SE463266B - Plasmidvektorer med hoegt kopieringstal, framstaellning och anvaendning daerav - Google Patents
Plasmidvektorer med hoegt kopieringstal, framstaellning och anvaendning daeravInfo
- Publication number
- SE463266B SE463266B SE8404637A SE8404637A SE463266B SE 463266 B SE463266 B SE 463266B SE 8404637 A SE8404637 A SE 8404637A SE 8404637 A SE8404637 A SE 8404637A SE 463266 B SE463266 B SE 463266B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- pbr322
- gene
- tetracycline resistance
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
10
15
20
25
30
35
2 6 2
O\
/9/7
'TOJ
95-113 (1977L7. Fram till nu föreligger en synnerligen ut-
tömmande vetenskaplig information om denna plasmid och de
flesta genkloningsförfarandena har utförts med denna plas-
mid eller dess derivat. Vi har använt denna substans som
utgångsmaterial vid våra försök. Strukturen hos pBR322 be-
stämdes av Sutcliffe [CHS Symp. Quant. Biol. Qâ , 77-90
(1979L7 och åskâdliggöres i fig. 1. Denna plasmid har en
molekyllängd av 4362 bp. Kopieringen av plasmiden startar
vid nukleotiden 2536 i motsols riktning och dess kopierings-
tal per cell är i allmänhet mellan 20 och 50. Kopierings-
talet kontrolleras medelst en komplicerad regleringsmeka-
nism Åïlasmid 2, 1, (1983L]. Fragmentet mellan nukleotider-
na 2978 och 3081 är ansvarig för syntesen av en RNA med
låg molekylvikt, vilken icke kodar för något protein och
som transkriberas i medsols riktning med en relativt hög
intensitet. Denna RNA med låg molekylvikt är den negativa
regulatorn (repressorn) vid plasmidkopieringen.
Uppfinningen baserar sig på den upptäckten att plasmidens
kopieringstal kan ökas väsentligt genom att man i den gen-
sektion som är ansvarig för produktionen av repressorn vid
plasmidkopieringen tillhandahåller en mutation, som för-
sämrar denna funktion hos gensektionen.
I vårt laboratorium isolerades den första plasmiden med
högt kopieringstal (pHC1) som en produkt vid spontan muta-
tion i ett försök utfört med plasmider av ampr-, tets-
fenotyp innehållande en främmande DNA mellan de EcoRI- och
BamHI-spjälkande ställena i plasmiden pBR322 under analys av
en.pool av rekombinanter bestående av ca 5000 oberoende
plasmider. Från bakteriecellerna innehållande plasmiden
pHC1 kunde ca 20-30 gånger mera plasmid DNA isoleras utan
förstärkning än från klonerna innehållande andra rekombi-
nantmolekyler med liknande struktur. Den upprepade retrans-
formationen av plasmiden pHC1 under användning av E. coli
HB101 (pro_, len-, thi-, lac', str-, r'm'rndol_, recA-)
[Éoyer, H.W. et al.: J. Mol. Biol. gl, 459-472 (1979)],
10
15
20
25
30
35
3
3 -66
[x
C600 (rk', mk-, thi_, thr_, leu-, lac_) [Boyer, H.W. et al.,
ibiduf ED8800 (supE, supF, hsdS , met , lacZM15, recA56)
ßumray, N.E. et al.: Mol. gen.Genet. låg, 53-61 (1977L7
värdceller resulterade varje gång i produktionen av ampr-,
tets-kloner innehållande en hög mängd plasmid. Som skäl
till det ökade kopieringstalet, som var ca 20-30 gånger
högre än hos pBR-plasmiderna, antog vi en ärftlig föränd-
ring i plasmid-DNA.
Identifiering av den mutation som är
ansvarig för högt kopieringstal
_Blasmiden pHC1 uppslöts med restriktionsendonukleaser EcoRI
och PruII och därefter fylldes de enkeltvinnade ändarna med
Klenow subfragment av DNA-polymeras I-enzymet i närvaro av
dNTP-substrat. De på så sätt framställda DNA-molekylerna
med trubbiga ändar cirkulerades med ett polynukleotidligas-
enzym och transformerades till HB101-celler. Från de kolo-
nier som växte på ett ampicillinhaltigtmedium isolerades
plasmid-DNA och DNA-proverna, som kunde isoleras i hög
mängd, analyserades medelst agaros- och polyakrylamidgâlelek-
trofores efter uppslutning med restriktionsendonukleaser
EcoRI, PvuII och BspRI. Den plasmid pHC81 (fig. 2) som val-
des för ytterligare undersökning kunde icke uppslutas med
enzymet PvuII och lineariserades med EcoRI. På basis av
plasmidens totala molekylvikt (2,3 kb) och storleken av de
genom uppslutning med BspRI (587, 457, 434, 267, 240, 80
...bp) erhållna fragmenten fastställdes att plasmiden pHC81
innehöll sektionen mellan nukelotiderna 2069 och 2 i plas-
miden pBR322 med en mutation, som var ansvarig för det höga
kopieringstalet. Denna mutation kan icke påvisas på basis
av storleken av något av de fragment som produceras medelst
de använda enzymerna. För att lokalisera mutationen isole-
rades det DNA-fragment med bp 1030, som hade erhållits
genom uppslutning av pHC81 med restriktionsendonukleaserna
PstI och TaqI, det DNA-fragment med bp 780 som hade erhål-
lits genom uppslutning av pBR322 med enzymer PstI och C1aI
och det DNA-fragment med bp 218 som hade erhållits genom
10
15
20
25
30
35
“ü
4-.5 266 4
uppslutning av pBR329 med enzymet TaqI. De tre DNA-fragmen-
ten blandades i ekvimolär proportion, de ligerades med ett
polynukleotidligas och därefter transformerades HB101-
celler med ligatet. Från de enkelkloner som växte på ampi-
cillinhaltigt medium isolerades plasmid-DNA. Dessa plasmi-
der uppvisade fenotypen med högt kopieringstal. Genom att
uppsluta plasmid-DNA med restriktionsendonukleaser fast-
ställdes att de producerades genom koppling av tre väl ur-
skiljbara fragment av olika ursprung; i de erhållna plas-
miderna var'da1proximala delen av' ß-laktamasgenen av
pBR322-ursprung, den region som innehöll replikatorigo här-
rörde från plasmiden pBR329 och det fragment som isolerades
från pHC81 innehöll förutom den distala delen av P-lakta-
masgenen även den mutation som resulterade i det höga kopi-
eringstalet. Den slutsatsen drogs därför att mutationen bil-
dades mellan nukelotiderna 2573 (Taqï) och 3612 (PstI) hos
DNA i plasmiden pBR322. Nukleotidsekvensen hos denna region
bestämdes och jämfördes med den kända pBR322-sekvensen. Den-
na jämförelse visade att en G-->-T transition (G=desoxi-
guanyl, T=timidyl) ägde rum vid nukleotiden 3074, vilket
motsvarar en C - 'A-transition i den komplementära DNA-
strängen (C=desoxicytosyl, A=desoxiadenyl).
Som en följd av den uppkomna punktmutationen skadas termi-
neringen av transkriptionen av repressorn RNA och en RNA
med högre molekylvikt syntetiseras, vilken icke längre kan
fungera som replikatrepressor. Termineringen av repressor-
funktionen resulterar i det högre kopieringstalet. Genom
denna spontana punktmutation, som således kan framkallas
avsiktligt, kunde talet hos plasmiden per cell ökas ca 20-
30 gånger (ca 1000) i förhållande till det ursprungliga
värdet. Genom denna punktmutation kan kopieringstalet hos
vilken som helst plasmid med samma replikatregion som
pBR322 väsentligt ökas.
Det har emellertid visat sig att den ursprungliga plasmiden
pBR322 innehållande en G ->-T-punktmutation icke längre
är levande. På grundav det höga kopieringstalet ökas nämli-
10
15
20
25
30
35
f
b
ö\
Lfl
CN
5 4 2
gen syntesen av båda proteinerna på de gener av plasmiden
som bestämmer den antibiotiska resistensen - Apr = |5-lakta-
mas, Tor + = membranprotein(er), och sistnämnda (membran-
protein ansvarigt för tetracyklinresistensen) är letal för
cellen i den ökade mängden. Samma problem observeras när
det gäller varje derivat av plasmid pBR322 med högt kopie-
ringstal, vilket derivat innehåller den ursprungliga tetra-
cyklinresistensgenen i oförändrad form.
Vid våra tidigare försök ställdes vi icke inför detta prob-
lem, eftersom vi använde plasmider, där främmande DNA-frag-
ment hade klonats mellan ställena BamHI och EcoRI i plasmi-
den pBR322 och på detta sätt inaktiverades tetracyklinresi-
stensgenen. För att följaktligen erhålla en levande plas-
mid med högt kopieringstal måste pBR322 eller ett derivat
därav med samma replikatregion modifieras genom inaktive-
ring eller repression av funktionen hos tetracyklinresistens-
genen.
Enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen tillhan-
dahålles därför nya plasmider, som härrör från pBR322 eller
derivat därav innehållande samma replikatregion, vilka kän-
netecknas därav att de icke innehåller en tetracyklinresi-
stent.ga1eller innehåller den i en inaktiverad form eller
modifierad form med modererad funktion och de innehåller
en punktmutation, som modifierar repressorproduktionen på
den gensektion som kodar repressorn RNA.
Enligt en mera föredragen utföringsform av uppfinningen
ersättes i plasmid-DNA pBR322 eller ett derivat därav med
samma replikatregion basparet GC i positionen 3074 (enligt
numreringen av pBR322) med TA genom kontrollerad punktmuta-
tion eller ersättandet av en sektion, som innehåller denna
mutation i en pHC-plasmid, som beskrives närmare nedan, med
en sektion av den önskade plasmiden, som, frånsett denna
mutation, är identisk.
10
15
20
25
30
35
266 6
(_25
flzf
“ru
Såsom beskrivits ovan måste, om pBR322 eller ett lämpligt
derivat därav användes som modellsubstans, GC ->-¶A-punkt-
mutationen utföras på ett derivat av utgångsplasmiden, vari
den tetracyklinresistenta genen är helt frånvarande eller ,
dess funktion är inaktiverad eller undertryckt. I detta
sammanhang innebär repression att den gen som kodar för pro- _
duktionen av det membranprotein som är ansvarigt för tetra-
cyklinresistensen ändras för tillhandahållande av en mins-
kad proteinproduktion. Enligt en föredragen utföringsform
elimineras den DNA som är ansvarig för tetracyklinresisten-
sen eller den totala sektionen upp till replikatorigo i
pBR322 och, om så önskas, ersättes med en polylinker av
syntetiskt ursprung, varigenom användningsmöjligheterna för
de erhållna plasmiderna väsentligt utökas på grund av de
ytterligare restriktionsendonukleasuppslutna ställen som
införes i plasmiden.
Konstruktion av plasmider pHC314,
pHC312 och pHC624
Under den vidare transformationen av de vid ovan beskrivna
försök erhållna plasmiderna infördes polylinkers i pHC81-
plasmiden i syfte att framställa vektorer lämpliga för in-
förande av DNA-fragment, som bildades med olika restrik-
tionsendonukleaser. DNA i plasmiden pHC81, som hade linea-
riserats med endonukleaset EcoRI och defosforylerats med
bakteriellt alkaliskt fosfatas, ligerades med plasmid-DNA-
fragment [šeed, B.: Nucleic Acid Research ll, 2427-2446
(1983L], och E.coli HB101-celler transformerades med liga-
tet. Från de Ap-resistenta bakteriekolonierna isolerades
plasmid-DNA och analyserades medelst gelelektrofores efter
uppslutning med EcoRI och PstI-restriktionsendonukleaser.
För ytterligare undersökningar utvaldes de plasmider som
kunde spjälkas till fragment med bp 2300 och 110 medelst
EcoRI och till fragment med bp 1580 och 820 medelst PstI
(pHC 314, fig. 3). Av denna plasmid konstruerades pHC312,
som endast innehöll ett EcoRI-ställe, på följande sätt:
Plasmiden uppslöts med restriktionsendonukleaset BamHI och
10
15
20
25
30
35
*v
7 ësš fas
[x
den erhållna linjära molekylen uppslöts delvis med ett
HinfI-enzym. DNA-fragmenten separerade i en 1,2% agaros-
gel och fragmentet med bp 2010 isolerades. De molekyländar
som innehöll enkelsträngade sektioner till följd av upp-
slutningen med enzymerna BamHI och Hinfl omvandlades till
trubbiga ändar med Klenow subfragment av enzymet DNA-poly-
meras I och recirkulerades därefter med T4-inducerat poly-
nukleotidligas. Den ligerade DNA transformerades till
HB101-celler och enkelkloner isolerades. För ytterligare
operationer utvaldes den plasmid pHC312 som inte kunde
spjälkas med endonukleas BamHI men som kunde lineariseras
med EcoRI och producerade fragment med bp 1495 och bp 516
vid uppslutning med HinfI (fig. 4). För framställning av
en vektor med högt kopieringstal lämplig för kloning av
DNA-fragment med trubbiga ändar uppslösts plasmiden pHC132
med restriktionsendonukleaser EcoRI och HindIII och frag-
mentet med bp 1980 isolerades från agarosgel. Detta frag-
ment blandades därefter med DNA i plasmiden.'flAN7 (Seed, B.:
Nucleic Acids Research, ll, 2427-2446 (1983L], som hade
uppslutits med enzymer EcoRI och HindIII, och molekylerna
kopplades med polynukleotidligas. E.coli HB1010-celler
transformerades med den ligerade plasmiden och från Ap-
resistenta enkelbakteriekloner isolerades plasmid-DNA. Den
plasmid-DNA som framställes på detta sätt (pHC624, fig. 5)
har icke något C1aI-ställe men kan i motsats till plasmiden
pHC312 lineariseras med restriktionsendonukleaser Smal,
Sa1I och BamHI.
Bestämning av plasmiders kopieringstal
.Bslsë.i.!'_=-1.s92issias§'s§l
För bestämning av det relativa kopieringstalet hos pHC-
plasmider fick E.coli HB101-kulturer, som innehöll plasmi-
der av olika storlek härrörande från rekombinant-pBR322
och derivat med högt kopieringstal av samma storlek, växa
till dess man uppnådde identisk celldensitet. Från identis-
ka mängder av de erhållna suspensionerna isolerades, utan
10
15
20
25
30
35
ëóš 266
förstärkning, plasmid-DNA under användning av den teknik
som beskrives av Birnboim och Doly [NuCleiC ACidS RSS- lf
1513-1523 (1979L7. Prover tagna från DNA-preparaten under-
kastades elektrofores på agarosgel i spädningar 5, 10, 15,
20, 25, 30, 40 resp. 50 gånger. Plasmiderna med högt kopie-
ringstal och deras par med normalt kopieringstal (med sam-
ma molekylvikt) undersöktes samtidigt. Försöksresultaten
visade att kopieringstalet hos pHC-plasmiderna var ca 20-
30 gånger högre än hos motsvarande pBR322-derivat med "nor-
malt kopieringstal".
êä§9l9§_ë9e¿e:i§9§§sl
Det absoluta kopieringstalet hos pHC-plasmider undersöktes
genom märkning av DNA i de celler som innehöll plasmiderna
in vivo och mätning av förhållandet mellan radioaktivite-
ten i den separerade plasmid-DNA och i den kromosomala DNA.
Medelst denna metod visade sig kopieringstalet hos plasmi-
der med samma storlek som pHC314 (Mw = 1,6 x 106 d) vara
ca 1000/cell (kromosomens molekylvikt = 2 x 109 d). 60-65%
av cellens totala DNA-halt var plasmid-DNA. För märkning av
DNA in vivo odlades de celler som inehöll plasmiderna på
ett M9-kulturmedium kompletterat med följande komponenter:
0,5% kasamino-syra (Difco), O,5% glukos, 1 pg/ml. vitamin
B1, 1 mmol MgSO4, 2 pg/ml tymidin, 250 pg/ml adenosin och
0,4 mßq/ml [sa]-tymiain fäastßq/mmol, cnemapol, Pragj.
De plasmidhaltiga cellerna uppslöts enligt Womble et al.
[U. Bacteriol, låg (1977) 148-1S3]. Kromosomal och plas-
mid DNA separerades från varandra medelst etidiumbromid/-
cesiumklorid-jämviktsdensitetsgradientcentrifugering av
det cellysat som härrörde från en bakteriesuspension som
hade fått växa till 2 ml (0D550 = 4-5/45000 rpm, Beckman
Type es rotor, 40 tim., 2o°c).
Det ökade kopieringstalet åskådliggöres i figurerna 6 och
7.
I fig. 6 visas fläckar motsvarande Apr-, TcS-rekombinant-
10
15
20
25
30
35
- "z F;
9 i se
C:
gm
-plasmid-DNA av pBR322-ursprung efter separation medelst
etidiuflnnmid/agarosgelelektrofores. Samtliga prover fram-
ställdes medelst samma teknik utgående från samma mängd
plasmidhaltiga HB101-celler [Birnboim och Doly, Nucleic
Acids Res. 1, 1513-1523 (1979L]. Proverna 1-2 och 4-6 är
rekombinant- plasmider innehållande en främmande DNA med
kb 1,5-2,0 mellan de spjälkande ställena EcoRI och BamHI
i plasmiden pBR322. Prov 3 är en plasmid av samma storlek,
som innehåller den mutation som är ansvarig för det höga
kopieringstalet (pHC1).
I fig. 7 visas fläckar av DNA av E.coli HB101-celler, som
innehåller plasmiden p715 (prov A) och plasmiden pHC314
(prov B), efter separation medelst etidiumbromid/cesium-
klorid-gradientcentrifugering. (Plasmiden p715 har samma
struktur som pHC314 med undantag av den mutation som är
ansvarig för det höga kopieringstalet.) Bilden togs efter
separation av plasmid och kromosomal DNA genom centrifuge-
ring under UV-belysning av det centrifugrör som innehöll
DNA. Såsom klart framgår av bilden är i den DNA som erhölls
från de celler som innehöll plasmiden med normalt kopie-
ringstal (prov A) det plasmidhaltiga lägre bandet praktiskt
taget helt frånvarande. A andra sidan bildar den pHC314
plasmid-DNA som erhölls från samma mängd celler medelst
samma teknik ett brett band under det band som innehåller
kromosomal DNA, till följd av det väsentligt ökade kopie-
ringstalet hos plasmiden.
Vid försöken användes följande material
och tekniker
Bakteriestammar och plasmider:
pßaszz empr, :eur [Boliven F. et a1.= Gene g, 95-113
(1977)];
pBR329 ampr, chlr, tetr [Covarubbias, L., Bolivar, F.:
Gene, 11, 79-89 (1982§h
10
15
20
25
30
35
. ha.
1°
GN
(_13
/qTvX- och AN7-plasmid-DNA-preparaten framställdes vid the
Institute of Biochemistry, Biological Research Centre of
the Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungern [Seed, B.:
Nucleic Acids Research, ll, 2427-2446 (1983)].
Det använda restriktionsendonukleaset, T4-inducerat poly-
nukleotidkinas och polynukleotidligaspreparat framställdes
vid the Institute of Biochemistry, Biological Research
Centre of the Hungarian Academy of Sciences; Szeged,
Ungern under användning av publicerade reningsmetoder
[Roberts, R.J.: Nucleic Acids Research ll, r135-r137 (1983);
Murray, N.E. et al.: J. Mol. Biol. låg, 493-505 (1979):
Panet,_A. et al.: Biochemistry, lå, 5045-5050 (1973L].
Klenow-fragmentet av enzymet DNA-polymeras I var en produkt
från New England BioLabs, medan det bakteriella alkaliska
fosfataset (BAP) tillverkades av Worthington.
[]”-322]ATP (Hungarian Isotope Institute, Budapest) hade
en specifik aktivitet av 22 TBq/mM.
YTB-kulturmediet [Miller, J.H., ed. Experiments in Mole-
cular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1972L] innehöll 10 g/liter Bacto Tryptone (Difco),
5 g/liter Bacto jästextrakt (Difco) och 5 g NaCl. För fram-
ställning av YTA-plattor kompletterades YTB-kulturmediet
med 15 g/liter Bacto agar (Difco).
För isolering av plasmid-DNA fick bakteriestammarna HB101,
C600 och ED8800 innehållande de lämpliga plasmiderna växa
pâ YTB-kulturmedium innehållande 100 pg/ml ampicillin
(Pharmachim, Sofia). Före isolering av varje igk§-pHC-
plasmid tillsattes 170 pg/ml kloramfenikol vid OD600nm
0,7-0,8 till bakteriekulturerna, som därefter skakades un-
der ytterligare 10-12 timmar. Plasmiderna med högt kopie-
ringstal (pHC) isolerades från cellerna av en kultur som
hade växt till stationär fas, utan förstärkning. Vid iso-
lering av plasmid-DNA i preparativa mängder (från 50 till
100 ml bakteriekultur när det gällde pHC-plasmider och
10
15
20
25
30
35
_.
11 163 Éób
från 1-3 liter kultur när det gällde andra derivat) fram-
ställdes ett klart lysat medelst den teknik som angivits
av Clewell och Helinski ÅU. Bacteriol., 112, 1135 (1972L],
och plasmid-DNA renades på en Sephacryl S1000 (Pharmacia)-
kolonn. För isolering av plasmid-DNA för analytiska ända-
mål (frân 1,0-1,5 ml bakteriekultur) användes den kalium-
acetatmetod som har utvecklats av Birnboim och Doly och
som har modifierats av D. Ish-Horowich [Maniatis, T. et al.:
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1982L].
Uppslutningen av DNA-prover medelst restriktionsendonuklea-
ser utfördes under de reaktionsbetingelser som har rekommen-
derats av New England BioLabs.
För transformering av DNA-fragment med enkelsträngade ändar
till fragment med trubbiga ändar utfälldes DNA med alkohol
efter uppslutning med restriktionsenzymer och upplöstes
däreftet i en buffert innefattande 50 mM Tris-HCl pH 7,4,
7 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP,
0,1 mM dGTP, 0,1 mM TTP (slutvolym: 10-20 pliter, DNA-
koncentration: 200-250 ng/ml). Lösningen inkuberades där-
efter med 1-2 U av DNS-polymeras I-Klenow-fragment vid 37°C
under 15 minuter [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982L7.
Den reaktionsblandning (30-40 pliter) som användes för
ligering av DNA-fragment med klibbiga ändar innehöll 0,5-
1,o pg DNA, 66mm 'rris-ncl (pa 7,6), s mn ngclz. s mn
ditiotreitol, 1 mM ATP och 1 U T4-inducerat polynukleotid-
ligas. Ligeringen utfördes vid 14°C under 2-3 timmar
[Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York (1982)]. Fragment med trubbiga
ändar ligerades i en buffert innehållande 30-40 pg/ml DNA,
25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 5 mM spermidin,
1 mM ATP, 10lpg/ml BSA (Sigma, Type V). Till reaktions-
blandningen sattes 4-6 U av T4-inducerat polynukleotid-
ligas och det inkuberades vid 14°C under 8-12 timmar
10
15
20
25
30
35
12
»z-f f,
Åfoo Å
U\
f'
O
_[Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York (1982)].
Gelelektroforesen av DNA-prover utfördes i 0,2-2,0% agaros-
geler (Sigma, Typ I) i horisontella elektroforesapparater
under användning av den teknik som har beskrivits av
Helling et al. [Ü. Virol. lå, 1235 (1974L]. Polyakrylamid-
gelelektroforesen (under användning av 1% och 8%, 1 mm
tjocka vertikala geler) utfördes i enlighet med Maniatis
et al. [Biochemistry, lå, 3787-3794 (1975)].
För isolering av DNA-fragment från agaros- och polyakryl-
amidgeler användes den teknik som har utvecklats av Winberg
et al. [Nucleic Acids Res. §, 253-264 (1980)] under använd-
ning av DEAE-papper.
Kompetenta celler för transformering av bakteriestammar
HB101, C600 och ED8800 framställdes medelst den s.k. CaCl2-
metoden, som har beskrivits av Mandel och Hlga (U. Mol.
13101., _53, 154 (197o)].
Defosforyleringen av 5'-ändarna av DNA-fragmenten, märkning
av ändarna med polynukleotidkinas och [17-322]ATP och be-
stämning av nukleotidsekvensen utfördes enligt det schema
som har beskrivits av Maxam och Gilbert [Methods Enzymol.
gå, 499 (1977L].
Av plasmiderna enligt uppfinningen föredras speciellt de
plasmidvektorer med högt kopieringstal som har samma rep-
likatregion som pBR322, en G -a>T-punktmutation i genen
för den lilla RNA som fungerar som repressor för replikat-
bildningen och som
a) innehåller den ampicillinresistenta genen av pBR322
som selektiv genetisk markör och där genen för tetra-
cyklinresistens är frånvarande eller inaktiverad eller
som
b) innehåller generna för ampicillin- och tetracyklin-
10
15
20
25
30
35
13 266
(;\
resistens i plasmiden pBR322 som en selektiv genetisk
markör och där transkriptionen av genen för tetracyk-
linresistens utföres från en mutant, som är svagare
än den naturliga, eller från en främmande promotor.
De plasmider som åskâdliggöres i figurerna 3, 4 och 5 är
föredragna representanter för plasmiderna med högt kopie-
ringstal enligt uppfinningen, vilka har följande karakte-
ristiska egenskaper:
1. Som en följd av en modifiering i strukturen hos den gen
som kodar för RNA med låg molekylvikt, vilken tjänar som
repressor av reproduktionen, avrepresseras deras reproduk-
tion och därför ökas kopieringstalet inuti cellen väsent-
ligt och liger i allmänhet runt 1000 (ca 65% av cellens
totala DNA-halt). Detta höga kopieringstal har icke något
inflytande på de E.coli-celler som användes som värdceller.
2. Plasmiderna tillhörande denna serie innehåller spjälk-
ningställerna för talrika restriktionsendonukleaser och
därför kan DNA-fragment, som uppslutes av dessa enzymer,
lätt införas i dessa plasmider genom kombination därav
eller medelst andra endonukleaser, som producerar samma
ändar.
Ställen, som är lämpliga för kloning i de föredragna plas-
miderna enligt uppfinningen är följande:
pHC 314: C1aI, HindIII, XbaI, BamHI, Bg1II och optimala
kombinationer av dessa ställen;
pHC 312: C1aI, HindIII, XbaI, Bg1II, EcoRI och optimala
kombinationer av dessa ställen;
pHC 624: EcoRI, HindIII, BamHI, XbaI, Bg1II, Smal, (XmaI),
Sa1I och deras kombinationer med vissa restrik-
tioner.
3. Storleken hos de föredragna pHC-plasmiderna är avse-
värt mindre än hos utgângs-pBR322 och således är storleken
10
15
20
25
30
35
13-6 266 14
hos de plasmiden som åskådliggöres i figurerna 3, 4 och 5
2405 bp, 2010 bp och 2015 bp. Detta är fördelaktigt efter-
som kopieringstalet hos de flesta av vektorplasmiderna
LN
inuti cellen är omvänt proportionellt mot plasmidens stor-
lek. Vid genkloningsförsök kan den större genen klonas
mera effektivt ju mindre vektorer som användes.
4. Dessa plasmider har den ampicillinresistenta genen från
den ursprungliga pBR322 som selektiv genetisk markör.
5. De innehåller reproduktionsorigo från den ursprungliga
pBR322.
Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahållas ett
förfarande för framställning av plasmidvektorer med högt
kopieringstal, vilket förfarande innebär att man i den
gensektion som är ansvarig för produktionen av repressorn
för plasmidreproduktion av en plasmid framkallar en muta-
tion, som modifierar repressorproduktionen.
Enligt en föredragen utföringsform av förfarandet enligt
uppfinningen framkallas en punktmutation, som modifierar
repressorproduktionen, i den gensektion som kodar repres-
sorn RNA i ett derivat av pBR322 eller någon annan plasmid
med samma reproduktionsregion, vari genen för tetracyklin-
resistens inaktiveras eller uppvisar represserad funktion
och där, om så önskas, den DNA-sektion som är ansvarig för
produktionen av membranprotein för tetracyklinresistens
ersättes med en syntetisk polylinker-DNA i ett eller flera
steg.
Såsom beskrivits ovan är mutationen företrädesvis en G ->T-
punktmutation i positionen 3074, enligt den ursprungliga
numreringen av pBR322.
Det finns flera alternativa vägar för eliminering av de
problem som är förknippade med tetracyklinresistens. Enligt
en möjlighet ersättes den DNA-sektion som är ansvarig för
10
15
20
25
30
35
.lin-_
Cjx
.,__|
f mf'
Cm
Cr.
15
produktionen av membranprotein för tetracyklinresistensen
med en polylinker-DNA av syntetiskt ursprung, som kan spjäl-
kas med ett eller flera viktiga restriktionsenzymer. Alter-
nativt kan en främmande DNA-fraktion införas i genen för
tetracyklinresistensen, vilken fraktion inaktiverar dess
funktion. Enligt en ytterligare möjlighet minskas transkrip-
tionen av genen för tetracyklinresistens genom en mutation
i promotorregionen eller genom att man ersätter den natur-
liga promotorn med en "främmande" promotor, som tillförsäk-
rar en mindre intensiv transkription. Alla dessa tekniker
och deras uppenbara modifikationer faller inom ramen för
uppfinningen.
Plasmidvektorerna enligt uppfinningen med högt kopierings-
tal har många användningsmöjligheter, såsom framställning
av vilken som helst klonad sektion av eller hela chimaera-
plasmiden i ren form, för kontrollprover, verifikation av
struktur, modifikation, transkloning, etc. Vid användning
av plasmiderna enligt uppfinningen kan samma mängd DNA er-
hållas utgående från avsevärt mindre mängd utgångsmaterial
än vad som är fallet med de allmänt använda plasmider som
är kända från litteraturen. När det gäller de exemplifiera-
de pHC-plasmiderna kräves ca 20-30 gånger mindre utgångs-
material för framställning av samma mängd DNA än från
pBR322. Plasmid-DNA, som kan isoleras från en enkelkoloni
av en bakterie, som uppbär pHC-plasmider, är tillräcklig
för 3-4 restriktionsanalyser. Av en liter bakteriekultur
kan mer än 10 mg ren plasmid isoleras.
Om den ökade mängden av produkten av den klonade genen är
tolerabel för värdcellen kan syntesen av vilken som helst
genprodukt förbättras genom användning av pHC-plasmider en-
ligt uppfinningen. I ett optimalt fall är utbytesstegringen
ca 20-30-faldig, eftersom denna grad av gendosökning kan
uppnås. I vissa fall är ökningen något mindre till följd
av den begränsande rollen hos andra faktorer.
Införandet av polylinkersektioner i pHC-plasmiderna ger
10
15
20
25
30
35
lš-áïš 21-36 16
dem en hög flexibilitet. Om de tillgängliga spjälknings-
ställena icke är lämpliga för den för kloning avsedda genen
kan ersättas eller kan göras lämpliga för kloning med andra
fragment medelst syntetiska adaptorer.
När det gäller industriella tillämpningar kan framställning-
en av insulin, vasopressin, etc. nämnas.
Det bör observeras att de försök som har utförts i syfte
att åskådliggöra uppfinningen endast är exemplifierande och
icke på något sätt begränsar uppfinningens skyddsomfâng.
Förutom de exemplifierade tekniska lösningarna finns talrika
ytterligare möjligheter att utöva uppfinningen. Genom att
exempelvis använda enzymerna Fnu4HI respektive Tthi II kan
motsvarande DNA-sektioner innehållande 21 respektive 32
nukleotider avspjälkas från den ursprungliga pBR322 och mot-
svarande fragment innehållande en G ->-T-punktmutation kan
syntetiseras kemiskt och införas i molekylen av pBR322 i
stället för de eliminerade fragmenten.
Likaledes kan en stor mångfald syntetiska polylinker-DNA-
fragment införas i molekylen i stället för den partiellt
eller helt eliminerade DNA-sektion som är ansvarig för tet-
racyklinresistensen.
Dessa och liknande lösningar och plasmiderna erhållna
medelst dessa metoder faller inom ramen för uppfinningen.
Plasmiderna pHC 312, pHC 314 respektive pHC 624 har depo-
nerats hos the National Collection of Microorganisms (OKI,
Ungern) under numren 00279, 00280 respektive 00281 den
7 mars 1984.
Nedan angivna mikroorganismstammar respektive plasmider
har deponerats hos the National Collection of Microorga-
nisms (OKI, Ungern) den 25 juli 1984 under följande nummer:
17
E. coli HB 101
E. coli ED 8800
E. coli C 600
p 715
pHC 1
pHC 81
qf AN7
¶TVX
00290
00291
00292
00293
00294
00295
00296
00297
Claims (5)
1. Plasmidvektorer med högt kopieringstal med samma reproduk- tionsregion som pBR322 och innehållande i den gensektion som är ansvarig för produktionen av repressorn av plasmidreplika- tionen en G -9 T-punktmutation vid bp 3074 vid transkriptor- terminalen så att repressorfunktionen modifieras och a) som innehåller ampicillinresistensgenen från plasmid pBR322 som selektiv genetisk markör, varvid i nämnda plasmidvektorer tetracyklinresistensgenen är inakti- verad eller helt frånvarande eller har en represserad funktion eller b) som innehåller ampicillin- och tetracyklinresistens- generna från plasmid pBR322 som selektiva genetiska markörer, varvid i nämnda plasmidvektorer transkrip- tionen av tetracyklinresistensgenen är utförd från en mutant, som är svagare än den naturliga eller från en främande promotor.
2. Plasmidvektorer pHC 314, pHC 312 och pHC 624.
3. En bakterie, som innehåller och reproducerar var och en av plasmidvektorerna enligt krav 1 eller 2. '
4. Förfarande för framställning av plasmidvektorer med högt kopieringstal med sama reproduktionsregion som pBR322, k ä n n e t e c k n a t därav, att i ett derivat av pBR322 eller någon annan plasmid med samma reproduktionsregion, som innehåller genen för tetracyklinresistens i en inaktiverad form eller i en form uppvisande en represserad funktion, en G -à T-punktmutation framkallas i position 3074 i den gen- sektion som kodar repressorn RNA, enligt den ursprungliga numreringen av pBR322, och, om så önskas, att den DNA-sektion I! a¿'? Ofl'6 mua LO H som är ansvarig för produktionen av membranprotein för tetra- cyklinresistensen ersättes med en syntetisk polylinker-DNA i ett eller flera steg.
5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att i en plasmid, som innehåller en G -à T-punktmuta- tion, den DNA-sektion som är ansvarig för produktionen av det membranprotein som orsakar tetracyklinresistens ersâttes med en syntetisk polylínker-DNA-sektion, som kan spjälkas med ett eller flera restriktíonsenzymer, eller att en främmande DNA- sektion, som desaktiverar dess funktion, införes i tetracyk- linresistensgenen eller att transkriptionen av tetracyklinre- sistensgenen represseras genom en mutation i promotorregionen eller genom att man ersätter den naturliga promotorn med en främmande sådan, som tillhandahåller en mindre intensiv transkription.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU833212A HU194307B (en) | 1983-09-16 | 1983-09-16 | Process for producing plasmidvectors of high copy number |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8404637D0 SE8404637D0 (sv) | 1984-09-14 |
SE8404637L SE8404637L (sv) | 1985-03-17 |
SE463266B true SE463266B (sv) | 1990-10-29 |
Family
ID=10963133
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8404637A SE463266B (sv) | 1983-09-16 | 1984-09-14 | Plasmidvektorer med hoegt kopieringstal, framstaellning och anvaendning daerav |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4703012A (sv) |
JP (1) | JPS60156389A (sv) |
AT (1) | AT384031B (sv) |
AU (1) | AU578041B2 (sv) |
BE (1) | BE900570A (sv) |
CA (1) | CA1275631C (sv) |
CH (1) | CH667672A5 (sv) |
DE (1) | DE3434041A1 (sv) |
DK (1) | DK439784A (sv) |
FI (1) | FI79552C (sv) |
FR (1) | FR2552102B1 (sv) |
GB (1) | GB2148301B (sv) |
HU (1) | HU194307B (sv) |
IL (1) | IL72952A (sv) |
IT (1) | IT1178510B (sv) |
NL (1) | NL8402846A (sv) |
PL (1) | PL152527B1 (sv) |
SE (1) | SE463266B (sv) |
SU (1) | SU1443806A3 (sv) |
ZA (1) | ZA847273B (sv) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0219814B1 (en) * | 1985-10-21 | 1991-09-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for production of isulin-like growth factor i and plasmid for production thereof |
DE4136389A1 (de) * | 1991-03-18 | 1992-10-08 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von glutarylacylase in grossen mengen |
JPH06327480A (ja) * | 1993-05-20 | 1994-11-29 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | プラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むdna断片 |
US20040259252A1 (en) * | 2001-07-18 | 2004-12-23 | Sanders Mitchell C. | Vector containing an enhanced p15a origin of replication |
WO2006081529A2 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Nature Technology Corp. | Compositions and processes for improved plasmid dna production |
CA2622710C (en) * | 2005-09-16 | 2016-10-18 | Monsanto Technology Llc | Hybrid portable origin of replication plasmids |
UA100692C2 (ru) | 2007-05-02 | 2013-01-25 | Мериал Лимитед | Днк-плазмиды, имеющие повышенную экспрессию и стабильность |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
FI793884A (fi) * | 1978-12-26 | 1980-06-27 | Cetus Corp | Stabila plasmider med stort kopieantal |
CA1198067A (en) * | 1981-02-27 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Stable high copy number plasmids |
CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
GB8308236D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Dna vectors |
EP0126166B1 (en) * | 1983-05-11 | 1990-01-31 | Fina Research S.A. | Cloning vectors comprising a restriction site bank and the construction thereof |
-
1983
- 1983-09-16 HU HU833212A patent/HU194307B/hu not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-09-12 CH CH4367/84A patent/CH667672A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-09-13 BE BE1/011088A patent/BE900570A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-09-13 GB GB08423161A patent/GB2148301B/en not_active Expired
- 1984-09-14 SE SE8404637A patent/SE463266B/sv not_active Application Discontinuation
- 1984-09-14 AT AT0293584A patent/AT384031B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-09-14 FR FR8414122A patent/FR2552102B1/fr not_active Expired
- 1984-09-14 AU AU33077/84A patent/AU578041B2/en not_active Ceased
- 1984-09-14 ZA ZA847273A patent/ZA847273B/xx unknown
- 1984-09-14 JP JP59191860A patent/JPS60156389A/ja active Pending
- 1984-09-14 PL PL1984249593A patent/PL152527B1/pl unknown
- 1984-09-14 IT IT22677/84A patent/IT1178510B/it active
- 1984-09-14 FI FI843600A patent/FI79552C/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-09-14 CA CA000463157A patent/CA1275631C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-09-14 SU SU843792252A patent/SU1443806A3/ru active
- 1984-09-14 DK DK439784A patent/DK439784A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-09-14 NL NL8402846A patent/NL8402846A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-09-14 IL IL72952A patent/IL72952A/xx unknown
- 1984-09-17 US US06/651,679 patent/US4703012A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-09-17 DE DE19843434041 patent/DE3434041A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI79552C (sv) | 1990-01-10 |
IT1178510B (it) | 1987-09-09 |
PL249593A1 (en) | 1985-07-16 |
CA1275631C (en) | 1990-10-30 |
AU3307784A (en) | 1985-03-21 |
IL72952A (en) | 1990-11-05 |
GB2148301B (en) | 1988-05-11 |
HUT35280A (en) | 1985-06-28 |
ZA847273B (en) | 1986-01-29 |
JPS60156389A (ja) | 1985-08-16 |
FR2552102A1 (fr) | 1985-03-22 |
IT8422677A0 (it) | 1984-09-14 |
SU1443806A3 (ru) | 1988-12-07 |
GB8423161D0 (en) | 1984-10-17 |
FI843600L (fi) | 1985-03-17 |
DK439784D0 (da) | 1984-09-14 |
US4703012A (en) | 1987-10-27 |
SE8404637L (sv) | 1985-03-17 |
IL72952A0 (en) | 1984-12-31 |
FR2552102B1 (fr) | 1987-09-18 |
AT384031B (de) | 1987-09-25 |
HU194307B (en) | 1988-01-28 |
ATA293584A (de) | 1987-02-15 |
AU578041B2 (en) | 1988-10-13 |
FI843600A0 (fi) | 1984-09-14 |
GB2148301A (en) | 1985-05-30 |
DE3434041A1 (de) | 1985-09-12 |
FI79552B (fi) | 1989-09-29 |
DK439784A (da) | 1985-03-17 |
BE900570A (fr) | 1985-03-13 |
NL8402846A (nl) | 1985-04-16 |
CH667672A5 (de) | 1988-10-31 |
PL152527B1 (en) | 1991-01-31 |
SE8404637D0 (sv) | 1984-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
de Smit et al. | Translational initiation on structured messengers: another role for the Shine-Dalgarno interaction | |
Wilson et al. | Molecular analysis of cloned human 18S ribosomal DNA segments. | |
Saedler et al. | IS2, a genetic element for turn-off and turn-on of gene activity in E. coli | |
Macrina et al. | A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis | |
Lopes et al. | Analysis of sequences in the INO1 promoter that are involved in its regulation by phospholipid precursors | |
Alexeyev et al. | Membrane topology of the Rickettsia prowazekii ATP/ADP translocase revealed by novel dual pho-lac reporters | |
Rasmussen et al. | Carbon metabolism regulates expression of the pfl (pyruvate formate-lyase) gene in Escherichia coli | |
Horinouchi et al. | Construction and application of a promoter-probe plasmid that allows chromogenic identification in Streptomyces lividans | |
Miller et al. | Chromosomal supercoiling in Escherichia coli | |
Shadel et al. | Control of the lux regulon of Vibrio fischeri | |
Linder et al. | An essential replication gene, repA, of plasmid pSC101 is autoregulated | |
Theophilus et al. | Regulation of the trfA and trfB promoters of broad host range plasmid RK2: identification of sequences essential for regulation by trfB/korA/korD | |
Bertelsen et al. | Molecular characterization of small polydisperse circular DNA from an African green monkey cell line | |
Berman et al. | Selection of lac gene fusions in vivo: ompR-lacZ fusions that define a functional domain of the ompR gene product | |
Kahn et al. | Genetic analysis of bacteriophage P4 using P4-plasmid ColE1 hybrids | |
ES2210424T3 (es) | Produccion mejorada de riboflavina. | |
Beggs et al. | A map of the restriction targets in yeast 2 micron plasmid DNA cloned on bacteriophage lambda | |
US9187752B2 (en) | Hybrid portable origin of replication plasmids | |
SE463266B (sv) | Plasmidvektorer med hoegt kopieringstal, framstaellning och anvaendning daerav | |
Abeles et al. | P1 plasmid replication requires methylated DNA. | |
Blanco et al. | Cloning and endonuclease restriction analysis of uidA and uidR genes in Escherichia coli K-12: determination of transcription direction for the uidA gene | |
Chung et al. | Bacteriophage T7 DNA Packaging: I. Plasmids containing a T7 replication origin and the T7 concatemer junction are packaged into transducing particles during phage infection | |
Niki et al. | Chromosomal genes essential for stable maintenance of the mini-F plasmid in Escherichia coli | |
Dhundale et al. | Mutations that affect production of branched RNA-linked msDNA in Myxococcus xanthus | |
Cowman et al. | Molecular cloning of the gene (ush) from Escherichia coli specifying periplasmic UDP-sugar hydrolase (5'-nucleotidase) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NAV | Patent application has lapsed |
Ref document number: 8404637-4 Effective date: 19921103 |