PL152527B1

PL152527B1 - Process for preparing plasmid vectors having a high copy-number

Info

Publication number: PL152527B1
Application number: PL1984249593A
Authority: PL
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1983-09-16
Filing date: 1984-09-14
Publication date: 1991-01-31
Also published as: FI79552C; IT1178510B; PL249593A1; CA1275631C; AU3307784A; IL72952A; GB2148301B; HUT35280A; ZA847273B; JPS60156389A; FR2552102A1; IT8422677A0; SU1443806A3; GB8423161D0; FI843600L; DK439784D0; US4703012A; SE8404637L; IL72952A0; FR2552102B1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wektorów plazmidowych o dużej liczbie kopii.

Tak zwana technika maaippulaji genowej czyli inżynieria genetyczna staje się coraz bardziej znacząca w produk^i związków medycznie użytecznych. Według preferowanej odmiany tej techniki odcinek genu z zakodowanym wytwarzaniem żądanego, aktywnego farmaceutycznie związku jest wprowadzany do wektora, np. plazmidu, dla otrzymania ^kombinowany, hybrydowej cząsteczki plazmidu, który jest następnie użyty do transformat i odpowiedniego mikroorganizmu. Plazmid jest następnie replikowany razem z bakterynnym gospodarzem, a wbudowany gen funkcjonuje. Mość produktów genu zależy od intensywności translacji i transkryppci, od rozkładu produktu genu wewnntrz komórki i od liczby kopii genu, tzn. plazmidu zawierającego gen. Stosownie do tego, jeżeli uda się zwiększyć liczbę kopii plazmidu w komórce, znaczące zwiększenie ilości produktów genu można uzyskać przez zwiększenie liczby kopii obcego genu. /Technika mmanipleaci genowej podana jest np. w United States Petent Speecfication No. 4 237 224/.

Przedmiotem omawianego wynalazku jest przygotowanie wektorów plazmidowych, posiadających zasadniczo /zdecydowaane/ wyższą Mczbę kopii w komórce niż znane i szeroko stosowane plazmidy.

W badaniach naukowych i w przemyśle są stkskwaii różne, na ogół sztucznie tworzone wektory plazmidowe. Oednym z najczęściej stosowanych plazmidów Jest pBR322, który został po raz pierwszy utworzony przez &>yer*a i wsp. /Gene, 2, 95-113 /1977//. P^^jLeważ do chwńli obecnej posiadamy najbardziej wyczerpujące informacje naukowe dotyczące tego plazmidu i większość procedur klonowania genów została przeprowadzona z tym plazmidem lub z jego pochodnymi, użylśśmy tej substancci jako materiału wyjściowego w naszych doświadczeniach. Budowa pBR322 określona przez Sttclifee*a /CSH Symp. Quann· Biol. 43,

152 527

I

IZjW 5/1979/// J e>t?przedst awiona ru* rys. 1. Plazmid ten posiada długość molekularną 4362 par zasad? replikacja plazmidu zaczyna się przy nukleotydzie 2536 w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegar| liczba kopii w komórce wynosi, na ogół pomiędzy 20 i 50. Liczba kopii Jest kontr-ob^iłana przez złożony mechanizm regulujęcy /Plasmid

9. 1 /1983//· Fragment pomiędzy nukle»otddaml 2978 i 30β1 Jest odpowiedzialny za syntezę RNA o niskim ciężarze cząsteczkowym, który nie koduje żadnego białka i który jest ' transkrybowany w kierunku ruchu wskazówek zegara ze stosunkowo dużę intensywnością. Ten RNA o niskim ciężarze cząsteckliwym Jest ujemnym regulatorem /represorsm/ replikacji plazmidu. Wynnlazek opiera się na stwierdzeniu, że liczba kopii plazmidu może być poważnie zwiększona przez wprowadzenie do odcinka genu odpowwedzialnego za wytwarzanie represora replikacji plazmidu - mutaajl, która uszkadza tę funkcję odcinka wymienionego genu. '

Pierwszy plazmid o wysoHej liczbie kopii pHCl został wyizolowany w naszym laboratoruum jako produkt spontanicznej mi^tcci, w doświadczeniu przepoowadzonym z plazr s mi^dami o ^not^ie amp , tet , zawieraj ącymi ob^ DNA m.^ędz^y miejscami rozcinanymi FcoRI i BamHi plazmidu pBR322, podczas analizy zbioru otrzymanych połączeń, zawierających około 5000 niezależnych plazmidów. Z komórek bakteryjnych zawierających plazmid pHCl może być wyizolowane baz powwększania /amplification/ około 20-30 razy więcej DNA plazmidu niż z klonów, zawierających inne rekombinowane cząsteczki o podobnej budowę. Powtórzona retransformacja plazmidu pHCl z użyciem E.coli HB101 /pro, leu, thi, lac, str, rm rndol, recA /Boyer H.W. i in.: 0. Mol. Biol. 41, 459-472 /1979//, C600 /rk”, thi, thr, leu, lac/ /Boyer H.W. i in. ibid./, ED8800 /supE, supF, hsdS, mee, lacZMl5, recA56/ /Murray N.E. i in.: Mol. gen. Genee . 150, 53-61 /1911/] jako komórkami gospodarza doprowadzała za każdym razem do otrzymania klonów amp , tet , zawierających dużą ilość plazmidu. Przypuszczamy, że zwiększona lcczba kopii, która była około 20-30 razy większa niż lcezba kopii plazmidów pBr, jest spowodowana dziedziczoną zmianą w DNA plazmidu.

Identyfikacja mutacji odpowiedzialnej za dużę liczbę kopii.

Plazmid pHCl trawiono restrykcyjnymi endonukleazami EcoRI i Pruli, a następnie jednonicóowe zakończenia obsadzano sub-fragmentami Klenow*a enzymu ONA polimerazy w obecności substratów dNTP. Oir^^^mane częsteczki DNA z tępymi końcami cyrkulayyzowano przy pomocy enzymu ligazy polinukleotddowej i przenoszono do komórek HB101. Z ko· lonii wyhodowanych na podłożu zawierającym ampicylinę wydzielano DNA plazmidu. Próbki DNA, które mogły być izolwwane w dużych ilościach, anaizzowano metodę elektroforezy na agarozie i żelu izlraktylopmiOiwym po uprzednim trawieniu restrykcyjnymi endonuklea zami EcoRI, ΡνυΙΙ i BspRI. Plazmid pHC81 /rys. 2/, wybrany do dalszych badań, nie mógł być trawiony enzymem ΡνυΙΙ i był lieaatiziwany przy pomocy EcoRi. Na podstawie całkowitego ciężaru cząsteczkowego plazmidu /2,3 kb/ i wielkości fragment ów otrzmroanych przy trawieniu BspRI /587, 457, 434, 267, 240, 80, par zasad// ustalono, że plazmid pHCl posiadał odcinek pomiędzy nukleotydami 2069 i 2 plazmidu pBR322 z muuację odpowiedzialną za dużę lcczbę koppi.

Mutaaji tej nie można było wykryć na podstawie wielkości Jakichkolwiek fragmentów wytwarzanych przez stosowane enzymy. W celu zlokrlizowrnia wyizzlowanz zawierający 1030 par zasad /pz/ fragment DNA, otrzymany przez trawienie pHC81 restrykcyjnymi endonukleazami pStl i Taql, fragment DNA zawierający 780 pz otzzymany przez trawienie pBR322 enzymami Pstl i Ciał oraz fragment DNA, zawierający 218 pz, o^zymany przez trawienie pBR329 enzymem Taql. Te trzy fragmenty DNA mieszano w równomolowych stosunkach, lioowano ligazą iolinukleotzdowę, a następniepoodukeern ligacji trans Zopπlowano komórki HBlOl. Z poszczególnych klonów hodowanych na podłożu zawierającym ampicylinę wyodrębniano DNA plazmid. Plazmidy te wykazywały fenotyp o dużej lćczbie kopii. Przez trawienie DNA plazmidu restrykcyjnymi endonuklerzrpi ustalono, że były one wytwarzane przez połączenie trzech dobrze odróżniających się fTigmentów o różnym pocho152 527 dzeniu; w otrzymanych plazmidach położona bliżej środka części genu y3-laktamazy pochodziła od pBR322, obszar zawierający start replikacji pochoddZł z plazmidu pBR329, natomiast fragment wydzielony z pHC 81 zawierał poza końcowę częścię genu J3-le^manzy również mutację powodujęcę wytwarzanie dużej liczby kopii. W zwięzku z tym stwierdzono, że mouscja utworzyła się między nukleotydami 2573 /Taql/ i 3612 /Pstl/ DNA plazmidu pBR322. Określono sekwencję nukleotydowę tego obszaru i porównano ze znanę sekwencję pBR322· Porównanie to wykazało, że tranzycja G—► T /G»dezoksyguanyl, Tstymidyl/ nastąpiło przy nukleotydzie 3074, co odpowiada tranzycji C ~^A w komplementarnym łańcuchu DNA /CdezoksyliloZyl, A-dezoksyadeeyy/.

W wyniku powstałej punktowej mutaaii jest uszkodzone zakończenie transkrypcji represora RNA i jest syntetyzowany RNA o wyższym ciężarze częsteczkowym, który nie może dalej funkcjonować jako represor replikacci.-Zatrzymanie funkcji represora powoduje w efekcie tworzenie większej lcczby kopii. Wskutek tej spontanicznej punktowej autaaii_f którą m^^na wytwarzać również umyHnie, m^^na zwiększyć lcczbę kopii plazmidu, w komórce około 20-30 - krotnie /*1000/ w stosunku do wartości pierwotnej. Dzięki tej punktowej mutaaii Hczba kopii każdego plazmidu posiadającego ten sam obszar replikacji co pBR322 może być wydatnie zwiększona·

Stwierdzono jednakże, że pierwotny plazmid pBR322 zawierajęcy punktowę muuację G —* T jest niezdolny do dalszego życia· Mianowicie - z powodu większej lcczby kopii

Tc^r « białka memtjranowe, zwię^ksza się synteza o^bu ^białe^k i to ostatnie /białko membranowe odpow^we^cj^l-al^ne za oporność tetracyklnnowę/ jest, w zwiększonej ilości, śmiertelne dla kornmrki. Ten sam problem obserwuje się w przypadku każdej pochodnej plazmidu pBR322 o dużej Hczbie kopii, posiadajęcej pierwotny gen oporności tetracyklinowej w niezmienionej formie.

W poprzednich doświadczeniach nie tpotkαlśaml się z tym problemem,ponieważ używalśmrny plazmidów, w których obce fragmenty DNA były klonowane pomiędzy położeniami BamHI i EcoRI plazmidu pBR322 1 w ten sposób gen oporności tetracyklńoowęj zostawał irnktywowany· W zwięzku z tym - celem otrzymania zdolnego do życia plazmidu o dużej lćczbie kopii - pBR322 lub Jego pochodne posiadające ten sam obszar replikacji powinny być modyfikowane przez inakt\wację lub represję funkcji genu oporności tetracykl^nowej. Dlatego - zgodnie z pkefeniwayę istotą wynalazku - przygotowano nowe plazmidy, uzyskiwane z pBR322 lub jego pochodny^,zawwerające ten 9am obszar replikacji, polegające na tym, że nie zawierają genu oporności tet: aacyklnoowej lub zawierają go w formie inaktwrowanej lub w formie zmodyfikowanej ze złagodzonę /zmoderowaną/ funkcję, i że zawierają punktowę mutację aoOylikuiąię produkcję kepkesnΓα w odcinku genu kodującego represor RNA.

Zgodnie z bardziej prefeoowanę i9totą wynalazku w plazmidzie DNA pBR322 lub w jego pochodnej posiαdaieiej ten sam obszar replikacji, w pozycci 3074 /według numerowania pBR322/ para zasad GC jest zastępowana parę TA metodę kontrolowanej mutacii punkto wej lub przez zastępienie odcinka zawierającego tę muuację w plazmidzie pHC, który będzie opisany poniżej, odcinkiem żędanego plazmidu, który - oprócz tej mutalii jest identyczny.

Oak podano powyżej jeżeli jako substancję modelowę stosuje się pBR322 lub jego odpowiednię pochodnę, punktowa muuacja GC —►TA ma być wytworzona w pochodnej wyjściowego plazmidu, w którym całkowicie brakuje genu oporności tetΓacyklynowei lub jego funkcja jest inakliwowana lub stuumiona. W tym kontekście stuumienie /represja/ oznccza, że gen kodujęcy wytwarzanie aemaranowigo białka,odpowiedziannego za oporność t et racykMnowę, jest zmeniony celem powodowania zmnejszone j produkcj tego- białka. Według preferowanej werssi, DNA odpowiedzialny za oporność tetaacykliowwą lub cały odcinek aż do poczętku replikacji pBR322 jest usuwany i ewennualnie zastępowany poliłccznikimm pochodzenia syntetycznego, przez co, skutkeem dodatkowych rest^^yj4

152 527 nych miejsc trawienia endonukleazą wprowadzonych do plazmidu, możliwości zastosowania otrzymanych plazmidów sy zdecydowanie rozszerzone.

Budowa plazmidów pHC314, pHC312 i pHC624.

Podczas dalszych transformacJi plazmidów otrzymanych w opisanych powyżej doświadczeniach, wprowadzano do plazmidu pHC81 poliłączniki celem otrzymania wektorów odpowiednich do wbudowania fragmentów DNA utworzonych z różnymi restrykcyjnymi endonukleazami. DNA plazmidu pHC88j linearyzowany przyomocy endonukleazy EcoRI i defosforylowany bakteryjny alkaliczną fosfatazy, był następnie lioowany z fragmentami plazmidu DNA /Seed, B.: Nucleic Acid Research 11, 2427-2446 /1983/7, a następnie komórki E.coli HB1O1 transformowano ligatem. Z Ap opornych kolonii bakteryjnych wyizolowano plazmid DNA i analizowano metody elektroforezy na żelu, po trawieniu restrykcyjnymi endonukleazami EcoRI i Pstl. *

Do dalszych badań wyselekcjonowano plazmid /pH8314, rys. 3/, który mógł być rozcinany na fragmenty 2300 i 110 pz przez EcoRI i na fragmenty 1580 i 820 pz przez Pstl. Z niego zbudowano plazmid pHC312, zawierający tylko jedno położenie EcoRI, w następujący sposób: plazmid trawiono restrykcyjną endonukleazy BamHI i otrzymany liniową czysteczkę poddawano następnie iięściowemu trawieniu enzymem Hinfl. Fragmenty DNA rozdzielano na 1,2% żelu aiarozowym i wyodrębniano fragment 2010 pz. Lepicie końce czysteczki zawierające jednonicóowe odcinki wskutek trawienia enzymami BamHI i Hinfl przekształcono w tępe końce przy pomocy subfragmentów Klonow^a enzymu DNA pollmerazyl, a następnie recąrkuraąioowani /pieepiowadzono znów w postać kolisty/ przy pomocy indukowanej 1*4 ligazy polinukleotydowej . Ligowane DNA t ransiormowa.io do komórek HB101 i wydzielano poszczególne klony. Do dalszych operami wybrano plazmid pHC3l2 /rys. 4/, który nie mógł być rozcinany przez eidonukleαią BamHI, ale mógł być Uneaąyiowaną przez EcoRI i tworzyć fragmenty 1495 pz i 516 pz po trawieniu przez HinfI.

Celem wytworzenia wektora o dużej Uczbie kopii odpowiedniego do klonowania fragmentów DNA z tępymi końcami, trawiono plazmid p!8l32 restrykcyjnymi endonukleazami EcoRI i Hindlll i izobi^/ano fragment 1980 pz z żelu aiaroiooego. Fragment ten mieszano następnie z DNA plazmidu JT AN7 /Śeed, B.: Nucleic Acids Research 11, 2427-2446 /1983/J trawionego eizą^ram. EcoRI 1 Hindlll i łączono czysteczki ligazą polinukleotydowy. Kornmrki E.coli HBlOl transformowaii Urwanym plazmidem i z pojedynczych, Ap opornych klonów bakteryjnych izoiowaio plazmid DNA. Otrzymywany w ten sposób plazmid DNA pH8624 rys. 5 nie posiada pozycj Ciał,ale w przeciwieństwie do plazmidu pHC312, może być liiearyzowany rest rykcyj nym i endonukleazami Sima, Sali 1 Ban.

Przykład: Oznaczanie Uczby kopii plazmidów.

Względna Uczba kopii. Celem oznaczenia względnej Uc:^by kopii plazmidów pHC, kultury E.coli HBlOl zawierające plazmidy o różnej wielkości pochodzyce z ^kombinowanych pBR322 i tej samej wielkości pochodnych o dużej Uczbie kopii hodowano aż do isiągnięcia identycznej gęstości komórek. Z jednakowych ilości otrzmanych zawiesin, bez powiększania, wydzielano plazmid DNA według techniki opisanej przez Birnbiim*α i Doły /Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 /1979//. Próbki pobrane z preparatów DNA poddawano elektroforezie na żelu agarosowym kolejno w rozcieńczenia^ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, i 50-krotnąih. Plazmidy o dużej Uczbie kopii i ich pary o normalnej Uczbie kopii /posiadające ten sam ciężar cząsteczkowy/ były badane jednocześnie. doświadczeń wykazały, że Uczba kopii plazmidów pHC była około 20-30 - krotnie większa niż Uczba kopii odpowiadających im pochodnych pBR322 o normalnej Uczoie kopii.

Bezwzględny Uczbę kopii plazmidów pHC oznaczano metody znakowania in vivo DNA komórek zawierających plazmidy. Mierzono stosunek radioaktywności zawartych w wydzielonych ONA plazmidu 1 chromosoma^ego DNA. Oznaczona tą metody Uczba kopii plazmidów posiadającycfi tę s^y wielko^ść co ^pHC31⁴ /C^ » 1^,6 . 10⁶ d/ wynosUa około 1000 w ^ko^mór^ce /ciężar cząsteczko^ chromosomu « 2 . 10⁹ d/. Plazmid DNA stanowił ⁶⁰ do ⁶5% cal· kowitej ilości DNA zawartego w komórce. W celu znakowania DNA in vivo, komórki zawiera

152 527 jące plazmidy hodowano na pożywce M9, uzupełnionej następującymi składnikami: 0*5%

Komórki zawierające plazmid trawiono według przepisu Womble*a i in. /5. Bactetiol. 130, 148-153 /1911/]· Chromosomowe i plazmidowe ONA rozdzielano przez wirowanie w gradiencie gęstości chlorek tezu/bromek etydyny lizy komórek, pochodzącej z zawiesiny bakterii wyrośniętej do 2 ml. /CD550 = 4-5 /45000 rpm, Betkman Type 65 rotor, 40 godziⁿ, 20°C/Z Wzrost l^tczb^y Kopii zlustrowano na r^ysun^kach 6 i 7.

r s

Prążki przedstawione na rys. 6 odpowiadają Ap , Tc rekomlinowanym plazóidowym DNA pochodzenia pBR322 po tlektrorotetyznnmm rozdziale na żelu bromek etydyny/bommek 2,7-dwuarainnrl0-etylo-9-fenyrotnnantydyny /z dodatkeem agarozy. Wszystkie próbki przygotowano tą samą techniką, z tej samej ilości komórek HBlOl zawierających plazmid ^Birnbomm i Doły, Nucleic Acids, Res. 7, 1513-1523 /1979//. Próbki 1-2 i 4-6 są rekombinowanymi plazmidami zawierającymi 1,5 do 2,0 kl obcego DNA pomiądzy miejscami rozcinanymi EcoRl i BamHI plazmidu pBR322. Próbka 3 jest plazmidem tej samej wielkości zawierającym mutacją odpowiedzialną za duźą liczbę kopii /pHCl/.

Na rysunku 7 przedstawiono prążki DNA komórek E.coli HBlOl zawierających plazmid p7l5 /próbka A/ i plazmid' pHC314 /próbka B/ po rozdzieleniu metodą wirowania w gradiencie bromek etydyny/chlorek C’izu. /Plazmid p7l5 posiada tę samą budową co plazmid pHC3l4, z wyjątkeem mutacci odpowOeedialmtj za dużą liczbę kopii//. Fotografią wykonywano po rozdzieleniu plazmidowego i chromosomowego DNA metodą wirowania, naśwOeflαjąc u.v. probówką wirówki zawierającą DNA. Dak pokazano wyraźnie na rysunku w DNA ot mmmanym z komórek zawierających plazmid o normalnej liczbie kopii /^pji^^b^ka A/ prawie całkowicie brakuje niższego pasma zawieraj ącego plazmid. N^^omast plazmidowy DNA pHC3l4 otrzymany z tej samej ilości komórek i tą saną techniką tworzy szerokie pasmo poniżej pasma zawierającego chromosomowy DNA, wskutek zdecydowanie zwią^zonej liczby kopii plazmidu. W doświadczeniach stosowano nastąp^ące materiały i techniki:

Szczep ^kte^jne i ^plazmid^y: ^pBR3²² amp^r, tet^r /Bolivar, ^F. j. in.: Gene ²,

95^-113 /1911/]', ^pBR52² amp^ chl^ tet^r /Cova ru^bbias, L,, ^Bolivar, ^F.: ^Gene, 1⁷, ⁷⁹-⁸⁹/1982//.

Preparaty Jl vX i AN7 plazmidowego DNA przygotowano w Instytucie Biochemii Biologicz nego Ośrodka Badawczego Węgierskiej Akademmi Nauk, Szeged, Węgry /Seed, B.: Nucleic Acid Research, 11, 2427-2446 /1983//.

Stosowane preparaty restrykcyjnych endonukleaz, indukowanej kinazy pol^ukl^^dowej i ligazy polinukleotydowej przygotowano w Instytucie Biochemii Biologicznego Ośrodka Badawczego Węągerskiej Akademmi Nauk, Szeeged, Węgry, stosując publikowane metody oczyszczania /fcoberts, R.D. : Nucleic Acids Research 11, Π35-Π37 /1983/; Murray, N.E. i in.: O. Mol. Biol. 132, 493-505 /1979/» Panet, A.i in. : Birchemóst jry, 12, 5045-5050 /1973//. Fragment Klenow'a enzymu DNA iolióetazy I był prtpaΓafem New England

BioLabs, natomiast bakteryjna alkaliczna fosfataza /BAP/ była produkeci Washingtona.

>

ATP Y p /Węgierski Instytut Izotopów, Budapesst/ posiadał aktywność właściwą

TBq/mM.

Pożywka YTB /Miller, D.H., ed. Experiments in Molecular Gene^cs, Cold, Spring Harbor Laboratory, New York /1912^// zawierała 10 g/1 Tryptone /□ifco/, 5 g/1

Bacto Yeast extract /Difco/ i 5 g NaCl. W celu przygotowania płytek YTA pożywką YTB uzupełniono 15 g/1 Bacto Agar /Di^o/.

Celem wydzielenia plazmidowego DNA szczepy bakteryjne HBlOl, C600 i ED8800 zawierające odpowiednie plazmidy hodowano na pożywce YTB, zawierającej lOO^ug/ml amp^yM^ /Pharmayhió, Sofia/. Przed wyodΓąlnitniem każdego plazmidu nie-pHC dodawano do kultur bakteryjnych 170 /jg/ml chloramfenikolu przy ΟΟθθθ nm 0,7-0,8 i nastąpnie wstrząsano przez dalsze 10 do 12 godzin. Plazmidy /pHC/ o dużej liczbie kopii wyodrąbniano z komórek kultur hodowanych aż do fazy stacjonarnej, bez powiększania. Po wydzieleniu

152 527 plazmidowych DNA w ilościach preparat'wnych /50-100 ml kultury bakteryjnej w przypadku plazmidów pHC i 1-3 lttrów kultury bakteryjnej w przypadku innych pochodnych, przygotowywano klarowną lizę według techniki Clewell*a i Heliński*ego /^. Baateerol., 110, 1135 /1972// i oczyszczano plazmidowy DNA na kolumnie wypełnionej Sefakryeern S1000 /Pharmaaca/. W celu wydzielenia plazmidowego DNA do badań analitycznych /1,0-1,5 ml kultury bakteryjnej/ stosowano metodę z użyciem octanu potasowego opracowaną przez Birnboim'a i Doły i zmodyfikowaną przez D^Tsh-Horowich /M^ann^atis,T. i in.: Mooecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York /1902^/J

Trawienie próbek DNA restrykcyjnymi lndonukleizaii przeprowadzono w warunkach reakcji polecanych przez New England BioLabs.

Celem przeprowadzenia fragmentów DNA z jednonicoowymi końcami we fragmenty z tępymi końcami, wytrącano DNA alkoho^m po wytrawieniu enzymem restrykcyJnym, a następnie rozpuszczano w buforze zawieraj ącym 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgC^, 1 mM ditiotreitolu, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM TTP /objętość końcowa: 10-20/Ul, stężenie DNA: 200-250/Ug/ml/. Roztwór inkubowano następnie z 1-2 U fragmentem Klenow^a DNS polimerazy I w 3⁷°C w ciągu 15 minut la, ^T. ¹ in.: Mo^cular

Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York /1952./]·

Meszanina reakcyjna /30-40/Ul/ używana do iggowania fragmentów DNA z lepkimi końcami zawierała 0,5-1,0/ug DNA, 66 mM Tris-HCl /pH 7,6/, 5 mM MgCl? 5 mM ditiotreitolu 1 mM ATP i 1 U lggazy polinukleotydowej indukowanej T4. Ligację przeprowadzono w 14 C w ciągu 2 do 3 godzin /Maniatis, T. i in. : Moc^cular Clming, Cold Spring Harbor Laboratory, New York /1982//. Fragmenty z· tępymi końcami łączono w buforze zawierającym 30-40/ug/ml DNA, 25 mM Tris-HCl. /pH 7,4/, 5 mM MgC^, 5 mM spermidyny. I mM ATP, lO,ug/ml BSA /β^ηϋ, Type V/. Do mieszaniny reakcyjnej dodawano 4-6 U lggazy pollnukleotydowej indukowanej T4 i inkubowano w 14 C w ciągu 8-12 godzin /Maniatis i in.: Mooecclar-Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York /1982//.

Elektroforezę żelową próbek DNA przeprowadzano w 0,8-2,% żelach agar^^^wych /β^πϋ, Type 1/, w pozoomym aparacie do elektroforezy według techniki opisanej przez HeHing'a i in. /□. Virol. 14, 1235 /W74/J. Elektroforezę na żelu poliakryloamidowym /z użyciem 1% i 8% pionowych żeli grubości wykonywano według Maanatls^a i in. /Biochemistry, 14, 3787-3794 /1977//. Celem wydzielenią fragmentów · DNA z żelów a^^zowego i poiiakryloamirowego zastosowano technikę opracowaną przez Winberg'a 1 in /^udeic Acids Res. 8, 253-264 /1980//, używając bibuły DEAE.

Odpowiednie do transformacci komórek szczepów bakteryjnych HB101, C600 i ED800 przygotowano metodą z użyciem CaC^ opisaną przez MenndKa i Hig*a /□. Mol. Biol., 53,

154 /1970//. Defosforylowanie końców 5* fragmentów DNA, znakowanie końców kinezą po32 do ową i ATP ^P oraz oznaczanie sekwann^ nukleotydów wykonywano według sposobu opisanego przez M^xarn'a i Gilbert'a /Mlethods Enzymoo. 65, 499 /1977//.

Z plazmidów według wynalazku szczególnie pre(erNam są wektory plazmidowe o dużej lcczbie kopii posiadające ten sam obszar replikacji co pBR322, punktową m^cję G —>T w genie krótk^go RNA działającej jako represor replikacji, i a/ zawierające gen oporności ϋηρίοΩίποϋj pBR322 jako selektywny marker genetyczny, i w których brakuje genu oporności tetracyklioowlj lub jest on inaktywoweny, lub b/ zawierające geny oporności ampicylinowlj i tetiacyklirowej plazmidu pBR322 jako selektywny genetyczny marker, i w których transkrypcją genu oporności tetracykliiriej jest przeniesiona z muuanta słabszego niż naturalny lub z obcego promo^Ta.

Plazmidy podane na rysunkach 3, 4 i 5 są przerwanymi przedstawicielami plazmidów o dużej lcczbie kopii zgodnie z wynalazkiem, posiadającymi następujące charakterystyczne własności:

1. Oako wynik mo^yikacc! w strukturze genu kodu jącego dla RNA o niskim ciężarze cząst e^k^wym frakcjonującego jako represor replikacji, jego replikacja Jest przywrócona i dlatego lcczba kopii wewnąąrz komórki zostaje zdecydowanie zwiększona 1 wynosi

152 527 na ogół około 1000 /około 65% całkowitej zawartości DNA w komórce/. Ta duża liczba kopii nie ma wpływu na komórki E.coli użyte jako komórki gospodarza.

2. Plazmidy tej serii posiadają miejsca do rozcinania dla licznych restrykcyjnych endonukleaz; dlatego fragmenty DNA trawione tymi enzymami, ich zespołami lub innymi endonukleazami, tworzącymi te same końce, mogą być łatwo wstawiane do tych plazmidów.

Miejsca odpowiednie do klonowania w ' preferowanych plazmidach według wynalazku są następujące:

pHC 314: Ciał, Hindlll, Xbal , BamHI, BgllI i dowolne połączenia tych miejsc;

pHC 312: Glal, Hindlll, Xbal, BgllI, EcoRI i dowolna połącze-naa tyhh miejsc;

pHC 624: EcoRI, Hindlll, BamHI, Xbal, BgllI, Smai XXmaI/, Sali i cci połcczenaa z pewnymi ograniczeniami.

3. Wielkość prefeoowanych plazmidów pHC jest znacznie mniejsza niż wyjścoowych plazmidów pBR322; wielkości plazmidów przedstawionych na rys. 3, 4 i 5 wynoszą 2405 pz 2010 pz i 2015 pz. Cecha ta jest korzystna ponieważ lcczba kopii wiąkszości wektorów plazmidowych w^^nąąrz komórki jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości plazmidu.

W doświadczeniach klonowania genowego tym wląkszy gen może być wydajnie klonowany im mniejsze wektory są stosowane.

4. Plazmidy te mają gen oporności ampicylinowej pierwotnego pBR322 jako selektywny genetyczny marker.

5. Posiadają one początek replikacji pierwotnego pBR322.

WeHug innej odmiany sposobu według wynalazku zastrzeżono sposób otrzymywania wektorów plazmidowych o dużej lćczbie kopii, obejmujący wytwarzanie w odcinku genu, odpowiedzialnym za produkcją represo^a plazmidowej replikacji plazmidu, mutacj modyfikującej produkcją represora.

Zgodnie z pr^e^waną istotą sposobu według wyna lazku punktowa muuacja moodyikująca produkcją represora jest wytwarzana w odcinku genu.kodującego represor RNA w pochodnej pBR322 lub każdego innego plazmidu posiadającego ten sam obszar replikacji, w któyym gen oporności tet aacykUoowej Jest lub Jego funkcja jest osłabiona i ewentualnie odcinek DNA odpowiedzialny za produkcją mθmmralowego białka oporności tetracykinnowej jest zastąpiony syntetycnnym paH^czni^ma! DNA w jednym lub kilku przejściach. Oak opisano poprzednio, pteferowanł muuacją jest punktowa muuacja G —* T w pozacji 3074, według pierwotnej numeraj pBR322.

Istnieją osobne altennayw*ne sposoby przydatne do eliminacji problmmów powodowanych opornością tet racykUoową. WeHug jednej z moli.wb^ci, odcinek DNA odpowiθdzirlny za produkcją rneramr anowego białka oporności tet racykUoową j jest zastępowany poliłęczniklθm DNA pochodzenia syntetycznego, który może być rozszczepiany przez jeden lub wiącej ważnych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie, odcinek obcego DNA może być wstawiony do genu oporności tet racykUnowej, co inakt^wuje jego funkcją. Według innej transkrypcja genu oporności tet ^cy^^owej jest zmniejszana przez muuacją w obszarze promotora lub przez zastąpienie naturalnego /własnego/ promotora •obcym promotorem, co zapewnia mniej intensywną transkrypcją. Wssyytkie te techniki i' ich oczywiste modyfikacje są objąte n^teszym wynalazkiem.

Weekory plazmidowe o dużej icezbie kopii /wytworzone/ według wynalazku mają różnorodne moż^wo^^i zastosowania, jak wytwarzanie jakichkolwiek klonowanych odcinków plazmidu lub chimer plazmidu w czystej formie, do testów kontrolnych, sprawdzanie budowy, moy f ikaac i, t ranskoonowania 1 in. Stosując plazmidy według wynalazku, m^^na otrzmmać tą saną ność DNA ze znacznie mnlejszlj ilości wyjścoowego maaeriału niż w przypadku powszechnie stosowanych plazmidów znanych z lHent^ury. W przypadku przedstawionych plazmidów pHC potrzeba około 20.30 razy mniej wyjścoowego maeri-ału dla wytworzenia tej samej ilości DNA niż z pBR322. Plazmidowy DNA, który może być wyodrąbniony z pojedynczej kolonii bakkerri, zawierającej plazmidy pHC, wystarcza do 3-4 analiz restrykcyjnych. Z jednego litaa kultury bakteryjnej można wyodrąbnić ponad 10 mg czystego plazmidu

152 527

Jeżeli zwiększona ilość produktu klonowanego genu Jest tolerowana przez komórkę gospodarza, m^^na zwiększyć syntezę jakiegokolwiek produktu genu przez zastosowanie plazmidów pHC według wynalazku. W optymalnym przypadku wzrost wydajności jest około 20-30-krotny, ponieważ można osiągnąć ten stopień zwiększenia dawki genu. W pewnych przypadkach wzrost ten będzie nieco mniejszy wskutek ograniczającego wpływu innych czynników.

Wprowadzenie odcinków poliłącznika do plazmidów pHC nadaje im dużą giętkość. Jeżeli dostępne miejsca cięcia są nieodpowiednie dla genu, który ma być klonowany, mogę być one zastąpione lub mogę być uzdatnione do klonowania z innymi fragmentami przy pomocy syntetycznych adapterów.

Odnośnie zastosowania przemysłowego należy wymienić produkcję insuliny, vasopressiny i in. Doświadczenia użyte dla objaśnienia wynalazku sę tylko przykładami 1 nie ograniczają zakresu wynalazku. Roza podawanymi przykładowo rozwiązaniami technicznymi są liczne dalsze moiżiolści objęte wynalazkiem. Na przykład, używając enzymów Fnu4HI i Tthill, można - z pierwotnegopBR322 - wyciąć odpowiednie odcinki DNA, zawierające kolejno 21 i 32 nukleotydy; odpowiednie fragmenty zawierające punktową mutację G <—»T można syntetyzować chemicznie i wprowadzić do cząsteczki pBR322 na miejsce eliminowanych fragmentów. Podobnie różne Hczne syntetyczne fragmenty poli^^ników DNA m^zżna wprowadzić do cząsteczki na miejsce częściowo lub całkowicie usuniętych odcinków DNA ldpowOedzialnych za oporność tetłacyklllową.

Ti i podobne rozwiązania oraz plazmidy otΓZiπywanl tymi met odami są objęte niniejszym wynalazkiem. Plazmidy pHC 312 i pHC 314 i pHC 624 zostały złożom 7 marca 1984 r. w Natlnal Collection of Microorganisms /OKI, Węgry/ pod kolejnymi numerami 00279, 00280 i 00281.

W^enim poniżej szczepy mikroorganimmów i plazmidy zostały zdeponowane w National Collection of Microorganisms /OKI, Węęry/ 25 lppca 1984 pod następującymi numerami E.coli HB 1Ó1 - 00290; E.coli ED 8800 - 00291; E.coli C 600 - 00292; p 715 - 00293; pHC 1 - 00294; pHC 81 - 00295; JTAN7 - 00296;3TVX - 00297.

Claims

1. Sposób wytwarzania wektorów plazmidowych o dużej lćczbie kopii pochodnych pBR322 lub innych plazmidów posiadających ten sam rejon replikacji co pBR322, znamienny tym, że w pochodnej pBR322 lub każdym innym plazmidzie posiadającym ten sam rejon replikacji, zawieraj ącym gen oporności na tet racykUnę w formie inaktywowanej lub w formie wykazującej osłabioną funkcję w odcinku genu kodują cym RNA, który jest represorem replikacji plazmidu wytwarza się punktową mutację mo^fikującą produkcję rspresora i, ewen^enie odcinek DNA ldpowOedziαlly za produkcję memiranowero biał ka odpc^^^w^i^JtJLa^n^go za oporność tetaacyklinową zastępuje się βyltetyclnym poli^znikiem DNA, w jednym lub w kilku etapach.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że punktową mt^c^jg

G -* T wytwarza się w pozycj 3074 odcinka gnu kodującego RNA-represor zachowując początkową numerację pBR322. v

3. Sposób według zaistrz. i, albo 2, znamienny tym, że w plazmidzie zawierającym punktową muuację G —>T odcinek DNA ldpowOedzially za produkcję rnernmralowlrl białka powodującego oporność tetłacyklloowę zastępuje się syntetycznym odcinkiem pol^czn±ka DNA rozszczepianym przez jeden lub więcej enzymów restrykcyjnych, lub do genu oporności na tet racykUnę wprowadza się odcinek obcego DNA dezaktywujący jego funkcję lub transkrypcję genu oporności na tet racykUnę osłabia się przez mutację w obszarze promotora, lub przez zastąpienie naturalnego promotora obcym zapewniającym rnn^j intensywną transkrypcję.