SE463266B - Plasmidvektorer med hoegt kopieringstal, framstaellning och anvaendning daerav - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 2 6 2 O\ /9/7 'TOJ 95-113 (1977L7. Fram till nu föreligger en synnerligen ut- tömmande vetenskaplig information om denna plasmid och de flesta genkloningsförfarandena har utförts med denna plas- mid eller dess derivat. Vi har använt denna substans som utgångsmaterial vid våra försök. Strukturen hos pBR322 be- stämdes av Sutcliffe [CHS Symp. Quant. Biol. Qâ , 77-90 (1979L7 och åskâdliggöres i fig. 1. Denna plasmid har en molekyllängd av 4362 bp. Kopieringen av plasmiden startar vid nukleotiden 2536 i motsols riktning och dess kopierings- tal per cell är i allmänhet mellan 20 och 50. Kopierings- talet kontrolleras medelst en komplicerad regleringsmeka- nism Åïlasmid 2, 1, (1983L]. Fragmentet mellan nukleotider- na 2978 och 3081 är ansvarig för syntesen av en RNA med låg molekylvikt, vilken icke kodar för något protein och som transkriberas i medsols riktning med en relativt hög intensitet. Denna RNA med låg molekylvikt är den negativa regulatorn (repressorn) vid plasmidkopieringen.

Uppfinningen baserar sig på den upptäckten att plasmidens kopieringstal kan ökas väsentligt genom att man i den gen- sektion som är ansvarig för produktionen av repressorn vid plasmidkopieringen tillhandahåller en mutation, som för- sämrar denna funktion hos gensektionen.

I vårt laboratorium isolerades den första plasmiden med högt kopieringstal (pHC1) som en produkt vid spontan muta- tion i ett försök utfört med plasmider av ampr-, tets- fenotyp innehållande en främmande DNA mellan de EcoRI- och BamHI-spjälkande ställena i plasmiden pBR322 under analys av en.pool av rekombinanter bestående av ca 5000 oberoende plasmider. Från bakteriecellerna innehållande plasmiden pHC1 kunde ca 20-30 gånger mera plasmid DNA isoleras utan förstärkning än från klonerna innehållande andra rekombi- nantmolekyler med liknande struktur. Den upprepade retrans- formationen av plasmiden pHC1 under användning av E. coli HB101 (pro_, len-, thi-, lac', str-, r'm'rndol_, recA-) [Éoyer, H.W. et al.: J. Mol. Biol. gl, 459-472 (1979)], 10 15 20 25 30 35 3 3 -66 [x C600 (rk', mk-, thi_, thr_, leu-, lac_) [Boyer, H.W. et al., ibiduf ED8800 (supE, supF, hsdS , met , lacZM15, recA56) ßumray, N.E. et al.: Mol. gen.Genet. låg, 53-61 (1977L7 värdceller resulterade varje gång i produktionen av ampr-, tets-kloner innehållande en hög mängd plasmid. Som skäl till det ökade kopieringstalet, som var ca 20-30 gånger högre än hos pBR-plasmiderna, antog vi en ärftlig föränd- ring i plasmid-DNA.

Identifiering av den mutation som är ansvarig för högt kopieringstal _Blasmiden pHC1 uppslöts med restriktionsendonukleaser EcoRI och PruII och därefter fylldes de enkeltvinnade ändarna med Klenow subfragment av DNA-polymeras I-enzymet i närvaro av dNTP-substrat. De på så sätt framställda DNA-molekylerna med trubbiga ändar cirkulerades med ett polynukleotidligas- enzym och transformerades till HB101-celler. Från de kolo- nier som växte på ett ampicillinhaltigtmedium isolerades plasmid-DNA och DNA-proverna, som kunde isoleras i hög mängd, analyserades medelst agaros- och polyakrylamidgâlelek- trofores efter uppslutning med restriktionsendonukleaser EcoRI, PvuII och BspRI. Den plasmid pHC81 (fig. 2) som val- des för ytterligare undersökning kunde icke uppslutas med enzymet PvuII och lineariserades med EcoRI. På basis av plasmidens totala molekylvikt (2,3 kb) och storleken av de genom uppslutning med BspRI (587, 457, 434, 267, 240, 80 ...bp) erhållna fragmenten fastställdes att plasmiden pHC81 innehöll sektionen mellan nukelotiderna 2069 och 2 i plas- miden pBR322 med en mutation, som var ansvarig för det höga kopieringstalet. Denna mutation kan icke påvisas på basis av storleken av något av de fragment som produceras medelst de använda enzymerna. För att lokalisera mutationen isole- rades det DNA-fragment med bp 1030, som hade erhållits genom uppslutning av pHC81 med restriktionsendonukleaserna PstI och TaqI, det DNA-fragment med bp 780 som hade erhål- lits genom uppslutning av pBR322 med enzymer PstI och C1aI och det DNA-fragment med bp 218 som hade erhållits genom 10 15 20 25 30 35 “ü 4-.5 266 4 uppslutning av pBR329 med enzymet TaqI. De tre DNA-fragmen- ten blandades i ekvimolär proportion, de ligerades med ett polynukleotidligas och därefter transformerades HB101- celler med ligatet. Från de enkelkloner som växte på ampi- cillinhaltigt medium isolerades plasmid-DNA. Dessa plasmi- der uppvisade fenotypen med högt kopieringstal. Genom att uppsluta plasmid-DNA med restriktionsendonukleaser fast- ställdes att de producerades genom koppling av tre väl ur- skiljbara fragment av olika ursprung; i de erhållna plas- miderna var'da1proximala delen av' ß-laktamasgenen av pBR322-ursprung, den region som innehöll replikatorigo här- rörde från plasmiden pBR329 och det fragment som isolerades från pHC81 innehöll förutom den distala delen av P-lakta- masgenen även den mutation som resulterade i det höga kopi- eringstalet. Den slutsatsen drogs därför att mutationen bil- dades mellan nukelotiderna 2573 (Taqï) och 3612 (PstI) hos DNA i plasmiden pBR322. Nukleotidsekvensen hos denna region bestämdes och jämfördes med den kända pBR322-sekvensen. Den- na jämförelse visade att en G-->-T transition (G=desoxi- guanyl, T=timidyl) ägde rum vid nukleotiden 3074, vilket motsvarar en C - 'A-transition i den komplementära DNA- strängen (C=desoxicytosyl, A=desoxiadenyl).

Som en följd av den uppkomna punktmutationen skadas termi- neringen av transkriptionen av repressorn RNA och en RNA med högre molekylvikt syntetiseras, vilken icke längre kan fungera som replikatrepressor. Termineringen av repressor- funktionen resulterar i det högre kopieringstalet. Genom denna spontana punktmutation, som således kan framkallas avsiktligt, kunde talet hos plasmiden per cell ökas ca 20- 30 gånger (ca 1000) i förhållande till det ursprungliga värdet. Genom denna punktmutation kan kopieringstalet hos vilken som helst plasmid med samma replikatregion som pBR322 väsentligt ökas.

Det har emellertid visat sig att den ursprungliga plasmiden pBR322 innehållande en G ->-T-punktmutation icke längre är levande. På grundav det höga kopieringstalet ökas nämli- 10 15 20 25 30 35 f b ö\ Lfl CN 5 4 2 gen syntesen av båda proteinerna på de gener av plasmiden som bestämmer den antibiotiska resistensen - Apr = |5-lakta- mas, Tor + = membranprotein(er), och sistnämnda (membran- protein ansvarigt för tetracyklinresistensen) är letal för cellen i den ökade mängden. Samma problem observeras när det gäller varje derivat av plasmid pBR322 med högt kopie- ringstal, vilket derivat innehåller den ursprungliga tetra- cyklinresistensgenen i oförändrad form.

Vid våra tidigare försök ställdes vi icke inför detta prob- lem, eftersom vi använde plasmider, där främmande DNA-frag- ment hade klonats mellan ställena BamHI och EcoRI i plasmi- den pBR322 och på detta sätt inaktiverades tetracyklinresi- stensgenen. För att följaktligen erhålla en levande plas- mid med högt kopieringstal måste pBR322 eller ett derivat därav med samma replikatregion modifieras genom inaktive- ring eller repression av funktionen hos tetracyklinresistens- genen.

Enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen tillhan- dahålles därför nya plasmider, som härrör från pBR322 eller derivat därav innehållande samma replikatregion, vilka kän- netecknas därav att de icke innehåller en tetracyklinresi- stent.ga1eller innehåller den i en inaktiverad form eller modifierad form med modererad funktion och de innehåller en punktmutation, som modifierar repressorproduktionen på den gensektion som kodar repressorn RNA.

Enligt en mera föredragen utföringsform av uppfinningen ersättes i plasmid-DNA pBR322 eller ett derivat därav med samma replikatregion basparet GC i positionen 3074 (enligt numreringen av pBR322) med TA genom kontrollerad punktmuta- tion eller ersättandet av en sektion, som innehåller denna mutation i en pHC-plasmid, som beskrives närmare nedan, med en sektion av den önskade plasmiden, som, frånsett denna mutation, är identisk. 10 15 20 25 30 35 266 6 (_25 flzf “ru Såsom beskrivits ovan måste, om pBR322 eller ett lämpligt derivat därav användes som modellsubstans, GC ->-¶A-punkt- mutationen utföras på ett derivat av utgångsplasmiden, vari den tetracyklinresistenta genen är helt frånvarande eller , dess funktion är inaktiverad eller undertryckt. I detta sammanhang innebär repression att den gen som kodar för pro- _ duktionen av det membranprotein som är ansvarigt för tetra- cyklinresistensen ändras för tillhandahållande av en mins- kad proteinproduktion. Enligt en föredragen utföringsform elimineras den DNA som är ansvarig för tetracyklinresisten- sen eller den totala sektionen upp till replikatorigo i pBR322 och, om så önskas, ersättes med en polylinker av syntetiskt ursprung, varigenom användningsmöjligheterna för de erhållna plasmiderna väsentligt utökas på grund av de ytterligare restriktionsendonukleasuppslutna ställen som införes i plasmiden.

Konstruktion av plasmider pHC314, pHC312 och pHC624 Under den vidare transformationen av de vid ovan beskrivna försök erhållna plasmiderna infördes polylinkers i pHC81- plasmiden i syfte att framställa vektorer lämpliga för in- förande av DNA-fragment, som bildades med olika restrik- tionsendonukleaser. DNA i plasmiden pHC81, som hade linea- riserats med endonukleaset EcoRI och defosforylerats med bakteriellt alkaliskt fosfatas, ligerades med plasmid-DNA- fragment [šeed, B.: Nucleic Acid Research ll, 2427-2446 (1983L], och E.coli HB101-celler transformerades med liga- tet. Från de Ap-resistenta bakteriekolonierna isolerades plasmid-DNA och analyserades medelst gelelektrofores efter uppslutning med EcoRI och PstI-restriktionsendonukleaser.

För ytterligare undersökningar utvaldes de plasmider som kunde spjälkas till fragment med bp 2300 och 110 medelst EcoRI och till fragment med bp 1580 och 820 medelst PstI (pHC 314, fig. 3). Av denna plasmid konstruerades pHC312, som endast innehöll ett EcoRI-ställe, på följande sätt: Plasmiden uppslöts med restriktionsendonukleaset BamHI och 10 15 20 25 30 35 *v 7 ësš fas [x den erhållna linjära molekylen uppslöts delvis med ett HinfI-enzym. DNA-fragmenten separerade i en 1,2% agaros- gel och fragmentet med bp 2010 isolerades. De molekyländar som innehöll enkelsträngade sektioner till följd av upp- slutningen med enzymerna BamHI och Hinfl omvandlades till trubbiga ändar med Klenow subfragment av enzymet DNA-poly- meras I och recirkulerades därefter med T4-inducerat poly- nukleotidligas. Den ligerade DNA transformerades till HB101-celler och enkelkloner isolerades. För ytterligare operationer utvaldes den plasmid pHC312 som inte kunde spjälkas med endonukleas BamHI men som kunde lineariseras med EcoRI och producerade fragment med bp 1495 och bp 516 vid uppslutning med HinfI (fig. 4). För framställning av en vektor med högt kopieringstal lämplig för kloning av DNA-fragment med trubbiga ändar uppslösts plasmiden pHC132 med restriktionsendonukleaser EcoRI och HindIII och frag- mentet med bp 1980 isolerades från agarosgel. Detta frag- ment blandades därefter med DNA i plasmiden.'flAN7 (Seed, B.: Nucleic Acids Research, ll, 2427-2446 (1983L], som hade uppslutits med enzymer EcoRI och HindIII, och molekylerna kopplades med polynukleotidligas. E.coli HB1010-celler transformerades med den ligerade plasmiden och från Ap- resistenta enkelbakteriekloner isolerades plasmid-DNA. Den plasmid-DNA som framställes på detta sätt (pHC624, fig. 5) har icke något C1aI-ställe men kan i motsats till plasmiden pHC312 lineariseras med restriktionsendonukleaser Smal, Sa1I och BamHI.

Bestämning av plasmiders kopieringstal .Bslsë.i.!'_=-1.s92issias§'s§l För bestämning av det relativa kopieringstalet hos pHC- plasmider fick E.coli HB101-kulturer, som innehöll plasmi- der av olika storlek härrörande från rekombinant-pBR322 och derivat med högt kopieringstal av samma storlek, växa till dess man uppnådde identisk celldensitet. Från identis- ka mängder av de erhållna suspensionerna isolerades, utan 10 15 20 25 30 35 ëóš 266 förstärkning, plasmid-DNA under användning av den teknik som beskrives av Birnboim och Doly [NuCleiC ACidS RSS- lf 1513-1523 (1979L7. Prover tagna från DNA-preparaten under- kastades elektrofores på agarosgel i spädningar 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 resp. 50 gånger. Plasmiderna med högt kopie- ringstal och deras par med normalt kopieringstal (med sam- ma molekylvikt) undersöktes samtidigt. Försöksresultaten visade att kopieringstalet hos pHC-plasmiderna var ca 20- 30 gånger högre än hos motsvarande pBR322-derivat med "nor- malt kopieringstal". êä§9l9§_ë9e¿e:i§9§§sl Det absoluta kopieringstalet hos pHC-plasmider undersöktes genom märkning av DNA i de celler som innehöll plasmiderna in vivo och mätning av förhållandet mellan radioaktivite- ten i den separerade plasmid-DNA och i den kromosomala DNA.

Medelst denna metod visade sig kopieringstalet hos plasmi- der med samma storlek som pHC314 (Mw = 1,6 x 106 d) vara ca 1000/cell (kromosomens molekylvikt = 2 x 109 d). 60-65% av cellens totala DNA-halt var plasmid-DNA. För märkning av DNA in vivo odlades de celler som inehöll plasmiderna på ett M9-kulturmedium kompletterat med följande komponenter: 0,5% kasamino-syra (Difco), O,5% glukos, 1 pg/ml. vitamin B1, 1 mmol MgSO4, 2 pg/ml tymidin, 250 pg/ml adenosin och 0,4 mßq/ml [sa]-tymiain fäastßq/mmol, cnemapol, Pragj.

De plasmidhaltiga cellerna uppslöts enligt Womble et al.

[U. Bacteriol, låg (1977) 148-1S3]. Kromosomal och plas- mid DNA separerades från varandra medelst etidiumbromid/- cesiumklorid-jämviktsdensitetsgradientcentrifugering av det cellysat som härrörde från en bakteriesuspension som hade fått växa till 2 ml (0D550 = 4-5/45000 rpm, Beckman Type es rotor, 40 tim., 2o°c).

Det ökade kopieringstalet åskådliggöres i figurerna 6 och 7.

I fig. 6 visas fläckar motsvarande Apr-, TcS-rekombinant- 10 15 20 25 30 35 - "z F; 9 i se C: gm -plasmid-DNA av pBR322-ursprung efter separation medelst etidiuflnnmid/agarosgelelektrofores. Samtliga prover fram- ställdes medelst samma teknik utgående från samma mängd plasmidhaltiga HB101-celler [Birnboim och Doly, Nucleic Acids Res. 1, 1513-1523 (1979L]. Proverna 1-2 och 4-6 är rekombinant- plasmider innehållande en främmande DNA med kb 1,5-2,0 mellan de spjälkande ställena EcoRI och BamHI i plasmiden pBR322. Prov 3 är en plasmid av samma storlek, som innehåller den mutation som är ansvarig för det höga kopieringstalet (pHC1).

I fig. 7 visas fläckar av DNA av E.coli HB101-celler, som innehåller plasmiden p715 (prov A) och plasmiden pHC314 (prov B), efter separation medelst etidiumbromid/cesium- klorid-gradientcentrifugering. (Plasmiden p715 har samma struktur som pHC314 med undantag av den mutation som är ansvarig för det höga kopieringstalet.) Bilden togs efter separation av plasmid och kromosomal DNA genom centrifuge- ring under UV-belysning av det centrifugrör som innehöll DNA. Såsom klart framgår av bilden är i den DNA som erhölls från de celler som innehöll plasmiden med normalt kopie- ringstal (prov A) det plasmidhaltiga lägre bandet praktiskt taget helt frånvarande. A andra sidan bildar den pHC314 plasmid-DNA som erhölls från samma mängd celler medelst samma teknik ett brett band under det band som innehåller kromosomal DNA, till följd av det väsentligt ökade kopie- ringstalet hos plasmiden.

Vid försöken användes följande material och tekniker Bakteriestammar och plasmider: pßaszz empr, :eur [Boliven F. et a1.= Gene g, 95-113 (1977)]; pBR329 ampr, chlr, tetr [Covarubbias, L., Bolivar, F.: Gene, 11, 79-89 (1982§h 10 15 20 25 30 35 . ha. 1° GN (_13 /qTvX- och AN7-plasmid-DNA-preparaten framställdes vid the Institute of Biochemistry, Biological Research Centre of the Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungern [Seed, B.: Nucleic Acids Research, ll, 2427-2446 (1983)].

Det använda restriktionsendonukleaset, T4-inducerat poly- nukleotidkinas och polynukleotidligaspreparat framställdes vid the Institute of Biochemistry, Biological Research Centre of the Hungarian Academy of Sciences; Szeged, Ungern under användning av publicerade reningsmetoder [Roberts, R.J.: Nucleic Acids Research ll, r135-r137 (1983); Murray, N.E. et al.: J. Mol. Biol. låg, 493-505 (1979): Panet,_A. et al.: Biochemistry, lå, 5045-5050 (1973L].

Klenow-fragmentet av enzymet DNA-polymeras I var en produkt från New England BioLabs, medan det bakteriella alkaliska fosfataset (BAP) tillverkades av Worthington. []”-322]ATP (Hungarian Isotope Institute, Budapest) hade en specifik aktivitet av 22 TBq/mM.

YTB-kulturmediet [Miller, J.H., ed. Experiments in Mole- cular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972L] innehöll 10 g/liter Bacto Tryptone (Difco), 5 g/liter Bacto jästextrakt (Difco) och 5 g NaCl. För fram- ställning av YTA-plattor kompletterades YTB-kulturmediet med 15 g/liter Bacto agar (Difco).

För isolering av plasmid-DNA fick bakteriestammarna HB101, C600 och ED8800 innehållande de lämpliga plasmiderna växa pâ YTB-kulturmedium innehållande 100 pg/ml ampicillin (Pharmachim, Sofia). Före isolering av varje igk§-pHC- plasmid tillsattes 170 pg/ml kloramfenikol vid OD600nm 0,7-0,8 till bakteriekulturerna, som därefter skakades un- der ytterligare 10-12 timmar. Plasmiderna med högt kopie- ringstal (pHC) isolerades från cellerna av en kultur som hade växt till stationär fas, utan förstärkning. Vid iso- lering av plasmid-DNA i preparativa mängder (från 50 till 100 ml bakteriekultur när det gällde pHC-plasmider och 10 15 20 25 30 35 _. 11 163 Éób från 1-3 liter kultur när det gällde andra derivat) fram- ställdes ett klart lysat medelst den teknik som angivits av Clewell och Helinski ÅU. Bacteriol., 112, 1135 (1972L], och plasmid-DNA renades på en Sephacryl S1000 (Pharmacia)- kolonn. För isolering av plasmid-DNA för analytiska ända- mål (frân 1,0-1,5 ml bakteriekultur) användes den kalium- acetatmetod som har utvecklats av Birnboim och Doly och som har modifierats av D. Ish-Horowich [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982L].

Uppslutningen av DNA-prover medelst restriktionsendonuklea- ser utfördes under de reaktionsbetingelser som har rekommen- derats av New England BioLabs.

För transformering av DNA-fragment med enkelsträngade ändar till fragment med trubbiga ändar utfälldes DNA med alkohol efter uppslutning med restriktionsenzymer och upplöstes däreftet i en buffert innefattande 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM TTP (slutvolym: 10-20 pliter, DNA- koncentration: 200-250 ng/ml). Lösningen inkuberades där- efter med 1-2 U av DNS-polymeras I-Klenow-fragment vid 37°C under 15 minuter [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982L7.

Den reaktionsblandning (30-40 pliter) som användes för ligering av DNA-fragment med klibbiga ändar innehöll 0,5- 1,o pg DNA, 66mm 'rris-ncl (pa 7,6), s mn ngclz. s mn ditiotreitol, 1 mM ATP och 1 U T4-inducerat polynukleotid- ligas. Ligeringen utfördes vid 14°C under 2-3 timmar [Maniatis, T. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. Fragment med trubbiga ändar ligerades i en buffert innehållande 30-40 pg/ml DNA, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 5 mM spermidin, 1 mM ATP, 10lpg/ml BSA (Sigma, Type V). Till reaktions- blandningen sattes 4-6 U av T4-inducerat polynukleotid- ligas och det inkuberades vid 14°C under 8-12 timmar 10 15 20 25 30 35 12 »z-f f, Åfoo Å U\ f' O _[Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)].

Gelelektroforesen av DNA-prover utfördes i 0,2-2,0% agaros- geler (Sigma, Typ I) i horisontella elektroforesapparater under användning av den teknik som har beskrivits av Helling et al. [Ü. Virol. lå, 1235 (1974L]. Polyakrylamid- gelelektroforesen (under användning av 1% och 8%, 1 mm tjocka vertikala geler) utfördes i enlighet med Maniatis et al. [Biochemistry, lå, 3787-3794 (1975)].

För isolering av DNA-fragment från agaros- och polyakryl- amidgeler användes den teknik som har utvecklats av Winberg et al. [Nucleic Acids Res. §, 253-264 (1980)] under använd- ning av DEAE-papper.

Kompetenta celler för transformering av bakteriestammar HB101, C600 och ED8800 framställdes medelst den s.k. CaCl2- metoden, som har beskrivits av Mandel och Hlga (U. Mol. 13101., _53, 154 (197o)].

Defosforyleringen av 5'-ändarna av DNA-fragmenten, märkning av ändarna med polynukleotidkinas och [17-322]ATP och be- stämning av nukleotidsekvensen utfördes enligt det schema som har beskrivits av Maxam och Gilbert [Methods Enzymol. gå, 499 (1977L].

Av plasmiderna enligt uppfinningen föredras speciellt de plasmidvektorer med högt kopieringstal som har samma rep- likatregion som pBR322, en G -a>T-punktmutation i genen för den lilla RNA som fungerar som repressor för replikat- bildningen och som a) innehåller den ampicillinresistenta genen av pBR322 som selektiv genetisk markör och där genen för tetra- cyklinresistens är frånvarande eller inaktiverad eller som b) innehåller generna för ampicillin- och tetracyklin- 10 15 20 25 30 35 13 266 (;\ resistens i plasmiden pBR322 som en selektiv genetisk markör och där transkriptionen av genen för tetracyk- linresistens utföres från en mutant, som är svagare än den naturliga, eller från en främmande promotor.

De plasmider som åskâdliggöres i figurerna 3, 4 och 5 är föredragna representanter för plasmiderna med högt kopie- ringstal enligt uppfinningen, vilka har följande karakte- ristiska egenskaper: 1. Som en följd av en modifiering i strukturen hos den gen som kodar för RNA med låg molekylvikt, vilken tjänar som repressor av reproduktionen, avrepresseras deras reproduk- tion och därför ökas kopieringstalet inuti cellen väsent- ligt och liger i allmänhet runt 1000 (ca 65% av cellens totala DNA-halt). Detta höga kopieringstal har icke något inflytande på de E.coli-celler som användes som värdceller. 2. Plasmiderna tillhörande denna serie innehåller spjälk- ningställerna för talrika restriktionsendonukleaser och därför kan DNA-fragment, som uppslutes av dessa enzymer, lätt införas i dessa plasmider genom kombination därav eller medelst andra endonukleaser, som producerar samma ändar.

Ställen, som är lämpliga för kloning i de föredragna plas- miderna enligt uppfinningen är följande: pHC 314: C1aI, HindIII, XbaI, BamHI, Bg1II och optimala kombinationer av dessa ställen; pHC 312: C1aI, HindIII, XbaI, Bg1II, EcoRI och optimala kombinationer av dessa ställen; pHC 624: EcoRI, HindIII, BamHI, XbaI, Bg1II, Smal, (XmaI), Sa1I och deras kombinationer med vissa restrik- tioner. 3. Storleken hos de föredragna pHC-plasmiderna är avse- värt mindre än hos utgângs-pBR322 och således är storleken 10 15 20 25 30 35 13-6 266 14 hos de plasmiden som åskådliggöres i figurerna 3, 4 och 5 2405 bp, 2010 bp och 2015 bp. Detta är fördelaktigt efter- som kopieringstalet hos de flesta av vektorplasmiderna LN inuti cellen är omvänt proportionellt mot plasmidens stor- lek. Vid genkloningsförsök kan den större genen klonas mera effektivt ju mindre vektorer som användes. 4. Dessa plasmider har den ampicillinresistenta genen från den ursprungliga pBR322 som selektiv genetisk markör. 5. De innehåller reproduktionsorigo från den ursprungliga pBR322.

Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahållas ett förfarande för framställning av plasmidvektorer med högt kopieringstal, vilket förfarande innebär att man i den gensektion som är ansvarig för produktionen av repressorn för plasmidreproduktion av en plasmid framkallar en muta- tion, som modifierar repressorproduktionen.

Enligt en föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen framkallas en punktmutation, som modifierar repressorproduktionen, i den gensektion som kodar repres- sorn RNA i ett derivat av pBR322 eller någon annan plasmid med samma reproduktionsregion, vari genen för tetracyklin- resistens inaktiveras eller uppvisar represserad funktion och där, om så önskas, den DNA-sektion som är ansvarig för produktionen av membranprotein för tetracyklinresistens ersättes med en syntetisk polylinker-DNA i ett eller flera steg.

Såsom beskrivits ovan är mutationen företrädesvis en G ->T- punktmutation i positionen 3074, enligt den ursprungliga numreringen av pBR322.

Det finns flera alternativa vägar för eliminering av de problem som är förknippade med tetracyklinresistens. Enligt en möjlighet ersättes den DNA-sektion som är ansvarig för 10 15 20 25 30 35 .lin-_ Cjx .,__| f mf' Cm Cr. 15 produktionen av membranprotein för tetracyklinresistensen med en polylinker-DNA av syntetiskt ursprung, som kan spjäl- kas med ett eller flera viktiga restriktionsenzymer. Alter- nativt kan en främmande DNA-fraktion införas i genen för tetracyklinresistensen, vilken fraktion inaktiverar dess funktion. Enligt en ytterligare möjlighet minskas transkrip- tionen av genen för tetracyklinresistens genom en mutation i promotorregionen eller genom att man ersätter den natur- liga promotorn med en "främmande" promotor, som tillförsäk- rar en mindre intensiv transkription. Alla dessa tekniker och deras uppenbara modifikationer faller inom ramen för uppfinningen.

Plasmidvektorerna enligt uppfinningen med högt kopierings- tal har många användningsmöjligheter, såsom framställning av vilken som helst klonad sektion av eller hela chimaera- plasmiden i ren form, för kontrollprover, verifikation av struktur, modifikation, transkloning, etc. Vid användning av plasmiderna enligt uppfinningen kan samma mängd DNA er- hållas utgående från avsevärt mindre mängd utgångsmaterial än vad som är fallet med de allmänt använda plasmider som är kända från litteraturen. När det gäller de exemplifiera- de pHC-plasmiderna kräves ca 20-30 gånger mindre utgångs- material för framställning av samma mängd DNA än från pBR322. Plasmid-DNA, som kan isoleras från en enkelkoloni av en bakterie, som uppbär pHC-plasmider, är tillräcklig för 3-4 restriktionsanalyser. Av en liter bakteriekultur kan mer än 10 mg ren plasmid isoleras.

Om den ökade mängden av produkten av den klonade genen är tolerabel för värdcellen kan syntesen av vilken som helst genprodukt förbättras genom användning av pHC-plasmider en- ligt uppfinningen. I ett optimalt fall är utbytesstegringen ca 20-30-faldig, eftersom denna grad av gendosökning kan uppnås. I vissa fall är ökningen något mindre till följd av den begränsande rollen hos andra faktorer.

Införandet av polylinkersektioner i pHC-plasmiderna ger 10 15 20 25 30 35 lš-áïš 21-36 16 dem en hög flexibilitet. Om de tillgängliga spjälknings- ställena icke är lämpliga för den för kloning avsedda genen kan ersättas eller kan göras lämpliga för kloning med andra fragment medelst syntetiska adaptorer.

När det gäller industriella tillämpningar kan framställning- en av insulin, vasopressin, etc. nämnas.

Det bör observeras att de försök som har utförts i syfte att åskådliggöra uppfinningen endast är exemplifierande och icke på något sätt begränsar uppfinningens skyddsomfâng.

Förutom de exemplifierade tekniska lösningarna finns talrika ytterligare möjligheter att utöva uppfinningen. Genom att exempelvis använda enzymerna Fnu4HI respektive Tthi II kan motsvarande DNA-sektioner innehållande 21 respektive 32 nukleotider avspjälkas från den ursprungliga pBR322 och mot- svarande fragment innehållande en G ->-T-punktmutation kan syntetiseras kemiskt och införas i molekylen av pBR322 i stället för de eliminerade fragmenten.

Likaledes kan en stor mångfald syntetiska polylinker-DNA- fragment införas i molekylen i stället för den partiellt eller helt eliminerade DNA-sektion som är ansvarig för tet- racyklinresistensen.

Dessa och liknande lösningar och plasmiderna erhållna medelst dessa metoder faller inom ramen för uppfinningen.

Plasmiderna pHC 312, pHC 314 respektive pHC 624 har depo- nerats hos the National Collection of Microorganisms (OKI, Ungern) under numren 00279, 00280 respektive 00281 den 7 mars 1984.

Nedan angivna mikroorganismstammar respektive plasmider har deponerats hos the National Collection of Microorga- nisms (OKI, Ungern) den 25 juli 1984 under följande nummer: 17 E. coli HB 101 E. coli ED 8800 E. coli C 600 p 715 pHC 1 pHC 81 qf AN7 ¶TVX 00290 00291 00292 00293 00294 00295 00296 00297

Claims (5)

.^_.{"Éf ñw/ó “rvq ÃÛ /8 EATENTKRAV

1. Plasmidvektorer med högt kopieringstal med samma reproduk- tionsregion som pBR322 och innehållande i den gensektion som är ansvarig för produktionen av repressorn av plasmidreplika- tionen en G -9 T-punktmutation vid bp 3074 vid transkriptor- terminalen så att repressorfunktionen modifieras och a) som innehåller ampicillinresistensgenen från plasmid pBR322 som selektiv genetisk markör, varvid i nämnda plasmidvektorer tetracyklinresistensgenen är inakti- verad eller helt frånvarande eller har en represserad funktion eller b) som innehåller ampicillin- och tetracyklinresistens- generna från plasmid pBR322 som selektiva genetiska markörer, varvid i nämnda plasmidvektorer transkrip- tionen av tetracyklinresistensgenen är utförd från en mutant, som är svagare än den naturliga eller från en främande promotor.

2. Plasmidvektorer pHC 314, pHC 312 och pHC 624.

3. En bakterie, som innehåller och reproducerar var och en av plasmidvektorerna enligt krav 1 eller 2. '

4. Förfarande för framställning av plasmidvektorer med högt kopieringstal med sama reproduktionsregion som pBR322, k ä n n e t e c k n a t därav, att i ett derivat av pBR322 eller någon annan plasmid med samma reproduktionsregion, som innehåller genen för tetracyklinresistens i en inaktiverad form eller i en form uppvisande en represserad funktion, en G -à T-punktmutation framkallas i position 3074 i den gen- sektion som kodar repressorn RNA, enligt den ursprungliga numreringen av pBR322, och, om så önskas, att den DNA-sektion I! a¿'? Ofl'6 mua LO H som är ansvarig för produktionen av membranprotein för tetra- cyklinresistensen ersättes med en syntetisk polylinker-DNA i ett eller flera steg.

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att i en plasmid, som innehåller en G -à T-punktmuta- tion, den DNA-sektion som är ansvarig för produktionen av det membranprotein som orsakar tetracyklinresistens ersâttes med en syntetisk polylínker-DNA-sektion, som kan spjälkas med ett eller flera restriktíonsenzymer, eller att en främmande DNA- sektion, som desaktiverar dess funktion, införes i tetracyk- linresistensgenen eller att transkriptionen av tetracyklinre- sistensgenen represseras genom en mutation i promotorregionen eller genom att man ersätter den naturliga promotorn med en främmande sådan, som tillhandahåller en mindre intensiv transkription.