KR101728420B1 - 실시간 rt-pcr을 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출법 개발 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중증열성혈소판감소증후군(Severe fever with thrombocytopenia syndrome; SFTS) 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트, 이를 포함하는 SFTS 바이러스 검출용 키트, 및 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 SFTS 바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 최초로 국내 SFTS 분리주를 기반으로 프로브 및 프라이머를 제작하였으며, 3가지의 유전자를 가지고 있는 SFTS 바이러스에서 2가지의 유전자를 선택하여 검출 타겟으로 선정하여 실시간(Real-time) PCR KIT로 개발함으로써, 한가지 유전자를 이용하는 기존의 일반 PCR 방법에 비하여 특이도와 정확성을 높이고 최적의 프로브 및 프라이머 세트를 선별하여 이를 이용하여 실시간 RT-PCR 기술을 이용함으로써 일반 PCR 방법에 비하여 민감도를 향상시킨 검출 키트 및 검출방법에 관한 것이다.

Description

실시간 RT-PCR을 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출법 개발{The method for detecting Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus using Multiplex Real-Time RT-PCR}
본 발명은 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV) 검출용 프로브 및 프라이머 세트, 이를 포함하는 SFTSV 검출용 키트, 및 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 SFTSV 검출 방법에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군(Severe fever with thrombocytopenia syndrome; SFTS)는 고열, 구토, 설사, 혈소판 감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다(Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011; 364:1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3).
SFTS는 분야바이러스(Bunyavirus)에 속하는 SFTS 바이러스에 의해 야기되며 2011년에 중국에서 최초로 보고되었다(Yu XJ et al. ibid).
SFTS 바이러스는 작은소피참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 주요 매개체로 하는 것으로, 상기 진드기는 한국에도 널리 퍼져 있는 것으로 알려져 있다(Chae JS et al. J Vet Sci 2008; 9: 285-93; Kim CM et al. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 5766-76).
SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 생각된다(Zhao L et al. Emerg Infect Dis 2013; 18: 963-5; Niu G et al. Emerg Infect Dis 2013; 19: 756-63).
중국 공개 특허 공보 제102618669호는 SFTS 바이러스의 전체 서열 및 그 용도에 관한 것으로, 중국에서 동정된 SFTS 바이러스의 전체 서열을 개시하고 있다. 또한, 중국 공개 특허 공보 제102070704호는 SFTS 바이러스를 이용한 SFTS 바이러스 증폭 및 검출 키트를 개시하고 있다.
기존의 PCR 검사 방법을 이용하여 SFTSV 검사를 진행하기 위해서는 PCR과 전기영동 과정 후 육안으로 분석하여 검출 여부를 확인해야 한다. 즉, 기존의 검사 방법으로 분석시 많은 시간과 노동력이 발생하며, 또한 결과 분석시 육안 판별에 의한 오류의 가능성을 가지고 있다. 또한, 전기영동 과정을 반복적으로 수행하면서 오염에 의한 위양성 반응이 일어날 수 있다.
이에 대해 SFTSV 검출을 위한 개선된 검출법 개발이 요구되고 있다.
그리고 국내에서 동정된 SFTS 바이러스의 전체 서열 정보를 바탕으로 하는 SFTS 바이러스 증폭 및 검출 키트가 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 국내에서 동정된 중증열성혈소판감소증후군(Severe fever with thrombocytopenia syndrome; SFTS) 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 세트를 포함하는 SFTS 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 SFTS 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 생체외 또는 시험관내 시료로부터, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 사용하여 Real-time PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 상기 시료내 중증열성혈소판증후군 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 피검 개체로부터 분리된 시료로부터, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 사용하여 Real-time PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 피검 개체의 중증열성혈소판증후군 바이러스의 감염 여부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 Real-time PCR 방법을 이용함으로써 전기영동 과정을 생략하여 결과확인을 위한 시간을 단축시키고, 3가지의 유전자를 가지고 있는 SFTSV에서 2가지의 유전자를 이용하여 동시에 검출함으로써 정확도와 특이도를 향상시켰다. 또한, EPC(Extraction Positive Control)를 추가함으로서 SFTSV 유전자의 추출과정 중 PCR을 억제하는 요소가 혼입되었는지 확인할 수 있다. 본 발명으로 기존의 일반 PCR법으로 발생될 수 있는 결과 분석의 에러와 소요 시간을 줄이고, SFTSV의 검출 특이도와 민감도를 향상시켰다. 또한, 본 발명은 국내 SFTS 분리주를 기반으로 프로브 및 프라이머를 제작하였으며, 정확도와 특이도가 높은 프로브 및 프라이머 세트를 선별하였다.
도 1은 국내 SFTS 바이러스 M 단편(segment)의 염기서열을 보여주는 그림이다.
도 2는 국내 SFTS 바이러스 S 단편(segment)의 염기서열을 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 설계된 프라이머 세트(primer set)의 효율을 SFTSV 양성 샘플을 이용하여 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 설계된 118bp 세트의 프로브 테스트(probe test)를 SFTSV 양성 샘플을 이용하여 수행한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 재설계된 2개의 프로브의 테스트를 SFTSV 양성 샘플을 이용하여 수행한 결과를 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명에 따른 SFTSV 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 민감도 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 SFTSV 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 특이도 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 종래에 중국 SFTS 분리주를 기반으로 하는 것과 달리, 최초로 국내 SFTS 분리주를 기반으로 프로브 및 프라이머를 제작하였으며, SFTS를 구성하는 3가지의 유전자 중에서 2가지의 유전자를 이용하여 동시에 검출함으로써 정확도와 특이도를 향상시켰다. 또한, 본 발명은 Real-time RT PCR 방법을 이용함으로써 종래에 conventional RT-PCR에 비해 시간을 단축시켰고, EPC(Extraction Positive Control)를 추가함으로서 SFTSV 유전자의 추출과정 중 PCR을 억제하는 요소가 혼입되었는지 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 기존의 일반 PCR법으로 발생될 수 있는 결과 분석의 에러와 소요 시간을 줄이고, SFTSV의 검출 특이도와 민감도를 향상시킨 발명이다.
구체적으로,
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브는 SFTSV의 S(small) 단편(segment)을 표적으로 하고, 상기 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브는 SFTSV의 M(Medium) 단편(segment)을 표적으로 함으로써, L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편인 3가지의 유전자를 가지고 있는 SFTSV에서 2가지의 유전자만을 선택하여 검출 타겟으로 선정한 것이다.
상기 프라이머 및 프로브 세트, 및 이를 포함하는 조성물은 실시간(Real-time) RT-PCR을 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출법에 사용될 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브 세트, 및 이를 포함하는 조성물은 검출시 내부 대조군(Internal Control, IC)로서 프라이머 세트 및 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 IC로서 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 프로브를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;
를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV) 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 실시간(Real-time) RT-PCR용 키트일 수 있다.
상기 키트는 프라이머 및 프로브 세트 외에 분리 시약, 증폭 시약 또는 검출 시약으로 사용가능한 물질들을 한 이상 더 포함할 수 있다.
상기 분리 시약으로는 생물학적 샘플로부터 중증열성혈소판증후군 바이러스의 RNA 분자를 분리하기 위한 시약이고, 상기 증폭 시약은 표적 분자의 증폭을 위한 시약으로서 프라이머 및 프로브 세트 외에 RT-PCR 조성물로서 사용하기 위한 완충용액, 중합효소 또는 증류수 등을 포함하며, 상기 검출 시약은 표적 분자의 검출을 위한 시약으로서 염료 또는 형광물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
생체외 또는 시험관내 시료로부터,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 사용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 상기 시료내 중증열성혈소판증후군 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 PCR은 RT-PCR(reverse transcription-PCR), 예를 들면 표적 핵산을 역전사하는 동시에 PCR에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) RT-PCR일 수 있거나, 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR), 실시간 PCR (realtime PCR) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 검체 시료는 생물학적 시료로서 혈액, 혈청, 혈장, 말초혈 단핵세포, 말초혈 백혈구, 타액, 소변, 분변, 인두 면봉 스와브(throat swabs), 피부 상처 스와브(dermal lesion swabs), 뇌척수액(cerebrospinal fluids), 경부 도말 표본(cervical smears), 농즙 샘플, 식품 기질(food matrices), 및 뇌, 비장 및 간을 포함하는 신체의 다양한 부분의 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
상기 PCR은 상기 프라이머 및 프로브 세트 외에 내부 대조군(Internal Control, IC)로서 프라이머 세트 및 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 IC로서 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 프로브를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은
피검 개체로부터 분리된 시료로부터,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;를 사용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 피검 개체의 중증열성혈소판증후군 바이러스의 감염 여부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 PCR은 RT-PCR(reverse transcription-PCR), 예를 들면 표적 핵산을 역전사하는 동시에 PCR에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) RT-PCR일 수 있거나, 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR), 실시간 PCR (realtime PCR) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 피검 개체는 인간 뿐만 아니라, 원숭이, 침팬지 및 고릴라 등을 포함하는 유인원, 돼지, 소, 말, 개, 고양이 및 토끼 등의 포유류, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아피그 등의 설치류, 또는 닭, 오리, 비둘기 및 앵무새 등의 조류, 및 다양한 어류를 모두 포함할 수 있다.
상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 세포 또는 조직을 포함하는 개체의 다양한 부분을 포함할 수 있다.
상기 PCR은 상기 프라이머 및 프로브 세트 외에 내부 대조군(Internal Control, IC)로서 프라이머 세트 및 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 IC로서 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 10의 프로브를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
이하에서는 본 발명의 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> SFTSV 프라이머 및 프로브의 제작
국내 SFTS 바이러스 S 단편(segment) 및 M 단편(segment)의 염기서열을 바탕으로 alignment를 수행하여 프라이머 및 프로브를 설계하였다(표 1).
<1-1> 국내 SFTS 바이러스의 입수 및 서열분석
국내 SFTS 바이러스는 질병관리본부 국립보건연구원에서 2013년도 SFTS 양성 환자 혈청으로부터 분리한 SFTS 바이러스를 염기서열 분석하여 서열(sequence) 정보를 확보하였으며, 2013년 국내분리주 SFTS 바이러스의 2개 단편 (S segment 및 M segmant)의 염기서열 정보는 하기 도 1 및 도 2에 표시하였다(도 1 및 도 2).
<1-2> 프라이머 및 프로브의 설계
국내 양성 SFTSV 염기서열을 바탕으로 alignment를 수행한 후, 국내에서 발생한 양성시료의 S 단편(segment)의 염기서열을 바탕으로 모든 SFTSV를 검출할 수 있도록 새롭게 primer&probe 3 세트(set)를 설계(design)하였다.
또한, 국내에서 발생한 양성시료의 M 단편(segment)의 염기서열을 바탕으로 alignment를 수행한 결과 M 유전자(gene)의 amplicon site에서 프로브 부위(probe region)에 미스매치(mismatch)되는 염기서열이 존재함을 확인하였다. MGB 프로브는 가격도 비싸고 프로브 제작 기간이 오래걸리기 때문에 BHQ 프로브로 사용하면서 모든 SFTSV를 검출할 수 있도록 2개의 프로브를 설계하였다.
<1-3> 프라이머 / 프로브의 테스트
국내 Design한 프라이머 세트(primer set)의 효율을 SFTSV 양성 샘플을 이용하여 확인한 결과 모두 검출이 되는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 3개의 세트 중에서 118 bp의 세트를 선택하여 프로브 테스트(probe test)를 수행하였다. SFTSV의 양성시료를 이용하여 118bp 세트의 프로브 테스트를 수행한 결과 검출결과에 이상이 없는 것을 확인하였다(도 4).
SFTSV 프라이머 및 프로브 서열
표적 프라이머/프로브 서열 (서열번호)
S 단편 포워드(정방향) CCT TCA GGT TCA TGA CAG CTG G (서열번호: 1)
리버스(역방향) ACC AGG CTC TCA ATC ACT CCT GT (서열번호: 2)
프로브 FAM-AGC ACA TGT CCA AGT GGG AAG GCT CTG-BHQ (서열번호: 3)
M 단편 포워드(정방향) GTC ATC ATC ATA TTT TGT TCC TGA TGC (서열번호: 4)
리버스(역방향) GGG CAC CCA GAC TGG CAG TC (서열번호: 5)
프로브 JOE-TCCAGGTGTACATCAGTGAGGAGATGTCG-BHQ (서열번호: 6)
JOE-TCCAGGTGTACATCTGTGAGGAGATGTCG-BHQ (서열번호: 7)
IC 포워드(정방향) GAC ATC GAT ATG GGT GCC G (서열번호: 8)
리버스(역방향) CGA GAC GAT GCA GCC ATT C (서열번호: 9)
프로브 Cy5-TCT CAT GCG TCT CCC TGG TG-BHQ (서열번호: 10)
< 실시예 2> SFTSV 유전자 검사
SFTSV 유전자 검사를 위한 Real-time PCR 반응조건 및 구성성분 농도는 다음과 같다(표 2 및 표 3). 이런 반응조건 및 구성성분 농도로 반응을 수행하였다.
SFTSV Real-time PCR 반응조건
온도(℃) 시간 사이클(Cycle)
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 45
60 45초
성분 제품정보 Stock 용액의 농도 최종농도 1회 분량
2X RT buffer 코젠바이오텍
(A0001)		 코젠바이오텍
(A0001)		 1X 10 ㎕
25X RT enzyme 코젠바이오텍
(A0001)		 코젠바이오텍
(A0001)		 1X 0.8 ㎕
S segment
primer(Forward)		 - 100 uM 500 nM 0.1 ㎕
S segment
primer(Reverse)		 - 100 uM 500 nM 0.1 ㎕
S segment
primer(Probe)		 - 100 uM 50 nM 0.01 ㎕
M segment
primer(Forward)		 - 100 uM 500 nM 0.1 ㎕
M segment
primer(Reverse)		 - 100 uM 500 nM 0.1 ㎕
M segment
primer(Probe-A)		 - 100 uM 50 nM 0.01 ㎕
M segment
primer(Probe-T)		 - 100 uM 50 nM 0.01 ㎕
IC primer(Forward) - 100 uM 25 nM 0.05 ㎕
IC primer(Reverse) - 100 uM 25 nM 0.05 ㎕
IC primer(Probe) - 100 uM 100 nM 0.02 ㎕
Template - - - 5 ㎕
RNA/DNA free
Water		 - - - 3.65 ㎕
Total - - - 20 ㎕
< 실시예 3> 민감도 테스트
제작된 각각의 양성 대조군(positive control)을 하기 표 4와 같이 희석하여 민감도를 확인하였다(표 4).
In vitro transcript 희석농도
No. Copies/㎕
 Ct value
SFTSV-S SFTSV-M
1 106 19.55 19.55
2 105 22.55 23.05
3 104 25.75 26.35
4 103 29.00 29.60
5 102 32.27 32.87
6 101 35.91 35.45
7 100 38.25 36.95
< 실시예 4> 특이도 테스트
인체에 감염될 수 있는 여러 호흡기 바이러스 및 박테리아와 다양한 숙주 DNA를 이용하여 SFTSV만을 특이적으로 검출하는지 확인하였다. 이때, 특이도 실험에 사용된 RNA 및 DNA는 하기 표 5에 표기하였다(표 5).
특이도 실험에 사용된 검체 종류
No. Name Reference SFTSV-S
(FAM) 		SFTSV-M
(VIC) 		IC
(Cy5)
1 Bacillus cereus KCTC 1013 - - +
2 Bacillus subtilis KCTC 2213 +
3 Bacillus thuringiensis KCTC 1108 - - +
4 E. coli KCCM 11234 - - +
5 Listeria monocytogenes ATCC 15313 - - +
6 Salmonella enterica subsp.arizonae KCTC 12398 - - +
7 Salmonella bongori KCTC 12397 - - +
8 Salmonella enterica subsp.enterica KTCC 9120 - - +
9 Salmonella enteritidis ATCC 13076 - - +
10 Salmonella enterica subsp.hutanae ATCC 43974 - - +
11 Salmonella typhimurium ATCC 13311 - - +
12 Shigella sonnei ATCC 9290 - - +
13 Vibrio vunificus KCTC 2980 - - +
14 Listeria monocytogenes ATCC 291150 - - +
15 E. coli O157:H7 비병원성 ATCC 43888 - - +
16 E. coli O157:H7 stx1 , stx2 ATCC 43894 - - +
17 E. coli O157:H7 stx1 ATCC 43890 - - +
18 E. coli O78:K80(B) : H6 ST ATCC 43896 - - +
19 E. coli O91:H21 : stx2 ATCC 51434 - - +
20 E. coli O25:K98 : HNM LT ATCC 43886 - - +
21 E. coli O157:H7 stx2 ATCC 43889 - - +
22 E. coli O78:H11 : LT ST ATCC 35401 - - +
23 E. coli O157:H7 stx1 , stx2 ATCC 43895 - - +
24 Bordetella pertussis ATCC 10380 - - +
25 Legionella pneumophila ATCC 33152 - - +
26 Mycobacterium pneumoniae ATCC 15531 - - +
27 Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010 - - +
28 Bordetella parapertussis - - - +
29 Clostridium difficile - - - +
30 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 - - +
31 Listeria innocua - - - +
32 Staphylococcus aureus NCCP 11470 - - +
33 Vibrio vulnificus ATCC 27562 - - +
34 Camphylobacter jejuni - - +
35 Salmonella Dublin ATCC 15480 - - +
36 Salmonella typhi ATCC 19214 - - +
37 Salmonella typhimurium ATCC 29629 - - +
38 Salmonella heidelberg ATCC 8326 - - +
39 Clostrudium perfrigens - - - +
40 Camphylobacter coli KCTC 15212 - - +
41 Shigella flexneri KCTC 2517 - - +
42 Shigella boydii KCTC 22528 - - +
43 Shigella sonnei KCTC 22530 - - +
44 Pandemic strain of H1N1 - - - +
45 Influenza A h3n2 - - - +
46 Influenza H5 - - - +
47 Rice fungi - - - +
48 ADV - - - +
49 PIV - - - +
50 RSV - +
51 HMV - - - +
52 Rhino virus - - +
53 Adeno virus type 1 - - +
54 Adeno virus type 2 - - +
55 Astro virus sample 1 - - +
56 Astro virus sample 2 - - +
57 Rota ( 01-029) - - +
58 Rota ( 02-044) - - - +
59 Noro GI type 8 - - +
60 Noro GI type 3 - - +
61 Noro GII type 4 - - +
62 Noro GII type 2
63 Sapo virus - - - +
64 AAR - - - +
65 Duck - - - +
66 Sheep - - - +
67 Chicken - - - +
68 Bovine - - - +
69 Porcine - - - +
70 Turckey - - - +
71 Goat - - - +
72 Horse - - - +
73 Human - - - +
74 Positive control - + + +
75 NTC - - - +
본 발명을 통해, 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출을 위한 바이오칩 또는 키트를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> The method for detecting Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus using Multiplex Real-Time RT-PCR <130> NP16-1146 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for SFTSV S segment <400> 1 ccttcaggtt catgacagct gg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for SFTSV S segment <400> 2 accaggctct caatcactcc tgt 23 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SFTSV S segment <400> 3 agcacatgtc caagtgggaa ggctctg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for SFTSV M segment <400> 4 gtcatcatca tattttgttc ctgatgc 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for SFTSV M segment <400> 5 gggcacccag actggcagtc 20 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SFTSV M segment <400> 6 tccaggtgta catcagtgag gagatgtcg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SFTSV M segment <400> 7 tccaggtgta catctgtgag gagatgtcg 29 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IC <400> 8 gacatcgata tgggtgccg 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IC <400> 9 cgagacgatg cagccattc 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for IC <400> 10 tctcatgcgt ctccctggtg 20

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
    서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;
    를 포함하는,
    한국(Korea)의 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV) 검출을 위한 실시간(Real-time) RT-PCR용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브는 각각 SFTSV의 S(small) 단편(segment)에 대한 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 한국(Korea)의 SFTSV 검출을 위한 실시간(Real-time) RT-PCR용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브는 각각 SFTSV의 M(Medium) 단편(segment)에 대한 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 한국(Korea)의 SFTSV 검출을 위한 실시간(Real-time) RT-PCR용 조성물.
  4. 삭제
  5. 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
    서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;
    를 포함하는,
    한국(Korea)의 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV) 검출을 위한 실시간(Real-time) RT-PCR용 키트.
  6. 삭제
  7. 시험관내(In Vitro) 시료로부터
    서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
    서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;
    를 사용하여 실시간(Real-time) RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는,
    시료내 한국(Korea)의 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV)의 검출 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 시료내 한국(Korea)의 SFTSV의 검출 방법.
  9. 삭제
  10. 피검체로부터 분리된 시료로부터
    서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브; 및
    서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6 또는 7 중 어느 하나의 프로브;
    를 사용하여 실시간(Real-time) RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는
    피검체의 한국(Korea) 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus; SFTSV)의 감염 여부에 관한 정보를 제공하기 위한 실시간 RT-PCR 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피검체의 한국(Korea) SFTSV의 감염 여부에 관한 정보를 제공하기 위한 실시간 RT-PCR 방법.




  12. 삭제
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