CH667672A5 - Plasmidvektoren mit hoher reduplikationsrate und diese enthaltende und replizierende mikroorganismen sowie verfahren zu ihrer herstellung. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft Plasmidvektoren mit hoher Reduplikationsrate und Mikroorganismen, die diese enthalten und replizieren und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die sogenannte Genmanipulationstechnik oder in anderen Worten die Gentechnik wird immer wichtiger bei der Herstellung von medizinisch nützlichen Produkten. Gemäss einer bevorzugten Variante dieser Technik wird der Genabschnitt, der für die Herstellung des gewünschten pharmazeutischen Wirkstoffs codiert, in einen Vektor, z.B. ein Plasmid, eingefügt, um ein rekombinantes «Hybrid»-Plasmidmolekül zu liefern, das dann zur Transformation eines geeigneten Mikroorganismus verwendet wird. Das Plasmid wird dann zusammen mit dem bakteriellen Wirt repliziert und das eingefügte Gen funktioniert. Die Anzahl der Genprodukte hängt von der Intensität der Translation und Transkription, von der Aufspaltung des Genprodukts innerhalb der Zelle und von der Reduplikationsrate des Gens, d.h. des Plasmids ab, welches das Gen trägt. Folglich kann eine beträchtliche Erhöhung der Anzahl der Genprodukte durch die Erhöhung der Reduplikationsrate des Fremdgens erzielt werden, wenn es gelingt, die Reduplikationsrate eines Plasmids in einer Zelle zu erhöhen. (Zur Genmanipulationstechnik siehe z.B. US-PS 4 237 224).

Deshalb liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Plasmidvektoren, die eine wesentlich höhere Reduplikationsrate pro Zelle haben als die bekannten und viel verwendeten Plasmide und Mikroorganismen, die diese enthalten und replizieren, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

In der wissenschaftlichen Forschung und in der Industrie werden eine Vielzahl an verschiedenen, im allgemeinen künstlich konstruierten Plasmidvektoren verwendet. Eines der am meisten verwendeten Plasmide ist pBR322, das zuerst von Boyer et al. konstruiert wurde (Gene, 2,95 — 113 (1977)).

Seitdem und bis heute verfügen wir über die erschöpfendsten wissenschaftlichen Informationen über dieses Plasmid und die meisten Genklonierungsverfahren wurden mit diesem Plasmid oder seinen Derivaten durchgeführt, da diese Substanz meistens als Ausgangsmaterial bei den Versuchen verwendet wurde. Die Struktur des pBR322 wurde von Sut-cliffe bestimmt (CSH Symp. Quant. Biol. 43, 77 — 90 (1979)) und wird in Fig. 1 veranschaulicht. Dieses Plasmid hat eine Molekularlänge von 4362 bp. Die Replikation des Plasmids beginnt an dem Nukleotid 2536 entgegen dem Uhrzeigersinn und seine Reduplikationsrate pro Zelle beträgt im allgemeinen zwischen 20 und 50. Die Reduplikationsrate wird durch einen komplizierten Reguliermechanismus gesteuert (Plasmid 9,1, (1983)). Das Fragment zwischen den Nukleotiden 2978 und 3081 ist für die Synthese einer RNA mit niedrigem Molekulargewicht verantwortlich, welche nicht für irgendein Protein codiert und die im Uhrzeigersinn mit einer relativ hohen Intensität transkribiert wird. Diese RNA mit niedrigem Molekulargewicht ist der negative Regulator (Repressor) der Plasmidreplikation.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, dass die Reduplikationsrate des Plasmids wesentlich erhöht werden kann, wenn in dem Genabschnitt, der für die Herstellung des Repressors der Plasmidreplikation verantwortlich ist, eine Mutation vorgesehen wird, die die Funktion dieses Genabschnitts beeinträchtigt.

Im eigenen Laboratorium wurde das erste Plasmid mit hoher Reduplikationsrate (pHCl) als das Produkt einer spontanen Mutation in einem Versuch isoliert, der mit Plasmiden des ampr, tets Phänotypus durchgeführt wurde, die eine Fremd-DNA zwischen den EcoRI und BamHI Spaltungsstellen des Plasmids pBR322 enthielten, und zwar während der Untersuchung eines Pools von Rekombinanten, die aus etwa 5000 unabhängigen Plasmiden bestanden. Aus den das Plasmid pHcl enthaltenden Bakterienzellen konnte etwa 20 bis 30 Mal mehr Plasmid-DNA ohne Verstärkung isoliert werden, als aus den Clonen, die andere rekombinante Moleküle mit ähnlicher Struktur enthielten. Diese wiederholte Retransformation des Plasmids pHCl unter Verwendung

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von E. coli HBIOI (pro-, leu", thi-, lac-, str-, r-m-rndol-, recA-) (Boyer, H.W. et al.: J. Mol. Biol. 41, 459—472 (1979)), C600 (rie-, nik-, thi-, leu-, lac-) (Boyer, H.W. et al., ibid.)), ED8800 (supE, supF, hsdS-, met-, lacZMI5, recA56) (Murray N.E. et al.: Mol. gen. Genet. 150, 53—61 (1977)) ergaben sich jedes Mal Wirtszellen bei der Erzeugung von ampr, tets Clonen, die eine grosse Menge an Plasmid enthielten. Als Grund für die erhöhte Reduplikationsrate, die etwa 20 bis 30 mal höher war als die der pBR Plasmide, muss eine vererbliche Änderung in der Plasmid-DNA angenommen werden.

Identifizierung der Mutation, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich ist.

Das Plasmid pHCl wurde mit Restriktionsendonucleasen EcoRI und Prüll aufgeschlossen und dann wurden die Einfachstrangenden mit dem Klenow Unterfragment des DNA Polymerase I Enzyms in Anwesenheit von dNTP Substraten gefüllt. Die so hergestellten DNA-Moleküle mit stumpfen Enden wurden mit einem Polynucleotid-Ligase-Enzym zir-kularisiert und in HB101 Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus den auf einem Ampicillin enthaltenden Medium gezüchteten Kolonien isoliert und die DNA-Proben, die in grosser Menge isoliert werden konnten, wurden mittels Agarose und Polyacrylamidgelelektrophorese nach Aufschliessung mit Restriktionsendenucleasen EcoRI, PvuII und BspRI analysiert. Das Plasmid pHC81 (Fig. 2), das für die weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde, konnte mit dem Enzym PvuII nicht aufgeschlossen werden und wurde mit EcoRI linearisiert. Auf der Basis des Gesamtmolekulargewichts des Plasmids (2,3 kb) und der Grösse der Fragmente, die durch Aufschliessung mit BspRI erzielt wurden (587, 457,434, 267, 240, 80 ... bp) wurde nachgewiesen, dass das Plasmid pHC81 den Abschnitt zwischen den Nukleotiden 2069 und 2 des Plasmids pBR322 mit einer Mutation enthielt, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich war. Diese Mutation kann nicht aufgrund der Grösse irgendeines der von den verwendeten Enzymen hergestellten Fragmente festgestellt werden. Um die Mutation zu lokalisieren, wurden das 1030 bp DNA-Fragment, das durch Aufschliessung von pHC81 mit den Restriktionsendonucleasen Pstl und Tagl erzielt wurde, das 780 bp DNA-Fragment, das durch Aufschliessung von pBR322 mit den Enzymen Pstl und Clal erzielt wurde und das 218 bp DNA-Fragment, das durch Aufschliessung von pBR329 mit dem Enzym Taql erzielt wurde, isoliert. Die drei DNA-Fragmente wurden im äquimolaren Verhältnis gemischt, mit einer Polynukleotidli-gase gekoppelt, und dann wurden HB 101 Zellen mit dem Li-gat transformiert. Aus den einzelnen, auf dem Ampicillin enthaltenden Medium gezüchteten Clonen, wurde Plasmid-DNA isoliert. Diese Plasmide wiesen den Phänotypus mit hoher Reduplikationsrate auf. Durch Aufschliessung der Plasmid-DNA's mit Restriktionsendonucleasen wurde nachgewiesen, dass sie durch die Verbindung von drei gut unterscheidbaren Fragmenten verschiedenen Ursprungs erzeugt wurden; in den erhaltenen Plasmiden war der proximale Teil des ß-Lactamase-Gens von pBR322 Ursprung, der Bereich, der das Replikationsorigin enthält, wurde von dem Plasmid pBR329 abgeleitet und das Fragment, das aus pHC81 isoliert wurde, enthielt zusätzlich zu dem distalen Teil des ß-Lactamasegens auch die Mutation, die zu der hohen Reduplikationsrate führt. Daraus wurde gefolgert, dass die Mutation zwischen den Nukleotiden 2573 (Taql) und 3612 (Pstl) der DNA des Plasmids pBR322 gebildet worden war. Die Nukleotidsequenz dieses Bereichs wurde bestimmt und mit der bekannten pBR322 Sequenz verglichen. Dieser Vergleich zeigte, dass eine G-»T Umwandlung (G — Desoxyguanyl, T = Thymidyl) an dem Nukleotid 3074 stattgefunden hatte,

was einer C->A Umwandlung in dem Komplementär-DNA-Strang entspricht (C = Desoxycytosyl, A = Desoxyadenyl).

Als Ergebnis der resultierenden Punktmutation ist die Beendigung der Transkription der Repressor-RNA beschä-5 digt und eine RNA mit höherem Molekulargewicht wird synthetisiert, die nicht länger als Replikationsrepressor wirken kann. Die Beendigung der Repressorfunktion führt zu einer höheren Reduplikationsrate. Durch diese spontane Punktmutation, die auch absichtlich verursacht werden io kann, könnte die Reduplikationsrate des Plasmids pro Zelle um das zwanzig- bis dreissigfache ( s 1000) mit Bezug auf den ursprünglichen Wert erhöht werden. Durch diese Punktmutation kann die Reduplikationsrate irgendeines Plasmids, das den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 hat, bei-15 spielsweise der in der US-Patentschrift 4 371 625 erscheinenden Plasmide pPC Ol, pPC <52 und pPC <t>3, wesentlich erhöht werden.

Es wurde jedoch festgestellt, dass das ursprüngliche Plasmid pBR322, das eine G—>T Punktmutation enthält, nicht 20 länger lebensfähig ist. Durch die hohe Reduplikationsrate wird bei den Genen des Plasmids, die die Antibiotikumresistenz bestimmen — Apr = ß-Lactamase, Tcr-> = Mem-branprotein(e), die Synthese beider Proteine erhöht; und das letztere (Membranprotein verantwortlich für die Tetracy-25 clinresistenz) ist in grösserer Menge für die Zelle tödlich. Das gleiche Problem wird im Falle irgendeines Derivats von Plasmid pBR322 mit hoher Reduplikationsrate festgestellt, welches das ursprüngliche Tetracyclinresistenzgen in unveränderter Form enthält.

30 Bei eigenen früheren Versuchen wurde man nicht mit diesem Problem konfrontiert, da Plasmide verwendet worden waren, in denen Fremd-DNA-Fragmente zwischen die Stellen BamHI und EcoRI des Plasmids pBR322 cloniert worden waren und auf diese Weise das Tetracyclinresistenzgen 35 inaktiviert worden war. Entsprechend muss, um ein lebensfähiges Plasmid mit hoher Reduplikationsrate zu erhalten, pBR322 oder ein Derivat davon mit demselben Replikationsbereich, durch Inaktivierung oder Repression der Funktion des Tetracyclinresistenzgens abgeändert werden. 40 Daher sind gemäss der Erfindung Plasmidvektoren, die den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 und eine G->T Punktmutation im Genabschnitt, der die RNA codiert, die als Repressor der Replikation wirkt, haben und a) ein Ampicillinresistenzgen des Plasmids pBR322 als ei-45 nen selektiven genetischen Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren das Tetracyclinresistenzgen inaktiviert wurde oder vollkommen fehlt oder eine reprimierte Wirkung hat, oder b) die Ampicillin- und Tetracyclinresistenzgene des Piasso mids pBR322 als selektive genetische Markierer enthalten,

wobei in diesen Plasmidvektoren die Transkription des Tetracyclinresistenzgens durch einen Mutanten, der schwächer als natürlich ist, oder durch einen Fremdpromotor erfolgt, vorgesehen.

55 Wie vorstehend beschrieben, muss zur Herstellung der erfmdungsgemässen Plasmidvektoren die GC->TA Punktmutation auf dem Ausgangsplasmid erzeugt werden, bei dem das Tetracyclinresistenzgen vollkommen fehlt oder seine Wirkung inaktiviert oder reprimiert wurde. In diesem Zu-60 sammenhang bedeutet Repression, dass das Gen, das für die Erzeugung des Membranproteins codiert, für die Tetracyclinresistenz verantwortlich ist, geändert wird, um eine verringerte Proteinerzeugung zu steuern. Gemäss einer bevorzugten Variante wird die DNA, die für die Tetracyclinresi-65 Stenz verantwortlich ist, oder der Gesamtabschnitt bis zu dem Replikationsorigin des pBR322 beseitigt und gegebenenfalls durch einen Polykoppler synthetischen Ursprungs ersetzt, wodurch auf Grund der in das Plasmid eingefügten

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zusätzlichen Restriktionsendonuclease-Aufschliessungsstel-len. die Anwendungsmöglichkeiten der erzielten Plasmide wesentlich erweitert werden können.

Die in Fig. 3.4 bzw. 5 gezeigten Plasmidvektoren pHC 314. pHC 312 und pHC 624 sind besonders bevorzugte Vertreter der erfindungsgemässen Plasmide mit hoher Reduplikationsrate. Sie haben die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

1 ) Als Ergebnis einer Modifikation in der Struktur des Gens, das für die RNA mit niedrigem Molekulargewicht codiert. die als Replikationsrepressor wirkt, wird ihre Replikation dereprimiert. damit wird die Reduplikationsrate innerhalb der Zelle wesentlich höher und liegt im allgemeinen bei 1000 (ca. 65°/o des Gesamt-DNA-Inhalts der Zelle). Diese hohe Reduplikationsrate hat keinen Einfluss auf die als Wirtszellen verwendeten E. coli Zellen.

II. Die Plasmide dieser Serie enthalten die Aufspaltungsstellen für zahlreiche Restruktionsendonucleasen. Aus diesem Grund können DNA-Fragmente, die durch diese Enzyme. durch ihre Kombination oder durch andere Endonu-cleasen. welche die gleichen Enden erzeugen, aufgeschlossen sind, leicht in diese Plasmide eingefügt werden.

Stellen, die zur Clonierung der erfindungsgemäss bevorzugten Plasmide geeignet sind, sind wie folgt:

pHC 314: C1AI, Hindlll, XBal, BamHI, Bglll und fakultative Kombinationen dieser Stellen;

pHC 312: C1AI, Hindill, Xbal, Bglll, EcoRI und fakultative Kombinationen dieser Stellen;

pHC 624: EcoRI. Hindlll, BamHI, Xbal, Bglll, Smal,

(Xmal), sali und ihre Kombinationen mit einigen Einschränkungen.

III. Die Grösse der bevorzugten pHC-Plasmide ist wesentlich kleiner, als die des Ausgangs-pBR322. So beträgt die Grösse der in Fig. 3, 4 und 5 gezeigten Plasmide 2405 bp, 2010 bp und 2015 bp. Dies ist von Vorteil, da die Reduplikationsrate der meisten Vektorplasmide innerhalb der Zelle umgekehrt proportional zu der Grösse des Plasmids ist. Bei Genclonierungsversuchen kann das grössere Gen wirksam cloniert werden, die kleineren Vektoren werden eingesetzt.

IV) Diese Plasmide haben das Ampicillinresistenzgen des ursprünglichen pBR322 als selektiven genetischen Markierer.

V) Sie enthalten das Replikationsorigin des ursprünglichen pBR322.

Gegenstand der Erfindung sind auch Mikroorganismen, die irgendwelche der erfindungsgemässen Plasmidvektoren enthalten und replizieren.

Konstruktion der Plasmide pHC314, pHC312 und pHC624

Während der weiteren Transformation der, gemäss vorstehend beschriebener Versuche erhaltenen Plasmide, wurden Polykoppler in das pHC81 Plasmid eingefügt, zur Erzeugung von Vektoren, die zur Einfügung der DNA-Frag-mente geeignet sind, die mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen gebildet wurden. Die DNA des Plasmids pHC81. die mit der Endonuclease EcoRI linearisiert worden war und mit bakterieller alkalischer Phosphatase depho-sphoryliert wurde, wurde mit Plasmid-DNA-Fragmenten gekoppelt (Seed. B.: Nucleic Acid Research 11, 2427 — 2446 (1983)) und E. coli HB 101 Zellen wurden mit dem Koppler transformiert. Plasmid-DNA wurde aus den Ap-resistenten bakteriellen Kolonien isoliert und mit Hilfe von Gel-Elektrophorese nach Aufschliessung von EcoRI und Pstl Restriktionsendonucleasen analysiert. Für weitere Untersuchungen wurde das Plasmid, das durch EcoRI auf 2300 und 110 bp Fragmente und durch Pstl auf 1580 und 820 bp Fragmente aufgespalten werden konnte, ausgewählt (pHC 314, Fig. 3). Aus diesem Plasmid wurde PHC312, das nur eine

EcoRI Stelle enthielt, wie folgt konstruiert: das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI aufgeschlossen und das erzielte lineare Molekül teilweise mit einem Hinfl Enzym aufgeschlossen. Die DNA-Fragmente wurden in einem 1,2%-igen Agarose-Gel getrennt und das 2010 bp Fragment isoliert. Die Molekülenden, die auf Grund der Aufschliessung mit BamHI und Hinfl Enzymen einzelsträngige Abschnitte enthielten, wurden mit dem Klenow-Subfrag-ment der Enzym-DNA-Polymerasel in stumpfe Enden umgewandelt und dann mit Tj-induzierter Polynukleotidligase rezirkularisiert. Die verbundene DNA wurde in HB101 Zellen transformiert und einzelne Clonen isoliert. Für weitere Arbeiten wurde das Plasmid pHC312, das mit Endonuclease BamHI nicht aufgespalten, aber mit EcoRI linearisiert werden konnte und bei Aufschliessung mit Hinfl, 1495 bp und 516 bP Fragmente ergab, ausgewählt (Fig. 4). Um einen Vektor mit hoher Reduplikationsrate herzustellen, der zur Clonierung von DNA-Fragmenten mit stumpfen Enden geeignet ist, wurde das Plasmid pHC312 mit Restriktionsendonucleasen EcoRI und Hindlll aufgeschlossen und das 1980 bp Fragment aus Agarose-Gel isoliert. Dieses Fragment wurde dann der DNA des Plasmids tcAN7 zugemischt (Seed, B.: Nucleic Acids Research, 11,2427 — 2446 (1983)), das mit den Enzymen EcoRI und Hindlll aufgeschlossen worden war, und die Moleküle wurden mit Polynukleotidligase verbunden. E. coli HB101 Zellen wurden mit dem verbundenen Plasmid transformiert und aus einzelnen Ap-resistenten Bakterienclonen wurde Plasmid-DNA isoliert. Die auf diese Weise erzielte Plasmid-DNA (pHC624, Fig. 5) hat keine Clal Stelle, aber anders als Plasmid pHC312 kann es mit Restriktionsendonucleasen Smal, sali und BamHI linearisiert werden.

Bestimmung der Reduplikationsrate von Plasmiden a) Relative Reduplikationsrate Zur Bestimmung der relativen Reduplikationsrate von pHC Plasmiden wurden E. coli HB101 Kulturen, die Plasmide verschiedener Grösse enthielten, die vom rekombinanten pBR322 und Derivaten der gleichen Grösse mit hoher Reduplikationsrate abgeleitet worden waren, gezüchtet, bis eine identische Zelldichte erreicht wurde. Aus identischen Mengen der erzielten Suspensionen wurde ohne Verstärkung Plasmid-DNA gemäss der von Birnboim und Doly beschriebenen Technik isoliert (Nucleic Acids Res. 7,1513 —1523 (1979)). Den DNA-Präparaten entnommene Proben wurden einer Elektrophorese auf Agarose-Gel in 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40- bzw. 50-fachen Verdünnungen unterworfen. Die Plasmide mit hoher Reduplikationsrate und ihre Paare mit normaler Reduplikationsrate (die das gleiche Molekulargewicht hatten) wurden gleichzeitig untersucht. Versuchsergeb-nisse zeigten, dass die Reduplikationsrate von pHC Plasmiden etwa 20 bis 30 mal grösser war als die der entsprechenden pBR322 Derivate mit «normaler Reduplikationsrate».

b) Absolute Reduplikationsrate Die absolute Reduplikationsrate der pHC Plasmide wurde bestimmt, indem die DNA der Zellen, die die Plasmide in vivo enthielten, markiert wurden und das Verhältnis der Radioaktivität in der abgetrennten Plasmid-DNA und in der chromosomalen DNA gemessen wurde. Durch diese Methode wurde festgestellt, dass die Reduplikationsrate der Plasmide mit gleicher Grösse wie pH314 (Molekulargewicht = 1,6- 106d) ungefähr 1000 pro Zelle betrug (Molekulargewicht des Chromosoms = 2-109d). 60 bis 65% des Gesamt-DNA-Inhalts der Zelle war Plasmid-DNA. Für die in vivo Markierung der DNA wurden die die Plasmide enthaltenden Zellen auf einem M9 Kulturmedium gezüchtet, welches durch eine 20-minütige Sterilisierung eines Mediums bei 121 °C erzielt

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wurde, bestehend aus Na2HP04 6 g KH0PO4 3 g NaCl 0,5 g NH4CI 1 g HoO bis 1000 ml,

und einen pH Wert von 7 hatte, und mit den folgenden Komponenten ergänzt wurde:

0,5% Casaminosäure (Difco)

0,5% Glucose 1 ng/ml Vitamin Bi

1 Millimol MgS04

2 |0.g/ml Thymidin

250 jag/ml Adenosin und

0,4 mBq/ml [3H]-Thymidin [888tBq/Millimol, Chemapol, Prag.].

Die Plasmid enthaltenden Zellen wurden gemäss Wom-ble et al. (J. Bacteriol., 130 (1977) 148 — 153) aufgeschlossen. Die chromosomale und die Plasmid-DNA wurden voneinander durch

Äthidiumbromid/Cäsiumchlorid-Gleichgewichtsdichtegrad-

Zentrifugation des Zell-Lysats, das von einer Bakteriensuspension abgeleitet wurde, die auf 2 ml gezüchtet worden war (ODs50 = 4—5/45000 Upm, Rotor des Beckman Typs 65, 40 Stunden, 20 C), getrennt.

Die erhöhte Reduplikationsrate wird in den Figuren 6 und 7 gezeigt.

In Fig. 6 werden Flecken, die Apr, Tc2 rekombinanten Plasmid-DNS's des pBR322 Ursprungs entsprechen, nach der Trennung durch Äthidiumbromid/Agarosegelelektrophorese gezeigt. Alle Proben wurden mit derselben Technik, aus der gleichen Menge an Plasmid enthaltenden HB 101 Zellen hergestellt (Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 —1523 (1979)). Die Proben 1 bis 2 und 4 bis 6 sind re-kombinante Plasmide, die ein 1,5 bis 2,0 kb Fremd-DNA zwischen den Aufspaltungsstellen EcoRI und BamHI des Plasmids pBR322 enthalten. Die Probe 3 ist ein Plasmid der gleichen Grösse, das die Mutation enthält, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich ist (pHCl).

In Fig. 7 werden Flecken der DNA von E. coli HB101 Zellen gezeigt, die das Plasmid p715 (Probe A) und das Plasmid pHC314 (Probe B) enthalten, nach Trennung durch Äthidiumbromid/Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation. (Das Plasmid p715 hat die gleiche Struktur wie pHC314 mit Ausnahme der Mutation, die für die hohe Reduplikationsrate verantwortlich ist.).

Die Aufnahme wurde nach der Trennung des Plasmids und der chromosalen DNA durch Zentrifugation mit ultravioletter Beleuchtung des Zentrifugenglases, das die DNA enthält, gemacht.

Wie deutlich auf dem Photo zu sehen, fehlt in der DNA, die aus den Zellen mit Plasmid mit normaler Reduplikationsrate erzielt wurden (Probe A), der Plasmid enthaltende untere Streifen fast vollkommen. Andererseits bildet die pHC314 Plasmid-DNA, die aus der gleichen Zahl von Zellen mit derselben Methode erzielt wurde, aufgrund der wesentlich höheren Reduplikationsrate des Plasmids, einen breiten Streifen unterhalb des Streifens, der die chromosomale DNA enthält.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Plasmidvektoren gemäss Anspruch 4.

Vorzugsweise wird eine G->T Punktmutation in der Position 3074 des Genabschnitts, der die Repressor-RNA codiert, gemäss der ursprünglichen Numerierung von pBR322, wie es weiter unten ausführlich beschrieben wird, erzeugt.

Verschiedene alternative Ausführungsformen stehen zur Beseitigung der durch Tetracyclinresistenz verursachten Probleme zur Verfügung. Gemäss einer Ausführungsform wird der DNA-Abschnitt der für die Erzeugung des Membranproteins für die Tetracyclinresistenz verantwortlich ist,

durch eine Polykoppler-DNA synthetischen Ursprungs, die durch eines oder mehrere bedeutende Restriktionsenzyme aufspaltbar ist, ersetzt. Gemäss einer alternativen Ausführungsform kann ein Fremd-DNA-Abschnitt in das Gen für die Tetracyclinresistenz eingesetzt werden, wodurch seine Wirkung inaktiviert wird.

Gemäss weiterer alternativer Ausführungsformen wird die Transkription des Gens für die Tetracyclinresistenz durch eine Mutation im Promotorbereich oder durch Ersetzen des natürlichen Promotors durch einen «Fremd»-Promotor, welcher eine weniger intensive Transkription sichert, vermindert.

Die erfindungsgemässen Plasmidvektoren mit hoher Reduplikationsrate haben verschiedene Anwendungsbereiche. Sie oder entsprechende Mikroorganismen können zur Herstellung irgendeines clonierten Abschnitts des gesamten Chi-märenplasmids in reiner Form für Kontrollversuche, zum Nachweis von Strukturen, zur Modifizierung oder Transclo-nierung und insbesondere zur Herstellung von Insulin oder Vasopressin, wobei die letztgenannten Beispiele für industrielle Anwendungen sind, eingesetzt werden.

Bei Verwendung der erfindungsgemässen Plasmide kann die gleiche Menge an DNA aus beträchtlich weniger Ausgangsmaterial erzielt werden, als in dem Fall der allgemein verwendeten, aus der Literatur bekannten Plasmide. Im Falle der als Beispiel angeführten pHC Plasmide ist ungefähr 20 bis 30 mal weniger Ausgangsmaterial erforderlich als bei pBR322, um die gleiche Menge an DNA herzustellen. Die Plasmid-DNA, die aus einer einzigen Kolonie eines Bacteri-ums, das pHC Plasmide trägt, isoliert werden kann, reicht für 3 bis 4 Restriktionsanalysen. Aus einem Liter der Bakterienkultur können mehr als 10 mg reines Plasmid isoliert werden.

Falls die erhöhte Menge des Produkts des clonierten Gens für die Wirtszelle erträglich ist, kann die Synthese irgendeines Genprodukts durch die Verwendung von erfindungsgemässen pHC-Plasmiden erhöht werden. In einem optimalen Fall ist die Ausbeute etwa 20 bis 30 mal grösser, da dieses Mass an Gendosiserhöhung erreicht werden kann. In bestimmten Fällen ist die Erhöhung etwas geringer wegen der begrenzenden Rolle anderer Faktoren.

Die Einfügung von Polykopplerbereichen in die pHC Plasmide verleiht ihnen eine grosse Flexibilität. Wenn die Abspaltungsstellen für das zu clonierende Gen ungeeignet sind, können sie ersetzt oder für die Clonierung mit anderen Fragmenten mittels synthetischer Adaptoren geeignet gemacht werden.

Zusätzlich zu den veranschaulichten technischen Lösungen gibt es zahlreiche weitere Möglichkeiten um mit der Erfindung zu arbeiten. Die entsprechenden DNA-Abschnitte, die 21 bzw. 32 Nukleotide enthalten, können z.B. unter Verwendung der Enzyme Fnu4HI und Tthill von dem ursprünglichen pBR322 abgespalten werden, wobei die entsprechenden Fragmente, die eine G->T Punktmutation enthalten, chemisch synthetisiert und in das Molekül von pBR322 statt der beseitigten Fragmente eingefügt werden können.

In gleicher Weise kann eine Vielzahl von synthetischen Polykoppler-DNA-Fragmenten in das Molekül anstelle des teilweise oder gänzlich beseitigten DNA-Abschnitts eingefügt werden, der für die Tetracyclinresistenz verantwortlich war.

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Plasmide pHC 312, pHC 314 bzw. pHC 624 wurden am 7. März 1984 bei der Ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszâgos Kôzegészségûgyi Intézet, Budapest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00279, 00280 und 00281 hinterlegt. Sie befinden sich nun bei der National Collection of Agricultural and Industriai Mi-croorganisms (NCAIM) Kertészeti Egyetem, Mikrobiologiai Tanszék, Somloi ut 14—16, Budapest, Ungarn.

Plasmide P 715, pHC 1, pHC 81, ttAN 7 bzw. tivX wurden am 25. Juli 1984 bei der Ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszâgos Kôzegészségûgyi Intézet, Budapest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00293, 00294, 00295, 00296 bzw. 00297 hinterlegt und befinden sich nun bei der NCAIM an der oben angegebenen Adresse.

Mikroorganismen E. coli HB 101, E. coli ED 8800 bzw. E. coli C 600 wurden am 25. Juli 1984 bei der Ungarischen Nationalen Stammsammlung von Mikroorganismen (Orszâgos Kôzegészségûgyi Intézet, Budest, Ungarn) unter den Nummern MNG 00290,00291 bzw. 00292 hinterlegt und befinden sich nun bei der NCAIM an der oben angegebenen Adresse.

Die Stämme E. Coli 46 101/pBR 322 E. Coli HB 101/ pBR 329 wurden bei der gleichen Hinterlegungsstelle am 12. September 1984 unter den Nummern 00298 bzw. 00299 hinterlegt und befinden sich nun bei der NCAIM an der oben angegebenen Adresse.

Die Erfindung wird an Hand des folgenden Beispieles näher erläutert.

Beispiel

Bei den Versuchen wurden die folgenden Materialien und Techniken verwendet:

Bacterium-Stämme und Plasmide:

pBR322 ampr, tetr [Bolivar, F. et al.: Gene 2, 95 — 113 (1977)];

pBR329 ampr, chlr, tetr (Covarubbias, L., Bolivar, F.: Gene, 17, 79-89(1982).

ipBR 322 und pBR 329 ist uneingeschränkt von H.W. Boyer, Abt. Biochem. Biophys., Univ. Calif., San Francisco, Kalifornien 94 143, USA erhältlich oder kann frei von Boehringer Mannheim GmbH Biochemica, Postfach 310120, D-6800 Mannheim 31 gekauft werden und ferner wurde pBR322 in der US-Patentschrift 4 371 625 [C. N. C. M. No. 1-065] beschrieben.}

Die ttvX und rcAN7 Plasmid-DNA-Präparate wurden im Institute of Biochemistry, Biological Research Centre, der Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn [Seed, B.: Nucleic Acids Research, 11, 2427 — 2446 (1983)] hergestellt.

Die verwendeten Restriktionsendonuclease-, T4-induzier-te Polynukleotidkinase- und Polynukleotidligase-Präparate wurden im Institute of Biochemistry, Biological Research Centre der Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn, unter Verwendung veröffentlichter Reinigungsmethoden hergestellt [Roberts, R. J.: Nucleic Acids Research 11, r 135 — r 137 (1983); Murray, N.E. et al.: J. Mol. Biol. 132, 493 — 505 (1979); Panet, A. et al.: Biochemistry, 12, 5045 — 5050 (1973)]. Das Klenow-Fragment der Enzym-DNA-Polymerasel war das Produkt der New England Bio Labs, während die bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) von Worthington hergestellt worden war.

Das [y-32P]ATP (Hungarian Isotope Institute, Budapest) hatte eine spezifische Aktivität von 22 TBq/mM.

Das YTB-Kulturmedium [Miller, J.H., ed. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] enthielt 10 g/1 Bacto Trypton (Difco), 5 g/1 Bacto-Hefeextrakt (Difco) und 5 g NaCl. Um YTA-Platten herzustellen, wurde das YTB-Kulturmedium mit 15 g/1 Bacto-Agar (Difco) ergänzt.

Zur Isolierung von Plasmid-DNA wurden die Bacterium-Stämme E. coli HB 101, C600 und ED8800, die die geeigneten Plasmide enthielten, auf dem YTB-Kulturmedium gezüchtet, das 100 [ig/ml Ampicillin (Pharmachim, Sofia) enthielt. Vor der Isolierung jedes nicht-pHC Plasmids wurden 170 ng/ml Chloramphenicol den Bakteriumkulturen bei ODöoonmOJ—0,8 hinzugefügt, die dann weitere 10 bis 12 Stunden geschüttelt wurden. Die Plasmide mit hoher Reduplikationsrate (pHC) wurden aus den Zellen einer Kultur, die bis zur stationären Phase gezüchtet worden war, ohne Verstärkung isoliert. Bei der Isolierung von Plasmid-DNA in präparativen Mengen (von 50 bis 100 ml der Bacterium-Kultur im Falle von pHC Plasmiden und 1 bis 3 Liter der Kultur im Falle anderer Derivate), wurde ein klares Lysat mit der Methode von Clewell und Helinski [J. Bacteriol., 110,1135 (1972)] hergestellt, und die Plasmid-DNA wurde auf einer Sephacryl S1000 (Pharmacia) Kolonne gereinigt. Um Plasmid DNA für analytische Zwecke (aus 1,0 bis 1,5 ml der Bacterium-Kultur) zu isolieren, wurde die von Birnboim und Doly entwickelte, von D. Ish-Horowich modifizierte Kaliumazetat-Methode verwendet [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)].

Die Aufschliessung der DNA-Proben durch Restriktionsendonucleasen wurde unter den von New England Bio Labs empfohlenen Reaktionsbedingungen durchgeführt.

Um DNA-Fragmente mit einzelstängigen Enden in Fragmente mit stumpfen Enden zu transformieren, wurde DNA mit Alkohol nach Aufschliessung mit dem Restriktionsenzym ausgefallt und dann in einem Puffer, der 50 Milli-mol Tris-HCl, pH 7.4, 7 Millimol MgCl2,1 Millimol Dithio-threitol, 0,1 Millimol dATP, 0,1 Millimol dCTP, 0,1 Millimol dGTP, 0,1 Millimol TTP (Endvolumen: 10 bis 20 jj.1, DNA-Konzentration: 200 — 250 |xl/ml) aufgelöst. Die Lösung wurde dann mit 1 — 2 U des DNS-Polymerasel Kle-now-Fragments bei 37 °C 15 Minuten lang inkubiert [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)].

Die Reaktionsmischung (30—40|J.l) die verwendet wurde, um DNA-Fragmente mit überstehenden Enden zu verknüpfen, enthielt 0,5 bis 1,0 (Xg DNA, 66 Millimol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-HCl) (pH 7,6), 5 Millimol MgCl2, 5 Millimol Dithiothreitol, 1 Millimol ATP und 1 U T4' induzierter Polynukleotidligase. Die Verknüpfung wurde bei 14 °C 2 bis 3 Stunden lang durchgeführt [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. Fragmente mit stumpfen Enden wurden in einem Puffer verknüpft, der 30 — 40 |xg/ml DNA, 25 Millimol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Hcl) (pH 7,4), 5 Millimol MgGh, 5 Millimol Spermidin, 1 Millimol ATP, 10 jig/ml BSA (Sigma, Typ V) enthielt. Der Reaktionsmischung wurden 4 bis 6 Einheiten (U) der Xj-indizier-ten Polynukleotidligase hinzugefügt und das Ganze dann bei 14 °C während 8 bis 12 Stunden inkubiert [Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)].

Die Gelelektrophorese der DNA-Proben wurde in 0,8 bis 2,0%-igen Agarose-Gels (Sigma, Typ I) in waagrechten Elektrophoresegeräten gemäss der von Helling et al. beschriebenen Methode durchgeführt [J. Virol. 14,1235 (1974)]. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (unter Verwendung von 1% und 8% 1 mm dickem, vertikalem Gel) wurde gemäss Maniatis et al. durchgeführt [Biochemistry, 14, 3787-3794(1975)].

Zur Isolierung der DNA-Fragmente aus Agarose- und Polyacrylamid-Gel wurde die von Winberg et al. entwickelte

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Methode [Nucleic Acids, Res. 8, 253—264 (1980)] unter Verwendung von DEAE-Papier verwendet.

Kompetente Zellen für die Transformation der Bacteri-um-Stämme HB101, C600 und ED8800 wurden mit der sogenannten CaCl-i-Methode hergestellt, über die Mandel und Higa berichten. [J. Mol. Biol., 53. 154 (1970)].

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Die Dephosphorylierung der 5'-Enden der DNA-Fragmente, die Markierung der Enden mit Polynukleotidkinase und [y-32P] ATP und Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde entsprechend dem von Maxam und Gilbert beschriebenen Protokoll durchgeführt [Methods Enzymol. 65, 499 (1977)].

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3 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

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1. Plasmidvektoren, dadurch gekennzeichnet, dass sie den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 und eine G->T Punktmutation im Genabschnitt, der die RNA codiert, die als Repressor der Replikation wirkt, haben und a) ein Ampicillinresistenzgen des Plasmids pBR322 als einen selektiven genetischen Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren das Tetracyclinresistenzgen inaktiviert ist oder vollkommen fehlt oder eine reprimierte Wirkung hat, oder b) die Ampicillin- und Tetracyclinresistenzgene des Plasmids pBR322 als selektive genetische Markierer enthalten, wobei in diesen Plasmidvektoren die Transkription des Te-tracyclinresistenzgens durch einen Mutanten, der schwächer als natürlich ist, oder durch einen Fremdpromotor erfolgt.

2. Plasmidvektoren pHC 312 mit der Restriktionskarte gemäss Fig. 4, pHC 314 mit der Restriktionskarte gemäss Fig. 3 und pHC 624 mit der Restriktionskarte gemäss Fig. 5, hinterlegt beim NCAIM, Budapest, Ungarn, unter den Nummern MNG 00279,00280 bzw. 00281, als Plasmidvektoren nach Anspruch 1.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Mikroorganismen, die Plasmidvektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 2 enthalten und replizieren.

4. Verfahren zur Herstellung von Plasmidvektoren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, die den gleichen Replikationsbereich wie pBR322 aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man im Plasmid mit demselben Replikationsbereich wie pBR322, welches ein Ampicillinresistenzgen des Plasmids pBR322 als einen selektiven Markierer und das Gen für die Tetracyclinresistenz in einer inaktivierten Form oder in einer Form, die eine reprimierte Wirkung aufweist, enthält, im die Repressor-RNS codierenden Genabschnitt eine G—>T Punktmutation, welche die Repressorerzeugung modifiziert, erzeugt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine G->T Punktmutation in der Position 3074 des Genabschnittes, der die Repressor-RNA codiert, gemäss der ursprünglichen Numerierung von pBR322, erzeugt.

6. Verfahren zur Herstellung von Plasmidvektoren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Plasmid mit demselben Replikationsbereich wie pBR322, welches die Ampicillin- und Tetracyclinresistenzgene des Plasmids pBR322 als selektive genetische Markierer enthält und das eine G->T Punktmutation im die Repressor-RNS codierenden Abschnitt enthält, den DNA-Abschnitt, der für die Erzeugung des Membranproteins, welches die Tetracyclinresistenz verursacht, verantwortlich ist, durch einen synthetischen Polykoppler-DNA-Abschnitt, der durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme abspaltbar ist, ersetzt oder in ein Tetracyclinresistenzgen einen Fremd-DNA-Abschnitt, der seine Wirkung inaktiviert, einsetzt oder die Transkription des Tetracyclinresistenzgens durch eine Mutation im Promotorbereich oder durch Ersetzen des natürlichen Promotors durch einen Fremd-Promotor, der für eine weniger intensive Transkription sorgt, reprimiert.