DE19544374C1 - Plasmid und damit transformierter Mikroorganismus für ein Verfahren zur luminometrischen Bestimmung der mutagenen und/oder karzinogenen Potenz eines Agens - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Plasmid, ein transformierter Mikroorganismus und eine Zusammenstellung enthaltend das Plasmid.

Es ist eine wichtige Aufgabe des Gesundheits- und Umweltschut­ zes, die Gefährdung von Mensch und Natur durch physikalische und chemische Umweltfaktoren zu erfassen. Besondere Aufmerksam­ keit gilt dabei krebserregenden Faktoren, deren Wirkung meist über eine Veränderung der Erbsubtanz (DNA) abläuft. Beispiele solcher Umweltbelastungen sind die Freisetzung von chemischen Karzinogenen als Folge der industriellen Entwicklung, eine erhöhte Belastung durch solare UV-Strahlung als Folge einer abnehmenden Ozonkonzentration in der Stratosphäre, und eine erhöhte Strahlenbelastung von Bevölkerungskreisen möglicherweise als Folge von Kernkraftwerkunfällen (z. B. Tschernobyl). Da vor allem die biologische Wirkung von Interesse ist, ist es notwen­ dig, neben der physikalischen Messung auch biologische Meßver­ fahren einzusetzen, die gezielt die biologisch wirksamen Dosen der einzelnen Schadstoffe bzw. ihrer Kombinationen anzeigen. Hierfür sind Biosensoren besonders geeignet, bei denen das biologische Signal in leicht meßbare physikalische Signale umgewandelt, verstärkt und möglichst on-line angezeigt wird.

Für den Nachweis mutagener und karzinogener Substanzen/Faktoren werden neben komplexen biologischen Systemen, z. B. Krebsaus­ lösung in Tieren (z. B. Nesnow, S., A multi-factor ranking scheme for comparing the carcinogenic activity of chemicals, Mutat. Res., 239: 83-115, 1990, Broerse JJ, Davelaar J, Zurcher C, Tumor induction in animals and the radiation risk for man, In; C.E. Swenberg, G. Horneck, E.g. Stassinopoulos (eds.) Biological Effects and Physics of Solar and Galactic Cosmic Radiation, Plenum, New York, 1993, pp. 161-175) oder Chromosomenaberratio­ nen in peripheren Blutzellen des Menschen (z. B. Cremer, T.; Popp, S.; Emmerich, P.; Lichter, P.; Cremer, C. Rapid metaphase and interphase detection or radiation - induced chromosome aberrations in human lymphocytes by chromosomal suppression in situ hybridization. Cytometry 11: 110-118; 1990, Natarjan, A.T.; Vyas, R.C.; Darroudi, F.; Vermeulen, S. Frequencies of X-ray­ induced chromosome translocation in human peripheral lymphocytes as detected by in situ hybridization using chromosome - specific DNA libraries. Int. J. Rad. Biol. 61: 199-203; 1992) oder einfache Zellsysteme wie z. B. Bakterien herangezogen.

Sehr häufig wird der Ames-Test (mutatest) verwendet, bei dem Stämme des Bakteriums Salmonella zum Nachweis der Mutagenität von Substanzen verwendet werden (Ames, B.N., J. McCann, and E. Yamasaki, Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test, Mutat. Res.; 31: 347-364, 1975, Setlow, R.B., F.E., Ahmed and E. Grist, Xeroderma pigmentosum: Damage to DNA is involved in carcinoge­ nesis, in: H.H. Hiatt, J.D., Watson and J.A. Winsten (Eds.), Origins of Human Cancer, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1977, pp. 889-902). Die Stämme TA97 und TA98 dienen dem Nachweis von "Frame-shift" Mutationen z. B. durch die mutagenen Substanzen ICR-191, 9-Aminoacridin, Diethylsulfat (Levin, D.E., E. Yamasaki and B.N. Ames, A new Salmonella tester strain, TA97, for the detection of frameshift mutagens: A run of cytosines as a mutational hot-spot, Mutat. Res., 94: 315-330, 1982). Stamm TA100 weist Basenpaar-Substitutionen vor allem in einem der G-C Paare des Codon nach. Er reagiert z. B. auf MNNG, Natriumazid, Methyl-Methansulfonat (Maron, D.M. and B.N. Ames, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutat. Res., 113: 173-215, 1983). Stamm TA102, der die ochre Mutation enthält, reagiert auf oxidierende Substanzen und auf ionisierende Strahlung (Levin, D.E., M.C. Hollstein, M.F. Christman, E.A. Schwiers and B.M. Ames, A new Salmonella tester strain (TA102) with A:T base pairs at the site of mutation detects oxidative mutagens. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79: 7445-7449, 1982, Kozubek, S., E.A. Krasavin, K.G. Amiratyev, B. Tokarova, J. Soska, V. Drásil, and M. Bonev, The induction of revertants by heavy particles and γ-rays in Salmonella tester strains. Mutat. Res. 210: 221-226, 1989).

Im SOS-Chromotest zum Nachweis von DNA-Schädigungen wird ein Stamm von Escherichia coli verwendet, bei dem das Strukturgen lacZ für die Produktion von β-Galactosidase vom Gen sulA kon­ trolliert wird, welches wiederum unter Kontrolle des SOS-Systems steht (Quillardet, P., O. Huisman, R. D Ari and M. Hofnung, SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K12 to meaure genotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 79, 5971-5975, 1982). Nach einer Schädigung der DNA wird in diesen Zellen das sogenannte SOS-System induziert, zu dem neben anderen Funktionen auch die u. a. mit der Mutationsaus­ lösung verknüpften Proteine RecA und UmuC/D gehören. Die dadurch gebildete β-Galactosidase wird kolorimetrisch nachgewiesen.

Im Leuchtbakterientest (LUMIStox, Fa. Dr. Lange) wird die Abnahme der Biolumineszenz des Leuchtbakteriums Photobacterium phosphoreum zur Ermittlung der Toxizität von Gewässern, Böden und anderen Substanzgemischen verwendet. Die Abnahme der Biolu­ mineszenz wird als quantitatives Signal der biologischen Hemm­ stoffwirkung herangezogen (z. B. Link M., Biotest in Abwasserana­ lytik. Laborpraxis, 4, 99-101, 1990, Steinhäuser K.G. und Hansen P.D. (Hrsg.) Biologische Testverfahren; Beiträge zu den BioTest- Statusseminaren 1989 und 1992, Gustav Fischer, Stuttgart, 1992). Der Leuchtbakterienabwassertest mit konservierten Bakterien ist Einheitsverfahren zu Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchun­ gen in Deutschland (DIN 38 412 Teil 34/Teil 341), Frankreich (afnor T90-320) und den Niederlanden (NEN 6516). Ebenso werden E. coli Zellen, in die lux-Gene für die Biolumineszenz vom Bakterium Vibrio fischeri kloniert worden sind, zum Nachweis chemischer Toxizität herangezogen (Lampinen J., Korpela M., Saviranta P., Kronfeld R., Karp M., Use of Escherichia coli cloned with genes encoding bacterial luciferase for evaluation of chemical toxicity. Tox. assessment, 5, 337-350, 1990, Lee S., Suzuki M., Tamiya E., Karube I., Microbial detection of toxic compounds utilizing recombinant DNA technology and bio­ luminescence Ann. chi. Acta 244, 201-206, 1991). Für den spezi­ fischen Nachweis von Quecksilber werden die lux-Gene unter die Kontrolle des Quecksilber-(II)-empfindlichen Promotors mer gestellt (Tescione L., Belfort G., Construction and evaluation of a metal ion biosensor, Biotech. Bioeng. 42, 945-952, 1993).

Die bisherigen biologischen Nachweisverfahren der mutagenen oder karzinogenen Wirksamkeit von Substanzen benötigen eine relativ lange Nachbehandlungsphase, wie z. B. bis zur Tumorentwicklung bei Säugetieren (z. B. Broerse et al. 1993), bis zur Aufarbeitung der Chromosomenpräparaten bei Lymphocyten (z. B. Cremer et al. 1990, Natarjan et al. 1992), oder bis zur Expression der Muta­ tionen im Amestest (z. B. Ames et al. 1975, Setlow et al. 1977). Deshalb sind diese Verfahren auch nicht als Biosensor einsetz­ bar. Die kürzeste Spanne zwischen Kontakt mit dem mutagenen Agens und dem biologischen Signal ist beim SOS-Chromotest mit etwa zwei Stunden gegeben.

Biosensoren auf der Basis der Biolumineszenz erlauben es, das biologische Reaktionssignal, d.i. das Ausmaß der Biolumineszenz, innerhalb von ca. 30 min aufzunehmen, zu verstärken und quan­ titativ nahezu on-line anzuzeigen. Allerdings ist der Leuchtbak­ terienhemmtest relativ unspezifisch, da er vor allem auf einer allgemeinen Hemmung des Energiestoffwechsels beruht. Bisher steht mit dem genetisch veränderten E. coli Stamm, der mit dem mer-lux Gen-Komplex kloniert worden ist, zwar ein Quecksilber- (II)-spezifischer Biosensor zur Verfügung, jedoch gibt es nicht einen solchen, der speziell auf DNA-Schäden ausgerichtet ist.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, ein Plasmid zur Verfügung zu stellen, das einen Assay ermöglicht, der die geschilderten Nachteile des Standes der Technik vermeidet und einen insbesondere schnellen und sen­ sitiven Assay zur Verfügung stellt.

Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Plasmid mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Der Patentanspruch 2 betrifft eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Plasmids. Der mit dem erfindungsgemäßen Plasmid transformierte Mikroorganismus ist in Anspruch 3 und eine diesen enthaltende Zusammenstellung in Anspruch 4 beansprucht.

Das erfindungsgemäße Plasmid ist erhältlich durch Ligation der Fragmente I, II, III, IV und V, wobei Fragment I aus Photobak­ terium leiognathi stammt und die lux-Gene CDABE trägt, wobei lux A, B die α- und β-Untereinheit des Enzyms Luciferase, lux C, D, E die Proteine für die Synthese des Aldehyd-Substrats der Lumineszenz-Reaktion kodieren, das Fragment II ein mit BamHI und EcoRI geschnittenes Fragment aus pBR322 ist, daran an­ schließend das Fragment III aus pUC18 mit Restriktionsschnitt­ stellen EcoRI und SmaI ligiert ist, woran sich das Fragment IV mit den Restriktionsschnittstellen SmaI-SmaI als SOS-Promotor aus ColD-CA23 anschließt und der Plasmidringschluß zu Fragment I durch ein Fragment V aus pUC18 mit den Restriktionsschnitt­ stellen Smal bis SphI erfolgt.

Das Plasmid gemäß Anspruch 6 pPLS1 wurde bei der DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Nummer DMS 10333 hinter­ legt.

Das erfindungsgemäße Plasmid wird in einem Verfahren verwendet, das zur Messung der mutagenen und/oder karzinogenen, im weiteren Sinne genotoxischen Potenz einer zu untersuchenden Probe oder eines Agens einen gentechnisch modifizierten Mikroorganismus geeignet ist und dessen Reaktion in Form von Biolumineszenz auf eine Induktion des bakteriellen SOS-Systems durch nukleinsäure­ schädigende Agentien gemessen wird. Dabei werden vorzugsweise transformierte Bakterien wie Escherichia coli, insbesondere Escherichia coli K12-Stämme eingesetzt.

Vorzugsweise erfolgt die Transfektion des Mikroorganismus mit einem Plasmid, daß das lux-Operon des Photobakteriums leiognathi mit den Genen lux CDABE trägt. Das lux-Operon steht dabei unter der Kontrolle eines SOS-Promotors. Wird das SOS-System indu­ ziert, erfolgt die Transkription und Translation der lux-Gene, deren Genprodukte Biolumineszenz hervorrufen. Diese Lichtemis­ sion, die z. B. mit einem Photomultiplier gemessen werden kann, ist dann ein Maß für die nukleinsäureschädigende Wirkung der Probe oder des Agens, das auf die zu untersuchende Probe ein­ wirkt. Mit dem Verfahren lassen sich sowohl chemische Stoffe mit mutagener oder karzinogener Potenz erfassen, wie auch physikalische Faktoren wie z. B. ionisierende oder ultraviolette Strahlung untersuchen.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmids in diesem Ver­ fahren ist vorteilhaft, da es eine schnelle und sensitive Erfassung der nukleinsäureschädigenden Potenz einer zu unter­ suchenden Probe oder eines auf eine zu untersuchende Probe einwirkenden nukleinsäureschädigenden Agens bewirkt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Mikroorganismen erfüllen quasi die Funktionen eines Biosensors, der nuklein­ säureschädigende Agentien anzeigt. Die Vorteile des Verfahrens, die auf die erfindungsgemäß einzusetzenden Biosensoren zurück­ gehen gegenüber den bisherigen Verfahren besteht im wesentlich im folgenden:

• - Kombination von Biolumineszenz zur direkten Quantifizierung der biologisch effektiven Dosis mit SOS-System zur spezifi­ schen Indikation von DNA-schädigenden mutagenen und karzinoge­ nen Substanzen und Faktoren,
• - automatische Registrierbarkeit des biologischen Signals Biolumineszenz,
• - hohe Empfindlichkeit gegenüber mutagenen und karzinogenen Substanzen (UV-, γ-Strahlen und Chemikalien),
• - schnelle Ansprechschwelle (Zunahme der Biolumineszenz um ca. 2 Größenordnungen nach einer 30 minütiger Bebrütung bei 33°C),
• - Verwendbarkeit von verschiedenen E. coli Stämmen mit unter­ schiedlicher Reparaturkapazität. Insbesondere vorteilhaft ist die Tatsache, daß durch Einschleusung des erfindungsgemäßen Plasmids in Bakterien verschiedenster Reparaturkapazität aufgrund ihres enzymatischen Systems unterschiedliche Agentien mit mutagener und/oder karzinogener Wirkung erfaßt werden können. Soll beispielsweise die karzinogene oder mutagene Wirkung von UV-Strahlen auf eine bestimmte nukleinsäurehaltige Probe untersucht werden, werden vorzugsweise transformierte Mikroorganismen wie die uvrA⁻ umuC⁻ Mutante von E. coli ein­ gesetzt, wohingegen bei der Untersuchung der Einwirkung von γ-Strahlen Mikroorganismen insbesondere der Wildstamm von E. coli eingesetzt werden.

Die Universalität des mit dem erfindungsgemäßen Plasmids durch­ führbaren Verfahrens kann noch dadurch gesteigert werden, daß in einer erfindungsgemäßen Zusammenstellung, die neben den transformierten Mikroorganismen gegebenenfalls noch Hilfsstoffe zur Durchführung der Assays beinhalten können, verschiedene Mikroorganismen eingesetzt werden, die eine unterschiedliche Reparaturkapazität aufgrund ihres Enzymapparates besitzen.

Fig. 1 zeigt schematisch das Plasmid pPLS1 in einer nicht maßstabsgerechten Skalierung.

Fig. 2 Zunahme der Biolumineszenz nach Bestrahlung des Biosen­ sors "SOS-kontrollierter LUX-Test" mit UV(254 nm)-Strahlung. Die drei Kurven sind mit unterschiedlichen E. coli Stämmen gewonnen worden. Lichtmessung mit Hilfe eines Szintillationszählers.

Fig. 3 Zunahme der Biolumineszenz nach Bestrahlung des Biosen­ sors "SOS-kontrollierter LUX-Test" mit γ-Strahlung. Die Kurven wurden bei verschiedenen Bestrahlungsdosen gewonnen. Lichtmes­ sung mit Hilfe eines Luminometers (LKB).

Fragment I

Herkunft: Photobakterium leiognathi 54D10 (Krasnoyarsk Univer­ sität, Rußland)
begrenzende Restriktionsschnittstellen: SphI-BamHI/Sau3A
Länge: 6,7 kBp
Funktion: Biolumineszenz durch die Gene lux CDABE
lux A, B: α- und β-Untereinheit des Enzyms Lu­ ciferase
lux C, D, E,: Proteine für die Synthese des Alde­ hyds-Substrats der Lumineszenz-Reak­ tion.

Fragment II

Herkunft: pBR322
begrenzende Restriktionsschnittstellen: BamHI (Position 375 in pBR322)-EcoRI (Position 185 in pBR322)
Länge: 4171 Bp
Funktion: Vermehrung der einklonierten DNA mit der Mög­ lichkeit zur Selektion von transformierten Bak­ terien über die Ampicillin-Resistenz des Plas­ mids.

Fragment III

Herkunft: pUC18
begrenzende Restriktionsschnittstellen: EcoRI (Position 455 in pUc18)-SmaI Position 436 in pUC18)
Länge: 19 Bp
Funktion: Teil des Polylinkers als Klonierungsstelle.

Fragment IV

Herkunft ColD-CA23
begrenzende Restriktionsschnittstellen: SmaI-SmaI
Länge: 1,54 Bp
Funktion: SOS-Promotor.

Fragment V

Herkunft pUC18
begrenzende Restriktionsschnittstellen: SmaI (Position 436 in pUC18)-SphI (Position 405 in pUC18)
Länge: 31 Bp
Funktion: Teil des Polylinkers als Klonierungsstelle.

Die Fig. 2 zeigt die Zunahme der Biolumineszenz nach Bestrah­ lung des erfindungsgemäßen Biosensors mit UV-Strahlung bei 254 nm. Die drei Kurven sind mit unterschiedlichen E. coli- Stämmen ermittelt worden, deren Charakterisierung sich als "wild type", "pol A⁻" und "umuC⁻uvrA⁻" angeben läßt. Ersichtlich ist, daß der Stamm "umuC⁻uvrA⁻" unter den gewählten Bedingungen die höchste Empfindlichkeit für UV-Strahlung aufwies, da dieser bereits bei einer Dosis unter 0,01 J/cm² eine Erhöhung der Biolumineszenz um den Faktor 1.000 lieferte.

Fig. 3 zeigt die Zunahme der Biolumineszenz nach Bestrahlung des erfindungsgemäßen Biosensors mit γ-Strahlung. Die Kurven wurden bei verschiedenen Strahlungsdosen ermittelt. Die unterste Kurve betrifft ein Kontrollergebnis, die ohne Bestrahlung mit γ-Strahlung gemessen wurde. Der oberste Kurvenverlauf entspricht dem Ergebnis bei einer Bestrahlung mit 11 Gy, darunter jeweils abnehmend mit 7 Gy, mit 3 Gy, mit 2 Gy. Der Aufnahme der Kurve 2 von unten ist eine Bestrahlung mit 1 Gy vorausgegangen.

Beispiel Herstellung des Plasmids pPLS1

Die DNA wird mit etablierten molekularbiologischen Methoden aus dem Photobacterium leiognathi isoliert und partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut. Die dabei entstehenden DNA- Fragmente werden mit Standardmethoden in die BamHI-Restrik­ tionsschnittstelle des mit zwei kurven Fragmenten aus dem Polylinker des Plasmids pUC18 modifizierten Vektors pBR322, aus dem der Abschnitt für die Tetracyclin-Resistenz entfernt wurde, einkloniert. Anschließend wird das 1,54 kBp lange SmaI-SmaI- Fragment aus dem Plasmid ColD-CA23, das den SOS-Promotor des Gens cda enthält, 56 Bp aufwärts vom 5′-Ende des lux-Operons in die SmaI-Restriktionsschnittstelle kloniert. Die Expression des lux-Operons und damit die Biolumineszenz ist daraufhin abhängig von der Induktion des SOS-Promotors durch DNA-schädi­ gende Agentien.

Referenzbeispiel 1

Von der gefrorenen Stammsuspension mit E. coli K12 C600 CR 34 (ATCC223724), die das Plasmid pPLS1 enthalten, wird eine Über­ nachtkultur hergestellt. Diese Suspension kann über mehrere Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Vor der Behandlung mit dem Mutagen wird die Zellsuspension zwei Stunden lang in LE-Medium, das mit Ampillicin supplementiert ist, bei 37°C bebrütet. Nach geeigneter Verdünnung (ungefähr 1 : 500 bis 1 : 2500) werden die Zellen mit dem Mutagen oder Karzinogen (z. B. chemisches Mutagen, UV-Strahlung, ionisierende Strahlung) behandelt. Danach wird die Zellsuspension weitere 30 bis 120 min bei 30 bis 37°C bebrütet.

Während der Bebrütung führt die Induktion des SOS-Systems zu einer Zunahme der Biolumineszenz, die bis zu einem Maximalwert ansteigt. Fig. 2 und 3 geben zwei Beispiele für den Nachweis von UV(254 nm)-Strahlung und γ-Strahlung. Die Messung wird am ansteigenden Teil der Kurve nahe des Maximums durchgeführt. Während der Bebrütung wird die Lichtemission I auf drei Kanälen gemessen: (1) Kontrollwert (I_c) von unbehandelter intakter Suspension, (2) positive Kontrolle (I_i) von einer Suspension, die mit einer definierten Dosis (F_i) z. B. von UV-Licht bestrahlt worden ist, und (3) Meßwert (I_e) von einer Suspension, die mit einem unbekannten Mutagen/Karzinogen unbekannter Dosis (F_e) behandelt worden ist. Das Ergebnis wird nach folgender Formel ermittelt:

F_e = (I_e-I_c)/(I_i-c)xF_i.

Die Lichtintensität wird mit z. B. mit einem Luminometer (LKB) gemessen. Das Verfahren ist empfindlich genug, um Strahlendosen kleiner 1 Gy nachzuweisen.

Claims (5)

1. Plasmid, erhältlich durch Ligation der Fragmente I, II, III, IV, V, wobei Fragment I aus Photobakterium leiognathi stammt und die lux-Gene CDABE trägt, wobei lux A,B die α- und β-Untereinheit des Enzyms Luciferase, lux C,D,E die Proteine für die Synthese des Aldehyd-Substrats der Lumi­ neszenz-Reaktion kodieren, das Fragment II ein mit BamHI und EcoRI geschnittenes Fragment aus pBR322 ist, daran anschließend das Fragment III aus pUC18 mit Restriktions­ schnittstellen EcoRI und SmaI ligiert ist, woran sich das Fragment IV mit den Restriktionsschnittstellen SmaI-SmaI als SOS-Promotor aus ColD-CA23 anschließt und der Plas­ midringschluß zu Fragment I durch ein Fragment V aus pUC18 mit den Restriktionsschnittstellen SmaI bis SphI erfolgt.

2. Plasmid, nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung pPLS1 hinter­ legt bei der DSM mit der Hinterlegungsnummer DMS 10333.

3. Mikroorganismen, transformiert mit einem Plasmid nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2.

4. Zusammenstellungen mit Mikroorganismen nach Anspruch 3 zur Durchführung eines Verfahrens zur luminometrischen Be­ stimmung der mutagenen und/oder karzinogenen, im weiteren Sinne genotoxischen Potenz einer zu untersuchenden Probe und/oder eines auf die zu untersuchende Probe einwirkenden Agens mittels Mikroorganismen, die ein SOS-System aufwei­ sen, gegebenenfalls mit weiteren Hilfsreagenzien.

5. Zusammenstellung nach Anspruch 4, mit Hilfreagenzien zur Vorbereitung des Mikroorganismus und/oder der zu unter­ suchenden Probe auf die luminometrische Bestimmung.