DE60021188T2 - Modifizierter humaner granulozyten-kolonie stimulierenderfaktor sowie verfahren zur herstellung desselben - Google Patents

Modifizierter humaner granulozyten-kolonie stimulierenderfaktor sowie verfahren zur herstellung desselben Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen modifizierten menschliche Granulozyten-Kolonien stimulierenden Faktor (hG-CSF), einen E-coli-Expressionsvektor, welcher eine DNA aufweist, die den modifizierten hG-CSF entschlüsselt, einen mit dem Vektor transformierten E. coli und ein Verfahren zur Herstellung des modifizierten hG-CSF unter Verwendung des E. coli.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Begriff Kolonien stimulierender Faktor (CSF) beinhaltet Granulozyten/Phagozyten-Kolonien stimulierende Faktoren (GM-CSF), Phagozyten-Kolonien stimulierende Faktoren (M-CSF) und Granulozyten-Kolonien stimulierende Faktoren (G-CSF), welche von T-Zellen, Phagozyten, Fibroplasten und endothelischen Zellen produziert werden. GM-CSF stimuliert Stammzellen von Granulozyten oder Phagozyten, um die Differenzierung derselben und die Wucherung von Granulozyt- oder Phagozyt-Kolonien hervorzurufen. M-CSF und G-CSF bewirken hauptsächlich die Bildung der Kolonien sowohl von Phagozyten als auch von Granulozyten. Am lebenden Objekt bewirkt G-CSF die Differenzierung von Knochenmarksleukozyten und verbessert die Funktion von reifen Granulozyten und dementsprechend ist seine klinische Wichtigkeit bei der Behandlung von Leukämie sehr anerkannt.
  • Humanes G-CSF (hG-CSF) ist ein Protein, welches aus 174 oder 177 Aminosäuren besteht, wobei die Variante mit 174 Aminosäuren eine höhere Aktivität bezüglich der Verbesserung von Neutrophilen aufweist (Morishita, K. et al., J. Biol. Chem., 262, 15208–15213(1987)). Die Aminosäuresequenz von aus 174 Aminosäuren bestehendem hG-CSF ist in 1 dargestellt und es gab viele Studien für die Serienproduktion von hG-CSF durch Manipulierung eines das hG-CSF verschlüsselnden Gens.
  • Zum Beispiel hat Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd. (Japan) die Aminosäuresequenz von hG-CSF und ein dasselbe verschlüsselndes Gen beschrieben (Koreanische Patentveröffentlichungen Nr. 91-5624 und 92-2312) und von einem Verfahren zum Herstellen von Proteinen berichtet, welches eine hG-CSF-Aktivität mittels eines Gen-Rekombinat-Prozesses (Koreanische Patente Nr. 47178, 53723 und 57582) aufweist. Bei diesem Herstellungsverfahren wird glykosylierstes hG-CSF in einer Zelle eines Säugetiers durch Verwenden einer genomischen DNA oder cDNA hergestellt, welche ein hG-CSF verschlüsselndes Polynucleotid aufweist. Das glykosylierte hG-CSF weist eine O-glykosidische Zuckerkette auf, es ist jedoch bekannt, dass diese Zuckerkette für die Aktivität des hG-CSF nicht notwendig ist (Lawrence, M. et al., Science, 232, 61(1986)). Des weiteren ist es auch gut bekannt, dass die Herstellung von glykosyliertem hG-CSF, welches Zellen eines Säugetiers verwendet, teure Materialien und Ausrüstung erfordert und aus diesem Grund ist ein solcher Prozess nicht ökonomisch machbar.
  • Mittlerweile gab es Versuche, nicht glykosyliertes hG-CSF durch Verwenden eines Mikroorganismus, z.B. E. coli, herzustellen. In diesen Studien werden hG-CSFs mit 175 oder 178 Aminosäuren, welche eine an dem N-Terminus derselben angebrachte Methioningruppe aufweisen, aufgrund des bei dem Mikroorganismus verwendeten ATG-Startkodons erhalten. Die zusätzliche Methioningruppe erzeugt jedoch unerwünschte Immunreaktionen im menschlichen Körper, wenn demselben das rekombinante hG-CSF verabreicht wird (Europäische Patentveröffentlichung Nr. 256,843). Des weiteren werden die meisten der Methionin enthaltenden hG-CSFs, welche in E. coli produziert werden, in den Zellen als nicht lösliche Einschlusskörper abgelagert und sie müssen durch einen Neufaltungsprozess mit einem erheblichen Ertragsverlust in eine aktive Form konvertiert werden. In diesem Zusammenhang nehmen vier der fünf Cys-Gruppen, welche im Wildtyp-hG-CSF vorhanden sind, an der Bildung von Disulfidverbindungen teil, während die verbleibende zu der Ansammlung des hG-CSF-Produkts während des Neufaltungsprozesses beiträgt, um den Ertrag zu verringern.
  • In jüngster Zeit wurden, um die mit der Herstellung eines Fremdproteins innerhalb einer Mikrobenzelle ver bundenen Probleme zu lösen, verschiedene Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren zu entwickeln, welches auf einer effizienten Ausscheidung eines Zielproteins über die Membran der Mikrobenzelle in die Domäne außerhalb der Zelle basiert.
  • Zum Beispiel wird bei einem Verfahren, welches ein Signalpeptid verwendet, ein gewünschtes Protein in der Form eines Fusionsproteins ausgedrückt, wobei ein Signalpeptid zu dem N-Terminus des Proteins hinzugefügt wird. Wenn das Fusionsprotein durch die Zellmembran gelangt, wird das Signalpeptid von einem Enzym entfernt und das gewünschte Protein wird in einer reifen Form ausgeschieden. Das Herstellungsverfahren zur Ausscheidung ist darin vorteilhaft, dass die produzierte Aminosäuresequenz üblicherweise identisch zu dem Wildtyp ist. Der Ertrag eines Herstellungsverfahrens zur Ausscheidung ist aufgrund von unbefriedigenden Wirksamkeiten sowohl bezüglich des Membrantransports als auch des nachfolgenden Reinigungsprozesses jedoch häufig sehr gering. Dies steht in Übereinstimmung mit der gut bekannten Tatsache, dass der Ertrag eines in einem Ausscheidungsmodus in Prokaryoten hergestellten Säugetierproteins sehr gering ist: Bis jetzt wurde von keinem Mikrobenverfahren zur effizienten Expression und Ausscheidung von löslichem hG-CSF berichtet, welches keine zusätzlichen Methioningruppen an ihrem N-Terminus aufweisen.
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben vor kurzem von der Verwendung eines neuen Ausscheidungssignal-Peptids be richtet, welches durch Modifizieren des Signalpeptids von E. coli wärmebeständigem Enterotoxin II (Koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2000–19788) bei der Herstellung von hG-CSF hergestellt wird. Insbesondere wurde ein Expressionsvektor, welcher ein an dem 3'-Ende des modifizierten Signalpeptids von E. coli wärmebeständigem Enterotoxin II angebrachtes hG-CSF-Gen aufweist, berichtet, und biologisch aktives, reifes hG-CSF wurde durch Verwendung von mit dem Expressionsvektor umgewandeltem E. coli ausgedrückt. Jedoch sammelte sich das meiste des ausgedrückten hG-CSF in dem Zytoplasma und nicht in dem Periplasma an.
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben danach gestrebt, ein effizientes Ausscheideverfahren für die Herstellung von hG-CSF in einem Mikroorganismus zu entwickeln und haben herausgefunden, dass ein modifiziertes hG-CSF, welches durch Ersetzen von wenigstens einer Aminosäuregruppe, insbesondere der 17. Zysteingruppe, von Wildtyp-hG-CSF mit einer andere Aminosäure hergestellt wird, die biologische Aktivität des Wildtyps bewahrt, und dass das modifizierte hG-CSF, welches an dem N-Terminus desselben keine Methioningruppe aufweist, mittels eines Organismus auf effiziente Weise ausgedrückt und ausgeschieden werden kann, wenn ein geeignetes Ausscheidungssignalpeptid verwendet wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen modifizierten, menschliche Granulozyten stimulierenden Faktor (hG-CSF) zu schaffen, welcher unter Verwendung eines Mikroorganismus auf effiziente Weise hergestellt werden kann.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen E. coli-Expressionsvektor zu schaffen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein mit diesem Vektor transformiertes E. coli zu schaffen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines hG-CGF zu schaffen, bei welchem unter Verwendung des E. coli an dem Amino-Terminus eine Methioningruppe nicht gebunden ist.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein modifizierter hG-CSF geschaffen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der 1., 2., 3. und 17. Aminosäuren des Wildtyp-hG-CSF durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die oben genannten anderen Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung deutlich, welche in Verbindung mit den nachfolgenden, beigefügten Zeichnungen angegeben wird, welche jeweils zeigen:
  • 1: die Nukleotid- und Aminosäureseauenzen von menschlichem Granulozyt stimulierenden Faktor des Wildtyps, der aus 174 Aminosäuregruppen zusammengesetzt ist (SEQ ID NR: 1 und 2);
  • 2: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT-CSF;
  • 3: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT14S1SG;
  • 4: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT19SS1SG;
  • 5: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT140SSG-4T22Q;
  • 6: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT14SS1S17SEG;
  • 7: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pTO1SG;
  • 8: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pBADG;
  • 9: das Verfahren zur Konstruktion des Vektors pBAD2M3VG;
  • 10a und 10b: die Ergebnisse von Western-Blot-Analysen, welche die Expression von hG-CSF und modifizierten hG-CSFs von rekombinierten Zelllinien und das Molekulargewicht der ausgedrückten Proteine verifizieren; und
  • 11: die zellularen Aktivitäten von hG-CSF und modifiziertem hG-CSF hergestellt aus rekombinierten Zelllinien.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die modifizierten hG-CSFs der vorliegenden Erfindung werden durch Ersetzen von einer oder mehreren der Aminosäuren des Wildtyp-hG-CSF (SEQ ID NR: 2), vorzugsweise der 1., 2. und 17. Aminosäure davon, durch andere Aminosäuren gewonnen. Noch bevorzugter sind diejenigen, welche durch Ersetzen der 17. Aminosäure von hG-CSF mit einer Aminosäure erhalten werden, welche bei neutralem pH-Wert nicht gesättigt ist. Spezielle Beispiele der bevorzugten modifizierten hG-CSFs weisen die Aminosäuresequenz des Wildtyp-hG-CSF auf, mit der Ausnahme, dass:
    • (a) die 1. Aminosäure Ser ist;
    • (b) die erste Aminosäure Ser ist und die 17. Aminosäure X ist;
    • (c) die zweite Aminosäure Met ist und die dritte Aminosäure Val ist;
    • (d) die zweite Aminosäure Met ist, die dritte Aminosäure Val ist und die siebzehnte Aminosäure X ist; oder
    • (f) die siebzehnte Aminosäure X ist,
    wobei X eine Aminosäure ist, welche bei einem neutralen pH-Wert nicht gesättigt ist, vorzugsweise Ser, Thr, Ala oder Gly, noch bevorzugter Ser.
  • Vier der fünf Cys-Gruppen von hG-CSF nehmen bei der Bildung von Disulfidbindungen teil, während die 17. Cys-Gruppe ungebunden in ihrem natürlichen Zustand verbleibt. Wenn jedoch eine große Menge an hG-CSF in Rekombinationszellen ausgedrückt wird, wird die 17. Cys-Gruppe in eine intermolekulare Disulfidbindungsbildung involviert, was zu der Ansammlung von agglomerierten hG-CSFs in dem Zytoplasma führt. Das erfindungsgemäße modifizierte hG-CSF, welches eine von Cys verschiedene Aminosäure an der 17. Position aufweist, ist jedoch frei von einem solchen Problem und kann in effektiver Weise mittels eines Ausscheidungsverfahrens unter Verwendung eines in geeigneter Weise umgewandelten Mikroorganismus hergestellt werden.
  • Das modifizierte hG-CSF der vorliegenden Erfindung kann mittels eines Gens verschlüsselt werden, welches eine Nukleotidsequenz aufweist, die von der modifizierten hG-CSF-Aminosäuresequenz gemäß dem genetischen Code abgeleitet wird. Es ist bekannt, dass einige unterschiedliche Kodons, welche eine spezielle Aminosäure verschlüsseln, aufgrund der Kodondegeneration existieren und aus diesem Grund schließt die vorliegende Erfindung in ihrem Schutzbereich alle Nukleotidsequenzen ein, welche von der modifizierten hG-CSF-Aminosäuresequenz abgeleitet sind. Vorzugsweise beinhaltet die modifizierte hG-CSF-Gensequenz einen oder mehrere bevorzugte Kodons von E. Coli.
  • Das auf diese Weise erzeugte Gen kann in einem konventionellen Vektor eingesetzt werden, um einen Expressionsvektor zu erlangen, welcher wiederum in einen geeigneten Wirt eingeführt werden kann, z.B. einen E. coli. Der Expressionsvektor kann des weiteren ein Signalpeptid beinhalten. Repräsentative Signalpeptide beinhalten ein wärmebeständiges E. coli-Enterotoxin II-Signalpeptid (SEQ ID NR: 53), ein modifiziertes wärmebeständiges E. coli-Enterotoxin II-Signalpeptid (SEQ ID NR: 54), ein Beta-Laktamase-Signalpeptid (SEQ ID NR: 24), ein Gen-III-Signalpeptid (SEQ ID NR: 42) oder ein modifiziertes Peptid davon, diese beschränken jedoch nicht die Signalpeptide, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Der bei der Erzeugung bzw. Herstellung des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung verwendete Aktivator kann jeder von denjenigen sein, welche ein heterologes Protein in einem Mikroorganismus als Wirt ausdrücken können. Insbesondere lac, Tac und Arabinose-Aktivator ist zu bevorzugen, wenn das heterologe Protein aus E. coli ausgedrückt wird.
  • Ein beispielhafter Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung schließt pT14SS1SG, pT14SS1S17SEG, pTO1SG, pT01S17SG, pTO17SG, pTO17TG, pTO17AG, pTO17GG, pBAD2M3VG, pBAD17SG und pBAD2M3V17SG ein.
  • Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können in den Mikroorganismus, z.B. E. coli BL21 (DE3)(Novagen), E. coli XL-1 blue (Novagen), gemäß einer konventionellen Umwandlungsmethode (Sambrook et al., the supra) eingeführt werden, um Umwandlungsprodukte E. coli BL21 (DE3)/pT14SS1SG (HM10310), E. coli B121(DE3)/pT14SS1S175EG (HM 10311), E. coli BL21(DE3)/pTO1SG (HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTO1S17SG (HM 10410), E. coli BL21(DE3)/pTO17SG (HM 10411), E. coli BL21(DE3)/pTO17TG (HM 10413), E. coli BL21(DE3)/pTO17AG (HM 10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG (HM 10415), E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3VG (HM 10510), E. coli BL21(DE3)/pBAD17SG (HM 10511) und E. coli BL21 (DE3)/BAD2M3V17SG (HM 10512) zu erhalten. Unter den umgewandelten Mikroorganismen sind die Umwandlungsprodukte E. coli BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG (HM 10311), E. coli BL21(DE3)/pTO1S17SG (HM 10410), E. coli BL21(DE3)/pTO17SG (HM 10411) und E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3VG (HM 10510) bevorzugt, welche an dem Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (Adresse: Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120–749, Republik Korea) am 24. März 1999 unter den jeweiligen Zugangsnummern KCCM-10154, KCCM-10151, KCCM-10152 und KCCM-10153 gemäß den Vorgaben des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt wurden.
  • Das modifizierte hG-CSF-Protein der vorliegenden Erfindung kann durch Züchten der umgewandelten Mikroorganismen hergestellt werden, um das Gen auszudrücken, welches das modifizierte hG-CSF-Protein verschlüsselt bzw. codiert, und um das modifizierte hG-CSF-Protein zu Periplasma abzusondern; und durch Wiedergewinnen des modifizierten hG-CSF-Proteins aus dem Periplasma. Der umgewandelte Mikroorganismus kann gemäß einem konventionellen Verfahren (Sambrook et al., the supra) gezüchtet werden. Die Mikroorganismuskultur kann zentrifugiert oder gefiltert werden, um den das modifizierte hG-CSF-Protein absondernden Mikroorganismus zu sammeln. Der umgewandelte Mikroorganismus kann gemäß einem konventionellen Verfahren (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1989)) gespaltet werden, um eine periplasmische Lösung zu erhalten. Zum Beispiel kann der Mikroorganismus in einer hypotonischen Lösung, z.B. destilliertem Wasser, mittels eines osmotischen Schocks gespaltet werden. Eine Wiedergewinnung des modifizierten hG-CSF in der periplasmischen Lösung kann mittels eines konventionellen Verfahrens (Sambrook et al., the supra) durchgeführt werden, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrations-Säulen-Chromatographie oder Immunsäulenchromatographie. Zum Beispiel kann hG-CSF mittels einer aufeinanderfolgenden Durchführung von CM-Sepharosesäulenchromatographie und Phenylsepharosesäulenchromatographie gereinigt werden.
  • Das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte, modifizierte hG-CSF-Protein ist an dem N-Terminus nicht methioniert und weist eine biologische Eigenschaft auf, welche gleich oder höher als diejenige von Wildtyp-hG-CSF ist. Aus diesem Grund kann es so wie es ist in verschiedenen Anwendungen verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung weiter darzustellen, ohne ihren Schutzbereich einzuschränken.
  • Beispiel 1: Präparation bzw. Herstellung eines Gens, welches hG-CSF verschlüsselt
  • Ein cDNA-Gen, welches hG-CSF verschlüsselt, wurde mittels Durchführen von PCR hergestellt, wobei ein hG-CSF-Muster (R&D system, USA) verwendet wurde. Die verwendeten Primer sind diejenigen, die in dem US-Patent Nr. 4,810,643 beschrieben sind.
  • Um ein cDNA-Gen herzustellen, welches reifes hG-CSF verschlüsselt, wurde der Vektor pUC19-G-CSF (Biolabs, USA) PCR unter Verwendung der Primer der SEQ ID NR: 3 und 4 ausgesetzt. Der Primer der SEQ ID NR: 3 wurde dafür bestimmt, eine NdeI-Drosselstelle (5'-CATATG-3') vor dem ersten Aminosäure (Threonin)-Kodon des reifen hG-CSF zu schaffen, und der Primer der SEQ ID NR: 4, um eine BamHI-Drosselstelle (5'-GGATCC-3') nach dem Endkodon davon zu schaffen.
  • Das verstärkte hG-CSF-Gen wurde mit NdeI und BamHI aufgespalten, um ein Gen zu erhalten, welches reifes hG-CSF verschlüsselt. Das hG-CSF-Gen wurde an dem NdeI/BamHI-Abschnitt des Vektors pET14b (Novagen, USA) eingefügt, um den Vektor pT-CSF zu erhalten.
  • 2 zeigt die oben genannte Vorgehensweise zum Konstruieren des Vektors pT-CSF.
  • Beispiel 2: Konstruktion eines Vektors, welcher das Gen beinhaltet, welches E. coli-Enterotoxin II-Signalpetid und ein modifiziertes hG-CSF verschlüsselt
  • (Schritt 1) Klonen des E. coli-Enterotoxin II-Signalpeptidgens
  • Um das E. coli-Enterotoxin II-Signalpeptidgen herzustellen, wurde das Paar komplementärer Oligonukleotide erzeugt, welches SEQ ID NR: 5 und 6 aufweist, und zwar basierend auf der Nukleotidsequenz des E. coli-Enterotoxin II-Signalpeptids, und unter Verwendung von DNA-Synthesizer (Model 380B, Applied Biosystem,USA) synthetisiert.
  • Die oben genannten Oligonukleotide wurden erzeugt, um vor dem Anfangskodon des E. Coli Enterotoxin II eine BspHI-Drosselstelle (Komplementärstelle zu einer NcoI-Drosselstelle) und eine MluI-Drosselstelle mittels eines langsamen Wechsels an dem anderen Ende zu schaffen.
  • Beide Oligonukleotide wurden bei 95°C temperiert, um stumpfendige DNA-Fragmente zu erhalten, welche eine Nukleotid-Sequenz aufweisen, welche E. coli-Enterotoxin II-Signalpetid (STII-Gen) verschlüsselt.
  • Das STII-Gen wurde an der SmaI-Stelle des Vektors pUC19 (Biolabs, USA) eingefügt, um den Vektor pUC19ST zu erhalten.
  • (Schritt 2) Herstellung eines Gens, welches STII/hG-CSF verschlüsselt
  • Um ein Gen herzustellen, welches STII/hG-CSF verschlüsselt, wurde der in dem Herstellungsbeispiel 1 erlangte Vektor pT-CSF unter Verwendung der Primers der SEQ ID NR: 7 und 8 PCR ausgesetzt. Der Primer der SEQ ID NR: 7 wurde dafür bestimmt, das erste Kodon von hG-CSF durch das Ser-Kodon zu ersetzen, und der Primer der SEQ ID NR: 8 um eine BamHI-Drosselstelle (5'-GGATCC-3') nach dem Endkodon davon zu schaffen.
  • Die verstärkten DNA-Fragmente wurden mit MluI und Bam-HI aufgespalten und dann an dem MluI/BamHI-Abschnitt des in Schritt 1 erlangten pUC19ST eingesetzt, um den Vektor pUC19S1SG zu erhalten. Der auf diese Weise erhaltene Vektor pUC19S1SG enthielt ein Gen, welches ein STII/hG-CSF (gewünschtes STII-hG-CSF-Gen) verschlüsselt.
  • Der Vektor pUC19S1SG wurde mit BspHI und. BamHI aufgespalten, um ein DNA-Fragment (522 bp) zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde an dem NcoI/BamHI-Abschnitt des Vektors pET14b (Novagen, USA) eingefügt, um den Vektor pT14S1SG zu erhalten.
  • 3 zeigt die oben genannte Vorgehensweise zum Herstellen des Vektors pT15S1SG.
  • (Schritt 3) Addition von E. coli-Enterotoxin II-Shine-Dalgarno-Sequenz zu STII-hG-CSF-Gen
  • Der in Schritt 2 erhaltene Vektor pT14S1SG wurde unter Verwendung der Primer der SEQ ID NR: 9 und 10 PCR ausgesetzt. Der Primer der SEQ ID NR: 9 wurde hergestellt, um eine E. coli-Enterotoxin II-Shine-Dalgarno-Sequenz (gewünschte STII-SD-Sequenz) und eine XbaI-Drosselstelle zu schaffen, und der Primer der SEQ ID NR: 10, um eine BamHI-Drosselstelle nach dem Endkodon des reifen hG-CSF zu schaffen, um ein DNA-Fragment (STII-SD-STII-hCSF) zu erhalten, welches ein STII-SD- und ein STII-hG-CSF-Gen enthält.
  • Das STIISD-STII-hG-CSF-Fragment wurde mit XbaI und BamHI aufgespalten und dann an dem XbaI/BamHI-Abschnitt des Vektors pET14b (Novagen, USA) eingefügt, um den Vektor pT14SS1SG zu erhalten.
  • 4 zeigt die oben genannte Vorgehensweise zum Erzeugen des Vektors pT14SS1SG.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pT14SS1SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10310 bezeichnet wird.
  • (Schritt 4) Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen enthält, welches STII/hG-CSF-Fusionsprotein verschlüsselt
  • Das erste Kodon des modifizierten hG-CSF-Gens von Plasmid pT14SS1SSG, welches in Schritt 3 erhalten wurde, wurde gemäß einer gerichteten Mutagenese (Papworth, C. et al., Strategies, 9 (1996)) durch Thr ersetzt, was mittels PCR des Plasmids mit einem Sense-Primer (SEQ ID NR: 12) durchgeführt wurde, welcher eine modifizierte Nukleotidsequenz, einen entsprechenden Antisense-Primer (SEQ ID NR: 13) und Pfu (Stragene, USA) aufwies.
  • Das verstärkte DNA-Fragment wurde wiedergewonnen und das Drosselenzym DpnI wurde hinzugegeben, um nicht umgesetzte Plasmide zu entfernen.
  • E. coli-XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Grundsequenz der DNA, welche von den umgewandelten Kolonien wiedergewonnen wurde, wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pT14SSG erhalten, welches ein Gen enthielt, welches Thr anstatt der ersten Aminosäure von hG-CSF (SEQ ID NR: 11) enthielt.
  • Figure 00170001
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pT14SSG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10301 bezeichnet wird.
  • (Schritt 5) Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen enthält, das modifiziertes STII/hG-CSF verschlüsselt
  • Der in Schritt 4 erhaltene Vektor pT14SSG wurde unter Verwendung der Komplementär-Primer von SEQ ID NR: 15 und 16, welche gebildet wurden, um Thr-Kodon für das 4. Kodon von STII gemäß dem Verfahren von Schritt 4 einzusetzen, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten, PCR unterzogen.
  • E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Grundsequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde ein Plasmid erhalten, welches ein Gen enthielt, das Thr anstelle der 4. Aminosäure von STII (SEQ ID NR: 14) aufweist.
  • Figure 00180001
  • Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wurde mit XbaI und MluI aufgespalten und dann an dem XbaI/MluI-Abschnitt des in Schritt 4 erhaltenen Vektors pT14SSG eingesetzt, um den Vektor pT14SSG-4T zu erhalten.
  • (Schritt 6) Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen aufweist, das modifiziertes STII/hG-CSF verschlüsselt
  • Der in Schritt 5 erhaltene Vektor pT14SSG-4T wurde unter Verwendung der Komplementär-Primer von SEQ ID NR: 18 und 19, welche gebildet wurden, um Gln-Kodon für das 22. Kodon von STII gemäß dem Verfahren von Schritt 4 einzusetzen, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten, PCR unterzogen.
  • E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Grundsequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde ein Plasmid pT14SSG-4T22Q erhalten, welches ein Gen enthielt, das Gln anstelle der 22. Aminosäure von STII (SEQ ID NR: 17) aufweist.
  • Figure 00190001
  • (Schritt 7) Erzeugung eines Vektors, welcher ein modifiziertes STII-SD und ein Gen beinhaltet, welches modifiziertes STII/hG-CSF verschlüsselt
  • Der in Schritt 6 erhaltene Vektor pT14SSG-4T22Q wurde unter Verwendung der Komplementär-Primer der SEQ ID NR: 20 und 21 gemäß dem Verfahren von Schritt 4 PCR unterzogen, um den Vektor pT140SSG-4T22Q zu erhalten, welcher die sechs Nukleotidsequenzen zwischen der STII-SD-Sequenz (GAGG) und dem Anfangskodon von STII (modifiziertes STII-SD von SEQ ID NR: 71) aufweist, PCR unterzogen.
  • 5 repräsentiert die oben genannte Vorgehensweise zur Erzeugung des Vektors pT140SSG-4T22Q.
  • E. coli BL21(DE3) wurde mit dem Vektor pT140SSG-4T22Q umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10302 bezeichnet wird.
  • Beispiel 3: Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen aufweist, das modifiziertes hG-CSF verschlüsselt
  • Um ein modifiziertes hG-CSF-Gen herzustellen, wurden S1-Oligomer (SEQ ID NR: 22), welches E. coli bevorzugte Kodone und Ser anstelle der 17. Aminosäure von hG-CSF aufweist, und AS1-Oligomer (SEQ ID NR: 23) unter Verwendung von DNA-Synthesizer (Model 380B, Applied Biosystem, USA) synthetisch hergestellt.
  • Eine 0,5 μl (50 pMol) Menge der Oligonukleotide wurde bei 95°C für 15 Min. zur Reaktion gebracht und für 3 Stunden bis 35°C gehalten. Die Mischung wurde in Ethanol abgeschieden und einer Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, um ein ein kohäsives Ende aufweisendes Doppelstrang(ds)-Oligomer zu erhalten.
  • Das in Schritt 3 von Beispiel 2 erhaltene Plasmid pT14SS1SG wurde mit ApaI und BstXI aufgespalten und dann mit dem ein adhäsives Ende aufweisenden ds-Oligomer abgebunden, um den Vektor pT14SS1S17SEG zu erhalten. Der Vektor pT14SS1S17SEG enthielt ein Gen, welches hC-CSF verschlüsselte, das E. coli bevorzugte Kodone an dem Aminoterminus und Ser anstelle von jeweils der 1. und der 17. Aminosäure von hG-CSF aufwies.
  • 6 zeigt die oben genannte Vorgehensweise zum Erzeugen des Vektors pT140SS1S17SEG.
  • E. coli BL21(DE3) wurde mit dem Vektor pT14SS1S17SEG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10311 bezeichnet wurde, welches bei dem Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) am 24. März 1999 unter der Zugangsnummer KCCM-10154 hinterlegt wurde.
  • Beispiel 4: Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen beinhaltet, das E. coli-OmpA-Signalpeptid und modifiziertes hG-CSF verschlüsselt
  • Ein Vektor, welcher ein Gen beinhaltet, welches Tac-Aktivator und OmpA-Signalpeptid (SEQ ID NR: 24) verschlüsselt, sowie ein Gen, welches modifiziertes hG-CSF verschlüsselt, wurde wie folgt hergestellt:
  • Figure 00210001
    HindII-Drosselstelle
  • Der in Beispiel 1 erhaltene Vektor pT-CSF wurde unter Verwendung eines Primers (SEQ ID NR: 27) PCR unterzo gen, welcher zum Ersetzen des Ser-Kodons für das erste Kodon von hG-CSF dafür bestimmt war, sowie einem weiteren Primer (SEQ ID NR: 28), um eine EcoRI-Drosselstelle (5'GAATTC-3') nach dem Endkodon davon zu schaffen, um ein DNA-Fragment zu erhalten, welches ein Gen beinhaltet, das modifiziertes hG-CSF verschlüsselt.
  • Das DNA-Fragment wurde mit HindIII und EcoRI aufgespalten und dann an dem HindIII/EcoRI-Abschnitt des Vektors pFlag.CTS (Éastman, USA) eingefügt, um den Vektor pTO1SG zu erhalten, welcher ein Gen beinhaltete, welches E. coli-OmpA-Signalpeptid und modifiziertes hG-CSF (SEQ ID NR: 29) verschlüsselt.
  • 7 zeigt das oben beschriebene Verfahren zur Erzeugung des Vektors pTO1SG.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO1SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10409 bezeichnet wurde.
  • Beispiel 5: Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen beinhaltet, das E. coli-OmpA-Signalpeptid und modifiziertes hG-CSF verschlüsselt
  • Das erste Kodon des modifizierten hG-CSF-Gens des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pTO1SG wurde durch Thr ersetzt, und zwar in Übereinstimmung mit gerichteter Mutagenese (Papworth, C. et al., Strategies, 9, 3 (1996)) mittels Durchführung von PCR des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pTO1SG mit einem Sense-Primer (SEQ ID NR: 30), welcher dafür bestimmt war, das erste Kodon hG-CSF mit einem Thr-Kodon zu ersetzen, sowie einem Komplementär-Aantisense-Primer (SEQ ID NR: 31).
  • E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den transformierten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde ein Plasmid pTOG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Thr anstelle der 1. Aminosäure von hG-CSF aufwies.
  • E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTOG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches E. coli-HM 10401 bezeichnet wurde.
  • Beispiel 6: Produktion von modifizierten hG-CSFs
  • (a) Produktion von [Ser1, Ser17]hG-CSF
  • Der im Beispiel 4 erhaltene Vektor pTO1SG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 32), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit einem Ser-Kodon zu ersetzen, und einem Komplementär-Antisense-Primer (SEQ ID NR: 33) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli-XL1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pTO1S17SG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Ser anstelle der 1. und 17. Aminosäuren von hG-CSF aufwies.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO1S17SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10410 bezeichnet wurde, welches am 24. März 1999 unter der Zugangsnummer KCCM-10151 am Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) hinterlegt wurde.
  • (b) Produktion von [Ser17]hG-CSF
  • Der im Beispiel 5 erhaltene Vektor pTOG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 32), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit einem Ser-Kodon zu ersetzen, und eines Komplementär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 33) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli-XL1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pTO17SG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Ser anstelle der 17. Aminosäure von hG-CSF aufwies.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO17SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10411 bezeichnet wur de, welches am 24. März 1999 unter der Zugangsnummer KCCM-10152 am Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) hinterlegt wurde.
  • (c) Produktion von [Thrl7]hG-CSF
  • Der im Beispiel 5 erhaltene Vektor pTOG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 34), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit einem Komplementär-Antisense-Primer (SEQ ID NR: 35) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 von Beispiel 2 zu ersetzen, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli-XL1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pTO17TG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Thr anstelle der 17. Aminosäuren von hG-CSF aufwies.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO17SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10413 bezeichnet wurde.
  • (d) Produktion von [Ala17]hG-CSF
  • Der im Beispiel 5 erhaltene Vektor pTOG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 36), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit einem Ala-Kodon zu ersetzen, und eines Komplementär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 37) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli-XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pTO17AG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Thr anstelle der 17. Aminosäuren von hG-CSF aufwies.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO17TG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10414 bezeichnet wurde.
  • (e) Produktion von [Gly17]hG-CSF
  • Der im Beispiel 5 erhaltene Vektor pTOG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 38), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit einem Gly-Kodon zu ersetzen, und eines Komplementär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 39) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli-XL1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pTO17GG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Gly anstelle der 17. Aminosäure von hG-CSF aufwies.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO17GG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10415 bezeichnet wurde.
  • (f) Produktion von [Asp17]hG-CSF
  • Der im Beispiel 4 erhaltene Vektor pTOG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 40), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit einem Asp-Kodon zu ersetzen, und eines Komplementär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 41) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli-XL1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der aus den umgewandelten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pTO1S17APG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches Asp anstelle der 17. Aminosäuren von hG-CSF aufwies.
  • E. coli-BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pTO1S17APG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 104.16 bezeichnet wurde.
  • Beispiel 7: Erzeugung eines Vektors, welcher ein Gen beinhaltet, das E. coli-Gen III-Signalpeptid und modifiziertes hG-CSF verschlüsselt
  • (a) Konstruktion eines Vektors, welcher ein Gen beinhaltet, das Arabinoseaktivator und E. coli-Gen II-Signalpeptid verschlüsselt
  • Ein Vektor, welcher ein Gen beinhaltet, das Arabinoseaktivator und E. coli-Gen III-Signalpeptid (SEQ ID NR: 42) verschlüsselt, sowie ein Gen, welches modifiziertes hG-CSF verschlüsselt, wurde wie folgt erzeugt:
  • Figure 00280001
    NcoI-Drosselstelle
  • Plasmid pBAD·gIIIA (Invitrogen, USA), welches ein Gen beinhaltet, das Arabinoseaktivator und Gen III-Signalpeptid verschlüsselt, wurde mit NcoI aufgespalten und Einzelstrang-DNAs wurden mit Klenow DNA-Polymerase entfernt, um eine stumpfendige Doppelstrang-DNA zu erhalten, welche dann mit BgIII aufgespalten wurde, um ein Vektorfragment zu erhalten, welches sowohl ein stumpfes Ende als auch ein kohäsives Ende aufwies.
  • Der in Beispiel 1 erhaltene Vektor pT-CSF wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 46), welcher eine Nukleotidsequenz aufwies, welche die 2. bis zu der 9. Aminosäure von hG-CSF (SEQ ID NR: 45) verschlüsselte, und eines Komplimentär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 47) in Über einstimmung mit der Vorgehensweise von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein stumpfendiges DNA-Fragment zu erhalten, welches hG-CSF-Gen und eine BamHI-Drosselstelle in dem Karboxyl-Terminus aufweist. Das Fragment wurde dann mit BamHI aufgespalten, um ein hG-CSF-Genfragment zu erhalten, welches sowohl ein stumpfes Ende als auch ein kohäsives Ende aufwies.
  • Figure 00290001
  • Das hG-CSF-Genfragment wurde in den oben erhaltenen Vektor eingeführt, um den Vektor pBADG zu erhalten, welcher ein Gen enthielt, welches E. coli-Gen III-Signalpeptid und hG-CSF (SEQ ID NR: 48) verschlüsselte.
  • 8 beschreibt die oben genannte Vorgehensweise zum Erzeugen des Vektors pBADG.
  • E. coli B121 (DE3) (Stratagene, USA) wurde, mit dem Vektor pBADG umgewandelt, um eine Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10501 bezeichnet wurde.
  • (b) Produktion von [Met2, Val3] hG-CSF
  • Plasmid pBAD·gIIIA (Invitrogen, USA) wurde mit NcoI und BgIII aufgespalten, um ein Fragment zu erhalten, welches zwei kohäsive Enden aufwies.
  • Der in Beispiel 1 erhaltene Vektor pT-CSF wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 50), welcher eine Nukleotidsequenz aufwies, welche für die 2. bis zu der 9. Aminosäure von [Met2, Val3] hG-CSF (SEQ ID NR: 49) verschlüsselte, und eines Komplimentär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 51) in Übereinstimmung mit der Vorgehensweise von Schritt 4 von Beispiel 2, um ein stumpfendiges DNA-Fragment zu erhalten, welches hG-CSF-Gen und eine BamHI-Drosselstelle in dem Karboxyl-Terminus aufweist, welches dann mit NeoI und BamHI aufgespalten wurde, um ein hG-CSF-Genfragment zu erhalten, welches zwei kohäsive Enden aufwies.
  • Figure 00300001
    NcoI-Drosselstele
  • Das hG-CSF-Genfragment wurde in den oben erhaltenen Vektor eingeführt, um den Vektor pBAD2M2VG zu erhalten, welcher ein Gen enthielt, das E. coli-Gen II-Signalpeptid verschlüsselte, und Met und Val anstelle der 2. und 3 Aminosäuren von hG-CSF (SEQ ID NR: 52).
  • 9 zeigt die oben genannte Vorgehensweise zum Konstruieren des Vektors pBAD2M3VG.
  • E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pGAD2M3VG umgewandelt, um ein Umwandlungspro dukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10510 bezeichnet wurde, welches am Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) am 24. März 1999 unter der Zugangsnummer KCCM-10153 hinterlegt wurde.
  • (c) Produktion von [Ser 17] hG-CSF
  • Der in (a) erhaltene Vektor pBADG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 32), welcher dafür konstruiert war, das 17. Kodon von hG-CSF mit dem Ser-Kodon zu ersetzen, und eines Komplementär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 33) gemäß der Vorgehensweise von Schritt 4 aus Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der von den umgewandelten Kolonien wiedererlangten DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pBAD17SG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches anstelle der 17. Aminosäure von hG-CSF Ser hatte.
  • E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pBAD17SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10511 bezeichnet wurde.
  • (d) Produktion von [Met2, Val3, Ser 17] hG-CSF
  • Der in (b) erhaltene Vektor pBAD2M3VG wurde PCR unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NR: 32), welcher dafür bestimmt war, das 17. Kodon von hG-CSF mit dem Ser-Kodon zu ersetzen, und eines Komplementär-Antisense-Primers eines Komplementär-Antisense-Primers (SEQ ID NR: 33) gemäß der Vorgehensweise von Schritt 4 aus Beispiel 2, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid umgewandelt. Die Basissequenz der von den umgewandelten Kolonien wiedererlangten DNA wurde ermittelt und auf diese Weise wurde das Plasmid pBAD2M3V17SG erhalten, welches ein Gen beinhaltete, welches anstelle der 2. 3, und 17. Aminosäure von hG-CSF Met, Val und Ser hatte.
  • E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, USA) wurde mit dem Vektor pBAD2M3V17SG umgewandelt, um ein Umwandlungsprodukt zu erhalten, welches als E. coli-HM 10512 bezeichnet wurde.
  • Beispiel 8: Produktion von hG-CSF
  • Die in den Beispielen 2 bis 7 hergestellten Umwandlungsprodukte wurden in LB-Medium (1% Baktotrypton, 0,5% Bakto-Hefeextrakt und 1% NaCl) in einer Kultur angelegt bzw. gezüchtet und dann in der Brutkammer in der Gegenwart eines Expressionsinduktors (IPTG) für 3 Stunden aufbewahrt oder in der Abwesenheit von IPTG für mehr als 15 Stunden gezüchtet. Jede der Kulturen wurde bei 6.000 U/min für 20 min. zentrifugiert, um bakterielle Zellen abzuscheiden, und der Niederschlag wurde in einem 1/10-Volumen einer isotonischen Lösung (20% Sucrose, 10 mM Tris-Cl-Pufferlösung, welche 1 mA EDTA, pH 7,0 enthielt) suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 min. stehengelassen und dann bei 7.000 U/min für 10 min. zentrifugiert, um bakterielle Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden in D. W. bei 4°C resuspendiert und bei 7.000 U/min für 10 min. zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit als eine periplasmische Lösung zu erhalten. Das hG-CSF-Niveau in der periplasmischen Lösung wurde gemäß dem ELISA-Verfahren analysiert (Kato, K. et al., J. Immunol., 116, 1554 (1976)) unter Verwendung eines Antikörpers gegen hG-CSF (Aland, USA), welcher als die Menge von hG-CSF berechnet wurde, welche pro 1 l der Kultur erzeugt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00330001
  • Beispiel 9: Reinigung von hG-CSF
  • Das Umwandlungsprodukt E. coli-HM 10411, welches in Beispiel 6(b) hergestellt wurde, wurde in LB-Medium gezüchtet und die Kultur wurde bei 6.000 1/min für 20 Min. zu Erntezellen zentrifugiert. Die periplasmische Lösung wurde aus den Zellen durch das Wiederholen der Vorgehensweise von Beispiel 8 hergestellt.
  • Die periplasmische Lösung wurde auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 eingestellt, adsorbiert auf einer CM-Sepharose-Säule (Pharmacia Inc., Schweden) auf einen pH-Wert von 5,3 vorausgeglichen und dann wurde die Säule mit 25 mM NaCl gewaschen. hG-CSF wurde durch sequenzielles Hinzufügen von Pufferlösungen, welche 50 mM, 100 mM und 200 mM NaCl enthielten, zu der Säule eliminiert und Teile, welche hG-CSF enthielten, wurden gesammelt und kombiniert.
  • Die kombinierten Teile wurden einer Phenylsepharose (Pharmacia Inc., Schweden) Säulenchromatographie unterzogen, um [Ser 17] hG-CSF zu erhalten, welches eine Reinheit von 99% aufwies.
  • Des weiteren wurde die oben genannte Vorgehensweise wiederholt, und zwar unter Verwendung von jedem der Umwandlungsprodukte E. coli HM 10311, HM 10409, HM 10411, HM 10413, HM 10414, HM 10415, Hm 10510 und HM 10512, welche in den jeweiligen Beispielen 3, 4, 6(b), 6(c), 6(d), 6(e), 7(b) und 7(d) hergestellt wurden.
  • Jede der gereinigten hG-CSF-Teile wurde einer Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, um die Reinheit und die ungefähre Konzentration des hG-CSF zu ermitteln, und dann ELISA ausgesetzt, um die exakte hG-CSF-Konzentration in der periplasmischen Lösung zu ermitteln. Met-hG-CSF (Kirin amgen) wurde als eine Kontrolle verwendet.
  • 10a reproduziert das SDS-PAGE-Ergebnis, wobei Spalte 1 Met-G-CSF, Spalte 2 die periplasmische Lösung des Umwandlungsprodukts E. coli-HM 10411 und Spalte 3 das gereinigte [Ser 17] hG-CSF zeigt. Wie in 10b ersichtlich ist, ist das Molekulargewicht von [Ser 17] hG-CSF dasselbe wie dasjenige des Wildtyp-hG-CSF und die periplamische Lösung des Umwandlungsprodukts E. coli HM 10411 beinhaltet einen hohen Anteil von [Ser 17] hG-CSF.
  • Des weiteren wurden die N-Terminal-Aminosäuresequenzen von hG-CSFs ermittelt und die Nukleotidsequenzen, welche die 1. bis 32. Aminosäure verschlüsselten, wurden unter Verwendung der Umwandlungsprodukte HM 10311, HM 10409, HM 10411, HM 10413, HM 10414, HM 10415, HM 10510 und HM 10512, welche in den SEQ ID NR: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 und 70 dargestellt sind, hergestellt. Das Ergebnis zeigt, dass das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte, modifizierte hG-CSF an dem N-Terminus nicht methioniliert ist.
  • Ein Nitrocellulosefilter (Bio-Rad Lab., USA) wurde mit einer Pufferlösung zum Aufsaugen befeuchtet (170 mM Glizin, 25 mM Tris·HCl (pH 8), 20% Methanol) und die auf dem Gel separierten Proteine wurden auf einem Nitrocelluosefilter (Bio-Rad Lab., USA) für 3 Stunden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Der Filter wurde in 1% Kasein für 1 Stunde gehalten und drei Mal mit PBS, welches 0,05 Tween 20 enthielt, gewaschen. Der Filter wurde in Ziegen-Anti-G-CSF-Antikörper (R&D System AB-214-NA, USA)-Lösung, welche mit PBS verdünnt war, getan und bei Zimmertemperatur für 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion wurde der Filter 3 Mal mit einer PBST-Lösung gewaschen, um unreagierte Antikörper zu entfernen. Meerrettich-Peroxydasekonjugiertes Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (Bio-Rad Lab., USA), verdünnt mit PBS, wurde hinzugefügt und bei Zimmertemperatur für 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Der Filter wurde mit PBST gewaschen und eine Peroxydase-Substanz-Kit (Bio-Rad Lab., USA)-Lösung wurde hinzugefügt, um eine Farbreaktion zu entwickeln. Die Ergebnisse von der oben angegebenen Western-Blot-Analyse sind in 10b dargestellt, wobei Spalte 1 eine positive Kontrolle, Met-G-CSF, repräsentiert und Spalte 2 gereinigtes [Ser 17] hG-CSF. Wie in 10b zu erkennen ist, entspricht das Molekulargewicht von [Ser 17] hG-CSF demjenigen von Wildtyp-hG-CSF.
  • Beispiel 10: Zelluläre Aktivität von hG-CSF und modiziertem hG-CSF
  • Die Zelllinie HL-60 (ATCC CCL-240 stammend von dem Knochenmark eines promyelozytischen Leukämiepatienten/einer weißen, 36 Jahre alten Frau) wurde in RPMI 1640 Medium, welches 10% fötales Bovinserum enthielt und auf 2,2 × 105 Zellen/ml eingestellt war, wonach zu demselben DMSO (Dimethylsulfoxid, Kulturgrad/SIGMA) auf eine Konzentration von 1,25 (v/v) hinzugegeben wurde. 90 μl der sich ergebenden Lösung wurde einer 96 Wellplatte (Corning/geringe Evaporation 96 Wellplatte) in einer Menge von 2 × 104 Zellen/Well und bei 37°C unter 5% CO2 für 48 Stunden inkubiert.
  • Jede der modifizierten [Ala 17] hG-CSF, [Gly 17] hG-CSF, [Ser 17] hG-CSF und [Thr 17] hG-CSF wurde in RPMI 1640-Medium verdünnt auf eine Konzentration von 500 ng/ml und dann 10 Mal zweifach mit RPMI 1640-Medium verdünnt.
  • Die sich ergebende Lösung wurde zu den Wells bei 10 μl pro Well hinzugefügt und bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Als eine positive Kontrolle wurde ein kommerziell erhältliches hG-CSF (Jeil Pharmaceutical.) eingesetzt.
  • Das Niveau der vergrößerten Zelllinie wurde festgestellt, indem ein kommerziell erhältlicher CellTiter96TM (Cat # G4100, Promega) basierend auf der gemessenen optischen Dichte bei 670 nm eingesetzt wurde.
  • Wie aus 11 ersichtlich ist, sind die zellularen Aktivitäten der modifizierten hG-CSF dieselben oder höher als diejenigen der positiven Kontrolle Wildtyp-hG-CSF.
  • Während die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben und dargestellt wurden, ist es offensichtlich dass verschiedene Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne von dem Gedanken der vorliegenden Erfindung abzuweichen, welcher nur durch den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche beschränkt werden sollte.
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Claims (17)

  1. Modifizierter menschliche Gronulozyten-Kolonien stimulierender Faktor (hG-CSF), welcher keine Zuckerkette aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der ersten, zweiten, dritten und siebzehnten Aminosäuren des Wildtyps hG-CSF(SEQ ID NO: 2) durch andere Aminosäure(n) ersetzt ist.
  2. Modifizierter hG-CSF nach Anspruch 1, dessen Aminosäuresequenz dieselbe ist wie diejenige des Wildtyp hG-CSF, mit der Ausnahme, dass (a) die erste Aminosäure Ser ist; (b) die erste Aminosäure Ser ist und die siebzehnte Aminosäure X ist; (c) die zweite Aminosäure Met ist und die dritte Aminosäure Val ist; (d) die zweite Aminosäure Met ist, die dritte Aminosäure Val ist und die siebzehnte Aminosäure X ist; oder (f) die siebzehnte Aminosäure X ist, wobei X eine Aminosäure ist, welche bei einem neutralen pH-Wert nicht gesättigt ist.
  3. Modifizierter hG-CSF nach Anspruch 2, wobei X Ser, Thr, Ala oder Gly ist.
  4. Modifizierter hG-CSF nach Anspruch 3, wobei X Ser ist.
  5. E.Coli-Expressionsvektor, welcher die DNA, die den modifizierten hG-CSF nach Anspruch 1 verschlüsselt, und ein Polynucleotid aufweist, welches ein Signalpeptid verschlüsselt, welches an dem 5'-Ende der DNA angehängt ist, welche den modifizierten hG-CSF decodiert.
  6. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Signalpeptid E. coli wärmebeständiges Enterotoxin II Signalpeptid oder modifzierters E. coli wärmebeständiges Enterotoxin II Signalpeptid ist.
  7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das E. coli wärmebeständige Enterotoxin II Signalpeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 53 aufweist.
  8. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das modifizierte E. coli wärmebeständige Enterotoxin II Signalpeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 54 aufweist.
  9. Expressionsvektor nach Anspruch 6, welcher des weiteren eine modifizierte E. coli Enterotoxin II Shine-Dalgano-Sequenz aufweist, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 71 aufweist.
  10. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Signalpeptid E. coli Betalaktamase Signalpeptid oder modifiziertes E. coli Betalaktamase Signalpeptid ist.
  11. Expressionsvektor nach Anspruch 10, wobei das E. coli Betalaktamase Signalpeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24 aufweist.
  12. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei das Signalpeptid E. coli Gen III Signalpeptid oder modifiziertes E. coli Gen III Signalpeptid ist.
  13. Expressionsvektor nach Anspruch 12, wobei das E. coli Gen III Signalpeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 42 aufweist.
  14. Expressionsvektor nach Anspruch 5, welcher pT14SS1SG, pT14SS1S17SEG, pTO1SG, pTO1S17SG, pTO17SG oder pBAD2M3V17SG ist.
  15. E. coli transformiert mit dem E. coli Expressionsvektor nach Anspruch 5.
  16. E. coli nach Anspruch 15, welches E. coli BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM 10310), E. coli BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311, KCCM-10154), E. coli BL21(DE3)/pTO1SG(HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410, KCCM-10151), E. coli BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411, KCCM-10152), E. coli BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413), E. coli BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415), E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510, KCCM-10153), E. coli BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511) oder E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512) ist.
  17. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten hG-CSF in E. coli, welches das Züchten des E. coli nach Anspruch 15 aufweist, um den modifizierten hG-CSF zu Zellplasma zu produzieren und abzusondern.
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