ES2353645T3 - Secuencias nucleotídicas para la detección de escherichia coli enterohemorrágicas (ehec). - Google Patents

Secuencias nucleotídicas para la detección de escherichia coli enterohemorrágicas (ehec). Download PDF

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Abstract

Ácido nucleico aislado consistente en la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 o la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 2, sus secuencias complementarias y los fragmentos de al menos 8 nucleótidos consecutivos de SEQ ID Nº 2 y las secuencias derivadas de SEQ ID Nº 2, que difiere por mutación, inserción, deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº2.

Description

Secuencias nucleotídicas para la detección de Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC).
La invención tiene por objeto dos secuencias nucleicas de origen plasmídico presentes en las bacterias del grupo Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC), la utilización de dichas secuencias para la búsqueda de las EHEC, sobre todo las que poseen los genes que codifican para los factores de virulencia enterohemolisina e intimina, y más en particular la detección específica del serotipo O157:H7. La invención se dirige igualmente a un procedimiento que pone en práctica dichas secuencias así como a los equipos de detección que las contienen.
Las bacterias del grupo EHEC pertenecen a la familia de Escherichia coli productoras de verotoxinas o VTEC, responsables de síndromes diarreicos cuyas consecuencias pueden ser fatales para el hombre. En particular, las EHEC pueden generar colitis hemorrágicas (CH), y eventualmente la aparición de complicaciones mayores como el síndrome hemolítico y urémico (SHU) o la púrpura trombótica trombopénica (Griffin y Tauxe, Epidemiol. Rev. 13, 1991, 60-98).
Además, la incidencia de estas infecciones en la salud pública es tal que implica un mayor control de los productos alimentarios y de los medios de detecciones rápidas, sobre todo en caso de epidemias.
Se han identificado varios serotipos, pertenecientes al grupo EHEC y se les ha hecho responsables de diferentes focos epidémicos: O157:H7, O26:H11, O111:NM, O103:H2, O145:NM, etc. (Acheson y Keush, ASM News 62,1996, 302-306). Sin embargo, el serotipo O157:H7 es el que se ha aislado más frecuentemente.
Los procedimientos de detección tradicionales consisten en identificar las bacterias o en descubrir las toxinas secretadas por éstas. La detección de E. coli O157:H7 se realiza principalmente sobre la base del serotipado, asociado a la búsqueda de propiedades metabólicas, que comprenden la ausencia de fermentación del sorbitol y/o la ausencia de actividad \beta-glucuronidasa. Además, no existe ningún procedimiento bacteriológico propio para la detección de EHEC, sino pruebas que permiten orientar el diagnóstico. En particular, la utilización de gelosas suplementadas con sangre o hematíes lavados permite poner de relieve el carácter enterohemolítico, presente generalmente en las
EHEC.
De manera general, los procedimientos bacteriológicos e inmunológicos relativos a la detección de E. coli O157:H7 son largos, pesados, relativamente costosos y necesitan una confirmación serológica. Además, estos procedimientos no permiten establecer una identificación de E. coli O157:H7 por las reacciones cruzadas con otros géneros y especies bacterianos, lo que hace difícil la interpretación.
El uso de sondas nucleicas ha aparecido así como una alternativa a estos procedimientos tradicionales. Se han realizado esfuerzos importantes para desarrollar las sondas, capaces de detectar de una manera sensible y específica las bacterias E. coli de tipo EHEC, implicadas en los casos de CH y/o SHU, y cuyo prototipo más extendido es E. coli O157:H7.
En particular, se han publicado sondas o fragmentos, que permiten la detección de los genes responsables de la virulencia de E. coli, denominados todavía factores de virulencia. Sin embargo, ninguno de los factores de virulencia conocido actualmente permite por sí solo identificar cepas patógenas de E. coli O157:H7 o EHEC.
Así, la utilización de sondas o fragmentos nucleicos para la detección de los genes que codifican las verotoxinas (vt1 o st1, vt2 o st2), descrito por numerosos grupos de investigación (Karch y Meyer, J. Clin Microbiol. 27, 1989, 2751-2757; Gannon y col., Appl. Env. Microbiol. 58, 1992, 3809-3815; Begum y col., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 3153-3156; Witham y col., Appl. Env. Microbiol., 62, 1996, 1347-1353), ha demostrado que los genes que codifican las verotoxinas se asocian a las cepas bacterianas patógenas E. coli O157:H7 y otras EHEC, pero también pueden estar presentes en cepas E. coli no patógenas, o eventualmente en otros géneros bacterianos tales como Shigella dysenteriae, Citrobacter freundii, etc.
Asimismo, la proteína de adhesión denominada intimina está implicada igualmente en la virulencia de las bacterias de tipo EHEC. Se han seleccionado sobre todo sondas en el gen correspondiente (eae) por parte de Gannon y col. en J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 1268-1274, Louie y col. en Epidemiol. Infect. 112, 1994, 449-461 y Meng y col. en Int. J. Food Microbiol. 32, 1996, 103-113. Sin embargo, aunque este factor de virulencia se asocia estrechamente al grupo de las EHEC, se ha encontrado igualmente en las E. coli enteropatógenas (EPEC) que comprenden el serotipo
O55:H7.
Finalmente, se han seleccionado sondas en un plásmido de 60 MDa, que codifica entre otros enterohemolisina, factor de virulencia presente igualmente en numerosas EHEC (Levine y col., J. Infect. Dis. 156, 1987, 175-182; Schmidt y col., Infect. Immun. 63, 1995, 1055-1061). Así, la patente US-5.475.098 se dirige a las secuencias nucleicas contenidas en el operón de la enterohemolisina, correspondiente a los genes hlyA, hlyB y a la región intergénica hlyA-hlyB. Las secuencias oligonucleotídicas reivindicadas permiten una detección específica de EHEC, pero la invención no permite diferenciar E. coli O157:H7 de otras EHEC. Además, la patente US-5.652.102 describe una secuencia nucleica situada en un fragmento de restricción obtenido del plásmido de 60 MDa. Sin embargo, el uso de oligonucleótidos obtenidos de esta secuencia en una reacción en cadena de la polimerasa "Polymerase Chain Reaction" (PCR), no permite por sí sola la identificación específica del serotipo O157:H7, y necesita en consecuencia el uso conjunto de cebadores que amplifican los genes que codifican para las verotoxinas y la
intimina.
El plásmido pO157, aislado de una cepa E. coli O157:H7 que proviene de una muestra clínica, ha sido descrito últimamente en su totalidad (Makino y col., DNA Research 5, 1998, 1-9). Una cartografía del plásmido que representa la ordenación de los diferentes genes en el genoma del plásmido indica la presencia de 186 fases de lectura abiertos (ORF). Sin embargo, la ausencia de datos de la secuencia nucleica (datos no disponibles en el momento de la aparición del artículo), no permite en ningún caso identificar una región de interés de diagnóstico para la detección específica de E. coli O157:H7.
Últimamente, la solicitud de patente WO-97/32.045 se dirige a oligonucleótidos seleccionados a partir de una secuencia cromosómica obtenida por el procedimiento RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), que conduce a la detección de aproximadamente el 99,5% de E. coli O157:H7, pero las secuencias nucleicas reivindicadas detectan igualmente cerca del 3% de E. coli no EHEC, lo que no es satisfactorio en términos de especificidad, sobre todo en el campo agroalimentario.
El principal inconveniente de todos estos sistemas de detección reside así en el hecho de que ninguno de ellos permite establecer de manera clara y sencilla la identificación del serotipo E. coli O157:H7. En la práctica, muy a menudo es necesario asociar varios sistemas de amplificación y/o de detección para hacer preciso el resultado. Los protocolos utilizados son así difíciles de poner en práctica (amplificaciones múltiples, simultáneas) y los resultados obtenidos en cuanto a sensibilidad y a la especificidad son altamente dependientes, no sólo de las dianas nucleicas usadas, sino también de las condiciones operativas.
Ahora bien, como se ha indicado anteriormente, este serotipo puede provocar graves síndromes que pueden conducir a la muerte, lo que implica tener medios rápidos y fiables de detección, en especial en caso de epidemia.
Los trabajos de los inventores han consistido en investigar secuencias específicas a partir de un banco genómico de E. coli O157:H7, lo que permite el reconocimiento de los principales serotipos de E. coli patógenas para el hombre, y más en particular O157:H7. El banco se ha cribado frente a E. coli enteropatógena O55:H7, supuesto ancestro del serotipo O157:H7, siendo los dos genomas extremadamente cercanos según los análisis de polimorfismo realizados por T. Whittam y col. en Infect. Immun. 61, 1993, 1619-1629.
Estos trabajos han permitido aislar dos fragmentos nucleicos de interés para la detección de EHEC y más en particular para la detección de E. coli O157:H7, que comprenden las secuencias nucleicas ID SEC Nº 1 e ID SEC Nº 2 situadas en el plásmido enterohemolítico de 60 MDa. Los clones correspondientes pDF3 y pDF4 que contienen secuencias han sido depositados en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos del Instituto Pasteur, respectivamente con los números I-1999 e I-2000, el 26 de marzo de 1998.
De una forma sorprendente, se ha puesto de relieve una primera secuencia (SEQ ID Nº 1) que comprende la asociación estable de una parte de la secuencia de inserción IS91 y de la secuencia obtenida del gen katP de E. coli O157:H7 o de una parte de ésta, encontrándose que el encadenamiento nucleico que se produce, por lo demás nunca descrito antes, lo hace específicamente en E. coli O157:H7.
El gen katP, que codifica una catalasa-peroxidasa, está presente en el plásmido enterohemolítico de E. coli O157:H7 y de numerosas EHEC (Brunder y col.., Microbiol. 142, 1996, 3305-3315), y la secuencia de inserción IS91, identificada en los plásmidos \alpha-hemolíticos de E. coli (Zabala y col., J. Bacteriol. 151, 1982, 472-476), nunca se ha descrito antes en las cepas enterohemolíticas de tipo E. coli O157:H7.
La puesta en evidencia de una secuencia de inserción truncada en la unión IS91-katP (ausencia de la secuencia inversa repetida izquierda (IR_{L}) de IS91) sugiere también una integración estable de IS91 en esta parte del genoma de E. coli O157:H7.
El análisis de los productos amplificados de un gran número de cepas O157:H7 de orígenes diversos demuestra la conservación de este encadenamiento nucleotídico en el serotipo O157:H7.
En la práctica, se ha observado un producto amplificado de 670 pares de bases en todas las cepas sometidas a ensayo (55 E. coli O157:H7 y 1 E. coli O157:H-) con los cebadores de SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4, situados respectivamente en las secuencias IS91 y katP.
Además, los datos obtenidos a partir de los perfiles de restricción AluI y RsaI efectuados en los productos amplificados de 5 cepas O157:H7 de orígenes diferentes, así como el análisis de secuencia realizado en 3 cepas, de las que 2 han sido aisladas de epidemias (EE.UU., 1993 y Japón, 1996), han demostrado una perfecta conservación, es decir, el 100% de homología en la parte de secuencia analizada (SEQ ID Nº 1: posiciones (nt) 272 a 624).
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Además, el encadenamiento nucleotídico, estable y conservado, es probablemente un episodio de recombinación relativamente antiguo, sobrevenido en E. coli O157:H7 en el curso de la evolución, ya que las cepas aisladas en lugares y épocas diferentes presentan esta misma característica.
Esta secuencia representa así una diana de elección para la detección específica del serotipo O157:H7.
Se ha caracterizado una segunda secuencia (SEQ ID Nº 2) en el mismo plásmido, asociada a la presencia de los factores de virulencia de enterohemolisina (ehly) e intimina (eae), caracteres propios de las cepas de E. coli enterohemorrágicas, que comprenden el serotipo O157:H7. A este respecto, este fragmento presenta un interés epidemiológico, ya que, a diferencia de los procedimientos ya conocidos, necesita la puesta en práctica de varios sistemas moleculares (Paton y Paton, J. Clin. Microbiol., 36, 1998, 598-602), el uso de esta secuencia para una aplicación de diagnóstico da lugar a una puesta en práctica simplificada y a una interpretación más rápida de los resulta-
dos.
La presente invención tiene así por objeto las secuencias nucleicas SEQ ID Nº 1 e SEQ ID Nº 2 y sus secuencias complementarias, las secuencias derivadas de éstas y los fragmentos según se definen posteriormente, que pueden usarse para la detección específica de las EHEC en una muestra alimentaria, clínica o veterinaria, o del en-
torno.
La presente invención tiene por objeto, más en particular, una secuencia específica para la detección del serotipo E. coli O157:H7, que comprende la secuencia SEQ ID Nº 1, un fragmento de esta secuencia o una secuencia derivada de ella, el fragmento o la secuencia derivada de tales, según se define posteriormente.
Según la invención, la secuencia SEQ ID Nº 1 comprende un encadenamiento nucleotídico que procede de un episodio de recombinación estable entre la secuencia del gen katP o una parte de éste y una secuencia de inserción IS91 truncada.
La presente invención tiene igualmente por objeto una segunda secuencia específica de las EHEC, que es la SEQ ID Nº 2, las secuencias complementarias de éstas, los fragmentos de éstas y las secuencias derivadas de éstas, siendo los fragmentos o secuencias derivadas según se define posteriormente, siendo estas secuencias detectadas siempre en las EHEC, sobre todo en las EHEC que poseen conjuntamente los genes que codifican para la enterohemolisina (ehly) y la intimina (eae); estando dicha secuencia SEQ ID Nº 2 representada en la Figura 2.
Según la presente invención, se entiende por secuencia nucleica tanto la secuencia de ADN o de ADN complementario (ADNc), como la secuencia de ARN correspondiente.
La solicitud describe también secuencias diferentes de SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 2 por mutación, inserción, deleción y/o sustitución de una o varias bases pero que, no obstante, se hibridan en condiciones muy rigurosas, con una de dichas secuencias.
Las condiciones muy rigurosas son condiciones de temperatura y de fuerza iónica tales que permiten una hibridación específica entre dos fragmentos de ácidos nucleicos complementarios y limitan las fijaciones específicas (Sambrook y col., Molecular Cloning, Segunda Edición (1989, 9.47-9.62). Las condiciones de temperatura están comprendidas generalmente entre (T_{m} inferior a 5ºC) y (T_{m} inferior 10ºC) cuando una de las secuencias del híbrido es corta (una veintena de nucleótidos), siendo T_{m} la temperatura teórica de fusión, definida como la temperatura a la que el 50% de las cadenas emparejadas se separan.
Se entiende por secuencia nucleica derivada de la SEQ ID Nº 1, toda secuencia que difiere de ésta por deleción y/o sustitución de una o varias bases y que incluye un encadenamiento nucleotídico que procede de la asociación estable de al menos una parte de la secuencia de inserción IS91 y al menos una parte de la secuencia del gen katP, y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia de la SEQ ID Nº 1.
Más en particular, las secuencias nucleicas contienen al menos 8 nucleótidos, preferentemente 10 nucleótidos, o muy preferentemente 14 nucleótidos consecutivos del encadenamiento de la Figura 1, y comprenden los nucleótidos de la posición 400 a la posición 407.
Se entiende por secuencia nucleica derivada de la SEQ ID Nº 2 toda secuencia que difiera de la de ésta por mutación, inserción, deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 2.
La invención se refiere igualmente a fragmentos oligonucleotídicos, obtenidos de la secuencia SEQ ID Nº 2, que pueden usarse como cebadores en un procedimiento de amplificación o como sonda en el marco de la puesta en práctica de un procedimiento de detección, que comprende al menos 8, ventajosamente al menos 10, más ventajosamente 14 nucleótidos, y preferentemente hasta 30 nucleótidos consecutivos del encadenamiento nucleotídico de la SEQ ID Nº 2, siendo dichos cebadores susceptibles de hibridarse en dichas secuencias en condiciones muy rigurosas, como las definidas anteriormente.
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La invención se refiere igualmente a los fragmentos oligonucleotídicos, obtenidos de la secuencia de SEQ ID Nº 1, que pueden usarse como cebadores en un procedimiento de amplificación o como sonda en el marco de la puesta en práctica de un procedimiento de detección, que comprenden al menos 14 nucleótidos, y preferentemente hasta 30 nucleótidos consecutivos del encadenamiento nucleotídico de SEQ ID Nº 1, comprendiendo dichos fragmentos un encadenamiento nucleotídico que procede de la asociación estable de al menos una parte de la secuencia de inserción IS91 y al menos una secuencia del gen katP, y siendo dichos cebadores susceptibles de hibridarse en dichas secuencias en condiciones muy rigurosas, tales como las definidas anteriormente.
Los cebadores o sondas de la invención comprenden igualmente oligonucleótidos que pueden ser modificados por sustitución y/o adición y/o supresión de varios nucleótidos, o por la adición en uno de los extremos (generalmente en 5' para los cebadores; 3' o 5' para las sondas) de una secuencia nucleica extraña a la secuencia buscada, o incluso de una molécula de marcado, siendo no obstante dichos oligonucleótidos capaces de hibridarse en unas condiciones muy rigurosas con secuencias nucleicas complementarias presentes en E. coli O157:H7 o en las EHEC. Según un modo preferido de la invención, los oligonucleótidos pueden usarse como cebadores, en un procedimiento de amplificación génica, que conduce a la obtención de una cantidad importante de copias de un fragmento de SEQ ID Nº 1 o de un fragmento de SEQ ID Nº 2 y que permiten respectivamente, la detección específica de E. coli O157:H7 o de las
EHEC.
La etapa de amplificación puede realizarse mediante cualquier procedimiento que utilice las técnicas clásicas de amplificación enzimática del ADN o del ARN, como sobre todo, la técnica TAS (Transcription-based Amplification System) propuesta por Kwoh y col. en PNAS, 86, 1989, 1173-1177, la técnica 3SR (Self-Sustained Sequences Replication) descrita por Fahy y col. en PCR Meth. Appl. 1, 1991, 25-33, la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) descrita en la patente EP-329.822, o incluso la técnica SDA (Strand Displacement Amplification) descrita por Walker y col. en P.N.A.S., 89, 1992, 392-396, o ventajosamente la técnica PCR según se describe sobre todo en las patentes europeas, EP-200.362 y EP-201.184, concedidas a nombre de Cetus, o incluso las técnicas derivadas de estas últimas y cualquier procedimiento dirigido a amplificar in vitro las secuencias
nucleicas.
En una realización preferida de la invención, los oligonucleótidos obtenidos de las secuencias SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 se utilizan en PCR.
La detección de productos amplificados puede realizarse mediante electroforesis en gel de parte o la totalidad del medio de reacción en el cual se ha efectuado la amplificación, sobre todo en gel de agarosa o de poliacrilamida, o por electroforesis capilar o por cromatografía. La visualización de una banda de fragmentos nucleicos localizada en un punto específico del gel permite apreciar el tamaño, pudiendo la intensidad de esta banda correlacionarse de forma genérica con el número de copias iniciales de la diana a detectar en la muestra.
Según otra realización de la invención, los oligonucleótidos, tales como los definidos anteriormente, pueden usarse como sondas en un procedimiento de hibridación para la detección directa de una secuencia nucleica diana o después de amplificación para la detección de productos amplificados.
A título de ilustración, los fragmentos nucleotídicos pueden marcarse mediante un elemento radioactivo (por ejemplo ^{32}P, ^{35}S, ^{3}H, ^{125}I) o mediante una molécula no radioactiva, especialmente biotina, acetilamino-fluoreno, fluorocromo, digoxigenina, o mediante una molécula enzimática, o un hapteno. Se describen ejemplos de marcajes no radioactivos de sondas, por ejemplo, en la patente francesa de P. Kourilsky nº 78-10.975, o en M. S. Urdea y col., Nucleic Acids Symp. Ser., 24, 1991, 197-200, o incluso en R. Sanchez-Pescador, J. Clin. Microbiol. 26, 1988, 1934-
1938.
El procedimiento de hibridación más general consiste en inmovilizar el ácido nucleico extraído de la muestra a analizar en un soporte (nitrocelulosa, nailon, poliestireno, etc.) y a incubar en condiciones definidas de temperatura y de fuerza iónica, con el ácido nucleico inmovilizado con la sonda. Después de hibridación, el exceso de sonda se elimina y las moléculas híbridas formadas son detectadas por el procedimiento apropiado (medida de la radioactividad, de la fluorescencia o de la actividad enzimática ligada a la sonda).
Las moléculas híbridas formadas pueden detectarse igualmente sin que sea necesario separar las fases "ligada" y "no ligada". Se dice entonces que la detección se efectúa en fase homogénea. Estos procedimientos, como los descritos por T. Walker y col., Clin. Chemistry 42, 1996, 9-13 y L. Morrison (Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, 1992, 312-352), se refieren sobre todo a la polarización de fluorescencia, en la cual una sonda se marca mediante fluoresceína y en la que la hibridación conlleva una modificación de la fluorescencia, o incluso la transferencia de energía. En este último caso, la detección descansa en interacciones inter o intramoleculares entre dos marcadores. Un primer marcador denominado "donador" es excitado por absorción de una luz de una longitud de onda determinada. La energía se transfiere a un segundo marcador denominado "aceptor", que a su vez es excitado y emite energía.
Las sondas oligonucleotídicas pueden ponerse en práctica igualmente en el seno de un dispositivo de detección que comprende una disposición matricial de loligonucleótidos en la que los oligonucleótidos de una longitud dada, se fijan en un orden predeterminado en un soporte y se incorporan unos con respecto a otros de una o varias bases; siendo cada oligonucleótido complementario de una secuencia de ADN o de ARN de la secuencia diana a detectar. La secuencia diana, marcada ventajosamente, se pone en contacto con el dispositivo matricial y puede hibridarse con las sondas fijadas en el soporte. A continuación, un tratamiento enzimático permite eliminar los híbridos incompletos. Conociendo la secuencia de una sonda en una posición determinada de la matriz, es posible así deducir la secuencia nucleotídica de la secuencia diana analizada y deducir las mutaciones eventualmente sobre-
venidas.
Una alternativa a la utilización de una secuencia marcada puede consistir en el uso de un soporte que permite una detección "bioelectrónica" de la hibridación de la secuencia diana en las sondas fijadas en el soporte de un material, tal como el oro, capaz de actuar, por ejemplo, como donador de electrones en las posiciones de la matriz en las que se forma un híbrido. La detección de la secuencia nucleica diana se determina entonces mediante un dispositivo electrónico. Se describe un ejemplo de realización de un biocaptador en la solicitud de patente EP-0.721.016 en nombre de Affymax Technologies.
Según un modo sencillo y ventajoso de puesta en práctica, las sondas nucleicas pueden usarse como sondas de captura. En este caso, la sonda denominada "sonda de captura" es inmovilizada en un soporte y sirve para capturar por hibridación específica el ácido nucleico diana a partir de la muestra que se someterá a ensayo. Si es necesario, el soporte sólido se separa de la muestra y el dúplex formado entre la sonda de captura y la secuencia de ácido nucleico diana se detecta a continuación gracias a una segunda sonda denominada "sonda de detección", marcada por un elemento detectable. Ventajosamente, las sondas de captura y de detección son complementarias de dos regiones diferentes comprendidas en la secuencia diana (amplificada o no) a detectar.
La fijación de la sonda de captura en el soporte sólido puede hacerse según procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, sobre todo por adsorción pasiva o por acoplamiento covalente (Cook y col., Nucleic Acids Res. 16, 1988, 4077-4095; Nagata y col., FEBS Lett. 183, 1985, 379-382; M. Longlaru y col., EP-420.260-A2; T. Gingeras y col., EP-276.302; E. Hornes y LM. Kornes, EP-446, 260).
La hibridación de las sondas de captura y de detección puede hacerse por separado (en dos tiempos) o simultáneamente (en un tiempo), sobre todo según uno de los procedimientos descritos por Langhale y Malcolm, Gene, 36, 1985, 201-210, o por Ranki y col., Gene 21, 1993, 77-85, por Dunn y Hassel, Cell, 12, 1977, 23-36 o incluso por Ranki y Soderlund en las patentes US-4.486.539 y US-4.563.419.
Los oligonucleótidos obtenidos de SEQ ID Nº 1 o de SEQ ID Nº 2, seleccionados como cebadores o como sondas, son susceptibles de hibridarse en condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico diana contenida en la muestra ensayada específicas de E. coli O157:H7 o de las EHEC.
Por secuencia nucleica diana se entiende cualquier molécula de ADN o ADNc o de ARN capaz de hibridarse en unas condiciones muy rigurosas con un oligonucleótido según la invención.
Los oligonucleótidos preferidos cuyas secuencias se especifican en anexo corresponden a las posiciones en las secuencias SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 referidas en la siguiente tabla:
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(Tabla pasa a página siguiente)
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La invención se refiere también a pares de oligonucleótidos, según se han descrito anteriormente, susceptibles de ser utilizados como cebadores para la amplificación de una secuencia nucleica diana correspondiente a SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 2, contenida en el genoma de E. coli O157:H7 o de las EHEC:
Los pares de cebadores preferidos son los siguientes:
\cdot para la amplificación de E. coli O157:H7
-
SEQ ID Nº 3 e SEQ ID Nº 4
-
SEQ ID Nº 5 e SEQ ID Nº 6
-
SEQ ID Nº 6 e SEQ ID Nº 7
-
SEQ ID Nº 6 e SEQ ID Nº 8
-
SEQ ID Nº 6 e SEQ ID Nº 9
\cdot para la amplificación de las EHEC:
-
SEQ ID Nº 21 e SEQ ID Nº 22
-
SEQ ID Nº 23 e SEQ ID Nº 24
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Así, el uso del par de cebadores de SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 6 para realizar la amplificación del ácido nucleico de E. coli O157:H7 conduce a la amplificación de un fragmento nucleico de 676 pb, característico de las cepas de E. coli O157:H7. La especificidad de este fragmento puede controlarse finalmente mediante la utilización de la sonda SEQ ID Nº 18.
Asimismo, el uso del par de cebadores de SEQ ID Nº 21 y SEQ ID Nº 22 amplifica específicamente una secuencia nucleica de 382 pb presente en las EHEC, que posee también los caracteres enterohemolisina e intimina. Las bacterias que pertenecen a otros grupos de E. coli, como las ETEC (E. coli productoras de enterotoxinas), las EPEC etc., no se detectan. La especificidad del producto amplificado puede confirmarse además con ayuda de sondas oligonucleotídicas internas en el fragmento amplificado, tales como SEQ ID Nº 27.
La presente invención tiene igualmente por objeto unos oligonucleótidos, como los descritos anteriormente, susceptibles de ser usados como sondas para la detección de una secuencia de nucleótidos, finalmente amplificada. Por ejemplo, las secuencias oligonucleotídicas SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 15 y SEQ ID Nº 18 pueden utilizarse para la detección específica de E. coli O157:H7. Asimismo, el uso de las secuencias SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26 y SEQ ID Nº 27 permite la detección de las EHEC como O157:H7.
La invención tiene igualmente por objeto los plásmidos que contienen las secuencias SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 mencionados anteriormente así como las células hospedadoras que los contienen.
La invención se dirige también a un procedimiento para la detección in vitro de E. coli O157:H7 o de las EHEC en una muestra, caracterizada porque comprende las etapas siguientes:
1.
la puesta en contacto de la muestra con uno de los pares de cebadores, según se han descrito anteriormente, habiendo sido el ácido nucleico contenido en la muestra, llegado el caso, hecho accesible para la hibridación de los cebadores en el ácido nucleico de la diana buscada,
2.
la amplificación de la secuencia nucleica enmarcada por el par de cebadores elegido,
3.
la verificación de la posible presencia del producto amplificado que puede efectuarse según un procedimiento conocido por el experto en la materia, según se ha descrito anteriormente.
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Según un modo de realización ventajosa, los fragmentos amplificados pueden detectarse según el principio del procedimiento denominado "sándwich".
En el marco de la invención queda comprendido igualmente un procedimiento para la detección in vitro de secuencias nucleotídicas específicas de E. coli O157:H7 o de EHEC, amplificadas previamente por detección en un soporte, por ejemplo una placa de microvaloración y, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
-
desnaturalización de la secuencia amplificada de E. coli O157:H7 y/o de EHEC por un medio físico o químico. Se preferirá la adición de una solución desnaturalizadora compuesta por 200 mM NaOH, 40 mM EDTA,
-
puesta en contacto, en un tampón de hibridación apropiado de fragmentos amplificados desnaturalizados con, por una parte, al menos una sonda de captura fijada en el soporte, y por otra parte, al menos una sonda nucleica de detección libre en el tampón de hibridación, marcada en su caso, susceptible de hibridarse con la misma cadena de fragmentos amplificados que aquella con la que se hibrida la sonda de captura, pero en una región distinta de la hibridada con la sonda de captura; pudiendo ser dicha solución de hibridación ventajosamente SSPE (Sodium Saline Phosphate EDTA; Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook y col., Vol. 3, 1989, anexo B13) concentrada 5 veces, Tween 20 al 0,5%, Mertiolato al 0,01%,
-
incubación de la mezcla de reacción durante un periodo suficientemente largo para permitir la hibridación; pudiendo realizarse esta incubación, por ejemplo, ventajosamente a 37ºC durante 1 hora aproximadamente,
-
uno o varios lavados de la mezcla precedente con el fin de eliminar toda secuencia nucleica que no haya reaccionado; pudiendo ser efectuados dichos lavados, por ejemplo, con una solución que contiene Tris-HCI 10 mM, NaCl 300 mM y Tween 20 al 0,1%, pH 7, 4.
-
revelado de las sondas de detección hibridadas para las secuencias nucleicas amplificadas.
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Según un modo ventajoso de la invención, la sonda de detección se marca con peroxidasa, y la revelación de la actividad de la peroxidasa ligada a la sonda de detección hibridada se realiza por lectura colorimétrica, en presencia de un sustrato cromógeno, según las etapas siguientes:
-
depósito de una solución que contiene un sustrato cromógeno, tal como la tetrametilbencidina (TMB), en cada uno de los pocillos que contienen la mezcla de la reacción, e incubación en la oscuridad de la microplaca durante un tiempo suficiente, generalmente de 20 a 30 min, y después se detiene la reacción mediante la adición de una solución de parada, siendo dicha solución ventajosamente una solución de H_{2}SO_{4} usada a una concentración final de 0,5 N,
-
determinación de la densidad óptica, realizándose dicha determinación a una longitud de onda de 450 nm (referencia 620 nm) cuando se usa TMB como sustrato cromógeno.
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Según un modo de realización particularmente ventajoso, la sonda de captura usada para la detección de E. coli O157:H7 puede ser SEQ ID Nº 15 y la sonda de detección es el oligonucleótido de SEQ ID Nº 18. Asimismo, la sonda de captura utilizada para la detección de las bacterias EHEC puede ser SEQ ID Nº 25 y la sonda de detección del oligonucleótido SEQ ID Nº 27.
La invención se refiere igualmente a un equipo de detección, para la identificación de E. coli O157:H7 o de las EHEC, contenidas en una muestra que comprende entre los reactivos:
-
al menos dos oligonucleótidos seleccionados en el grupo que consiste en SEQ ID Nº 3 a SEQ ID Nº 20, utilizados como cebadores para la amplificación de E. coli O157:H7 o al menos dos oligonucleótidos seleccionados en el grupo que consiste en SEQ ID Nº 21 a SEQ ID Nº 27 usados como cebadores para la amplificación de las bacterias del grupo EHEC,
-
eventualmente, un componente para verificar la secuencia del fragmento amplificado, más en particular, una sonda nucleica seleccionada en el grupo que consiste en SEQ ID Nº 3 a SEQ ID Nº 20 (E. coli O157:H7) o SEQ ID Nº 21 a SEQ ID Nº 27 (EHEC).
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Los ejemplos siguientes son dados a título no limitativo para ilustrar la invención.
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Ejemplo 1
Caracterización de las secuencias SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 1) Construcción del banco genómico de E. coli O157:H7
El ADN genómico de la cepa E. coli O157:H7 aislada a partir de las deposiciones de un paciente afectado de colitis hemorrágica y productora de verotoxinas de tipo 1 y 2 ha sido digerido parcialmente por la endonucleasa PstI (Boehringer Mannheim; Ref. 621.625) haciendo reaccionar 0,03 unidades de enzima por \mug de ADN en medio tamponado durante 1 hora a 37ºC. El ADN genómico así digerido ha permitido generar unos fragmentos de 35-45 kb. El cósmido pHC79 (Hohn y Murray, Proc. Natl. Acad. Sci 74, 1977, 3259-3263) ha sido digerido de la misma manera y desfosforilado para evitar toda autoligadura.
La ligadura se efectúa mezclando 900 ng de vector y 2,6 \mug de fragmentos de ADN de 35-45 kb (es decir, una relación molar vector/inserción de 2), dejándose el medio de reacción a 14ºC durante 18 horas después de haberse añadido 2 unidades de T4 ADN ligasa (Boehringer Mannheim; Ref. 481.220). Los cósmidos recombinantes han sido encapsulados in vitro y utilizados para transformar las bacterias E. coli XL1-Blue MR (Stratagene; Ref. 200.300). Las bacterias transformadas se han incubado 1 hora a 37ºC en medio LB (Luria-Bertani, Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook y col., Vol. 3, 1989, anexo A1). Los fragmentos de ADN de 35-45 kb se han introducido en el vector pHC79 de manera que se elimine el sitio de resistencia a ampicilina y se conserve el sitio de resistencia a tetraciclina, y a continuación se han dispuesto las bacterias en medio selectivo de gelosa que conteniendo 12,5 \mug/ml de
tetraciclina.
Se han efectuado minipreparaciones de ADN cosmídico a partir de las 360 primeras colonias aisladas en tetraciclina usando el equipo REAL Prep96 distribuido por Quiagen (Ref. 26.171).
A continuación, el ADN de estas preparaciones ha sido digerido por las endonucleasas PstI, EcoRI y SalI (Boehringer Mannheim, Ref. 621.625, 703.737 y 567.663), analizado en electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y después transferido en filtro de nailon Hybond N^{+} (Amersham, Ref. RPN 303B). El ADN ha sido fijado de forma irreversible por 5 mn de exposición a UV.
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2) Cribado del banco
Las hibridaciones se han realizado con una sonda de ADN homóloga que proviene de la cepa E. coli O157:H7 (Colección del Instituto Pasteur, nº 103.571) y con una sonda de ADN heteróloga constituida por un "pool" de ADN que proviene de 8 cepas E. coli O55:H7 (Colección del Instituto Pasteur, nº 105.215, 105.216, 105.217, 105.228, 105.239, 105.240, 105.241, 105.242).
Los diferentes filtros han sido hibridados durante 16 a 18 horas a 65ºC en una solución que contiene tampón SSC (Sodium Saline Citrate; Molecular Cloning, A practical guide, Sambrook y col., Vol. 3, 1989, anexo B13) concentrado 6 veces, de la solución de Denhart concentrada 5 veces (Molecular Cloning, Vol. 3, 1989, anexo B15), 10% de sulfato de dextrano (Pharmacia Biotech, Ref. 17-0340-02), 10 mM EDTA, SDS al 0,5%, 100 \mug/ml de ADN monocatenario de esperma de salmón y el ADN relevante (O157:H7).
Después de la hibridación, se han lavado los filtros 2 veces 10 mn en un tampón SSC concentrado 2 veces a 65ºC, 1 vez 30 mn en un tampón que contenía SSC concentrado 2 veces y SDS al 0,1% a 65ºC y después 1 vez 10 mn en SSC diluido 1/10ª a 65ºC. Los filtros todavía húmedos se han expuesto en casete con una pantalla de intensificación durante 24 a 48 horas a -80ºC.
Después del tiempo de exposición necesario, se han revelado las películas y después las membranas de nailon deshibridadas efectuando de 4 a 5 ciclos de baños a 45ºC con agitación. Para cada ciclo, se han efectuado 2 baños sucesivos de 30 mn en una solución de NaOH 0,5 N y después 30 mn en un tampón que contenía SSC diluido 1/10ª y SDS al 0,1%. Las membranas se han lavado finalmente en SSC concentrado 2 veces y se han puesto en casete para verificar que sólo quedan trazas de hibridación. Después de la deshibridación, se han hibridado los filtros de la misma manera que anteriormente con un combinado de ADN no relevante (O55:H7).
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3) Aislamiento y clonación de los fragmentos SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2
Los resultados de estas hibridaciones han permitido identificar dos clones cosmídicos a partir de los cuales se ha aislado un fragmento de aproximadamente 1 a 2 kb, que hibrida con la sonda homóloga y no hibrida con la sonda heteróloga, respectivamente. Después de haber verificado su conservación en diferentes cepas O157:H7 por hibridación en "inmunotransferencia" (dot-blot), estos fragmentos se han clonado en un vector pUC18 (Oncor Appligene, Ref. 161.131) y después se han preparado en gran cantidad. Los plásmidos recombinantes se han denominado pDF3 y pDF4 y corresponden respectivamente a las secuencias SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2.
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4) Determinación de las secuencias SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2
Los fragmentos se han secuenciado según el procedimiento de Sanger y col. descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1977, 5463, usando el "cebador universal" y el "cebador inverso" del plásmido pUC18, así como oligonucleótidos internos de las secuencias.
La secuencia SEQ ID Nº 1 (Figura 1), que contiene 1.489 pb, presenta una homología del 99,9% con el gen katP de E. coli O157:H7 en la región 407 a 1489 y una homología del 95,8% con el IS91 de E. coli en la región 1 a
406.
El análisis de la secuencia SEQ ID Nº 2 (Figura 2), que contiene 1.181 pb, no revela ninguna secuencia conocida del plásmido enterohemolítico. Sólo la parte 237 a 570 presenta una homología del 68% con el gen plasmídico virK, que codifica para una proteína de virulencia de Shigella flexneri.
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Ejemplo 2
Detección específica de E. coli O157:H7
El estudio de especificidad se ha efectuado en 100 cepas de E. coli de serotipos diferentes y 42 cepas no de E. coli que comprenden, entre otras, bacterias susceptibles de presentar reacciones cruzadas con E. coli O157:H7 como por ejemplo Salmonella, Shigella dysenteriae, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Escherichia hermanii.
1) Extracción de ADN
Se obtienen las secuencias de ADN por el procedimiento de ebullición en presencia de Chelex (InstaGene^{TM} Matrix, Biorad). Las muestras se han preparado según el protocolo siguiente:
Se ha efectuado una suspensión bacteriana en agua ultrapura estéril a partir de varias colonias bacterianas aisladas en gelosa Triptona-Caseína-Soja (Sanofi Diagnostics Pasteur, Ref. 53.455), y después se ha centrifugado a 10.000-12.000 vueltas/min durante 2 a 3 min y se ha eliminado el sobrenadante cuidadosamente. El fondo bacteriano se vuelve a suspender en 200 \mul de reactivo de lisis, homogeneizado y después incubado en un bloque calefactor a 100ºC durante 10 a 15 min. La muestra se homogeneiza de nuevo, y después se centrifuga a 10.000-12.000 vueltas/min durante 2 a 3 min. El ADN puede amplificarse directamente o almacenarse a -20ºC.
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2) Amplificación por PCR
La reacción de amplificación se realiza en un volumen total de 50 \mul que contiene KCI 50 mM; Tris-HCI 10 mM, pH 8,3; gelatina al 0,01%; MgCl_{2} 3 mM; 0,25 \muM de cada cebador de SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 6; 100 \muM (dATP, dCTP, dGTP); 400 \muM dUTP; 0,5 unidades de Uracilo-ADN-Glucosilasa (UDG; BRL Life Technologies); 1 unidad de Taq ADN Polimerasa (BRL Life Technologies) y 5 \mul de ADN preparado según se indica en el párrafo 1.
Después de una incubación a 50ºC durante 2 min y luego a 95ºC durante 5 min, se someten las muestras a 35 ciclos de amplificación compuestos por 15 seg a 95ºC, 15 seg a 65ºC y 15 seg a 72ºC. Los tubos se mantienen a 72ºC hasta la retirada de la bandeja.
Los ciclos térmicos se realizan en un termociclador "Perkin-Elmer 9600".
Cada experiencia comprende un control positivo y un control negativo.
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3) Visualización de los productos amplificados
Las reacciones de amplificación se visualizan en gel de agarosa o se detectan en microplaca.
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3-1) Gel de agarosa
Después de amplificación, se añaden 50 \mul de cloroformo a cada muestra con el fin de inactivar el UDG y después se analiza una parte alícuota de cada reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% coloreado con bromuro de etidio, en presencia de un marcador de tamaño. La visualización de un fragmento de ADN de 676 pb indica la presencia de E. coli O157:H7 en la muestra sometida a ensayo.
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3-2) Hibridación en microplaca
Se desnaturalizan los productos de amplificación mediante adición volumen a volumen de una solución que contiene NaOH 200 mM, EDTA 40 mM. Se prehibrida la microplaca en la que la superficie de pocillos está revestida por la sonda de captura de SEQ ID Nº 15 en un tampón de hibridación que contiene SSPE concentrado 5 veces, Tween 20 al 0,5% y Mertiolato al 0,01%. Después se vacía la microplaca y cada una de las cúpulas recibe 200 \mul de tampón de hibridación que contiene el fragmento amplificado desnaturalizado y la sonda de revelación de SEQ ID Nº 18. La incubación se efectúa a 37ºC en agitación durante 1 hora.
A continuación se lavan las cúpulas seis veces con 400 \mul de solución (Tris-HCI 10 mM, pH 7,4; NaCI 300 mM y Tween 20 al 0,1%), y a continuación se detecta la actividad de la peroxidasa ligada a la sonda añadiendo en cada cúpula 200 \mul de una solución de detección que contiene el cromógeno tetrametilbencidina (TMB). La microplaca se incuba a 37ºC en la oscuridad durante 30 min y después se añaden 100 \mul de una solución de H_{2}SO_{4} 1,5 N para bloquear las reacciones. Las densidades ópticas se determinan a 450 nm frente a una referencia de 620 nm.
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4) Estudio de la especificidad
Las pruebas se han efectuado en un total de 142 cepas bacterianas, utilizando el par de cebadores de SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 6 para la etapa de amplificación por PCR, la sonda de captura de SEQ ID Nº 15 y la sonda de detección de SEQ ID Nº 18 para la etapa de hibridación en microplaca.
Los resultados obtenidos en microplaca con las cepas E. coli y no E. coli (bacterias de géneros y especies diferentes) se presentan respectivamente en las Tablas I y II mostradas a continuación:
TABLA I
5
TABLA II
6
En conclusión, sólo las cepas O157:H7 y O157:H- se detectan en microplaca con el sistema mencionado anteriormente.
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Ejemplo 3
Detección específica de EHEC
La especificidad se ha sometido a ensayo en un total de 142 cepas bacterianas que incluyen diferentes serotipos de E. coli así como otras especies bacterianas que pueden interferir con la detección de las EHEC.
Los ADN se han extraído según el protocolo descrito en el primer párrafo del ejemplo 2.
Las condiciones de amplificación son las siguientes:
La reacción se realiza en un volumen total de 50 \mul que contiene KCI 50 mM; Tris-HCI 10 mM, pH 8,3; MgCI_{2} 1,5 mM; 0,5 \muM de cada cebador de SEQ ID Nº 21 y SEQ ID Nº 22; 200 \muM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1 unidad de Taq ADN Polimerasa (BRL Life Technologies) y 5 \mul de ADN preparado según se indica en el párrafo 1 del ejemplo 2.
Los ciclos térmicos se realizan en un termociclador "Perkin-Elmer 9600".
Cada experiencia comprende un control positivo y un control negativo.
Los productos de amplificación se han visualizado en gel de agarosa coloreado con BET, y la presencia de una banda de 382 pb es testimonio de la presencia de EHEC en la muestra sometida a ensayo.
Los resultados se presentan en la Tabla III.
Solo las cepas que presentan los caracteres ehly y eae, factores de virulencia asociados frecuentemente a cepas aisladas de infecciones humanas, son detectadas por PCR con el par de cebadores SEQ ID Nº 21 e SEQ ID Nº
22.
Además, el uso de dicho par de cebadores permite igualmente detectar en particular, gracias a una reacción de amplificación única, las cepas de E. coli que poseen el genotipo (vt+, eae+ y ehly+), característico de las E. coli enterohemorrágicas.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA III
8
9 
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Documentos indicados en la descripción
En la lista de documentos indicados por el solicitante se ha recogido exclusivamente para información del lector, y no es parte constituyente del documento de patente europeo. Ha sido recopilada con el mayor cuidado; sin embargo, la EPA no asume ninguna responsabilidad por posibles errores u omisiones.
Documentos de patente indicados en la descripción
\bullet US 5475098 A [0011]
\bullet EP 0721016 A [0048]
\bullet US 5652102 A [0011]
\bullet EP 420260 A2, M. Longlaru [0050]
\bullet WO 9732045 A [0013]
\bullet EP 276302 A, T. Gingeras [0050]
\bullet EP 329822 A [0040]
\bullet EP 446260 A, E. Hornes et L M. Kornes [0050]
\bullet EP 200362 A [0040]
\bullet US 4486539 A [0051]
\bullet EP 201184 A [0040]
\bullet US 4563419 A [0051]
\bullet FR 7810975, P. Kourilsky [0044]
Literatura de patentes no citadas en la descripción
\bulletGriffin; Tauxe. Epidemiol. Rev., 1991, vol. 13, 60-98 [0002]
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\bulletLuria-Bertani et al. Molecular Cloning, A practical guide. 1989, vol. 3 [0068]
\bulletSambrook et al. Sodium Saline Citrate; Molecular Cloning, A practical guide. 1989, vol. 3 [0072]
\bulletMolecular Cloning, 1989, vol. 3 [0072]
\bulletSanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1977, vol. 74, 5463 [0076]
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: PASTEUR SANOFI DIAGNOSTICS
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(B)
CALLE: 3 BOULEVARD RAYMOND POINCARÉ
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(C)
CIUDAD: MARNES LA COQUETTE
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(D)
PAÍS: FRANCIA
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(E)
CÓDIGO POSTAL: 92430
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS PARA LA DETECCIÓN DE {}\hskip4,95cm ESCHERICHIA COLI ENTEROHEMORRÁGICAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.489 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.181 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAGATGAAAGCACCACTGTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido contrario
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCTGTGTAATCTCAGAGGAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCCGGAGATGAAAGCACCACTGTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido contrario
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGGGCTGTGTAATCTCAGAGGAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGCTGATACCGGCAAGAATGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCCCGCAGGCCATGATTTTTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGCAAGAATGGTCGCAAACTCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido contrario
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGGGTTCCAAGCCGCAACTGACGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAGGGGTTCCAAGCCGCAACTGACG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCAACGGCATCGTCAGTTGCGGCTTGGAAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCACTCAACGGCATCGTCAGTTGCGGCTTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTATTTCAGGATACCCTTCGTCATCAACACG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTTCCCTTAATCCGGAGCTATTCGTATGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGACCAGCTTTTTGTTTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTCACAGACTCAATGACTA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCATCGTCAGTTG 
\hfill
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCATCGTCAGTTGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGGCATCGTCAGTTGCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCTGAACGATAAGCGGAAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido contrario
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCTTCCTTCCATCCTCAGAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCCCAGCGCGCTCCAGCTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido contrario
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCATGATGGCGCATCTGATG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGTTCTGGTCTTACGGGTGATGTAGGTTTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGTGAAGCGGTGACAGCATATCAGACGGCT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CADENA: de sentido directo
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGAGATAGGCACAACAATGA 
\hfill

Claims (35)

1. Ácido nucleico aislado consistente en la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 o la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 2, sus secuencias complementarias y los fragmentos de al menos 8 nucleótidos consecutivos de SEQ ID Nº 2 y las secuencias derivadas de SEQ ID Nº 2, que difiere por mutación, inserción, deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 2.
2. Ácido nucleico aislado que consiste en un fragmento de al menos 14 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1, o de una secuencia derivada de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1, que difiere por deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 1, comprendiendo dicho fragmento o dicha secuencia derivada un encadenamiento nucleotídico resultante de la asociación estable de al menos una parte de la secuencia de inserción IS91 y al menos una parte de la secuencia del gen katP.
3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2, que comprende al menos 14 nucleótidos consecutivos del encadenamiento de la secuencia SEQ ID Nº 1, que incluyen los nucleótidos de la posición 400 a 407.
4. Ácido nucleico aislado que comprende al menos 8 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 2, o de la secuencia complementaria y de secuencias derivadas de SEQ ID Nº 2, tales como las definidas en la reivindicación 1.
5. Ácido nucleico según la reivindicación 4 que comprende al menos 14 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 2.
6. Ácido nucleico aislado según una de las reivindicaciones 3 a 5, elegido entre las secuencias nucleotídicas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
13
14 
\newpage
7. Pares de ácidos nucleicos aislados, utilizados como cebadores, elegidos entre los pares siguientes de secuencias siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
8. Plásmidos pDF3 y pDF4 depositados en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos respectivamente con los números 1 a 1.999 y 1 a 2.000, el 26 de marzo de 1998.
9. Célula hospedadora que comprende un plásmido según la reivindicación 8.
10. Procedimiento de detección de una E. coli enterohemorrágica (EHEC) en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento la detección de una cadena nucleotídica de secuencia SEQ ID Nº 2 con un ácido nucleico aislado según se define en la reivindicación 4, siendo la presencia de dicha cadena nucleotídica reveladora de la presencia de una EHEC.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la secuencia de dicho ácido nucleico aislado se selecciona del grupo que consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho ácido nucleico aislado es utilizado como cebador y/o sonda.
13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que dicho ácido nucleico está marcado.
14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en el que dicho ácido nucleico aislado está inmovilizado en un soporte.
\newpage
15. Procedimiento de detección de EHEC en una muestra, que comprende las etapas siguientes:
(a)
puesta en contacto de la muestra con un par de cebadores oligonucleotídicos seleccionados del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
con el ácido nucleico contenido en la muestra habiendo sido, en su caso, hecho accesible para dichos cebadores en la diana buscada,
(b)
amplificación de la secuencia nucleotídica enmarcada por el par de cebadores elegido,
(c)
verificación de la presencia del producto amplificado mediante la utilización de al menos una sonda específica del producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento según la reivindicación 15, según el cual la etapa (c) comprende las subetapas siguientes:
(c1)
desnaturalización de las secuencias amplificadas por un medio físico o químico;
(c2)
puesta en contacto con una solución que contiene los fragmentos amplificados desnaturalizados de la etapa (c1) con, por una parte, al menos una sonda de captura, y por otra parte, al menos una sonda de detección, en su caso marcada, siendo las sondas de captura y de detección susceptibles de hibridarse con la misma cadena de los fragmentos amplificados, realizándose dicha puesta en contacto durante un tiempo suficiente para permitir la reacción de hibridación;
(c3)
al menos un lavado para eliminar las secuencias nucleotídicas que no hayan reaccionado;
(c4)
revelado de las sondas de detección hibridadas para las secuencias nucleotídicas amplificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la sonda de captura se fija a la superficie de un pocillo de una placa de microvaloración.
18. Procedimiento según la reivindicación 16 ó 17, en el que la sonda de detección está marcada con peroxi-
dasa.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la puesta en relieve de la actividad de la peroxidasa ligada a la sonda de detección que ha reaccionado, se efectúa por reacción colorimétrica, en presencia de un sustrato cromógeno, tal como la tetrametilbencidina (TMB), por la puesta en práctica de las etapas siguien-
tes:
-
adición del sustrato cromógeno, tal como una solución de TMB en los pocillos que contienen la mezcla de reacción,
-
incubación, en oscuridad, durante un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de la coloración,
-
bloqueo de la reacción por adición de una solución de parada,
-
determinación de la densidad óptica para una longitud de onda apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Procedimiento de detección de las EHEC, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, poniendo en práctica los oligonucleótidos siguientes:
-
las secuencias SEQ ID Nº 21 y SEQ ID Nº 22, como cebadores para la amplificación,
-
la secuencia SEQ ID Nº 25 como sonda de captura, y
-
la secuencia SEQ ID Nº 27, como sonda de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Procedimiento de detección de E. coli O157:H7 en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento la detección de una cadena nucleotídica que resulta de la asociación estable de al menos una parte de la secuencia de inserción IS91 y al menos una parte de la secuencia del gen katP con ayuda de un ácido nucleico aislado que comprende al menos 8 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 1, de la secuencia complementaria de ésta o de una secuencia derivada de ésta, que difieren por deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibridan en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 1, siendo la presencia de dicha cadena nucleotídica reveladora de la presencia de E. coli O157:H7.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la secuencia de dicho ácido nucleico aislado es seleccionado del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento según la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho ácido nucleico aislado es utilizado como cebador y/o como sonda.
24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicho ácido nucleico aislado está marcado.
25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicho ácido nucleico aislado está inmovilizado en un soporte.
\newpage
26. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende las etapas siguientes:
(a)
puesta en contacto de la muestra con un par de cebadores oligonucleotídicos seleccionados del grupo que consiste en:
20
\quad
con el ácido nucleico contenido en la muestra habiendo sido, en su caso, hecho accesible para dichos cebadores en la diana buscada;
(b)
amplificación de la secuencia nucleotídica enmarcada por el par de cebadores elegido;
(c)
verificación de la presencia del producto amplificado mediante la utilización de al menos una sonda específica del producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Procedimiento según la reivindicación 26, según el cual la etapa (c) comprende las subetapas siguientes:
(c1)
desnaturalización de las secuencias amplificadas por un medio físico o químico;
(c2)
puesta en contacto con una solución que contiene los fragmentos amplificados desnaturalizados de la etapa (c1) con, por una parte, al menos una sonda de captura, y por otra parte, al menos una sonda de detección, en su caso marcada, siendo las sondas de captura y de detección susceptibles de hibridarse con la misma cadena de los fragmentos amplificados, realizándose dicha puesta en contacto durante un tiempo suficiente para permitir la reacción de hibridación;
(c3)
al menos un lavado para eliminar las secuencias nucleotídicas que no hayan reaccionado;
(c4)
revelado de las sondas de detección hibridadas para las secuencias nucleotídicas amplificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la sonda de captura se fija a la superficie de un pocillo de una placa de microvaloración.
29. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, en el que la sonda de detección está marcada con peroxidasa.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, caracterizado porque la puesta en relieve de la actividad de la peroxidasa ligada a la sonda de detección que ha reaccionado, se efectúa por reacción colorimétrica, en presencia de un sustrato cromógeno, como la tetrametilbencidina (TMB), por la puesta en práctica de las etapas siguientes:
-
adición del sustrato cromógeno, como una solución de TMB en los pocillos que contienen la mezcla de reacción,
-
incubación, en oscuridad, durante un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de la coloración,
-
bloqueo de la reacción por adición de una solución de parada,
-
determinación de la densidad óptica para una longitud de onda apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
31. Procedimiento de detección de E. coli O157:H7, según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, poniendo en práctica los oligonucleótidos siguientes:
-
las secuencias SEQ ID Nº 5 e SEQ ID Nº 6, como cebadores para la amplificación,
-
la secuencia SEQ ID Nº 15 como sonda de captura, y
-
la secuencia SEQ ID Nº 18, como sonda de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
32. Equipo para la detección de las EHEC, comprendiendo entre los reactivos:
-
al menos dos cebadores nucleotídicos seleccionados del grupo consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
-
en su caso, al menos una sonda nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
para la detección del producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
33. Equipo para la detección de las EHEC, según la reivindicación 32, comprendiendo:
-
dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 21 e SEQ ID Nº 22, usados como par de cebadores,
-
dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 25 e SEQ ID Nº 27, para la detección del producto amplificado.
\newpage
34. Equipo para la detección de E. coli O157:H7, comprendiendo entre los reactivos:
-
al menos dos cebadores oligonucleotídicos seleccionados del grupo consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
y
-
en su caso al menos un cebador oligonucleotídico seleccionado del grupo consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
24
25
para la detección del producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
35. Equipo para la detección de E. coli O157:H7 según la reivindicación 34 comprendiendo:
-
dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 5 e SEQ ID Nº 6, usados como par de cebadores; y
-
dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 15 e SEQ ID Nº 18 para la detección del producto amplificado.
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