KR102145657B1 - 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스의 전체 유전자를 진단하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 SFTS 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르는 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 전체 유전자를 대상으로 하여 보존 영역에 상보적으로 결합할 수 있어 다양한 SFTS 바이러스 분리주에 대하여 유의적인 PCR 증폭이 가능할 것으로 기대할 수 있으며, 따라서 SFTS에 대한 정확하고 신속한 진단이 가능하다.
본 발명에 따르는 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 전체 유전자를 대상으로 하여 보존 영역에 상보적으로 결합할 수 있어 다양한 SFTS 바이러스 분리주에 대하여 유의적인 PCR 증폭이 가능할 것으로 기대할 수 있으며, 따라서 SFTS에 대한 정확하고 신속한 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스의 전체 유전자를 진단하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 SFTS 진단 방법에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTS virus)에 의한 감염병으로, SFTS 바이러스에 감염된 매개체인 진드기가 숙주를 물어 바이러스를 숙주로 옮겨 나타나는 질병이다. 이에 대한 추정 매개체는 작은소참피진드기(Haemophysalis longicornis)로 알려져 있으며, 인간 뿐 아니라 소, 염소, 양, 원숭이, 돼지, 사슴, 고양이 또는 쥐와 같은 포유류에서 SFTS 바이러스 감염이 나타나는 것으로 보고된 바 있다.
SFTS를 유발하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(SFTS 바이러스)는 부니아바이러스과(Bunyaviridae)의 플레보바이러스속(Phlebovirus)에 속하며, 2009년 중국에서 최초로 분리 및 보고된 RNA 바이러스이다. SFTS 바이러스는 직경 80 내지 100 ㎚의 구형 바이러스 형태를 가지며, 총 3개의 절편(segment)로 구성된 단일 가닥의 RNA 게놈을 가지고 있다. 상기 절편으로는 총 길이 1744 bp의 S 절편(뉴클레오캡시드 단백질, 비구조 단백질을 암호화), 총 길이 3378 bp의 M 절편(2 가지 당단백질을 암호화) 및 총 길이 6368 bp의 L 절편(RNA 의존적인 RNA 합성 효소를 암호화)으로 이루어지는 것으로 공지된 바 있다.
SFTS 바이러스에 감염되면, 1 내지 2주 간의 잠복기를 거친 후, 감기와 비슷한 두통, 고열, 기침, 발열과 같은 증상이 나타나면서, 림프절 종창(염증, 종양으로 곪거나 부어오름), 혈뇨, 피로감, 의식저하, 구토 및 설사 등의 다양한 증상을 동반하고, 치사율이 6 내지 30%에 이르는 심각한 질환인 것으로 알려져 있다. 진드기에 의해 매개되는 특징에 따라, 감염군은 80 내지 97%가 주로 농업 또는 임업 종사자인 것으로 보고되었고, 4월에서 11월에 진드기가 활동함에 따라 5월에서 8월 사이에 집중적으로 환자가 발생한다.
국내에서는 2012년 08월 강원도 춘천에서 SFTS 환자가 첫 발생됨이 보고된 이후, 2013년부터 지속적으로 환자의 수가 증가하여, 2013년 09월에는 보건복지부 제 4군 감염병으로 지정되어 이에 대한 진단 및 치료 방법의 연구가 시급함이 인정되었다. 현재 SFTS의 진단은 혈청학적인 검사를 통하여 이루어지고 있으며, 혈청항체가를 확인하여 진단하는 방법이 주를 이루고 있다. 그러나, 이러한 혈청항체가 확인을 위하여는 대조 검체 실험이 필요하거나, 예방 접종을 통해 면역 형성이 이루어져 항체가 형성되어야 하는 등의 기반 조건들이 마련되어야만 하므로, 정확하고 신속한 진단이 이루어지지 않는다는 한계를 가진다. 따라서, SFTS 바이러스를 높은 정확도로 신속하게 진단하는 방법을 확립하기 위해, 전체 유전자를 이용한 진단 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 SFTS 바이러스의 전체 유전자를 검출하는 효과적인 SFTS 진단 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, SFTS 바이러스의 전체 유전자 서열을 기반으로 하여 보존영역을 확인하고 이에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍을 총 18쌍으로 디자인하였으며, 이를 이용하여 SFTS 감염 환자로부터 분리된 SFTS 바이러스 RNA를 대상으로 PCR 반응을 수행하였을 때, 유의적으로 PCR 산물이 증폭될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상술한 바와 같이, 국내에서 SFTS 감염 환자가 증가되는 것으로 보고됨에 따라 정확하고 신속하게 SFTS 바이러스를 검출하는 방법의 개발이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 a) 내지 r)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다:
a) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
b) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
c) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
d) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
e) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
f) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
g) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
h) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
i) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
j) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
k) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
l) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
m) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
n) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
o) 서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
p) 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
q) 서열번호 33의 정방향 프라이머 및 서열번호 34의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
r) 서열번호 35의 정방향 프라이머 및 서열번호 36의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 a) 내지 c)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 S 절편(small segment, S segment)에 상보적으로 결합하며, 상기 d) 내지 h)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 M 절편(Medium segment, M segment)에 상보적으로 결합하고, 및 상기 i) 내지 r)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 L 절편(Large segment, L segment)에 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)를 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:
i) 중증 열성 혈소판 감소 증후군의 감염이 의심되는 환자에서 분리된 시료에서 바이러스성 RNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리한 바이러스성 RNA를 주형으로 하고, 제 3항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
iii) 상기 단계 iii)의 PCR 증폭 산물을 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 시료는 조직, 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 정액 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)의 PCR 증폭 산물의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 SFTS는 한국에서 분리된 SFTS 바이러스 분리주에 의해 감염되는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 총 18 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 쌍 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 SFTS 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따르는 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 전체 유전자를 대상으로 하여 보존 영역에 상보적으로 결합할 수 있어 다양한 SFTS 바이러스 분리주에 대하여 유의적인 PCR 증폭이 가능할 것으로 기대할 수 있으며, 따라서 SFTS에 대한 정확하고 신속한 진단이 가능하다.
도 1은 국내외에서 분리된 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스의 S 절편(small segment) 염기서열을 배열 분석(aligment)한 결과이다.
도 2는 국내외에서 분리된 SFTS 바이러스의 M 절편(Medium segment) 염기서열을 배열 분석한 결과이다.
도 3은 국내외에서 분리된 SFTS 바이러스의 L 절편(Large segment) 염기서열을 배열 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 총 18 쌍의 프라이머가 각각 상보적으로 결합하는 SFTS 유전체 부위 및 이에 따라 증폭되는 유전체 부위를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 총 18 쌍의 프라이머를 각각 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 a) 내지 c)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 a) 내지 c)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 d) 내지 h)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 i) 내지 r)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 국내외에서 분리된 SFTS 바이러스의 M 절편(Medium segment) 염기서열을 배열 분석한 결과이다.
도 3은 국내외에서 분리된 SFTS 바이러스의 L 절편(Large segment) 염기서열을 배열 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 총 18 쌍의 프라이머가 각각 상보적으로 결합하는 SFTS 유전체 부위 및 이에 따라 증폭되는 유전체 부위를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 총 18 쌍의 프라이머를 각각 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 a) 내지 c)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 a) 내지 c)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 d) 내지 h)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 SFTS 유전체 염기서열을 대상으로 하고, 본 발명에서 제공하는 i) 내지 r)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 서열분석 후, Blast 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 국내에서 SFTS 감염 환자가 증가되는 것으로 보고됨에 따라 정확하고 신속하게 SFTS 바이러스를 검출하는 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명에 따르는 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 전체 유전자를 대상으로 하여 보존 영역에 상보적으로 결합할 수 있어 다양한 SFTS 바이러스 분리주에 대하여 유의적인 PCR 증폭이 가능할 것으로 기대할 수 있으며, 따라서 SFTS에 대한 정확하고 신속한 진단이 가능하다.
따라서, 본 발명은 하기 a) 내지 r)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다:
a) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
b) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
c) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
d) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
e) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
f) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
g) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
h) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
i) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
j) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
k) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
l) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
m) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
n) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
o) 서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
p) 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
q) 서열번호 33의 정방향 프라이머 및 서열번호 34의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
r) 서열번호 35의 정방향 프라이머 및 서열번호 36의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 SFTS 검출용 조성물에 있어서, 상기 a) 내지 r)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 전체 유전자 서열 중 보존 영역에 상보적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 a) 내지 c)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 S 절편(small segment, S segment)에 상보적으로 결합하며, 상기 d) 내지 h)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 M 절편(Medium segment, M segment)에 상보적으로 결합하고, 및 상기 i) 내지 r)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 L 절편(Large segment, L segment)에 상보적으로 결합할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 프라이머 세트 중, a)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 S 절편(small segment, S segment)의 1 내지 615 번째 서열을 증폭할 수 있고, b)의 프라이머 세트는 S 절편의 514 내지 1164 번째 서열을 증폭할 수 있으며, c)의 프라이머 세트는 1076 내지 1744 번째 서열을 증폭할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트 중, d)의 프라이머 세트는 M 절편(Medium segment, M segment)의 1 내지 775 번째 서열을 증폭할 수 있고, e)의 프라이머 세트는 M 절편의 673 내지 1406 번째 서열을 증폭할 수 있으며, f)의 프라이머 세트는 M 절편의 1314 내지 2093 번째 서열을 증폭할 수 있고, g)의 프라이머 세트는 M 절편의 1953 내지 2637 번째 서열을 증폭할 수 있으며, h)의 프라이머 세트는 M 절편의 2514 내지 3378 번째 서열을 증폭할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트 중, i)의 프라이머 세트는 L 절편(Large segment, L segment)의 1 내지 656 번째 서열을 증폭할 수 있고, j)의 프라이머 세트는 L 절편의 569 내지 1328 번째 서열을 증폭할 수 있으며, k)의 프라이머 세트는 L 절편의 1297 내지 1406 번째 서열을 증폭할 수 있고, l)의 프라이머 세트는 L 절편의 1903 내지 2536 번째 서열을 증폭할 수 있으며, m)의 프라이머 세트는 L 절편의 2490 내지 3188 번째 서열을 증폭할 수 있고, n)의 프라이머 세트는 L 절편의 3135 내지 3836 번째 서열을 증폭할 수 있으며, o)의 프라이머 세트는 L 절편의 3746 내지 4457 번째 서열을 증폭할 수 있고, p)의 프라이머 세트는 L 절편의 4397 내지 5100 번째 서열을 증폭할 수 있으며, q)의 프라이머 세트는 L 절편의 4994 내지 5668 번째 서열을 증폭할 수 있고, r)의 프라이머 세트는 L 절편의 5603 내지 6368 번째 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 한국에서 분리된 SFTS 분리주 바이러스의 전체 염기서열을 분석하고, 이를 공지된 국내외 분리주 염기서열과 비교하여 보존 영역을 확인하였다(도 1 내지 도 3). 이에, 보존영역에 상보적으로 결합할 수 있는 총 18 쌍의 프라이머 쌍을 디자인하였다(표 1 및 도 4).
또한, 본 발명자들은 상기 한국에서 분리된 SFTS 분리주 바이러스의 전체 염기서열을 주형으로 하고, 본 발명에서 디자인한 프라이머 쌍을 각각 사용하여 PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 유의적으로 PCR 산물이 증폭되어 전기영동을 통해 아가로즈 젤에서 밴드를 확인할 수 있음을 확인하였다(도 5).
또한, 본 발명자들은 상기 PCR 산물의 서열을 분석한 결과, PCR 반응의 주형인 바이러스 RNA 서열이 유의적으로 증폭할 수 있음을 확인하여(도 6 내지 도 8). 본 발명의 프라이머 쌍을 사용하여 유의적인 SFTS 바이러스 유전체 증폭이 가능할 것으로 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따르는 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 전체 유전자를 대상으로 하여 보존 영역에 상보적으로 결합할 수 있어 다양한 SFTS 바이러스 분리주에 대하여 유의적인 PCR 증폭이 가능할 것으로 기대할 수 있으며, 따라서 SFTS에 대한 정확하고 신속한 진단이 가능하다.
또한, 본 발명은 하기 i) 내지 iii)의 단계를 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:
i) 중증 열성 혈소판 감소 증후군의 감염이 의심되는 환자에서 분리된 시료에서 바이러스성 RNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리한 바이러스성 RNA를 주형으로 하고, 제 3항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
iii) 상기 단계 iii)의 PCR 증폭 산물을 확인하는 단계.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 단계 i)의 시료는 조직, 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 정액 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 환자 유래의 혈액 또는 혈청 시료를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 단계 iii)의 PCR 증폭 산물의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 SFTS는 SFTS 바이러스 분리주에 의해 감염되어 유발되는 질병을 지칭하며, 상기 SFTS 바이러스 분리주는 국내에서 분리된 SFTS 바이러스일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 국내외 분리주에서 공통 서열을 포함하는 보존 영역에 대하여 상보적인 결합이 가능하므로, 국내외 분리주 모두에 대한 검출 및 SFTS 진단이 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
바이러스 시료의 확보
본 발명의 대상 바이러스 DNA를 확보하기 위하여, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 환자로부터 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스(SFTS virus)의 유전체 DNA를 확보하였다. 2017년 제주도에서 SFTS로 진단(제주 한라 병원)받은 70 대 여성의 환자를 대상으로 하여, 상기 환자의 혈청 시료로부터 SFTS 바이러스 검체를 수득하였다.
수득한 검체로부터 QIA Amp Viral RNA Mini Kit(Qiagen GmbH, Germany)를 사용하여 바이러스의 RNA를 추출하였다. 추출한 바이러스 RNA는 전체 염기서열 분석을 수행하여 한국에서 분리된 SFTS 바이러스의 전체 염기서열로서 사용하였다.
SFTS 특이적 프라이머의 제작
상기 [실시예 1]에서 분석한 염기서열을 국내 SFTS 바이러스 분리주의 염기서열로 사용하고, 이 외 국내외에서 분리된 SFTS 바이러스 염기서열을 수집하여 이에 특이적인 프라이머 서열을 구축하고자 하였다. 국내외에서 분리된 SFTS 바이러스 염기서열은 Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)로부터 수집하고, CLC Main Workbench 7 프로그램을 이용해 각각의 분리주 서열 중 S 절편, M 절편 및 L 절편의 염기서열을 정렬한 다음, 이 중 SFTS 바이러스 RNA의 보존영역(conserved region)을 확인하였다(도 1 내지 도 3). 확인한 보존영역을 바탕으로 하여, 하기 [표 1]에 개시된 바와 같이 총 18 쌍의 프라이머를 디자인하였다.
SFTS 특이적 프라이머쌍을 이용한 SFTS 바이러스 유전자의 증폭
SFTS 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 상기 [실시예 2]에서 제작한 프라이머쌍을 이용하여 유전자를 증폭하였다.
구체적으로, 상기 [실시예1]에서 수득한 국내 분리주의 SFTS 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 상기 [표 1]의 각각의 프라이머쌍 및 One step RT-PCR 키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 RT-PCR 반응을 수행하였다. 상기 RT-PCR 반응을 수행하기 위한 PCR 반응물의 조성은 다음과 같다: 주형 RNA 5 ㎕, 10 pmol의 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pmol의 역방향 프라이머 2 ㎕, 5×반응 버퍼 10 ㎕, dNTP 2 ㎕, DNA 합성 효소 2 ㎕ 및 DW 22 ㎕. PCR 반응은 하기 [표 2]의 조건에서 수행하였다. RT-PCR 수행 후, 증폭 산물은 1% Et-Br(Ethidium bromide)이 염색된 2% 아가로즈 젤(Agarose gel)에 전기영동하여 UV 환경에서 각 표적 서열이 특이적으로 증폭되었는지를 확인하였다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 반복 횟수 |
| 역전사 단계 | 50℃ | 30분 | - |
| 초기 활성 단계 | 95℃ | 15분 | - |
| 변성(denaturation) | 94℃ | 1분 | 40 회 |
| 결합(annealing) | 55℃ | 1분 | |
| 신장(extension) | 72℃ | 1분 | |
| 최종 신장 | 72℃ | 10분 | - |
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 S 절편, M 절편 또는 L 절편을 표적하는 프라이머쌍이 각각에 해당하는 유전자 부위를 증폭할 수 있음을 확인하였다(도 5).
SFTS 특이적 프라이머쌍을 이용해 증폭된 SFTS 바이러스 유전자의 서열 확인
본 발명의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였을 때, SFTS 바이러스 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있는지 확인하기 위해, PCR 산물의 서열을 분석하였다.
먼저, 서열 분석이 가능하도록 PCR 산물을 대량 생산하기 위해 클로닝(cloning)을 수행하였다. 클로닝을 위하여, PCR 산물을 T-벡터(Promega 사)에 삽입하였다. PCR 산물 3 ㎕, 2×라이게이션 버퍼 5 ㎕, T-벡터 1 ㎕ 및 T4 DNA ligase 1 ㎕를 혼합하여, 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 형질전환(transformation)을 위해 상기 혼합한 반응물 5 ㎕와 대장균(E.coli DH5α) 50 ㎕를 혼합하여 1 초간 볼텍싱(vortexing)한 다음, 얼음에서 10 분간 냉각하여 형질전환을 유도하였다.
형질전환된 대장균은 LBamp+ 한천 배지에 도말하여 16 시간 동안 배양기에서 정치 배양하였다. 배양 후, 콜로니를 확인하여 선택한 후, 이를 다시 LBamp+ 액체 배지(LBamp+ broth)에 접종하여 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양된 대장균을 원심분리로 수득한 다음, 플라스미드 prep 키트를 통해 DNA를 수득하였다. 수득한 DNA으로 염기서열 분석(마크로젠 사 의뢰)하고, Blast 분석하여 SFTS 바이러스 서열에 해당하는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 6 내지 도 8에서 나타난 바와 같이 본 발명의 프라이머 쌍으로 증폭된 PCR 산물은 모두 SFTS 바이러스의 S 절편, M 절편 및 L 절편에 해당하는 서열임을 확인하였다(도 6 내지 도 8).
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Syndrome virus and a method of diagnosing Severe Fever with
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Claims (7)
- 하기 a) 내지 r)로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS) 바이러스 검출용 조성물:
a) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
b) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
c) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
d) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
e) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
f) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
g) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
h) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
i) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
j) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
k) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
l) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
m) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
n) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
o) 서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
p) 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
q) 서열번호 33의 정방향 프라이머 및 서열번호 34의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
r) 서열번호 35의 정방향 프라이머 및 서열번호 36의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서,
상기 a) 내지 c)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 S 절편(small segment, S segment)에 상보적으로 결합하며,
상기 d) 내지 h)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 M 절편(Medium segment, M segment)에 상보적으로 결합하고, 및
상기 i) 내지 r)의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스의 L 절편(Large segment, L segment)에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, SFTS 바이러스 검출용 조성물.
- 제 1항의 조성물을 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 진단용 키트.
- i) 중증 열성 혈소판 감소 증후군의 감염이 의심되는 환자에서 분리된 시료에서 바이러스성 RNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리한 바이러스성 RNA를 주형으로 하고, 제 3항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
iii) 상기 단계 iii)의 PCR 증폭 산물을 확인하는 단계;를 포함하는,
중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 단계 i)의 시료는 조직, 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 정액 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
SFTS 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 단계 iii)의 PCR 증폭 산물의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
SFTS 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 SFTS는 한국에서 분리된 SFTS 바이러스 분리주에 의해 감염되는 것을 특징으로 하는,
SFTS 감염의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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