凝集，则可鉴定为Fxb血清型。
可以理解，在已知待测福氏痢疾杆菌菌株型部分信息的前提下，或者在只需鉴定待测菌株是否为某血清亚型时，可以仅利用本发明的部分引物对进行扩增检测，以确定具体的血清亚型。例如，在已经待测福氏痢疾杆菌菌株为F1型，在确定其具体为F1a或是F1b血清亚型时，仅利用本发明的为检测oac基因的引物对进行扩增，根据扩增结果即可鉴定其为F1a或是F1b血清亚型。再如，在检测待测福氏痢疾杆菌菌株是否为所述的Fxb血清型时，可以仅利用本发明的为检测gtrII、oac、gtrV、gtrX基因的引物对进行单重扩增，并辅助血清凝集方法；当为检测gtrX基因的引物对扩增阳性，而为检测gtrII、oac、gtrV基因的引物对扩增阴性，且待测菌株与单价血清IV或单克隆抗体MASF IV-1发生凝集，则可以鉴定为所述Fxb血清型。所属领域的技术人员在本发明的基础上可以直接推导或通过适当变更而得出的各种实施方式均应包含在本发明的范围内，在此不再用文字一一赘述。
本实施例表明，本发明的引物可以用于福氏痢疾杆菌菌株血清型的检测和鉴定，应用本发明引物的扩增检测可作为血清凝集方法的补充和完善，能及时、准确鉴定福氏痢疾杆菌的血清型。
实施例2、PCR扩增特异性检测
为检测本发明所述引物PCR扩增特异性，本实施例中，分别提取菌株S.dysenteriae(1)、S.boydii(1)、S.Sonnie(S)、S.Sonnie(R)、猪霍乱沙门氏菌(50109-3)、甲型副伤寒沙门氏菌(50001-24)、EAggEc(17-2)、EHEC(EDL933)、EPEC(234869)、大肠杆菌K12(HB101)、EHEC(Sakai)、ETEC(10407)、EIEC(44825)、鼠伤寒沙门氏菌(50013-6)、UPEC(CFT073)、大肠杆菌K12(MG1655)、EHEC(882364)、EAggEc(O42)、小肠结肠炎耶尔森菌(W/O)、霍乱弧菌(N16961)、鼠伤寒沙门氏菌(LT2)、单增李斯特菌(54003)、S.flexneriF6的染色体DNA作为模板，应用本发明如SEQ IDNo.1和2、SEQ ID No.3和4、SEQ ID No.5和6、SEQ ID No.7和8、SEQID No.9和10、SEQ ID No.11和12所示六对引物分别进行PCR扩增，并分别以标准菌株51571(S.flexneri 1a)、301(S.flexneri 2a)、51575(S.flexneri3b)、51576(S.flexneri 4a)、51247(S.flexneri 5a)、2002017(S.flexnerixb)作为gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX基因的阳性对照。
PCR扩增体系：上、下游引物各1μmol、dNTP 10mmol、10×缓冲液2.0μl、Tag DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的混合物(1∶1)0.2μl(1U)、DNA模板1μl(1mmol)，补充蒸馏水至20μl。
PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
PCR产物进行凝胶电泳，以判断扩增产物的有无与大小。
PCR扩增特异性检测结果请参见图2以及下表3所示。结果显示，在相应的扩增体系和扩增条件下，阳性对照的福氏痢疾杆菌中均能扩增得到预期的片段和特异基因组合(图2中图片A、B、C、D、E、F中的泳道1)，而其它菌株PCR扩增结果均为阴性(图2中图片A、B、C、D、E、F中的泳道2～24，表3)。证明利用本发明的引物进行PCR扩增具有很高的特异性。
表3用于特异性分析的菌株及特异基因PCR扩增结果
实施例3、PCR反应敏感性检测
PCR反应的敏感性用ng/反应来表示，即每个反应中能检测到的最低DNA质量浓度来表示。将标准菌株51571(S.flexneri 1a)、301(S.flexneri2a)、51575(fl.flexneri 3b)、51576(fl.flexneri 4a)、51247(S.flexneri 5a)、2002017(S.flexneri xb)基因组DNA测定OD260的光吸收，换算为质量浓度。进行10倍系列稀释，浓度范围为每20μl反应体系DNA量1pg、10pg、100pg、1ng、10ng。分别以本发明的引物对(如SEQ ID No.1和2、SEQ IDNo.3和4、SEQ ID No.5和6、SEQ ID No.7和8、SEQ ID No.9和10、SEQID No.11和12所示)进行单重PCR扩增。
PCR反应体系：上、下游引物各1μmol、dNTP 10mmol、10×缓冲液2.0μl、Tag DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的混合物(1∶1)0.2μl(1U)、DNA模板1μl(1mmol)，补充蒸馏水至20μl。
PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
PCR产物进行凝胶电泳，检测PCR反应敏感性。
PCR反应敏感性检测结果请参见图3所示，本发明中不同引物对PCR扩增的灵敏性不同，gtrI、gtrV基因引物对(SEQ ID No.1和2、SEQ ID No.9和10)特异基因检测的最低DNA浓度为10ng/20μl；而oac、gtrIV和gtrX基因引物对(SEQ ID No.5和6、SEQ ID No.7和8、SEQ ID No.11和12)特异基因检测的最低DNA浓度为1ng/20μl；gtrII基因引物对(SEQ ID No.3和4)最低检测浓度为100pg/20μl。
实施例4、临床分离福氏痢疾杆菌菌株血清型分子标识的PCR检测
分别选取临床分离福氏痢疾杆菌的不同血清型菌株单菌落，采用日本生研公司的抗血清，进行血清凝集反应检测菌株的群抗原和型抗原，确定菌株的血清型，分别为：F1a(4株)、F1b(5株)、F2a(8株)、F2b(2株)、F3a(2株)、F3b(1株)、F4a(1株)、F5b(3株)、Fy(6株)、Fxb(38株)、Fx(29株)。
提取上述菌株的染色体DNA作为模板，利用本发明的引物对(如SEQID No.1和2、SEQ ID No.3和4、SEQ ID No.5和6、SEQ ID No.7和8、SEQID No.9和10、SEQ ID No.11和12所示)，分别PCR扩增gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX基因，特异基因PCR扩增结果请参见下表4所示。
根据PCR扩增结果判断菌株血清型，并与血清凝集鉴定结果进行比较。血清型与PCR结果矛盾的菌株，采用瑞典Reagensia AB公司的单克隆抗体进行鉴定。
表4检测用福氏痢疾杆菌菌株血清型及特异基因PCR扩增结果
在本实施例所有99株福氏痢疾杆菌中，除了38株Fxb菌株外，其它菌株的血清型与其特异基因组合一致；38株Fxb菌株其血清凝集反应、gtrIV基因的PCR扩增与实施例1中2002017菌株一致。
实施例5、特异基因的southern blot检测
本实施例中，将与单价血清IV发生凝集但gtrIV基因PCR扩增阴性的Fxb血清型2002017菌株，以F4a血清型标准菌株51576的gtrIV基因扩增产物(其序列如SEQ ID No.16所示)为探针进行特异基因的Southern blot分析。选取51576(4a)菌株作为阳性对照，以2003036(Fy)菌株作为阴性对照。
首先进行2002017(Fxb)、2003036(Fy)和51576(4a)菌株DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)，PFGE参照Ribot等的方法进行(Ribot，E.M.et al.Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for thesubtyping of Escherichia coli O 157：H7，Salmonella，and Shigella for PulseNet.Foodborne Pathog Dis 3，59-67，doi：10.1089/fpd.2006.3.59(2006))。
2002017(Fxb)、2003036(Fy)和51576(4a)菌株DNA经PFGE后，PFGE胶上DNA片段转移采用真空转移法转移至尼龙膜上，以标记的gtrIV基因扩增片段为探针进行杂交(采用ECL direct labeling and detectionsystem进行探针标记及检测)。
特异基因的southern blot检测结果请参见图4所示，其中，2002017(Fxb)、2003036(Fy)均没有发现杂交条带；而阳性对照菌株51576(4a)在相应的位置出现杂交条带，提示Fxb菌株中没有gtr IV基因。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>福氏痢疾杆菌血清型检测用引物及其应用
<130>GAI09CN0700C
<160>18
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ctgttaggtg atgatggctt ag 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
attgaacgcc tccttgctat gc 22
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<211>23
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<220>
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tgcgacatta ctttctccct gag 23
<210>4
<211>22
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tagttgccac catcccacca aa 22
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<211>22
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ccagtgggtc gccaacggat gt 22
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ctgttcggct ttgaaagtgc tg 22
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acagttctca catgatggca ca 22
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aatgcaacag gaatcctcac ag 22
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aatacgattc tcctggtgct aaac 24
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tagggcattg cttgtatctt tcat 24
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taccttgacc cgtttccg 18
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tggcttaggc gcattgac 18
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<212>DNA
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<223>探针
<400>13
ctgttaggtg atgatggctt agtagcatta agattatcaa ctgcagtttt ctctattgct 60
atagtaatag cagcgatgtt aacgctacgt aaggcattcg ggtttacccc tgctttattt 120
tctattatac ttctatctct aataccatat ttttcataca cttatggttt tgtatcacat 180
cctttttctc ataattcaac aaacgctttc ggctttttat gcttgcttat atctgttttc 240
aacatacagt ataaaaatat atttatcact ctcctcttaa gtttgacagc attattttcc 300
agcgtatccg atccgtggtt tacagctgca ttttttattc cactattaat atcttacttt 360
ttattctctg tatgggataa aaaattattt aagcatactg cattaatact atttgcatgt 420
ttaatctctc tttccaatgt attgcaaaat ctacttaaca tacctcccca ccaatttgaa 480
attgtatcac tcaatgatat gattttaaat gcaaaatggt gcattctgtt aataggaaaa 540
agtcttaatt tattagttgt cgacaataac gcaacatctt acgcctcatt tgtcatttgg 600
ttcattgcca ttattacatc tgcgtggttt gttttatcgg acaataaaaa aaacacatac 660
cgtatttata ttgtgttatt ttcattatta tctatcgcag gtattgtctc atcattcata 720
ctgagctata aatcccctga ttatattagc atgcgtttct ttatgaatgt tacctgtttc 780
gcactgatat tgtgctgtat cggtacatca acaaaagcaa agatattatt ttatctaatc 840
gcatttttat tttcgatcag ttcaattaaa tcttacacaa ataatgcttc accattacac 900
gatcaggaga agattgttaa atcatacatt gattttttaa aaaaaaataa tctccattat 960
gggtacggct ctttttggga tttgtcaatg actgtaaatt ggttatctgg tggggacata 1020
cagataactc ctgttttctt taatgctgat tcggggaaaa ttaactttac tggcgtgaga 1080
caacagacac tggcttcttg gcatagcaag gaggcgttca at 1122
<210>14
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<212>DNA
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<220>
<223>探针
<400>14
tgcgacatta ctttctccct gagccttttt cactttatat aacaccatta atagccttat 60
cttttatcat catttcagca tttataatct gcagatcgct aaagctagaa tcttatgaat 120
tattgatagg tatgttagta tttattacct tccctcagat ctcctatcaa ttagagtttc 180
ttaaccaagc tgatactgtg ggaattgctt ttctactggc agcgatatca gcaattattt 240
ttcactcgca aaaaaatagg attgtgatat tttctggtat agtactgtcc attctttcaa 300
tggcaatcta ccaaacattc gtaacatata ttattgcatt cgtcattggg ttgcagataa 360
attcgataat acgaaatgag aaaaatattc gtgaatcttt ttatagttca tgtttatctc 420
tatccctcat agctttatct accttaattt acctgctatt aaccaaagct atcaagcatt 480
atttttcgct tgaatcgaac gagtacatct caaattatat acaaaatgca agcgatatta 540
aatggcttgt taaatcagcc atagataata tatataactt ctataacaat cctcccactg 600
gtttaaacct atacaagtgg ttactgattc ctttattaat tctgatattt accctaacat 660
ataaattaaa aacaagatca atttatttga tttcatcaat cattttcatt tatatacttc 720
cggttatatt tatcgttgtt gttggctcag gggcgccacc tcgcctgttt gttttaatgc 780
ctatagtagc agtaattttg ttttcttgct taagcaattt tcgctctata aaatacctaa 840
actgcatgtt ttttttattt attatattta atggcgtttc aacatccaaa aatctatttt 900
tgaatgatac tctcgcaaga cagaaagata tctctttagc taaagaaata tcatacacat 960
ctcaaacaaa aggcatttcc cttaacggaa aatatatata tatacatggt tcaaacgact 1020
caggaaatat gctctccatg agcgcagaca cttttggaaa atcttttttt tggtgggatg 1080
gtggcaacta 1090
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<223>探针
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ccagtgggtc gccaacggat gtgcatatgg ctattgtcga gaatgaaacc aggatatagc 60
aagtcatagt ataatcaatg cctttgccat aactagcgta ggcgtacata gcaagcaaag 120
aaactacagt aattttaaca ttacttacat tccatgactt ctcatacatt gccatagtgg 180
caccaaaaaa gaacgccagt ccacgcaaag gatacagcca taacggaata gagaacatta 240
catccctgtt ttctgacaca cttccaatta atgaaagaga aacaaaaacc aacagtataa 300
ctatgaatgc ttttccgttc tttagtaggg caactgctac tcccgttatt atataacaca 360
ggaactcaag cggtagggtc cacaaactgc cgttaattcc ggcatgaatt aaatgtgatg 420
taatgtcagc atctggagcc tgactcataa aaatagagct tatggtcttc ctgacaatgt 480
catggctaaa atattctgcg ctgaagtcgt taagtatcca tccaaataaa aaatatgtca 540
gtatagagca agggaccagc gccgggaata ttcttctcgc tcttttagcc atgaaatcaa 600
taaaggaatc actcctgata gctgattttg aaatcagata tcctgatatt gaaaagaata 660
tgataactgc aatgccgcca gcactttcaa agccgaacag 700
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<220>
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<400>16
acagttctca catgatggca cattacttta taccctgaag gaaaatttca gttcaattgt 60
gaactatgag tataaaagct cattcagtta tattctttat ttatacgctt atgttatatc 120
gatattcaca cacacatttg atcttaggtt atggtcatct ctttccaaaa tcgtgtatat 180
ttgtgcgtta tataaactat ttgtagaaat aaacaataaa aaatattctt atcttttatt 240
tccggtatca gcattattgc tatttactcc ttccatactt tcacaattca cagcatttta 300
tcaggatcaa atagtaatca ctttacttcc ggtaattact tatataattc ttaaaaaaga 360
aatatcaagg tttgataaag tattactagt tgcatgcgca gcgctaatcg ccacatcaaa 420
atctcagttc ttctatattc ccattttaat ttctttaatt tcaataatat ttattgacat 480
aagagataaa aaatttcact tagctatggt aattgcgacg ataattgcat tgtcattttc 540
atttttctcg ccaagcgcaa ctaaaaataa cagctatcac tccctttatt tcgggacttt 600
gctatacaat aaaagcaatg gaaaagaaaa tccatcgtgg gccgtggacg aatgcattgg 660
tgttgatgca tggggaaata aatttgattt agataaggga gctgttacca cagaagatgc 720
tggagcctgc ttcgcaaaaa ataaagaaag gggattgaag gattctttgc ttttgatgct 780
aaagcaacct tccatgttcc tccttcttcc ttttgattct ggagttcgaa cccaattaac 840
tgaagattac ttccatgtct tcaaggaaaa taagctaata ataagtaaga gtgttttttt 900
gaatgaagtt caaaaaataa aagactctgc tctatcaact gtgaggattc ctgttgcatt 960
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<212>DNA
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<223>探针
<400>17
aatacgattc tcctggtgct aaactttcaa attttttaac ttgctctttc cacccgtaat 60
ctgggagtgg ggtaagattg aaaaaatata aacatgagat taacgatgtt gtatataata 120
tccatggtag gaatttaaag tccaactggg aaatatggtt taagaagtaa accaatacag 180
agtaccatat aattgttggt atgacagaat atcttccccc gccatgaatt aataatggcc 240
attgctcact tgtagaagaa agcattggtt ttgctagtga aaacgttaat gttagtattg 300
cgaaaactat tgccgagcgc atggggtaat tggaaacaat aaatgtaaaa atagtgatgg 360
aaagacaaat cattgtaatt gcaatgcaaa ttgaatcatg attccataaa ggtggcaaaa 420
agtcaccatt agcccataaa cccagaaaaa cctttgttgt taatattttg caaagtgttg 480
cgaaattagc tccaagaacc atatcaactc tggtctcaga ggatgtcatg ataatagaaa 540
taaattgaat caaacaaata gcaatgaaaa cgtattcgtg agtggtgatt ttttttgtag 600
ataagcgttt ttgtataagt atatttatcc ctaccattgg agccatgaac actataaatg 660
ggccacttag tccacatatg attatcgcta tataatcgtg tgctttttga taattatttg 720
taggctttgg agctaacata acaagaagta aatatagtga taaataccaa tgatcattag 780
taacattggc gtgcacttct gatacttccg gcattgttat aataaacaaa gcagtaaata 840
ttcttggtgt tatgtttacg taactaaatc ttccagagag tatgaaagat acaagcaatg 900
cccta 905
<210>18
<211>935
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>4
taccttgacc cgtttccggt tgcaagtgtt ggcagttgag gaacagaatc tgccagttga 60
ggttttgcca tagaaaatgc gacaataagt attggaaggg tggcaaacac tttcatttgc 120
caatttcctt taatataaat gaaaacacat aatgtaatta ctaaagttga tagtgtgtac 180
gataaaaggt gattatccca tccagcatta gcgatattcc aagggacaaa tgaaaaaaga 240
aatacattag atgatattat agatgacata acatcaaaac tgaatcctaa tggagcatgt 300
gatcttgttc cattaaatgt aagaattatt gatgttgcct gtatcagccc acacaagatc 360
attgccaaat atggcagtcg agtataaaat aagtataaac ctcttatgct tattactcct 420
tttgataagt gtaaatattt aaaaacagat gatgcaatta tgaatataat aaatggaccg 480
ctcaatccag ataatactat aaaaaataaa tcatgtgctt tccataattt tgacttggat 540
tcttcagata ttattatcat tgcaacatac aatgataaat accagtgagc atttgttata 600
ttggcttgga cttcatcaag cccgggcatg caaattaaat atacagagat gaagattttt 660
gatgtggtgc ttaggaattt aaatctatcg gtaaataaga accatataat tatagctcta 720
attattattc caaaaaagtt tgataataat ggtgcgtaaa ttggattaat aaatgtcgtc 780
gcaccaacaa tgagtgttga tactgtttga aaataaccat ttcttggggt tatgagtgaa 840
ctgaaaaaac cttgttcgta tgcatcttta taccaaaaaa ctgcatcctc agcccaaaac 900
tgggcatttg tcaaaatgtc aatgcgccta agcca 935
Claims (5)
1.福氏痢疾杆菌血清型检测用引物，其包括分别为检测以下目标基因：gtr I、gtrII、gtr IV、gtr V、gtrX和oac基因的扩增引物；
所述引物包括：
SEQ ID No.1和2；
SEQ ID No.3和4；
SEQ ID No.5和6；
SEQ ID No.7和8；
SEQ ID No.9和10；和
SEQ ID No.11和12。
2.权利要求1所述的引物在制备福氏痢疾杆菌血清型检测用制剂中的应用。
3.权利要求1所述的引物在制备福氏痢疾杆菌血清型检测用试剂盒中的应用。
4.一种福氏痢疾杆菌血清型检测用试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。
5.根据权利要求4所述的检测用试剂盒，该试剂盒还包括以下标记或未标记的探针：SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和/或SEQ ID No.18。
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- 2009-04-14 CN CN2009100821271A patent/CN101532057B/zh not_active Expired - Fee Related
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