DD284898A5 - Verfahren zur herstellung von authentischer serotyp c-streptokinase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein gentechnisch-mikrobielles Verfahren zur Gewinnung von authentischer Serotyp C-Streptokinase. Sie verfolgt das Ziel, das genannte Protein in effektiver Weise herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird wie folgt geloest: Zunaechst wird eine Zellpopulation jeweils eines Stammes der Art Streptococcus equisimilis mit einem rekombinanten, in grampositiven Bakterien replizierbaren Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS fuer wenigstens einen in Streptococcus auspraegbaren Phaenotypmarker die kodierende DNS-Sequenz fuer authentische Serotyp C-Streptokinase traegt. Hierbei erhaltene transformierte Rezipientenzellen werden anschlieszend ueber 8 bis 20 Generationen ohne Selektionsdruck bzgl. des plasmidkodierten Phaenotypmarkers vermehrt und auf die Merkmalskombination Plasmidfreiheit bei gleichzeitiger Erhaltung des besagten Markers kontrolliert. Im Ergebnis dieser Prozedur entstehen durch homologe Rekombination mutierte S. equisimilis -Staemme, bei denen das skc -Gen im Chromosom des Wirts dupliziert vorliegt. Die auf diese Weise gewonnenen neuartigen S. equisimilis -Staemme, so die Staemme H46SM sowie H46SMS, werden zur Submersfermentation herangezogen, und aus der gebildeten Kulturfluessigkeit wird das genannte Protein schlieszlich in an sich bekannter Weise isoliert.{authentische Serotyp C-Streptokinase; gentechnisch-mikrobielles Verfahren; Streptococcus equisimilis, rekombinanter Plasmidvektor; kodierende DNS; skc -Gen; Transformation; Vermehrung ohne Selektionsdruck; Staemme H46SM und H46SMS}

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bisher sind für die Skc-Herstellung Submersfermentationen bekannt, in denen Streptokokken-Stämme aus der serologischen Gruppe C eingesetzt werden. Die pharmazeutische Industrie zieht aus den Gruppen C-Streptokokken ausnahmslos Stämme der Species Streptococcus equisimilis als Produzenten heran. Die so hergestellten Streptokinasen werden z.B. unter den

Handelsnamen Awelysin (AWD, vgl. Patentschrift DD 111 096), Kabikinase (Kabi, Schweden) und Streptase (Behringwerke AG, BRD) vertrieben.

Verfahren zur Steigerung der Skc-Produktion in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Industrie haben sich bislang praktisch nur auf die Verbesserung der Milieubedingungen während der Fermentation und der Reinigungsschritte bei der Skc-Herstellung aus dem Kulturmedium beschränkt (vgl. etwa Patentschrift DD 126342).

Durch die Klonierung äes Skc-Gens aus der chromosomalen DNS des Donorstammes S. equisimilis H46 A (vgl. Patentschrift DD 249037) und durch die Subklonierung dieses Gens auf Plasmide, die in gramnegativen sowie in grampositiven Bakterien repliziert werden, bestehen Möglichkeiten zur alternativen heterologen Produktion von Skc (vgl. Patentschriften DD 250546,

Diese Verfahren zur Herstellung von Skc haben jedoch wenigstens folgende Nachteile:

- Das Niveau der Expression von Skc liegt zur Zeit noch unter dem des Gendonorstammes H 46 A;

- die Ausschleusung von Skc aus den heterologen Wirtszellen erfolgt teilweise nur unvollständig;

- von den bislang eingesetzten rekombinanten bakteriellen Skc-Bildnern (normale Zellen) kann keine authentische Skc (Molokulargewicht47 kDa) isoliert werden. (Heterolog synthetisierte Skc wird posttranslational so modifiziert, daß nur eine 44kDa große, C-terminal um 31/32 Aminosäuren verkürzte Skc isoliert werden kann [vgl. Patentschrift DD 250546,

K. W. Jackson, H.Malke et al.. Biochemistry, 1986,25,108-114]).

Ein Verfahren zur Herstellung von Skc mit Hilfe eines gentechnisch manipulierten S.equisimilis-Stammes ist bisher nicht beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, in effektiver Weise authentische Serotyp C-Streptokinase herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, welches unter

Bereitstellung von rekombinanten homologen Produzentenstämmen die effektivere Gewinnung von authentischer Serotyp

C-Streptokinase ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Eine Zellpopulation eines Stammes der Art Streptococcus equisimilis wird mit einem rekombinanten, jeweils in grampositiven Bakterien replizierbaren Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für wenigstens einen in S. equisimilis ausprägbaren Phänotypmarker die kodierende DNS für authentische Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: Skc-Gen) unter der Kontrolle von Expressions- und Sekretionssignalen trägt. Die in diesem ersten Schritt erhaltenen transformierten S.equisimilis-Zellen werden über 8 bis 20 Generationen ohne Selektionsdruck bezüglich des auf dem Skc-rekombinanten Expressionsplasmid kodierten Phänotypmarkers vermehrt, und die gewonnene Population wird anschließend in an sich bekannter Weise auf die

Merkmale Plasmidfreiheit sowie Erhalt des besagten Phänotypmarkers kontrolliert (Schritt 2). Jeder gewonnene S. equisimilis-Stamm mit dieser Kennzeichnung wird sodann submers in einem flüssigen Nährmedium fermentiert, und aus der

Kulturflüssigkeit wird das genannte Protein in an sich bekannter Weise isoliert (Schritt 3).

In seiner weiteren Ausgestaltung ist das Verfahren nun zunächst dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellpopulation eines

S.equisimilis-Stammes aus der Kollektion

(H 46A, C 9/50, SSIC Typ 20)

m it einem rekombinantenStreptococcus-Plasmidvektortransformiert wird, welcher neben der kodierenden DNS für wenigstens jeweils einen in obigen S.equisimilis-Stämmen ausprägbaren Phänotypmarker vom Typ einer Antibiotika-Resistenzdeterminante, vorzugsweise für wenigstens eine in dieser Species ausprägbare Antibiotika-Resistenzdeterminante aus der Gruppe

- Makrolid-Lincosamid-Streptogramin B-Resistenzdeterminante (MLS¹),

- Chloramphenicol-Resistenzdeterminante (Cm^r),

- Kanamycin-Resistenzdeterminante (Km') bzw.

- Streptomycin-Resistenzdeterminante (Sm'),

die kodierende Sequenz für das authentische Skc-Gen, vorzugsweise die kodierende Sequenz für das Skc-Gen aus dem Donorstamm S.equisimilis H46A (Kurzwort: Skc (H46A)-Gen), unter der Kontrolle von Streptococcus-Expressions- und Sekretionssignalen, vorzugsweise unter der Kontrolle der nativen Expressions- und Sekretionssignale des Skc (H46 A)-Gens, trägt. Für diesen Transformationsschritt des Gesamtverfahrens werden besonders vorteilhaft solche rekombinanten Streptococcus- Plasmidvektoren herangezogen, welche neben der kodierenden DNS für eine in S.equisimilis ausprägbare Antibiotika-Resistenzdeterminante aus der Gruppe

(MLS', CnV, KnV, Sm'),

vorzugsweise für eine MLS'-Determinante, die kodierende Sequenz für das Skc (H46A)-Gen (einschließlich seiner nativen Expressions- und Sekretionssignale)

- auf einem 2568bp-Pstl-Pstl-Fragment (Variante A) bzw.

- auf einem 2076bp-Haelll-Pstl-Fragment (Variante B)

tragen. Als solche Skc (H46 A)-rekombinanten Streptococcus-Vektoren stehen aus früherer Forschungsarbeit des Zentralinstitutes vorzugsweise die Plasmide (s. a. nachstehende besondere Ausführungsform des Verfahrens)

pSM752 (Molekülgröße 13,3 kb; MLS') für Variante A bzw

pSMS 69 (Molekülgröße 7,8 kb; MLS') für Variante B

zur Verfügung.

Die bereitgestellte DNS des verfahrensgemäß gewählten Skc-rekombinanten Plasmidvektors, vorzugsweise eines Skc (H 46 A)-rekombinanten Vektors wie Plasmid pSM752 bzw. pSMS69, wird vorteilhaft wahlweise durch Elektroporation oder durch Polyethylenglycol-vermittelte Protoplastentransformation in die jeweils gewählten S. equisimilis-Rezipientenzellen eingeschleust.

Soll die Transformation der besagten S. equisimilis-Zellen nach der letztgenannten Prozedur ausgeführt werden, so ist als erfolgsverbürgender Teilschritt hierbei eine Inkubation der durch Zentrifugation und Waschung vorbehandelten Rezipientenpopulation in einer Protoplastierungslösung, der 4 mg/ml bis 20 mg/ml Lysozym zugesetzt sind, vorzunehmen. Nach der Transformation werden die erhaltenen modifizierten S. equisimilis-Zellen über die eingangs angegebene Anzahl von Generationen kultiviert, ohne daß dabei ein Selektionsdruck bezüglich der auf dem eingeschleusten Skc-rekombinanten Plasmidvektor, vorzugsweise bezüglich der auf dem eingeschleusten Skc (H46A)-rekombinanten Plasmidvektor, kodierten Antibiotika-Resistenzdeterminante, vorzugsweise MLS'-Determinante (synonyme Bezeichnung: Em^r; Erythromycin-Resistenzdeterminante), ausgeübt wird. Im Ergebnis des voranstehend beschriebenen Vorgehens bilden sich in den bereitgestellten S. equisimilis-Transformantenkulturen als Folge eines Rekombinationsereignisses zwischen Plasmid- und chromosomaler Wirts-DNS mit Sicherheit neuartige Selektanten - und darunter insbesondere auch solche neuartigen Selektanten, in denen das komplette Plasmid unter Erhaltung der im vorliegenden Verfahren wesentlichen Komponenten seiner biologischen Aktivität in die chromosomale DNS übergewechselt ist. Neuartige S. equisimilis-Selektanten dieses Grundtyps werden nach dem oben gemäß Schritt 2 vorgeschlagenen Screening-System, d.h. durch die gleichzeitige Kontrolle auf die Merkmale Plasmidfreiheit und Beibehaltung der kodierten Antibiotika-Resistenzdeterminante, vorzugsweise der kodierten MLS'- bzw. Em'-Determinante, erkannt und isoliert.

Für diese durch sog. homologe Rekombination (zwischen plasmidaler und chromosomaler DNS jeweils obiger Kennzeichnung) erhaltenen neuartigen S. equisimilis-Stämme mit dupliziertem Skc-Gen wurde gefunden, daß sie

- die authentische Serotyp C-Streptokinase im Vergleich zum Referenzstamm S. equisimilis H46 A mit erhöhter Rate produzieren und

- bei Kultivierung ohne Selektivdruck über viele Generationen das erworbene Resistenzniveau gegen ein Antibiotikum aus o.g. Gruppe, vorzugsweise gegen ein MLS-Antibiotikum, beibehalten.

Die in der beschriebenen Weise durch homologe Rekombination gewonnenen S. equisimilis-Stämme werden in Schritt 3 des Gesamtverfahrens in mit flüssigem Nährmedium gefüllten Schüttelgefäßen bzw. Rührreaktoren fermentiert. In diesen Fermentationen kommen vorzugsweise Hefeautolysat-Nährmedium mit jeweils einem Mono- bzw. Disaccharid wie Glucose, Maltose, Saccharose oder Lactose als nachdosierter Kohlenstoff-Quelle zum Einsatz. Die neuartigen S. equisimilis-Stämme obiger Kennzeichnung werden in diesen Nährmedien bei Temperaturen von 30°C bis 37°C für die Dauer von 12 Stunden bis 24 Stunden fermentiert, wobei der pH-Wert in der Umgebung des Neutralpunktes (pH 5,5 bis pH 8,0) gehalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für die Transformation in Schritt 1 nun der Stamm S. equisimilis H46A bereitgestellt, so daß in den Verfahrensschritt 2 (Kultivierung ohne Selektionsdruck; Screening auf die Merkmale Plasmidfreiheit sowie Erhalt der besagten Antibiotika-Resistenzdeterminante) damit die Skc (H46A)-rekombinanten Stämme

S. equisimilis H46A(pSM752) und S. equisimilis H46A(pSMS69)

einbezogen werden.

In diesem Zusammenhang sind ergänzend die beiden folgenden Sachverhalte zu offenbaren:

- Der in Streptococcus replizierbare Skc (H46A)-rekombinante Plasmidvektor pSMS69 (Molekülgröße 7,8kb; MLS^r) seinerseits wird erhalten, indem das literaturbekannte Skc (H46A)-Trägerplasmid pMM 191 (Molekülgröße 5,2kb, Ap^f), welches das Skc (H46A)-Gen als portable Box enthält, sowie der gleichfalls literaturbekannte Streptococcus-Klonierungsvektor pSM6 (Molekülgröße 5,6 kb; MLS') über ihren jeweiligen singulären EcoRI-Ort miteinander fusioniert werden, indem weiter dieses Zwischenplasmid komplett mit dem Enzym Haelll verdaut und das hierbei anfallende Hauptfragment in einer Ligationsreaktion schließlich wieder zu einer zirkulären Struktur gefügt wird (s.a. Abb. 5).

- Die pSM 752-wie die pSMS 69-DNS wird wiederum wahlweise durch Elektroporation oder durch Polyethylenglycol-vermittelte Protoplastentransformation in die S. equisimilis-H46A-Rezipientenzellen eingeschleust. Wird die Einschleusung nach der zuletzt genannten Methode vorgenommen, so werden hierzu durch Zentrifugation und Waschung vorbehandelte H 46A-Zellen in SGM17-Medium als Protoplasierungslösung, dem 8 mg/ml Lysozym zugesetzt sind, für die Dauer von 4 Stunden bei 37⁰C inkubiert.

Im Verfahrensschritt 2 der bevorzugten Ausführungsform werden die o.g. transformierten Stämme S. equisimilis H46A(pSM 752) und S. equisimilis H46A(pSMS69) über 10 bis 15 Generationen ohne Selektionsdruck, d. h. ohne Zugabe des MLS-Antibiotikums Erythromycin, vermehrt; anschließend werden die hierbei entstehenden neuartigen Stämme S. equisimilis H46SM sowie S. equisimilis H46SMS in der dargelegten Weise auf die Merkmale Plasmidfreiheit bei gleichzeitiger Erhaltung der Erythromycin-Resistenz kontrolliert. Für die beiden genannten Stämme erwies sich die besagte Merkmalskombination als gegeben; beide Stämme sind somit, wie oben skizziert, im Ergebnis eines homologen Rekombinationsereignisses entstanden. Im Vergleich zu den transformierten Stämmen H46A (pSM752) und H46A (pSMS69) weisen die neuen Stämme S. equisimilis H46A sowie S. equisimilis H46SMS eine so hohe Stabilität auf, daß sie ohne Sondervorkehrungen in mikrobiellen Fermentationen eingesetzt werden können.

Durch Hybridisierungsexperimente konnte auch aufgeklärt werden, daß von den zwei möglichen Wegen der homologen Rekombination zwischen plasmidaler und chromosomaler DNS in beiden Varianten der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gerade jener realisiert worden ist, der (im Ergebnis eines „crossing over"-Ereignisses in den Homologie-Regionen von Plasmid pSM752 bzw. pSMS69 und H46 Α-Chromosom)zur kompletten Integration der Plasmid-DNS in die chromosomale DNS führt, wobei pro H46SM- bz'w. H46SMS-Zelle dann zwei (noch dazu gleichgerichtete) Skc (H46A)-Genkopien vorliegen, zwischen denen jeweils die Erythromycin-Resistenzdeterminante angeordnet ist. Für den Fall der Entstehung von Stamm S. equisimilis H46SM ist dieser Ablauf in Abb. 1 skizziert.

Bei den Hybridisierungsexperimenten wurde das Plasmid pMM 191, welches über Nick-Translation mit ³²P-ATP radioaktiv markiert worden war, als Sonde eingesetzt. Zur Hybridisierung wurden

- chromosomale DNS des Ausgangsstammes H46A,

- chromosomale DNS der Integrationsmutante H46SM bzw. H46SMS sowie

- die DNS der genannten Hybridisierungssonde

jeweils mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Pstl und Hindill gespalten sowie gelelektrophoretisch getrennt (vgl. Abb.2,Teil A). Wie das Autoradiogramm (vgl. Teil B von Abb. 2) zeigt, liegen in Stamm H 46SM, auf den die Abb.2 bezogen ist, zwei Skc-Genkopien vor: Während der Ausgangsstamm H46 A bei der EcoR I-Spaltung nur ein Signal und bei der Hind Ill-Spaltung (als Folge des Skc-intemen Spaltortes für dieses Enzym) zwei Signale liefert, weist die Integrationsmutante bei EcoR I-Spaltung 2 Signale sowie bei Hind Ill-Spaltung 4 Signale auf. (Die Pstl- bzw. Pst-Hae Ill-Spaltung von H46SM bzw. H46SMS dient jeweils als Beleg dafür, daß in beiden Varianten der bevorzugten Ausführungsform das etwa 2,5 kb große bzw. etwa 2,1 kb große Fragment mit dem Skc-Gen komplett dupliziert ist.)

Die verfahrensgemäß erhaltenen Stämme S. equisimilis H46SM und S. equisimilis H46SMS werden zur Submersfermentation sowohl in einem mit flüssigem Hefeautolysat-Nährmedium gefüllten Schüttelgefäß als auch in einem so gefüllten Rührreaktor eingesetzt, wobei bevorzugt Glucose als nachdosierte Kohlenstoffquelle verwendet wird. Die Fermentation wird hierbei bei Temperaturen von 30°C bis 37"C und bei pH-Werten im Bereich von pH 5,5 bzw. pH 8,0 für die Dauer von 12 Stunden bis 24 Stunden vorgenommen. Besonders vorteilhaft wird die Fermentation dieser beiden neuen Stämme in der Variante I mit den Parameterwerten

pH 7,2; Temperatur 37°C; Dauer: 12 Stunden bis 14 Stunden bzw. in der Variante Il mit den Parametern

pH 7,2; Temperatur 30⁰C; Dauer: 14 Stunden bis 18 Stunden

realisiert. Die bei Fermentationsende vorliegende Kulturlosung wird hierbei nach Abtötung der S. equisimilis-Population in an sich bekannterWeise aufgearbeitet (Separation der Biomasse; Einrühren von Kieselgel in das Kulturfiltrat zum Zwecke der Adsorption der Streptokinase; Elution des Aktivatorproteins Skc vom beladenen Kieselgel; Fällung der Skc aus dem Eluat). In dieser Etappe durchgeführte genauere Expressionsanalysen zeigten, daß sowohl bei Stamm S. equisimilis H46SM als auch bei Stamm S. equisimilis H46SMS das Niveau der Streptokinase-Expression pro Biomasse-Einheit im Vergleich zum Ausgangsstamm H 46A verdoppelt ist (vgl. Abb. 3), d. h. bei der verfahrensgemäßen Kultivierung erfolgt in der Tat eine der Gendosis entsprechende gesteigerte Bildung des interessierenden Genproduktes. Mit der Abb. 4 wird darüber hinaus belegt, daß es sich bei dem aus voranstehend dargestellter Kultivierung und Aufarbeitung von Stamm H46SM bzw. von Stamm H46SMS erhaltenen Genprodukt um authentische Serotyp C-Streptokinase (Molekulargewicht 47kDa) handelt.

-6- 284 898 Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Gewinnung von authentischer Serotyp C-Streptokinase unter Einsatz von Stamm Streptococcus equisimilis H46SM

1.1. Auswahl und Bereitschaft von Rezipientenstamm sowie Plasmidvektor

Als Rezipientenstamm wird der als nativer Bildner von authentischer Serotyp C-Streptokinase bekannte Stamm S. equisimilis H46A gewählt. Eine biologisch reine Probe dieses pfasmidfreien, MLS-sensitiven Stammes, der ja in der pharmazeutischen Industrie gelegentlich auch zur Produktion von Skc nach konventionellen mikrobiologischen Verfahren eingesetzt wird, ist i η der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR-6900 unter dem Registrierzeichen IMET 11407 deponiert worden. Für die Transformation gemäß Schritt 1 des Gesamtverfahrens wird in diesem Beispiel das literaturbekannte E. coli-Streptococcus-shuttle-Plasmid pSM752 herangezogen. Dieses Skc (H46A)-rekombinante Plasmid, dessen Charakterisierung bereits an anderer Stelle der vorliegenden Erfindungsbeschreibung gegeben wurde, kann aus verschiedenen, in der Laborpraxis gebräuchlichen bakteriellen Rezipientenstämmen entnommen werden. Eine biologisch reine Probe des Stammes Streptococcus sanguis Challis (pSM 752) ist im Zusammenhang mit der schutzrechtlichen Sicherung früherer Forschungsergebnisse des Zentralinstituts in der 0.9. Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen unter dem Registrierzeichen ZIMET 10959 deponiert worden. Im Bereich der Gattung Streptococcus ist bislang die Replikation von Plasmid pSM752 in Stämmen der serologischen Gruppen H sowie N verifiziert.

Das Plasmid pSM 752 wird im vorliegenden Fall nach Standardmethoden aus dem E. coli-Stamm HB10KpSM 752) isoliert, über Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt, mit Ethanol gefällt und in SMC-Puffer (0,5 M Saccharose, 0,02 M Maleat, 0,05 M CaCI₂; pH 6,5) resuspendiert.

1.2. Transformation und Charakterisierung der Transformation

1.2.1. Transformation

Der Stamm S. equisimilis H46A wird über Nacht in BHI-Medium als Standkultur bei 37°C angezogen. Nach 16stündiger Kultivierung werden die Zellen von 10ml dieser Kultur durch 5minütige Zentrifugation bei 400Orpm gewonnen, einmal in 10 ml SGM 17-Medium (nach Terzagi & Sandine, Appl. Microbiol. 29 [1975], 807-813; Kondo & McKay, Appl. Environ. Microbiol.48 [1984], 252-259) gewaschen und in 5ml SGM17-Medium resuspendiert. Zur Protoplastierung der Zellen werden diesem Medium 8 mg/ml Lysozym (10000U/ml) zugesetzt, und die so erhaltene Zellsuspension wird 4 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die in dieser Weise vorbehandelten Zellen werden durch 4minütige Zentrifugation bei 3000 rpm gewonnen, einmal mit 5ml SMC-Puffer gewaschen und in 100μΙ SMC-Puffer resuspendiert. Nach Resuspendierung der Zellen werden der Lösung 2 μg Plasmid-DNS pSM752 (in 5μΙ SMC-Puffer) zugesetzt. Anschließend werden 300μΙ einer 30%igen PEG 4000-Lösung (in SMC-Puffer) zugegeben. Nach vorsichtiger Homogenisierung und lOminütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden der Lösung 1,2 ml SMC-Puffer zugesetzt und nach Homogenisieren der somit erhaltenen Lösung die Protoplasten durch Zentrifugation (4 Minuten bei 3000 rpm) gewonnen. Zur Ausprägung der MLS-Resistenz werden die Zellen in 1 ml SGM 17-Medium resuspendiert und 2 Stunden bei 37°C inkubiert; die Protoplasten werden zur Regeneration auf SGM 17-Agarplatten, die mit 1 цд/ті Erythromycin (Em) versetzt sind, ausgespatelt

Die Transformanten sind nach 2- bis 5tägiger Inkubation bei 37°C identifizierbar.

1.2.2. Charakterisierung der transformierten H46A-Zellen

Die S. equisimilis-H46A(pSM752)-Transformanten werden durch ihren Phänotyp (Wachstum bis 20μς/ηιΙ Em) vom plasmidfreien Ausgangsstamm (sensitiv gegen <1 μο/ιηΙ Em) unterschieden.

Durch eine Miniprep-Plasmidanalyse, die nach der Methode von Anderson & McKay (1983) durchgeführt wurde, und durch die anschließende Spaltung des Plasmides mit den Restriktasen Pstl, EcoRI sowie Hindill wird hierbei die Identität des eingeschleusten Plasmides pSM752 gezeigt.

Die H46A(pSM752)-Transformanten zeichnen sich durch eine im Vergleich zum Ausgangsstamm erhöhte Skc-Expression aus (s.a.Abb.3).

1.3. Gewinnung und Charakterisierung der Integrationsmutante 1.3.1. Gewinnung der Integrationsmutante S. equisimilis H46SM

Jeweils 10ml einer Kultur des rekombinanten Stammes S. equisimilis H46A(pSM752) werden gemäß Schritt 2 des Gesamtverfahrens über 20 Generationen in BHI-Medium, dem standardgemäß 5цд/тІ Em zugesetzt sind, bei 37°C inkubiert. Zur Anreicherung von Klonen, in denen während dieser Kultivierungsphase das voranstehend beschriebene homologe Rekombinationsereignis zwischen Plasmid pSM752 und H46A-Chromosom stattgefunden hat, wird jede 10ml-Standkultur anschließend über 15 Generationen (während etwa 12 Stunden) in BHI-Medium bei gleichfalls 37°C ohne Selektionsdruck, d.h. gänzlich ohne Em-Zugabe zum Medium, erneut kultiviert; anschließend wird die so behandelte Kultur auf BHI-Agarplatten mit 5μg/ml Em ausplattiert und zur Koloniebildung über Nacht bei 37°C inkubiert. Im Ergebnis dieser Kultivierungsfolge ist das Plasmid pSM752 aus wenigstens 90% der mitinkubierten ursprünglichen H46A(pSM752)-Zellen segregiert (und bei diesen Zellen somit die Env/MLS-Resistenz verloren gegangen), d.h. diese Teilpopulationen vermochten bei o.g. Kultivierungsfolge nicht zu überleben.

In den im Ergebnis dieser Kultivierungsfolge auf den BHI-Platten erhaltenen Kolonien finden sich Populationen der Integrationsmutante S. equisimilis H46SM (Majorkomponente) gegebenenfalls neben Restpopulationen des transformierten Einsatzstammes S. equisimilis H46A(pSM752) (Minorkomponente). Hierbei kann Material des verfahrensgemäß gewonnenen neuen Stammes in einem anschließenden Screening-Schritt (neben einer Miniprep-Analyse zum Beleg auf Abwesenheit von Plasmid-DNS) eindeutig daran von Stammaterial der Minorkomponente unterschieden werden, daß S. equisimilis H46SM-Zellen nach zwischenzeitlicher Kultivierung ohne Selektionsdruck (über erneut bis zu etwa 15 Generationen) die MLS-Resistenz stabil behalten haben.

1.3.2. Zusätzliche Charakterisierung der integrationsmutante S. equisimilis H46SM Zur zusätzlichen Bestätigung des Faktes, daß im Ergebnis von Schritt 2 des Gesamtverfahrens die DNS des ursprünglichen Plasmids pSM752 komplett in das Chromosom des S. equisimilis-Wirtsstammes integriert worden ist, wird in an sich bekannter Weise eine Southernblot-Analyse durchgeführt. Dazu wird sowohl vom Ausgangsstamm H46 A als auch vom rekombinanten Stamm H46SM nach Standardmethoden chromosomale DNS isoliert, mit den Restriktasen Pstl, EcoRI sowie Hindill gespalten und elektrophoretisch in einem 0,6%igen Agarosegel getrennt. Die Hybridisierung erfolgt mit ³²P-markierter DNS, die die Sequenz für Skc trägt.

Das Autoradiogramm des Gels (Abb. 2) zeigt eindeutig, daß in der Integrationsmutante H46SM zwei vollständige Kopien des Skc-Gens im Chromosom vorliegen. Während die chromosomale DNS vom H46 A-Wildtyp bei EcoRI-Spaltung nur ein Signal und bei Hindlll-Spaltung (aufgrund des geninternen Hind Ill-Ortes) 2 Signale (Hybridisierungszonen) liefert, zeigt die chromosomale DNS der H46SM-Integrationsmutante bei EcoRI-Spaltung 2 und bei Hindlll-Spaltung 4 Signale. Die Pst I-Spaltung von H46SM dient als Nachweis, daß das 2,5 kb große, das Skc-Gen tragende Pstl-Fragment komplett verdoppelt ist.

1.4. Kultivierung des Skc-Bildners S. equisimilis H46A und Isolierung des Genprodukts

Der Stamm S. equisimilis H 46 SM wird auf BHI-Agar-Plalten, die mit 5pg/ml Em versetzt sind, gehalten. Zur Skc-Bildung wird der Stamm submers in einem 80-Liter-Rührreaktor ohne Belüftung fermentiert. Die Kulturlösung besteht aus Hefe-Autolysat-Nährmedium, welches pro Liter 32g Hefeextrakt, 80g Glucose und 5,6g Kaseinpepton enthält.

Einer 250-ml-Vorkultur werden 5 Mg/ml Em zugesetzt. Diese Vorkultur wird 20 Stunden bei 37 "C inkubiert. Mit dieser Vorkultur werden 50 Liter Hauptkultur beimpft. Kultiviert wird unter Rühren bei 30⁰C ohne Antibiotikazusatz. Der pH-Wert von 7,2 und der Glucosespiegel von 1 % werden automatisch durch Zupumpen von 2%iger NaOH-Lösung bzw. 50%iger Glucoselösung reguliert.

Die nach 24 Stunden erhaltene Skc-haltige Kulturlösung wird in Anlehnung an die Methode aus den Patentschriften DD 121522 und DD 126342 aufgearbeitet. Im einzelnen wird wie folgt verfahren: Die Streptokokkenkultur (50 Liter) wird zur Abtötung der Population mit 250 ml 30%igem H₂O₂ versetzt und 1 Stunde gerührt. Anschließend werden die Zellen abgetrennt und die Skc aus dem Kulturfiltrat durch Einrühren von 1kg Kieselgel Bl (Partikelgröße 0,1 mm bis 0,4 mm) adsorbiert. Von intensiv mit Wasser gewaschenem Kieselgel wird die Skc mit 5 Liter einer Lösung aus 1 % NaCO₃ und 10% Ethanol efuiert. Aus dem Eluat wird die Skc durch Zugabe von 500g NaCI und pH-Absenkung auf 4,0 gefällt.

Der abgetrennte Niederschlag wird in 300 ml H₂O bei pH 8,0 gelöst. Die Lösung wird 3mal mit 4 g frisch gefälltem CaHPO^-GeI bei pH 7,0 gerührt. Die Skc wird anschließend mit Ammoniumsulfat zwischen 25% und 45% Sättigung gefällt. Der abgetrennte und in H₂Ogelöste Ammonsulfat-Niederschlag wirdanSephacryl-S200(50cm χ 5cm Säule,0,5M NaCI; 0,01 M Phosphatpuffer; pH 8,0) fraktioniert und die Skc-haltigen Fraktionen werden vereinigt.

1.5. Quantitative und qualitative Produkt-Charakterisierung

Zur Quantifizierung des Skc-Bildungsniveaus wird der Stamm S. equisimilis H46SM in 50-ml-Standkulturen (BHI-Mediummit 5ug/ml Em) bei 37⁰C kultiviert. Als Vergleich dienen die Stämme H46A und H46A(pSM 752), die unter analogen Bedingungen kultiviert werden.

Zu verschiedenen Zeiten der Kultivierung werden das Wachstum (über die Bestimmung der OD₆Oo) und die Skc-Konzentration im zellfreien Kulturüberstand (Bestimmung über einen Lochplattentest) gegen ZIMET-Standard-Skc (spez. Aktivität 50000U/mg) ermittelt (Abbildung 3).

Als Folge der Duplizierung der Gendosis ist das Niveau der Skc-Expression bei H 46 SM gegenüber dem Ausgangsstamm H46A pro Biomasseeinheit gleichfalls angenähert verdoppelt. Als Vergleich ist in Abb.3 der instabile Stamm H46 AIpSM 752) dargestellt, bei dem das Gen skczusätzlich extrachromosomal mit 5 bis 10 Kopien vorliegt. Dieser Stamm weist gegenüber dem Wildtyp ein mehr als verdoppeltes Skc-Bildungsniveau auf.

Zur qualitativen Charakterisierung der von H46SM gebildeten Skc werden die Kulturüberstände von Kulturen der stationären Phase der Stämme H46A, H46A(pSM752) udn H46SM in einem SDS-Polyacrylamidgel unter Standardbedingungen elektrophoretisch getrennt.

Anschließend wird die Skc im Polyacrylamidgel reaktiviert. Dazu wird das Gel 2mal eine Stunde in einer 2,5%igen Triton X-100-Lösung und 3mal 8 Minuten in H₂O unter mäßiger Bewegung gewaschen. Nach dieser Reaktivierung wird das Gel mit humanplasminogenhaitigem Milchagar überschichtet. Nach 2- bis 4stündiger Inkubation bei 37⁰C ist die Authentizität der Skc hinsichtlich ihres Molekulargewichtes anhand der Lysozonen im Milchagar identifizierbar (vgl. Abbildung 4).

Außerdem wird gezeigt, daß vom rekombinanten Stamm S. equisimilis H46SM das gleiche Verhältnis von 47 zu 44 kDa-Skc gebildet wird wie vom Stamm H 46 A. Aus diesem Stamm kann nach Prozeßdurchführung gemäß Patentschrift DD 126342 die authentische 47 kDa-Skc isoliert werden.

Beispiel 2

Gewinnung von authentischer Serotyp C-Streptokinase unter Einsatz von Stamm Streptococcus equisimilisH46SMS 2.1. Auswahl und Bereitstellung von Rezipientenstamm und Plasmidvektor

Als-Rezipienten-Stamm wird wie in Beispiel 1 der Serotyp C-Skc-bildende Stamm S. equisimilis H46A ausgewählt.

Zur Transformation wird das Streptokokken-PlagmidpSMS69 eingesetzt (Abb. 5). Dieses Plasmid mit einer Resistenzdeterminante gegen MLS-Antibiotika trägt ein 2706bp großes Haelll-Pstl-DNS-Fragment von Donorstamm S.

equisimilis H46A, auf welchem das Skc-Gen mit seinen nativen Expressions- und Sekretionssignalen lokalisiert ist. Für die Transformation gemäß Schritt 1 des Gesamtverfahrens wird Plasmid pSMS69 aus dem rekombinanten Laborstamm Streptococcus sanguis Challis 6 (pSMS69) nach Standardmethoden isoliert, mit Ethanol gefällt und in SMC-Puffer (vgl. Pkt. 1.1.

von Beispiel 1) resuspendiert. Eine biologisch reine Probe des Stammes S. sanguis Challis 6(pSMS69) ist in der o.g.

Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen unter dem Registrierzeichen IMET 11408 deponiert worden.

2.2. Transformation und Charakterisierung derTransformanten

Es wird vorgegangen wie in den Abschnitten 1.2.1. und 1.2.2. von Beispiel 1, d.h. es wird wiederum eine Polyethylenglycolvermittelte Protoplastentransformation der S. equisimilis H46 A-Rezipientenzellen vorgenommen, mit dem Unterschied, daß zur Transformation das Plasmid pSMS69 eingesetzt wird. Im Ergebnis dieser Prozedur entsteht der Stamm S. equisimilis H46A(pSMS69).

2.3. Gewinnung und Charakterisierung der Integrationsmutante

Es wird vorgegangen wie in den Abschnitten 1.3.1. und 1.3.2. von Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß der Stamm H46 A (pSMS69) eingesetzt wird und im Ergebnis der Prozedur der Stamm S. equisimilis H46SMS entsteht. In diesem Stamm ist die DNS des Plasmids pSMS69 komplett in das Chromosom des Wirtes integriert, was wiederum zur Skc (H46A)-Gen-Duplizierung führt.

2.4. Kultivierung des Skc-Bildners S. equisimilis H46SMS und Isolierung des Genproduktes

Es wird vorgegangen wie im Abschnitt 1.4. von Beispiel 1 mit der Maßgabe, daß zur Kultivierung der neue Stamm S. equisimilis H46SMS eingesetzt wird.

2.5. Quantitative und qualitative Produkt-Charakterisierung

Es wird vorgegangen wie in Abschnitt 1.5. von Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß der Stamm H46SMS und der Vergleichsstamm H46A (pSMS69) charakterisiert werden. Dabei konnten folgende Befunde gesichert werden:

a) Das Niveau der Skc-Expression pro Biomasseeinheit ist bei Stamm H46SMS gegenüber dem Ausgangsstamm wiederum angenähert verdoppelt.

b) Der im Beispiel 2 erhaltene rekombinante Stamm H46 SMS bildet authentische 47 kDa-Skc in gleicher Proportion zur44kDa-Skc wie der native Produzent H 46 A.

Abbildungslegenden

Abbildung 1:

Mechanismus der Integration von pSM752 in das Chromosom von S. equisimilis H46A. Durch ein „crossing over"-Ereignis in der Homologie-Region von Plasmid und Chromosom (verstärkte Abschnitte) integriert das Plasmid komplett in das Chromosom von H46A. Die beiden skc-Gene sind identisch orientiert (Pfeile). (Em^r: MLS-Resistenzdeterminante).

Abbildung 2:

Agarose-Gelelektrophorese (A) und Autoradiogramm der Hybridisierung (B) von ³²P-markierter Skc-DNS gegen chromosomale DNS von H 46 A, H 46 SM und Plasmid-DNS von pMM 191, die jeweils mit EcoRI (E), Pst I (P) und Hind III (H) verdaut wurde. Als Sonde diente das Plasmid pMM 191 (Müller et al., J. Bart. 171 [1989)4,2202-2208).

Abbildung 3:

Wachstum (offene Symbole) und extrazelluläre Skc-Aktivität (ausgefüllte Symbole) der S. equisimilis-Stämme H46A (Kreise), H46A (pSM752) (Dreiecke) und H46SMS (Quadrate). Die Kultivierung erfolgte in 50ml-Standkulturen in BHI-Medium.

Abbildung 4:

SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese und Zymographie von Kulturüberständen der S. equisimilis-Stämme H46A (Bahn 1), H46A (pSM752) (Bahn 2) und H46SM (Bahn 3).

Abbildung 5:

Konstruktionsschema für das Plasmid pSMS 69. Physische und funktionell Karte für die Plasmide pMM 191, pSM 6, pSM 691 und pSMS69. (o-: Restriktionsort für HaeIII; Em^r: MLS-Resistenzdeterminante).

Claims (24)

1. Verfahren zur Herstellung von authentischer Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: Skc) auf gentechnisch-mikrobiellem Wege einschließlich Isolierung des genannten Proteins aus der Kulturflüssigkeit, gekennzeichnet dadurch, daß man

- eine Zellpopulation jeweils eines Stammes der Art Streptococcus equisimilis mit einem rekombinanten, in grampositiven Bakterien replizierbaren Plasmidvektor, welcher neben der kodierenden DNS für wenigstens einen in S. equisimilis ausprägbaren Phänotypmarker die kodierende Sequenz für authentische Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: Skc-Gen) unter der Kontrolle von Expressions- und Sekretionssignalen trägt, transformiert (Schritt 1),

- hierbei erhaltene transformierte S. equisimilis-Zellen über 8 bis 20 Generationen ohne Selektionsdruck bezüglich desauf obigem Skc-rekombinanten Expressionsplasmid kodierten Phänotypmarkers vermehrt und anschließend die Population und die Merkmale Plasmidfreiheit sowie Erhalt des besagten Phänotypmarkers kontrolliert (Schritt 21) und

- jeden gewonnenen S.equisimilis-Stamm obiger Kennzeichnung in einem flüssigen Nährmedium submers fermentiert (Schritt 3).

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S. equisimilis-Stammes aus der Kollektion

(H46A,C9/50,SSICTyp20)

mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für wenigstens einen in obigen S.equisimilis-Stämmen ausprägbaren Phänotypmarker vom Typ einer Antibiotika-Resistenzdeterminante die kodierende Sequenz für das authentische skc-Gen unter der Kontrolle von Expressions- und Sekretionssignalen trägt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S. equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für wenigstens eine in

S. equisimilis ausprägbare Antibiotika -Resistenzdeterminante aus der Gruppe

- Makrolid-Lincosamid-Streptogramin B-Restistenzdeterminante (MLS^r),

- Chloramphenicol-Resistenzdeterminante (Cm^r)/

- Kanamycin-Resistenzdeterminante (Km^r) bzw.

- Streptomycin-Restistenzdeterminante (Sm^r)

die kodierende Sequenz für das skc-Gen aus dem Donorstamm S. equisimilis H46 A (Kurzwort: Skc [H46A]-Gen) unter der Kontrolle von Expressions- und Sekretionssignalen trägt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S. equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für eine in S. equisimilis ausprägbare Antibiotika-Resistenzdeterminante aus der Gruppe (MLS^r,Cm^r,Km^r,Sm^r)

die kodierende Sequenz für das Skc (H 46 A)-Gen unter der Kontrolle einer nativen Expressionsund Sekretionssignale trägt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S. equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für eine in S. equisimilis ausprägbare Antibiotika-Resistenzdeterminante aus der Gruppe (MLS^r,Cm^r,Km^r,Sm^r)

die kodierende Sequenz für das Skc (H 46 A)-Gen einschließlich seiner nativen Expressions- und Sekretionssignale auf einem 2568 bp-Pstl-Pstl-Fragment trägt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S. equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden Sequenz für eine MLS^r-Determinante das 2568bp-Pstl-Pstl-Fragment obiger Kennzeichnung trägt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S. equisimilis- Stammes aus besagter Kollektion mit dem Skc (H46A)-rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor pSM752 (Molekülgröße 13,3kb; MLS^r) transformiert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation des Stammes S.equisimilis mit einem Vektor pSM752 transformiert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S.equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für eine in S. equisimilis ausprägbare Antibiotika-Resistenzdeterminante aus der Gruppe (MLS^r,Cm^r,Km^r,Sm^r)

die kodierende Sequenz für das Skc (H 46A)-Gen einschließlich seiner nativen Expressions- und Sekretionssignale auf einem 2076bp-Haelll-Pstl-Fragment trägt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S.equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit einem rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor transformiert, welcher neben der kodierenden DNS für eine MLS -Determinante des 2076bp-Haelll-Pstl-Fragment obiger Kennzeichnung trägt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation eines S.equisimilis-Stammes aus besagter Kollektion mit dem Skc (H46A)-rekombinanten Streptococcus-Plasmidvektor pSMS69 (Molekülgröße 7,8 kb, MLS^r) transformiert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zellpopulation des Stammes S.equisimilis H46A mit dem Vektor pSMS69 transformiert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß man die zur Transformation bereitgestellte Plasmidvektor-DNS durch Elektroporation in die jeweils gewählten S.equisimilis-Zellen einschleust.

14. Verfahren gemäß Anspruch 8,12und 13, gekennzeichnet dadurch, daß man die DNS des Vektors pSM752 bzw. des Vektors pSMS69 durch Elektroporation in die Zellen des Rezipientenstammes S.equisimilis H 46 A einschleust.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß man die Plasmidvektor-DNS durch Polyethylenglycol-vermittelte Protoplastentransformation in die jeweils gewählten

S. equisimilis-Rezipientenzellen einschleust.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß man durch Zentrifugation und Waschung vorbehandelte S.equisimilis-Zellen in einer Protoplastierungslösung, der 4mg/ml bis 20 mg/ml Lysozym zugesetzt sind, inkubiert.

17. Verfahren gemäß Anspruch 8,12 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß man in obiger Weise vorbehandelte S.equisimilis-Zellen in SGM 17-Medien, dem 8mg/ml Lysozym zugesetzt sind, während 4 Stunden bei 37°C inkubiert.

18. Verfahren gemäß-Anspruch 1 bis 7,9 bis 11 sowie 13,15 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 2 jeweils erhaltene transformierte S. equisimilis-Zellen über 8 bis 20 Generationen ohne Selektionsdruck bezüglich derauf dem Skc-rekombinanten Expressionsplasmid kodierten Antibiotika-Resistenzdeterminante vermehrt und anschließend die Population auf die Merkmale Plasmidfreiheit sowie Erhaltung der besagten Resistenzdeterminante kontrolliert.

19. Verfahren gemäß Anspruch 8,12,14,17 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß man die transformierten Stämme S. equisimilis H46A (pSM752) bzw. S. equisimilis H46A (pSMS69) über 10 bis 15 Generationen ohne Selektionsdruck durch MLS-Antibiotikum-Zugabe vermehrt und anschließend die Stämme S. equisimilis H 46SM bzw. S. equisimilis H 46SMS auf die Merkmalskombination Plasmidfreiheit bei gleichzeitiger Erhaltung der MLS-Resistenz kontrolliert.

20. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 3 jeden gewonnenen S. equisimilis-Stamm obiger Kennzeichnung in einem mit flüssigem Nährmedium gefüllten Schüttelgefäß bzw. Rührreaktor fermentiert.

21. Verfahren gemäß Anspruch 19 und 20, gekennzeichnet dadurch, daß man den Stamm

S.equisimilis H46SM bzw. den Stamm S. equisimilis H46SMS submers in einem mit flüssigem Nährmedium gefüllten Schüttelgefäß bzw. Rührreaktor fermentiert.

22. Verfahren gemäß Anspruch 20 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß man die Fermentation in einem Hefeautolysat-Nährmedium mit einem Mono- bzw. Disaccharid als nachdosierter Kohlenstoff-Quelle bei Temperaturen von 30⁰C bis 40⁰C und pH-Werten im Bereich von pH 5,5 bis pH 8,5 für die Dauer von 8 Stunden bis 24 Stunden durchführt.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, daß man die Fermentation in einem Hefeautolysat-Nährmedium mit Glucose als nachdosierter Kohlenstoff-Quelle bei 37°C und pH 7,2 für die Dauer von 12 Stunden bis 14 Stunden durchführt.

24. Verfahren gemäß Anspruch 22, gekennzeichnet dadurch, daß man die Fermentation in einem
Hefeautolysat-Nährmedium mit Glucose als nachdosierter Kohlenstoff-Quelle bei 30⁰C und pH 7,2 für die Dauer von 14 Stunden bis 18 Stunden durchführt.

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von authentischer Serotyp C-Streptokinase (Kurzwort: Skc) auf mikrobiellem Wege.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Industrie.

Skc ist ein in der Humanmedizin eingeführtesTherapeutikum. Dieses Protein katalysiert die Konversion des enzymatisch aktiven Plasmins, welches durch begrenzte Proteolyse das Fibrinnetzwerk von Blutgerinnseln solubilisiert. Auf dieser fibrinolytischen Reaktion basiert der Einsatz von Skc in der klinischen Medizin als bedeutsames Therapeutikum zur Behandlung

thromboembolischer Gefäßverschlüsse (venöse und arterielle Thrombosen, Thrombophlebitiden, Lungenembolien,

Gehirnembolien etc.).