JPH0412118B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、SOS応答の誘導発現を利用して、細
胞DNAの損傷を誘発し得る物質の突然変異誘発
能を検出する方法に係る。より詳細には本発明
は、ヨーロツパ特許出願第82 400664号の主題で
ある、物質の突然変異誘発能の検出方法の改良に
係る。 ［従来の技術］ 前記ヨーロツパ特許出願の方法では、sfi遺伝
子（特なsfiA）と、定量可能な酵素（好ましくは
β−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子との
組換え体によつて形質転換された微生物を、被検
物質の存在下適当な培地中で培養し、定量可能な
酵素又は少くとも一部がこの定量可能な酵素から
成るハイブリツド酵素の増加を検出することによ
つて、該被検物質の突然変異誘発能を評価する。 しかし乍ら、前記ヨーロツパ特許出願に記載の
検出方法を使用した場合、例えば被検物質が使用
微生物に対して別の独立した作用を有するとき、
また例えば被検物質がタンパク合成の阻害を誘発
する特性を有するときは、少くとも或る程度の被
検物質濃度では得られる応答が変り易いことが判
明した。このような場合、被検物質が実際に突然
変異誘発能を有していても、β−ガラクトシダー
ゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含むハイブリツド
酵素の誘発がかなり減少することがあるので、得
られた結果から少くとも被検物質の実際の突然変
異誘発能の強さに関して確実な結論を引出すこと
ができない。 ［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、この種の欠点を除去するこ
と、特に被検物質の未知であることが多い特性に
帰因して起り得、被検物質の実際の突然変異誘発
能即ち遺伝子毒性（genotoxique）を増加し得る
ような障害（perturbations）を防止すること、
及び、それにより、定量可能な酵素の誘発が前記
障害に隠されてしまうのを回避することである。 ［課題を解決するための手段］ ある物質又は組成物が有し得る突然変異誘発能
を検出するための本発明の方法は、sfi遺伝子と、
定量可能な酵素をコードする遺伝子との組換え
体、より特定的にはsfiA：lacZオペロン融合体を
担う微生物、特に大腸菌（Ｅ．coli）を被検物質
の存在下で培養することと、sfi遺伝子が前記物
質又は組成物の突然変異誘発能によつて活性化さ
れたときにsfi遺伝子の制御下で誘発され得るβ
−ガラクトシダーゼ活性を測定することとを含ん
でおり、その特徴は、当該微生物によつて合成さ
れ得る前記酵素とは別の酵素であつてSOS応答の
発現に関与する遺伝子の活性化プロセスに関係し
ない遺伝子によつてコードされている別の酵素の
活性も同時に測定し、被検物質が有し得る突然変
異誘発能を、観察された変化、より特定的には前
記定量可能な酵素の活性と別の酵素の活性との比
の増加から導出し、特に突然変異誘発物質を存在
させずに同じ微生物を培養した際に得られる同じ
比の変化を考慮して前記被検物質の突然変異誘発
能を判定することである。 別の酵素としては、前記組換え体を担う微生物
が有意量で生産し得る酵素のうちから選択するの
が好ましい。必要ならば該微生物は、選択された
酵素の合成に関して構成的（constitutif）とされ
る。即ち、該酵素は当該微生物にとつて構成酵素
となつている。この酵素としてはアルカリ性ホス
フアターゼが有利である。 勿論アルカリ性ホスフアターゼ以外のいかなる
酵素を基準（比較用）酵素として使用してもよ
い。アルカリ性ホスフアターゼの代りに使用し得
る酵素の例としては、トリプトフアナーゼ及びグ
ルクロニダーゼがある。 定量可能な酵素についても同様にUVR Ａ、
rec^a又はumuCの如き遺伝子によつてコードされ
る酵素に代替し得る。 考察すべきパラメータとしての前記の比を利用
するので、診断は定量可能な酵素の合成に影響を
与え得る障害にほとんど左右されない。このよう
な障害は、酵素合成に影響を与え得る被検物質の
別の特性によるsfi遺伝子誘発に対する応答とし
て生じる。実際、このような障害により、被検物
質が現に突然変異誘発能を有する場合、誘発され
た定量可能な酵素及び基準酵素の双方に対して、
sfi遺伝子の活性化によつて誘発された定量可能
な酵素の合成と基準酵素の合成との相対的阻害度
に関わりなく、前記比が極めて顕著に増加するよ
うな影響が常に出ることが確認された。 本発明はまた、前記組換え体を担う微生物の菌
株のうちで、特に基準酵素を構成酵素として合成
し得る菌株に係る。この例として、本発明は特
に、sfiA：lacZオペロン組換え体を担持しており
且つsfiA遺伝子の活性化によつてlacZ遺伝子を発
現させ得る微生物、特にＥ．_cpliの菌株に係る。特
にこれらの微生物は、アルカリ性ホスフアターゼ
を構成酵素として合成し得ることを特徴とする。 sfiA：lacZオペロン組換え体を担つておりアル
カリ性ホスフアターゼを構成酵素として合成する
微生物は、調節遺伝子phoR内に突然変異を誘発
するか、又はバクテリオフアージP₁を用いてマ
ーカーphoR^-を形質導入することによつて得るこ
とができる。 ［実施例］ 本発明の例の特徴は、本発明方法の好ましい実
施態様に関する以下の記載によつて明らかになる
であろう。この実施態様では、sfiA：lacZ組換え
体を担つており且つアルカリ性ホスフアターゼを
構成酵素として合成する本発明の菌株を使用す
る。しかし、本発明が特に詳細に検討した以下の
実施態様に限定されないことは本明細書の記載か
ら勿論明らかである。逆に本発明はその全ての変
形を包含する。 下記のテストで使用した微生物は、PQ37と命
名されたＥ．coli形質転換株である。この菌株
は、1982年９月24日付でパリ、パスツール研究所
のla Collection Nationale des Cultures de
Micro−organismes（C.N.C.M.）に委託番号Ｉ−
205として寄託されている。この微生物は以下の
如き遺伝学的特性を有する。F^- thr leu ｈis
−４ pyrD thi ｇalE qalK又はTlacΔUI69
srl300：：Tn10 rpoB ｒpsL ｕvrA rfal
trp：：Muｃ ⁺ sfiA：：Mud（Ap、lac）ｃ−
Ts。この微生物はアルカリ性ホスフアターゼを
構成酵素として合成する（Pho^c）。 この菌株は、1981年４月13日付で委託番号Ｉ−
152としてC.N.C.M.に寄託されたsfiA：jacZ組換
え体を含む菌株に前記遺伝子型を与えるような適
当な遺伝的組換えを行なつて得られたものであ
る。 本発明の方法は、特に以下の条件で実施でき
る。 アンピシリンを加えたLB培地（Bactoトリプ
ソン10ｇ、Bacto酵母抽出物５ｇ、NaCl10ｇを
含有し水を加えて１にしたもの）中で予め対数
期まで増殖させた上記微生物の培養物を10倍に希
釈する。希釈には、新しい培地を用いるか、又は
B.N.AMES等（1975）“Mutation Research”
31、347−364に記載の活性混合物を用いる。夫々
所定量の被検物質を入れたガラス製試験管にサン
プルを0.6mlずつ分配する。37℃で撹拌しながら
２時間インキユベートし、β−ガラクトシダーゼ
活性とアルカリ性ホスフアターゼ活性とを定量す
る。 アルカリ性ホスフアターゼの定量には特に以下
の条件を用い得る。2.7mlのバツフアＴ（121ｇ／
のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶
液、HClでPH8.8に調整）を0.3mlの細胞培養物に
加える。0.1％ドデシル硫酸ナトリウム溶液と
0.15mlのクロロホルムとを添加し、VORTEX型
撹拌装置内で激しく撹拌して細胞膜を破壊する。
次に、試験管を28℃の定温にする。0.6mlのパラ
ニトロフエニルホスフエート（PNPP）（バツフ
アＴ中４mg／ml）の添加によつて反応を開始させ
る。５分後に１mlの2N HClを添加して反応を停
止させ、１mlの2Nトリスを加えて発色させ、
420nｍの分光測光器で測定する。酵素ユニツト
の算出にはβ−ガラクトシダーゼの場合と同様に
J.MILLER（1972）“Cold Spring Harbour
Laboratory”ニユーヨークに記載の方法を用い
る。 β−ガラクトシダーゼ活性の定量にも、同じく
MILLERの方法を用いる。操作手順はアルカリ
性ホスフアターゼの場合と同じであるが、但し、
バツヘアＴに代えて下記の組成のバツフアＺを用
い、PNPPに代えてオルトニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（ONPG）から成る基
質を使用し、反応を停止させるために炭酸ナトリ
ウムを用いる。 バツフアＺの組成は次の通り（当り）。 Na₂HPO₄、7H₂O 16.1ｇ NaH₂PO₄、H₂O 5.5ｇ KCl 0.75ｇ MgSO₄、7H₂O 0.25ｇ β−メルカプトエタノール 2.7ml PH7.0に調整。 第１図のグラフは、遺伝子毒性物質（4NQO）
の濃度の関数として、β−ガラクトシダーゼ活性
（曲線ａ）、アルカリ性ホスフアターゼ活性（曲線
ｂ）、SOSIF（SOS誘発因子）比（曲線ｃ）の
夫々の変化を示す。 実験開始の２時間後に種々の測定を行なつた。
実際、実験によれば、SOSIF比を示す曲線は遺
伝子毒性物質がいかなる濃度であつても、70乃至
100分後にはプラトーに到達し一般に２時間以上
は安定している。更に、遺伝子毒性物質の濃度が
或る値以上になると曲線が上昇し、引続いてタン
パク合成の阻害効果が生じる。タンパク合成阻害
はβ−ガラクトシダーゼ活性とアルカリ性ホスフ
アターゼ活性との減少を生じさせるが、被検物質
の突然変異誘発能即ち遺伝子毒性効果を評価する
ために使用されるSOSIF比には実質的な影響を
与えない。即ち、遺伝子毒性物質の濃度がタンパ
ク合成を阻害する程度になつてもSOSIF比はほ
ぼ一定に維持される。 第２図及び第３図のグラフは、SOSIF比の変
化を種々の遺伝子毒性試薬の使用濃度の関数とし
て示す。 遺伝子毒性物質として以下の物質を使用した。 R5255：２−ニトロ−５−メトキシベンゾフラン AF B1：アフラトキシン 4NQO：４−ニトロキノリン−１−オキシド R5144：２−ニトロ−ベンゾフラン AF G1：アフラトキシンＧ AF B2：アフラトキシンＢ Ｂ（ａ）Ｐ：ベンゾ−ａ−ピレン MNNG：Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン。 特に注目すべきは、SOSIF比が使用遺伝子毒
性物質の濃度のほぼ直線状関数になることであ
り、物質使用量が比較的少量の範囲内にある場合
特にこの傾向が見られる。横座標に示す濃度の範
囲の下限から上限までの間に測定値が１〜60ミリ
オンの範囲に亘る変化を示すことから、テスト感
度の優秀さが十分に理解されよう。 ［発明の効果］ 従つて本発明によれば、被検物質の突然変異誘
発能の強さに関して正確な定量的情報を提供し得
る極めて高感度の検査を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、一方では、β−ガラクトシダーゼ及
びアルカリ性ホスフアターゼの各々の活性（酵素
ユニツト：u.e.）の変化を、他方では、β−ガラ
クトシダーゼ活性のアルカリ性ホスフアターゼ活
性に対する比の変化を、４−ニトロキノリン−１
−オキシド（4NQO）から成る公知の発癌性（遺
伝子毒性）化合物の濃度（前記微生物培地中濃
度：nM）の関数として示すグラフであり、第２
図及び第３図は、種々の遺伝子毒性物質を存在さ
せた同種の培養物中で測定され得る前記比（すな
わち、SOSIF比）の対数の変化を、培地中での
前記遺伝子毒性物質の各々の濃度（テストサンプ
ル当りのナノモル）の関数として示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ある物質又は組成物が有し得る突然変異誘発
   能の検出方法であつて、sfi遺伝子と定量可能な
   酵素をコードする遺伝子との組換え体を担持する
   微生物を被検物質の存在下で培養し、sfi遺伝子
   が前記物質又は組成物の突然変異誘発能によつて
   活性化されたときにsfi遺伝子の制御下で誘発さ
   れ得る前記定量可能な酵素の活性を測定すること
   からなつており、当該微生物によつて合成され得
   る別の酵素であつてSOS応答の発現に関係する遺
   伝子の活性化プロセスに関与しない遺伝子によつ
   てコードされている酵素の活性も測定し、観察さ
   れる前記定量可能な酵素の活性と別の酵素の活性
   との比の増加から、突然変異誘発物質を含まない
   同じ微生物の培養物中での同じ比の変化を考慮し
   て、被検物質が有し得る突然変異誘発能を導出す
   ることを特徴とする方法。 ２ 微生物が大腸菌であることを特徴とする請求
   項１に記載の方法。 ３ 組換え体がsfiA：lacZオペロン融合体である
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４ 定量可能な酵素がβ−ガラクトシダーゼであ
   ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記
   載の方法。 ５ 別の酵素がアルカリ性ホスフアターゼである
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載
   の方法。 ６ 別の酵素が前記微生物にとつて構成酵素にな
   つていることを特徴とする請求項１〜５のいずれ
   かに記載の方法。